CN102548549A - 利用外代谢转换剂(辅酶q10)治疗肉瘤的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了利用外代谢转换剂，例如辅酶Q10、辅酶Q10的组成部分、辅酶Q10的衍生物、辅酶Q10的类似物、辅酶Q10的代谢产物或辅酶生物合成途径的中间体，治疗人类肉瘤的方法和制剂。还提供了评估肉瘤的治疗效果、诊断和预后的方法。

Description

利用外代谢转换剂(辅酶Q10)治疗肉瘤的方法
相关申请
本申请要求2009年8月25日提交的题为“Methods for Treatmentof a Sarcoma Using an Epimetabolic Shifter(Coenzyme Q10)”(代理人案卷号：117732-02601)的61/236,845号美国临时申请的优先权。上述申请的全文通过引用在此引入。
发明背景：
癌症是目前发达国家的主要死亡原因之一，也是现代社会的一个严重的威胁。特别地，肉瘤代表了在包括骨骼肌、平滑肌、骨骼和软骨的遍及全身的原发部位发生的，间充质细胞源的异质恶性肿瘤组。尤文氏肿瘤族(EFT)代表包括经典骨骼尤文氏肉瘤(ES)、骨外尤文氏肉瘤(EOE)和原始神经外胚叶肿瘤(PNET)的一类形态上的小圆形细胞恶性肿瘤。他们代表几乎3％的小儿癌症和在儿童和青少年中第二普遍的恶性肿瘤。尤文氏肉瘤在西半球的发病率是大约1-3例/100万。虽然在治疗尤文氏肉瘤中的相当大的进展已经增加了5年生存率，但患有转移性疾病的尤文氏瘤患者的结果仍然严峻，其低于25％生存超过5年。
尤文氏肉瘤是一种其发病率似乎与孟德尔遗传、环境或药物暴露不相关的高度侵袭性的癌症。尤文氏肉瘤最一致的特征是由于EWSR1基因座和ETS转录因子基因之间的染色体易位而导致的融合基因的存在。EWS-ETS融合基因编码转录因子如EWS-FLI1，其异常的功能与尤文氏肉瘤的发病机理相关。
尽管最近的研究已经极大地增加了我们对许多肿瘤发生的分子机制的理解，并提供了许多治疗癌症的新途径，但对包括尤文氏肿瘤族的大多数恶性肿瘤的标准疗法包括完全切除、化疗和放疗。这些治疗可能会引起许多不希望的副作用。例如，外科手术可能导致疼痛、对健康组织的外伤性损伤和疤痕。放射疗法具有杀死癌细胞的优势，但它同时也损害非癌性组织。化疗涉及向病人施用各种抗癌药物。这些标准疗法常常伴随着有害的副作用，例如，恶心、免疫抑制、胃溃疡和继发性肿瘤发生。
多年来，许多个人和公司已经进行了广泛的研究以寻找改善对治疗包括尤文氏肿瘤族的各种各样的癌症的方法。多家公司正在开发有望提供更为有利的癌症疗法的生物活性剂，包括化学实体如小分子，和生物制剂如抗体。例如，正在研究胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)抗体单独地和与其它标准化疗相结合作为潜在的疗法用于复发性尤文氏族肿瘤的治疗。然而，到目前为止，尤文氏庭肿瘤的治疗仍然非常困难。因此，迫切需要开发成功治疗尤文氏肉瘤的新疗法。
辅酶Q10，本文也称之为CoQ10、Q10、泛醌或泛癸利酮，是一种流行的营养补充剂且可以在营养品商店、保健食品商店、药店等等中作为维生素类补充品以胶囊的形式找到，其有助于通过泛醇(辅酶Q10的还原形式)的抗氧化性质保护免疫系统。辅酶Q10是本领域内公知的，并进一步在国际公开号WO 2005/069916中被公开，其全部公开在本文中通过引用引入。Turunen等，Biochimica et BiophysicaActa 1660：171-199(2004)中描述了辅酶Q10的代谢和功能，包括辅酶Q 10的代谢产物，该文献的全部内容在此通过引用引入。
辅酶Q10被发现遍及人体的大部分组织和其它哺乳动物的组织。在Bhagavan HN等的综述文献，Coenzyme Q10：Absorption，tissueuptake，metabolism and pharmacokinetic，Free Radical Research 40(5)，445-453(2006)(以下，Bhagavan等)中综述了辅酶Q10在人体中的组织分布和氧化还原状态。作者报告，“作为一般规则，具有高能源需求或代谢活性的组织，如心脏、肾脏、肝脏和肌肉，含有相对高浓度的辅酶Q10。”作者进一步地报告，“除脑部和肺部以外，组织中辅酶Q10的主要部分是对苯二酚或泛醇(uniquinol)的还原形式”，其“在这两种组织中表现为增强的氧化应激的反映”。特别是，Bhagavan等报告，在心脏、肾脏、肝脏、肌肉、肠和血液(血浆)中，分别约61％、75％、95％、65％、95％和96％的辅酶Q10是还原形式的。类似地，Ruiz-Jiminez等，Determination of the ubiquinol-10 andubiquinone-10(coenzyme Q10)in human serum by liquidchromatography tandem mass spectrometry to evaluate the oxidativestress，J.Chroma A 1175(2)，242-248(2007)(以下，Ruiz-Jiminez等)报告，当测量人血浆的Q10和还原形式的Q10(Q10H2)时，发现大多数(90％)的分子为还原形式。
辅酶Q10是高度亲脂性的，且对于其大部分来说，不溶于水。由于其在水中的不溶解性、在脂质中有限的溶解度和相对大的分子量，口服辅酶Q10的吸收率很差。Bhagavan等报告，“在用大鼠进行的一项研究中，据报告只有大约2-3％的口服施用的辅酶Q10被吸收”。Bhagavan等进一步报告，“来自大鼠研究的数据表明，辅酶Q10在肠道内吸收过程中或吸收之后被还原为泛醇”。
辅酶Q10在文献中已经与癌症相关联很多年了。下面描述一些有代表性的，但不是包括所有文献中报告的相关性的例子。Karl Folkers等，Survival of Cancer Patients on Therapy with Coenzyme Q10，Biochemical and Biophysical Research Communication 192，241-245(1993)(以下，“Folkers等”)描述了8个“用辅酶Q10治疗”的癌症患者的病历及“5-15年时间的”他们的生存史......。向八个患有包括胰腺癌、腺癌、喉癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌的不同类型癌症的患者口服施用辅酶Q10。folkers等阐述，“目前这些结果证明了全身性的方案”。Lockwood等，Progress on Therapy of Breast Cancer withVitamin Q10 and the Regression of Metastases，Biochemical andBiophysical Research Communication 212，172-177(1995)(以下，“Lockwood等”)是另一个报道关于“用维生素Q10治疗乳腺癌的进展”的综述文章。Lockwood等引用Folkers等，其“涵盖了35年的关于动物和人类的国际研究，显示在非肿瘤和肿瘤组织中维生素Q10的不同水平且包括基于具有肿瘤的处理小鼠的生存者增加的宿主防御系统固有的维生素Q10的数据”。Lockwood等进一步阐述，依靠测定在199个瑞典和美国的癌症患者中的辅酶Q10血液浓度的研究(其表明在乳腺癌的情况下不同水平的缺乏)，“人类癌症的维生素Q10疗法的潜力在1961年得到证明”。2002年7月9日授权的6,417,233号美国专利(以下，Sears等)描述了含有脂溶性苯醌的组合物，如辅酶Q10，用于预防和/或治疗线粒体病。Sears等阐述了“辅酶Q10治疗已被报道在癌症患者中提供了一些优势(见第2栏，30-31行)”。
截至提交本申请之日，据美国国家癌症研究所报告，还没有进行涉及大量患者的辅酶Q10用于癌症治疗的良好设计的临床试验，因为“进行研究的方法和报道的信息量使得该益处是由辅酶Q10还是由其它物质所引起的还不清楚”。可通过www.cancer.gov/cancertopics/pdq/cam/coenzymeQ10/patient/allpages(2008年9月29日)访问美国国家癌症研究所(NCI)。特别地，NCI引用了关于在乳腺癌患者的标准治疗后使用辅酶Q10作为辅助疗法的3个小型研究，其中一些患者表现出受益于该治疗，并重申“然而，研究设计和报告的缺陷使得该益处是由辅酶Q10还是由其它物质所造成的并不清楚”。NCI特别指出，“这些研究具有以下缺点：这些研究不是随机的或对照的；除了辅酶Q10外患者还使用了其它的补充剂；患者在辅酶Q10疗法之前或期间接受标准治疗；且在研究中没有报告所有患者的详细情况”。NCI进一步报告了关于“辅酶Q10已帮助一些癌症患者，包括患有胰腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌和前列腺癌的患者，活得更长的未经证实的报道”，但是其指出“然而，在这些报告中所描述的病人也接受了除辅酶Q10以外的其它治疗，包括化疗、放疗和手术”。
2006年2月16日公布的美国专利申请公开2006/0035981(以下称“Mazzio 2006”)描述了使用组合物治疗或预防人类和动物的癌症的方法和制剂，该组合物利用了癌症与宿主相反的对葡萄糖的非氧化磷酸化以获取能量的厌氧需求的弱点。Mazzio 2006的制剂包含一种或多种协同地促进氧化代谢和/或阻碍乳酸脱氢酶或无氧糖代谢的化合物，和特别地描述为含有“2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌(本文也称为“DMBQ”)(醌式碱)和整个泛醌系列的可选项，包括相应的对苯二酚、泛色烯醇、泛色烯醇或合成的/天然的衍生物和类似物。见mazzio2006第3页，第0010段。Mazzio 2006确认“短链泛醌(CoQ＜3)作为抗癌剂”，且甚至进一步确认“2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌(DMBQ)作为抗癌剂比辅酶Q10效力高出1000倍”。见mazzio 2006第3页，第0011段。Mazzio 2006进一步阐述，该研究“没有发现辅酶Q10如所预计的一样是致死性的”且似乎“采用辅酶Q10对抗癌症的先前研究存在一些矛盾”。见mazzio 2006第3-4页大量列出的支持了这一论述的引用文献列表。
2007年10月25日公布的美国专利申请公开2007/0248693(本文以下称“Mazzio 2007”)还描述了营养保健组合物及其用于治疗或预防癌症的用途。而且，公布的该专利申请集中于短链泛醌，并具体地阐明辅酶Q10不是该发明的关键成分。根据Mazzio 2007，“虽然辅酶Q10可以增加癌细胞中线粒体复合体II活性的Vmax(Mazzio和Soliman，Biochem Pharmacol.67：1167-84，2004)，它没有控制通过复合体IV的线粒体呼吸率或氧气利用率。而且，辅酶Q10没有如预计的一样是致死性的。同样地，辅酶Q10对抗癌症的结果是矛盾的”。见mazzio 2007第5页，第0019段。
申请人先前已经描述了辅酶Q10的局部制剂和在动物受试者中降低肿瘤的生长速度的方法(Hsia等，2005年8月4日公开的WO2005/069916)。在Hsia等所描述的该实验中，证明辅酶Q10增加了皮肤癌细胞而非正常细胞的培养物中的细胞凋亡速率。此外，证明用辅酶Q10的局部制剂治疗荷瘤动物显著地降低了该动物中肿瘤的生长速率。本发明至少部分地基于对辅酶Q10在人体和/或细胞中作用的更完全的了解。特别地，本发明的方法和制剂至少部分地基于从辅酶Q10体外治疗肉瘤细胞的广泛研究中获得的关于辅酶Q10的治疗机制的知识。
具体来说，在至少一个实施方式中，本发明的方法和制剂至少部分地基于用辅酶Q10治疗的原代肉瘤细胞中调节相当数目的基因的表达的惊人发现。发现这些被调节的蛋白质被群集到几个细胞途径中，包括细胞过程、代谢过程、转录调控、程序性细胞死亡(细胞凋亡)、细胞发育、细胞骨架、细胞核、蛋白质组和器官发育的调节。综上所述，本文所述的结果已经为Q10的治疗机制提供了深刻的理解。虽然不希望被理论约束，本文所述的结果表明，辅酶Q10诱导细胞骨架蛋白的全面的表达，从而破坏细胞的结构体系的稳定并启动以不同寻常和出乎意料的速度达到顶点的细胞过程和稳定的细胞凋亡反应。
因此，本发明的一个方面提供了通过向人体局部施用辅酶Q10分子(例如，辅酶Q10、辅酶Q10的组成部分、辅酶Q10的衍生物、辅酶Q10的类似物、辅酶Q10的代谢产物或辅酶生物合成途径的中间产物)来治疗或预防发生以治疗或预防人类中的肉瘤的方法。在一个实施方式中，局部施用是用于对特定的待治疗肉瘤在人体中提供疗效而选择的剂量。在某些实施方式中，通过施用辅酶Q10的氧化形式进行肉瘤的治疗或预防。
在某些实施方式中，被治疗或预防的肉瘤不是通常通过局部施用进行治疗或预防的肉瘤，而是预期系统递送治疗上有效水平的活性剂。
在一些实施方式中，被治疗的人类组织中的辅酶Q10分子的浓度与代表健康或正常状态的人类组织的对照标准浓度不同。
在本发明的另一些实施方式中，向人类施用的所述辅酶Q10分子的形式与在人类的体循环中发现的主要形式不同。
在本发明的另一实施方式中，该治疗涉及或者通过辅酶Q10分子(如CoQ10、CoQ10的组成部分、CoQ10的衍生物、CoQ10的类似物、CoQ10的代谢物或辅酶生物合成途径的中间体)与选自于ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3AL9S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD65 67、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白(Syntrophin)、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白(Catenin)、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基、Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白(Translin)相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮结合抑制剂、α2-HS糖蛋白(黄牛(Bos Taurus)，牛)、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3、真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2(mif two 3 homolog 2)的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD、hnRNP C1/C2、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160 200、Rab5、晶丝蛋白(Filensin)、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白(Myosine)、MEKK4、cRaf pSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、肌球蛋白调节轻链、hnRNP C1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、β-微管蛋白、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1β2、ER脂筏相关2同型体1(β肌动蛋白)、信号序列受体1δ、真核翻译起始因子3、亚基3γ、胆绿素(Bilverdin)还原酶A(转醛醇酶1)、角蛋白1，10(旁胸腺素(Parathymosin))、GSTω1、B链多巴胺苯醌结合DJ-1、蛋白酶体激活剂Reg(α)、T-复合蛋白1同型体A、链A甲巯蛋白(Tapasin)ERP57(含伴侣蛋白(Chaperonin)的TCP1)、泛素激活酶E1；丙氨酰-tRNA合成酶、动力蛋白激活蛋白(Dynactin)1、热休克蛋白60kd、β肌动蛋白、亚精胺合成酶(β肌动蛋白)、热休克蛋白70kd、视网膜母细胞瘤结合蛋白4同型体A、TAR DNA结合蛋白、真核翻译延长因子1β2、含伴侣蛋白的TCP1、亚基3、胞质动力蛋白IC-2、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2、VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34cdc2、P53BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素(surviving)、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21 WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)、MRP1、MDC1、层粘连蛋白2 a2、b联蛋白，FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、Neurabin I、AP1和Apaf1组成的组的基因(或蛋白质)的相互作用进行。
在一个实施方式中，以在向人施用所述的辅酶Q10分子后至少1个小时诱导肉瘤细胞的细胞凋亡的剂量施用辅酶Q10分子。在其它实施方式中，通过以在向人施用辅酶Q10后至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、18小时、24小时、36小时、48小时后诱导肉瘤细胞的细胞凋亡的剂量施用辅酶Q10分子。
在本发明的某些实施方式中，提供了通过向人局部地施用辅酶Q10分子以进行治疗或预防而用于治疗或预防人的肉瘤的方法，其中向人类施用外用剂量的外用介质中的辅酶Q10，其中以每平方厘米的皮肤约0.01至约0.5毫克的辅酶Q10的剂量范围向靶组织应用辅酶Q10。在一个实施方式中，以每平方厘米的皮肤约0.09至约0.15毫克的辅酶Q10的剂量范围向靶组织应用该辅酶Q10。在另一个实施方式中，以每平方厘米的皮肤约0.12毫克的辅酶Q10的剂量向靶组织应用辅酶Q10。
在本发明的某些实施方式中，被治疗和预防的肉瘤是尤文氏肿瘤族中的肉瘤类型。在某些实施方式中，被治疗和预防的尤文氏肿瘤族中的肉瘤类型是尤文氏肉瘤。
本发明的某些方面提供了通过向人局部地施用辅酶Q10分子以进行治疗或预防而用于治疗或预防人的肉瘤的方法，其中每24小时局部应用该辅酶Q10分子一次或多次，持续六星期或更多的时间。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防人中肉瘤的方法，包括以使辅酶Q10在肉瘤的治疗过程中维持其氧化形式的方式向人施用辅酶Q10。在一个实施方式中，被治疗的肉瘤不是通常通过局部给药治疗的肉瘤，而是预期以治疗有效水平系统递送活性剂治疗的肉瘤，如尤文氏肉瘤。
然而本发明的再另一个方面提供了抑制在尤文氏肉瘤中发现的通过染色体11和22之间的易位产生的融合蛋白(即EWS-FLI1融合蛋白)的活性的方法，这些方法包括选择或治疗患有肉瘤的人类受试者和向所述的人类受试者施用治疗上有效量的辅酶Q10分子，从而抑制EWS-FLI1融合蛋白的活性。
在某些实施方式中，辅酶Q10分子是CoQ10生物合成途径的中间体，包括：(a)苯醌或至少一种促进苯醌环生物合成的分子，和(b)至少一种促进类异戊二烯单元合成和/或连接到苯醌环的分子。在其它实施方式中，所述的至少一种促进苯醌环生物合成的分子包括：L-苯丙氨酸、DL-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-酪氨酸、DL-酪氨酸、D-酪氨酸、4-羟基-苯丙酮酸、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸(香草基扁桃酸酯或VMA)、香草酸、吡哆醇或泛酰醇。在其它实施方式中，所述的至少一种促进类异戊二烯单元合成和/或连接到苯醌环的分子包括：乙酸苯酯、4-羟基苯甲酸、甲羟戊酸、醋甘氨酸、乙酰辅酶A或法呢基。在其它实施方式中，所述中间体包括：(a)L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和4-羟基苯丙酮酸中的一种或多种；和(b)4-羟基苯甲酸、乙酸苯酯和苯醌中的一种或多种。在其它实施方式中，该中间体：(a)抑制Bcl-2的表达和/或促进半胱天冬酶-3的表达；和/或(b)抑制细胞增殖。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防人的肉瘤的方法。该方法包括按给药方案向需要的人施用辅酶Q10分子，从而调节人的细胞膜的渗透性和进行治疗或预防。
在一些实施方式中，用于治疗或预防人的肉瘤或抑制人的EWS-FLI1融合蛋白活性的方法进一步地包括上调选自于LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160 200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRaf pSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、肌球蛋白调节轻链、hnRNP  C1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、微管相关蛋白、β微管蛋白、蛋白酶体α3、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1δ、热休克蛋白27kD、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、ER脂筏相关2同型体1(β肌动蛋白)、铜/锌过氧化物歧化酶和信号序列受体1δ、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2和VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34 cdc2、P53BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21 WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)和MRP1组成的组的一个或者多个基因的表达水平；和/或下调选自于ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3 AL9 S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD65 67、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基，Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure BPA00001530185500111
结合抑制剂、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3，真核翻译延长因子1δ，核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD，hnRNP C1/C2，真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、MDC1、层粘连蛋白2a2、b联蛋白、FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、Neurabin I、AP1和Apaf1组成的组的一个或者多个基因的表达水平。
在本发明的一些实施方式中，用于治疗或预防人的肉瘤或抑制人的EWS-FLI1融合蛋白活性的方法包括或通过辅酶Q10分子与选自于ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3 AL9 S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD65 67、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(EndophilinB1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基，Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure BPA00001530185500112
结合抑制剂、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3，真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD，hnRNP C1/C2、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160 200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRafpSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、肌球蛋白调节轻链、hnRNP C1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、β-微管蛋白、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1β2、ER脂筏相关2同型体1(β肌动蛋白)、信号序列受体1δ、真核翻译起始因子3、亚基3γ、胆绿素还原酶A(转醛醇酶1)、角蛋白1，10(旁胸腺素)、GSTω1、B链多巴胺苯醌结合DJ-1、蛋白酶体激活剂Reg(α)、T-复合蛋白1同型体A、链A甲巯蛋白ERP57(含伴侣蛋白的TCP1)、泛素激活酶E1；丙氨酰-tRNA合成酶、动力蛋白激活蛋白1、热休克蛋白60kd、β肌动蛋白、亚精胺合成酶(β肌动蛋白)、热休克蛋白70kd、视网膜母细胞瘤结合蛋白4同型体A、TAR DNA结合蛋白、真核翻译延长因子1β2、含伴侣蛋白的TCP1、亚基3、胞质动力蛋白IC-2、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2、VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34 cdc2、P53 BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21 WAF1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)、MRP1、MDC1、层粘连蛋白2a2、b联蛋白，FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、Neurabin I、AP1和Apaf1组成的组的基因的相互作用进行。
在本发明的某些实施方式中，该方法进一步包含包括外科手术、放射疗法、激素治疗、抗体治疗、应用生长因子、细胞因子的疗法、化疗和同种异体干细胞疗法中的任何一个或者其组合的治疗方案。而在再另一个方面，本发明提供了评估用于治疗受试者中肉瘤的疗法的效力的方法。该方法包括将向受试者施用治疗方案的至少一部分前从该受试者获得的第一样品中存在的标志物的表达水平(其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组)和从施用了治疗方案的至少一部分后的受试者中获得的第二样品中存在的标志物的表达水平进行比较，其中与第一样品相比，第二样品中的标志物的表达水平的调节表明该疗法对治疗受试者中的肉瘤是有效的。
但在再另一个方面，本发明提供了评估受试者是否患有肉瘤的方法。该方法包括测定从受试者中获得的生物样品中存在的标志物的表达水平(其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组)及比较从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平和对照样品中存在的标志物的表达水平，其中相对于对照样品中标志物的表达水平，从受试者中获得的生物样品中标志物的表达水平的调节表明该受试者患有肉瘤，由此评估受试者是否患有肉瘤。
在另一个方面，本发明提供了预测受试者是否具有患肉瘤的倾向的方法。该方法包括测定从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组，和比较从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平和对照样品中存在的标志物的表达水平，其中相对于对照样品中标志物的表达水平，从受试者获得的生物样品中标志物的表达水平的调节表明该受试者具有患肉瘤的倾向，从而预测受试者是否有患肉瘤的倾向。
而在再另一个方面，本发明提供了预测受试者中肉瘤复发的方法。该方法包括测定从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组，和比较从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平和对照样品中存在的标志物的表达水平，其中相对于对照样品中标志物的表达水平，从受试者获得的生物样品中标志物的表达水平的调节表明肉瘤的复发，从而预测受试者中肉瘤的复发。
一个方面，本发明提供了预测患有肉瘤的受试者的生存的方法，该方法包括测定从受试者中获得的生物样品中存在的标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组，和比较从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平和对照样品中存在的标志物的表达水平，其中相对于对照样品中存在的标志物的表达水平，从受试者获得的生物样品中标志物的表达水平的调节是受试者的生存的指示，从而预测患有肉瘤的受试者的生存。
在再另一个方面，本发明提供了监测受试者中肉瘤发展的方法。该方法包括比较向受试者施用治疗方案的至少一部分前从该受试者获得的第一样品中存在的标志物的表达水平和从施用了治疗方案的至少一部分后从受试者中获得的第二样品中存在的标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组，从而监测受试者中肉瘤的发展。
在再另一个方面，本发明提供了鉴定用于治疗受试者中肉瘤的化合物的方法。该方法包括从受试者中获得生物样品，将该生物样品与受试化合物接触，测定从受试者获得的生物样品中存在的一个或多个标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的具有正倍数变化和/或负倍数变化的标志物组成的组，比较生物样品中存在的一个或多个标志物的表达水平和适合的对照，及选择降低生物样品中存在的具有负倍数变化的一个或多个标志物的表达水平和/或提高生物样品中存在的具有正倍数变化的了一个或多个标志物的表达水平的受试化合物，从而鉴定用于治疗受试者中肉瘤的化合物。
在一个实施方式中，该肉瘤是尤文氏肿瘤族中的肉瘤类型。在一个实施方式中，该肉瘤类型是尤文氏肉瘤。
适合用于本发明的方法中的样品包括，例如，流体，例如从受试者获得的血液流体、呕吐物、唾液、淋巴液、囊肿液(cystic fluid)、尿液、通过支气管灌洗收集的流体、通过腹膜冲洗收集的流体和妇科流体。在一个实施方式中，该样品是血液样品或其成分。适用于本发明的方法中的样品也可以包括，例如，组织或其组成部分，例如，骨骼、结缔组织、软骨、肺、肝、肾、肌肉组织、心脏、胰腺和/或皮肤。
在一个实施方式中，该受试者是人类。
在一个实施方式中，通过分析样品中转录的多核苷酸或其部分(例如，通过扩增该转录的多核苷酸)而测定生物样品中标志物的表达水平。
在另一个实施方式中，通过使用例如与样品中的蛋白质特异地结合的试剂(例如，标记试剂)分析蛋白质或其部分测定受试者样品中的标志物的表达水平。在一个实施方式中，该试剂选自于抗体和抗原结合的抗体片段组成的组。
在一个实施方式中，使用选自于所述样品的聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、单链构象多态性分析(SSCP)、错配裂解检测(mismatch cleavage detection)、异源双链体分析、Southern印迹分析、Northern印迹分析、Western印迹分析、原位杂交、阵列分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析及其组合或亚组合组成的组的技术测定样品中标志物的表达水平。
在另一个实施方式中，使用选自于免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞仪、ELISA和质谱分析组成的组的技术测定样品中标志物的表达水平。
在另一个实施方式中，该标志物是选自于ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3 AL9 S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD65 67、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基，Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure BPA00001530185500151
结合抑制剂、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3、真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD，hnRNP C1/C2，真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRaf pSer621、FKHR FOXO 1a、MDM2、Fas配体、P53R2、肌球蛋白调节轻链、hnRNPC1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、β-微管蛋白、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1β2、ER脂筏相关的2同型体1(β肌动蛋白)、信号序列受体1δ、真核翻译起始因子3、亚基3γ、胆绿素还原酶A(转醛醇酶1)、角蛋白1，10(旁胸腺素)、GSTω1、B链多巴胺苯醌结合DJ-1、蛋白酶体激活剂Reg(α)、T-复合蛋白1同型体A、链A甲巯蛋白ERP57(含伴侣蛋白的TCP1)、泛素激活酶E1；丙氨酰-tRNA合成酶、动力蛋白激活蛋白1、热休克蛋白60kd、β肌动蛋白、亚精胺合成酶(β肌动蛋白)、热休克蛋白70kd、视网膜母细胞瘤结合蛋白4同型体A、TAR DNA结合蛋白、真核翻译延长因子1β2、含伴侣蛋白的TCP1、亚基3、胞质动力蛋白IC-2、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2、VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34 cdc2、P53 BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21 WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)、MRP1、MDC1、层粘连蛋白2 a2、b联蛋白，FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、NeurabinI、AP1和Apaf1组成的组的标志物
在一个实施方式中，测定多个标志物的表达水平。
在一个实施方式中，用选自于环境影响剂(environmentalinfluencer)化合物、外科手术、放射疗法、激素治疗、抗体治疗、应用生长因子、细胞因子的疗法、化学疗法、同种异体干细胞疗法组成的组的疗法治疗受试者。
在一个实施方式中，该疗法包括环境影响剂化合物和任选地进一步地包括选自于外科手术、放射疗法、激素治疗、抗体治疗、应用生长因子、细胞因子的疗法、化学疗法、同种异体干细胞疗法组成的组的治疗方案。
环境影响剂化合物可以是多维细胞内分子(multidimensionalintracellular molecule)(MIM)、外代谢转换剂(epimetabolic shifter)(外-转换剂(epi-shifter))、辅酶Q10分子、维生素D3、乙酰辅酶A、棕榈酰基、L-肉毒碱、酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、小分子、纤维连接蛋白、TNF-α、IL-5、IL-12、IL-23、血管生成因子和/或细胞凋亡因子。
在本发明的再另一个方面，提供了用于评估受试者是否患有肉瘤的试剂盒。该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒评估受试者是否患有肉瘤的说明。
一方面，本发明提供了用于预测受试者是否具有患肉瘤的倾向的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒预测受试者是否具有患肉瘤的倾向的说明。
在另一个方面，本发明提供了用于预测受试者中肉瘤复发的试剂盒，该试剂盒包括用于评估选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒预测肉瘤复发的说明。
在另一个方面，本发明提供了用于预测肉瘤复发的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒预测肉瘤复发的说明。
在再另一个方面，本发明提供了用于预测患有肉瘤的受试者的生存的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒预测患有肉瘤的受试者的生存的说明。
在另一个方面，本发明提供了用于监测受试者中肉瘤发展的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒预测受试者中肉瘤的发展的说明。
在再另一个方面，本发明提供了用于评估治疗肉瘤的疗法的效果的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒评估治疗肉瘤的疗法的效力的说明。
本发明的试剂盒可以进一步包含从受试者获得生物样品的手段、对照样品和/或环境影响剂化合物。
用于测定至少一个标志物的表达水平的手段可以包括用于分析样品中转录的多核苷酸或其部分的手段和/或用于分析样品中的蛋白质或其部分的手段。
在一个实施方式中，该试剂盒包含用于测定多个标志物的表达水平的试剂。
附图简要说明
本公开的各种实施方式将在本文下面根据附图进行描述，其中：
图1：来自不同的处理组的NCIES0808细胞的显微照片。(A)3小时培养基，(B)3小时50uM的Q10，(C)3小时100uM的Q10，(D)6小时媒介，(E)6个小时50uM的Q10，(F)6个小时100uM的Q10，(G)24小时培养基，(H)24小时50uM的Q10，(I)24小时100uM的Q10，(J)48小时培养基，(K)48小时50uM的Q10，(L)48小时100uM的Q10，在任何组中，Q10处理后的细胞数量或形态都没有明显差异。
图2：从用50μM辅酶Q10处理3个小时的NCIES0808细胞分离的蛋白的示例性抗体阵列的图样分析(pattern analysis)。
图3：用辅酶Q10处理24个小时的NCIES0808细胞的2-D凝胶电泳示例凝胶分析。标记了切除用于鉴别的点。
图4：从用50uM或100uM辅酶Q10处理24小时的NCIES0808细胞中分离的蛋白质使用不同的抗体进行的Western印迹分析。(A)抗血管紧缩素转化酶(ACE)(Santa Cruz生物技术公司，sc-23908)。(B)抗半胱天冬酶(abcam公司，ab44976)。(C)抗GARS(abcam公司，ab42905)。(D)抗基质金属蛋白酶(MMP-6)(Santa Cruz生物技术公司，sc-101453)。(E)抗溶神经素(NON)-催化结构域(abcam公司，ab59523)。(F)抗溶神经素(NLN)(abcam公司，ab59519)。
图5：(A)EWS和FLI1蛋白的蛋白质相互作用的网络。(B)ANGPTL3蛋白的蛋白质相互作用的网络。
发明详述
为了更容易地理解本发明，首先定义一些术语。
一、定义
本文所使用的下列各个术语具有与其在本节中相关的含义。
本文所使用的冠词“一(a)”和“一个(an)”是指一个或多于一个(即指至少一个)该冠词语法上的宾语。举例来说，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
本文所使用的术语“包括”是指“包括但不限于”并与该短语可互换地使用。
本文所使用的术语“或”是指“和/或”并与该术语可互换地使用，除非上下文清楚地表明另外的情况。
本文所使用的术语“例如”是指“例如但不限于”，并与该短语可互换地使用。
本发明的方法治疗的“患者”或“受试者”可以指人或者非人类的动物，优选地是哺乳动物。应当指出，本文所描述的临床观察是对人类受试者进行的，且至少在某些实施方式中，该受试者是人类。
“治疗有效量”是指当用于治疗疾病而向患者施用时，足以实现对该疾病的治疗的化合物的量。当用以预防疾病而施用时，该量足以避免或延缓疾病的发作。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度和被治疗的患者的年龄、体重等发生变化。
“预防”或“防止”是指减少获得疾病或失调的风险(即导致在可能会暴露于或具有患疾病的倾向但还没有发生或显示疾病症状的患者中不出现该疾病的至少一种临床症状)。
术语“预防性的”或“治疗性的”治疗是指向受试者施用一种或多种所述组合物。如果在有害的病症(例如，宿主动物的疾病或其它有害的状态)的临床表现之前施用，那么该治疗是预防性的，即它保护宿主抵抗有害的病症发生，然而如果在有害的病症表现后施用，该治疗是治疗性的(即，它的目的是减少、缓解或维持现有的有害的病症或由其产生的副作用)。
术语“疗效”是指由药理活性物质引起的，在动物中，特别地是哺乳动物中，更特别地是在人体中，局部的或全身性的效应。因此该术语是指在动物或人类中意图用于疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防的或用于增强希望的身体或精神的发展和状态的任何物质。短语“治疗有效量”意思是以适用于任何治疗的合理的利益/风险比产生想要的局部或全身性效应的这种物质的量。在某些实施方式中，化合物的治疗有效量将取决于其治疗指数、溶解性等等。例如，由本发明的方法发现的某些化合物可以足够的量施用以产生适用于这种治疗的合理的利益/风险比。
“患者”是指包括马、狗、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼和鸟类的任何动物(如人类)。
“代谢途径”是指将一种化合物转化为另一种化合物并为细胞功能提供中间体和能源的一系列酶介导的反应。代谢途径可以是线性的或环状的。
“代谢状态”是指在给定的时间点通过各种化学和生物指示剂测量的特定细胞、多细胞或组织环境的分子含量，因为它们与健康或疾病的状态有关。
术语“微阵列”是指在基底，如纸、尼龙或其它类型的膜、滤器、芯片、载玻片或任何其它合适的固体载体上合成的不同的多核苷酸、寡核苷酸、多肽(如抗体)或肽的阵列。
术语“失调”和“疾病”以包容的方式使用，并指与身体的任何部分、器官或系统(或其任何组合)的正常结构或功能的任何偏离。特定的疾病由特征性的症状和体征表现，包括生物的、化学的和物理的变化，并且常常与包括，但不仅限于，人口统计的、环境的、职业、遗传的和医疗史的因素的多种其它因素相关。可以通过多种方法定量某些特征性的体征、症状和相关的因素，以产生重要的诊断信息。
术语“肉瘤”指连接、支持或包围身体的其它结构和器官的组织的恶性肿瘤。在一个实施方式中，肉瘤是“尤文氏肿瘤族”的肿瘤类型。
本文所用的术语“尤文氏肿瘤族”与术语“EFT”互换地使用，并指影响骨骼或附近的软组织的一组癌症。本文所使用的“尤文氏肿瘤族”包括骨骼的尤文氏肿瘤(也称为尤文氏肉瘤)，最常见类型的EFT，骨外尤文氏肉瘤(EOE)，在骨外软组织中生长的肿瘤，以及外周原发性神经外胚层瘤(PPNET)，在骨骼和软组织中发现的癌症，包括Askin肿瘤，其是胸壁的PPNET。
本文所使用的术语“表达”是指从DNA产生多肽的过程。该过程包括将基因转录成mRNA和该mRNA翻译成多肽。根据在其中使用的上下文，“表达”可指RNA、蛋白质或两者的产生。
术语“细胞中的基因表达水平”或“基因表达水平”是指细胞中基因编码的mRNA、以及pre-mRNA初生转录本、转录本加工中间体、成熟的mRNA和降解产物的水平。
术语“调节”是指反应的上调(即激活或刺激)、下调(即，抑制或阻止)或这两者组合或分离。“调节剂”是调节的化合物或分子，且可以是例如，激动剂、拮抗剂、活化剂、刺激物、抑制物或抑制剂。
“较高的表达水平”、“较高的活性水平”、“提高的表达水平”或“提高的活性水平”是指测试样品中大于用于评估表达和/或活性的试验的标准误差的表达水平和/或活性，并且优选为对照样品(例如，源自未患肉瘤的健康受试者的样品)中的标志物的表达水平和/或活性和优选地几个对照样品中的标志物的平均表达水平和/或活性的至少两倍，和更优选地三倍、四倍、五倍或十倍或更多倍，且优选地。
“较低的表达水平”、“较低的活性水平”、“降低的表达水平”或“降低的活性水平”是指测试样品中高于用于评估表达和/或活性的试验的标准误差的表达水平和/或活性，但是优选比对照样品(例如，已经被直接地或间接地针对具有用作用于标志物的预测能力的验证标准的随访信息校准的一组肉瘤校准的样品)中的标志物的表达水平和/或活性和优选地几个对照样品中的标志物的平均表达水平和/或活性低至少两倍，优选地三倍、四倍、五倍或十倍或更多倍。
本文所用的“抗体”包括，例如，自然发生的抗体形式(例如，IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体，如单链抗体、嵌合的和人源化的抗体及多特异性抗体，以及所有上述的片段及衍生物，该片段和衍生物至少具有抗原结合位点。抗体衍生物可以包含与抗体偶联的蛋白质或化学部分。
本文所使用的“已知标准”或“对照”是指关于本发明的标志物的一个或多个量和/或数学关系(如果适用的话)，和存在或不存在肉瘤。已知标准优选反映复发性肿瘤和非复发性肿瘤和/或侵袭性或非侵袭性肿瘤特征性的这类量和/或数学关系。用于产生已知标准的试剂包括，但不限于，从已知为侵袭性的肿瘤得到的肿瘤细胞、从已知为非侵袭性的肿瘤得到的肿瘤细胞和任选标记的抗体。已知标准也可以包括组织培养细胞系(包括，但不仅限于，已被操作以表达特定的标志物蛋白或者不表达特定的标志物蛋白的细胞系，或者组成地含有恒定量的标志物蛋白或可以被操作(例如，通过暴露于改变化的环境，其中这种改变的环境可以包括但不限于生长因子、激素类、类固醇、细胞因子、抗体、各种药物和抗代谢物、及细胞外基质)以表达标志物蛋白的肿瘤异种移植物。细胞系可直接装载在用于分析的载玻片上、固定、直接作为团粒包埋在石蜡中，或者悬浮于如琼脂糖的基质中，然后固定、石蜡包埋、切片和加工成组织样品。该标准必须针对具有用作标志物蛋白的预测能力的验证标准的随访信息的肉瘤组直接或间接地校准。
本文所用的“初级治疗”是指患有肉瘤的受试者的原始治疗。初级治疗包括但不限于，外科手术、放疗、激素治疗、化疗、免疫疗法、血管生成疗法、同种异体干细胞疗法和通过生物调节剂的治疗。
如果肉瘤的至少一种症状预计将或者被缓解、终止、减缓或防止，则肉瘤被“治疗”。如本文使用的，如果肉瘤的复发或转移被减少、减缓、延迟或防止，则肉瘤也被“治疗”。
试剂盒是包含特异性地检测本发明的标志物的至少一种试剂，如探针，的任何制品(如包装或容器)，该制品作为用于执行本发明的方法的单位推销、分销或出售。
本文所使用的术语“三乙醇胺(Trolamine)”是指三乙醇胺NF、三羟乙基胺、TEAlan
Figure BPA00001530185500231
TEAlan 99％、三羟乙基胺，99％、三羟乙基胺，NF、或者三羟乙基胺，99％，NF。这些术语在此可以互换使用。
本文所使用的“辅酶Q10分子”或“CoQ10分子”包括辅酶Q10、辅酶Q10的组成部分、辅酶Q10的衍生物、辅酶Q10的类似物、辅酶Q10的代谢产物或辅酶生物合成途径的中间体。
CoQ10具有以下结构：
Figure BPA00001530185500241
CoQ10的“组成部分”包括，但不限于，苯丙氨酸、酪氨酸、4-羟基苯基丙酮酸盐、乙酸苯酯、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸盐、香草酸、4-羟基苯甲酸、甲羟戊酸、法尼基、2，3-二甲氧基-5-甲基-p-苯醌及其相应的酸或离子。
“辅酶Q10的衍生物”是具有与辅酶Q10相似的结构的化合物，只是一个原子或官能团被另一个原子或原子团所取代。“辅酶Q10的类似物”包括没有或具有至少一个(例如，一、二、三、四、五、六、七、八或九个)异戊二烯基重复单元的类似物。
本文所用的术语“辅酶生物合成途径的中间体”表征那些在酪氨酸和乙酰辅酶A化学/生物转化为泛醌之间形成的化合物。辅酶生物合成途径的中间体包括3-六异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、3-六异戊二烯基-4，5-二羟基苯甲酸、3-六异戊二烯基-4-羟基-5-甲氧基苯甲酸、2-六异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-六异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-六异戊二烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-6-甲氧基--1，4-苯醌、2-十异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、3-十异戊二烯基-4-羟基-5-甲氧基苯甲酸、3-十异戊二烯基-4，5-二羟基苯甲酸、3-十异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯基乳酸、4-羟基-苯甲酸、4-羟基肉桂酸和六异戊二烯基二磷酸。
在某些实施方式中，辅酶生物合成途径的中间体包括：(a)苯醌或至少一种促进苯醌环生物合成的分子，和(b)至少一个促进类异戊二烯单元合成和/或连接到苯醌环的分子。在其它实施方式中，所述的至少一种促进苯醌环生物合成的分子包括：L-苯丙氨酸、DL-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-酪氨酸、DL-酪氨酸、D-酪氨酸、4-羟基-苯丙酮酸、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸(香草基扁桃酸或VMA)、香草酸、吡哆醇或泛酰醇。在其它实施方式中，所述至少一种促进类异戊二烯单元合成和/或连接到苯醌环的分子包括：乙酸苯酯、4-羟基苯甲酸、甲羟戊酸、醋甘氨酸、乙酰辅酶A或法呢基。在其它实施方式中，该中间体包括：(a)L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和4-羟基苯丙酮酸中的一种或多种；(b)4-羟基苯甲酸、乙酸苯酯和苯醌中的一种或多种。在其它实施方式中，该中间体：(a)抑制Bcl-2的表达和/或促进半胱天冬酶-3的表达；和/或(b)抑制细胞增殖。
在一些实施方式中，本发明的化合物(例如，本文所述的MIM或外-转换剂，例如，本发明的辅酶Q10分子)与辅酶Q10具有共同的活性。这里所用的短语“与辅酶Q10具有共同的活性”是指化合物显示至少一部分与辅酶Q10相同或类似的活性的能力。在一些实施方式中，本发明的化合物显示25％或更多的辅酶Q10的活性。在一些实施方式中，本发明的化合物显示最多达和包括约130％的辅酶Q10的活性。在一些实施方式中，本发明的化合物显示大约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％、111％、112％、113％、114％、115％、116％、117％、118％、119％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、126％、127％、128％、129％或130％的辅酶Q10的活性。应该理解的是，本段中所列出的各个数值可用词语“大约”来修饰。此外，应该理解的是本发明意在包含本段所列出的任何两个值限定的任何范围。例如，在一些实施方式中，本发明的化合物显示约50％和约100％之间的辅酶Q10的活性。在一些实施方式中，辅酶Q10和本发明的化合物共有的活性是在细胞代谢中诱导转换的能力。在某些实施方式中，通过OCR(耗氧率)和/或ECAR的(细胞外酸化率)来测量由辅酶Q10和本发明的化合物共有的活性。在某些实施方式中，辅酶Q10和本发明的化合物共有的活性是抑制肉瘤细胞生长的能力。在某些实施方式中，辅酶Q10和本发明的化合物共有的活性是诱导细胞骨架蛋白整体表达的能力。在某些实施方式中，辅酶Q10和本发明的化合物共有的活性是破坏癌症(如肉瘤)细胞的结构体系稳定的能力。
现在将详细参照本发明的优选的实施方式。虽然将结合优选的实施方式描述本发明，应该理解的是，并非意图将本发明限制于这些优选的实施方式。与此相反，它是旨在涵盖可被包含在如后面的权利要求所定义的本发明的精神和范围之内的替代方案、改进和等同物。
二、环境影响剂
一方面，本发明提供了通过施用环境影响剂治疗肉瘤的方法。“环境影响剂”(Env-影响剂)是以有利的方式影响或调节人的疾病环境从而使人类的疾病环境转换、重建或维持正常的或健康的环境以导致正常状态的分子。Env-影响剂包括如下所定义的多维细胞内分子(MIM)和外代谢转换剂(外-转换剂)。Env-影响剂、MIM和外-转换剂被更详细地描述于美国专利申请序列号12778,094、美国专利申请序列号12/777,902、美国专利申请序列12/778,029、美国专利申请序列号12/778,054和美国的专利申请编号12/778,010，其中各个参考文献的全文在本文中通过引用引入。
1、多维细胞内分子(MIM)
术语“多维细胞内分子(MIM)”是由身体自然地产生的和/或存在于至少一个人类细胞中的内源性分子的分离形式或合成地产生的形式。MIM能够进入细胞中，所述进入细胞包括完全的或部分的进入细胞中，只要该分子的生物活性部分完全地进入细胞。MIM能够诱导细胞内的信号转导和/或基因表达机制。MIM是多维的，因为该分子同时具有治疗的和载体的(如药物递送)效果。MIM是多维的，还因为该分子在疾病状态下以一种方式和在正常的状态下以不同的方式起作用。例如，在辅酶Q-10的情况下，在存在VEGF的情况下向黑色素瘤细胞施用辅酶Q-10导致了Bcl2的水平下降，这相应地导致黑色素瘤细胞的致癌潜力下降。相反地，在正常的成纤维细胞中，辅酶Q-10和VEFG联合施用对Bcl2的水平没有影响。
在一个实施方式中，MIM也是外-转换剂。在另一个实施方式中，MIM不是外-转换剂。在另一个实施方式中，MIM特征在于具有一种或多种上述功能。在另一个实施方式中，MIM特征在于具有两种或更多种的上述功能。在进一步的实施方式中，MIM特征在于具有三种或更多种的上述功能。在再另一个实施方式中，MIM特征在于具有所有的上述功能。熟练的技术人员可以理解，本发明的MIM也意在包括两种或更多的内源性分子的混合物，其中该混合物特征在于具有一种或多种上述功能。混合物中的内源性分子以使得该混合物起到MIM的功能的比例存在。
MIM可以是脂基分子或非脂基分子。MIM的例子包括，但不限于，辅酶Q10、乙酰辅酶A、棕榈酰辅酶A、L-肉毒碱、氨基酸例如，酪氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸。在一个实施方式中，MIM是小分子。在本发明的一个实施方式中，MIM不是辅酶Q10。使用本文中详细描述的任何分析方法，本领域技术人员可以常规地鉴别MIM。
(i)鉴别MIM的方法
本发明提供了鉴别MIM的方法。用于鉴别MIM的方法一般地包括向细胞添加及评价内源性分子提供的对细胞的影响，例如细胞微环境特性。在细胞、mRNA、蛋白质、脂质和/或代谢物的水平中的一个或更多评价对细胞的影响以确认细胞微环境特性的改变评估。在一个实施方式中，该细胞是培养的细胞，如体外培养。在一个实施方式中，该细胞存在于有机体中。内源性分子可以以单一的浓度添加到细胞中或可以以一个浓度范围添加到细胞中。在一个实施方式中，内源性分子添加到细胞中以使得细胞中内源性分子的水平比对照的未经治疗的细胞中内源性分子的水平提高(例如，提高了1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或更高)的方式将内源性分子加入到细胞。
如通过例如形态学、生理学和/或组成(例如mRNA、蛋白质、脂质、代谢物)中的任何一个或多个的改变检测的，诱导细胞变化的分子可以被进一步地评价以确定疾病细胞状态和正常细胞状态之间的诱导的细胞微环境特征的变化是否不同。可以评价多样组织起源、细胞类型或疾病状态的细胞(例如，细胞培养系)以进行对照评价。例如，可以对比癌细胞的细胞微环境特性中诱导的变化和非癌的细胞或正常的细胞诱导的变化。被观察到在细胞的微环境特性中诱导变化(例如，诱导细胞的形态学、生理学和/或组成例如，mRNA、蛋白质、脂质或代谢物的变化)和/或与正常细胞相比差异(或优先)诱导患病细胞的细胞微环境特性的变化的内源性分子被确认为MIM。
本发明的MIM可以是脂基MIM或非脂基MIM。鉴别脂基MIM的方法包括基于上述细胞的方法，其中脂基内源性分子外源地添加到细胞中。在优选的实施方式中，以细胞中脂基内源性分子的水平升高的方式将脂基内源性分子添加到细胞中。在一个实施方式中，脂基内源性分子的水平比对照的未经治疗的细胞的水平提高了1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或更多。脂基分子的制剂和到细胞的递送取决于各测试分子的属性，但许多方法是本领域中已知的。脂基分子的制剂和递送的例子包括但不限于，共溶剂的增溶、载体分子、脂质体、分散体、悬浮液、纳米颗粒分散体、乳剂如水包油或油包水型乳剂、多相乳剂如油包水包油型乳剂、聚合物包埋和包覆。脂基MIM递送到细胞中可以通过细胞脂质的提取确认和通过用本领域中已知的常规方法，如质谱，进行MIM的定量。
用于鉴别非脂基MIM的方法包括基于上述细胞的方法，其中将非脂基内源性分子外源地添加到细胞中。在优选的实施方式中，以细胞中非脂基内源性分子的水平升高的方式将非脂基内源性分子添加到细胞中。在一个实施方式中，非脂基内源性分子的水平比未经治疗的对照细胞的水平提高了1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或更多。非脂基分子的制剂和对细胞的递送取决于各测试分子的属性，但许多方法是本领域中已知的。非脂基分子的制剂和递送方式的例子包括但不限于，通过共溶剂的增溶、载体分子、主动转运、聚合物包埋和吸附、聚合物接枝、脂质体包封和具有靶向递送系统的制剂。非脂基MIM递送到细胞中可以通过细胞内容物的提取确认和用本领域中已知的常规方法，如质谱，进行MIM的定量。
2、外代谢转换剂(外-转换剂)
本文所用的“外代谢转换剂”(外-转换剂)是调节从健康的(或正常的)状态向疾病的状态及相反的代谢转换从而维持或重建人体中细胞、组织、器官、系统和/或宿主健康的分子。外-转换剂能够实现组织微环境的正常化。例如，外-转换剂包括当添加到细胞中或从细胞耗除时能够影响细胞微环境(例如，代谢状态)的任何分子。熟练的技术人员都了解，本发明的外-转换剂还意在包括两种或更多种分子的混合物，其中该混合物特征在于具有一种或多种上述功能。混合物中的分子以使得混合物起到外-转换剂的功能的比例存在。外-转换剂的例子包括但不限于，辅酶Q-10、维生素D3、ECM成分如纤维连接蛋白、免疫调节剂如TNFα或任何白细胞介素如IL-5、IL-12、IL-23、血管生成因子和细胞凋亡因子。
在一个实施方式中，外-转换剂也是MIM。在一个实施方式中，外-转换剂不是辅酶Q10。本领域的技术人员使用在本文中详细描述的任何分析方法可以常规地鉴别外-转换剂。
(i)鉴别外-转换剂的方法
外代谢转换剂(外-转换剂)是能够调节细胞的代谢状态，例如，诱导从健康的(或正常的)状态向疾病的状态及相反的代谢转换，从而能够维持或重建人体中细胞、组织、器官、系统、和/或宿主健康的分子。因此本发明的外-转换剂具有疾病状态的诊断评估的作用。本发明的外-转换剂还具有治疗应用的用途，其中外-转换剂的应用或施用(或通过其它治疗分子的外-转换剂的调节)影响组织微环境和疾病状态的正常化。
一般地，鉴别外代谢转换剂包括对于显示不同的疾病状态、发展或侵袭性的一组细胞或组织建立例如代谢产物、脂类、蛋白质或RNA的分子谱(以单个谱或组合的方式)。来自其水平的变化(例如，提高或降低的水平)与疾病状态、发展或侵袭性相关的的谱中的分子被确定为潜在的外-转换剂。
在一个实施方式中，外-转换剂也是MIM。通过使用本领域已知的多种常规技术和通过使用本文所述的任何方法，可以评价潜在的外-转换剂在外源性添加到细胞中时进入细胞的能力。例如，潜在的外-转换剂进入细胞中可以通过细胞内容物的提取确认和用本领域中周知的常规方法，如质谱，定量。因此，能够进入细胞的潜在的外-转换剂被确定为MIM。
为了鉴别外-转换剂，接下来评价潜在的外-转换剂转换细胞的代谢状态的能力。通过向细胞引入(例如，外源地添加)潜在的外-转换剂和监测细胞中基因表达的变化(例如，mRNA中或蛋白质表达的变化)、脂质或代谢物水平的浓度变化、生物能量分子水平的变化、细胞能量学的变化和/或线粒体功能或数量的变化中的一种或多种来评估潜在的外-转换剂转换细胞微环境的代谢状态的能力。本领域的技术人员可以使用在本文中详细描述的任何分析方法常规地鉴别能够转换细胞微环境代谢状态的潜在的外-转换剂。进一步评价潜在的外-转换剂将患病细胞的代谢状态转换为正常的健康状态的能力(或相反地，将正常的细胞的代谢状态转换为患病状态的能力)。因此能够将患病细胞的代谢状态转换为正常的健康状态(或能够将健康的正常细胞的代谢状态转换为患病的状态)的潜在的外-转换剂被确定为外-转换剂。在优选的实施方式中，外-转换剂对正常细胞的健康和/或生长不产生负面的影响。
本发明的外代谢转换剂包括，但不限于，小分子代谢物、脂基分子以及蛋白质和RNA。为了鉴别小分子的内源性代谢物类中的外代谢转换剂，建立了显示不同的疾病状态、发展或侵袭性的细胞或组织的组的代谢物谱。通过从细胞或组织中提取代谢物和然后使用熟练技术人员已知的常规方法，包括例如，液相色谱耦合质谱或气相色谱耦合质谱方法，鉴别和定量该代谢物来确定各细胞或组织的代谢物谱。其水平的变化(例如，提高或降低的水平)与疾病状态、进展或侵袭性相关的代谢物被确定为潜在的外-转换剂。
为了鉴别内源性脂基分子类中的外代谢转换剂，建立了显示不同的疾病状态、发展或侵袭性的细胞或组织的组的脂质谱。通过使用脂质提取方法，然后使用熟练的技术人员已知的常规方法，包括例如，液相色谱耦合的质谱或气相色谱耦合的质谱方法，鉴别和定量该脂质来确定各细胞或组织的脂质谱。水平的变化(例如，大量的或痕量的水平的提高或降低)与疾病状态、进展或侵袭性相关的脂质被确定为潜在的外-转换剂。
为了鉴别蛋白质和RNA类中的外代谢转换剂，建立了显示不同的疾病状态、发展或侵袭性的细胞或组织的组的基因表达谱。使用标准的蛋白质谱、mRNA阵列或基因组阵列方法，例如，如本文中详细描述的方法，在mRNA和/或蛋白水平测定各细胞或组织的表达谱。其表达的变化(例如，mRNA和/或蛋白质水平的表达提高或降低)与疾病状态、进展或侵袭性相关的基因被确定为潜在的外-转换剂。
当上述的分子谱被建立(例如，对于水溶性代谢物、脂基分子、蛋白质、RNA或其它的生物类组合物)时，进行细胞的和生物化学途径的分析以阐明细胞环境中确定的潜在的外-转换剂之间的已知联系。可以利用通过该细胞和/或生化途径分析所获得的这种信息将途径和潜在的外-转换剂分类。
本领域的技术人员可以使用本领域已知的或者本文详细描述的多种分析方法进一步评价和确认外-转换剂调节疾病状态的功用。可以通过将外-转换剂直接地外源递送到细胞或有机体中评估外-转换剂调节疾病状态的功用。可通过直接调节外-转换剂(例如，外-转换剂的水平或活性)的分子的发生替代地评价外-转换剂调节疾病状态的功用。还可以通过通过调节处于与外-转换剂相同的途径中的其它分子，如基因(例如，在RNA或蛋白质水平调节)，而间接调节外-转换剂(例如，外-转换剂的水平或活性)的分子的发生的评估外-转换剂调节疾病状态的功用。
本文所述的Epimetabolomic(外代谢)途径有助于鉴别在细胞微环境中存在的且其水平通过基因的、mRNA或基于蛋白质的机制起作用和控制的内源性分子。本发明的外-转换剂触发的正常细胞中存在的调节反应途径可以在失调的或者患病的细胞环境中提供治疗价值。另外，本文所述的外代谢途径鉴别可以提供用于临床病人的选择、疾病诊断试剂盒中的诊断指示的或作为预后指示的外-转换剂。
三、用于鉴别MIM/外-转换剂的分析方法
本发明用来分离和鉴别目的分子和化合物的技术和方法包括但不限于：液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)、气相色谱(GC)、液相色谱/质谱(LC-MS)、气相色谱/质谱(GC-MS)、核磁共振(NMR)、磁共振成像(MRI)、傅立叶变换红外法(FT-IR)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)。需要进一步了解的是，质谱技术包括，但不限于，使用磁式扇形和双聚焦仪、传输四极器、四极离子阱器、飞行时间仪(TOF)、傅里叶变换离子回旋共振仪(FT-MS)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。
生物能分子水平的定量：
可以通过候选的外-转换剂所应用的细胞的细胞生物能量分子水平(例如，ATP、丙酮酸、ADP、NADH、NAD、NADPH、NADP、乙酰CoA、FADH2)的变化鉴别环境影响剂(例如，MIM或外-转换剂)。生物能量分子水平的典型分析法使用比色法、荧光法和/或基于生物发光的方法。下面提供了这类分析法的例子。
可以用本领域已知的多种分析方法和系统测量细胞内的ATP水平。例如，在一个系统中，从裂解的细胞释放的胞质ATP与荧光素和荧光素酶反应以产生光。用生物发光仪测量这一生物发光和可以计算裂解细胞的细胞内ATP浓度(EnzyLightTM ATP分析试剂盒(EATP-100)，BioAssay Systems，Hayward，CA)。在另一个系统中，例如，通过生物发光计算ATP及其去磷酸化形式，ADP；计算ATP水平后，ADP被转化成ATP且然后使用相同的荧光素酶系统(ApoSENSORTM ADP/ATP比分析试剂盒，BioVision公司，MountainView，CA)检测和计算。
丙酮酸是细胞代谢途径中重要的中间体。丙酮酸可以经由糖原异生被转化成糖，经由乙酰辅酶A转化成脂肪酸或者被代谢或转化为丙氨酸或乙醇，取决于细胞的代谢状态。因此丙酮酸水平的检测提供了对细胞样品的代谢活性和状态的测量。一个检测丙酮酸的分析方法例如使用比色法和荧光测定法检测不同范围内的丙酮酸浓度(EnzyChromTM丙酮酸检测试剂盒(Cat#EPYR-100)，BioAssaySystems，Hayward，CA)。
环境影响剂(例如，MIM或外-转换剂)可以影响细胞中线粒体完成的氧化磷酸化过程，其涉及细胞中生物能量分子的产生和维持。除了直接地检测在细胞培养物和样品中细胞能量学变化的分析方法(如下所述)外，还存在检测和定量化合物对细胞中的离散的酶和线粒体复合物的影响的分析方法。例如，对MT-OXC MitoToxTM完全OXPHOS活性分析(MitoSciences公司，Eugene，OR)可以检测和定量直接应用于从线粒体中提取的复合物I至V的化合物的影响。也可以得到检测和定量对单个线粒体复合物，如NADH脱氢酶(复合体I)、细胞色素c氧化酶(复合体IV)和ATP合成酶(复合体V)的影响的分析方法(MitoSciences公司，Eugene，OR)。
细胞能量学测量：
也可以通过细胞能量学的变化鉴别环境影响剂(例如，MIM或外-转换剂)。一个测量细胞能量学的例子是实时测量细胞氧的消耗和/或细胞培养基pH值的变化。例如，可以使用例如，XF24分析仪(Seahorse公司)分析潜在外-转换剂调节细胞的代谢状态的能力。这种技术允许实时检测细胞单层的氧和pH值的变化，以评估细胞微环境的生物能量学。XF24分析仪测量和比较氧消耗率(OCR)(其为有氧代谢的量度)和细胞外酸化率(ECAR)(其为糖酵解的量度)，两者都是细胞能量学的关键指示物。
氧化磷酸化和线粒体功能的测量
氧化磷酸化是经由营养化合物的氧化(其通过嵌在线粒体膜中的蛋白质复合体在真核细胞中完成)产生ATP的过程。作为大多数生物体的细胞中ATP的主要来源，氧化磷酸化活性的变化可以强烈地改变细胞内的新陈代谢和能量平衡。在本发明的一些实施方式中，环境影响剂(例如，MIM或外-转换剂)可以通过其对氧化磷酸化的作用被检测和/或鉴别。在一些实施方式中，环境影响剂(例如，MIM或外-转换剂)可以通过其对氧化磷酸化的特定方面，包括但不限于电子传递链和ATP合成，的作用被检测和/或鉴别。
实现氧化磷酸化中涉及的过程的线粒体的膜嵌入蛋白质复合体执行特定的任务，并被编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。这些复合体以及跨-内膜ATP合成酶(也被称为复合体V)是氧化磷酸化过程中所涉及的关键实体。除了可以检测环境影响剂(例如，MIM或外-转换剂)一般地对线粒体功能和特别地对氧化磷酸化过程的影响的分析方法，还可获得能够被用于检测外-转换剂对与其它复合体分离的单个复合体的影响的分析方法。
复合体I，又被称为NADH-辅酶Q氧化还原酶或NADH脱氢酶，是电子传递链中的第一个蛋白质。在一些实施方式中，可检测和定量外-转换剂对通过复合体I产生NAD+的影响。例如，可以从96孔板中的样品免疫捕获该复合体；NADH氧化为NAD+与在450nM具有增强吸收的染料分子的还原同时地发生(复合体I酶活性微孔板检测试剂盒，MitoSciences公司，Eugene，OR)。
复合体IV，也被称为细胞色素c氧化酶(COX)，是电子传递链中的最后一个蛋白质。在一些实施方式中，可检测和定量外-转换剂对通过复合体IV的细胞色素c的氧化和氧还原为水的影响。例如，COX可以在微孔板中免疫捕获和用比色分析法测量COX的氧化(复合体IV酶活性微孔板检测试剂盒，MitoSciences公司，Eugene，OR)。
在氧化磷酸化过程中的最后一个酶是ATP合成酶(复合体V)，其利用由其它复合体产生的质子梯度以为从ADP合成ATP提供动力。在一些实施方式中，可以检测和定量外-转换剂对ATP合成酶活性的影响。例如，对于已经在微孔板孔中被免疫捕获的ATP合成酶，可以测量ATP合成酶的活性和样品中ATP合成酶的量。这种酶还可以在一定条件下起到ATP酶的作用，因此在对于ATP合成酶活性的该分析中，ATP被还原为ADP的速率通过检测同时发生的NADH至NAD+的氧化测量。使用ATP酶的标记抗体(ATP合成酶双工(活性+数量)微孔板检测试剂盒，MitoSciences公司，Eugene，OR)计算ATP的量。用于氧化磷酸化的其它分析包括测试复合体II和III活性的影响的分析方法。例如，MT-OXC MitoToxTM完全OXPHOS系统(MitoSciences，公司Eugene，OR)可被用来评估化合物对复合物II和复合物III以及复合物I、IV和V的影响，以提供有关化合物对整个氧化磷酸化系统的影响的数据。
如上所述，可以使用探针进行完整细胞样品的实时观察以确定细胞培养基中氧消耗和pH值的变化。这些细胞能量学的分析方法提供了线粒体功能和潜在的环境影响剂(如MIM或外-转换剂)对样品的细胞内线粒体活性的影的广泛观察。
环境影响剂(如MIM或外-转换剂)也可以影响线粒体通透性转换(MPT)，这是其中由于形成了线粒体通透性转换孔(MPTP)而导致线粒体膜发生通透性增加的现象。线粒体通透性的增加可导致线粒体膨胀、进行氧化磷酸化和ATP生成的能力丧失及细胞死亡。MPT可能涉及细胞凋亡的诱导(见，例如，Halestrap，A.P.，Biochem.Soc.Trans.34：232-237(2006)和Lena，A.等Journal of Translational Med.7：13-26(2009)，本文以其全文通过引用引入)。
在一些实施方式中，检测和定量环境影响剂(如MIM或外-转换剂)对MPT和MPTP的形成、中止和/或效应的影响。例如，分析方法可以通过使用定位于线粒体内膜和其它胞质空间内的专门染料分子(钙黄绿素)检测MPT。另一种分子，CoCl2，的应用起到抑制细胞质中钙黄绿素染料的荧光的作用。但是，CoCl2不能进入线粒体的内部，因此线粒体内的钙黄绿素荧光不受抑制，除非MPT已发生和CoCl2可以经由MPTP进入线粒体的内部。丧失线粒体特异性荧光表明MPT已发生。可以用流式细胞法评估细胞的和细胞器的荧光(MitoProbeTM转换孔分析试剂盒，Molecular Probes，Eugene，OR)。另外的分析方法将荧光显微镜用于评估实验结果(Image-iTTM LIVE线粒体转换孔分析试剂盒，Molecular Probes，Eugene，OR)。
细胞增殖和炎症的测量
在本发明的一些实施方式中，可通过其对与细胞增殖和/或炎症相关的分子的产生和活性的影响鉴别和评价环境影响剂(如MIM或外-转换剂)。这些分子包括，但不限于，细胞因子、生长因子、激素、细胞外基质的成分、趋化因子、神经肽、神经递质、神经营养因子和其它参与细胞信号传导的分子，以及细胞内的分子如那些涉及信号转导的分子。
血管内皮生长因子(VEGF)是具有强力的血管生成、血管发生和促有丝分裂特性的生长因子。VEGF刺激内皮通透性和膨胀且VEGF活性涉及许多疾病和失调，包括类风湿性关节炎、转移癌、年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病。
在本发明的一些实施方式中，可以通过其对VEFG产生的影响鉴别和表征环境影响剂(如MIM或外-转换剂)。例如，保持在低氧条件下或模拟酸中毒条件下的细胞会表现出增加的VEGF产生。使用ELISA或其它基于抗体的分析利用可得的抗VEGF抗体(R&DSystems，Minneapolis，MN)，可检测分泌到培养基中的血管内皮生长因子。在本发明的一些实施方式中，可以基于其在细胞对VEGF的响应性上的影响和/或基于其对VEGF受体的表达或活性的影响鉴别和/或表征环境影响剂。
涉及到健康免疫系统功能以及自身免疫性疾病，肿瘤坏死因子(TNF)是炎症和免疫系统激活的重要介质。在本发明的一些实施方式中，可以通过其对TNF的产生和活性的影响鉴别和表征外-转换剂。例如，通过培养的细胞产生并分泌到培养基中的TNF可以通过ELISA和本领域中已知的其它基于抗体的分析方法定量。此外，在一些实施方式中，可以通过其对TNF的受体的表达的影响鉴别和表征环境影响剂(Human TNF RI Duoset、R&D系统、Minneapolis、MN)。
细胞外基质(ECM)的成分在细胞和组织的结构中和信号传导过程中都发挥作用。例如，潜在的转化生长因子β结合蛋白是在ECM内产生转化生长因子β(TGFβ)库的ECM成分。基质结合的TGFβ可以在基质重建的过程中随后释放，并可以对附近的细胞发挥生长因子的作用(Dallas，S.Methods in Mol.Biol.139：231-243(2000))。
在一些实施方式中，可以通过其对培养的细胞产生ECM的影响鉴别和表征环境影响剂(如MIM或外-转换剂)。研究人员已经开发了通过其可以研究和定量细胞的ECM产生以及ECM的组成的技术。例如，可以通过在孵育前将细胞嵌入水凝胶中评估细胞的ECM合成。在水凝胶的细胞收获和消化后，对细胞产生的ECM进行生化分析和其它分析(Strehin，I.和Elisseeff，J.Methods in Mol.Bio.522：349-362(2009))。
在一些实施方式中，环境影响剂(如MIM或外-转换剂)对有机体中ECM或其成分之一的产生、状态或缺乏的影响可以被确定或表征。已经开发了产生条件性基因敲除(KO)小鼠的技术，其使得能够仅在离散的细胞类型中或在特定的发育阶段敲除特定的ECM基因(Brancaccio，M.等，Methods in Mol Bio.522：15-50(2009))。因此可以评估外-转换剂或潜在的外-转换剂的应用或者施用对特定组织中的或特定发育阶段的特定ECM成分的活性或者缺失的影响。
质膜完整性和细胞死亡的测量
可通过细胞样品的质膜完整性的改变和/或通过发生细胞凋亡、坏死的细胞数目或比例的改变或表明提高或降低细胞死亡的可能性的细胞变化鉴别环境影响剂(例如，MIM或外-转换剂)。
对乳酸脱氢酶(LDH)的测定可以提供细胞状态和损伤程度的测量。LDH是稳定的和相对丰富的细胞质酶。当质膜失去了物理完整性，LDH逸出至细胞外空间。高浓度的LDH与较高水平的质膜损伤和细胞死亡相关。LDH分析的例子包括使用比色系统检测和定量样品中LDH水平的分析，其中四唑盐的还原形式经由LDH酶(QuantiChromTM乳酸脱氢酶试剂盒(DLDH-100)，BioAssay Systems，Hayward，CA；LDH细胞毒性检测试剂盒，Clontech，Mountain View，CA)的活性而产生。
细胞凋亡是可能具有各种不同的启动事件的程序性细胞死亡的过程。很多分析方法可以检测发生凋亡的细胞的比率和/或数目的变化。一种类型的用于检测和定量细胞凋亡的分析方法是半胱天冬酶分析。半胱天冬酶是细胞凋亡过程中经由蛋白裂解激活的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。检测激活半胱天冬酶的分析方法的实例包括PhiPhiLux(OncoImmunin公司，Gaithersburg，MD)和Caspase-GLO
Figure BPA00001530185500382
3/7分析系统(Promega公司，Madison，WI)。可以检测比较样品中细胞凋亡和经历细胞凋亡的细胞的百分比或数目的变化的其它分析方法包括TUNEL/DNA片段分析。这些分析法检测在细胞凋亡的执行阶段中由核酸酶产生的180至200碱基对的DNA片段。典型的TUNEL/DNA片段分析包括原位细胞死亡分析试剂盒(Roche AppliedScience，Indianapolis，IN)和DeadEnTM比色和荧光TUNEL系统(Promega公司，Madison，WI)。
有些细胞凋亡分析法检测和定量与细胞凋亡和/或非细胞凋亡状态相关的蛋白质。例如，在MultiTox-Fluor多重毒性分析(Promega公司，Madison，WI)使用单一底物、荧光系统以检测和量化活的和死的细胞特异性的蛋白酶，从而提供了活细胞和细胞或组织样品中已经发生细胞凋亡的细胞的比例。
可用于检测和定量细胞凋亡的另外的分析方法包括检测细胞的通透性的分析(例如，APOPercentageTM APOPTOSIS分析，Biocolor，UK)和膜联蛋白V的分析(例如，膜联蛋白V-生物素细胞凋亡检测试剂盒，BioVision公司，Mountain View，CA)。
四、肉瘤的治疗
本发明提供了在人中治疗或预防肉瘤的方法，包括向该人施用足以治疗或预防肉瘤的量的环境影响剂，例如，MIM或EPI转换剂，例如，辅酶Q10分子(例如，辅酶Q10、辅酶Q10的组成部分、辅酶Q10的衍生物、辅酶Q10的类似物、辅酶Q10的代谢产物或辅酶生物合成途径的中间体)，从而治疗或预防肉瘤。在优选的实施方式中，治疗或预防人的肉瘤的方法包括向该人施用足以治疗或预防肉瘤的量的辅酶Q10分子，从而治疗或预防肉瘤。
本发明还提供了辅酶Q10的组合物和其制备方法。在一个实施方式中，本发明提供了辅酶Q10组合物和制备方法。优选地，该组合物包含至少约1％至约25％w/w的辅酶Q10。辅酶Q10可作为UBIDECARENONE(USP)从Asahi Kasei N&P(Hokkaido，日本)获得。辅酶Q10也可以从(Pasadena，Texas，USA)以粉状形式作为KanekaQ10(USP UBIDECARENONE)获得。本文例举的方法中使用的辅酶Q10具有以下特征：溶剂残留量符合USP 467的要求；含水量低于0.0％、低于0.05％或低于0.2％；灼烧残渣是0.0％、低于0.05％、或小于0.2％以内；重金属含量小于0.002％或小于0.001％；纯度在98-100％之间或99.9％、或99.5％。此处提供制备组合物的方法。
本文所用的术语或语言“肿瘤疾病”、“癌症”、“瘤”和“肿瘤”可互换地使用，且无论是单数形式或复数形式，是指已经发生了恶变(其引起宿主生物体病态)的细胞。通过良好确认的技术，特别是病理检查，可以很容易地区分原发癌细胞(即，从恶变位点附近获得的细胞)和非癌性细胞。本文所使用的癌细胞的定义不仅包括原发癌细胞，而且包括癌症干细胞，以及癌症祖细胞或从癌细胞的原型衍生的任何细胞。这包括转移的癌细胞，及源自癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及通常显示为实体肿瘤的癌症类型时，“临床可检测的”肿瘤是以肿瘤团块为基础可检测的肿瘤，例如通过如CAT扫描、磁共振成像、X射线、超声波或触诊的程序，和/或因为在从患者获得的样品中一个或多个癌症特异性抗原的表达而可检测的。
术语“肉瘤”一般地指类似胚胎结缔组织的物质组成的且一般地由嵌入在纤丝或同质物质中的紧密包装的细胞构成的肿瘤。可以用本发明的环境影响剂治疗的肉瘤的例子包括，但不限于，尤文氏族肿瘤(如尤文氏肉瘤(亦称作尤文氏骨肿瘤)、骨外尤文氏肉瘤(EOE)和外周原发神经外胚层肿瘤(PPNET))、软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、造釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、肾母细胞瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质性肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤，纤维母细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤(idiopathicmultiple pigmented hemorrhagic sarcoma)、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、Jensen肉瘤、卡波济氏肉瘤、枯氏细胞肉瘤、血管肉瘤、白色肉瘤、恶性间叶肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、Rous肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细管扩张性肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。
因此，在一个实施方式中，本发明的治疗或预防的方法包括治疗或预防选自于尤文氏肉瘤、骨外尤文氏肉瘤(EOE)、外周原发神经外胚层肿瘤(PPNET)和Askin肿瘤组成的组中的肉瘤。在一个实施方式中，所述肉瘤是尤文氏肉瘤。在一个实施方式中，所述肉瘤是EOE。在一个实施方式中，所述肉瘤是PPNET。在一个实施方式中，所述肉瘤是Askin肿瘤。
在一些实施方式中，肉瘤特征在于缺乏细胞凋亡。在另外的实施方式中，肉瘤以增强的血管生成为特征。在另外的实施方式中，肉瘤以细胞外基质(ECM)降解为特征。在再另外的实施方式中，肉瘤以缺少细胞周期调控为特征。还在另外的实施方式中，肉瘤以代谢调控从线粒体氧化磷酸化转换为更多利用和/或依赖乳酸和糖酵解流为特征。在进一步的实施方式中，肉瘤以逃过免疫监视的适应性免疫调节机制为特征。在一个实施方式中，肉瘤特征在于具有至少两个上述的特征，例如，增强的血管生成和ECM降解。在一个实施方式中，肉瘤特征在于具有至少三个上述特征。在一个实施方式中，肉瘤特征在于具有至少四个上述特征。在一个实施方式中，肉瘤特征在于具有至少五个上述特征。在一个实施方式中，肉瘤特征在于具有所有六个上述特征。
因此，在一些实施方式中，本发明的辅酶Q10分子通过恢复细胞凋亡或诱导细胞凋亡的能力而起作用。在另外的实施方式中，本发明的辅酶Q10分子通过减少、降低或抑制血管生成起作用。在再另外的实施方式中，本发明的辅酶Q10分子通过恢复重建的细胞外基质起作用。在另外的实施方式中，本发明的辅酶Q10分子通过恢复细胞周期调控起作用。在再另外的实施方式中，本发明的辅酶Q10分子通过将代谢调控从糖酵解转换回线粒体氧化磷酸而起作用。在进一步的实施方式中，本发明的辅酶Q10分子通过恢复免疫监视或恢复机体识别癌细胞为异物的能力而起作用。
不希望被任何特定的理论约束，据认为通常地存在协调的级联事件，其集合以发展成癌症，如肉瘤。也就是说，在一些实施方式中，癌症，如肉瘤，不是单一地依赖于1基因-1蛋白质-基本因果关系。在一些实施方式中，癌症，如肉瘤，是表现为组织变化和改变(其变成肿瘤、改变的组织状态如能量学、导致转移可能的细胞外基质完整性的破坏、免疫监视的缺失和/或改变的血管生成状态)的生理疾病状态。
通过良好建立的技术，特别是组织学检查，原发性癌症细胞，例如，原发性肉瘤细胞(即从恶变的位点附近获得的细胞)，可以很容易地区别于非癌性细胞。此处所用的癌细胞的定义，不仅包括原发性癌细胞，而且还包括癌症干细胞，以及癌症祖细胞或从源自原始癌细胞的任何细胞。这包括转移的癌细胞，及源自癌细胞的体外培养和细胞系。当提及通常显示为实体肿瘤的癌症类型时，“临床可检测的”肿瘤是基于肿瘤团块可检测的肿瘤，例如通过如CAT扫描、磁共振成像、X射线、超声波或触诊的程序，和/或因为在从患者获得的样品中表达一种或多种癌症特异性抗原而可检测的。
在一些实施方式中，本发明的化合物，如本发明的辅酶Q10分子，可在需要的受试者中用于治疗辅酶Q10反应性肉瘤。词语“辅酶Q10反应性肉瘤”或“CoQ10反应性肉瘤”包括可以通过施用辅酶Q10被治疗、预防或以另外的形式改善的肉瘤。不希望被任何特定的理论约束和如本文进一步所述的，辅酶Q10被认为，至少部分地，通过诱导细胞微环境的代谢转换，如向正常状态细胞中的氧化磷酸化类型和/或水平的转换，起作用。因此，在一些实施方式中，辅酶Q10反应性肉瘤是由改变的细胞微环境代谢产生的肉瘤。辅酶Q10反应性肉瘤包括，例如，可以偏向于糖酵解和乳酸生物合成的肉瘤。
一般来说，辅酶Q10分子(如CoQ10、辅酶Q10的组成部分、辅酶Q10的衍生物、辅酶Q10的类似物、辅酶Q10的代谢产物或辅酶的生物合成途径的中间产物)可用于预防性地或治疗性地治疗任何肿瘤。在一个实施方式中，辅酶Q10分子被用于治疗或预防肉瘤。在一个实施方式中，辅酶Q10分子被用于尤文氏族肿瘤的治疗。在一个实施方式中，尤文氏族肿瘤是尤文氏肉瘤。
此处所用的癌细胞的定义意在包括通过无氧糖酵解(例如，细胞质中跟随乳酸发酵的糖酵解)、有氧糖酵解(例如，线粒体中跟随丙酮酸氧化的糖酵解)或无氧酵解和有氧糖酵解的组合产生能量的癌细胞。在一个实施方式中，癌细胞主要通过无氧糖酵解产生能量(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞的能量由无氧酵解产生)。在一个实施方式中，癌细胞主要由有氧糖酵解产生能量(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞能量由无氧酵解产生)。此处所用的癌细胞的定义也意在包括癌细胞群或者包含通过无氧酵解产生能量的细胞和通过有氧糖酵解产生能量的细胞的癌细胞混合物。在一个实施方式中，癌细胞群主要包含通过无氧糖酵解产生能量的细胞(例如，细胞群中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞通过无氧酵解产生能量)。在一个实施方式中，癌细胞群主要包含通过有氧糖酵解产生能量的细胞(例如，细胞群中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的细胞)。
这里所用的短语“葡萄糖的厌氧利用”或“无氧糖酵解”是指通过细胞质中的乳酸发酵跟随的糖酵解的细胞能量产生。例如，许多癌细胞通过无氧糖酵解产生能量。
这里所用的短语“有氧糖酵解”或“线粒体氧化磷酸化”是指通过线粒体中的丙酮酸氧化的糖酵解的细胞能量产生。
这里所用的短语“能阻断葡萄糖的厌氧利用和增强线粒体氧化磷酸化”是指环境影响剂(例如，外代谢转换剂)诱导细胞的代谢状态从厌氧糖酵解转换或改变为有氧糖酵解或线粒体氧化磷酸化的能力。
在本发明的一些实施方式中，被治疗的肉瘤不是通常经由局部施用治疗的失调，而是预期以治疗有效水平系统递送活性剂。此处所用的短语“不是通常经由局部施用治疗的失调”指不是通常地或者常规地通过局部施用治疗剂来治疗的肉瘤，而是通常通过例如静脉内施用治疗剂治疗的肉瘤。
本发明还提供了用于治疗或预防人的侵袭性肿瘤障碍的方法，包括以选定的与为较低侵袭性的或非侵袭性的肿瘤障碍使用的或选择的给药方案相比更低的剂量向人施用辅酶Q10分子(如，CoQ10、CoQ10的组成部分、CoQ10的衍生物、CoQ10的类似物、CoQ10的代谢物或辅酶生物合成途径的中间体)，从而治疗或预防侵袭性的肿瘤疾病。在相关的方面，本发明提供了一种用于治疗或预防人的非侵袭性的肿瘤障碍的方法，包括以选定的与用于侵袭性的肿瘤障碍的或选择的给药方案相比更高的剂量向人施用环境影响剂，从而治疗或预防非侵袭性的肿瘤障碍。
本文中所使用的术语“侵袭性的肿瘤障碍”指涉及快速增长的肿瘤的肿瘤障碍。侵袭性的肿瘤障碍通常对治疗处理没有反应或反应不佳。侵袭性肿瘤障碍的例子包括，但不限于，胰腺癌、肝癌、尤文氏肉瘤、转移性乳腺癌、转移性黑色素瘤、脑癌(星形细胞瘤、胶质母细胞瘤)、神经内分泌癌、结肠癌、肺癌、骨肉瘤、雄激素非依赖性前列腺癌、卵巢癌和非何杰金氏淋巴瘤。
这里所用的术语“非侵袭性的肿瘤障碍”指涉及缓慢生长的肿瘤的肿瘤障碍。非侵袭性的肿瘤障碍通常对治疗处理有利地反应或适度地反应。非侵袭性肿瘤障碍的例子包括，但不限于，非转移性乳腺癌、雄激素依赖性前列腺癌、小细胞肺癌和急性淋巴细胞性白血病。在一个实施方式中，非侵袭性的肿瘤障碍包括任何不是侵袭性肿瘤障碍的肿瘤障碍。
本发明还提供了用于破坏人的肉瘤细胞中的骨架结构的方法，包括选择患肉瘤的人类受试者，和向所述人施用治疗有效量的辅酶Q10分子(如，CoQ10、CoQ10的组成部分、CoQ10的衍生物、CoQ10的类似物、CoQ10的代谢物或辅酶生物合成途径的中间体)，从而破坏人的肉瘤细胞的细胞骨架结构。在一个实施方式中，这种方法涉及上调一种或多种细胞骨架的基因或蛋白质的表达。
在一个实施方式中，辅酶Q10分子(如，CoQ10、CoQ10的组成部分、CoQ10的衍生物、CoQ10的类似物、CoQ10的代谢物或辅酶生物合成途径的中间体)减小肿瘤的大小，抑制肿瘤的生长和/或延长荷瘤受试者的生存时间。因此，本发明还涉及在人类或其它动物中通过向该人或动物施用有效的、非毒性量的辅酶Q10分子(如，CoQ10、CoQ10的组成部分、CoQ10的衍生物、CoQ10的类似物、CoQ10的代谢物或辅酶生物合成途径的中间体)治疗肿瘤的方法。本领域的技术人员能够通过常规的实验确定什么样的有效的非毒性量用于治疗恶性肿瘤的目的。例如，治疗活性量的辅酶Q10分子(如，CoQ10、CoQ10的组成部分、CoQ10的衍生物、CoQ10的类似物、CoQ10的代谢物或辅酶生物合成途径的中间体)可根据例如受试者的疾病阶段(如一期对四期)、年龄、性别、医学并发症(如免疫抑制状态或疾病)和体重及辅酶Q10分子在受试者中引起所需的反应的能力的因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以每日施用数个分剂量，或可以根据治疗情况的紧急状态所表明的成比例地减小剂量。
在一个实施方式中，局部地应用辅酶Q10分子，如CoQ10，每24小时一次或多次，持续六个星期或以上。
在一个实施方式中，以CoQ10乳膏的形式按每平方厘米的皮肤0.5至10毫克辅酶Q10分子的剂量施用辅酶Q10分子，如CoQ10，其中该CoQ10乳膏包含1％至5％之间的辅酶Q10。在一个实施方式中，该CoQ10乳膏包含大约3％的辅酶Q10。在一个实施方式中，以CoQ10乳膏的形式按每平方厘米的皮肤3至5毫克辅酶Q10的剂量施用辅酶Q10分子，其中该CoQ10乳膏包含1％至5％的辅酶Q10。在一个实施方式中，该CoQ10乳膏包含大约3％的辅酶Q10。
在上述治疗或预防方法的某些实施方式中，该方法用于调节选自于ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3AL9S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD65 67、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基、Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure BPA00001530185500451
结合抑制剂、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3、真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD、hnRNP C1/C2、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、LAMA5、PXLDC1、p300 CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160 200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRafpSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、肌球蛋白调节轻链、hnRNP C1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNPC1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、β-微管蛋白、三磷酸腺苷依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1β2、ER脂筏相关2同型体1(β肌动蛋白)、信号序列受体1δ、真核翻译起始因子3、亚基3γ、胆绿素还原酶A(转醛醇酶1)、角蛋白1，10(旁胸腺素)、GSTω1、B链多巴胺苯醌结合DJ-1、蛋白酶体激活剂Reg(α)、T-复合蛋白1同型体A、链A甲巯蛋白ERP57(含伴侣蛋白的TCP1)、泛素激活酶E1；丙氨酰-tRNA合成酶、动力蛋白激活蛋白1、热休克蛋白60kd、β肌动蛋白、亚精胺合成酶(β肌动蛋白)、热休克蛋白70kd、视网膜母细胞瘤结合蛋白4同型体A、TAR DNA结合蛋白、真核翻译延长因子1β2、含伴侣蛋白的TCP1、亚基3、胞质动力蛋白IC-2、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2、VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34cdc2、P53BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)、MRP1、MDC1、层粘连蛋白2a2、b联蛋白、FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、Neurabin I、AP1和Apaf1组成的组中的一种或多种基因(或蛋白质)。在一些实施方式中，所述治疗或预防方法用于调节至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十五种、三十种或更多种上述基因(或蛋白质)的组合。
在一些实施方式中，本发明的治疗或预防的方法，用于上调选自于LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160 200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRaf pSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、肌球蛋白调节轻链、hnRNP C1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、微管相关蛋白、β微管蛋白、蛋白酶体α3、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1δ、热休克蛋白27kD、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、ER脂筏相关2同型体1(β肌动蛋白)、铜/锌过氧化物歧化酶和信号序列受体1δ、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2和VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34cdc2、P53BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)和MRP1组成的组的一种或多种基因或者基因的任何组合的表达水平。在一些实施方式中，治疗或预防方法用于上调至少两种，三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十五种、三十或更多种上述基因(或蛋白质)的组合。
在进一步的实施方式中，本发明提供的治疗或预防方法用于下调选自于ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3 AL9 S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD65 67、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基，Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure BPA00001530185500481
结合抑制剂、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3，真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD、hnRNP C1/C2、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、MDC1、层粘连蛋白2a2、b联蛋白、FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、Neurabin I、AP1和Apaf1组成的组的一种或多种基因或者基因的任何组合的表达水平。在一些实施方式中，治疗或预防方法用于下调至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十五种、三十种或更多种上述基因(或蛋白质)的组合。
在一个实施方式中，本发明所提供的治疗或预防方法用于调节糖尿病有关的基因的表达水平。这类基因可以包括例如，ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOX C2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2、VEGFA、ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、LAMA5和/或PXLDC1。在一些实施方式中，治疗或预防的方法用于调节至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八岁种或全部十九种上述基因(或蛋白质)的组合。
在进一步的实施方式中，治疗或预防的方法用于上调糖尿病有关的基因的表达水平。这些基因可以包括，例如，ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOX C2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2和/或VEGFA。在一些实施方式中，治疗或预防方法上调至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或全部十二种上述基因(或蛋白质)的组合。
在进一步的实施方式中，治疗或预防方法用于下调糖尿病有关的基因的表达水平。这类基因可以包括，例如，ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、LAMA5和/或PXLDC1。在一些实施方式中，治疗或预防方法下调至少两种、三种、四种、五种、六种或全部七种上述基因(或蛋白质)的组合。
在再另一个实施方式中，治疗或预防方法用于调节血管发生有关的基因的表达水平。这类基因可以包括，例如，ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、LAMA5和/或PXLDC1。在一些实施方式中，治疗或预防方法调节上述组中的至少两种、三种、四种、五种、六种或全部7种基因的组合。
在进一步的实施方式中，治疗或预防方法用于上调血管发生有关的基因的表达水平。这类基因可以包括，例如，ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1和/或CXCL3。在一些实施方式中，治疗或预防方法上调来自上组的至少两种、三种、四种或者全部五种基因的组合。
在进一步的实施方式中，治疗或预防方法用于下调血管发生有关的基因的表达水平。这些基因可以包括，例如，LAMA5和/或PXLDC1。在一个实施方式中，治疗或预防方法下调LAMA5和PXLDC1。
在另一个实施方式中，治疗或预防方法用于调节细胞凋亡相关的基因的表达水平。这些基因可以包括，例如，本文所述的实验中调节的基因，即在表2-9中列出的基因。在另一个实施方式中，涉及细胞凋亡的基因或蛋白质包括JAB1、p53R2、磷脂酰丝氨酸受体、Rab 5、AFX、MEKK4、HDAC2、HDAC4、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、p34cdc2、BTK、ASC2、BubR1、PCAF、Raf1、MSK1和mTOR中的一种或多种。在一些实施方式中，治疗或预防方法调节上组中的至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种或者全部十九种基因的组合。
五、本发明的诊断方法
本发明提供了诊断肉瘤的方法。本发明的方法可以与熟练技术人员用来预测肉瘤复发和/或进行肉瘤治疗的受试者的生存的任何其它方法结合实施。例如，本发明的方法可与从受试者获得的样品的形态学或细胞学分析结合进行。细胞学方法包括通过其与任何其它的标志物自身、与其它标志物结合和/或与Shc标志物结合的免疫组织化学或免疫荧光检测(和定量分析，如果合适的)。其它方法包括通过原位PCR或通过提取组织并通过实时PCR定量其它标志物来检测其它标志物。PCR被定义为聚合酶链式反应。
还提供了评价治疗方案例如，化疗、放疗、外科手术、激素治疗或任何其它用于治疗受试者中的肿瘤障碍的治疗途径的效力的方法。在这些方法中，评价一对样品(第一样品没有经历治疗方案，而第二样品经历至少部分治疗方案)中的标志物的量。
本发明还提供了确定肉瘤是否为侵袭性的方法。该方法包括测定细胞中存在的标志物的量，以及与对照样品中存在的标志物的对照量相比较，如在定义部分中定义的，从而确定肉瘤是否为侵袭性的。
本发明的方法也可用于选择能够调节，即降低，肉瘤的侵袭性的化合物。在此方法中，将癌细胞与受试化合物接触，和测定受试化合物调节肉瘤细胞中本发明的标志物的表达和/或活性的能力，从而选择能够调节肉瘤侵袭性的化合物。
使用本文所述的方法，可以筛选各种各样的分子，特别地包括足够小以能够穿过细胞膜的分子，以鉴别调节，例如，增加，本发明的标志物的表达和/或活性的分子。为了抑制受试者中肉瘤的侵袭性、防止受试者中肉瘤的复发或者治疗受试者的肉瘤，可以向受试者提供如此鉴别的化合物。
六、本发明的标志物
本发明涉及在表2-9中列出的标志物(以下称“标志物”或“本发明的标志物”)。本发明提供由标志物编码的或者对应于标志物的核酸和蛋白质(以下分别称“标志物核酸”和“标志物蛋白质”)。这些标志物特别地用于筛选肉瘤的存在，用于评价肉瘤的侵袭性和转移潜能，用于评价受试者是否患有肉瘤，用于鉴别用于治疗肉瘤的组合物，用于评价环境影响剂化合物治疗肉瘤的疗效，用于监测肉瘤的进展，用于预测肉瘤的侵袭性，用于预测患肉瘤的受试者的生存，用于预测肉瘤的复发和用于预测受试者是否具有患肉瘤的倾向。
“标志物”是与其在正常的或健康的组织或细胞中的表达水平相比，在组织或细胞中表达水平的改变与疾病的状态，如肉瘤，相关的基因。“标志物核酸”是由本发明的标志物编码的或对应于本发明的标志物的核酸(例如，mRNA、cDNA)。这种标志物核酸包括包含由任何作为本发明的标志物的任何基因的全部或部分序列或者这样的序列的互补序列的DNA(例如，cDNA)。这些序列是本领域的技术人员已知的且能够在，例如，美国国立卫生研究所政府pubmed站上找到。标志物核酸还包括包含任何本发明的基因标志物的全部或部分序列或者这样序列的互补序列(其中所有的胸苷残基被尿苷残基取代)的RNA。“标志物蛋白质”是由本发明的标志物编码的或对应于本发明的标志物的蛋白质。标志物蛋白质包含本发明的任何标志物蛋白质的全部或部分序列。这类序列是本领域的技术人员已知的且能够在，例如，在美国国立卫生研究所政府pubmed网站上找到。术语“蛋白质”和“多肽”可互换地使用。
“肉瘤相关的”体液是在处于病人的身体中时接触或经过肉瘤细胞的或者从肉瘤细胞流出的细胞或蛋白质能够流入其中的流体。示例性的肉瘤相关的体液包括血液流体(如全血、血清、移除血小板的血液)，并在下面更详细地描述。许多肉瘤疾病相关的体液可在其中具有肉瘤细胞，尤其是当细该胞转是转移性的。可以包含肉瘤细胞的含细胞流体包括，但不限于，全血、移除血小板的血液、淋巴、前列腺液、尿液和精液。
标志物的“正常”表达水平是人类受试者或者没有患肉瘤的患者的细胞中的标志物表达水平。
标志物的“过表达”或“较高的表达水平”是指受试样品中的表达水平大于用于评估表达的分析方法的标准误，且优选地是对照样品(例如，从没有标志物相关的疾病如肉瘤的健康受试者获得的样品)中标志物的表达水平和优选地几个对照样品的标志物的平均表达水平的至少两倍，和更优选地三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍。
标志物的“较低的表达水平”是指受试样品中的表达水平比对照样品(例如，从没有标志物相关的疾病如肉瘤的健康受试者获得的样品)中的标志物的表达水平和优选地几个对照样品中的标志物的平均表达水平低至少两倍，和优选地三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍。
“转录的核苷酸”或“核苷酸转录本”是与由本发明标志物的转录和RNA转录本的正常转录后加工(如剪接)(如果有的话)或者RNA转录本的反转录产生的成熟的mRNA的全部或部分互补或者同源的多核苷酸(例如mRNA、hnRNA、cDNA、或这种RNA或cDNA的类似物)。
“互补的”是指两个核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性的广义概念。已知第一个核酸区域的腺嘌呤残基能够同与第一个区域反向平行的第二个核酸区域的残基(如果该残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特异性的氢键(“碱基配对”)。类似地，已知第一个核酸链的胞嘧啶残基能够同与第一个核酸链反向平行的第二个核酸链的残基(如果该残基是鸟嘌呤)碱基配对。如果，当核酸的第一个区域与相同的或者不同的核酸的第二个区域以反平行的方式排列时，第一个区域的至少一个核苷酸残基能够与第二个区域的残基碱基配对，则这两个区域互补。优选地，第一个区域包括第一部分和第二个区域包括第二部分，从而当第一部分和第二部分以反向平行的方式排列时，至少约50％和优选地至少约75％，至少约90％或至少约95％的第一部分的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分的全部核苷酸残基能够与第二部分的核苷酸残基碱基配对。
本文所用的“同源的”是指相同的核酸链的两个区域之间或两个不同核酸链的区域之间的核苷酸序列的相似性。当两个区域中的核苷酸残基位点被相同的核苷酸残基占据时，那么该区域在该位置上是同源的。如果各个区域的至少一个核苷酸残基位点被相同的残基占据，第一个区域与第二个区域同源。两个区域之间的同源性根据被相同的核苷酸残基占据的两个区域的核苷酸残基位置的比例来表示。举例说明，具有核苷酸序列5′-ATTGCC-3′的区域与具有核苷酸序列5′-TATGGC-3的区域具有50％的同源性。优选地，第一个区域包含第一部分和第二个区域包含第二部分，从而各部分的至少约50％，和优选地至少约75％，至少约90％或至少约95％的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。更优选地，各部分的全部核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。
“本发明的蛋白质”包括标志物蛋白质及其片段；变异体标志物蛋白质及其片段；包含标志物或变异体标志物蛋白质的至少15个氨基酸的片段的肽和多肽；以及包含标志物或变异体标志物蛋白质，或标志物或变异体标志物蛋白质的至少15个的氨基酸片段的融合蛋白。
本发明进一步提供了与本发明的标志物蛋白质和标志物蛋白质的片段特异性结合的抗体、抗体衍生物和抗体片段。除非本文另有说明，术语“抗体”和“多种抗体”广义地包括自然发生的抗体形式(如IgG、IgA、IgM、IgE)和重组的抗体，如单链抗体、嵌合的和人源化的抗体及多特异性抗体，以及所有上述的片段和衍生物，该片段和衍生物至少具有抗原结合位点。抗体衍生物可以包含与抗体偶联的蛋白质或化学基团。
在某些实施方式中，本发明的标志物包括选自于ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3 AL9 S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD6567、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基，Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮结合抑制剂、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3、真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD、hnRNP C1/C2、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160 200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRaf pSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、肌球蛋白调节轻链、hnRNPC1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、β-微管蛋白、三磷酸腺苷依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1β2、ER脂筏相关2同型体1(β肌动蛋白)、信号序列受体1δ、真核翻译起始因子3、亚基3γ、胆绿素还原酶A(转醛醇酶1)、角蛋白1，10(旁胸腺素)、GSTω1、B链多巴胺苯醌结合DJ-1、蛋白酶体激活剂Reg(α)、T-复合蛋白1同型体A、链A甲巯蛋白ERP57(含伴侣蛋白的TCP1)、泛素激活酶E1；丙氨酰-tRNA合成酶、动力蛋白激活蛋白1、热休克蛋白60kd、β肌动蛋白、亚精胺合成酶(β肌动蛋白)、热休克蛋白70kd、视网膜母细胞瘤结合蛋白4同型体A、TAR DNA结合蛋白、真核翻译延长因子1β2、含伴侣蛋白的TCP1、亚基3、胞质动力蛋白IC-2、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2、VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34cdc2、P53BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21 WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)、MRP1、MDC1、层粘连蛋白2a2、b联蛋白，FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、NeurabinI、AP1和Apaf1组成的组的一种或多种基因。在一些实施方式中，该标志物是至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十五种、三十种、三十五种、四十种、四十五种、五十种或更多种上述基因(或蛋白质)的组合。
在一些实施方式中，本发明的标志物是在用辅酶Q10处理肉瘤细胞时被上调的基因或蛋白质。在用辅酶Q10处理肉瘤细胞时被上调的标志物包括LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB1、肌球蛋白、MEKK4、cRafpSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、肌球蛋白调节轻链、hnRNP C1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、微管相关蛋白、β微管蛋白、蛋白酶体α3、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1δ、热休克蛋白27kD、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、ER脂筏相关2同型体1(β肌动蛋白)、铜/锌过氧化物歧化酶和信号序列受体1δ、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2和VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34 cdc2、P53 BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21 WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)和MRP1。在一些实施方式中，被上调的标志物是至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、二十五种、三十种或更多种上述基因(或蛋白质)的组合。
在进一步的实施方式中，该标志物是在用辅酶Q10处理肉瘤细胞时被下调的基因或蛋白质。被下调的标志物包括ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3 AL9 S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD65 67、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基，Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure BPA00001530185500561
结合抑制剂、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3、真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD、hnRNP C1/C2、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域、溶神经素(NLN)、MDC1、层粘连蛋白2a2、b联蛋白、FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、NeurabinI、AP1和Apaf1。在一些实施方式中，被下调的标志物是至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、二十种、十五种、三十种或更多种上述基因(或蛋白质)的组合。
在一个实施方式中，本发明的标志物是与糖尿病相关的或者涉及糖尿病的基因或蛋白质。这些涉及糖尿病的基因或蛋白质包括例如，ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOX C2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2、VEGFA、ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、LAMA5和/或PXLDC1。在一些实施方式中，本发明的标志物是至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八岁种或全部十九种上述基因(或蛋白质)的组合。
在一个实施方式中，与糖尿病相关的或者涉及糖尿病的标志物是在用辅酶Q 10处理肉瘤细胞时被上调的基因或蛋白质。这些标志物包括例如，ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOX C2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2和/或VEGFA。在一些实施方式中，涉及糖尿病的被上调的标志物是至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或全部十二种上述基因(或蛋白质)的组合。
在进一步的实施方式中，与糖尿病相关的或者涉及糖尿病的标志物在用辅酶Q10处理肉瘤细胞时被下调的基因或蛋白质。这些基因包括例如，ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、LAMA5和/或PXLDC1。在一些实施方式中，涉及糖尿病的被下调的标志物是至少两种、三种、四种、五种、六种或全部七种上述基因(或蛋白质)的组合。
在再另一个实施方式中，本发明的标志物是与血管生成相关的或参与血管生成的基因或蛋白质。这些基因可以包括，例如，ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、LAMA5和/或PXLDC1。在一些实施方式中，参与血管生成的标志物是上组的至少两种、三种、四种、五种、六种或全部的7种基因的组合。
在进一步的实施方式中，与血管生成相关的或参与血管生成的标志物是在用辅酶Q10处理肉瘤细胞时被上调的基因或蛋白质。这些基因可以包括，例如，ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1和/或CXCL3。在一些实施方式中，与血管生成有关的上调标志物是上组的至少两种、三种、四种或者全部五种基因的组合。
在进一步的实施方式中，与血管生成相关的或参与血管生成的标志物是在用辅酶Q10处理肉瘤细胞时被下调的基因或蛋白质。这些基因可以包括，例如，LAMA5和/或PXLDC1。在一个实施方式中，下调的标志物是LAMA5和PXLDC1两者。
在另一个实施方式中，标志物是参与细胞凋亡的基因或蛋白质。这些基因可以包括，例如，表2-9中列出的基因。在一个实施方式中，参与细胞凋亡的标志物包括JAB1、p53R2、磷脂酰丝氨酸受体、Rab 5、AFX、MEKK4、HDAC2、HDAC4、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、p34cdc2、BTK、ASC2、BubR1、PCAF、Raf1、MSK1和mTOR。
在以下小节中进一步地详细描述本发明的各个不同的方面。
1.分离的核酸分子
本发明的一个方面涉及到分离的核酸分子，包括编码标志物蛋白质或其部分的核酸。本发明的分离的核酸还包括足以用作识别标志物核酸分子和标志物核酸分子的片段的杂交探针的核酸分子，如适合用作标志物核酸分子扩增或突变的PCR引物的核酸分子。本文所使用的术语“核酸分子”意图包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
“分离的”核酸分子是与存在于该核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。在一个实施方式中，“分离的”核酸分子不含该核酸所来源的有机体的基因组DNA中天然侧邻该核酸的序列(即位于该核酸5′和3′末端的序列)(优选编码蛋白质的序列)。例如，在各种实施方式中，分离的核酸分子可以包含小于约5kB、4kB、3kB、2kB、1kB、0.5kB或0.1kB的该核酸所来源的有机体的基因组DNA中天然侧邻该核酸的序列。在另一个实施方式中，“分离的”核酸分子如cDNA分子在通过重组技术产生时可以基本上没有其它细胞物质或者培养基，或者当化学合成时可以基本上没有化学前体或其它化学物质。基本上没有细胞物质的核酸分子包括具有小于约30％、20％、10％或5％的外源核酸(本文也称为“污染核酸”)的制剂。
本发明的核酸分子可以使用标准的分子生物学技术和本文描述的数据库中的序列信息进行分离。利用这样的核酸序列的全部或部分，可以使用标准的杂交和克隆技术(例如，Sambrook等编辑，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989中所描述的)分离本发明的核酸分子。
本发明的核酸分子可以采用作为模板的cDNA、mRNA或基因组DNA和适宜的寡核苷酸引物按照标准的PCR技术扩增。如此扩增的核酸可以被克隆到合适的载体中和通过DNA测序分析表征。此外，对应于本发明核酸分子的全部或一部分的核苷酸可以通过标准的合成技术制备，例如，使用DNA自动合成仪。
在另一个优选的实施方式中，本发明的分离的核酸分子包含与标志物核酸的核苷酸序列或与编码标志物蛋白质的核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。与给定的核苷酸序列互补的核酸分子是与该给定核苷酸序列充分互补的核酸分子，其可以与该给定核苷酸序列杂交从而形成稳定的双链体。
此外，本发明的核酸分子可以可以仅包含核酸序列的一部分，其中全长核酸序列包含标志物核酸或其编码标志物蛋白质。这种核酸可以用作例如探针或引物。探针/引物通常作为一个或多个基本纯化的寡核苷酸使用。寡核苷酸通常包含在严格条件下与本发明核酸的至少约7个，优选约15个，更优选约25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个或者更多的连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
基于本发明核酸分子的序列的探针可以用来检测对应于本发明的一种或多种标志物的转录本或者基因组序列。探针包含连接于其上的标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶的辅助因子。这些探针可以作为诊断性检测试剂盒的一部分用来鉴别错误表达蛋白质的细胞或组织，比如通过测定来自受试者的细胞样品中编码该蛋白质的核酸分子的含量，例如检测mRNA水平，或者确定编码该蛋白质的基因是否已经发生突变或缺失。
本发明还包括与编码标志物蛋白质的核酸的核苷酸序列不同但由于遗传密码子的简并性而编码相同的蛋白质的核酸分子。
本领域的研究人员了解，导致氨基酸序列变化的DNA序列的多态性可以存在于群体(例如人群)中。这种遗传多态性可以由于自然的等位基因变异而存在于群体内的个体之间。等位基因是指择一地存在于给定基因座的一组基因之一。此外，可以理解，影响RNA的表达水平的DNA多态性也可以存在，其可以影响该基因的整体表达水平(例如，通过影响调节或降解)。
本文所使用的短语“等位基因变异体”是指在给定基因座存在的核苷酸序列或是指由该核苷酸序列编码的多肽。
本文所使用的术语“基因”和“重组基因”是指包含编码与本发明的标志物对应的多肽的开放阅读框的核酸分子。这种自然等位基因变异通常可以导致给定基因的核苷酸序列中1-5％的变异。交替等位基因可以通过测序多个个体中的目的基因来进行鉴定。这可以很容易地通过利用杂交探针来鉴别多个个体中的同一基因座而完成。任何的和所有的这些核苷酸变异及所获得的氨基酸多态性或变异是天然等位基因变异的结果且不改变意图落入本发明范围内的功能活性。
在另一实施方式中，本发明的分离的核酸分子长度为至少7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500个或更多的核苷酸，且在严格条件下与标志物核酸或者编码标志物蛋白质的核酸杂交。本文所使用的术语“在严格条件下杂交”是用来描述至少有60％(65％、70％，优选75％)彼此同一的核苷酸序列通常保持相互杂交的杂交和洗涤条件。这种严格条件是本领域研究人员熟知的，且可以在Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)的6.3.1-6.3.6节中找到。严格条件的优选的非限制性的实例是约45℃下在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，随后在50-65℃下的0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。
除了可能存在于群体中的本发明核酸分子自然发生的等位基因变异外，熟练技术人员可以理解，通过突变可以引入序列变化从而导致编码蛋白质的氨基酸序列发生变化，但不改变所编码蛋白质的生物活性。例如，可以进行核苷酸置换从而导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸置换。“非必需”的氨基酸残基是指可以相对于野生型序列发生改变而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性必需的。例如，在不同物种的同源物之间不保守或仅半保守的氨基酸残基可能对于活性是非必需的，因此很可能作为改变的靶标。或者，各种不同物种(例如鼠和人)的同源物之间保守的氨基酸残基可能对于活性是必需的，因此不太可能作为改变的靶标。
因此，本发明的另一个方面涉及的是编码变异标志物蛋白质的核酸分子，该变异标志物蛋白质包含对于活性非必需的氨基酸残基的变化。这些变异标志物蛋白质的氨基酸序列与天然发生的标志物蛋白质的氨基酸序列不同，但保持生物活性。在一个实施方式中，这种变异标志物蛋白质的氨基酸序列与标志物蛋白质氨基酸序列至少有约40％的同一性、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
编码变异标志物蛋白质的分离的核酸分子可以通过向标志物核酸的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸置换、添加或缺失而生成，从而一个或多个氨基酸残基的置换、添加或缺失被引入编码的蛋白质中。突变可以通过标准的技术引入，如定点诱变和PCR介导的诱变。优选地，保守的氨基酸置换在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“保守的氨基酸置换”是氨基酸残基具有类似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸置换。具有相似侧链的氨基酸残基的族在本领域中被定义。这些族包括具有碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。或者，突变可以沿编码序列的全长或部分随机引入，如通过饱和诱变，且得到的突变体可以对生物活性进行筛选，以确定保留活性的突变体。诱变之后，编码的蛋白质可重组表达和蛋白质的活性可以测定。
本发明包括反义核酸分子，即与本发明正义核酸互补的分子，例如，与双链标志物cDNA分子的编码链互补或与标志物mRNA序列互补。因此，本发明的反义核酸可以氢键结合本发明的正义核酸结合(即与本发明的正义核酸退火)。反义核酸可以与整条编码链互补或仅与其一部分互补，例如全部或部分的蛋白质编码区(或开放阅读框)。反义核酸分子也可以相对编码标志物蛋白质的核苷酸序列编码链的全部或部分非编码区反义的。非编码区(“5′和3′非翻译区”)是侧邻编码区且不翻译成氨基酸的5′和3′序列。
反义寡核苷酸长度可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个或更多核苷酸。本发明的反义核酸可以通过本领域已知的方法利用化学合成和酶促连接反应来构建。例如，反义核酸(如反义寡核苷酸)可以由天然存在的核苷酸或者设计为提高分子的生物稳定性或正义和反义核酸之间形成的双链体的物理稳定性的经过不同修饰的核苷酸(如硫逐磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)进行化学合成。可用于生成反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-g半乳糖基Q核苷(galactosylqueosine)、次黄嘌呤核苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、和2，6-二氨基嘌呤。或者，反义核酸可以利用将核酸按反义方向亚克隆到其中的表达载体进行生物合成(即由插入核酸转录的RNA是目的标志物核酸的反义方向，在下面的小节进一步描述)。
本发明的反义核酸分子通常施用于受试者或原位生成以使得它们能够与细胞mRNA和/或编码标志物蛋白质的基因组DNA杂交或结合，由此通过如抑制转录和/或翻译来抑制标志物蛋白的表达。杂交可以是通过常规的核苷酸互补性以形成稳定的双链体，或者例如在与DNA双链体结合的反义核酸分子的情况中，通过在双螺旋的大沟中的特异性相互作用。本发明的反义核酸分子的给药途径的例子包括将反义核酸直接注射到组织位点或输注到内瘤相关体液中。或者，反义核酸分子可以被修饰以靶向选择的细胞，然后系统地施用。例如，对于系统施用，可以修饰反义分子以使其特异性地结合细胞表面上表达的受体或抗原，例如，通过将反义核酸分子与肽或结合细胞表面受体或抗原的抗体连接。反义核酸分子也可以通过本文所述的载体递送给细胞。为了使反义分子达到足够的细胞内浓度，优选的是反义核酸分子处于强pol II或pol III启动子的控制下。
本发明的反义核酸分子可以是α-异头的核酸分子。α-异头的核酸分子与互补的RNA形成特定的双链杂交，其中与通常的α-单元相反，两条链彼此平行延伸(Gaultier等，1987，Nucleic Acids Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还可以包括2′-o-甲基核糖核苷(Inoue等，1987，NucleicAcids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBSLett.215：327-330)。
本发明还包括核糖酶。核糖酶是具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其能够切割它们具有互补区域的单链核酸，如mRNA。因此，核糖酶(如锤头(状)核糖酶，如文献Haselhoff和Gerlach，1988，Nature334：585-591所述)可用于催化裂解mRNA转录本，从而抑制由该mRNA编码的蛋白质的翻译。对编码标志物蛋白的核酸分子具有特异性的核糖酶可以根据对应于标志物的cDNA核苷酸序列进行设计。例如，四膜虫(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物被构建，其中活性位点的核苷酸序列与被切割的核苷酸序列互补(见Cech等，美国专利号4,987,071；和Cech等，美国专利号5,116,742)。或者，本发明的编码多肽的mRNA可以用来从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化RNA(见Bartel和Szostak，1993，Science 261：1411-1418)。
本发明还包括形成三螺旋结构的核酸分子。例如，本发明的标志物的表达可以通过靶向于与编码标志物核酸或蛋白质的基因的调控区(如启动子和/或增强子)互补的核酸序列而抑制，以形成阻止目标细胞中基因的转录的三螺旋结构。见Helene(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher(1992)Bioassays 14(12)：807-15。
在各种不同的实施方式中，本发明的核酸分子的可以在碱基部分、糖基部分或磷酸酯骨架进行修饰以提高例如分子的稳定性、杂交作用或溶解性。例如，核酸的脱氧核糖磷酸酯骨架可以被修饰以生成肽核酸(见Hyrup等，1996，Bioorganic&Medicinal Chemistry 4(1)：5-23)。本文所使用的术语“肽核酸”或“PNA”指的是其中脱氧核糖磷酸酯骨架被拟肽骨架替换且只保留四种天然核碱基的核酸模拟物，例如DNA模拟物。已证明PNA的中性骨架允许在低离子强度条件下DNA与RNA特异性杂交。PNA寡聚体的合成可以利用植物固相肽合成方案进行，如Hyrup等(1996)，supra；Perry-O′Keefe等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14670-675中所述。
PNA可被用于治疗和诊断应用中。例如，PNA可以用作用于基因表达的序列特异性调控的反义或反基因(antigene)剂，例如，通过诱导转录或翻译抑止或抑制复制。PNA也可以通过例如PNA指导PCR发夹技术用于例如分析基因中的单碱基对突变；当与其它酶如S1核酸酶结合使用时，PNA可以作为人工限制性酶(Hyrup，1996，同上)；或者作为用于DNA序列和杂交的探针或者引物(Hyrup，1996，同上；Perry-O′Keefe等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675)。
在另一个实施方式中，PNA可以通过将亲脂基团或其它辅助基团连接到PNA上，通过形成PNA-DNA嵌合体或者通过利用脂质体或其它本领域已知的药物递送技术进行修饰以例如增强其稳定性或细胞摄取。例如，可以产生结合了PNA和DNA的优点的PNA-DNA嵌合体。这种嵌合体允许DNA识别酶(例如核糖核酸酶H和DNA聚合酶)与DNA部分相互作用而PNA部分提供高结合亲和力和特异性。例如，PNA-DNA嵌合体可以使用按照碱基堆积、核碱基之间键的数目和定向进行选择的具有适当长度的接头连接(Hyrup，1996年，同上)。PNA-DNA嵌合体可以根据文献(Hyrup(1996)，同上和Finn等(1996)Nucleic AcidsRes.24(17)：3357-63)所描述的合成。例如，DNA链可以采用标准的亚磷酰胺偶联化学作用和修饰的核苷类似物在固相载体上合成。化合物如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脱氧胸腺嘧啶核苷亚磷酰胺可以作为PNA和DNA 5′末端之间的连接(Mag等，1989，Nucleic Acids Res.17：5973-88)。PNA单体随后以分步的方式进行偶联以产生具有5′PNA段和3′DNA段的嵌合分子(Finn等，1996，Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63)。或者，嵌合分子也可以由5′DNA段和3′PNA段合成(Peterser等，1975，Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119-11124)。
在其它实施方式中，寡核苷酸可以包括其它附加基团如肽(例如，用于在体内靶向宿主细胞受体)或有助于跨细胞膜(见例如，Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-652；PCT公布号WO 88/09810)或血脑屏障(见例如PCT公布号WO 89/10134)转运的物质。此外，寡核苷酸可以用杂交-引发切割剂(见Krol等，1988，Bio/Techniques 6：958-976)或嵌合剂(见Zon，1988，Pharm.Res.5：539-549)进行修饰。为此，寡核苷酸可以与另一分子结合，例如，肽、杂交引发交联剂、转运物质、杂交引发切割剂等等。
本发明还包括分子信标核酸，它含有至少一个与本发明的核酸互补的区域，以使得分子信标可用来定量样品中本发明核酸的存在。“分子信标”核酸是包含一对互补区域并具有与之结合的荧光团和荧光淬灭剂的核酸。荧光团和淬灭剂以使得当二者以互补区域相互退火时，荧光团的荧光被淬灭剂淬灭的定向与核酸的不同部分结合。当核酸的互补区域没有相互退火时，荧光团的荧光以较低水平淬灭。分子信标核酸描述于例如美国专利5876930中。
2.分离的蛋白质和抗体
本发明的一个方面涉及分离的标志物蛋白质及其生物活性部分，以及适合作为免疫原以生成针对标志物蛋白或其片段的抗体的多肽片段。在一个实施方式中，原始标志物蛋白可以用标准的蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织来源中分离。在另一实施方式中，包含整个标志物蛋白或部分的蛋白质或肽由重组DNA技术产生。作为重组表达的替代方式，这些蛋白质或肽可以使用标准的肽合成技术来化学合成。
“分离的”或“纯化的”的蛋白质或其生物活性部分基本上不含细胞材料或来自于获得该蛋白质的细胞或组织来源的其它污染蛋白质，或者在化学合成时，基本上不含化学前体或其它化学试剂。词语“基本上不含细胞材料”包括其中蛋白质与分离或重组产生该蛋白质的细胞的成分分离的蛋白质制剂。因此，基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有小于约30％、20％、10％或5％(干重)的异质蛋白质(本文中也称为“污染蛋白质”)的蛋白质制剂。当蛋白质或其生物活性部分通过重组产生时，优选基本上不含培养基，即培养基占蛋白制剂体积的小于约20％、10％或5％。当蛋白质是通过化学合成产生时，优选基本上不含化学前体或其它化学试剂，即其与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学试剂分离。因此，这类蛋白质制剂除了目标多肽外具有低于约30％、20％、10％、5％(干重)的化学前体或化合物。
标志物蛋白的生物活性部分包括包含与标志物蛋白氨基酸序列充分相同的或源于标志物蛋白氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，其包括比全长蛋白质少的氨基酸并表现出相应全长蛋白质的至少一种生物活性。通常情况下，生物活性部分包含具有相应全长蛋白质的至少一种生物活性的结构域或基序。本发明标志物蛋白质的生物活性部分可以是例如长度为10、25、50、100个或更多个氨基酸的多肽。此外，其它生物活性部分(其中标志物蛋白的其它区域被删除)可以通过重组技术制备，并针对标志物蛋白原始形式的一种或多种功能活性来进行评估。
优选标志物蛋白由包含表2-9中列出的任何基因编码的序列的核苷酸序列编码。其它可用的蛋白质与这些序列之一基本上相同(例如至少约40％、优选50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同)，且保持相应的天然存在标志物蛋白的功能活性而由于自然等位基因变异或诱变作用导致氨基酸序列的不同。
要确定两个氨基酸序列或两个核酸的百分同一性，序列进行比对以达到最佳比较的目的(例如，为了与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对，可以在第一氨基酸或核酸序列中引入空位)。相应氨基酸或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸然后进行比较。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置的相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在这个位置上是同一的。优选地，两个序列之间的百分同一性采用总体比对计算。或者，两个序列之间的百分同一性采用局部比对计算。两个序列之间的百分同一性是序列共有的相同位置数目的函数(即％同一性＝#同位置数/位置总数(例如，重叠位置)X 100)。在一个实施方式中，两个序列是相同的长度。在另一个实施方式中，这两个序列具有不相同的长度。
确定两序列之间的百分同一性可以使用数学算法完成。用于序列比较的数学算法的优选的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中改进的。这种算法整合到Altschul，等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸检索可以通过BLASTN程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以通过BLASTP程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比对目的的空位比对，可以利用更新版本的BLAST算法，称为Gapped BLAST(如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述)，这种算法能够对BLASTN、BLASTP和BLASTX程序进行空位局部比对。或者，PSI-Blast可用于执行迭代检索，其检测分子间的距离关系。当使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各自程序(例如，BLASTX的BLASTN)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller，(1988)CABIOS 4：11-17的算法。这种算法被整合到ALIGN程序(版本2.0)中，这是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，会用到PAM120权重残基表(weight residue table)，空位长度罚分为12和空位罚分为4。用于确定局部序列相似性的区域和比对的再另一个有用的算法是FASTA算法(如Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448中所述)。当使用FASTA算法比较核苷酸或者氨基酸序列时，例如PAM120权重残基表可以以2的k-元组值使用。
两序列之间的百分同一性可以使用类似于上述技术的技术进行确定，具有或不具有允许的空位。在计算百分同一性中，只有精确匹配进行计数。
本发明还提供了包含包含标志物蛋白质或其部分的嵌合或融合蛋白。本文所使用的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含可操作地连接到异源多肽(即标志物蛋白以外的多肽)上的标志物蛋白的全部或部分(优选生物活性部分)。在融合蛋白中，术语“可操作地连接”意图表示标志物蛋白或其片段与异源多肽彼此同框地融合。异源多肽可以与标志物蛋白质或片段的氨基端或羧基端融合。
一种有用的融合蛋白是GST融合蛋白，其中标志物蛋白或片段融合到GST序列的羧基端。这种融合蛋白可利于本发明重组多肽的纯化。
在另一实施方式中，融合蛋白包含氨基端的异源信号序列。例如，标志物蛋白的原始信号序列可以被移除并以来自另一蛋白的信号序列替代。例如，杆状病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可以用作异源信号序列(Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY，1992)。真核异源信号序列的其它例子包括蜂毒肽和人类胎盘碱性磷酸酶的分泌序列(Stratagene；La Jolla，California)。在再另一个例子中，有用的原核异源信号序列包括phoA分泌信号(Sambrook等，同上)和蛋白质A分泌信号(Pharmacia Biotech；Piscataway，New Jersey)。
在再另一实施方式中，融合蛋白是免疫球蛋白融合蛋白，其中标志物蛋白的全部或部分与来自免疫球蛋白家族成员的序列融合。本发明的免疫球蛋白融合蛋白可以整合到药物组合物中并施用于受试者以抑制配体(可溶性的或膜结合的)和细胞表面上的蛋白质(受体)之间的相互作用，从而抑制体内信号转导。免疫球蛋白融合蛋白可用于影响标志物蛋白的同源配体的生物利用率。抑制配体/受体相互作用可能在医疗方面是有用的，用于治疗增殖性和分化性的紊乱和用于调节(例如，促进或抑制)细胞的存活。此外，本发明的免疫球蛋白融合蛋白可以被用作在受试者中产生针对标志物蛋白的受体的免疫原，用于纯化配体和用于筛选试验中以鉴别抑制标志物蛋白与配体的相互作用的分子。
本发明的嵌合蛋白和融合蛋白可以通过标准的重组DNA技术产生。在另一实施方式中，融合基因可以通过包括自动DNA合成仪在内的常规技术合成。或者，基因片段的PCR扩增可以利用锚定引物进行，锚定引物导致在两个连续的基因片段(其随后可以退火和重扩增以产生嵌合基因序列)之间的互补悬突(见Ausubel等，同上)。此外，很多编码融合部分(例如，GST多肽)的表达载体也能商购得到。编码本发明的多肽的核酸可以克隆到这样的表达载体上，这样融合部分与本发明的多肽同框连接。
信号序列可以用于促进标志物蛋白的分泌和分离。信号序列通常特征在于具有疏水氨基酸的核心，其一般在一个或多个切割事件中在分泌时从成熟蛋白上切除。这种信号肽含有允许信号序列在成熟蛋白通过分泌途径时从成熟蛋白切除的加工位点。因此，本发明涉及标志物蛋白，带有信号序列的融合蛋白或其片段，以及涉及信号序列已被蛋白水解切除的蛋白(切割产物)。在一个实施方式中，编码信号序列的核酸序列可以在表达载体中可操作地连接到目标蛋白上，如标志物蛋白或其片段。信号序列指导蛋白的分泌，如从表达载体转化的真核宿主分泌，且信号序列随后或同时被切割。然后，蛋白质可以利用本领域公知的方法从细胞外介质纯化。或者，信号序列可以使用有助于纯化的序列连接到目标蛋白上，例如GST域。
本发明还涉及到标志物蛋白的变异体。这种变异体具有改变的氨基酸序列，其可以起到激动剂(类似物)或拮抗剂的作用。变异体可以由诱变产生，例如，离散的点突变或截短。激动剂可以保持基本上相同的蛋白质的天然存在形式的生物活性或部分。蛋白质的拮抗剂可以例如，通过竞争结合包括目标蛋白质的细胞信号级联的下游或上游成员抑制蛋白质的天然存在形式的一种或多种活性。因此，特定的生物效应可以通过用具有有限功能的变异仃处理来引起。用具有蛋白质的天然存在形式的部分生物活性的变异体处理受试者可能在受试者中比用蛋白质的天然存在形式处理具有更小的副作用
可以作为激动剂(模拟物)或拮抗剂发挥作用的标志物蛋白的变异体可以通过筛选本发明蛋白质的突变体(如截短突变体)的组合库的激动剂或拮抗剂活性而进行鉴定。在一个实施方式中，多样的突变体库通过核酸水平的组合诱变产生且由多样的基因文库编码。多样的突变体库可以通过例如酶促接合合成寡核苷酸的混合物到基因序列中以使得这样潜在蛋白质序列简并集可作为单个多肽进行表达或者一组大的融合蛋白进行表达(例如用于噬菌体展示)而产生。有多种方法可以用来从简并寡核苷酸序列产生标志物蛋白的潜在突变体。合成简并寡核苷酸的方法在本领域内是已知的(见Narang，1983，Tetrahedron 39：3；Itakura等，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等，1984，Science 198：1056；Ike等，1983 Nucleic Acid Res.11：477)。
此外，标志物蛋白的片段库可用于产生多肽的多样化群，以用来筛选和后续选择标志物蛋白突变体或其片段。例如，编码序列片段的文库可以通过用核酸酶在其中每分子仅出现约一次刻口的条件下处理目标编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性以形成可以包括来自不同的切刻产物的正义/反义对的双链DNA，通过S1核酸酶从重新形成的双链体中去除单链部分，和将所得片段文库接合到表达载体中而产生。通过这种方法，可以得出编码目标蛋白质的不同大小的氨基端和内部片段的表达文库。
用来筛选由点突变或截短形成的组合文库的基因产物和用来筛选具有选择的特性的基因产物的cDNA文库的几种技术是本领域中已知的。适合高通过量分析的用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得的载体文库转化合适的细胞，并其中所需活性的检测有助于的编码该基因(其产物被检测)的载体的分离的条件下表达组合基因。递归集合诱变(REM)是提高文库中功能突变体的频率的技术，其可与筛选试验相结合使用以鉴别本发明蛋白的突变体(Arkin和Yourvan，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7811-7815；Delgrave等，1993，Protein Engineering 6(3)：327-331)。
本发明的另一个方面涉及针对本发明蛋白质的抗体。在优选的实施方式中，抗体特异性地结合标志物蛋白或其片段。在本文中可互换使用的“抗体”和“多个抗体”是指免疫球蛋白分子以及包含免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，这种部分包含与抗原如标志物蛋白(如标志物蛋白的表位)特异性结合的抗原结合位点)的其片段或衍生物。特异性结合本发明的蛋白质的抗体是结合该蛋白质而基本上不结合天然包含该蛋白质的样品(如生物样品)中的其它分子的抗体。免疫球蛋白分子的免疫活性部分包括，但不限于单链抗体(scAb)、F(ab)和F(ab′)2片段。
本发明的分离蛋白质或片段可以用作产生抗体的免疫原。可以使用全长蛋白，或者者本发明提供用作免疫原的抗原性肽片段。本发明蛋白质的抗原性肽段包含本发明蛋白质之一的氨基酸序列的至少8个(优选10、15、20、30或更多个)氨基酸残基，并包含蛋白质的至少一个表位以使得生成的抗该肽的抗体与蛋白质形成特异性免疫复合物。抗原性肽包括的优选的表位是位于蛋白质表面上的区域，如亲水区域。疏水性序列分析、亲水性序列分析或相似分析可以用来确定亲水区域。在优选的实施方式中，分离的标志物蛋白或其片段用作免疫原。
免疫原通常用于通过免疫合适的(即，有免疫能力的)受试者如兔子、山羊、小鼠或其它哺乳动物或脊椎动物制备抗体。合适的免疫原性制剂可以包含例如重组表达或化学合成的蛋白质或肽。该制剂还可以包括佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂或类似的免疫刺激剂。优选的免疫原组合物是不包含其它人类蛋白质的组合物，例如利用用于重组表达本发明蛋白质的非人宿主细胞产生的免疫原组合物。以这样的方式，获得的抗体组合物具有较少的或不具有本发明蛋白质以外的其它人类蛋白质的结合。
本发明提供了多克隆和单克隆抗体。本文所使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指只包含能与特定表位发生免疫反应的一种抗原结合位点的抗体分子群体。优选的多克隆和单克隆抗体组合物是针对抗本发明蛋白质进行选择的抗体组合物。特别优选的多克隆和单克隆抗体制剂是那些只包含抗标志物蛋白质或其片段的抗体的制剂。
通过以本发明的蛋白质作为免疫原免疫合适的受试者可以制备多克隆抗体。被免疫的受试者中的抗体滴度可以利用标准技术随时间监测，如使用固定的多肽进行的酶联免疫吸附分析(ELISA)。在免疫后的适当时间，如在特异性抗体滴度最高时，可以从受试者获得抗体生成细胞并用标准技术制备单克隆抗体(mAb)，如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-497最初描述的杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等，1983，Immunol.Today 4：72)、EBV-杂交瘤技术(参见Cole等，pp.77-96在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中，Alan R.Liss，Inc.，1985)或三源杂交瘤(trioma)技术。生产杂交瘤的技术是熟知的(一般参见Current Protocols in Immunology，Coligan等编辑，John Wiley&Sons，New York，1994)。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞通过筛选杂交瘤培养物上清液，如使用标准的ELISA分析，结合目标多肽的抗体进行检测。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的替代方法，针对本发明蛋白质的单克隆抗体可通过利用目标多肽筛选重组的组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)来识别和分离。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒可商购得到(如Pharmacia的重组噬菌体抗体系统，产品编号27-9400-01和Stratagene的SurfZAP噬菌体展示试剂盒，产品编号240612)。此外，特别适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可以在例如美国专利号5223409；PCT公布号WO 92/18619；PCT公布号WO 91/17271；PCT公布号WO 92/20791；PCT公布号WO92/15679；PCT公布号WO 93/01288；PCT公布号WO 92/01047；PCT公布号WO 92/09690；PCT公布号90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas3：81-85；Huse等(1989)Science 246：1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J.12：725-734中找到。
本发明还提供了特异性结合本发明蛋白质的重组抗体。在优选的实施方式中，重组抗体特异性地结合标志物蛋白或其片段。重组抗体包括，但不限于，嵌合的和人源化的单克隆抗体(包含人的和非人的部分)、单链抗体和多特异性抗体。嵌合抗体是其中不同部分来源于不同的动物物种的分子，如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体(参见，例如Cabilly等，4,816,567号美国专利；和Boss等，4,816,397号美国专利，其以其全文在此通过引用引入)。单链抗体含有抗原结合位点并由单一多肽组成。他们可以利用本领域已知的方法制备，例如使用Ladner等4,946,778号美国专利(其以其全文在此通过引用引入)；Bird等，(1988)Science 242：423-426；Whitlow等，(1991)Methods in Enzymology 2：1-9；Whitlow等，(1991)Methods in Enzymology2：97-105；和Huston等，(1991)Methods in Enzymology Molecular Designand Modeling：Concepts and Applications 203：46-88中描述的方法。多特异性抗体是具有与不同抗原特异性地结合的至少两个抗原结合位点的抗体分子。这类分子可以利用本领域已知的方法制备，例如使用Segal，4,676,980号美国专利(其公开以其全文在此通过引用引入)；Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Whitlow等，(1994)Protein Eng.7：1017-1026和6,121,424号美国专利中描述的方法。
人源化抗体是来自于非人类物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(见例如，Queen，5,585,089号美国专利，其中本文以其全文在此通过引用引入)。人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如使用PCT公布号WO87/02671；欧洲专利申请184187；欧洲专利申请171496；欧洲专利申请173494；PCT公布号WO 86/01533，美国专利号4816567；欧洲专利申请125023；Better等(1988)Science240：1041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura等(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等(1988)J.Natl.CancerInst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等(1986)Bio/Techniques 4：214；5,225,539号美国专利；Jones等(1986)Nature321：552-525；Verhoeyan等(1988)Science 239：1534；和Beidler等(1988)J.Immunol.141：4053-4060中描述的方法。
更特别的是，人源化抗体可以例如利用，不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因但可以表达人类的重链和轻链基因的转基因小鼠产生。通过常规方式利用选定的抗原，例如对应于本发明的标志物蛋白的全长或部分多肽，免疫该转基因小鼠。通过常规的杂交瘤技术可以获得抗该抗原的单克隆抗体。在B细胞分化过程中转基因小鼠锚定的人免疫球蛋白基因重排，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，有可能生产出治疗可用的IgG、IgA和IgE抗体。对于这一生产人抗体的综述，请参阅例如，Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.13：65-93)。对于这一生产人类抗体和人类单克隆抗体的技术以及生产这类抗体的方案的详细讨论参见例如，美国专利5,625,126；美国专利5,633,425；美国专利5,569,825；美国专利5,661,016；美国专利5,545,806。此外，例如Abgenix公司(弗里蒙特，加利福尼亚州)的公司可以利用上述类似的技术预订提供针对选定抗原的人抗体。
使用称为“指导选择”的技术可以产生识别选定表位的完全人抗体。用这种方法，选定的非人单克隆抗体，如鼠抗体，用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers等，1994，Bio/technology 12：899-903)。
本发明的抗体可以在产生后分离(例如，从受试者的血液或血清)或通过公知技术进一步纯化。例如，IgG抗体可以使用蛋白A层析纯化。对本发明蛋白质特异性的抗体可以通过如亲和层析进行选择或纯化(例如，部分纯化)。例如，本发明的重组表达和纯化(或部分纯化)的蛋白质如本文所述地产生，且共价或非共价偶联到固相载体上，例如层析柱。该柱然后可被用来从含有针对大量不同表位的抗体的样品中亲和纯化对本发明蛋白质特异性的抗体，从而产生基本上纯化的抗体组合物，即基本上没有污染抗体的抗体组合物。基本上纯化的抗体组合物的意思是在这里，抗体样品包含最多仅30％(干重)的针对本发明的希望蛋白质以外的表位的污染抗体，且优选样品的最多20％，再更优选10％，和最优选至多5％(干重)是污染抗体。纯化的抗体组合物是指对组合物中至少99％的抗体为抗本发明希望的蛋白质。
在优选的实施方式中，本发明的基本上纯化的抗体可以与本发明蛋白质的信号肽、分泌的序列、细胞外域、跨膜或胞质域或者细质膜特异生结合。在特别优选的实施方式中，本发明的基本上纯化的抗体特异性地结合本发明蛋白质氨基酸序列的分泌序列或胞外域。在更优选的实施方式中，本发明的基本上纯化的抗体能特异性地结合标志物蛋白质氨基酸序列的分泌序列或胞外域。
抗本发明蛋白质的抗体可用来通过标准技术分离蛋白，如亲和层析法或免疫沉淀。此外，这种抗体可用于检测标志物蛋白或其片段(例如，在细胞裂解物或细胞上清液中)，以测定标志物的表达水平和表达模式。抗体也可在诊断上用于监测组织或体液中(如在肉瘤相关的体液中)的蛋白质水平作为一个临床试验程序的一部分，例如，确定例如给定治疗方案的疗效。抗体衍生物的应用可有助于检测，其包括与可检测物质偶联的本发明的抗体。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光材料、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合体的例子包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括发光氨；生物发光物质的例子包括荧光(素)酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性物质的例子包括125I、131I、35S或3H。
本发明的抗体也可成为治疗癌症的治疗药物使用。在优选的实施方式中，本发明的完全人抗体被用于人类癌症患者的药物治疗，特别是具有癌症的患者。在另一优选的实施方式中，特异性结合标志物蛋白或其片段的抗体用于治疗。此外，这种治疗性抗体可以是抗体衍生物或免疫毒素，其包含一个与如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子的治疗部分结合的抗体。细胞毒素或细胞毒性剂包括任何对细胞有害的物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤及其类似物或同系物。治疗剂包括，但不限于：抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺(decarbazine))、烷化剂(如二氯甲基二乙胺、thioepa chlorambucil、左旋溶肉瘤素、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(如柔红霉素(前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(如更生霉素(原名放线菌素)、博莱霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。
本发明的偶联抗体可用于改变给定的生物反应，因为药物部分不理解为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括，例如毒素如核糖体抑制蛋白(见Better等，6,146,631号美国专利，其公开在本文中以其全文引入)、相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质如肿瘤坏死因子、α干扰素、β干扰素、神经生长因子、血小板源生长因子、组织纤维蛋白溶酶原激活剂；或生物反应调节剂如淋巴因子、白细胞介素-1(″IL-1″、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其它生长因子。
将这种治疗部分与抗体偶联的技术是熟知的，见例如，Arnon等，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy中的“Monoclonal AntibodiesFor Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，Reisfeld等(编)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，Controlled Drug Delivery(第二版)中的″Antibodies For Drug Delivery″，Robinson等(编辑)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications中的“Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review”，Pinchera等(编辑)，pp.475-506(1985)；Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy中“Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，Baldwin等(编)，pp.303-16(Academic Press 1985)；Thorpe，“The Preparation And Cytotoxic PropertiesOf Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
因此，一方面，本发明提供基本上纯化的抗体、抗体片段及衍生物，所有这些都与本发明的蛋白质和优选标志物蛋白质特异性地结合。在各种不同实施方式中，本发明的基本上纯化的抗体、或其片段或衍生物可以是人、非人、嵌合的和/或人源化的抗体。另一个方面，本发明提供了非人抗体、抗体片段和衍生物，所有这些都与本发明的蛋白质和优选标志物蛋白特异性地结合。这种非人抗体可以是山羊、小鼠、绵羊、马、鸡、兔或大鼠抗体。或者，本发明的非人抗体可以是嵌合体和/或人源化抗体。此外，本发明的非人抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在再一方面，本发明提供了单克隆抗体、抗体片段和衍生物，所有这些都与本发明的蛋白质和优选标志物蛋白质特异性地结合。单克隆抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或非人的抗体。
本发明还提供了包含与可检测物质偶联的本发明抗体和使用说明的试剂盒。本发明的再另一个方面是包括本发明抗体的药物组合物。在一个实施方式中，药品组合物包含本发明的抗体和药学上可接受的载体。
3.预测医学
本发明涉及预测医学领域，其中诊断分析、预后分析、药物基因组学(pharmacogenomics)和监测临床试验用于预测的目的，从而预防性地治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及诊断分析以确定一个或多个标志物蛋白质或标志物核酸的表达水平，从而确定个体是否存在发生肉瘤的风险。这种分析可以用于预后或预测目的，从而在疾病发作前对个体进行预防性治疗。
本发明的再另一个方面涉及到在临床试验中监测药物对本发明的标志物蛋白的表达或活性的影响(例如，药物或其它施用的化合物抑制肉瘤或者治疗或预防任何其它障碍{即为了解这种治疗可能具有的任何致癌效应})。这些和其它药剂在下面的章节中进一步详细描述。
A.诊断分析
检测生物样品中标志物蛋白或标志物核酸的存在与否的示例性方法包括从测试受试者获得生物样品(如肉瘤相关体液或组织样品)和使生物样品接触能够检测多肽或核酸(例如mRNA、基因组DNA或cDNA)的化合物或试剂。因此本发明的检测方法可用于在体内和在体外检测例如生物样品中的mRNA、蛋白质、cDNA或基因组DNA。例如，体外检测mRNA的技术包括Northern杂交和原位杂交。体外检测标志物蛋白质的技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和荧光免疫。体外检测基因组DNA的技术包括Southern杂交。体内检测mRNA的技术包括聚合酶链反应(PCR)、Northern杂交和原位杂交。此外，体内检测标志物蛋白质的技术包括受试者体内引入抗标志物蛋白或其片段的标记抗体。例如，该抗体可用放射性标志物标记，该放射性标志物的存在和位置可以通过标准的成像技术检测。
这样的诊断和预后分析的一般原理包括制备可以包含标志物和探针的样品或反应混合物，经过适当的条件和足够使标志物和探针互相作用和结合的时间，因此形成可以移除和在反应混合物中检测的复合体。这些分析可以通过很多方式来进行。
例如，进行这种分析的一种方法包括将标志物或探针锚定在固相载体(也称为基底)上，且在反应结束时检测锚定在固相载体上的目标标志物/探针复合体。在这种方法的一个实施方式中，来自受试者的样品(其被检测标志物的存在和/或浓度)可以锚定在载体或固相支持物上。在另一实施方式中，相反的情况是可能的，其中探针可以被锚定在固相上，而来自受试者的样品可以使得作为分析的非锚定成分发生反应。
已有多种用于锚定分析成分到固相上的确立的方法。这些包括，但不限于，通过生物素和抗生物素蛋白链菌素的偶联固定的标志物或探针分子。这种生物素化分析成分可以利用本领域已知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)从生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)制备，且固定到抗生物素蛋白链菌素涂覆的96孔板(Pierce Chemical)的孔内。在某些实施方式中，具有固定分析成分的表面可以预先制备并储存。
其它适用于这种分析的载体或固相支持物包括任何能够结合标志物或探针所属的分子种类的材料。公知的支持物或载体包括，但不限于，玻璃、聚苯乙烯、尼龙、聚丙烯、尼龙、聚乙烯、葡聚糖、淀粉酶、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。
为了能够用以上方法进行分析，非固定成分被添加到第二成分锚定于其上的固相上。反应完成后，在使得所形成的任何复合体保持固定在固相上的条件下去除未复合的成分(例如，通过洗涤)。锚定到固相上的标志物/探针复合体的检测可以通过本文概述的很多方法来完成。
在优选的实施方式中，当探针为非锚定分析成分时，探针可以用此处讨论的可检测标记进行标记以用来检测和直接或间接地分析读数，这是本领域技术人员熟知的。
也可以直接检测标志物/探针复合体形成而不需要进一步操作或标记任一成分(标志物/探针)，例如通过利用荧光能量转移的技术(见例如，Lakowicz等，美国专利号5,631,169；Stavrianopoulos等，美国专利号4,868,103)。选择第一“供体”分子上的荧光团以使得用具有适当波长的入射光激发时，它的发射荧光能够被第二“受体”分子上的荧光标记吸收，其随后由于吸收的能量而能够发荧光。或者，“供体”蛋白质分子可以简单地利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记以使得“受体”分子标记可以与“供体”分子相区别。由于标记之间的能量转移的效率与分隔分子的距离相关，所以可以评估分子之间的空间关系。分子之间发生结合的情况下，分析中“受体”分子标记的荧光发射应该是最大的。可以用本领域公知的标准荧光检测手段方便地测量FET结合事件。
在另一个实施方式中，测定探针识别标志物的能力可以通过利用如实时生物分子相互作用分析(BIA)的技术在不标记任一分析成分(探针或标志物)的情况下完成(参见，例如Sjolander，S.和Urbaniczky，C.，1991，Anal.Chem.63：2338-2345和Szabo等，1995，Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705)。本文所使用的“BIA”或“表面等离子体共振”是在不标记任何相互作用物的情况下实时研究生物特异性相互作用的技术(例如BIAcore)。结合表面处质量的变化(指示结合事件)造成表面附近光的折射率的变化(表面等离子共振(SPR)的光学现象)，从而导致可检测信号(其可以用作生物分子之间的实时反应的指示)。
或者，在另一个实施方式中，类似的诊断和预后分析可以由作为液相中溶质的标志物和探针完成。在这样的一个分析中，用多种标准技术中的一种将复合的标志物和探针与非复合成分分离，包括但不限于：差速离心法、色谱法、电泳法和免疫沉淀法。在差速离心中，可以通过一系列的离心步骤把标志物/探针复合物与非复合分析成分分离，由于基于不同大小和密度导致复合体的不同沉降平衡(见，例如Rivas，G.，和Minton，A.P.，1993，Trends Biochem Sci.18(8)：284-7)。标准色谱技术也可以用来分离复合的分子和非复合分子。例如，凝胶过滤色谱通过使用柱形式的适当的凝胶过滤树脂根据分子大小分离分子，例如，把相对较大的复合体与相对较小非复合成分分离。类似地，也可以利用标志物/探针复合体与非复合成分相比相对不同的电荷特性将复合体与非复合成分分离，例如，通过利用离子交换层析树脂。这种树脂和色谱技术都是本领域技术人员熟知的(见，例如Heegaard，N.H.，1998，J.Mol.Recognit.Winter 11(1-6)：141-8；Hage，D.S.，和Tweed，S.A.JChromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10；699(1-2)：499-525)。凝胶电泳也可以用于分离复合的分析成分和未结合的分析成分(见，例如Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1987-1999)。在这一技术中，蛋白质或核酸复合体根据例如大小和电荷分离。为了在电泳过程中保持结合相互作用，在不存在还原剂的条件下非变性凝胶基质材料和条件通常是优选的。对于特定分析及其成分的适当条件是本领域的技术人员熟知的。
在特定的实施方式中，生物样品中标志物mRNA水平可以使用本领域已知的方法通过原位和体外的方式测定。术语“生物样品”意图包括组织、细胞、生物流体和从受试者分离的其分离物，以及受试者体内存在的组织、细胞和流体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，不针对mRNA分离进行选择的任何RNA分离技术可以用来从细胞纯化RNA(见例如，Ausubel等编辑，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，New York 1987-1999)。此外，使用那些本领域技术人员熟知的技术可以很容易地处理大量的组织样品，例如，Chomczynski(1989年，美国专利号4843155)的单步RNA分离法。
分离的mRNA可用于杂交或扩增分析，其包括，但不限于，Southern或Northern分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的一种优选的诊断方法包括将分离的mRNA与核酸分子(探针)接触，此探针可以与待检测的基因编码的mRNA杂交。例如，核酸探针可以是全长cDNA或其部分，如长度至少为7、15、30、50、100、250或500个寡核苷酸且足以在严格条件下与编码本发明的标志物的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。本文描述了用于本发明的诊断分析中的其它合适的探针。mRNA与探针的杂交表明所讨论的标志物正在表达。
在一种形式中，mRNA固定在固体表面上且与探针接触，例如，通过将分离的mRNA在琼脂糖凝胶上进行电泳并将mRNA从凝胶转移到膜上，如硝酸纤维素膜。在替代的形式中，探针固定在固体表面上且mRNA与探针接触，例如在Affymetrix的基因芯片阵列中。熟练技术人员可以很容易地采用已知的mRNA检测方法去检测本发明标志物编码的mRNA的水平。
用于测定样品中mRNA标志物水平的其它替代方法包括核酸扩增的过程，如通过RT-PCR(其实验实施方式在Mullis，1987，美国专利号4,683,202中给出)、连接酶链反应(Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-193)、自主序列复制(Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等，1988，Bio/Technology 6：1197)、滚环复制(Lizardi等，5,854,033号美国专利)或任何其它核酸复制方法，然后用本领域的技术人员熟知的技术对扩增的分子进行检测。如果这些核酸分子存在的数量很低，那么这些检测方案对核酸分子的检测特别有用。如本文所使用的，扩增引物被定义为是可以与基因的5′或3′区域(分别是正链和负链，反之亦然)退火的一对核酸分子。在一般情况下，扩增引物长度是从大约10至30个核苷酸，且侧邻约50至200个核苷酸长度的区域。使用适当的条件和适当的试剂，这些引物允许扩增包含引物侧邻的核苷酸序列的序列的核酸分子。
对于原位方法，mRNA不需要在检测前分离。在这些方法中，利用已知的组织学方法制备/处理细胞或组织样品。然后样品被固定在载体上，通常是载玻片，然后与可以与编码标志物的mRNA杂交的探针接触。
作为是基于标志物的绝对表达水平进行测定的替代方式，也可以是基于标志物的标准化表达水平进行测定。表达水平通过将标志物的表达与非标志物的基因(如组成型表达的管家基因)的表达进行比较而校正标志物的绝对表达水平来标准化。用于标准化的合适基因包括管家基因如肌动蛋白基因或上皮细胞特异性基因。这种标准化允许一个样品(例如，患者样品)中的表达水平与另外一个样品(如非癌样品)进行比较或来自不同来源的样品之间进行比较。
或者，表达水平可以作为相对表达水平提供。为确定标志物的相对表达水平，在确定所研究的样品的表达水平之前，对于正常细胞相对癌细胞分离物的10个或更多个样品，优选50个或更多个样品测定标志物的表达水平。测定较大数目样品中分析的各基因的平均表达水平且这用作标志物的基线表达水平。然后对于测试样品测定的标志物的表达水平(绝对表达水平)除以该标志物获得的平均表达值。这提供了相对表达水平。
优选地，用于基线确定的样品来自于非癌细胞。细胞来源的选择取决于相对表达水平的应用。利用正常组织中发现的表达作为平均表达评分有助于评价分析的标志物是否是癌细胞特异性的(相对于正常细胞)。此外，随着更多数据的积累，平均表达值可以被修正，从而根据积累的数据提供改善的相对表达值。来自癌细胞的表达数据提供用于对癌症状态的严重性分级的手段。
在本发明的另一个实施方式中，标志物蛋白被检测。本发明的优选的用于检测本发明标志物蛋白的试剂是能够结合这种蛋白质或其片段的抗体，优选带有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的，或更优选地是单克隆的。完整的抗体或其片段或衍生物(如Fab或F(AB′)2)可以被使用。涉及探针或抗体的术语“标记的”意图包括将可检测物质与探针或抗体偶联(即物理连接)的直接标记以及通过与直接标记的另一试剂的反应性的探针或抗体的间接标记。间接标记的例子包括使用荧光标记的二级抗体检测初级抗体和生物素末端标记DNA探针以使得可以用荧光标记的抗生蛋白链菌素进行检测。
来自细胞的蛋白质可以用本领域技术人员熟知的技术分离。应用的蛋白质分离方法可以是例如在Harlow和Lane(Harlow和Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)中所述的方法。
可以采用多种形式确定样品中是否含有与给定抗体结合的蛋白质。这些形式的例子包括，但不限于，酶免疫分析法(EIA)、放射免疫分析法(RIA)、Western印迹分析和酶联免疫吸附分析(ELISA)。熟练技术人员可以很容易地采用已知的蛋白质/抗体检测方法去测定细胞是否表达本发明的标志物。
在一种形式中，抗体或抗体片段或衍生物可用于如Western印迹或免疫荧光技术的方法中以检测表达的蛋白质。在这些应用中，通常优选的是将抗体或蛋白质固定在固体载体上。适合的固相支持物或载体包括任何能够结合抗原或抗体的载体。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖酐、尼龙、淀粉酶、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。
本领域的技术人员知道很多其它用于结合抗体或抗原的合适载体，且也能够采用应用于本发明的这类载体。例如，从癌细胞中分离的蛋白质可以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并固定到例如硝酸纤维素的固相载体上。然后，载体可以用适当的缓冲液清洗，随后用可检测的标记抗体进行处理。然后用缓冲液对固相载体进行第二次清洗以除去未结合的抗体。固相载体上的结合标记的量可以通过常规手段检测。
本发明还包括用于检测生物样品中标志物蛋白质或标志物核酸是否存在的试剂盒。这些试剂盒可用于确定受试者是否患有肉瘤或者处于发生肉瘤的较高风险。例如，该试剂盒可包含标记的化合物或能够检测生物样品中的标志物蛋白或核酸的试剂，和用于测定样品中蛋白质或mRNA的量的手段(例如，结合蛋白质或其片段的抗体，或结合编码蛋白质的DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。试剂盒还可以包含解释使用试剂盒得到的结果的说明。
对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可以包括，例如：(1)第一种抗体(例如附着在固体支持物上)，其结合标志物蛋白质；和任选地(2)第二种不同的抗体，其结合蛋白质或结合第一种抗体，并且偶联可检测的标记。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒可以包含，例如：(1)寡核苷酸，例如可检测地标记的寡核苷酸，其与编码标志物蛋白的核酸序列杂交或(2)一对用于扩增标志物核酸分子的引物。该试剂盒还可以包含，例如，缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。该试剂盒可以进一步包含检测可检测的标记所必需的成分(如酶或底物)。该试剂盒也可以包含对照样品或一系列对照样品，其可以用于分析并与测试样品进行比较。试剂盒的各成分可以包封在单个容器中，且所有这些各种不同容器可以处于单一包装中，还具有用于解释使用试剂盒进行的分析的结果的说明书。
B药物基因组学
本发明的标志物也可以作为药物基因组学标志物使用。本文所使用的“药物基因组学标志物”是客观的生化标志物，其表达水平与病人的特异临床药物反应或易感性相关(见，例如McLeod等(1999)Eur.J.Cancer 35(12)：1650-1652)。药物基因组学标志物表达的存在或量与病人的预测反应相关，且更特别地与病人肉瘤对特定药物或特定类药物的治疗的预测反应有关。通过评估病人体内一个或多个药物基因组学标志物表达的存在或量，可以选择对病人最恰当的药物治疗或者预测具有更大程度成功的药物治疗。例如，以病人体内的由特定肿瘤标志物编码的RNA或蛋白质的存在或量为基础，可以选择对很可能存在于病人中的特定肿瘤最优的治疗药物或疗程。所以，使用药物基因组学标志物能够选择或设计对于各个癌症患者最合适的治疗而不用尝试不同的药物或方案。
药物基因组学的另一个方面涉及改变身体对药物的作用方式的遗传状态。这些药物遗传学状态可以作为罕见缺陷或作为多态性发生。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷是常见的遗传酶病，其中主要的临床并发症是氧化剂药物(抗疟疾药物、磺胺类药物、镇痛药、呋喃类药物)摄入后会的溶血和蚕豆消耗。
作为说明性的实施方式，药物代谢酶的活性是是药物作用的强度和持续时间的主要决定因素。药物代谢酶(如N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的遗传多态性的发现提供了为什么有些患者在摄取标准和安全剂量的药物后没有获得预期的药物效应或表现出放大的药物反应和严重的毒性的解释。这些多态性在群体中以两种表型表现出来，强代谢者(EM)和弱代谢者(PM)。PM的流行度在不同群体之间是不同的。例如，编码CYP2D6的基因是高度多态性的且弱代谢者中的几个突变已被确定，其都导致功能性CYP2D6的缺失。当CYP2D6和CYP2C19的弱代谢者接受标准剂量时，他们经常发生放大的药物反应和副作用。如果代谢产物是有活性的治疗成分，PM不显示治疗反应，如由CYP2D6形成的代谢产物吗啡介导的可待因的镇痛作用所证明的。其它的极端情况是所谓的超快代谢者，他们对标准剂量没有反应。最近，超快代谢的分子基础已被确定为是由于CYP2D6基因扩增。
因此，个体内本发明标志物的表达水平可被测定，从而选择针对该个体的治疗或预防处理合适的药剂。此外，药物遗传学研究可以用于将编码药物代谢酶的多态性等位基因的基因型用来鉴定个体的药物反应表型。在用于药物定量或药物选择时，这一知识可以避免不良反应或治疗失败，并因此在用本发明标志物的表达调节治疗受试者时，提高治疗或预防的效率。
C.监测临床试验
监测药剂(例如，药物化合物)对本发明标志物的表达水平的影响不仅可以用于基本药物筛选，也可以用在临床试验中。例如，可以在患者接受对肉瘤的治疗的临床试验中监测药剂影响标志物表达的效果。在优选的实施方式中，本发明提供了用来监测药剂(例如，激动剂、拮抗剂、拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其它候选药物)治疗受试者的效果的方法，包括以下步骤：(i)在施用药剂之前从受试者获得用药前样品；(ii)检测用药前样品中选取的一种或多种本发明标志物的表达水平；(iii)从受试者获得一个或多个用药后样品；(iv)检测用药后样品中标志物的表达水平；(v)比较在用药前样品中标志物的表达水平和一个或多个用药后样品中标志物的表达水平；(vi)相应地改变对受试者的药剂施用。例如，疗程期间标志物基因的表达增加可能表示无效剂量，并且需要增加剂量。相反，标志物基因的表达量下降可以表示是有效治疗，且没有必要改变剂量。
D.阵列
本发明还包含含有本发明标志物的阵列。该阵列可用于分析阵列中一个或多个基因的表达。在一个实施方式中，阵列可以用来分析组织中的基因表达，从而确定阵列中基因的组织特异性。用这种方法，最高约7600个基因的表达可以被同时分析。这允许构建一个或多个组织中特异性表达的一组基因的谱。
除了这些定性测定，本发明还允许基因表达的定量。因此，不仅可以确定组织中的一组基因的组织特异性，而且也能确定组织中一组基因的表达水平。因此，可以根据基因的组织表达本身和表达水平来将其分组。这可用于例如，确定组织间或组织内基因表达的关系。因此，一个组织可以受到干扰且第二组织中基因表达的效应可以确定。在此情况下，可以确定在响应于生物学刺激时，一种细胞类型对另一种细胞类型的影响。这种测定可用于，例如了解细胞-细胞相互作用在基因表达水平的效应。如果药剂被用于治疗性施用地一种细胞类型但对另一细胞类型有不良效应，本发明提供了确定不良效应的分子基础的分析方法，并因此提供了同时共施用中和药剂或者处理不良效应的其它方式的可能。同样，即使是在单一的细胞类型内，不良的生物效应可以在分子水平上确定。因此，也可以确定药剂对标志物基因以外的基因的表达的影响并进行抵消。
在另一个实施方式中，阵列可以用来监测阵列中一个或多个基因的表达时程。这可以发生在各种生物背景中，如本文所披露的，例如肉瘤的发生、肉瘤的发展和过程，与内瘤相关的这种细胞转化。
阵列也可以用来确定在相同细胞或不同细胞中基因的表达对其它基因的表达的影响。如果最终或下游靶标不能被调控，这提供了例如用于治疗介入的替代分子靶标的选择。
阵列还可用于确定正常和异常细胞中一个或多个基因的差异表达谱。这提供了可以用作诊断的或治疗介入的分子靶标的一组基因。
七、获得样品的方法
可在本发明的方法中使用的样品包括表达本发明标志物的任何组织、细胞、组织活检样品或体液样品。在一个实施方式中，样品可以是组织、细胞、全血、血清、血浆、口腔拭子、唾液、脑脊液、尿液、粪便或支气管肺泡灌洗液。在优选的实施方式中，组织样品是肉瘤样品。
可以通过本领域已知的多种技术，包括，例如，通过使用活检或刮或擦拭一个区域或用针抽吸体液，从受试者获取样品。
适用于检测和定量本发明的标志物的组织样品可以是新鲜的、冷冻的或根据本领域的技术人员已知的方法固定的。合适的组织样品优选是切片的并置于显微镜玻片上作进一步分析。或者，固体样品，即组织样品，可以被溶解和/或匀浆，随后做为可溶性提取物进行分析。
在一个实施方式中，使用，例如，液氮或二氯二氟甲烷冷冻新获得的活检样品。使用，例如，OCT加载冷冻的样品用于切片，和在低温恒温器中连续切片。将系列切片收集在玻璃显微镜载片上。对于免疫组织化学染色，该载片可涂覆例如，铬明矾、明胶或聚L-赖氨酸，以确保切片粘附在载片上。在另一个实施方式中，在切片前固定和包埋样品。例如，组织样品可固定在，例如甲醛中，连续脱水和包埋在例如，石蜡中。
一旦获得了样品，可以使用适合检测和定量本发明的标志物的本领域已知的任何方法(在核酸或蛋白质水平)。这些方法是本领域公知的，且包括但不限于，western印迹、Northern印迹、Southern印迹、免疫组织化学、ELISA例如扩增ELISA、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞分析、免疫细胞化学、质谱分析如MALDI-TOF和SELDI-TOF、核酸杂交技术、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。在特定的实施方式中，使用例如，与这些蛋白特异性结合的抗体在蛋白质水平上检测本发明的标志物的表达。
为了使本发明的标志物可用于抗体结合，可能需要对样品进行改性。在免疫细胞学或免疫组织化学方法的特定方面中，载片可以被转移到预处理缓冲液和任选地加热以增加抗原的可接近性。加热预处理缓冲液中的样品快速地破坏细胞的脂质双层和使抗原(可以在新鲜标本的情况下，但通常不会发生在固定的标本中)更易于抗体结合。本文互换地使用的术语“预处理缓冲液”和“制备缓冲液”以指用于为免疫染色制备细胞学或组织学样品的缓冲液，特别是通过增加本发明标志物对于抗体结合的可用性。预处理缓冲液可以包含pH特异性的盐溶液、聚合物、洗涤剂或非离子或阴离子表面活性剂，例如乙氧基化阴离子或非离子表面活性剂、链烷酸脂或烷氧基化物或甚至这些表面活性剂的共混物、或甚至使用胆盐。预处理缓冲液，例如可以是0.1％至1％的脱氧胆酸，钠盐的溶液，或月桂醇聚醚-13-羧酸钠(如，Sandopan LS)的溶液或和乙氧基化阴离子复合物。在一些实施方式中，预处理缓冲液也可以被用作载片存储缓冲液。
任何使本发明的标志物蛋白更易用于抗体结合的方法都可用于本发明的实施中，包括本领域已知的抗原修复方法。见，例如，Bibbo，等，(2002)Acta.Cytol.46：25-29；Saqi，等(2003)Diagn.Cytopathol.27：365-370；Bibbo，等(2003)Anal.Quant.Cytol.Histol.25：8-11，各文献的全部内容在本文中通过引用引入。
经过预处理以增加标志物蛋白质的可用性以后，使用适当的封闭剂，如过氧化物酶封闭剂，如过氧化氢封闭样品。在一些实施方式中，可以使用蛋白质封闭剂封闭样品以防止抗体的非特异性结合。蛋白质封闭剂可以包含，例如，纯化酪蛋白。然后将抗体，尤其是与本发明的标志物特异性地结合的单克隆或多克隆抗体，与样品一起孵育。本领域的技术人员都明白，在某些情况下，可以通过检测病人样品中本发明标志物蛋白质上的多重表位获得更准确的预后或诊断。因此，在特定的实施方式中，使用至少两个针对本发明的标志物的不同表位的抗体。当使用一个以上的抗体时，这些抗体可以作为单独的抗体试剂被顺序添加到单一样品中或作为抗体混合物同时加入。或者，各单独的抗体可被添加到来自同一病人的分离样品中且将由此产生的数据合并。
用于检测抗体结合的技术是本领域中众所周知的。可通过使用产生对应于抗体结合水平的并相应地对应于标志物蛋白质表达水平的可检测信号的化学试剂检测与本发明标志物结合的抗体。在本发明的免疫组织化学或免疫细胞化学方法之一中，通过使用与标记聚合物偶联的次级抗体检测抗体结合。标记聚合物的例子包括但不限于聚合物-酶偶联物。这些复合物中的酶被通常用于催化发色体在抗原抗体结合位点的沉积，从而导致对应于目标标志物的表达水平的细胞染色。特别有用的酶包括，但不限于，辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。
在一个特定的本发明免疫组织化学或免疫细胞化学方法中，通过使用与次级抗体偶联的HRP标记的聚合物检测抗体结合于本发明标志物的抗体。抗体结合也可以通过使用结合单克隆或多克隆抗体的物种特异性探针试剂，和结合于物种特异性探针试剂的与HRP偶联的聚合物检测。使用任何发色团，例如，3，3-二氨基联苯胺(DAB)发色团对于抗体结合进行载片染色，然后用苏木精和任选地发蓝剂如氢氧化氨或TBS/Tween-20复染。其它合适的发色团包括，例如，3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)。在本发明的某些方面，由细胞学技师和/或病理学家在显微镜下检查切片以评价细胞染色，如荧光染色(即标志物表达)。或者，可以通过自动显微镜或借助于有利于阳性染色细胞的识别的计算机软件的人工检查样品。
通过抗标志物抗体与可检测物质的耦合，可以有助于抗体结合的检测。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光物质、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括发光氨；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白质；且合适的放射性材料的例子包括125I、131I、35S、14C或3H。
在本发明的一个实施方式中，如上所述地制备冷冻的样品，并随后用例如使用Tris缓冲盐水(TBS)稀释到适当浓度的抗本发明标志物的抗体染色。可以通过在生物素化的抗免疫球蛋白中孵育载片检测初级抗体。该信号可以任选地放大并使用有抗原的二氨基联苯胺沉淀可视化。此外，可以任选地用，例如，苏木精，复染色载片以使细胞可视化。
在另一个实施方式中，被固定和包埋的样品用抗本发明的标志物的抗体染色，和如上所述地复染冷冻切片。此外，为了可视化抗体染色，可以任选地用试剂处理样品以放大该信号。例如，可以使用过氧化物酶催化的生物素基-酪胺(其随之与过氧化物酶偶联的抗生蛋白链菌素(催化的信号放大(CSA)系统，DAKO，Carpinteria，CA)反应)的沉积。
基于组织的分析(即免疫组织化学)是检测和定量本发明标志物的优选方法。在一个实施方式中，可以通过免疫组织化学检测本发明的标志物的存在或不存在。在一个实施方式中，该免疫组织化学分析使用低浓度的抗标志物抗体，这样使得缺少标志物的细胞不染色。在另一个实施方式中，使用采用高浓度的抗标志物抗体的免疫组织化学方法检测存在或没有本发明的标志物，这样使得缺少标志物蛋白质的细胞重度染色。不染色的细胞含有任一突变的标志物，并不能产生可抗原识别的标志物蛋白质，或者是在其中的调节标志物水平的途径失调的细胞，导致可忽略标志物蛋白质在稳态表达。
本领域的技术人员会认识到，用于实施本发明的方法的特定的抗体的浓度会随着如结合时间、本发明标志物的抗体的特异性水平和样品制备的方法等因素而变化。此外，当使用多种抗体时，所需的浓度可能会受抗体应用于样品的顺序影响，例如，作为混合物同时地应用或作为单独的抗体试剂顺序地应用。此外，还必须优化用于使结合于本发明标志物的抗体可视化的检测化学作用，以产生所需的信噪比。
在本发明的一个实施方式中，使用蛋白质组学方法，例如，质谱，检测和定量本发明的标志物蛋白质。例如，使用其中涉及将生物样品，如血清应用到蛋白质结合芯片上的基质相关激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)或表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF MS)(Wright，G.L.，Jr.等(2002)Expert Rev Mol Diagn2：549；Li，J.等(2002)Clin Chem 48：1296；Laronga，C.等(2003)DisMarkers 19：229；Petricoin，E.F.等(2002)359：572；Adam，B.L.等(2002)Cancer Res 62：3609；Tolson，J.等(2004)Lab Invest 84：845；Xiao，Z.等(2001)Cancer Res 61：6029)检测和定量PY-Shc和/或P66-Shc蛋白质。在例如，美国专利号5,622,824、5,605,798和5,547,835中描述了质谱方法，其中各个文献的全部内容本文通过引用引入。
在另外的实施方式中，在核酸水平检测本发明的标志物的表达。用于评价表达的基于核酸的技术是本领域中熟知的和包括，例如，测定来自受试者的样品中的标志物mRNA的水平。许多表达检测方法使用分离的RNA。可以利用任何不针对mRNA的进行选择的RNA分离技术从表达本发明的标志物的细胞中纯化RNA(见，例如，Ausubel等编辑，(1987-1999)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，New York)。此外，可以使用本领域的技术人员熟知的技术，例如，Chomczynski的单步RNA分离过程(1989，美国专利号4,843,155)，很容易地处理大量的组织样品。
术语“探针”指任何能够选择性地结合到本发明的标志物上的分子，例如，核苷酸的转录本和/或蛋白质。探针可以由本领域的技术人员合成，或源自适当的生物制剂。探针可专门地被设计为被标记的。可以被利用为探针的分子的例子包括，但不限于，RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
分离的mRNA可用于杂交或扩增实验中，包括，但不仅限于，Southern或Northern分析、聚合酶链反应分析及探针阵列。检测mRNA水平的一种方法包括将分离的mRNA与可以与标志物mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。该核酸探针可以是，例如，全长的cDNA，或其一部份，如至少7、15、30、50、100、250或500个核苷酸长度的和足以在严格的条件下与标志物的基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。
在一个实施方式中，mRNA被固定在固体的表面上并与探针接触，例如，通过在琼脂糖凝胶上电泳分离的mRNA和将mRNA从凝胶转移到膜上，如硝酸纤维素膜。在替代的实施方式中，探针被固定在固体表面上并将mRNA与探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列中。熟练的技术人员可以很容易地采用已知的mRNA检测方法用于检测标志物mRNA的水平。
测定样品中的标志物mRNA的水平的可选择的方法涉及核酸扩增的过程，例如，通过RT-PCR(Mullis，1987，4,683,202号美国专利中给出实验性的实施方式)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自主序列复制(Guatelli等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等，(1988)Bio/Technology 6：1197)、滚环复制(Lizardi等，5,854,033美号国专利)或任何其它的核酸扩增方法，随后使用本领域的技术人员众所周知的技术检测该扩增的分子。如果这些分子以非常低的数量存在，这些检测方案特别地适用于核酸分子的检测。在本发明的特定方面，通过定量荧光RT-PCR(即TaqManTM系统)评价标志物的表达。这类方法通常利用本发明的标志物特异性的寡核苷酸引物对。用于设计对已知的序列特异性的寡核苷酸引物的方法是本领域众所周知的。
可以使用膜印迹(如用于杂交分析的，如Northern、Southern、点印迹等等)或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或任何包括结合核酸的固体载体)监测本发明的标志物的表达水平。见，此处通过引用引入的5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934号美国专利。标志物表达的检测也可以包括使用在溶液中的核酸探针。
在本发明的一个实施方式中，将微阵列用于检测本发明的标志物的表达。因为不同实验之间的再现性，微阵列特别好地适合于这一目的。DNA微阵列为大量的基因的表达水平的同时测量提供了方法。每个阵列由附着在固体支撑物上的捕获探针的可再现图案组成。标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后由激光扫描检测。测定阵列上各探针的杂交强度，并转换为代表相关基因表达水平的定量值。见此处通过引用引入的6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316号美国专利。高密度寡核苷酸阵列特别地可用于测定样品中大量RNA的基因表达谱。
使用本发明的方法(其可包括本领域的技术人员已知的回归分析的方法)，本发明标志物的量和/或标志物量的数学关系可用于计算接受肉瘤治疗的受试者中肉瘤复发的风险、接受肉瘤治疗的受试者的生存、肉瘤是否为侵袭性的、治疗肉瘤的治疗方案的疗效等等。例如，适当的回归模型包括，但不限于，CART(如Hill，T和Lewicki，P.(2006)“STATISTICS Methods and Applications”StatSoft，Tulsa，OK)、Cox(如，www.evidence-based-medicine.co.uk)、指数的、正态的和对数正态的(例如，www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html)、逻辑的(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression)、参数的、非参数的、半参数的(例如，www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion)、线性的(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression)或加性的(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model)。
在一个实施方式中，回归分析包括标志物的量。在另一个实施方式中，回归分析包括标志物数学关系。在再另一个实施方式中，标志物量的回归分析和/或标志物数学关系可以包括另外的临床的和/或分子的协变量。这种临床的协变量包括，但不限于，淋巴结状态、肿瘤阶段、肿瘤级别、肿瘤大小、治疗方案例如化疗和/或放射治疗、临床结果(例如，复发、疾病特异性生存、治疗失败)和/或随诊断后时间、治疗开始后的时间和/或治疗结束后的时间变化的临床结果。
在另一个实施方式中，使用本发明的方法(其可以包括本领域的技术人员已知的回归分析的方法)，标志物的量和/或标志物量的数学关系可用于计算接受肉瘤治疗的受试者中肉瘤复发的风险、接受肉瘤治疗的受试者的生存、肉瘤是否为侵袭性的、治疗肉瘤的治疗方案的疗效等等。例如，适当的回归模型，包括但不限于，CART(如，Hill，T和Lewicki，P.(2006)“STATISTICS Methods and Applications”StatSoft，Tulsa，OK)、Cox(如，www.evidence-based-medicine.co.uk)、指数的、正态的和对数正态的(例如，www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html)、逻辑的(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression)、参数的、非参数的、半参数的(例如，www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion)、线性的(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression)或加性的(例如，www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model)。
在一个实施方式中，回归分析包括标志物的量。在另一个实施方式中，回归分析包括标志物数学关系。在再另一个实施方式中，标志物量和/或标志物数学关系的回归分析可以包括另外的临床的和/或分子的协变量。这种临床的协变量包括，但不限于，淋巴结状态、肿瘤阶段、肿瘤级别、肿瘤大小、治疗方案例如化疗和/或放射治疗、临床结果(例如，复发、疾病特异性的生存、治疗失败)和/或随诊断后时间、治疗开始后的时间和/或治疗结束后的时间变化的临床结果。
八、试剂盒
本发明还提供了用于预测肉瘤、肉瘤复发或正在接受肉瘤治疗的受试者的生存的组合物和试剂盒。这些试剂盒包括下列的一个或多个：与本发明的标志物特异性结合的可检测的抗体、与本发明的标志物特异性结合的可检测的抗体、获取和/或制备受试者组织样品进行染色的试剂和使用说明。
本发明的试剂盒可以任选地包含用于完成本发明方法的另外的成分。例如，该试剂盒可以包含适用于互补核酸的退火或适用于将抗体和与之特异性结合的蛋白质相结合的流体(例如，SSC缓冲液)、一个或多个样品室、描述本发明方法的性能的说明材料和组织特异性的对照/标准品。
九、筛选试验
本发明的靶标包括，但不限于，本文后面的表2-9中所列出的基因。基于申请人此处所描述的实验结果，由Q10调节的关键蛋白质与不同的途径或分子组相关联或可以被划分到不同的途径或分子组中，包括细胞骨架成分、转录因子、细胞凋亡反应、磷酸戊糖途径、生物合成途径、氧化应激(促氧化剂)、膜更迭(membrane alteration)和氧化磷酸化代谢。
因此，在本发明的一个实施方式中，标志物可以包括ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3AL9S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD6567、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基，Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure BPA00001530185500961
结合抑制剂、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3、真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD，hnRNP C1/C2，真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRaf pSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、肌球蛋白调节轻链、hnRNPC1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、β-微管蛋白、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1β2、ER脂筏相关2同型体1(β肌动蛋白)、信号序列受体1δ、真核翻译起始因子3、亚基3γ、胆绿素还原酶A(转醛醇酶1)、角蛋白1，10(旁胸腺素)、GSTω1、B链多巴胺苯醌结合DJ-1、蛋白酶体激活剂Reg(α)、T-复合蛋白1同型体A、链A甲巯蛋白ERP57(含伴侣蛋白的TCP1)、泛素激活酶E1；丙氨酰-tRNA合成酶、动力蛋白激活蛋白1、热休克蛋白60kd、β肌动蛋白、亚精胺合成酶(β肌动蛋白)、热休克蛋白70kd、视网膜母细胞瘤结合蛋白4同型体A、TAR DNA结合蛋白、真核翻译延长因子1β2、含伴侣蛋白的TCP1、亚基3、胞质动力蛋白IC-2、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2和VEGFA。
下面描述用于鉴定已识别标志物的调节剂的筛选试验。
本发明还提供了鉴别通过调节本发明的标志物的表达和/或活性而可用于治疗或预防肉瘤的调控剂，即候选的或测试的化合物或试剂(如蛋白质、肽、拟肽、类肽、小分子或其它药物)的方法(本文也称为“筛选试验”)。这种分析通常包括本发明的标志物和一种或多种分析成分之间的反应。其它成分可以是测试化合物本身或测受试化合物与本发明标志物的天然结合伴体的组合。通过分析(如本文所述的那些)鉴别的化合物可用于，例如，调节如抑制、缓解、治疗或防止肉瘤的侵袭性。
本发明的筛选试验中使用的测试化合物可从任何可用的来源获得，包括天然的和/或合成的化合物的系统文库。测试化合物也可以通过本领域已知的组合文库的多种途径中任何一种获得，包括：生物文库；类肽文库(具有肽的功能性但具有对酶降解有抗性的新型的、非肽骨架的分子的文库，其仍保持生物活性，见，例如，Zuckermann等，1994，J.Med.Chem.37：2678-85)；可空间编址的平行固相或溶液相文库；需要去卷积的合成文库方法；“一珠一化合物”文库方法；和采用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库和类肽文库途径限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽低聚物或小分子化合物文库(Lam，1997，Anticancer Drug Des.12：145)。
在本领域中可以找到分子文库的合成方法的实例，例如在DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann等(1994).J.Med.Chem.37：2678；Cho等(1993)Science 261：1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；和Gallop等(1994)J.Med.Chem.37：1233中。
化合物文库可存在于溶液中(例如，Houghten，1992，Biotechniques13：412-421)、或在珠上(Lam，1991，Nature 354：82-84)、芯片上(Fodor，1993，Nature 364：555-556)、细菌和/或孢子上(Ladner，USP5,223,409)、质粒上(Cull等，1992，Proc Natl Acad Sci USA89：1865-1869)或在噬菌体上(Scott和Smith，1990，Science249：386-390；Devlin，1990，Science 249：404-406；Cwirla等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382；Felici，1991，J.Mol.Biol.222：301-310；Ladner，同上)。
本发明的筛选方法包括将肉瘤细胞与测试化合物接触，并测定测试化合物调节细胞中本发明标志物的表达和/或活性的能力。可以如本文所述地测定本发明的标志物的表达和/或活性。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于筛选作为本发明标志物或其生物活性部分的底物的候选或测试化合物的分析方法。在再另一个实施方式中，本发明提供了用于筛选结合于本发明的标志物或者其生物活性部分的候选或测试化合物的分析方法。测定测试化合物直接结合标志物的能力可以通过，例如，将化合物与放射性同位素或酶学标记偶联以使得可以通过检测复合物中标记的标志物化合物测定标志物与化合物的结合来完成。例如，可以直接地或者间接地用131I、125I、35S、14C或3H标记化合物(如标志物底物)和通过射电辐射的直接计数或通过闪烁计数检测放射性同位素。或者，可以用例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶酶学标记分析成分，和通过测定合适的底物至产物的转化检测酶学标记。
本发明进一步涉及通过上述筛选试验确定新型药剂。因此，进一步在合适的动物模型中使用如本文所述地鉴定的药剂包括在本发明的范围内。例如，如本文所述的被鉴定为能够调节本发明标志物的表达和/或活性的药剂可用于动物模型中来确定用这种药剂治疗的效力、毒性或副作用。或者，如本文所述的被鉴定的药剂可用于动物模型中以测定这样的药剂的作用机制。此外，本发明涉及应用通过如上所述的筛选试验确定的新型药剂用于如上所述的治疗。
X.药物的组合物和药物施用
本发明提供了包含辅酶Q10分子如CoQ10的组合物。可以把辅酶Q10分子加入到适合给受试者施用的药物组合物中。通常情况下，药物组合物包含辅酶Q10分子和药学上可接受的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任一和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等等。药学上可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种以及其组合。在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包括少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们能延长环境影响剂的保存期或效力。
本发明的组合物可以以多种形式存在。这些形式包括，例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如可注射溶液和可输注溶液)、分散或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、膏剂、洗剂、搽剂、软膏或糊剂、施用于眼睛、耳朵或鼻子的滴剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于用药和治疗应用的预期模式。
可以通过本领域已知的多种方法将辅酶Q10分子施用于受试者。对于许多治疗应用，优选的用药途径/模式是局部的施用、皮下注射、静脉注射或输注。如专业的技术人员可以理解的，给药途径和/或模式随着所期望的结果的不同而改变。在某些实施方式中，活性化合物可以与载体一起制备，载体用来防止化合物快速释放，如控释制剂，包括埋植剂、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容性的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于这类制剂的许多制备方法获得专利或为本领域技术人员所知。见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。在一个实施方式中，用药模式是肠胃外用药(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。在一个实施方案中，通过静脉内输注或注射施用环境影响剂。在另一个实施方案中，通过肌肉内或皮下注射施用环境影响剂。在优选的实施方案中，局部施用环境影响剂。
药物组合物通常必须是无菌和在生产和储存条件下是稳定的。组合物可以被配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或其它适合高药物浓度的有序结构。无菌注射溶液的制备可以通过将活性化合物(即环境影响剂)按需要量加入到适当的溶剂中，根据需要具有上述列举的成分中的一种或组合，然后过滤除菌。一般来说，分散体的制备是通过将活性化合物加入到包含基础分散介质和所需的上述列举的其它成分的无菌载体中。在用于制备无菌注射液的无菌冻干粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和喷雾干燥，其从前述无菌过滤溶液产生活性成分加所需的任何附加成分的粉末。可以保持溶液适当的流动性，例如通过使用涂层如卵磷脂，在分散体的由衷中通过维持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂。可以通过在组合物中包括延缓吸收的物质，例如，单硬脂酸盐和明胶，导致可注射组合物的延长吸收。
技术和制剂一般可在参考文献Remmington′s PharmaceuticalSciences，Meade Publishing Co.，Easton，Pa中找到。对于全身施用，注射是优选的，包括肌肉内注射、静脉内注射、腹膜内注射及皮下注射。对于注射，本发明的化合物可在液体溶剂中配制，优选在生理学相容的缓冲液如Hank′s溶液或Ringer′s溶液中。此外，该组合物可以配制成固体形式，且恰在使用前再溶解或重悬。也可以包括冻干形式。
对于口服施用，药物组合物可以采取的剂型，例如，通过传统方法用药学上可接受的赋形剂制成的片剂或胶囊的形式，赋形剂如粘合剂(例如预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉或二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)或湿润剂(如十二烷基硫酸钠)。片剂可以用本领域熟知的方法进行包衣。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆剂或悬浮液的形式，或它们可被制成干燥产品，在使用前用水或适当的介质构建。这种液体制剂可用药学上可接受的添加剂通过常规方法制备，药学上可接受的添加剂如悬浮剂(如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)、乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性介质(如ationd油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。制剂中也可以包含适当的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
口服施用的制剂可以适当地配制以控制活性化合物的释放。对于口腔施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。对于吸入施用，用于本发明的化合物可以方便地利用合适的推进剂以来自加压的容器或喷雾器的气溶胶喷雾剂形式递送，推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适用气体。在加压气溶胶的情况中，剂量单位可以通过设置定量递送的阀进行确定。如用于吸入器或吹入器中的明胶的胶囊或药筒可以配制为包含化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的混合物。
化合物可以配制成用于通过注射方法进行肠胃外给药，如快速浓注或连续输注。用于注射的制剂可以以加有防腐剂的单位剂型存在，例如安瓿中或多剂量容器中。组合物可以采取油性或水性介质中的混悬液、溶液或乳液的形式，且可以包含制剂物质如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用之前由适宜的介质构建，如灭菌无热原水。
化合物也可以配制成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂，如包含常规的栓剂基质，如可可脂或其它甘油酯。
除了前面所述的制剂，化合物也可以配制成储存制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下的或肌肉内的)或通过肌肉内注射施用。因此，例如化合物可以用合适的聚合的或疏水的材料(如可接受油中的乳液)或离子交换树脂，或难溶衍生物如难溶盐配制。
全身用药也可以通过经粘膜或透皮装置。对于经粘膜或透皮给药，制药中使用适合需渗透的屏障的渗透剂。这类渗透剂通常是本领域已知的，且包括例如，用于经粘膜施用胆盐和夫西地酸衍生物，另外去污剂可以用来帮助渗透。经粘膜给药可以通过鼻腔喷雾或使用栓剂。对于局部给药，本发明的化合物配制成通常本领域已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。洗液可用于局部治疗损伤或炎症以加快愈合。
如果需要的话，组合物可以以包含一个或多个含活性成分的单位剂型的包装或分配器装置的形式存在。这种包装可以包括例如金属或塑料箔，如泡罩包装。这种包装或分配器装置可以附带用药说明书。
对于涉及核酸给药的治疗，本发明的化合物可以被配制成多种施用模式，包括全身和局部或定位给药。技术和制剂一般可在Remmington′sPharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.，Easton，Pa中找到。对于全身给药，注射是优选的，包括肌肉内注射、静脉内注射、腹膜内注射、节内注射和皮下注射。对于注射，本发明的化合物可配制在液体溶液中，优选生理相容的缓冲液，如Hank′s溶液或Ringer′s溶液。此外，化合物可以配制成固体形式，且恰在使用前再溶解或重悬。也包括冻干形式。
在本发明的优选实施方案中，包含辅酶Q10分子如CoQ10的组合物局部给药。优选经药物制剂呈现活性成分，即辅酶Q10分子。对于局部给药，活性成分可以占终产物中制剂重量的约0.001％至约20％w/w，尽管可以占到制剂的多达30％w/w，但优选是制剂的1％到20％w/w。本发明的局部制剂包含活性成分以及一种或多种的可接受的载体和任选的其它治疗成分。载体在与制剂中其它成分相容和对接受者无毒害作用方面是“可接受的”。
在治疗表现目标疾病的患者时，施用一种或多种治疗有效量的药剂。治疗有效剂量是指改善病人症状和延长病人生存的化合物的量。
这些化合物的毒性和疗效可通过标准的药学过程在细胞培养物或实验动物中来测定，例如，测定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，且它可以表示为LD50/ED50比。表现出较大治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养物分析和动物研究所得数据可以用来制定一系列用于人类的剂量。这些化合物的剂量优选在包括ED50而具有很少或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以根据所用剂型和采用的施用途径在这个范围内变化。
对于本发明方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可从细胞培养物分析初始估算。例如，可在动物模型中制定剂量以达到包括在细胞培养物中确定的IC50的循环血浆浓度范围。这些信息可以被用来更准确地确定人类的可用剂量。血浆水平可以被测量，例如通过高效液相色谱。
确切的制剂、用药途径和剂量可以根据病人的情况由个人医生来选择(见例如，Fingl等，在The Pharmacological Basis of Therapeutics，1975，Ch.1p.1中)。应该指出的是，根据毒性或器官机能障碍，主治医生知道如何和何时终止、中断或调整用药。相反，主治医生也知道，如果临床反应不充分(排除毒性)，则调整治疗至较高水平。在控制目标致癌疾病时，施用剂量的幅度随待治疗病症的严重性和用药途径来改变。病症的严重性可以例如通过标准的预后评价方法部分地评价。此外，剂量和也许剂量频率也根据个体病人的年龄、体重和反应而变化。与上述讨论相当的程序可被用于兽药学。
取决于进行治疗的特定病症，这些药剂可被配制和全身或局部用药。制剂和施用的技术可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1990)中找到。合适的途径可以包括口服、直肠、透皮、阴道、经粘膜或肠道给药；肠胃外递送，包括肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、心室内直接注射、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，仅举几例。
上述的组合物可以以任何合适的制剂施用于受试者。除了用辅酶Q10分子如CoQ10的局部制剂治疗肉瘤外，在本发明的其它方面中辅酶Q10分子可以通过其它方法递送。例如，辅酶Q10分子可以配制用于肠胃外递送，例如用于皮下、静脉内、肌肉内或肿瘤内注射。可以使用其它递送方法，例如，脂质体递送或用组合物浸渍的装置的扩散。组合物可以以单次快速浓注、多次注射或持续输注(例如静脉内或通过腹膜透析)给药。对于肠胃外给药，组合物优选配制成无菌无热原的形式。本发明的组合物也可以通过简单地将组合物加到含有细胞的流体中而在体外施用于细胞(例如，在体外培养物中诱导癌细胞的细胞凋亡)。
对于注射，本发明的药剂可以配制成水性溶液，优选生理学相容的缓冲液如Hanks′s溶液、Ringer′s溶液或生理盐水缓冲液。对于这种经粘膜的给药，适合于待穿透的屏障的渗透剂用于制剂中。这些渗透剂是本领域通常熟知的。
使用药学上可接受的载体将本文公开用于实施本发明的化合物配制成适合全身给药在本发明的范围内。通过选择合适的载体和合适的制备方式，本发明的组合物特别是配制为溶液的组合物可以通过肠胃外给药，如通过静脉内注射。化合物可以使用本领域公知的药学上可接受的载体很容易地配制成适合口服用药的剂型。这些载体使得本发明的化合物能够配制成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、悬浮液等，用于治疗的病人口服摄取。
意图用于细胞内施用的药剂可以使用本领域的普通技术人员熟知的技术施用。例如，这些药剂可以被包封在脂质体中，然后按上述方法施用。脂质体是带有水性内部的球形脂质双层。在形成脂质体时存在于水性溶液中的所有分子结合到水性内部中。脂质体内容物会受到保护免受外部微环境影响，和由于脂质体与细胞膜的融合，脂质体内容物能有效地递送到细胞的胞质中。此外，由于其疏水性，有机小分子可以直接进行细胞内施用。
适用于本发明中的药物组合物包括其中包含有效量的活性成分以达到预期目的的组合物。本领域的技术人员能确定有效量，特别是参照本文提供的详细公开。除了活性成分，这些药物组合物可以含有合适的药学上可接受的载体包括赋形剂和辅料，其有助于将活性化合物加工成可治疗使用的制剂。该配制用于口服施用的制剂可以是片剂、胶囊或溶液的形式。本发明的药物组合物可以通过例如常规混合、溶解、造粒、糖锭形成、悬浮、乳化、包封、包埋或冻干过程以其本身已知的方式制备。
适合局部给药的制剂包括适于通过皮肤渗透到达治疗所需的位置的液体或半液体制剂，如搽剂、洗液、乳膏、油膏或糊剂，及适合施用于眼睛、耳朵或鼻子的滴剂。本发明的滴剂可以包含无菌水性或油性溶液或悬浮液，且可以通过将活性成分溶解在杀菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其它合适的防腐剂的适宜水性溶液中制备，且优选包括表面活性剂。由此得到的溶液随后可以通过过滤澄清和作菌，并通过无菌技术转移到容器中。适合包括在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的例子为硝酸苯基汞或醋酸(0.002％)、洁尔灭(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。用于油性溶液制备的适用溶剂包括甘油、稀释乙醇和丙二醇。
本发明的洗剂包括适用于皮肤或眼睛的洗剂。眼睛洗剂可包含任选含有杀菌剂的无菌水性溶液，且可以用类似于滴剂制备的方法来制备。用于皮肤的洗剂或搽剂也可以含有是加速干燥或冷却皮肤的试剂，如醇或丙酮，和/或保湿剂如甘油或油如蓖麻油或花生油。
本发明的乳膏、油膏或糊剂是用于外部的有效成分的半固体制剂。它们可以通过在合适机械设备的辅助下混合细分的或粉末形式的活性成分(单独的或在水性或非水性流体的溶液或悬浮液中)和油脂性或非油脂性基质。该基质可以包括碳氢化合物如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；粘胶；天然来源的油如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物、或脂肪酸如硬脂酸或油酸，以及醇如丙二醇或大粒凝胶。该制剂可以包含任何合适的表面活性剂，如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，如脱水山梨醇酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以包括悬浮剂如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料如silicaceous二氧化硅和其它成分如羊毛脂。
用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶性形式的活性俄的水溶液。此外，活性化合物的悬浮液可制备成溶于适宜的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或介质包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯或者脂质体。水性注射悬浮液可以包含提高悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液也可以包含提高化合物的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的合适的稳定剂或试剂。
口服使用的药物制剂可以通过将活性化合物与固体赋形剂混合来制备，任选地研磨得到的混合物，和添加合适的辅助剂后(如果需要)处理颗粒混合物以获得片剂或糖锭核心。合适的赋形剂特别是，填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，崩解剂可以被添加，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐，如藻酸钠。
糖锭核心设置合适的包衣。为此，可以使用浓缩糖溶液，糖溶液可以任选地包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料可以被添加到片剂或糖锭包衣中用来识别或表征的活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物制剂包括明胶制成的压接胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油和山梨醇制成的软的、密封的胶囊。压接胶囊可容纳与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以添加稳定剂。
如果需要的话，组合物可以包括缓冲系统。缓冲系统选择用来维持或缓冲组合物的pH值在希望的范围内。本文使用的术语“缓冲系统”或“缓冲液”是指当处于水溶液中时，在酸或碱加入其中时稳定该溶液以避免大的pH值(或氢离子浓度或活性)变化的一种或多种溶质物质。一种或多种溶质物质是公知的，其负责对抗或改变在上述范围内的起始缓冲pH值。
药物组合物的最终pH值可以在生理相容范围内发生变化。必然地，最终pH值是不刺激人体皮肤和优选使得有助于活性化合物，即辅酶Q10分子透皮运输的pH值。在不违反这个限制条件的情况下，当需要时可以选择pH值以提高辅酶Q10分子的稳定性和调节稠度。在一个实施方案中，优选的pH值为约3至约7.4，更优选约3至约6.5更好，最优选约3.5至约6.0。
对于优选的局部递送介质，组合物的其余成分是水，其必须是纯化的，如去离子水。这样的递送介质组合物包含占组合物总重的超过约50％至约95％的水。具体的存在水量不是关键的，但可调整以获得需要的粘度(通常约50cps至约10000cps)和/或其它成分的浓度。局部递送介质的粘度优选是至少约30厘泊。
其它已知的透皮渗透增强剂也可以用来帮助辅酶Q10分子的递送。用作说明的物质有亚砜类如二甲亚砜(DMSO)等等；环酰胺类如1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮(1-dodecylazacycloheptane-2-one)(Azone.TM.，Nelson Research，Inc.公司的注册商标)等等；酰胺类如N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二乙基甲苯酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基辛酰胺、N，N-二甲基癸酰胺(decamide)等等；吡咯烷酮衍生物如N-甲基-2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮、2-吡咯烷酮-5-羧酸、N-(2-羟乙基)-2-吡咯烷酮或其脂肪酸酯、1-十二烷基-1-4-甲氧羰基-2-吡咯烷酮、N-牛脂基吡咯烷酮等等；多元醇如丙二醇、乙二醇、聚乙二醇、二丙二醇、甘油、己三醇等等；线性和支链脂肪酸如油酸、亚油酸、月桂酸、戊酸、庚酸、己酸、肉豆蔻酸、异戊酸、新戊酸、三甲基己酸、异硬脂酸等等；醇类如乙醇、丙醇、丁醇、辛醇、油醇、硬脂醇、亚麻醇等等；阴离子表面活性剂如月桂酸钠、十二烷基硫酸钠等等；阳离子表面活性剂如苯扎氯铵、十二烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵等等；非离子表面活性剂如丙氧基化聚氧乙烯醚，例如泊洛沙姆231、泊洛沙姆182、泊洛沙姆184等等，乙氧基化脂肪酸，例如吐温20、Myjr 45等等，去水山梨糖醇衍生物，例如吐温40、吐温60、吐温80、司盘60等等，乙氧基化醇，例如聚氧乙烯(4)月桂醇醚(Brij 30)、聚氧乙烯(2)油基醚(Brij93)等等，卵磷脂和卵磷脂衍生物等等；萜类如D-柠檬烯、α-蒎烯、β-蒈烯、α-松油醇、香芹醇、香芹酮、薄荷酮、二戊烯氧化物、α-蒎烯氧化物、桉树油等等。有机酸和酯如水杨酸、水杨酸甲酯、柠檬酸、琥珀酸等等也适合作为皮肤渗透增强剂。
在一个实施方式中，本发明提供了辅酶Q10组合物和其制备方法。优选地，组合物包含至少约1％到约25％w/w的辅酶Q10的分子(例如，CoQ10)。可从Asahi Kasei N&P(日本，北海道)公司作为UBIDECARENONE(USP)获得CoQ10。也可以从Kaneka公司(得克萨斯州，帕萨迪纳，美国)作为Kaneka Q10(USP UBIDECARENONE)获得粉状形式的CoQ10。用于本文中例举方法中的辅酶Q10具有以下特性：残留溶剂符合USP 467的要求；含水量低于0.0％，低于0.05％或低于0.2％；灼烧残渣为0.0％，低于0.05％，或低于0.2％以内；重金属含量低于0.002％，或低于0.001％；纯度达到98-100％或99.9％，或99.5％。药制备组合物的方法举例将在下面实施例章节中提供。
在本发明的某些实施方案中，提供用于通过向人体局部施用辅酶Q10分子，如CoQ10，治疗或预防人的肉瘤的方法，以治疗和预防肉瘤的发生，其中向人施用局部介质中的局部剂量的辅酶Q10分子，如CoQ10，其中辅酶Q10分子，如CoQ10，以每平方厘米皮肤约0.01至约0.5毫克辅酶Q10分子，如CoQ10，的范围应用于靶组织。在一个实施方案中，辅酶Q10分子，如CoQ10，以每平方厘米皮肤约0.09至0.15毫克辅酶Q10的范围应用到靶组织。在各种不同的实施方式中，辅酶Q10的分子，如CoQ10，以每平方厘米皮肤约0.001至约5.0，约0.005至约1.0，约0.005到约0.5，约0.01至约0.5，约0.025至约0.5，约0.05至约0.4，约0.05至约0.30，约0.10至约0.25或约0.10至约0.20毫克辅酶Q 10分子，如CoQ10的范围应用到靶组织。在其它实施方案中，辅酶Q 10的分子，如CoQ10，以约为每平方厘米皮肤约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49或0.5毫克辅酶Q10分子，如CoQ10，的剂量应用到靶组织。在一个实施方案中，辅酶Q10分子，如CoQ10，以每平方厘米皮肤约0.12毫克辅酶Q10分子，如CoQ10，的剂量应用到靶组织。应当理解，具有这些值中的任意一个作为上限或下限的范围也是本发明的部分，例如，每平方厘米皮肤约0.03至约0.12、约0.05至约0.15、约0.1至约0.20或约0.32至约0.49毫克。
本发明的另一实施方案中，辅酶Q10分子以辅酶Q10分子乳膏的形式进行给药，剂量为每平方厘米皮肤0.5至10毫克辅酶Q10分子乳膏，其中辅酶Q10分子乳膏包含1至5％的辅酶Q10分子，例如CoQ10。在一个实施方案中，辅酶Q10分子，例如CoQ10，乳膏包含约3％的辅酶Q10分子，例如CoQ10。在其它实施方案中，辅酶Q10分子乳膏包含约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的辅酶Q10分子，例如CoQ10。在各种不同的实施方式中，辅酶Q10分子乳膏以每平方厘米皮肤约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，9.5或10毫克辅酶Q10分子，例如CoQ10乳膏的剂量施用。应当理解，具有这些值中的任意一个作为上限或下限的范围也是本发明的一部分，例如，每平方厘米皮肤约0.5至约5.0、约1.5至2.5或约2.5至5.5毫克的CoQ10分子，例如CoQ10乳膏。
在另一实施方案中，辅酶Q10分子以乳膏的形式给药，剂量为每平方厘米皮肤3至5毫克辅酶Q10分子，例如CoQ10，乳膏，其中辅酶Q10分子，例如CoQ10，乳膏包含1至5％的辅酶Q10分子。在一个实施方案中，辅酶Q10分子，例如CoQ10，乳膏包含约3％的辅酶Q10分子。在其它实施方案中，辅酶Q10分子，例如CoQ10，乳膏包含约1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的辅酶Q10分子。在各种不同的实施方案中，辅酶Q10分子乳膏以每平方厘米皮肤约3.0、3.1、3.2、、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.84.9或5.0毫克辅酶Q10分子，例如CoQ10乳膏的剂量施用。应当理解，具有这些值中的任意一个作为上限或下限的范围也是本发明的一部分，例如每平方厘米皮肤约3.0至约4.0、约3.3至5.3或约4.5至4.9毫克CoQ10分子，例如CoQ10，乳膏。
本发明的某些方面提供了通过向人局部施用辅酶Q10以使得治疗或预防肉瘤发生而治疗或预防肉瘤的方法，其中每24小时局部应用辅酶Q 10一次或多次，持续6周或更长。
本发明的某些方面提供了辅酶Q10乳膏3％的制备方法，其包括制备A、B、C、D和E相并组合所有相以形成3％辅酶Q10乳膏的水包油型乳剂的步骤。
在某些实施方案中，A相成分包括4.00％w/w的烷基C12-15苯甲酸NF、2.00％w/w的十六醇NF、4.5％w/w的甘油硬脂酸盐/PEG-100和1.50％w/w的十八(醇NF；而B相成分包括5.00％w/w的二乙二醇单乙基醚NF、2.00％w/w的甘油USP、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇、16.725％w/w的纯化水USP和40.00％w/w的卡波姆分散体2％；且C相成分包括0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。此外，在这些实施方案中，D相成分包括1.00％w/w的二氧化钛USP，而E相成分包括15％w/w的辅酶Q1021％浓缩物。
在其它某些实施方案中，A相成分包括4.00％w/w的癸/辛酸甘油三酯、2.00％w/w的十六醇NF、4.5％的甘油硬脂酸盐/PEG-100、1.5％w/w的十八醇NF；而B相成分包括5.00％w/w的二乙二醇单乙醚NF、2.00％w/w的甘油、1.50％w/w的丙二醇USP、0.475％w/w的苯氧乙醇NF、16.725％w/w的纯化水USP和40.00％w/w的卡波姆分散体2％；和C相成分包括0.50％w/w的乳酸USP、2.00％w/w的乳酸钠溶液USP、1.30％w/w的三乙醇胺NF和2.50％w/w的纯化水USP。此外，在这些实施方案中，D相成分包括1.00％w/w的二氧化钛USP，而E相成分包括15％w/w的辅酶Q10 21％浓缩物。
在本发明的某些实施方案中，提供了用于制备辅酶Q10乳膏3％的方法，其包括(1)将A相成分加入到合适的容器中并在70-80℃水浴加热；(2)将B相成分(除了卡波姆分散体)加入到合适的容器中，并混合形成混合的B相；(3)将E相成分置于合适的容器中，并在50-60℃下用水浴使其融解以形成融熔的E相；(4)将卡波姆分散体加入到混合罐中，并在混合条件下加热到70-80℃；(5)将混合的B相加入到混合罐中，同时保持温度在70-80摄氏度；(6)将C相成分加入到混合罐中，同时保持在70-80摄氏度的温度；(7)将D相成分加入到混合罐中，然后继续混合和均质化混合罐中的内容物；然后(8)停止均质化，并将混合罐的内容物冷却到50-60摄氏度；然后(9)停止混合，并将融熔的E相加入到混合罐中以形成分散体；(10)然后恢复混合直到分散体平滑和均匀；然后(11)冷却混合罐的内容物至45-50℃的步骤。
在本发明的一些其它实施方式中，提供了包含辅酶Q10乳膏3％的药物组合物。此乳膏包括：具有组合物的4.00％w/w的C12-15烷基苯甲酸酯、组合物的2.00％w/w的十六醇、1.5％w/w的十八醇、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；具有2.00％w/w的甘油、1.5％w/w的丙二醇、5.0％w/w的乙氧基二甘醇(ethoxydiglycol)、0.475％w/w的苯氧乙醇、40.00％w/w的卡波姆分散体、16.725％w/w的纯化水的B相；具有1.300％w/w的三乙醇胺、0.500％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠、2.5％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有15.000％w/w的辅酶Q10 21％浓缩物的E相。在一些实施方案中，卡波姆分散体包括水、苯氧乙醇、丙二醇、卡波姆940。
在本发明的一些其它实施方案中，提供了包含辅酶Q10乳膏3％的药物组合物。该乳膏包括具有组合物的4.00％w/w的癸/辛酸甘油三酯、组合物的2.00％w/w的十六醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.5％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；具有2.00％w/w的甘油、1.5％w/w的丙二醇，5.0％w/w的乙氧基二甘醇、0.475％w/w的苯氧乙醇、40.00％w/w的卡波姆分散体、16.725％w/w的纯化水的B相；具有1.300％w/w的三乙醇胺、0.500％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠、2.5％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有15.000％w/w的浓度辅酶Q 1021％浓缩物的E相。在一些实施方案中，卡波姆分散体包括水、苯氧乙醇、丙二醇和卡波姆940。
在本发明的一些其它实施方式中，提供了包含辅酶Q10乳膏1.5％的药物组合物。该乳膏包括具有5.000％w/w的C12-15烷基苯甲酸酯、2.000％w/w的十六醇、1.5％w/w的十八醇、4.500％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；具有2.000％w/w的甘油、1.750％w/w的丙烯、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.463％w/w的苯氧乙醇、50％w/w卡波姆分散体和11.377％w/w的纯化水的B相；具有1.3％w/w三乙醇胺、0.400％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液和4.210％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有1.500％w/w的辅酶Q10 21％浓缩物的E相。
在本发明的一些其它实施方案中，提供了包含辅酶Q10乳膏1.5％的药物组合物。该乳膏包括具有5.00％w/w的癸/辛酸甘油三酯、2.00％w/w的十六醇、1.5％w/w的硬脂醇、4.500％w/w的硬脂酸甘油酯和PEG-100的A相；具有2.00％w/w的甘油、1.750％w/w的丙烯、5.000％w/w的乙氧基二甘醇、0.463％w/w的苯氧乙醇、50.00％w/w的卡波姆分散体和11.377％w/w的纯化水的B相；具有1.3％w/w的三乙醇胺、0.400％w/w的乳酸、2.000％w/w的乳酸钠溶液、4.210％w/w的水的C相；具有1.000％w/w的二氧化钛的D相；和具有1.500％w/w的辅酶Q1021％浓缩物的E相。在一些实施方案中，卡波姆分散体包括水、苯氧乙醇和丙二醇。
1.联合治疗
在某些实施方案中，辅酶Q10分子和/或其药物组合物可用于与至少一种其它治疗剂的联合治疗。辅酶Q10分子和/或其药物组合物与其它治疗剂可以叠加地，更优选协同地发挥作用。在一个实施方案中，辅酶Q10分子和/或其药物组合物与另一治疗剂同时施用。在另一实施方案中，化合物和/或其药物组合物在另一种治疗剂施用之前或在另一种治疗剂施用之后施用。
在一个实施方案中，本发明的治疗方法包括附加药剂。例如，在一个实施方案中，用于本发明治疗方法中的附加药剂是化学治疗剂。
化学治疗剂一般属于各种类别，包括例如，1.拓扑异构酶II抑制剂(细胞毒性抗生素)，如蒽环类/蒽二酮类，如阿霉素、表柔比星、去甲氧基柔红霉素和奈莫柔比星；蒽醌类，例如米托蒽醌和洛索蒽醌；和鬼臼毒素类，如依托泊苷和替尼泊苷；2.影响微管形成的药剂(有丝分裂抑制剂)，如植物生物碱(例如，属于来源于植物的碱性含氮分子家族的化合物，其为生物活性的和细胞毒性的)，例如紫杉烷类，如紫杉醇和多烯紫杉醇；和vinka生物碱类，如长春碱、长春新碱和长春瑞滨；和鬼臼毒素衍生物；3.烷化剂，如氮芥、乙烯亚胺化合物、烷基磺酸盐和其它具有烷化作用的化合物如亚硝基脲类、达卡巴嗪、环磷酰胺、异环磷酰胺和美法仑；4.抗代谢物(核苷抑制剂)，例如，叶酸类，如叶酸、氟嘧啶(fiuropyrimidines)、嘌呤或嘧啶类似物，如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、甲氨蝶呤和依达曲沙；5.拓扑异构酶I抑制剂，如拓扑替康、伊立替康和9-硝基喜树碱和喜树碱衍生物；和6.铂化合物/复合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂。用在本发明方法中的示例性化疗剂包括，但不限于，阿米斯丁(氨磷汀)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链脲菌素、环磷酰胺、卡莫司汀(carrnustine)(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、阿霉素(亚德利亚霉素)、阿霉素脂质体(doxil)、吉西他滨(健择)、柔红霉素、柔红霉素脂质体(daunoxome)、甲基苄肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春碱、长春新碱、博莱霉素、紫杉醇(紫杉酚)、多西紫杉醇(泰索帝)、阿地白介素、天门冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-I 1、10-羟基-7-乙基喜树碱(SN38)、达卡巴嗪、S-I卡培他滨、呋氟尿嘧啶、5′-脱拉氟尿嘧啶、优福定、恩尿嘧啶、脱氧胞苷、5-氮杂胞嘧啶、5-氮杂脱氧胞嘧啶、别嘌呤醇、2-氯腺苷、曲美沙特、氨基喋呤、亚甲基-10-去氮杂氨基喋呤(MDAM)、奥沙利铂、皮卡铂、四铂、沙铂、铂-DACH、奥马铂、CI-973、JM-216及其类似物、表柔比星、依托泊苷磷酸盐、9-氨基喜树碱、10，11-亚甲基二氧喜树碱、karenitecin、9-硝基喜树碱、TAS 103、长春地辛、L-苯丙氨酸氮芥、ifosphamidemefosphamide、过磷酰胺、氯乙环磷酰胺卡氮芥、卡莫司汀、司莫司汀、埃博霉素A-E、拓优得、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、安吖啶、依托泊苷磷酸盐、karenitecin、阿昔洛韦、万乃洛韦、更昔洛韦、金刚烷胺、金刚烷乙胺、拉米夫定、齐多夫定、贝伐单抗、曲妥单抗、利妥昔单抗、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、喷司他丁、曲美沙特、克拉屈滨、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、去甲氧柔红霉素、美司那、伊立替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法兰、巯基嘌呤、光辉霉素、米托坦、天门冬酰胺酶、喷司他丁、哌双溴丙酰、光辉霉素、链脲佐菌素、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内脂、硫鸟嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、顺铂、阿霉素、紫杉醇(紫杉酚)和博莱霉素，及根据对于特定肿瘤或癌症护理的适当标准本领域技术人员很容易理解的其组合。
在另一个实施方案中，在本发明的联合治疗中使用的附加药剂是生物剂。
生物剂(也称为生物物质)是生物系统的产物，例如，有机体、细胞或重组系统。这种生物剂的例子包括核酸分子(如反义核酸分子)、干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、抗体如单克隆抗体、抗血管生成剂和细胞因子。示例性生物剂在下面更详细地讨论且一般地属于各种不同类别，包括例如：1.激素、激素类似物和激素复合物，如雌激素和雌激素类似物、黄体酮、黄体酮类似物和黄体酮、雄激素、肾上腺皮质类固醇、抗雌激素、抗雄激素、抗睾丸激素、肾上腺类固醇抑制剂和抗-促黄体生成激素；和2.酶、蛋白质、肽、多克隆和/或单克隆抗体，如白细胞介素、干扰素、集落刺激因子等。
在一个实施方式中，生物物质是干扰素。干扰素(IFN)是天然存在于身体中的生物剂类型。干扰素也在实验室中产生，且给予癌症患者来进行生物治疗。已经证明它们改善癌症病人的免疫系统对抗癌细胞的方式。
干扰素可以直接作用于癌细胞以减缓其增长，或者它们可以使癌细胞转变成具有更加正常性能的细胞。一些干扰素也可刺激自然杀伤细胞(NK)细胞、T细胞和巨噬细胞，它们是血流中的白细胞类型，其有助于对抗癌细胞。
在一个实施方式中，生物物质是白细胞介素。白细胞介素(IL)刺激许多免疫细胞的生长和活性。它们是体内自然生成的蛋白质(细胞因子和趋化因子)，但也可以在实验室中制备。
一些白细胞介素刺激免疫细胞的生长和活性，如淋巴细胞，其发挥作用以破坏癌细胞。
在另一个实施方案中，生物物质是集落刺激因子。
集落刺激因子(CSF)是刺激骨髓内的干细胞以产生更多的血细胞的蛋白质。人体不断地需要新的白细胞、红细胞和血小板，特别是当癌症存在时。CSF与化疗一起给予以帮助激励免疫系统。当癌症患者接受化疗时，骨髓产生新的血细胞的能力受到抑制，从而使患者更容易发生感染。免疫系统的部分不能在没有血细胞的情况下发挥作用，因此集落刺激因子促进骨髓干细胞生成白细胞、血小板和红细胞。
具有适当的细胞生成，其它癌症治疗可以继续以使患者能够安全地接受更高剂量的化疗。
在另一个实施方案中，生物物质是抗体。抗体如单克隆抗体是在实验室中产生的结合癌细胞的药剂。
当灭癌制剂引入人体中时，他们寻找抗体并杀死癌细胞。单克隆抗体剂不破坏健康的细胞。单克隆抗体通过各种不同的机制实现其治疗效果。他们可以具有产生细胞凋亡或程序性死亡细胞的直接效应。他们可以阻断生长因子受体，有效地制止肿瘤细胞的增殖。在表达单克隆抗体的细胞中，它们可以引发抗个体基因型抗体的形成。
可用于本发明的联合治疗的抗体的例子包括抗胰岛素样生长因子受体-1、抗CD20抗体，例如，但不限于，西妥昔单抗、托西莫单抗、利妥昔单抗和替伊莫单抗。抗HER2抗体也可以与环境影响剂结合用于治疗癌症。在一个实施方式中，抗HER2抗体是曲妥珠单抗(赫赛汀)。可以与环境影响剂结合用于治疗癌症的抗体的其它实例包括抗CD52抗体(如阿仑单抗)、抗CD-22抗体(如依帕珠单抗)、抗CD33抗体(例如，吉妥珠单抗奥佐米星)。抗VEGF抗体也可用于与环境影响剂结合以治疗癌症。在一个实施方式中，抗VEGF抗体是贝伐单抗。在其它实施方案中，生物剂是作为抗EGFR抗体的抗体，如西妥昔单抗。另一个例子是抗糖蛋白17-1A抗体依决可单抗。
在另一个实施方案中，生物物质是细胞因子。细胞因子疗法使用蛋白质(细胞因子)以帮助受试者的免疫系统识别和破坏那些癌性细胞。细胞因子由体内免疫系统自然产生，但也可以在实验室中产生。这种疗法用于晚期黑色素瘤和用于辅助治疗(主要癌治疗之后或之外给予的治疗)。细胞因子治疗到达在身体的所有部分以杀死癌细胞和防止肿瘤生长。
在另一个实施方案中，生物物质是融合蛋白。例如，重组人Apo2L/TRAIL(Genentech)可用于联合治疗。Apo2/TRAIL是第一种双重促细胞凋亡受体激动剂，设计为激活参与调控细胞凋亡(程序性细胞死亡)的促细胞凋亡受体DR4和DR5。
在一个实施方式中，生物物质是反义核酸分子。
本文使用的“反义”核酸包含与编码蛋白质的正义核酸互补的核苷酸序列，如与双链cDNA分子的编码链互补，与mRNA序列互补或与基因的编码链互补。因此，反义核酸可以与正义核酸氢键结合。
一个实施方式中，生物剂是siRNA分子，例如增强血管生成的分子，如bFGF、VEGF和EGFR。在一个实施方式中，抑制血管生成的生物剂介导RNAi。RNA干扰(RNAi)是转录后的靶向基因沉默技术，其采用双链RNA(dsRNA)降解包含与dsRNA的相同序列的信使RNA(mRNA)(Sharp，P.A.和Zamore，P.D.287，2431-2432(2000)；Zamore，P.D.等.Cell 101，25-33(2000).Tuschl，T.等.Genes Dev.13，3191-3197(1999)；Cottrell TR，和Doering TL.2003.Trends Microbiol.11：37-43；Bushman F.2003.MoI Therapy.7：9-10；McManus MT和Sharp PA.2002.Nat Rev Genet.3.737-47)。当内源核糖核酸酶将较长的dsRNA切割成较短的，，例如21-或22个核苷酸长的RNA，称为小干扰RNA或siRNA时该过程发生。较小的RNA片段介导靶mRNA的降解。用于合成RNAi的试剂盒可从如New England Biolabs公司或Ambion公司购买。在一个实施方案中，可利用一种或多种用于反义RNA中的化学作用于介导RNAi的分子中。
利用反义核酸下调细胞中特定蛋白的表达是本领域熟知的(见例如，Weintraub，H.等，Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis，Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986；Askari，F.K.和McDonnell，W.M.(1996)N.Eng.J.Med.334：316-318；Bennett，M.R.和Schwartz，S.M.(1995)Circulation 92：1981-1993；Mercola，D.和Cohen，J.S.(1995)CancerGene Ther.2：47-59；Rossi，JJ.(1995)Br.Med.Bull.51.217-225；Wagner，R.W.(1994)Nature 372：333-335)。反义核酸分子包含与另一核酸分子的编码链(例如mRNA序列)互补的核苷酸序列，且因此能与其它核酸分子的编码链氢键结合。与mRNA序列互补的反义序列可以与mRNA的编码区中存在的序列互补，mRNA的5′或3′非翻译区或桥接编码区和非翻译区的区域(例如在5′非翻译区和编码区的接头处)。此外，反义核酸可以与编码mRNA的基因的调控区序列互补，例如转录起始序列或调控元件。优选地，反义核酸设计为使得与mRNA的编码链上或3′非编码区中的起始密码子之前或跨该起始密码子的区域互补。
给定增强血管生成的分子的编码链的序列，可以根据沃森和克里克碱基互补配对原则设计本发明的反义核酸。反义核酸分子可以与mRNA的整个编码区互补，但更优选的是仅与mRNA的编码或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与mRNA翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸的长度可以是，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。
本发明的反义核酸可以使用本领域已知的过程利用化学合成和酶促连接反应构建。例如，反义核酸(例如，反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或设计为提高分子的生物稳定性或增加在正义和反义核酸之间形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸化学合成，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来生成反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。可以使用一种或多种反义寡核苷酸以抑制细胞中的表达。或者，可以使用将核酸以反义方向亚克隆到其中的表达载体生物产生反义核酸(即由插入的核酸转录的RNA是目标靶核酸的反义方向，在以下小节中进一步描述)。
在又另一实施方案中，本发明的反义核酸分子是a-异头核酸分子。a-异头核酸分子与互补RNA形成特异的双链杂交体，其中与通常的a-单元相反，链互相平行地延伸(Gaultier等(1987)Nucleic Acids.Res.15：6625-6641)。反义核酸分子也可以包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215：327-330)。
在另一个实施方案中，本发明的反义核酸是介导RNAi的化合物。RNA干扰剂包括，但不限于，包括与靶基因或基因组序列同源的RNA的核酸分子、“短干扰RNA”(siRNA)、“短发夹”或“小发夹RNA”(shRNA)和通过RNAi干扰或抑制靶基因表达的小分子。RNA干扰是转录后的靶向的基因沉默技术，其利用双链RNA(dsRNA)降解含有与dsRNA相同序列的信使RNA(mRNA)(Sharp，P.A.和Zamore，P.D.287，2431-2432(2000)；Zamore，P.D.等.Cell 101，25-33(2000).Tuschl，T.等Genes Dev.13，3191-3197(1999))。该过程在内源核糖核酸酶把较长的dsRNA切割成较短的、21-或22个核苷酸长的RNA(称为小干扰RNA或siRNA)时发生。然后较小的RNA片段介导靶mRNA的降解。用于RNAi合成的试剂盒可以从如New England Biolabs公司和Ambion公司商购获得。在一个实施方案中，可以利用用于反义RNA中的上述一种或多种化学作用。
编码例如抑制血管生成的分子的核酸分子可以以适合在受试者的细胞中表达编码的蛋白的形式引入到受试者体内，其也可以用在本发明的方法中。抑制血管生成的示例性分子包括，但不限于，TSP-I、TSP-2、IFN-g、IFN-a、血管抑素、内皮抑素、tumastatin、血管能抑素(canstatin)、VEGI、PEDF、vasohibin和催乳素2-甲氧雌二醇的16kDa片段(见Kerbel(2004)J.Clin Invest 114：884的综述)。
例如，全长或部分cDNA序列克隆到重组表达载体中，并使用标准的分子生物学技术转染到细胞中。可以获得cDNA，例如通过采用聚合酶链反应(PCR)的扩增或通过筛选适当的cDNA文库。cDNA的核苷酸序列可以用来设计允许通过标准PCR方法扩增cDNA的PCR引物或者用来设计可以用于利用标准的杂交方法筛选cDNA文库的杂交探针。cDNA的分离或扩增之后，DNA片段被引入到合适的表达载体中。
用在本发明方法中的示例性生物剂包括，但不限于，吉非替尼(易瑞沙)、阿那曲唑、二乙基己烯雌酚、雌二醇、普力马林、雷洛昔芬、孕酮、异炔诺酮、炔孕酮、dimesthisterone、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、炔诺酮、甲睾酮、睾酮、地塞米松、强的松、皮质醇、琥钠甲强龙、它莫西芬、氟维司群、托瑞米芬、氨鲁米特、睾内脂、屈洛昔芬、阿那曲唑、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、戈舍瑞林、氟他胺、亮丙瑞林、曲普瑞林、氨鲁米特、米托坦、戈舍瑞林、西妥昔单抗、埃罗替尼、伊马替尼、托西莫单抗、阿仑单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、替伊莫单抗、贝伐单抗、地尼白介素、达利珠单抗、α-干扰素、β-干扰素、抗-4-1BB、抗-4-1BBL、抗CD40、抗CD 154、抗OX40、抗OX40L、抗CD28、抗CD80、抗CD86、抗CD70、抗CD27、抗-HVEM、抗-LIGHT、抗-GITR、抗-GITRL、抗-CTLA-4、可溶性OX40L、可溶性4-IBBL、可溶性CD154、可溶性GITRL、可溶性LIGHT、可溶性CD70、可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CTLA4-Ig、GVAX
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及根据用于特定肿瘤或癌症的护理的适当标准，本领域技术人员很容易了解的其组合。药剂的可溶性形式可以通过药剂与例如Ig-Fc区域可操作地连接而以例如融合蛋白的形式制备。
应当指出，多于一种附加药剂，例如，1、2、3、4、5种，可与辅酶Q10分子联合给药。例如，在一个实施方式中，两种化疗药物可以与辅酶Q10分子联合给药。在另一个实施方案中，可以施用化疗药物、生物剂以及辅酶Q10分子。
可以使用生物剂的各种形式。这些形式包括，但不限于，如原形分子、不带电荷的分子、分子复合物、盐、醚、酯、酰胺等等的形式，其在植入、注射或以其它方式插入肿瘤时为生物活性的。
本发明进一步地由下面的实施例进行说明，实施例不能被理解为以任何方式进行限制。所有引用的参考文献的内容，包括参考文献书目、授权的专利和公布的专利申请，本文通过引用明示地引入到本申请中。
具体实施方式
实施例1：辅酶Q10作为MIM的确认
为了评估辅酶Q10作为潜在的MIM，氧化形式的辅酶Q10外源添加到一组细胞系中，包括癌细胞系和正常对照细胞系，并且评估对于这组中各细胞系的细胞微环境特征诱导的变化。细胞形态/生理的变化和细胞成分的变化(包括mRNA和蛋白质水平)被评估并且患病的细胞与正常细胞之间进行比较。这些实验的结果确认辅酶Q10，特别是辅酶Q10的氧化形式，为MIM。
在第一组实验中，细胞形态/生理的变化通过检查细胞对辅酶Q 10的敏感和细胞凋亡反应进行评估。一组皮肤细胞系包括对照细胞系(原代培养的角质形成细胞和黑素细胞)和几种皮肤癌细胞系(SK-MEL-28，非转移皮肤黑色素瘤、SK-MEL-2，转移性皮肤黑色素瘤或SCC，鳞状细胞癌、PaCa2，胰腺癌细胞系或HEP-G2，肝癌细胞系)用各种不同水平的辅酶Q10处理。这些实验的结果表明，癌细胞系与对照细胞相比表现出变化的剂量依赖性的反应，只有在癌细胞中诱导细胞凋亡和细胞死亡。
接下来的分析是用来评估在用辅酶Q10处理后细胞组成的变化。mRNA水平上的基因表达变化使用实时PCR阵列方法分析的。在补充实验中，蛋白水平的基因表达变化使用抗体微阵列方法、二维凝胶电泳，接下来使用质谱鉴定进行蛋白质的确认和使用western印迹分析进行分析的。这些分析的结果表明，在基因和蛋白质水平上基因表达的重大变化都由于添加氧化形式的辅酶Q10而在被检查的细胞系中被诱导。辅酶Q10处理调节的基因发现群集在几个细胞途径中，包括细胞凋亡、癌症生物学和细胞生长、糖酵解、分子转运和细胞信号传导。
进行实验以证实辅酶Q10进入细胞并确定存在于细胞中的辅酶Q10的水平和形式。特别地，存在于线粒体中的辅酶Q10的水平以及辅酶Q10的形式(即，氧化的或者还原的)通过分析来自用辅酶Q10处理的细胞的线粒体富集的制剂而确定。存在于线粒体中的辅酶Q10的水平被证实以时间和剂量依赖性的方式随着外源辅酶Q10的添加而提高。在令人惊讶和意外的结果中，辅酶Q10被确定为主要以氧化形式存在于线粒体中。此外，来自线粒体浓富集样品的蛋白质水平的变化通过使用二维凝胶电泳和通过质谱表征的蛋白质鉴定进行分析。这些实验的结果表明，随着时间进程，线粒体中氧化形式的辅酶Q10的水平与广泛的细胞变化相关，如由与代谢和细胞凋亡途径相关的特定蛋白质的mRNA和蛋白质水平的调节所证明的。
本申请人所描述的结果确定内源性分子辅酶Q10，尤其是氧化形式的辅酶Q10，是MIM。例如，该结果确定辅酶Q10为MIM，因为辅酶Q10被观察到在mRNA和蛋白质水平上诱导基因表达的变化。该结果确定辅酶Q10具有多维特征，因为辅酶Q10在疾病状态下(如癌症)与正常(例如，非癌)状态相比诱导细胞形态/生理和细胞组成的不同变化(例如，在mRNA和蛋白质水平基因表达的不同变化)。此外，该结果确定辅酶Q10具有多维特征，因为辅酶Q10能够进入细胞并且因此表现出治疗和载体效应。
实施例2：鉴定肉瘤的相关过程和生物标志物的方法
从用目标分子处理细胞系(如肉瘤细胞系)的基于细胞的分析，在处理与未被处理细胞中的差异通过mRNA阵列、蛋白质抗体阵列和二维凝胶电泳进行评估。由比较样品分析确认为被MIM或EPI-置换剂(例如辅酶Q10)调节的蛋白质，从具有途径分析(Ingenuity IPA软件)的生物学角度和已知文献的综述进行评定。对鉴定为潜在的治疗或生物标志物靶标的蛋白质进行确认分析，例如Western印迹分析、siRNA敲除或重组蛋白的产生和鉴定方法。
实施例3：致癌细胞和正常细胞对辅酶Q10的相对敏感性
辅酶Q10处理对多种致癌和正常细胞系的效应被检验和比较。细胞对辅酶Q10的敏感性通过监测细胞凋亡的诱导而被评估。细胞的辅酶Q10处理如在下面的材料和方法中详细描述的进行。细胞凋亡的诱导在被处理的细胞中通过监测早期凋亡的指示(如Bcl-2表达、半胱天冬酶激活和通过使用膜联蛋白V分析)进行评估，如下所述。从这些研究中，确定在该组细胞中诱导细胞凋亡所需的辅酶Q10的最小剂量，比如，辅酶Q10的浓度和处理时间。
在一个意想不到的和令人惊讶的结果中，数据表明，辅酶Q10处理的效果在表现出增加的致癌性和/或更大的转移潜力的细胞类型中更高，即源自更具侵袭性的癌症或肿瘤的细胞类型。这些研究的结果归纳如下表1中。数据表明，辅酶Q10以时间和浓度依赖性的方式更有效地作用于处于更具侵袭性的癌症状态的细胞。此外，与致癌细胞相比，在正常细胞中观察到令人惊讶的不同效果。具体来说，意外地发现辅酶Q10在正常组织环境中表现出轻微的支持作用，其中在正常细胞中观察到增加的增殖和转移，包括角质形成细胞和真皮成纤维细胞。
辅酶Q10对癌细胞中的基因调控和蛋白质机制的作用与正常细胞中是不同的。关键的细胞机构和成分，如细胞骨架结构、膜的流动性、转运机制、免疫调节、血管生成、细胞周期调控、基因组稳定性、氧化控制、糖酵解流、代谢控制和细胞外基质蛋白的完整性，是失调的，并因此改变细胞的遗传和分子指纹。疾病环境有利于细胞控制过程的管理。此处提供的数据表明，辅酶Q10通过以允许恢复细胞凋亡潜能的方式使一些关键的前述过程正常化而发挥更大的效力水平(例如，在癌细胞和相比较的正常细胞中，和在具有较高侵袭性的癌症状态下的细胞中和相比较的具有较低侵袭性或非侵袭性的癌症状态下的细胞中)。
表1：各种不同细胞类型中早期细胞凋亡诱导所需的最小辅酶Q10浓度和处理时间
Figure BPA00001530185501231
材料和方法
细胞制备和处理
在平皿或烧瓶中制备的细胞
细胞在T-75烧瓶中用补充10％胎牛血清(FBS)、1％的PSA(青霉素、链霉素、两性霉素B)(Invitrogen和Cellgro)的相关培养基，在具有5％的二氧化碳水平的37℃培养箱中培养，直到达到70-80％的汇合。收获细胞用于处理，烧瓶中加入1mL胰蛋白酶，抽吸，用额外的3mL胰蛋白酶进行胰蛋白酶化，并在37℃孵育3-5分钟。然后用等体积的培养基中和细胞，且后续的溶液在10000rpm下离心8min。吸去上清液并用8.5ml培养基重悬细胞。500ul的重悬液和9.5ml异丙醇的混合物由库尔特计数器读数两次并确定接种到各个平皿中适当细胞数。对照和浓度范围0-200μM的组一式三份进行检验。从500μM的辅酶Q-10原液进行连续稀释以在适当的平皿中达到预期的实验浓度。平皿在具有5％的二氧化碳水平的37℃培养箱中依据细胞类型和实验方案孵育0-72小时。
蛋白质的分离和定量
在平皿中制备的细胞
在细胞处理孵育期结束后，进行蛋白质分离。所有处理组的平皿用冰冷的1×磷酸缓冲盐水(PBS)2ml洗涤两次，1ml洗涤1次。仅在最初的两次洗涤后从平皿中吸去PBS。从第三次洗涤的最终体积轻轻刮下细胞并收集至微量离心管中，以10,000rpm离心10分钟。离心后，吸去上清液，用50μl裂解缓冲液(1uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂，用于每100μl裂解缓冲液)裂解细胞沉淀。而后样品在-20℃冷冻过夜。
在烧瓶中制备的细胞
在细胞处理孵育期结束后，进行蛋白质分离。所有处理组的烧瓶用冰冷1×PBS 5ml洗涤两次，3ml洗涤1次。仅在最初的两次洗涤后从烧瓶中吸去PBS。从第三次洗涤的最终体积轻轻刮下细胞，并收集在15ml离心管中，以10,000rpm离心10分钟。离心后，吸去上清液，并用适量的裂解缓冲液(1uL蛋白酶和磷酸酶抑制剂，用于每100μl裂解缓冲液)裂解细胞沉淀。裂解缓冲液的体积取决于沉淀团块的大小。而后将样品转移至微量离心管中，并在-20℃下冷冻过夜。
蛋白质定量
在蛋白质分离后的第二天，样品在-4℃解冻和超声处理以确保均匀。使用微BCA蛋白质检测试剂盒(Pierce)进行蛋白质定量。为准备用于免疫印迹的样品，制备了β-巯基乙醇(Sigma)-样品缓冲液(Bio-Rad)的1∶19溶液。用β-巯基乙醇-样品缓冲溶液1∶1稀释样品，在95℃下煮沸5分钟，并在-20℃冷冻过夜。
免疫印迹
BCL-2、半胱天冬酶，9、细胞色素c
使用由BCA蛋白质分析获得的蛋白质的原始平均浓度确定装入每孔的样品体积。对于各处理时间点，约30至60μg的蛋白质被加载。蛋白质在1x电泳缓冲液中的12％的Tris-HCl现成凝胶(Bio-Rad公司)或手浇凝胶上以85和100伏特一式三份进行电泳。之后在100伏特下将蛋白质转移到硝酸纤维素纸上一小时，并在5％的牛奶溶液中封闭另外一小时。膜被放置在初级抗体(1uL Ab：1000uL TBST)(Cell Signaling)中-4℃过夜。第二天，膜用Tris-Buffered SalineTween-20(TBST)洗涤三次，每次10分钟，并在-4℃下应用二级抗体(抗兔；1uL Ab：1000uL TBST)一小时。膜再用TBST洗涤三次，每次10分钟，且化学发光用Pico或者Femto底物完成(Pierce)。而后膜按产生最佳可视化结果的时间间隔显影。显影后，膜被在-4℃下保持在TBST中，直到肌动蛋白的水平可以被测量。
肌动蛋白
膜在-4℃下被放置在初级肌动蛋白抗体(1uL Ab：5000uL TBST)(cell signaling)中1小时，用TBST洗涤3次每次10分钟，且二级抗体在-4℃下(抗小鼠；1uL Ab：1000uL TBST)应用一小时。膜再次用TBST洗涤三次，每次10分钟，且化学发光用Pico或者Femto底物完成(Pierce)。而后按产生最佳可视化结果的时间间隔显影。
膜联蛋白V分析
细胞在PBS10X中洗涤两次并重悬浮在结合缓冲液(0.1M HEPES，pH 7.4；1.4M NaCl；25mM CaCl2)中。100μL的样品添加到具有5μL膜联蛋白-PE染料或7-ADD的培养管中。细胞混合和在无光室温条件下孵育15分钟。之后，400μL的1X结合缓冲液被添加到各样品中，并且它们通过流式细胞技术进行分析。
在下面的实施例4-7中，目的是获得辅酶Q10作用机制的深入了解，特别是对于NCIES0808细胞系。NCIES0808细胞系直接来源于患有尤文氏肉瘤的患者，因此是在研究中被使用的最相关的细胞系。该研究的基本思想是，这项研究将有利于API的发展和向公众提供对其作用的更好的了解。
实验的意图在于基于以下实验在RNA和蛋白质水平表征细胞环境内的变化。
(1)PCR阵列
血管生成
糖尿病
线粒体
(2)抗体阵列
(3)二维凝胶电泳分析
(4)Western分析
实施例4-8的材料和方法
辅酶Q10原料
500μM的辅酶Q10(细胞生长培养基中的5％异丙醇)制备如下。每次新制备10mL 500μM的辅酶Q10原液。
分子量：863.34
(0.0005mol/L)(0.010L)(863.34g/mol)＝0.004317g
为制备10mL的500μM辅酶Q10原液，称取4.32mg辅酶Q10至15mL falcon管中，加入500μL的异丙醇。该溶液在50-60℃水浴中加热同时涡旋以完全溶解。向该溶液加入9.5mL的培养基(细胞生长的相同培养基)。
NCIES0808细胞
NCIES0808细胞在含glutamax和17mM葡萄糖以及5％FBS、Penstrep和两性霉素的DMEM/F12中生长。细胞传代以获得用于实验的足够量。
辅酶Q10处理和总蛋白质的分离
补充培养基用Q10条件化至50和100微摩尔浓度。细胞用对照、50μM Q10和100μM Q10处理，一式三份。蛋白质在3、6或24小时后从处理的和对照的烧瓶中分离。为了蛋白质的分离，细胞用5ml冰冷的pH值为7.4的PBS洗涤三次。这些细胞而后在3ml的PBS中刮下，离心沉淀，且重悬在pH值7.4的裂解缓冲液(80mM的Tris-HCl，1％SDS，含蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中。蛋白质浓度使用BCA法定量。
RNA分离：
细胞被裂解以使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen公司，瓦伦西亚CA)按照制造商的指示在不同处理时间进行RNA分离。RNA通过测量在260nm处的光密度定量。
第一链合成：
第一链cDNA从1μg总RNA使用RT2第一链合成试剂盒(SABiosciences.，Frederick MD)按照制造商的建议进行合成。
实时PCR：
第一链合成的产物用水稀释，与SYBR green master mix(SABiosciences.，Frederick MD)混合，并加载到PCR阵列上。实时PCR在Biorad CFX96上的PCR阵列(细胞凋亡阵列、糖尿病阵列、氧化应激和抗氧化剂防御阵列以及热休克蛋白阵列)(SABiosciences，Frederick MD)上运行。
PCR阵列：
在培养基中或含50uM/100uM Q10的培养基中，NCIES0808细胞以2x106个细胞每烧瓶的密度接种在T25烧瓶中。所有处理组一式三份地进行。0、3、6、24或48小时时收获细胞。在细胞收获前拍照以检查细胞形态。为收获细胞，培养基被移出，但被保存以能够收集漂浮的凋亡细胞。细胞用胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶化，然后酶作用通过添加4ml完全培养基被停止。胰蛋白酶化的细胞被添加至含有具死亡细胞的培养基的适当管中。细胞在1200rpm离心5分钟，吸去介质以留下用于RNA提取的细胞沉淀。从细胞沉淀分离RNA使用RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia CA)根据制造商的指示进行。RNA样品从离心柱(spin column)洗脱在水中；在260nm、230nm和280nm处测量吸光度。RNA的纯度由260/230和280/230比进行评定。所有样品中的RNA浓度由为230nm处的吸光度值计算。从0.5ug的所有RNA样品应用由第一链试剂盒(SABiosciences，Frederick，MD)提供的使用说明合成第一链cDNA。从样品合成的第一链被平均分配到包含途径(血管生成、糖尿病和线粒体)中的引物的PCR阵列板(SABiosciences Corporation，Frederick，MD)中。阵列使用SYBR Green检测方法利用制造商认可的方案通过实时PCR扩增。来自各样品的ct值相对于三个管家基因标准化，并且Q10处理组的倍数调控与在正常培养基中生长的时间匹配的对照相比较和计算。
蛋白质组学的制备样品：
NCIES0808细胞在类似于PCR阵列段落所描述的实验条件下被接种在T25烧瓶中。在处理时间结束时，细胞如在PCR阵列段落中所描述的胰蛋白酶化，在冰冷的TBS中洗涤两次并在液氮中速冻。进一步的用于Western印迹的处理在UMass进行。
NCIES0808细胞以较大量分别用Q10处理以用于分离足够的线粒体用于蛋白质组学分析。细胞在T175烧瓶中用培养基、50uM Q10或100uMQ10处理0、3、6、24和48小时。对于各条件培养两个烧瓶，且在收获过程中合并来自两个烧瓶的细胞。所需的处理时间后，细胞被胰蛋白酶化并在冰冷的TBS中洗涤两次。沉淀的细胞在液氮中速冻，并在-80℃下冷冻直到线粒体分离。线粒体的分离用于培养细胞的MitoProfile Mitosciences分离试剂盒获得(Mitosciences Inc，Eugene，OR)获得的制造商使用说明进行。
Western印迹准备：
细胞生长和用50uM和100uM的辅酶Q10处理，具有适当的对照。总细胞裂解物(如上制备的)通过Western印迹分析处理和评估。来自每个处理组的蛋白质在SDS-PAGE上解析和转移到PVDF膜上。然后，它们与抗体杂交。
免疫印迹：
每个样品的5或10μg蛋白质通过免疫印迹进行分析。蛋白质在10-20％的Tris-HCl凝胶或4-12％的Bis-Tris凝胶上分离，通过电泳转移至PVDF膜，并且用5％的GE/Amersham ECF封闭剂和TBST溶液封闭，随后与初级抗体一起孵育。初级抗体在4摄氏度下在5％BSA和TBST溶液中孵育过夜。二级抗体在室温下孵育一小时。从商业供应商购买所有的抗体。抗体按照制造商建议的稀释度使用，对照β肌动蛋白以1∶5000的稀释度。使用GE/Amersham ECF试剂显影印迹，并且结果使用富士FL-5100激光扫描仪和Bio-Rad Quantity One密度分析软件定量。所有印迹也被探测和相对相应的β肌动蛋白表达标准化。
二维电泳：
在等电聚焦(IEF)之前，样品被溶解在40mM Tris，7M尿素，2M硫脲和1％C7两性离子洗涤剂，用三丁基膦还原，并用10mM丙烯酰胺在室温下烷基化90分钟。之后，样品经10kDa截止值的Amicon Ultra装置以至少3体积的由7M尿素、2M硫脲和2％CHAPS组成的重悬缓冲液运行以降低样品导电率。一百微克蛋白质在11cm的pH值3～10、pH值4至7或pH值6至11的固定pH梯度条(GE，Amersham，美国)经历100000伏特小时的IEF。IEF后，固定的pH梯度条在6M尿素、2％的SDS、50mM的Tris-醋酸缓冲液，pH 7.0和0.01％溴酚蓝中平衡，并且经过8％至16％Tris-HCl预浇凝胶，1毫米(Bio-Rad，美国)上的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。一式两份。他们被固定，在SYPRO Ruby，80mL/凝胶(Invitrogen，美国)中染色，并在富士FLA-5100激光扫描仪上成像。
图像分析：
所有凝胶图像的分析使用Progenesis Discovery和Pro(NonlinearDynamics Inc.，Newcastle upon Tyne，英国)进行。在点可检测、匹配、背景消除、标准化和过滤后，SYPRO Ruby凝胶图像的数据被输出。各组之间使用Student’s T检验在Progenesis Discovery中进行配对比较以确定其表达被显著地改变(P＞0.05)的点。各个统计显著点进行手动标注以保证准确的检测。
质谱分析：
从相应的凝胶塞提取的胰蛋白酶肽干燥至10ul体积，用1-2ul的1％TFA酸化。样品在0.1％TFA中预平衡后加载到uC18 Zip Tip(Millipore，Corp Millipore)。在用2x10ul等分的0.1％TFA洗涤后，样品被直接沉积在MALDI样品标靶，使用1ul Matrix溶液15mg/ml的2，5二羟基苯甲酸(MassPrep DHB，Waters Corp.)在50∶50的乙腈：0.1％TFA中。使样品空气干燥，随后插入质谱仪中。分析在Kratos AximaQIT(Shimadzu Instruments)基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱仪上进行。肽以正离子模式中在中等质量范围内(700-3000Da)进行分析。该仪器使用血管紧张素II(1046.54)、P14R(1533.86)和ACTH(18-39)2465.20Da进行外部校准。基于使用氩气作为碰撞气在对于CID断裂的250的质量解析宽度下的信号强度选择前体。在使用用于MS数据的Peptide Mass Fingerprint程序作为和用于CID数据的MS/MS Ion Search程序以Mascot(Matrix Sciences，Ltd.)进行内部数据库检索。所有鉴别使用CID(MS/MS)数据证实或确定。
抗体阵列：
NCIES0808细胞从T165烧瓶(x 55)中的SBH接收。这些细胞是约90-95％汇合并且培养基带有典型的粉红色。细胞形态在显微镜下仔细检查，并注意到细胞显示出健康，不具有污染或细胞内包含体的可见迹象。
使用针对PCR阵列所述的相同方案制备500μM Q10原液。每个烧瓶中培养基与放置在适当烧瓶中的50μM和100μM Q10培养基交换。细胞在Q10配制的中培养基培养3小时和6小时，并收获细胞。各个烧瓶用10ml冰冷的PBS洗涤，和用5ml胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶化。细胞通过轻轻地吸出而收获，且通过添加30ml完全培养基停止酶的作用。细胞在1200rpm下离心5分钟，且培养基从管中吸去以留下用于蛋白质提取的细胞沉淀。
按照制造商的产品信息页，SigmaPanarama
Figure BPA00001530185501322
抗体微阵列EPRESSProfiler725，cat#：XP725，第2页，亚类IA，从细胞中提取蛋白质。按照上面所述产品页亚类IIA中给出的制造商使用说明，来自全细胞裂解物的蛋白质物质与Cy3和Cy5染料，GE医疗集团，产品#：25-8009-86Cy3和25-8009-87Cy5，偶联。抗体阵列芯片再次按照在产品页的亚类III中给出的制造商的使用说明制备，并使其在黑暗的室内干燥24小时。使用富士FLA-5100UV扫描仪，对Cy3染料在532nm处和对Cy5染料在635nm处对阵列进行分析。在单独的培养基、50μM Q10和100μMQ10的样品上3小时和6小时收集数据。全部一式三份。
IPA分析：
下面描述的实验的结果结合使用Ingenuity Pathway Analysis(http://www.ingenuity.com)作为阐明由Q10调节的潜在途径的工具。
实施例4：NCI-ES-0808细胞对辅酶Q10处理的敏感性
NCI-ES-0808细胞的形态在用辅酶Q10处理后监测。NCI-ES-0808细胞的照片通过显微镜在Q10处理后3、6、24或48小时和刚好在收获之前拍摄。处理后3小时细胞部分贴壁，但在6小时时其表现为完全贴壁。在处理后3小时至6小时的实验时程中，形态上、目视可确定的凋亡细胞数或通过显微镜表现清楚的细胞数在处理组之间没有差异(图1)。
实施例5：实时PCR阵列
进行本实施例中所描述的实验以测试以下整体假设：Q10对尤文氏肉瘤细胞中的多个基因的表达有影响。通过RT-PCR对来自用50μM或100μM Q10处理各种不同时间的NCIE0808细胞的mRNA针对参与人的糖尿病、人的血管生成或人的线粒体途径的一组标靶蛋白进行评估。
将从实时热循环仪上获得的Ct值载入SABiosciences网站上的分析工具中用来计算与具有培养基的细胞相比的倍数调节(fold regulation)。在人糖尿病阵列的分析中辅酶Q10调节的基因总结在表2中。在人的血管生成阵列的分析中辅酶Q10调节的基因总结在表3中。在下面的表中包括的基因是那些显示出接近0.05的p值的基因。人的线粒体阵列的分析在被检验的辅酶Q10剂量和时间点没有揭示出任何调节的基因。
表2人的糖尿病阵列的基因
对于100μM辅酶Q10处理的NCIE0808细胞在主要mRNA水平的变化中受到调节。
Figure BPA00001530185501341
表3来自人血管生成阵列的基因
对于100μM辅酶Q10处理的NCIE0808细胞在主要mRNA水平的变化中受到调节。
 基因   调节模式
 ANGPTL3   100uM Q10在3小时下调.
 CCL2   100uM Q10在3小时下调
 CDH5   100uM Q10在3小时和24小时下调
 CXCL1   100uM Q10在3小时下调
 CXCL3   100uM Q10在3小时下调
 LAMA5   100uM Q10在6小时上调
 PXLDC1   100uM Q10在48小时上调
实施例6：抗体微阵列分析
由于Q10的存在导致蛋白质浓度变化的评估通过利用抗体微阵列方法来评估。该微阵列包含超过700种蛋白质的抗体，采集了广泛范围的蛋白质类型和潜在途径标志物。
对于芯片制备的效率和可重复性的初步分析，进行了各芯片(n＝1，2，3)对所有数据集的一般概述。50μMQ10，3小数据系列的模式分析表明，虽然n＝1和n＝2非常相似，但n＝3却有非常不同的模式。出于这个原因，n＝3的数据在阵列数据的统计评估中被放弃了。
一旦对于所有阵列收集了数据集，数据针对三个主要参数被严格审核。首先，数据使用制造商使用说明亚类V中所描述的总计荧光强度方法标准化。在标准化过程之后，任何对于标准化的Cy3/Cy5比具有零值的数据点被认为是在统计学无关的并从测试组中去除。正的和负的Cy3/Cy5数据(包括作为芯片上的对照)的评估和其决定的对于给定点的谱密度的目视检查，谱密度小于10的阵列数据点接近背景水平且被视为是统计学无关的并从数据系列中除去。所得到的数据被认为是作进一步评估的基础数据。各个数据集按照标准化的谱密度比分类和前45个上调和下调的蛋白质进行评估。只有注意到出现在所有重复试验(n＝1，2，3)中的蛋白质被指定作统计学相关，并落入这些统计评估的95％的置信范围。应当指出，在3小时时间实验的各数据集中存在显著变异。这可能是由于在这一时间点上，细胞还没有集中达到可以以高的统计学相关百分比从数据中得出结论的点上。然而，从6小时时间点获得的数据满足我们的所有统计分析，并出现在重复试验(n＝1，2，3)中，这些分析的数据列于下表4和5中。
表4.在以50或100uM辅酶Q10处理6小时的NCIE0808细胞中被上调的蛋白质
Figure BPA00001530185501351
Figure BPA00001530185501361
Figure BPA00001530185501371
表5.在以50或100uM辅酶Q10处理6小时的NCIE0808细胞中被下调的蛋白质
Figure BPA00001530185501372
Figure BPA00001530185501381
实施例7：二维凝胶分析
处理3、6和24小时的NCIES0808细胞进行2-D凝胶电泳，并进行分析以确定相对于对照培养基样品的蛋白质水平的变化。进行跨多次重复凝胶的点的对比分析，从而将“对照培养基样品”同所有50uM和100uM剂量的处理样品对比。分析包括在整个时间过程中由于提高、降低或者翻译后修饰导致变化的点的鉴定。凝胶图像的代表性例子如图3所示，且被调节的蛋白质如表6中所示。
表6在以50或100uM辅酶Q10处理3、6和24小时的NCIE0808细胞中调节的蛋白质
Figure BPA00001530185501382
Figure BPA00001530185501391
Figure BPA00001530185501401
注：“1”表示蛋白质量没有变化。
从MASCOT分析中，顶层的点较早识别。在分析的第二阶段，分析第二水平的点和，基于目视检查和QC，也被提交MS鉴定。
以下表7中是对于用辅酶Q10处理后3小时的NCIES0808细胞中蛋白质的量被调节的被确定为“水平2”的点的蛋白质ID的列表。
表7.用辅酶Q10处理3小时的NCIES0808细胞中调节的蛋白质
545-过低信号(无ID)
522-真核翻译起始因子3，亚基3γ
673-胆绿素还原酶A，转醛醇酶1
504-角蛋白1，10；旁胸腺素
491-GSTω1
348-B链多巴胺苯醌结合DJ-1
201-蛋白酶体激活剂Reg(α)
270-无显著信号(无ID)
233-T-复合蛋白1同型体A
289-β肌动蛋白
401-A链甲巯蛋白ERP57；含伴侣蛋白的TCP1
429-泛素激活酶E1
346-泛素激活酶E1，丙氨酰-tRNA合成酶
254-动力蛋白激活蛋白1
323-热休克蛋白60kd
275-β肌动蛋白
356-亚精胺合成酶；β肌动蛋白
385-热休克蛋白70kd
NICES0808样品的线粒体制剂也进行了蛋白质分析，且如下在表8中是辅酶Q10处理后调节的蛋白质的列表。
表8.辅酶Q10处理的NICES0808细胞中调节的蛋白质
108-视网膜母细胞瘤结合蛋白4同型体A
1000-TAR DNA结合蛋白
37-真核翻译延长因子1β2
227-含伴侣蛋白的TCP1，亚基3
172-胞质动力蛋白IC-2
实施例8：Western印迹分析
用50或100μM Q 10处理24小时的NCIES0808细胞进行western印迹分析，并进行分析以确定相对于对照培养基样品的蛋白质水平的变化。
从处理细胞获得的蛋白质通过western印迹分析针对血管紧张素转化酶(ACE)抗体(图4A)、半胱天冬酶3的抗体(图4B)、GARS的抗体(图4C)、基质金属蛋白酶(MMP-6)的抗体(图4D)和一系列溶神经素(NLN)的抗体(图4E-F)进行评估。这些实验的结果表明，所有被检验的蛋白质因为Q10处理细胞而下调。特别是，以100μM Q10处理的24小时时半胱天冬酶3有明显的下调。
表9：通过western分析对NCIES0808细胞中调节的蛋白质进行分析
 血管紧张素转化酶(ACE)   下调
 半胱天冬酶3   下调
 GARS   下调
 基质金属蛋白酶6   下调
 溶神经素   下调
实施例4-8的讨论：
尤文氏肉瘤是一种极具侵袭性的癌症，其发病率没有显示与孟德尔遗传、环境或药物接触相关。ES最一致的特征在于作为EWSR1基因座和ETS转录因子基因之间染色体易位的结果的融合基因的存在。EWS-ETS融合基因编码转录因子，比如EWS-FLI1，其异常的功能与ES发病机制相关。利用高通量(HTS)技术的最新进展已开始提供对EWS-FLI1的功能后果的认识。
上述实施例中提供的结果描述了蛋白质组学数据的分析，从而说明辅酶Q10对作为尤文氏肉瘤病因学的特征的重要遗传标志物的影响。抗体阵列、二维凝胶电泳/质谱和实时聚合酶链微阵列的组合确定了超过90个基因产物，其表达在尤文氏肉瘤细胞系(JDT，0808)中响应于辅酶Q10处理而表现出显著的影响。其中，被鉴定的基因产物的约60％的表达模式被上调和40％被下调。使用“The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery”[DAVID](其将基因细分至42个主要的群)确定功能组。该列表的最大数目的基因被分在“细胞过程的调节”和“代谢过程”功能组中，而其它蛋白质分布在包括转录调控、程序性细胞死亡、细胞发育、细胞骨架、细胞核、蛋白酶和器官发育的功能组中。蛋白质的功能评价及其细胞事件的调节表明，暴露于辅酶Q10的尤文氏细胞诱导细胞骨架蛋白质的全面表达，所导致的结构体系的去稳定性引发细胞程序以最终导致快速和稳定的细胞凋亡。
A.辅酶Q10调节几个细胞骨架蛋白的表达：细胞凋亡反应的起始中细胞结构的破坏。
用辅酶Q10对尤文氏肉瘤细胞系进行处理导致许多细胞骨架成分的表达发生改变，包括微丝(β肌动蛋白、肌球蛋白调节轻链、肌动蛋白相关蛋白ACTL6)、中间丝(角蛋白1、10、13、17)和微管(β-微管蛋白、微管相关蛋白、动力蛋白)、相互作用蛋白(动力蛋白激活蛋白)和伴侣蛋白(含伴侣蛋白的TCP1)。这种现象部分地受到观察到的核糖体蛋白(RPLP2)、真核翻译起始因子(EIF3G、EIF4A2)和真核翻译延长因子(EEF1B2、EEF1D)的增加的支持。热休克蛋白(HSP27、HSP60、HSP70)表达的相应增加和良好证明的HSP27上调肌动蛋白的表达和稳定微管结构的能力表明，辅酶Q10所介导的结构蛋白表达的改变使细胞骨架结构去稳定(Robitaille等，2009；Mounier&Arrigo，2002)。细胞骨架相关改变参与细胞凋亡的执行，如细胞圆化(cell rounding)、胞膜出泡和染色质凝聚，这是早已确定的(Mills等，1999)。然而，最近的研究表明，细胞骨架的破坏或调节是在细胞凋亡过程中的必要步骤(Pawalak Helfman，2001年)。由细胞松弛素D引起的细胞骨架的破坏导致半胱天冬酶3激活的增加并加速DNA损伤诱导的细胞凋亡。100μM的辅酶Q10在尤文JDT细胞系暴露后一小时引起半胱天冬酶3的表达增加30％，这种现象重演了以上效应。假定微管如动力蛋白(其表达响应于辅酶Q10而提高)对DNA损伤作出响应促进p53至细胞核的转运和微管蛋白和微管相关蛋白在有丝分裂过程中发挥关键作用，这表明辅酶Q10破坏/去稳定细胞骨架结构和细胞周期，从而导致程序性细胞死亡的激活。
B.辅酶Q10经由CBP/p300途径解除EWS-ETS介导的细胞凋亡抑制
NCIES0808细胞系中响应于辅酶Q10暴露而上调的蛋白质之一是CBP/p300，CREB结合蛋白，和其E1A结合蛋白同源物，这两者都是良好表征的转录共激活剂(Chirivia JC等，1995年Eckner R等人，1994年)。CBP和p300具有相似的、可互换的调节细胞的生长和发育的细胞功能(Janknecht R，2002；Goodman&Smolik，2000)。CBP/p300作为一种用于多种转录因子的共激活剂发挥功能，且表现出起到转录机构中的桥/支架的作用(Goodman&Smolik，2000)。有证据表明EWSR1基因产物维持正常细胞功能的活性部分地经由与CBP/p300的相互作用介导(Araya等，2003；Rossow&Janknecht，2001)。此外，使用缺失突变体证明，Fli-1单独和EWS-Fli1融合体结合CBP并干扰核受体转录活性(Ramakrishnan等，2004)。CBP/p300间接调节EWS-ETS融合蛋白的证据是基于其与RNA解旋酶A(RHA)(RNA解旋酶的DEXH家族的成员)和RNA聚合酶II相互作用以调节转录的能力(Nakajima T，1997)。RHA的表达ES细胞系和肿瘤中被发现，且RHA和EWS-FLI1融合体之间的相互作用表现为增强EWS-FLI1蛋白的转录和转换潜力(Toretsky等，2006)。事实上，有人提出，EWS-ETS靶向于转录辅助因子如CBP的活性可能是造成细胞转化的部分原因(Fujimura等，1996)。这一观念受到EWS-FLI1通过影响CBP/p300途径来抑制细胞凋亡途径的现象的支持(Ramakrishnan等，2004)。在相同的研究中，还证明CBP/p300细胞水平增加使细胞对视黄酸细胞凋亡敏感(Ramakrishnan et al，2004)。在本研究中，以辅酶Q10对ES0808细胞系的处理导致CBP/p300表达的增加(与基线相比)。这表示，辅酶Q10介导的CBP/p300增加重新激活(即解除抑制)通常在尤文氏肉瘤中被EWS-ETS蛋白抑制的细胞凋亡途径。
C.辅酶Q10在尤文肉瘤细胞系中诱导细胞死亡是由于p53转录因子调节的细胞凋亡的激活。
多方面的证据支持细胞凋亡在辅酶Q10诱导的尤文氏肉瘤模型细胞系的细胞死亡中的作用。其中最突出的是p53激活的参与，这通过用辅酶Q10处理一小时后在尤文氏JDT细胞系中其表达显著的增加而证明。被良好确认的是，p53转录因子响应于细胞损伤/应激而激活，从而激活导致细胞周期停滞或细胞凋亡的基因表达途径(Levine，1997；Giaccia和Kastan，1998)。此外，CBP/p300与p53相互作用，且转录地激活p53依赖性MDM2、p21和Bax启动子(Avantaggiati等，1997；Gu等，1997；Lill等，1997)和乙酰特异性赖氨酸残基且增强p53的DNA结合特性(Gu&Roeder，1997)。因此，辅酶Q10直接和/或间接增加了在尤文氏肉瘤细胞系中p53的表达。
Ku70的减少(本领域中和在本文中也称为ATP依赖性解旋酶II)在辅酶Q10处理的尤文氏肉瘤ES0808细胞系中被观察到。Ku70与促凋亡蛋白Bax相关，并且具有去泛肽(dequbiquitin)酶活性(Rathaus等，2009)。最近的证据表明，乙酰化的p53具有阻止和破坏Ku70-Bax复合物以提高细胞凋亡的能力(Yamaguchi等，2009)。因此，这表明，辅酶Q10诱导的Ku70的减少伴随着p53活性的提高，这可以增强Bax的促细胞凋亡活性。
用辅酶Q10处理导致异质核核糖核蛋白C(hnRNP C1/C2)表达的下调，其持续长达24小时。hnRNP C1/C2蛋白是形成形成细胞凋亡的X-连接抑制剂(XIAP)和内部核糖体进入位点(IRES)的复合物的一部分(Holcik等，2003)。XIAP是最强大的内在细胞凋亡抑制剂，并且结合半胱天冬酶3、半胱天冬酶7和半胱天冬酶9且抑制它们的活性(Deveraux等，1997)。hnRNP C1/C2的过度表达特异性地增强XIAPIRES的翻译，表明在XIAP表达的调控中起作用(Holcik等，2003)。这表示，hnRNP C1/C2表达的减少降低XIAP的表达和增强尤文氏肉瘤细胞系细胞对辅酶Q10诱导的细胞凋亡的敏感性。支持这一假说的是辅酶Q10处理一小时后尤文JDT肉瘤细胞系中观察到的半胱天冬酶3表达的显著提高。用EWS蛋白质共纯化的hnRNP C1/C2(Zinszner等，1994)的现象表明对XIAP的调控和EWS-FLI1融合体的抗凋亡能力的新途径。
辅酶Q10处理的尤文氏肉瘤ES0808细胞系证明构成蛋白酶体的各种亚基(包括蛋白体亚基PSMA3、PSMB3、PSMB4和泛素酶(ubiquilin))的表达持续增加。蛋白酶体是大的多蛋白复合物，其识别、结合和降解被多泛素标签所标记的蛋白质。由于细胞凋亡的过程伴随着细胞大小的进行性减小，因此蛋白酶体是对胞质和核蛋白的降解必不可少的(Wojcik，1999年)。事实上，细胞凋亡过程中的蛋白酶体系统的激活此前已被报导(Drexler，1998；Piedimonte，1999)。
其调节支持细胞凋亡的作用的其它蛋白质和辅酶Q10诱导的尤文氏肉瘤细胞的细胞毒性(例如，肿瘤细胞生长的抑制或细胞凋亡的激活)中的其它途径如细胞结构候体系的去稳定包括：
(a)JAB1表达的增加：JAB1(Jun活化结合域或CSN5)是调节多信号传导途径的COP9信号复合体(signalosome)的一部分。JAB1是BcLGs特异性结合蛋白且增强BH3结构域依赖的促凋亡途径(Liu X等。Cell Signaling 20(1)：230-240，2008)。
(b)p53R2表达的增加：核糖核苷二磷酸还原酶是涉及细胞核和线粒体DNA的合成和修复的酶。p53R2表达是在DNA损伤后由p53诱导的。p53R2的过量表达干扰p53依赖性DNA修复途径的调节并增强细胞对抗癌药物的敏感性(Yamaguchi T等，Cancer Res.2001 Nov 15；61(22)：8256-62.；Nakamura Y：Cancer Sci.95(1)：7-11，2004.；Pontarin G等，Proc Natl Acad Sci USA.105(46)：17801-6，2008.)。
(c)磷脂酰丝氨酸受体表达的增加：这些受体在抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞和树突状细胞的细胞表面上表达。它们可以潜在地与磷脂酰丝氨酸或从凋亡细胞发出的分泌磷脂酰丝氨酸相互作用，并通过帮助肿瘤巨噬细胞的募集促进抗炎性反应(Kim JS，等ExperimentalMolecular Med.37(6)：575-87，2005.)
(d)
(e)细胞角蛋白肽13和17表达的增加：细胞角蛋白肽属于细胞质内细胞骨架蛋白家族，其表达失调与基底细胞癌(BCC)有关(Lo BK等Am J Pathol.176(5)：2435-46，2010)。细胞角蛋白表达是用于肺与结肠直肠腺癌的诊断的最一致的标志物之一(Kummar S等Br J Cancer.86(12)：1884-7，2002)。虽然细胞角蛋白肽(如18)已知是半胱天冬酶3蛋白水解的最终产物，但是没有多少关于肽17和13作为细胞凋亡级联的产物的报道。然而，CK17已被证明与在BCC肿瘤发生的白细胞趋化性起作用的趋化因子共定位。很可能是这些产物是增加的细胞调亡的效果或者是在被处理的NCI0808细胞中改变的肿瘤发生的原因。
(f)神经丝160和200表达的增加：神经丝160和200是神经元细胞中表达的中间丝蛋白质的相应同型体。尤文氏肉瘤是神经源的，200kD同型体的异常表达在EWS细胞系中已被观察到(Lizard-Nacol S等Tumour Biol.13(1-2)：36-43，1992)。
(g)Rab5表达的增加：Rab 5是参与自体吞噬和在吞噬体中凋亡细胞的处理的小GTP酶(Kinchen JM等Nature.464(7289)：778-82，2010)。其在辅酶Q10处理的NCI0808细胞中表达增加表示细胞凋亡事件后的终末阶段。
(h)AFX表达的增加：也被称为FOXO4，它是叉头转录因子家族的成员。FOXO4受NAD依赖性去乙酰酶SIRT1和乙酰转移酶、CBP/P300的调节。FOXO4激活氧化应激反应(MnSOD)、DNA修复(GADD45)、细胞周期阻滞(p27Kip1)和细胞凋亡(BIM和Fas配体)基因(Giannakou ME等Trends Cell Biol.14(8)：408-12，2004)。AFX表达的增加与NCI0808对辅酶Q10诱导的细胞死亡的易感性增加一致。FOXO1a也在100μM辅酶Q10的处理后上调。
(i)MEKK4表达的增加：也被称为MAP3K4，它是有丝分裂原激活的蛋白激酶激酶4，调节其下游有丝分裂原激活的激酶，p38和cJun N末端激酶(JNK)。MEKK4在心肌细胞中的激活已被证实引起增加细胞凋亡水平提高(Mizote I等J Mol Cell Cardiol.48(2)：302-9，2010)。50μM的辅酶Q10处理的NCI0808中MEKK4表达的增加可能代表着响应于处理的正在进行的细胞凋亡。
(j)HDAC2表达的减少：CBP/p300与HDAC2相互作用以提高Bcl2的启动子活性，该活性在HDAC抑制剂存在时降低(Duan H等Molecular and Cellular Biology.25(5)：1608-1619，2005)。因此，响应于辅酶Q10的HDAC2表达的减少应降低Bcl2的启动子活性(及相关的抗细胞凋亡功能)。
(k)HDAC4表达的减少：CBP/p300与HDAC4的相互作用涉及HIF-1α的转录调控(Seo H-W等FEBS Letters 583：55-60，2009；BuchwaldM等Cancer Letters.280：160-167，2009)。因此，由辅酶Q10导致的HDAC4表达的减少应当降低HIF-1α的转录激活及与细胞转化和肿瘤发生相关的下游信号级联。
(l)PDK1表达的增加：磷酸肌醇3磷酸依赖性激酶1(PDK1)是AKT的主要调节剂，且在经由AKT信号传导的细胞生存中起作用。近来，MEK/ERK和PI3K/AKT信号传导复合物的组成型活化在尤文氏肉瘤肿瘤族(ESFT)中被报道(Benini S.等Int J Cancer.108(3)：358-66，2004；Liu LZ等Cancer Res.67(13)：6325-32，2007)。包括PDK1的这些信号传导酶响应于抗癌治疗的表达提高也已被报导(Kawaguchi W等：CancerSci.98(12)：2002-2008，2007，Liu SQ等Dig Liver Dis.2006May；38(5)：310-318，2006)。在ESFT中PDK1和MAPK的抑制与抗癌药物的结合在癌症治疗的开发中是非常成功的策略(Yamamoto T等JCancer Res Clin Oncol.135(8)：1125-36，2009)。
(m)半胱天冬酶12表达的增加：这些都属于半胱氨酸蛋白酶大家族，其是ER应激特性细胞凋亡的重要介质。尽管，ER应激不被认为是EWS中的重要成分，但是推测辅酶Q10处理触发ER应激。采用抗癌药物如顺铂的先前研究已证明导致半胱天冬酶12介导的ER应激特异性细胞凋亡的增加(Liu H等J Am Soc Nephrol.16(7)：1985-92，2005)。
(n)磷脂酶D1表达的增加：这是磷脂酰胆碱特异性磷脂酶D，其参与调节有丝分裂/细胞增殖和膜流通的信号传导事件。一项涉及EWS/FLi或FLi的过表达和RNAi敲除的研究表明，仅PLD2基因表达被改变而PLD1的基因表达没有改变(Kikuchi R等Oncogene.26(12)：1802-10，2007)。他们还证明，PLD1基因中的5’启动子缺乏EWS/FLi融合蛋白的结合序列。然而，PLD1已被证明对于细胞生存和保护细胞不发生凋亡是必不可少的。由半胱天冬酶切割PLD1经由p53依赖的细胞死亡途径的调节促进细胞凋亡(Jang YH等Cell Death Differ.15(11)：1782-93，2008)。
(o)p34cdc2激酶及p34BP1表达的增加：p34cdc2是调节细胞进入M期的激酶。p34cdc2的过早激活导致细胞周期停滞和细胞凋亡的启动。如紫杉醇的抗癌药物诱导EWS中p34cdc2的过早激活，从而导致细胞凋亡(Duan，H.等，2005；Lee S.等Cancer Res.62(20)：5703-10，2002)。响应于辅酶Q10的p34cdc2和结合蛋白(p34BP1)表达的增加表明辅酶Q10在NCI0808细胞中诱导的凋亡活性的增加。
(p)Bruton丙种球蛋白缺乏症酪氨酸激酶(BTK)表达的增加：BTK参与磷脂酶γ2的激活，从而导致细胞内钙释放、细胞外钙内流和PKC激活。BTK已被报道直接与EWS蛋白质结合和相互作用(Bajpai UD等J Exp Med.191(10)：1735-44，2000)，但是其在EWS中的确切作用还不为人知。因BTK激活PKC表明其介导癌细胞中钙触发的细胞凋亡(Zhu，D-M.等Clin.Cancer Res.，5：355-360，1999)。
(q)ASC2表达的增加：含有CARD域(半胱天冬酶募集域)的细胞凋亡相关斑点样蛋白—属于含pyrine域的蛋白质类型，并且是调节炎症反应、细胞凋亡和细胞因子处理的途径的关键成分。这些蛋白质利用pyrine域激活NFkb和半胱天冬酶1(Stehlik C等Biochem J.373(Pt1)：101，2003)。这表示，这些蛋白质参与介导辅酶Q10引起的在NCI0808中的细胞凋亡。
(r)BubR1表达的增加：BubR1用作有丝分裂检查点的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其是调节后期促进复合物(APC/C)必不可少的(Choi等，2009)。这种蛋白质的破坏导致癌细胞的有丝分裂停滞和细胞凋亡(Xu HZ等Cell Cycle.9(14)：2897-907，2010)。已在许多形式的癌症中报道受损的纺锤体检查点且BubR1表达增加可能与对辅酶Q10的反应一致。
(s)PCAF表达的增加：PCAF是组蛋白乙酰转移酶，其乙酰化组蛋白和非组蛋白蛋白质。其参与介导包括细胞凋亡的各种功能。
(t)Raf1表达的增加：Raf1是原癌基因且作为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶发挥作用，其调节G2/M从细胞周期退出。其参与从细胞膜到细胞核的有丝分裂信号的转导，代表从受体到细胞核的Ras依赖性信号传导途径的一部分。
(u)MSK1表达的增加：MSK1是有丝分裂原和应激激活的蛋白激酶1，其直接被MAPK和SAPK/p38激活且随之可以激活CREB蛋白质(Deak M等EMBO J.17(15)：4426-41，1998)。活性CREB的抑制在人非小细胞肺癌中诱导细胞凋亡和抑制细胞生长。
(v)SNAP25表达的增加：SNAP-25蛋白质是SNARE复合体的组分，并参与突触前神经细胞膜上通道的装配。EWS/Fli嵌合蛋白通过调节Brn-3a(调控SNAP25的转录因子)抑制神经元分化和SNAP25的表达(Gascoyne DM等Oncogene.23(21)：3830-40，2004)。辅酶Q10可以在处理的NCIES 0808细胞中抑制EWS/Fli嵌合蛋白的激活。
(v)mTOR表达的减少：雷帕霉素的哺乳动物靶标也称为雷帕霉素的机械靶标或FK506结合蛋白12-雷帕霉素相关蛋白1(FRAP1)，其是在人类中被FRAP1基因编码的蛋白质(Brown EJ等Nature 369(6483)：756-8，1994；Moore PA等Genomics 33(2)：331-2，1996)。mTOR是调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动、细胞存活、蛋白质合成、转录的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和属于磷脂酯肌醇3-激酶相关的激酶蛋白质家族(Hay N等Genes Dev 18(16)：1926-45，2004；Beevers C.等Int J Cancer119(4)：757-64，2006)。mTOR在由营养物质和有丝分裂原如生长因子引起的信号传导中起到核心作用以调节转录。mTOR整合来自上游途径的输入，包括胰岛素、生长因子(如IGF-1和IGF-2)和有丝分裂原。mTOR也感知细胞的营养和能量水平及氧化还原状态(Hay N等，2004)。考虑到其在细胞新陈代谢/生物能量状态的调节中的主要作用和mTOR失调与癌症相关的现象，在NCIES 0808细胞系中响应于辅酶Q10的mTOR表达的减少暗示其影响尤文氏肉瘤中细胞新陈代谢/生物能量状态的能力。
实施例9：制备包括辅酶Q10 21％浓缩物和烷基苯甲酸酯的0.5kg批量3％辅酶Q10乳膏的方法
0.5kg批量的辅酶Q10乳膏3.0％组合物通过组合以下几个相制备。相A包括C12-15烷基苯甲酸酯4.00％w/w、十六醇NF 2.00％w/w、甘油硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯4.50％w/w和十八醇NF 1.5％w/w。下表中列出其百分比和量。
Figure BPA00001530185501501
Figure BPA00001530185501511
表47
相B包括二乙二醇单乙醚NF 5.00％w/w、甘油USP 2.00％w/w、丙二醇USP 1.50％w/w、苯氧乙醇NF 0.475％w/w、纯化水USP 16.725％w/w和2％卡波姆分散体40％w/w。其百分比和量被列于下表相应的相中。
Figure BPA00001530185501512
表48
相C包括乳酸USP 0.50％w/w、乳酸钠溶液USP 2.00％w/w、三乙醇胺NF 1.30％w/w和纯化水USP 2.50％w/w。百分比、量和其它细节列于下表中。
  相   商品名   CTFA名称   百分比   量(kg)
  C   TEALAN 99％   三乙醇胺   1.300   0.0065
  C   RITALAC LA   乳酸   0.500   0.0025
  C   RITALAC NAL   乳酸钠、水   2.000   0.0100
  C   PURIFIED WATER，USP   水   2.500   0.0125
表49
相D包括二氧化钛USP 1.00％w/w，而相E包括辅酶Q10 21％浓缩物15.00％w/w。百分比、量和其它细节列于下表中。
Figure BPA00001530185501521
表50
所有的重量百分比是相对于整个辅酶Q10乳膏3.0％组合物的重量。
相A成分被添加至合适的容器中，并在水浴中加热到70至80℃。相B成分，但不包括卡波姆分散体，被加入合适的容器中并混合。相C成分也加入合适的容器中，然后在水浴中加热到70至80℃。相E的辅酶Q10 21％浓缩的被放置在合适的容器中并用50至60℃水浴融化。必要时，成分被混合以确保其均匀性。卡波姆分散体随后添被加到合适的容器(混合罐)中，并在混合的同时在水浴中加热到70至80℃。在成分正在被混合的同时，相B的成分被添加至混合罐的内含物中同时保持温度。该内含物被不断混合和均匀化。之后搅拌器被关闭，但均匀化仍被保持。在继续均匀化的同时，相D的二氧化钛被加入到混合罐中。之后打开搅拌器，并且内含物被混合和进一步均匀化直到完全均匀和充分扩展(检查颜色)。之后停止均匀化并且物料冷却到50至60℃之间。然后搅拌器被关闭，并将融化的辅酶Q10 21％浓缩物加入混合罐中。搅拌器随后被打开，并且内含物进行混合/循环直至分散相光滑和均匀。混合罐的内容物然后冷却到45至50℃，然后内容物转移到合适的容器中进行存储直到开包。
实施例10：尤文氏肉瘤肿瘤在体内的治疗。
进行实验以评估局部辅酶Q10处理在动物模型中对体内尤文氏肉瘤肿瘤的效力。一种或多种下列尤文氏肉瘤细胞系被应用于这些实验中：TC71、TC32、RD-ES、5838、A4573、EWS-925、NCI-EWS-94和NCI-EWS-95(Kontny HU等，Simultaneous expression of Fas andnonfunctional Fas ligand in Ewings’s sarcoma.Cancer Res1998；58：5842-9)。NCI-EWS-011和NCI-EWS-021细胞系在美国国家癌症研究所从复发的尤文氏肉瘤获得的肿瘤组织中建立。切除的肿瘤和建立的细胞系都是对t(11；22)EWS/FLI-1易位呈阳性的。横纹肌肉瘤细胞系RD4A(Kalebic T等，Metastatic human rhabdomyosarcoma：molecular，cellular and cytogenetic analysis of a novel cellular model，InvasionMetastasis 1996；16：83-96)和神经母细胞瘤细胞系CHP-212和KCNR(Thiele C.Neuroblastoma.In：Masters J，Palsson B，editors.Human cellculture.Vol 1.Boston(MA)：Kluwer Academic Publishers；1999.p.21-53)被用做阴性对照。细胞系生长在补充了2mM L-谷氨酰胺和0.1％或10％胎牛血清(Life Technologies，Gaithersburg，MD)的RPMI-1640培养基中。
肿瘤细胞被培养至75％汇合，用胰蛋白酶/EDTA收获，之后用PBS洗涤两次。两百万尤文氏肉瘤细胞在100μL PBS中被注射至4-8周龄雌性SCID/bg小鼠(Taconic，Germantown，NY)的腓肠肌中。每只小鼠一般产生在接种后21-28天明显的单一的可触摸肿瘤。在肿瘤体积达到100-500mm3时，小鼠被随机分配以接受在本申请描述的各种不同剂量的局部辅酶Q10(例如，每平方厘米皮肤0.01至0.5毫克的辅酶Q10或用于小鼠施用的适当等同量)或者仅介质(5或10只小鼠每组)。辅酶Q10的局部剂量被给予小鼠以单一给药或以多个(比如2、3、4、5或更多个)周期或轮施用。每1或2天使用数显卡尺测量肿瘤尺寸以获得肿瘤球体的两个直径。肿瘤部位的低极限体积按公式(Dxd2/6)xπ确定，这里D是较长的直径，d是较短的直径。无肿瘤的低极限体积约50mm3。肿瘤体积在用辅酶Q10局部处理的小鼠和仅用介质处理的小鼠中随时间进行比较以评价辅酶Q10体内抑制尤文氏肉瘤肿瘤细胞的生长和扩散的效力。
参考文献
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等同：
本领域的技术人员可以认识到或者能够只使用常规实验确定许多本文所述的具体的实施方式和方法的等同方式。这些等同方式意在被包含在以下的权利要求的范围中。

Claims (54)

1.一种治疗或预防人的肉瘤的方法，包括：
向该个人局部地施用辅酶Q10分子以治疗或预防肉瘤发生。
2.权利要求1的方法，其中所述局部施用是通过为在人体中对所治疗的肉瘤提供疗效而选择的剂量。
3.权利要求1的方法，其中被治疗的肉瘤不是通常通过局部施用来治疗的肉瘤，而是预期以治疗有效水平系统递送活性剂。
4.权利要求1的方法，其中所述辅酶Q10分子在被治疗的人类组织中的浓度与代表健康或正常状态的人类组织的对照标准的浓度不同。
5.权利要求1的方法，其中向人体施用的所述辅酶Q10分子的形式与在人体内系统循环中发现的主要形式不同。
6.权利要求1-5中的任一项的方法，其中所述治疗通过辅酶Q10分子与选自下组的基因的相互作用进行：ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3AL9S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD65 67、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基、Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure FPA00001530185400011
结合抑制剂、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3、真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD、hnRNP C1/C2、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRaf pSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、肌球蛋白调节轻链、hnRNPC1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、β-微管蛋白、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1β2、ER脂筏相关的2同型体1(β肌动蛋白)、信号序列受体1δ、真核翻译起始因子3、亚基3γ、胆绿素还原酶A(转醛醇酶1)、角蛋白1，10(旁胸腺素)、GSTω1、B链多巴胺苯醌结合DJ-1、蛋白酶体激活剂Reg(α)、T-复合蛋白1同型体A、链A甲巯蛋白ERP57(含伴侣蛋白的TCP1)、泛素激活酶E1；丙氨酰-tRNA合成酶、动力蛋白激活蛋白1、热休克蛋白60kd、β肌动蛋白、亚精胺合成酶(β肌动蛋白)、热休克蛋白70kd、视网膜母细胞瘤结合蛋白4同型体A、TAR DNA结合蛋白、真核翻译延长因子1β2、含伴侣蛋白的TCP1、亚基3、胞质动力蛋白IC-2、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2、VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34 cdc2、P53 BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21 WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)、MRP1、MDC1、层粘连蛋白2 a2、b联蛋白，FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、NeurabinI、AP1和Apaf1。
7.权利要求2的方法，其中所述辅酶Q10分子以每平方厘米皮肤约0.01至约0.5毫克辅酶Q10的剂量范围在局部载体中应用于靶组织。
8.权利要求2的方法，其中所述辅酶Q10分子以每平方厘米皮肤约0.09至约0.15毫克辅酶Q10的剂量范围在局部载体中应用于靶组织。
9.权利要求2的方法，其中所述辅酶Q10分子以每平方厘米皮肤约0.12毫克辅酶Q10的剂量范围在局部载体中应用于靶组织。
10.权利要求1的方法，其中所述肉瘤是尤文氏肿瘤族中的肉瘤类型。
11.权利要求10的方法，其中所述尤文氏肿瘤族中的肉瘤类型是尤文氏肉瘤。
12.一种抑制人中EWS-FLI1融合蛋白的活性的方法，包括：
选择患有肉瘤的人类受试者，以及
向所述人类受试者施用治疗有效量的辅酶Q10分子，从而抑制EWS-FLI1融合蛋白的活性。
13.一种治疗或预防人中肉瘤的方法，包括：
按照给药方案向需要的人施用辅酶Q10分子以使得调节人的细胞膜的渗透性，和治疗或预防肉瘤发生。
14.权利要求1-5和8-13中任一项的方法，进一步地包括：
上调选自于下组的一种或者多种基因的表达水平：LAMA5、PXLDC1、p300 CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160 200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRaf pSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、肌球蛋白调节轻链、hnRNP  C1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、微管相关蛋白、β微管蛋白、蛋白酶体α3、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1δ、热休克蛋白27kD、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、ER脂筏相关的2同型体1(β肌动蛋白)、铜/锌过氧化物歧化酶、信号序列受体1δ、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2和VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34 cdc2、P53BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21 WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)和MRP1；和/或
下调选自于下组的一种或者多种基因的表达水平：ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3AL9S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD6567、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基，Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure FPA00001530185400041
结合抑制剂、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3、真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD、hnRNP C1/C2、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、MDC1、层粘连蛋白2a2、b联蛋白、FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、NeurabinI、AP1和Apaf1。
15.权利要求12或13的方法，其中所述治疗通过所述辅酶Q10分子与选自于下组的基因的相互作用进行：ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3 AL9 S10、MTA 2、谷氨酸脱羧酶GAD65 67、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基，Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure FPA00001530185400051
结合抑制剂、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3、真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD、hnRNP C1/C2、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRaf pSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、肌球蛋白调节轻链、hnRNPC1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNP C1/C2、热休克蛋白70kD、β-微管蛋白、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1β2、ER脂筏相关的2同型体1(β肌动蛋白)、信号序列受体1δ、真核翻译起始因子3、亚基3γ、胆绿素还原酶A(转醛醇酶1)、角蛋白1，10(旁胸腺素)、GSTω1、B链多巴胺苯醌结合DJ-1、蛋白酶体激活剂Reg(α)、T-复合蛋白1同型体A、链A甲巯蛋白ERP57(含伴侣蛋白的TCP1)、泛素激活酶E1；丙氨酰-tRNA合成酶、动力蛋白激活蛋白1、热休克蛋白60kd、β肌动蛋白、亚精胺合成酶(β肌动蛋白)、热休克蛋白70kd、视网膜母细胞瘤结合蛋白4同型体A、TAR DNA结合蛋白、真核翻译延长因子1β2、含伴侣蛋白的TCP1、亚基3、胞质动力蛋白IC-2、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2、VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34 cdc2、P53 BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21 WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)、MRP1、MDC1、层粘连蛋白2 a2、b联蛋白，FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、NeurabinI、AP1和Apaf1。
16.权利要求1-15任一项的方法，进一步包含选自于外科手术、放射疗法、激素治疗、抗体治疗、利用生长因子、细胞因子的疗法、化疗和同种异体干细胞疗法的治疗方案。
17.一种评估用于治疗受试者中肉瘤的疗法的效力的方法，该方法包括：
比较向受试者施用治疗方案的至少一部分之前从该受试者获得的第一样品中存在的标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组；和
从施用了治疗方案的至少一部分后从受试者获得的第二样品中存在的标志物的表达水平，
其中与第一样品相比，第二样品中标志物的表达水平的调节表明该疗法对治疗受试者中的肉瘤是有效的。
18.一种评估受试者是否患有肉瘤的方法，该方法包括：
测定从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组；和
对比从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平和对照样品中存在的标志物的表达水平，其中相对于对照样品中标志物的表达水平，从受试者获得的生物样品中标志物的表达水平的调节表明该受试者患有肉瘤，由此评估受试者是否患有肉瘤。
19.一种预测受试者是否有患肉瘤的倾向的方法，该方法包括：
测定从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组；和
对比从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平和对照样品中存在的标志物的表达水平，其中相对于对照样品中标志物的表达水平，从受试者获得的生物样品中标志物的表达水平的调节表明该受试者易患肉瘤，从而预测受试者是否有患肉瘤的倾向。
20.一种预测受试者中肉瘤复发的方法，该方法包括：
测定从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组；和
对比从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平和对照样品中存在的标志物的表达水平，其中相对于对照样品中标志物的表达水平，从受试者获得的生物样品中标志物的表达水平的调节表明肉瘤的复发，从而预测受试者中肉瘤的复发。
21.一种预测患有肉瘤的受试者的生存的方法，该方法包括：
测定从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组；和
对比从受试者获得的生物样品中存在的标志物的表达水平和对照样品中存在的标志物的表达水平，其中相对于对照样品中标志物的表达水平，从受试者获得的生物样品中标志物的表达水平的调节是受试者的生存的指示，从而预测患有肉瘤的受试者的生存。
22.一种监测受试者中肉瘤发展的方法，该方法包括：
比较在向受试者施用治疗方案的至少一部分前从该受试者获得的第一样品中存在的标志物的表达水平和施用了治疗方案的至少一部分后从受试者获得的第二样品中存在的标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的标志物组成的组，从而监测受试者中肉瘤的发展。
23.一种鉴别用于治疗受试者中肉瘤的化合物的方法，该方法包括：
从受试者获得生物样品；
将该生物样品与测试化合物接触；
测定从受试者获得的生物样品中存在的一种或多种标志物的表达水平，其中该标志物选自于表2-9中列出的具有正倍数变化和/或负倍数变化的标志物组成的组；
对比生物样品中该一种或多种标志物的表达水平和适合的对照；和
选择降低生物样品中存在的具有负倍数变化的一种或多种标志物的表达水平和/或提高生物样品中存在的具有正倍数变化的一种或多种标志物的表达水平的受试化合物，从而鉴别用于治疗受试者中肉瘤的化合物。
24.权利要求17-23中任一项的方法，其中所述肉瘤是尤文氏肿瘤族中的肉瘤类型。
25.权利要求24的方法，其中所述尤文氏肿瘤族中的肉瘤类型是尤文氏肉瘤。
26.权利要求17-23中任一项的方法，其中所述样品包括从受试者获得的流体。
27.权利要求26的方法，其中所述流体选自于血液流体、呕吐物、唾液、淋巴液、囊肿液、尿液、通过支气管灌洗收集的流体、通过腹膜冲洗收集的流体和妇科流体组成的组。
28.权利要求27的方法，其中所述样品是血液样品或其成分。
29.权利要求17-23任一项的方法，其中所述样品包括从受试者获得的组织或其成分。
30.权利要求29的方法，其中所述组织选自于骨骼、结缔组织、软骨、肺、肝、肾、肌肉组织、心脏、胰和皮肤组成的组。
31.权利要求17-23中任一项的方法，其中所述受试者是人。
32.权利要求17-23中任一项的方法，其中通过分析样品中转录的多核苷酸或其部分而测定生物样品中标志物的表达水平。
33.权利要求32的方法，其中分析转录的多核苷酸包括扩增该转录的多核苷酸。
34.权利要求17-23中任一项的方法，其中通过分析样品中的蛋白质或其部分测定受试者样品中标志物的表达水平。
35.权利要求34的方法，其中所述蛋白质利用与该蛋白质特异性结合的试剂进行分析。
36.权利要求17-23中任一项的方法，其中使用选自于所述样品的聚合酶链反应(PCR)扩增反应、逆转录酶PCR分析、单链构象多态性分析(SSCP)、错配裂解检测、异源双链体分析、Southern印迹分析、Northern印迹分析、Western印迹分析、原位杂交、阵列分析、脱氧核糖核酸测序、限制性片段长度多态性分析及其组合或亚组合组成的组的技术测定样品中标志物的表达水平。
37.权利要求17-23中任一项的方法，其中使用选自于免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞分析、ELISA和质谱分析组成的组的技术测定样品中标志物的表达水平。
38.权利要求17-23中任一项的方法，其中所述标志物是选自于下组的标志物：ANGPTL3、CCL2、CDH5、CXCL1、CXCL3、PRMT3、HDAC2、一氧化氮合酶bNOS、乙酰磷酸化组蛋白H3AL9S10、MTA2、谷氨酸脱羧酶GAD6567、KSR、HDAC4、BOB1 OBF1、a1互生蛋白、BAP1、Importina 57、αE-联蛋白、Grb2、Bax、蛋白酶体26S亚基13(Endophilin B1)、类肌动蛋白6A(真核起始因子4A11)、核氯离子通道蛋白、蛋白酶体26S亚基，Cu/Zn过氧化物歧化酶、转位蛋白相关因子X、亚砷酸盐移位ATP酶(精胺合成酶)、核糖体蛋白质SA、dCTP焦磷酸酶1、蛋白酶体β3、蛋白酶体β4、酸性磷酸酶1、苯二氮
Figure FPA00001530185400091
结合抑制剂、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、核糖体蛋白P2(RPLP2)；组蛋白H2A、微管相关蛋白、蛋白酶体α3、真核翻译延长因子1δ、核纤层蛋白B1、mif二3同源物2的SMT3抑制因子、热休克蛋白27kD，hnRNP C1/C2、真核翻译延长因子1β2、类似于HSPC-300、DNA指导的DNA聚合酶epislon 3；(canopy 2同源物)、LAMA5、PXLDC1、p300CBP、P53R2、磷脂酰丝氨酸受体、细胞角蛋白肽17、细胞角蛋白肽13、神经丝160200、Rab5、晶丝蛋白、P53R2、MDM2、MSH6、热休克因子2、AFX、FLIPg d、JAB 1、肌球蛋白、MEKK4、cRaf pSer621、FKHR FOXO1a、MDM2、Fas配体、P53R2、肌球蛋白调节轻链、hnRNP C1/C2、Ubiquilin 1(磷酸酶2A)、hnRNP C1/C2、α2-HS糖蛋白(黄牛，牛)、β-肌动蛋白、hnRNPC1/C2、热休克蛋白70kD、β-微管蛋白、ATP依赖的解旋酶II、真核翻译延长因子1β2、ER脂筏相关的2同型体1(β肌动蛋白)、信号序列受体1δ、真核翻译起始因子3、亚基3γ、胆绿素还原酶A(转醛醇酶1)、角蛋白1，10(旁胸腺素)、GSTω1、B链多巴胺苯醌结合DJ-1、蛋白酶体激活剂Reg(α)、T-复合蛋白1同型体A、链A甲巯蛋白ERP57(含伴侣蛋白的TCP1)、泛素激活酶E1；丙氨酰-tRNA合成酶、动力蛋白激活蛋白1、热休克蛋白60kd、β肌动蛋白、亚精胺合成酶(β肌动蛋白)、热休克蛋白70kd、视网膜母细胞瘤结合蛋白4同型体A、TAR DNA结合蛋白、真核翻译延长因子1β2、含伴侣蛋白的TCP1、亚基3、胞质动力蛋白IC-2、血管紧张素转化酶(ACE)、半胱天冬酶3、GARS、基质金属蛋白酶(MMP-6)、溶神经素(NLN)-催化结构域和溶神经素(NLN)、ADRB、CEACAM1、DUSP4、FOXC2、FOXP3、GCGR、GPD1、HMOX1、IL4R、INPPL1、IRS2、VEGFA、假定的c-myc反应性同型体1、PDK1、半胱天冬酶12、磷脂酶D1、P34cdc2、P53BP1、BTK、ASC2、BUBR1、ARTS、PCAF、Raf1、MSK1、SNAP25、APRIL、DAPK、RAIDD、HAT1、PSF、HDAC1、Rad17、生存素、SLIPR、MAG13、半胱天冬酶10、Crk2、Cdc 6、P21WAF 1 Cip 1、ASPP 1、HDAC 4、细胞周期蛋白B1、CD 40、GAD 65、TAP、Par4(前列腺凋亡反应蛋白4)、MRP1、MDC1、层粘连蛋白2a2、b联蛋白、FXR2、膜联蛋白V、SMAC Diablo、MBNL1、二甲基组蛋白h3、独立生长因子1、U2AF65、mTOR、E2F2、Kaiso、糖原合酶激酶3、ATF2、HDRP MITR、Neurabin I、AP1和Apaf1。
39.权利要求17-23中任一项的方法，其中测定多个标志物的表达水平。
40.权利要求17-23中任一项的方法，其中所述受试者用选自于环境影响剂化合物、外科手术、放射疗法、激素治疗、抗体治疗、用生长因子、细胞因子的疗法、化学疗法、同种异体干细胞疗法组成的组的疗法进行治疗。
41.权利要求40的方法，其中该环境影响剂化合物是辅酶Q10分子。
42.一种用于评估治疗肉瘤的疗法的效力的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒评估治疗肉瘤的疗法的效力的说明。
43.一种用于评估受试者是否患有肉瘤的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒评估受试者是否患有肉瘤的说明。
44.一种用于预测受试者是否易于发生肉瘤的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒预测受试者是否易于发生肉瘤的说明。
45.一种用于预测受试者中肉瘤复发的试剂盒，该试剂盒包括用于评估选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒预测肉瘤复发的说明。
46.一种用于预测肉瘤复发的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒预测肉瘤复发的说明。
47.一种用于预测患有肉瘤的受试者的生存的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒预测患有肉瘤的受试者的生存的说明。
48.一个用于监测受试者中肉瘤发展的试剂盒，该试剂盒包括用于测定选自于表2-9中列出的标志物组成的组的至少一个标志物的表达水平的试剂，和应用该试剂盒预测受试者中肉瘤的发展的说明。
49.权利要求42-48中任一项的试剂盒，进一步包括从受试者获得生物样品的手段。
50.权利要求42-48中任一项的试剂盒，进一步包括对照样品。
51.权利要求42-48中任一项的试剂盒，其中用于测定至少一个标志物的表达水平的手段包括用于分析样品中转录的多核苷酸或其部分的手段。
52.权利要求42-48中任一项的试剂盒，其中用于测定至少一个标志物的表达水平的手段包括用于分析样品中蛋白质或其部分的方法。
53.权利要求42-48中任一项的试剂盒，进一步包括环境影响剂化合物。
54.权利要求42-48中任一项的试剂盒，其中该试剂盒包括用于测定多个标志物的表达水平的试剂。
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