CN106053813A - 一种检测鼻咽癌pdk1表达量的免疫组化试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测鼻咽癌pdk1表达量的免疫组化试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒及其应用。该试剂盒包括盒体、连接在盒体上的盖体、固定在盒体内与盒体容积相匹配的衬体，所述衬体上设置有若干试管孔；该试剂盒还包括装有人源性可溶性鼻咽癌PDK1抗原的抗体的试管、装有HRP标记的羊抗鼠IgG的试管、装有显色液试管以及装有复染液的试管，各试管插装在试管孔中；所述盖体的前端向下延伸出扣合片，扣合片内设置有第一磁片，所述盒体上与扣合片叠合的位置处设置有与第一磁片极性相反的第二磁片，盖体通过第一磁片与第二磁片之间的磁力贴合在盒体上。本发明所述的试剂盒可根据检测到的PDK1的表达量作为预测鼻咽癌患者复发检测指标。

Description

一种检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒及其应用。
背景技术
鼻咽癌为我国多发肿瘤之一，其发病率为耳鼻咽喉科恶性肿瘤之首，系恶性程度较高的肿瘤。流行病学上我国是鼻咽癌最高发地区之一，尤以南方为甚。目前鼻咽癌患者的治疗主要是采用放疗及同步放化疗为主的综合治疗模式，许多早期患者经治疗可获得痊愈。但是仍然有约30％-40％的患者由于转移和复发，未能获得长期生存，尤其对于晚期鼻咽癌患者的治疗效果仍不容乐观。
丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)是Akt信号通路上的一个重要蛋白质，能够激活Akt信号通路，抑制肿瘤细胞凋亡，被认为是一种致癌基因。PDK1的激活限制了丙酮酸流入线粒体进行氧化磷酸化，而在胞浆进行糖酵解，对肿瘤细胞凋亡的拮抗也有很大的影响。研究发现在非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈部癌、肾癌等细胞中PDK1蛋白表达明显增高，而且表达程度与患者预后有关，抑制PDK1还可以作为一种新的靶向治疗手段。因此有必要在临床开发检测针对于PDK1的方法，从而有望将PDK1作为一种新的肿瘤标记物，为鼻咽癌的预后观察提供一种辅助判定指标。
目前在该领域的生物标记物研究仍处于新兴阶段，尚无成熟的可用于鼻咽癌放疗后复发预测的指标。也没有PDK1可作为预测鼻咽癌放疗后复发的生物标记物的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，用于检测PDK1的表达量，并根据检测到的PDK1的表达量作为预测鼻咽癌患者复发检测指标。
本发明的另一目的在于检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒制备鼻咽癌复发诊断试剂中的应用。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其包括盒体、连接在盒体上的盖体、固定在盒体内与盒体容积相匹配的衬体，所述衬体上设置有若干试管孔；该试剂盒还包括装有人源性可溶性鼻咽癌PDK1抗原的抗体的试管、装有HRP标记的羊抗鼠IgG的试管、装有显色液试管以及装有复染液的试管，各试管插装在试管孔中；所述盖体的前端向下延伸出扣合片，扣合片内设置有第一磁片，所述盒体上与扣合片叠合的位置处设置有与第一磁片极性相反的第二磁片，盖体通过第一磁片与第二磁片之间的磁力贴合在盒体上。
作为进一步的方案，本发明所述的衬体为泡沫衬体。
作为进一步的方案，本发明所述的试剂盒还包括用于固定各试管的固定套管，所述固定套管套接在各个试管上，固定套管的下端外径与试管孔内径过盈配合。
在本发明具体的方案中，所述的显色液为DAB显色液。
在本发明具体的方案中，所述的复染液为苏木素复染液。
在本发明具体的方案中，所述放入抗体能够特异性结合PDK1抗原分子。
作为进一步的方案，本发明所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒还包括PBS洗涤液，该PBS洗涤液的pH值为7.2-7.5。
在本发明具体的方案中，检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒检测的样本为肿瘤组织。
本发明所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒在制备预测复发鼻咽癌的检测试剂中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒敏感性高，PDK1抗体与市面上其它的鼻咽癌标志物相比，阳性强度可以达到++++，符合临床监测标准；
2.本发明所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒准确性高，PDK1抗体与市面上其它的鼻咽癌标志物相比，准确率较高，符合临床监测标准；
3.本发明所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒可以应用于人的鼻咽癌细胞PDK1抗原的检测，然后分析阳性细胞百分比和细胞染色强度并进行打分，再以二者分数的乘积作为总分数，结果发现鼻咽癌组织PDK1蛋白表达显著上升，PDK1高表达的鼻咽癌患者复发率较高。本发明提供了证实了PDK1可作为鼻咽癌复发的生物标记物，为预测鼻咽癌复发提供了一种切实可行的方法。根据PDK1的表达量作为鼻咽癌患者预后复发检测指标；本发明以病人肿瘤组织为检测样本具有快捷，敏感性好，特异性高，易于推广等特点。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒的结构示意图；
图2为本发明用于正常鼻咽粘膜组织免疫组化实验的图片(400x)；
图3为本发明用于初发鼻咽癌患者免疫组化实验的图片(400x)；
图4为本发明用于复发鼻咽癌患者免疫组化实验的图片(400x)；
图5为鼻咽癌患者PDK1分别在初发鼻咽癌组织中和复发鼻咽癌组织中的表达关系图；
图6为PDK1低表达组和高表达组患者的生存比较曲线图；
其中，各附图标记为：10、盒体；20、盖体；21、扣合片；30、衬体；31、试管孔。
具体实施方式
如图1所示，本发明所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其包括盒体10、连接在盒体10上的盖体20、固定在盒体10内与盒体10容积相匹配的衬体30，所述衬体30上设置有若干试管孔31；该试剂盒还包括装有人源性可溶性鼻咽癌PDK1抗原的抗体的试管、装有HRP标记的羊抗鼠IgG的试管、装有显色液试管以及装有复染液的试管，各试管插装在试管孔中；所述盖体20的前端向下延伸出扣合片21，扣合片21内设置有第一磁片，所述盒体10上与扣合片21叠合的位置处设置有与第一磁片极性相反的第二磁片，盖体20通过第一磁片与第二磁片之间的磁力贴合在盒体10上。
作为进一步的方案，本发明所述的衬体为泡沫衬体。
作为进一步的方案，本发明所述的试剂盒还包括用于固定各试管的固定套管，所述固定套管套接在各个试管上，固定套管的下端外径与试管孔内径过盈配合。
在本发明具体的方案中，所述的显色液为DAB显色液。
在本发明具体的方案中，所述的复染液为苏木素复染液。
在本发明具体的方案中，所述放入抗体能够特异性结合PDK1抗原分子。
作为进一步的方案，本发明所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒还包括PBS洗涤液，该PBS洗涤液的pH值为7.2-7.5。
在本发明具体的方案中，检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒检测的样本为肿瘤组织。
本发明所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒在制备预测复发鼻咽癌的检测试剂中的应用。
实施例1
一种检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其包括盒体10、连接在盒体10上的盖体20、固定在盒体10内与盒体10容积相匹配的衬体30，所述衬体30上设置有若干试管孔31；该试剂盒还包括装有人源性可溶性鼻咽癌PDK1抗原的抗体的试管、装有HRP标记的羊抗鼠IgG的试管、装有显色液试管以及装有复染液的试管，各试管插装在试管孔中；所述盖体20的前端向下延伸出扣合片21，扣合片21内设置有第一磁片，所述盒体10上与扣合片21叠合的位置处设置有与第一磁片极性相反的第二磁片，盖体20通过第一磁片与第二磁片之间的磁力贴合在盒体10上。
采用实施例1所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒检测肿瘤组织样本的具体方法如下：
1)对肿瘤组织进行切片；
2)每张切片组织滴5μL3％H2O2，随后室温孵育10min；
3)用pH 7.5的PBS漂洗3次，每次5min；
4)每张切片组织滴5μL稀释至工作浓度的PDK1抗体，过夜37℃孵育；
5)用pH7.5的PBS漂洗3次，每次5min；
6)每张切片组织滴5μL HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育20min；
7)用pH7.5的PBS漂洗3次，每次5min；
8)每张切片组织滴5μL DAB显色缓冲液，室温孵育3-10min；
9)然后苏木素复染1min，盐酸酒精泛蓝1min；
10)脱水；
11)透明；
11)指甲油封片；
13)显微镜拍照。
采用该试剂盒检测的过程中，可用PBS代替一抗作为阴性对照，以预试验中已知阳性的鼻咽正常黏膜为阳性对照；PDK1蛋白主要在肿瘤细胞及鼻咽正常黏膜上皮细胞胞质内表达，偶见于胞膜和胞核，出现浅棕到棕褐色颗粒为阳性反应。染色结果采用独立双盲评分原则，具体包括两种方式：①染色范围计分：阳性细胞数＜5％为0分，6％～25％为1分，26％～50％为2分，5l％～75％为3分，＞75％为4分。②染色强度计分：按阳性细胞染色强度按未染色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别记为0分、1分、2分、3分。
实施例2
采用实施例1所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，按照上述检测方法对82份鼻咽癌手术样本，包括复发鼻咽癌组织(见图4)和初发鼻咽癌组织(见图3)进行检测。检测结果显示，按照染色程度和染色范围乘积进行评分。最后用统计软件进行分析，复发鼻咽癌中PDK1高表达率则为79.3％(65/82)，主要分布在细胞质中，亦可见细胞核(见图2-4)，差异有统计学意义(P<0.05)。其中图2的结果显示DK1在正常鼻咽组织中呈几乎没有表达；图3的结果显示PDK1在初发鼻咽癌患者中表达呈低表达；图4的结果显示PDK1在复发鼻咽癌患者中表达呈高表达。
通过图5的数据分析后发现，PDK1表达越高患者预后越差，复发率高，因此可以作为鼻咽癌预后复查，复发率高的评判标准，具有显著性差异。根据实施例2的复发率数据比对后发现，图6的结果表明：PDK1阳性患者出现治疗愈后差，复发率高，因此可以作为鼻咽癌愈后复发的评判标准，具有显著性差异。(见图5)。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其特征在于，其包括盒体、连接在盒体上的盖体、固定在盒体内与盒体容积相匹配的衬体，所述衬体上设置有若干试管孔；该试剂盒还包括装有人源性可溶性鼻咽癌PDK1抗原的抗体的试管、装有HRP标记的羊抗鼠IgG的试管、装有显色液试管以及装有复染液的试管，各试管插装在试管孔中；所述盖体的前端向下延伸出扣合片，扣合片内设置有第一磁片，所述盒体上与扣合片叠合的位置处设置有与第一磁片极性相反的第二磁片，盖体通过第一磁片与第二磁片之间的磁力贴合在盒体上。
2.根据权利要求1所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述衬体为泡沫衬体。
3.根据权利要求1所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括用于固定各试管的固定套管，所述固定套管套接在各个试管上，固定套管的下端外径与试管孔内径过盈配合。
4.根据权利要求1所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述显色液为DAB显色液。
5.根据权利要求1所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述复染液为苏木素复染液。
6.根据权利要求1所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述抗体能够特异性结合PDK1抗原分子。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其特征在于，其还包括PBS洗涤液，该PBS洗涤液的pH值为7.2-7.5。
8.根据权利要求1-6任一项所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒，其特征在于，检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒检测的样本为肿瘤组织。
9.权利要求1所述的检测鼻咽癌PDK1表达量的免疫组化试剂盒在制备预测复发鼻咽癌的检测试剂中的应用。
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