JP2023530391A - バレット食道の発症及び食道腺癌の進行を明らかにするマーカーについてのシステム及び方法 - Google Patents

バレット食道の発症及び食道腺癌の進行を明らかにするマーカーについてのシステム及び方法 Download PDF

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Abstract

以下のマーカー遺伝子/タンパク質: ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの1つ又は複数を用いて、対象の食道腺癌を発症するリスクを評価する方法が提供される。対象における1以上の食道腺癌リスク因子の発現を決定するための方法も提供される。対象の食道腺癌を治療するか、対象の食道腺癌を予防するか、食道腺癌細胞の増殖を阻害しもしくは減少させるか、食道腺癌細胞の遊走を阻害しもしくは減少させるか、又は食道腺癌細胞の細胞傷害性に対する感受性を増大させもしくは食道腺癌細胞の細胞死を誘導する方法も提供される。【選択図】図１

Description

(関連出願の相互参照)
本出願は、あらゆる目的のためにその全体が引用により本明細書中に組み込まれている2020年5月19日に出願された米国出願第63/026,818号の恩典を主張する。
(EFSウェブ経由でテキストファイルとして提出された配列表の参照)
ファイル556336SEQLIST.txt中に書かれている配列表は、14キロバイトであり、2021年5月19日に作成された。これは、引用により本明細書中に組み込まれる。
(背景)
食道腺癌(EAC)は、1970年代以降、発生率と普及率の両方において激しい増加を見せ、毎年50万人以上が診断される、現在、世界で8番目に最も一般的な癌である。この発生率の急増は、肥満とバレット食道(BE)として知られる下部食道の異形成をもたらし得る胃食道逆流症の増加とに関連しており、米国の約200万人がこの疾患を抱えて生きている。あらゆる目的のためにその全体が引用により本明細書中に組み込まれる、Zhangの文献(2013) World J. Gastroenterol. 19(34):5598-5606。時間とともに、食道腺癌の罹患数が増加するにつれて、近代医学による比例した生存統計は増加していない。平均して、診断から13カ月後に死に至り、5年の記録に達するのは18％未満である。これは、1975年からわずか10％の5年生存増加である。あらゆる目的のためにその全体が引用により本明細書中に組み込まれる、Howladerらの文献、SEER Cancer Statistics Review, 1975-2011, National Cancer Institute. Bethesda, MD(2014)。これを、それぞれ、白血病、非ホジキンリンパ腫、腎臓癌、及び前立腺癌患者の1975年における予後と比較した、5年生存患者の50、40、50、及び70パーセント増加と対比されたい。驚くこともないが、EACは、限定されないが、シスプラチン、5-FU、タキソール、及びカルボプラチンを含む、多くの初回化学療法戦術に抵抗することが分かっている。さらに、ある研究により、実際は、外科手術のみによる治療を受けたEAC患者と比べて、外科手術＋化学療法による治療を受けたEAC患者の延命効果がないことが示唆された。あらゆる目的のためにその全体が引用により本明細書中に組み込まれる、Rajagopalらの文献(2014) Ann. Palliat. Med. 3(3):203-228。この急速転移性かつ化学療法抵抗性の癌に寄与するものをより良く理解することが必要とされている。
(概要)
食道腺癌及びバレット食道から食道腺癌への進行についての新規のバイオマーカーに関する組成物及び方法が提供される。
一態様において、提供されるのは、対象の食道腺癌を発症するリスクを評価する方法である。いくつかのそのような方法は:(a)対象由来の検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定すること(ここで、該1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される);並びに(b)該検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを対照食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルと比較すること(ここで、該対照食道組織試料と比べた該検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも1つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す)を含む。
いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15を含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、LTFを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、CNDP2を含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、DAD1を含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、SETを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、UBE2Nを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、S100Pを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、GPIを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15及びLTFを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15及びDAD1を含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、LTF及びDAD1を含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、及びDAD1を含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15及びCNDP2を含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、LTF及びCNDP2を含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、及びCNDP2を含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、及びCNDP2を含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、及びSETを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、及びGPIを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、及びSETを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、及びGPIを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、SET、及びGPIを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIを含む。
いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、CNDP2、SET、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、UBE2N、S100P、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
いくつかのそのような方法において、対象は、胃食道逆流症もしくはバレット食道を有するか、又はそれらを有する疑いがある。いくつかのそのような方法において、対象は、バレット食道を有し、検査用食道組織試料は、バレット食道組織試料であり、かつ該方法は、バレット食道から食道腺癌に進行するリスクを評価する。いくつかのそのような方法において、対象はヒトである。
いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、単離された食道組織試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、生検試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、新鮮な試料、凍結試料、保存試料、ホルマリン固定試料、又はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道試料は、顕微解剖試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、粘膜試料又はバレット食道粘膜試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、非粘膜組織から分離されている粘膜試料又はバレット食道粘膜試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、正常粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料を含む。任意に、検査用食道組織試料は、非粘膜組織から分離されているホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)粘膜試料又はFFPEバレット食道粘膜試料を含み、検査用食道組織試料は、正常粘膜組織から分離されているFFPEバレット食道粘膜試料を含むか、又は検査用食道組織試料は、非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されているFFPEバレット食道粘膜試料を含む。
いくつかのそのような方法において、該方法は、工程(a)の前に、検査用食道組織試料から粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織から分離されている検査用食道粘膜試料を産生することをさらに含み、1以上のマーカー遺伝子の発現レベルは、検査用食道粘膜試料中で決定される。いくつかのそのような方法において、該方法は、工程(a)の前に、検査用食道組織試料からバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、正常粘膜組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ1以上のマーカー遺伝子の発現レベルは、検査用バレット食道粘膜試料中で決定される。いくつかのそのような方法において、該方法は、工程(a)の前に、検査用食道組織試料からバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ1以上のマーカー遺伝子の発現レベルは、検査用バレット食道粘膜試料中で決定される。いくつかのそのような方法において、粘膜組織を選択的に単離する工程は、顕微解剖を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である。
いくつかのそのような方法において、対照食道組織試料は、正常食道粘膜を含む。いくつかのそのような方法において、対照食道組織試料は、対象由来のものである。いくつかのそのような方法において、対照食道組織試料は、胃食道逆流症、バレット食道、又は食道腺癌を有さない1以上の対照対象由来のものである。
いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、1以上のマーカー遺伝子によってコードされるメッセンジャーRNA(mRNA)の発現を測定するためのアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、1以上のマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を測定するためのアッセイを実施することを含む。任意に、該アッセイは、マススペクトロメトリーアッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、アルファLISAアッセイ、又は酵素結合免疫吸収スポット(ELISpot)アッセイを含む。
いくつかのそのような方法において、アッセイは、マススペクトロメトリーアッセイを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、検査用食道組織試料を1以上のプロテイナーゼで消化することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料であり、該方法は、マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、FFPE試料を処理して、ホルマリン架橋を無効にすることをさらに含み、任意に、ここで、該処理は、FFPE試料を、洗剤を含まないバッファー中で加熱することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、FFPE試料を処理して、ホルマリン架橋を無効にし、その後、検査用食道組織試料を1以上のプロテイナーゼで消化することを含む。任意に、1以上のプロテイナーゼは、トリプシンを含む。
いくつかのそのような方法において、マススペクトロメトリーアッセイは、標的化マススペクトロメトリーアッセイを含む。いくつかのそのような方法において、マススペクトロメトリーアッセイは、トリプル四重極マススペクトロメーターで行われる。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子はISG15を含み、ここで、ISG15の発現レベルを決定することは、配列番号11又は配列番号12に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子はLTFを含み、ここで、LTFの発現レベルを決定することは、配列番号54又は配列番号58に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子はCNDP2を含み、ここで、CNDP2の発現レベルを決定することは、配列番号20又は配列番号31に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子はDAD1を含み、ここで、DAD1の発現レベルを決定することは、配列番号7又は配列番号9に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子はSETを含み、ここで、SETの発現レベルを決定することは、配列番号50に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子はUBE2Nを含み、ここで、UBE2Nの発現レベルを決定することは、配列番号1又は配列番号5に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子はS100Pを含み、ここで、S100Pの発現レベルを決定することは、配列番号67又は配列番号68に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上のマーカー遺伝子はGPIを含み、ここで、GPIの発現レベルを決定することは、配列番号35又は配列番号39に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。
いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの2つ以上の発現レベルを決定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの3つ以上の発現レベルを決定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの4つ以上の発現レベルを決定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの5つ以上の発現レベルを決定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの6つ以上の発現レベルを決定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの7つ以上の発現レベルを決定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIの発現レベルを決定することを含む。
いくつかのそのような方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子のうちの1つ又は複数の大部分の発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。いくつかのそのような方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子のうちの1つ又は複数の各々の発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。
いくつかのそのような方法において、対象はヒトであり、かつバレット食道を有し、該方法は、バレット食道から食道腺癌に進行するリスクを評価し、ここで、検査用食道組織試料は、単離されたバレット食道粘膜試料を含み、対照食道組織試料は、正常食道粘膜を含み、ここで、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、検査用食道組織試料をトリプシンで消化し、その後、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施して、1以上のマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を測定することを含み、ここで、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIの発現レベルを決定すること(又はその代わりに、ISG15、LTF、及びDAD1の発現レベルを決定すること;又はその代わりに、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIの発現レベルを決定すること)を含み、かつここで:(I)ISG15の発現レベルを決定することは、配列番号11又は配列番号12に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(II)LTFの発現レベルを決定することは、配列番号54又は配列番号58に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(III)CNDP2の発現レベルを決定することは、配列番号20又は配列番号31に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(IV)DAD1の発現レベルを決定することは、配列番号7又は配列番号9に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(V)SETの発現レベルを決定することは、配列番号50に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(VI)UBE2Nの発現レベルを決定することは、配列番号1又は配列番号5に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(VII)S100Pの発現レベルを決定することは、配列番号67又は配列番号68に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;かつ(VIII)GPIの発現レベルを決定することは、配列番号35又は配列番号39に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。任意に、検査用食道組織試料は、非粘膜組織から及び正常粘膜組織から分離されているホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)バレット食道粘膜試料を含み、かつ該方法は、検査用食道組織試料から顕微解剖によってバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織から及び正常粘膜組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生し、その後、該検査用バレット食道粘膜試料を消化前に処理して、ホルマリン架橋を無効にすることをさらに含む。
別の態様において、提供されるのは、対象における1以上の食道腺癌リスク因子の発現を決定する方法である。いくつかのそのような方法は、対象から得られる検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することを含み、ここで、該1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの1つ又は複数を含む。いくつかのそのような方法は、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを対照食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルと比較することをさらに含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、及びDAD1のうちの1つ又は複数を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、CNDP2、SET、及びGPIのうちの1つ又は複数を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIのうちの1つ又は複数を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、UBE2N及びS100Pのうちの1つ又は複数を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、及びGPIのうちの1つ又は複数を含む。
いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、LTFを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、CNDP2を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、DAD1を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、SETを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、UBE2Nを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、S100Pを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、GPIを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15及びLTFを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15及びDAD1を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、LTF及びDAD1を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、及びDAD1を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15及びCNDP2を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、LTF及びCNDP2を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、及びCNDP2.いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、DAD1、及びCNDP2を含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、DAD1、及びSETを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、DAD1、及びGPIを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、及びSETを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、及びGPIを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、DAD1、SET、及びGPIを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIを含む。
いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、DAD1、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、CNDP2、SET、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、UBE2N、S100P、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
いくつかのそのような方法において、対象は、胃食道逆流症もしくはバレット食道を有するか、又はそれらを有する疑いがあり、或いは対象は、バレット食道を有し、かつ検査用食道組織試料は、バレット食道組織試料である。いくつかのそのような方法において、対象はヒトである。
いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、単離された食道組織試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、生検試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、新鮮な試料、凍結試料、保存試料、ホルマリン固定試料、又はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道試料は、顕微解剖試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、粘膜試料又はバレット食道粘膜試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、非粘膜組織から分離されている粘膜試料又はバレット食道粘膜試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、正常粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、非粘膜組織から分離されているホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)粘膜試料又はFFPEバレット食道粘膜試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、正常粘膜組織から分離されているFFPEバレット食道粘膜試料を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されているFFPEバレット食道粘膜試料を含む。
いくつかのそのような方法において、該方法は、1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施する前に、検査用食道組織試料から粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織から分離されている検査用食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルは、検査用食道粘膜試料中で測定される。いくつかのそのような方法において、該方法は、1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施する前に、検査用食道組織試料からバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、検査用正常粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルは、検査用バレット食道粘膜試料中で決定される。いくつかのそのような方法において、該方法は、1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施する前に、検査用食道組織試料からバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、検査用非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルは、検査用バレット食道粘膜試料中で決定される。いくつかのそのような方法において、粘膜組織を選択的に単離する工程は、顕微解剖を含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である。
いくつかのそのような方法において、該方法は、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを対照食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルと比較することをさらに含む。いくつかのそのような方法において、対照食道組織試料は、正常食道粘膜を含む。いくつかのそのような方法において、対照食道組織試料は、対象由来のものである。いくつかのそのような方法において、対照食道組織試料は、胃食道逆流症、バレット食道、又は食道腺癌を有さない1以上の対照対象由来のものである。
いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、1以上の食道腺癌リスク因子によってコードされるメッセンジャーRNA(mRNA)の発現を測定するためのアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、1以上の食道腺癌リスク因子によってコードされるタンパク質の発現を測定するためのアッセイを実施することを含む。任意に、該アッセイは、マススペクトロメトリーアッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、アルファLISAアッセイ、又は酵素結合免疫吸収スポット(ELISpot)アッセイを含む。
いくつかのそのような方法において、アッセイは、マススペクトロメトリーアッセイを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、検査用食道組織試料を1以上のプロテイナーゼで消化することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料であり、該方法は、マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、FFPE試料を処理して、ホルマリン架橋を無効にすることをさらに含み、任意に、ここで、該処理は、FFPE試料を、洗剤を含まないバッファー中で加熱することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、FFPE試料を処理して、ホルマリン架橋を無効にし、その後、検査用食道組織試料を1以上のプロテイナーゼで消化することを含む。任意に、1以上のプロテイナーゼは、トリプシンを含む。
いくつかのそのような方法において、マススペクトロメトリーアッセイは、標的化マススペクトロメトリーアッセイを含む。いくつかのそのような方法において、マススペクトロメトリーアッセイは、トリプル四重極マススペクトロメーターで行われる。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子はISG15を含み、ここで、ISG15の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、配列番号11又は配列番号12に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子はLTFを含み、ここで、LTFの発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、配列番号54又は配列番号58に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子はCNDP2を含み、ここで、CNDP2の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、配列番号20又は配列番号31に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子はDAD1を含み、ここで、DAD1の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、配列番号7又は配列番号9に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子はSETを含み、ここで、SETの発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、配列番号50に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子はUBE2Nを含み、ここで、UBE2Nの発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、配列番号1又は配列番号5に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子はS100Pを含み、ここで、S100Pの発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、配列番号67又は配列番号68に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。いくつかのそのような方法において、1以上の食道腺癌リスク因子はGPIを含み、ここで、GPIの発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、配列番号35又は配列番号39に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。
いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの2つ以上の発現レベルを測定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの3つ以上の発現レベルを測定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの4つ以上の発現レベルを測定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの5つ以上の発現レベルを測定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの6つ以上の発現レベルを測定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの7つ以上の発現レベルを測定することを含む。いくつかのそのような方法において、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIの発現レベルを測定することを含む。
いくつかのそのような方法において、対象はヒトであり、かつバレット食道を有し、ここで、検査用食道組織試料は、単離されたバレット食道粘膜試料を含み、ここで、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、検査用食道試料をトリプシンで消化し、その後、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み、ここで、検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIの発現レベルを測定すること(又はその代わりに、ISG15、LTF、及びDAD1の発現レベルを測定すること;又はその代わりに、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIの発現レベルを測定すること)を含み、かつここで:(I)ISG15の発現レベルを測定することは、配列番号11又は配列番号12に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(II)LTFの発現レベルを測定することは、配列番号54又は配列番号58に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(III)CNDP2の発現レベルを測定することは、配列番号20又は配列番号31に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(IV)DAD1の発現レベルを測定することは、配列番号7又は配列番号9に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(V)SETの発現レベルを測定することは、配列番号50に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(VI)UBE2Nの発現レベルを測定することは、配列番号1又は配列番号5に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;(VII)S100Pの発現レベルを測定することは、配列番号67又は配列番号68に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;かつ(VIII)GPIの発現レベルを測定することは、配列番号35又は配列番号39に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む。任意に、検査用食道組織試料は、非粘膜組織から及び正常粘膜組織から分離されているホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)バレット食道粘膜試料を含み、かつ該方法は、検査用食道組織試料から顕微解剖によってバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織から及び正常粘膜組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生し、その後、該検査用バレット食道粘膜試料を消化前に処理して、ホルマリン架橋を無効にすることをさらに含む。
別の態様において、提供されるのは、対象由来の単離された検査用食道組織試料中のISG15の発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号11又は12に示される配列を含む単離されたペプチドである。任意に、単離されたペプチドは、重同位体で標識されている。
別の態様において、提供されるのは、対象由来の単離された検査用食道組織試料中のLTFの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号54又は58に示される配列を含む単離されたペプチドである。任意に、単離されたペプチドは、重同位体で標識されている。
別の態様において、提供されるのは、対象由来の単離された検査用食道組織試料中のCNDP2の発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号20又は31に示される配列を含む単離されたペプチドである。任意に、単離されたペプチドは、重同位体で標識されている。
別の態様において、提供されるのは、対象由来の単離された検査用食道組織試料中のDAD1の発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号7又は9に示される配列を含む単離されたペプチドである。任意に、単離されたペプチドは、重同位体で標識されている。
別の態様において、提供されるのは、対象由来の単離された検査用食道組織試料中のSETの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号50に示される配列を含む単離されたペプチドである。任意に、単離されたペプチドは、重同位体で標識されている。
別の態様において、提供されるのは、対象由来の単離された検査用食道組織試料中のUBE2Nの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号1又は5に示される配列を含む単離されたペプチドである。任意に、単離されたペプチドは、重同位体で標識されている。
別の態様において、提供されるのは、対象由来の単離された検査用食道組織試料中のS100Pの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号67又は68に示される配列を含む単離されたペプチドである。任意に、単離されたペプチドは、重同位体で標識されている。
別の態様において、提供されるのは、対象由来の単離された検査用食道組織試料中のGPIの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号35又は39に示される配列を含む単離されたペプチドである。任意に、単離されたペプチドは、重同位体で標識されている。
別の態様において、提供されるのは、食道腺癌を有する対象の食道腺癌を治療するか、又は食道腺癌を発症するリスクのある対象の食道腺癌を予防する方法である。いくつかのそのような方法は、1以上の阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含み、ここで、該1以上の阻害剤は、該対象の食道組織におけるISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる。いくつかのそのような方法において、食道腺癌リスク因子は、ISG15、DAD1、UBE2N、及びS100Pから選択される。いくつかのそのような方法において、食道腺癌細胞は、食道腺癌を有する対象のものである。いくつかのそのような方法において、1以上の阻害剤は、1以上の食道腺癌リスク因子の発現を低下させる。いくつかのそのような方法において、阻害剤は、RNAi剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
別の態様において、提供されるのは、食道腺癌細胞の増殖を阻害し又は減少させる方法であって、1以上の阻害剤を食道腺癌細胞に投与することを含み、ここで、該1以上の阻害剤が、ISG15、UBE2N、及びS100Pから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる、方法である。いくつかのそのような方法において、食道腺癌細胞は、食道腺癌を有する対象のものである。いくつかのそのような方法において、1以上の阻害剤は、1以上の食道腺癌リスク因子の発現を低下させる。いくつかのそのような方法において、阻害剤は、RNAi剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
別の態様において、提供されるのは、食道腺癌細胞の遊走を阻害し又は減少させる方法であって、1以上の阻害剤を食道腺癌細胞に投与することを含み、ここで、該1以上の阻害剤が、ISG15、DAD1、UBE2N、及びS100Pから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる、方法である。いくつかのそのような方法において、食道腺癌細胞は、食道腺癌を有する対象のものである。いくつかのそのような方法において、1以上の阻害剤は、1以上の食道腺癌リスク因子の発現を低下させる。いくつかのそのような方法において、阻害剤は、RNAi剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
別の態様において、提供されるのは、食道腺癌細胞の細胞傷害性に対する感受性を増大させ又は食道腺癌細胞の細胞死を誘導する方法であって、1以上の阻害剤を食道腺癌細胞に投与することを含み、ここで、該1以上の阻害剤が、ISG15、UBE2N、及びS100Pから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる、方法である。いくつかのそのような方法において、食道腺癌細胞は、食道腺癌を有する対象のものである。いくつかのそのような方法において、1以上の阻害剤は、1以上の食道腺癌リスク因子の発現を低下させる。いくつかのそのような方法において、阻害剤は、RNAi剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
(図面の簡単な説明)
本出願ファイルは、カラーで仕上げられた少なくとも1つ図面を含有する。カラー図面を有する本特許出願のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて、特許庁により提供される。
図1。マススペクトロメトリーを用いたヒトプロテオミクスの検出及び定量のためのプラットフォームを示したイメージ。最初のパネルの結果(図の最上部)に応じて、最初の結果から1～3年後に同じパネルに戻るように推奨し、これらの疾患ドライバーが安定な状態を維持しているかどうかを評価することができる。逆に、結果が疾患進行の高い又は中等度のリスクを示す場合、他の2つのパネル用いる生検の評価が推奨される。これらのパネルは、6つの増殖マーカー及び6つの細胞死マーカーを解析して、患者の食道が実際に癌のリスクに曝されていることを確認する。最後に、もう1つのパネルを、既に食道腺癌(EAC)と診断されている患者に使用して、FDAにより承認されたEACの療法の全てに対する利益又は抵抗性の増大と関連するプロテオーム発現パターンを定量することにより、第一選択療法を最適化することができる。
図2。バレット食道の進行及び食道腺癌の攻撃性における様々な遺伝子の経路及び役割を示したイメージ。UBE2N及びS100Pは、遠位食道粘膜における細胞損傷への応答時に上方調節され、腫瘍促進プロセスを引き起こす。
図3。例示的な発見LT-SWATH-MSワークフローを示したイメージ。
図4A。正常扁平上皮食道上皮、バレット食道、及び食道腺癌におけるDAD1、S100P、ISG15、及びUBE2Nの発現を示したグラフ(****P＜0.0001、***P＜0.001、**P＜0.01、*P＜0.1)。
図4B 正常扁平上皮食道上皮、バレット食道、及び食道腺癌におけるタンパク質の発現を示したヒートマップ。
図5。正常組織、BE、及びEACにおけるDAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nの免疫蛍光強度の定量を示した棒グラフ。発見マススペクトロメトリー研究で観察された発現傾向は、抗体ベースのプロテオームアッセイ(免疫蛍光)を介して観察された発現傾向と一致する。
図6。DAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nに対するsiRNAの存在下又は非存在下の食道腺癌細胞株におけるタンパク質存在量を示したウェスタンブロット。
図7。DAD1、S100P、UBE2N、及びISG15に対するsiRNAで処理された細胞におけるEAC細胞株のMTT増殖アッセイによって決定される生存率を示したグラフ。統計的有意性は、未処理細胞と比較した様々な処理群に関するものである。未処理のEAC細胞と比較した有意性(**P＜0.01、****P＜0.0001)。
図8。DAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nに対するsiRNAで処理されたEAC細胞、又は対照処理細胞を用いたスクラッチ閉塞によって測定される細胞遊走の減少を示したグラフ。
図9。DAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nを標的とするsiRNAで処理しているEAC OE-33細胞における細胞傷害性の割合を示したグラフ。
図10A。OE-33細胞におけるISG15遺伝子のノックダウンに応答した腫瘍促進遺伝子の発現の減少及び腫瘍サプレッサー遺伝子の発現の増大を示したグラフ。
図10B。OE-33細胞におけるUBE2N遺伝子のノックダウンに応答した腫瘍促進遺伝子の発現の減少及び腫瘍サプレッサー遺伝子の発現の増大を示したグラフ。
図10C。OE-33細胞におけるDAD1遺伝子のノックダウンに応答した腫瘍促進遺伝子の発現の減少及び腫瘍サプレッサー遺伝子の発現の増大を示したグラフ。
図10D。OE-33細胞におけるS100P遺伝子のノックダウンに応答した腫瘍促進遺伝子の発現の減少及び腫瘍サプレッサー遺伝子の発現の増大を示したグラフ。
図11。食道組織が、正常から前癌(バレット食道)に、前癌(バレット食道)から癌(食道腺癌)に進行するときの表示されたマーカーの増加発現を示した棒グラフ。
図12A～12B。UBE2Nペプチドを用いたヒト試料中のUBE2Nタンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトル。
図13A～13F。担体ワーキング溶液(CWS)及びパイロコッカス(pyro)を含む溶液中の組換えUBE2Nペプチドの検出、並びにホルマリン固定パラフィン包埋食道腺癌組織中のUBE2Nペプチドの検出。
図14A～14C。DAD1ペプチドを用いたヒト試料中のDAD1タンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトル。
図15A～15C。担体ワーキング溶液(CWS)及びパイロコッカス(pyro)を含む溶液中の組換えDAD1ペプチドの検出、並びにホルマリン固定パラフィン包埋食道腺癌組織中のDAD1ペプチドの検出。
図16A～16B。ISG15ペプチドを用いたヒト試料中のISG15タンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトル。
図17A～17G。担体ワーキング溶液(CWS)及びパイロコッカス(pyro)を含む溶液中の組換えISG15ペプチドの検出、並びにホルマリン固定パラフィン包埋食道腺癌組織中のISG15ペプチドの検出。
図18。CNDP2ペプチドを用いたヒト試料中のCNDP2タンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトル。
図19A～19N。担体ワーキング溶液(CWS)及びパイロコッカス(pyro)を含む溶液中の組換えCNDP2ペプチドの検出、並びにホルマリン固定パラフィン包埋食道腺癌組織中のCNDP2ペプチドの検出。
図20A～20B。GPIペプチドを用いたヒト試料中のGPIタンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトル。
図21A～21F。担体ワーキング溶液(CWS)及びパイロコッカス(pyro)を含む溶液中の組換えGPIペプチドの検出、並びにホルマリン固定パラフィン包埋食道腺癌組織中のGPIペプチドの検出。
図22A～22B。SETペプチドを用いたヒト試料中のSETタンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトル。
図23A～23B。担体ワーキング溶液(CWS)及びパイロコッカス(pyro)を含む溶液中の組換えSETペプチドの検出、並びにホルマリン固定パラフィン包埋食道腺癌組織中のSETペプチドの検出。
図24A～24C。LTFペプチドを用いたヒト試料中のLTFタンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトル。
図25A～25M。担体ワーキング溶液(CWS)及びパイロコッカス(pyro)を含む溶液中の組換えLTFペプチドの検出、並びにホルマリン固定パラフィン包埋食道腺癌組織中のLTFペプチドの検出。
図26A～26B。S100Pペプチドを用いたヒト試料中のS100Pタンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトル。
図27A～27B。担体ワーキング溶液(CWS)及びパイロコッカス(pyro)を含む溶液中の組換えS100Pペプチドの検出、並びにホルマリン固定パラフィン包埋食道腺癌組織中のS100Pペプチドの検出。
図28。例示的な標的化マススペクトロメトリーワークフローを示したイメージ。
図29A。バレット粘膜の顕微解剖。
図29B。バレット粘膜の針解剖。
図30A～30B。標的化マススペクトロメトリーによって決定された、正常扁平上皮食道上皮及び食道腺癌におけるISG15、CNDP2、DAD1、及びGPI(図30A)、並びにLTF、S100P、SET、及びUBE2N(図30B)の発現を示したグラフ。
図31A～31B。標的化マススペクトロメトリーによって決定された、食道腺癌に進行したことがない対象由来のバレット食道試料及び食道腺癌に実際に進行した対象由来のバレット食道試料におけるISG15、CNDP2、DAD1、及びGPI(図31A)、並びにLTF、S100P、SET、及びUBE2N(図31B)の発現を示したグラフ。
(定義)
本明細書で互換的に使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、コード及び非コードアミノ酸並びに化学的に又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語は、修飾されているポリマー、例えば、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドも含む。「ドメイン」という用語は、特定の機能又は構造を有するタンパク質又はポリペプチドの任意の部分を指す。
タンパク質は、「N-末端」(アミノ-末端)及び「C-末端」(カルボキシ-末端又はカルボキシル-末端)を有すると言われる。「N-末端」という用語は、遊離アミン基(-NH2)を有するアミノ酸によって終わるタンパク質又はポリペプチドの始点に関する。「C-末端」という用語は、遊離カルボキシル基(-COOH)を有するアミノ酸によって終わるアミノ酸鎖(タンパク質又はポリペプチド)の終点に関する。
本明細書で互換的に使用される「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの類似体もしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、プリン塩基、ピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、及び多本鎖DNA又はRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、及びポリマーが含まれる。
1つのモノヌクレオチドペントース環の5'ホスフェートが、ホスホジエステル結合を介して、その隣のものの3'酸素と一方向に結合するような様式で、モノヌクレオチドが反応して、オリゴヌクレオチドを生成するので、核酸は、「5'末端」及び「3'末端」を有すると言われる。オリゴヌクレオチドの末端は、その5'ホスフェートがモノヌクレオチドペントース環の3'酸素に結合していない場合、「5'末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その3'酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の5'ホスフェートに結合していない場合、「3'末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にある場合にも、5'及び3'末端を有すると言うことができる。線状DNA分子又は環状DNA分子のいずれかにおいて、個別のエレメントは、「上流」又は「下流」の5'又は3'エレメントと呼ばれる。
細胞、組織(例えば、肝臓試料)、脂肪滴、タンパク質、及び核酸に関する「単離された」という用語は、細胞、組織(例えば、肝臓試料)、脂肪滴、タンパク質、及び核酸の実質的に純粋な調製物までを含む、通常インサイチュで存在し得る他の細菌成分、ウイルス成分、細胞成分、又はその他の成分に関して比較的純化されている細胞、組織(例えば、肝臓試料)、脂肪滴、タンパク質、及び核酸を含む。「単離された」という用語は、天然に存在する対応物を有さず、化学的に合成され、したがって、他の細胞、組織(例えば、肝臓試料)、脂肪滴、タンパク質、及び核酸によって実質的に汚染されていないか、或いはそれらに天然に付随する(例えば、他の細胞タンパク質、核酸、又は細胞もしくは細胞外成分)、他のほとんどの成分(例えば、細胞成分もしくは生物成分)から分離又は純化されている、細胞、組織(例えば、肝臓試料)、脂肪滴、タンパク質、及び核酸も含む。
「野生型」という用語は、(突然変異体の、罹患した、改変されたなどとは対照的に)正常な状態又は状況で見られるような構造及び/又は活性を有する実体を含む。野生型遺伝子及びポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態(例えば、アレル)で存在する。
「内因性配列」という用語は、ラット細胞又はラットで自然に生じる核酸配列を指す。例えば、マウスの内因性Hsd17b13配列は、マウスのHsd17b13遺伝子座に自然に生じるネイティブなHsd17b13配列を指す。
「外因性」分子又は配列は、細胞内に、その形態で通常は存在しない分子又は配列を含む。通常の存在は、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関する存在を含む。外因性分子又は配列は、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなどの、細胞内の対応する内因性配列の突然変異バージョンを含むことができ、又は細胞内にあるが、異なる形態の(すなわち、染色体内にない)内因性配列に対応する配列を含むことができる。対照的に、内因性分子又は配列は、特定の環境条件下、特定の発生段階にある特定の細胞内に、その形態で通常存在する分子又は配列を含む。
核酸又はタンパク質との関連において使用される場合の「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が同じ分子内で自然には一緒に生じない少なくとも2つのセグメントを含むことを示す。例えば、核酸のセグメント又はタンパク質のセグメントとの関連において使用される場合の「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が天然では互いに同じ関係で(例えば、結合して)見出されない2以上の部分配列を含むことを示す。1つの例として、核酸ベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連して見出されない別の核酸分子内にあるか又はそれに結合している核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、天然ではコード配列と関連して見出されない配列が隣接するコード配列を含むことができる。同様に、タンパク質の「異種」領域は、天然では他のペプチド分子と関連して見出されない別のペプチド分子(例えば、融合タンパク質、もしくはタグを有するタンパク質)内にあるか又はそれに結合しているアミノ酸のセグメントである。同様に、核酸又はタンパク質は、異種標識又は異種分泌もしくは局在化配列を含むことができる。
「遺伝子」という用語は、天然に存在する場合、少なくとも1つのコード領域及び少なくとも1つの非コード領域を含有し得る染色体中のDNA配列を指す。産物(例えば、限定されないが、RNA産物及び/又はポリペプチド産物)をコードする染色体中のDNA配列は、非コードイントロンで中断されたコード領域と遺伝子が全長mRNA(5'及び3'非翻訳配列を含む)に対応するように5'末端と3'末端の両方でコード領域に隣接して位置する配列とを含むことができる。さらに、調節性配列(例えば、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、及び転写因子結合部位)、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位、サイレンサー、絶縁配列、並びにマトリックス結合領域を含む他の非コード配列が遺伝子中に存在してもよい。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接しているか(例えば、限定されないが、10kb以内)又は遠位部位にあってもよく、それらは、遺伝子の転写及び翻訳のレベル又は速度に影響を及ぼす。
「変異体」という用語は、集団内で最も一般的な配列と(例えば、1ヌクレオチドだけ)異なるヌクレオチド配列又は集団内で最も一般的な配列と(例えば、1アミノ酸だけ)異なるタンパク質配列を指す。
タンパク質に言及する場合の「断片」という用語は、全長タンパク質よりも短いか又は少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。核酸に言及する場合の「断片」という用語は、全長核酸よりも短いか又は少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。タンパク質断片は、例えば、N-末端断片(すなわち、タンパク質のC-末端の一部の除去)、C-末端断片(すなわち、タンパク質のN-末端の一部の除去)、内部断片(すなわち、タンパク質のN-末端及びC-末端の各々の一部の除去)であることができる。核酸断片は、例えば、5'断片(すなわち、核酸の3'末端の一部の除去)、3'断片(すなわち、核酸の5'末端の一部の除去)、又は内部断片(すなわち、核酸の5'末端及び3'末端の各々の一部の除去)であることができる。
「インビトロ」という用語は、人為的環境、及び人為的環境(例えば、試験管又は単離された細胞もしくは細胞株)内で起こるプロセス又は反応を含む。「インビボ」という用語は、自然環境(例えば、生物体もしくは身体又は生物体もしくは身体内の細胞もしくは組織)、及び自然環境内で起こるプロセス又は反応を含む。「エクスビボ」という用語は、個体の身体から取り出された細胞、及びそのような細胞内で起こるプロセス又は反応を含む。
1以上の列挙された要素を「含む(comprising)」又は「含む(including)」組成物又は方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む(comprising)」又は「含む(including)」組成物は、タンパク質を単独で又は他の成分と組み合わせて含有し得る。「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲の範囲が、特許請求の範囲において列挙された特定の要素及び特許請求された発明の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきであることを意味する。したがって、本発明の特許請求の範囲において使用される場合の「から本質的になる」という用語は、「含む(comprising)」と等価であると解釈されることが意図されない。
「任意の」又は「任意に」は、後に記載された事象又は状況が起こっても起こらなくてもよいということ、並びにその記載が該事象又は状況が起こる場合及び該事象又は状況が起こらない場合を含むことを意味する。
値の範囲の指定は、該範囲内の又は該範囲を定義する全ての整数、及び該範囲内の整数によって定義される全ての部分的な範囲を含む。
別途、文脈から明白でない限り、「約」という用語は、記述された値の値±5を包含する。
「及び/又は」という用語は、関連する列挙された項目のうちの1つ又は複数の任意の及び全ての可能な組合せ、並びに別の可能性(「又は」)で解釈される場合の組合せの欠如を指し、かつ包含する。
「又は」という用語は、特定のリストのいずれか1つのメンバーを指す。
文脈上、別途明確に示されない限り、単数形の冠詞「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、複数の指示対象を含む。例えば、「1つのタンパク質」又は「少なくとも1つのタンパク質」という用語は、その混合物を含む、複数のタンパク質を含むことができる。
統計的有意は、p≦0.05を意味する。
(詳細な説明)
(I.概要)
以下のマーカー遺伝子/タンパク質: ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの1つ又は複数を用いて、対象における食道腺癌を発症するリスクを評価する方法が提供される。対象における1以上の食道腺癌リスク因子の発現を決定する方法も提供される。対象の食道腺癌を治療するか、対象の食道腺癌を予防するか、食道腺癌細胞の増殖を阻害しもしくは減少させるか、食道腺癌細胞の遊走を阻害しもしくは減少させるか、又は食道腺癌細胞の細胞傷害性に対する感受性を増大させもしくは食道腺癌細胞の細胞死を誘導する方法も提供される。
食道腺癌を発症するリスクを評価するか、又は対象における1以上の食道腺癌リスク因子の発現を決定する方法は、バレット食道から食道腺癌への進行についての新たに同定されたマーカーに基づく。これらのマーカーとしては、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIが挙げられる。
1つには、不十分なスクリーニングが原因で、30分毎に、米国人が食道癌で死亡している。これらの疾患の予後に関する現在の病理学標準は、食道生検の肉眼及び顕微鏡検査である。バレット食道と診断された患者は、遠位食道の異形成の重症度に応じて、3カ月毎から3年毎の範囲で定期的な内視鏡評価を受ける。これらの診察時に、食道が治療を施す消化器(GI)内科医によって肉眼で観察され、この処置時に回収された生検が病理学者によって染色され、細胞構造、構成、及び分化のような特徴が記入されて、GI内科医に報告し直される。この前悪性状態の現在の標準的なスクリーニングプロトコルでは、あるとしても、ごくわずかな分子情報しか評価されない。本明細書に開示される方法は、これらの処置時に採取される少量の残りの生検組織を用いて、確固とした分子情報を提供し、標準的なスクリーニングワークフロー及び臨床組織病理学検査を中断することなく、バレット食道における疾患ドライバーの存在に関するより多くの情報を円滑に提供することができる。本明細書に開示される方法は、細胞増殖、浸潤、遊走、及び細胞生存の増大をもたらす発癌性プロテオーム環境を明らかにする新規バイオマーカーの発現傾向を解明することができる。パネル中のバイオマーカーの存在及び活性は、医師にカラフルな写真を提供し、自分の患者の組織が正常に機能しているか又は従来の診断手法では検出されないこともある発病の分子特徴を示し始めているかを示すことができる。本明細書に開示される方法は、いくつかの例では、マススペクトロメトリーを用いて、ハイスループットで、多重化可能で、かつ確信できるデータをもたらすことができる。マススペクトロメトリーは、物理法則(各々のペプチドの質量及び電荷)を同時に用いて、目的の全てのマーカーを同時に定量して、全てのバイオマーカーの極めて正確でかつ精緻な定量をもたらし、それにより、必要とされる組織の量が低下し、迅速な所要時間が可能になる。それゆえ、マススペクトロメトリーの独自の長所によって、現在の標準治療に関して問題となる、非特異的結合、主観的解釈、及び過染色のような標準的な抗体ベースの診断の制限を回避するためのプラットフォームが可能になる。マススペクトロメトリーベースの診断は、現在、内視鏡検査及び標準的な組織病理学検査によって検出できない悪性形質転換と関連するプロテオームシグナチャーの前癌状態をモニタリングするためには使用されていない。本明細書に開示される方法で使用されるマーカーは、バレット食道から食道腺癌への発症において役割を果たすことが発見されていない。精度の高い定量を保証するために、マススペクトロメトリーを使用したとき、本発明者らは、本発明者らの目的のバイオマーカータンパク質中に独自に存在し、かつマススペクトロメトリーで良好に機能するものとして確認されるペプチドを発見した。既知の量のこれらの合成されたマーカーをスパイクインし、本発明者らのパネル中のバイオマーカータンパク質を代表するものにすることができる。マーカーペプチドを容易に検出することができるように、それらを同位体標識することができ、スパイクインされたタンパク質の量を内因性シグナルから差し引き、標的化マススペクトロメトリーによって、全てのバイオマーカーの極めて正確でかつ精緻な定量を同時にもたらすことができる。
この方法を用いて、主観的解釈及び偽陽性のない正確な結果をごくわずかの新鮮な又は固定された組織片から適時に送達することが可能になる。これらの検査は、わずか8mm2の組織しか必要とせず、臨床生検回収から1～2週間以内に、結果を発注者に送達することができる。標的化マススペクトロメトリープロテオミクスを用いて、医師は、治療計画の初期に、胃食道逆流症(GERD)、バレット食道、及び食道癌の発症において役割を果たす発現パターンについて知らされることができる。
(II.対象における食道腺癌リスク因子の発現を決定する方法及び対象における食道腺癌を発症するリスクを評価する方法)
対象における食道腺癌を発症するリスクを評価する方法が提供される。対象における1以上のマーカー遺伝子(すなわち、食道腺癌リスク因子)の発現を決定する方法も提供される。そのような方法は、対象由来の検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することを含むことができる。そのような方法は、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを対照食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルと比較することをさらに含むことができ、ここで、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも1つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。リスクの増大は、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子のうちの少なくとも1つの発現の増大がなかった場合よりも、対象が食道腺癌を発症する可能性が高いことを意味する。いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数の大半の発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも2つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも3つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも4つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも5つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも6つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも7つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも8つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数の各々の発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。
いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中の発現の増大は、統計的に有意である。いくつかの方法において、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中の発現の増大は、少なくとも約1.1倍、少なくとも約1.2倍、少なくとも約1.3倍、少なくとも約1.4倍、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、又は少なくとも約10倍(例えば、少なくとも1.1倍、少なくとも1.2倍、少なくとも1.3倍、少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、又は少なくとも10倍)である。
マーカー遺伝子は、例えば、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの1つ又は複数を含むことができる。本方法は、例えば、対象から得られた検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを測定すること(すなわち、発現レベルを測定するためのアッセイを実施すること)を含むことができ、ここで、該1以上のマーカー遺伝子(食道腺癌リスク因子)は、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの1つもしくは複数を含むか、又は本明細書に記載されるマーカー遺伝子の任意の他の組合せのうちの1つもしくは複数を含む。
いくつかの方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの1つもしくは複数又は本明細書に記載されるマーカー遺伝子の任意の他の組合せのうちの1つもしくは複数の発現レベルを決定することを含む。いくつかの方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの2つ以上、又は本明細書に記載されるマーカー遺伝子の任意の他の組合せのうちの2つ以上(例えば、ISG15、LTF、及びDAD1のうちの2つ以上、又はISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIのうちの2つ以上)の発現レベルを決定することを含む。いくつかの方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの3つ以上、又は本明細書に記載されるマーカー遺伝子の任意の他の組合せのうちの3つ以上(例えば、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIのうちの3つ以上)の発現レベルを決定することを含む。いくつかの方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの4つ以上、又は本明細書に記載されるマーカー遺伝子の任意の他の組合せのうちの4つ以上(例えば、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIのうちの4つ以上)の発現レベルを決定することを含む。いくつかの方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの5つ以上、又は本明細書に記載されるマーカー遺伝子の任意の他の組合せのうちの5つ以上(例えば、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIのうちの5つ以上)の発現レベルを決定することを含む。いくつかの方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの6つ以上、又は本明細書に記載されるマーカー遺伝子の任意の他の組合せのうちの6つ以上の発現レベルを決定することを含む。いくつかの方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの7つ以上、又は本明細書に記載されるマーカー遺伝子の任意の他の組合せのうちの7つ以上の発現レベルを決定することを含む。いくつかの方法において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIの各々の発現レベルを決定することを含む。
1以上のマーカー遺伝子は、例えば、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPI、並びにこれらの任意の組合せからなる群から選択されることができる。いくつかの方法において、1つ又はマーカー遺伝子は、UBE2Nを含む。いくつかの方法において、1つ又はマーカー遺伝子は、DAD1を含む。いくつかの方法において、1つ又はマーカー遺伝子は、ISG15を含む。いくつかの方法において、1つ又はマーカー遺伝子は、CNDP2を含む。いくつかの方法において、1つ又はマーカー遺伝子は、GPIを含む。いくつかの方法において、1つ又はマーカー遺伝子は、SETを含む。いくつかの方法において、1つ又はマーカー遺伝子は、LTFを含む。いくつかの方法において、1つ又はマーカー遺伝子は、S100Pを含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15及びLTFを含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15及びDAD1を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、LTF及びDAD1を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、及びDAD1を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15及びCNDP2を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、LTF及びCNDP2を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、及びCNDP2を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、及びCNDP2を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、及びSETを含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、及びGPIを含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、及びSETを含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、及びGPIを含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、SET、及びGPIを含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIを含む。
いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、DAD1、UBE2N、S100P、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。1つの例において、マーカー遺伝子は、ISG15及びLTFを含む。別の例において、マーカー遺伝子は、ISG15及びDAD1を含む。別の例において、マーカー遺伝子は、LTF及びDAD1を含む。別の例において、マーカー遺伝子は、ISG15、LTF、及びDAD1を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
或いは、マーカー遺伝子は、CNDP2、SET、GPI、及びこれらの任意の組合せのうちの1つ又は複数を含むことができる。或いは、マーカー遺伝子は、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、GPI、及びこれらの任意の組合せのうちの1つ又は複数を含むことができる。或いは、マーカー遺伝子は、UBE2N、S100P、及びこれらの任意の組合せのうちの1つ又は複数を含むことができる。或いは、マーカー遺伝子は、ISG15、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、GPI、及びこれらの任意の組合せのうちの1つ又は複数を含むことができる。
ISG15(UniProt Ref. P05161、インターフェロン刺激遺伝子15又はユビキチン様タンパク質ISG15としても知られる)は、自然免疫応答において重要な役割を果たすユビキチン様タンパク質である。
LTF(UniProt Ref. P02788、ラクトトランスフェリンとしても知られる)は、母乳及び粘膜分泌物などの外分泌液中に見られる主要な鉄結合性かつ多機能性タンパク質であり、かつ抗微生物活性を保有する。LTFは、Cアデノウイルスという種の上皮細胞への結合を促進し、アデノウイルス感染を促進する。LTFは、TLR4シグナル伝達経路を刺激し、NF-κ-B活性化及びその後の炎症促進性サイトカイン産生をもたらすと同時に、リポ多糖(LPS)刺激性TLR4シグナル伝達も妨害する。LTFは、アポトーシス細胞によって分泌されたとき、アポトーシスの部位への好中球顆粒球遊走を阻害し、VEGF媒介性内皮細胞遊走及び増殖を刺激する。
CNDP2(UniProt Ref. Q96KP4、細胞質ゾル性非特異的ジペプチダーゼとしても知られる)は、種々のジペプチド、優先的には、プロリルアミノ酸を含む疎水性ジペプチドを加水分解する。CNDP2は、逆タンパク質分解による乳酸塩及びアミノ酸からのN-ラクトイル-アミノ酸の生成を触媒する。CNDP2のレベルの上昇は、p38及びJNK/MAPK経路を活性化して、細胞アポトーシスを誘導し、CNDP2のレベルの低下は、ERK MAPK経路を活性化して、細胞増殖を促進する。
DAD1(UniProt Ref. P61803、細胞死からの防御因子又はドリチル-ジホスホオリゴ糖--タンパク質グリコシルトランスフェラーゼサブユニットDAD1としても知られる)は、効率的なグリコシル化に必要とされる酵素である。
SET核癌原遺伝子(UniProt Ref. Q01105、タンパク質SETとしても知られる)は、転写されて、アポトーシス、転写、ヌクレオソーム会合、及びヒストンシャペロニングに関与するマルチタスクタンパク質になる。
UBE2N(UniProt Ref. P61088、ユビキチン結合酵素E2 Nとしても知られる)は、乳癌、膵臓癌、結腸癌、前立腺癌、及び卵巣癌で過剰発現されることが分かっている。UBE2Nの過剰発現は、乳癌の肺への転移に必要とされることが分かっている。このマーカーの阻害は、神経芽腫で細胞死を引き起こした。UBE2Nは、NFkβ炎症活性化という発癌と関連する機構にとって極めて重要であるユビキチン鎖を特異的に構築する。UBE2N阻害は、自然免疫シグナル伝達、細胞生存、RNAスプライシング、及びDNA損傷応答に関与する～140個のタンパク質のユビキチン化を特異的に変化させ、それが、それぞれ、遙か上流でその機能を果たすことを示している。
S100P(UniProt Ref. P25815、タンパク質S100-Pとしても知られる)は、幅広い細胞の細胞質及び/又は核に局在し、細胞周期進行及び分化などの、いくつかの細胞プロセスの調節に関与する。S100Pは、RAGEに結合し、それを活性化することにより、その機能を果たし、おそらくは、細胞分裂機構に、多くの固形腫瘍でしばしば上方調節される古典的なチロシンキナーゼ/KRAS増殖経路を迂回させる。
GPI(UniProt Ref. P06744、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼとしても知られる)は、解糖の第二段階であるグルコース-6-ホスフェートからフルクトース-6-ホスフェートへの変換、及び糖新生時の逆反応を触媒する。これは、ワールブルグ効果を伴う経路－癌細胞が解糖経由で高率にエネルギーを産生するよく記載されている手段と関連する主要な解糖系酵素である。
記載されている方法における対象は、例えば、健康な対象、食道腺癌を発症する既知の家族性リスクを有する対象、食道腺癌を発症する1以上の既知のリスク因子を有する対象、又は食道腺癌への前駆状態を有する対象であることができる。年齢(年齢が高くなるにつれて、リスクが増大する)、性別(男性は女性よりも食道腺癌を発症する可能性が高い)、肥満、遺伝的リスク因子、又は胃食道逆流症(GERD)もしくはバレット食道を有することなどの様々な因子は、人が食道腺癌を発症するリスクを高め得る。例えば、対象は、GERD又はバレット食道を有し得る。特定の例において、対象は、バレット食道を有し得る。食道腺癌は、GERDを有する人で起こることが最も多い。GERDは、組織病理学検査によって、及び時には、上部内視鏡検査(噴門括約筋の拡張及び炎症)によって、正常粘膜と区別することができる。GERDの最も一般的な症状は、胸焼けであり、これは、米国の成人の20パーセントが週に少なくとも2回経験する状態である。これらの個体は食道癌を発症するリスクが高いが、彼らの大部分は、それを一度も発症することがない。しかしながら、GERDを有する患者の約10～15％において、食道内層の変化であるバレット食道と呼ばれる状態が生じる。食道の腺癌のほとんどの症例は、バレット組織で始まる。バレット食道は、食道内層が変化して、腸を裏打ちする組織に似てくる状態である。バレット食道は、米国消化器病学会(American College of Gastroenterology)ガイドラインに従って、管状食道内のサーモン色の粘膜の部分における腸化生と定義される。GERDの合併症であるバレット食道は、若い頃に初めてGERDを経験したか又は長期にわたって症状を有しているかのいずれかの患者で起こる可能性がより高い。GERDの頻度及び又は重症度は、バレット食道が形成され得る可能性に影響を及ぼさない。食道腺癌のリスクはバレット食道を有する人でより高いが、バレット食道を有するほとんどの患者は、癌を発症しない。しかしながら、何人かの患者において、異形成と呼ばれる組織の前癌性変化が生じる。その前癌性変化は、食道癌に発展する可能性がより高い。バレット組織は、内視鏡検査時に目に見えるが、内視鏡的な外観のみによる診断は十分ではない。バレット食道の確定診断は、生検確認を必要とする。バレット食道を有する患者における食道癌のリスクは、かなり低く、年間約0.5パーセント(又は200人のうち1人)である。バレット食道の診断が定期的内視鏡検査の理由である。初回生検が異形成を示さない場合、生検を伴う内視鏡検査を約3年毎に反復するべきである。本明細書に開示される方法のうちのいくつかにおいて、対象は、バレット食道を有しており、該方法は、バレット食道から食道腺癌に進行するリスクを評価する。
本方法における対象は、例えば、哺乳動物、例えば、非ヒト哺乳動物又はヒトであることができる。いくつかの方法において、哺乳動物は、齧歯類、例えば、ラット又はマウスである。いくつかの方法において、対象は、ヒト、例えば、バレット食道を有するヒトである。
本方法における検査用食道組織試料は、対象から単離された食道組織試料(すなわち、単離された食道組織試料)であることができる。単離された食道組織試料は、生検試料、例えば、食道胃十二指腸内視鏡検査生検試料又は食道切除試料であることができる。対象がバレット食道を有する場合、検査用食道組織試料は、検査用バレット食道組織試料(すなわち、病理組織)であることができる。単離された試料は、任意の形態のものであることができる。例えば、それは、新鮮な食道組織試料、凍結された食道組織試料、保存された食道試料、ホルマリン固定食道試料、又はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)食道試料であることができる。
特定の例において、単離された食道組織試料は、FFPE試料である。入手可能な癌組織標本の大部分は、長期保存用にホルマリンで固定され、パラフィン中に包埋される。
単離された食道組織試料は、粘膜試料(例えば、バレット食道粘膜試料)であることができる。食道の内層は、粘膜として知られる。正常食道の粘膜は、皮膚又は口腔のものと同様の扁平上皮細胞(扁平上皮粘膜)から構成される。食道の大部分は、扁平上皮粘膜によって裏打ちされている。杯細胞は、通常、食道ではなく、腸を裏打ちしている。杯細胞が、食道の内層のような、それが存在することになっていない場所に見出される場合、腸化生と呼ばれる。腸化生は、扁平上皮粘膜が通常見出される任意の場所に生じることができる。腸化生が食道の扁平上皮粘膜に置き換わる場合、それは、バレット食道と呼ばれる。本方法における単離された食道組織試料(例えば、FFPE試料)は、例えば、非粘膜組織から(例えば、顕微解剖によって)分離されている粘膜試料(例えば、バレット食道粘膜試料又はFFPEバレット食道粘膜試料)であることができる。具体的な例において、単離された食道組織試料は、間質、微細構造細胞(例えば、コラーゲン、エラスチン、及びフィブリン)、血管細胞、並びに免疫細胞などの非粘膜組織から分離されているFFPE粘膜試料(例えば、FFPEバレット食道粘膜試料)である。
さらに、生検(例えば、ピンチ生検)及び食道切除標本は、正常扁平上皮食道上皮を含有することもできる。正常組織は、隣接する疾患組織における発現パターンの定量を妨害することがあるので、バレット食道組織を評価する場合、正常組織の周囲を顕微解剖することが有益であり得る。組織病理学検査及び全ゲノムシークエンシングのような現在のバレット食道の診断方法は、疾患細胞、正常細胞、及び構造細胞を含む、標本全体を評価する。したがって、本方法における単離された食道組織試料(例えば、FFPE試料)は、例えば、隣接する正常組織(例えば、隣接する正常扁平上皮食道上皮)から分離されているバレット食道粘膜試料であることができる。同様に、本方法における単離された食道組織試料(例えば、FFPE試料)は、例えば、隣接する正常組織(例えば、隣接する正常扁平上皮食道上皮)から分離されている、並びに/又は間質、微細構造細胞(例えば、コラーゲン、エラスチン、及びフィブリン)、血管細胞、並びに免疫細胞などの非粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料であることができる。具体的な例において、本方法における単離された食道組織試料(例えば、FFPE試料)は、正常組織から及び非粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料である。
単離された食道組織試料は、解剖(例えば、レーザー顕微解剖又は針解剖)することもできる。すなわち、粘膜(例えば、扁平上皮粘膜)、バレット食道粘膜、又は食道腺癌を、目的としない細胞を避けながら、プロテオーム解析用の単離された食道組織試料から取り除くことができる。顕微解剖は、顕微鏡を用いて、正常な又は構造的な微小環境からの疾患組織の分離を助ける種々の技法を指す。利用可能なソフトウェア(例えば、Histokat Fusion又はMMI CellCut)を用いて、単離された食道組織試料(例えば、FFPE試料、又はスライド)中の目的の細胞の輪郭を描くことができ、試料(例えば、スライド)をひっくり返すことができ、レーザーは、目的の細胞を剥がして、試料調製及び解析用のチューブに入れることができる。針解剖は、ゲージの小さい針を用いた、目的としない細胞からの目的の組織の分離を指す。例えば、単離された食道組織試料は、解剖もしくは顕微解剖された粘膜試料(解剖もしくは顕微解剖された扁平上皮粘膜試料)、解剖もしくは顕微解剖されたバレット食道粘膜試料(例えば、解剖もしくは顕微解剖されたバレット食道粘膜試料)、又は解剖もしくは顕微解剖された食道腺癌細胞であることができる。
本方法は、1つ又はマーカー遺伝子の発現レベルを決定する前に、検査用食道組織試料(例えば、検査用バレット食道組織試料)から粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織から分離されている検査用食道粘膜試料(例えば、検査用バレット食道粘膜試料)を産生する工程をさらに含むことができる。その後、1以上のマーカー遺伝子の発現レベルは、検査用食道粘膜試料中で決定される。例えば、粘膜組織(例えば、バレット食道粘膜組織)を選択的に単離する工程は、顕微解剖、例えば、レーザー顕微解剖を含むことができる。例えば、試料(例えば、FFPE試料、又はスライド)中の目的の粘膜細胞又はバレット食道粘膜細胞は、(例えば、目的の細胞の輪郭を描いた後に)レーザーを用いて、試料の残りから分離することができる。或いは、粘膜組織(例えば、バレット食道粘膜組織)を選択的に単離する工程は、針解剖を含むことができる。例えば、試料(例えば、FFPE試料、又はスライド)中の目的の粘膜細胞又はバレット食道粘膜細胞は、針(例えば、ゲージの小さい針)を用いて、試料の残りから分離することができる。具体的な例において、粘膜組織又はバレット食道粘膜組織の選択的単離に使用される検査用食道試料は、FFPE試料である。
同様に、本方法は、1つ又はマーカー遺伝子の発現レベルを決定する前に、隣接する正常組織(例えば、隣接する正常扁平上皮食道上皮)からバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、正常組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生する工程をさらに含むことができる。その後、1以上のマーカー遺伝子の発現レベルは、検査用バレット食道粘膜試料中で決定することができる。例えば、バレット食道粘膜組織を選択的に単離する工程は、顕微解剖、例えば、レーザー顕微解剖を含むことができる。或いは、それは、針解剖を含むことができる。具体的な例において、バレット食道粘膜組織の選択的単離に使用される検査用食道試料は、FFPE試料である。例えば、試料(例えば、FFPE試料、又はスライド)中の目的の粘膜細胞又はバレット食道粘膜細胞は、(例えば、目的の細胞の輪郭を描いた後に)レーザーを用いて、試料の残りから分離することができる。或いは、粘膜組織(例えば、バレット食道粘膜組織)を選択的に単離する工程は、針解剖を含むことができる。例えば、試料(例えば、FFPE試料、又はスライド)中の目的の粘膜細胞又はバレット食道粘膜細胞は、針(例えば、ゲージの小さい針)を用いて、試料の残りから分離することができる。具体的な例において、粘膜組織又はバレット食道粘膜組織の選択的単離に使用される検査用食道試料は、FFPE試料である。
同様に、本方法は、1つ又はマーカー遺伝子の発現レベルを決定する前に、検査用食道組織試料(例えば、検査用バレット食道組織試料)から粘膜組織を選択的に単離し、かつ隣接する正常組織(例えば、隣接する正常扁平上皮食道上皮)からバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織及び正常組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生する工程をさらに含むことができる。その後、1以上のマーカー遺伝子の発現レベルは、検査用バレット食道粘膜試料中で決定することができる。例えば、バレット食道粘膜組織を選択的に単離する工程は、顕微解剖、例えば、レーザー顕微解剖を含むことができる。或いは、それは、針解剖を含むことができる。具体的な例において、バレット食道粘膜組織の選択的単離に使用される検査用食道試料は、FFPE試料である。例えば、試料(例えば、FFPE試料、又はスライド)中の目的の粘膜細胞又はバレット食道粘膜細胞は、(例えば、目的の細胞の輪郭を描いた後に)レーザーを用いて、試料の残りから分離することができる。或いは、粘膜組織(例えば、バレット食道粘膜組織)を選択的に単離する工程は、針解剖を含むことができる。例えば、試料(例えば、FFPE試料、又はスライド)中の目的の粘膜細胞又はバレット食道粘膜細胞は、針(例えば、ゲージの小さい針)を用いて、試料の残りから分離することができる。具体的な例において、粘膜組織又はバレット食道粘膜組織の選択的単離に使用される検査用食道試料は、FFPE試料である。
対照食道組織試料は、正常(非癌性、非バレット)食道組織(例えば、正常食道扁平上皮)を含むことができる。例えば、対照食道組織試料は、正常食道粘膜(例えば、扁平上皮)を含むことができる。いくつかの方法において、対照食道組織試料は、対象由来のものである。例えば、正常食道粘膜を近位切除マージンから採取して、付随する病理プロセスから遠く離れている組織として選択することができる。他の方法において、対照食道組織試料は、バレット食道も食道腺癌も有さない、又はGERDもバレット食道も食道腺癌も有さない対照対象由来のものであることができる。いくつかの方法は、対照食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定する工程を含むこともできる。
検査用食道試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、検査用食道試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現を測定すること(すなわち、該発現を測定するためのアッセイを実施すること)を含むことができる。例えば、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、1以上のマーカー遺伝子によってコードされるメッセンジャーRNA(mRNA)の発現を測定すること(すなわち、該発現を測定するためのアッセイを実施すること)を含むことができ、かつ/又は1以上のマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を測定すること(すなわち、該発現を測定するためのアッセイを実施すること)を含むことができる。1つの例において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、1以上のマーカー遺伝子によってコードされるメッセンジャーRNA(mRNA)の発現を測定すること(すなわち、該発現を測定するためのアッセイを実施すること)を含むことができる。例えば、mRNAレベルは、任意の公知の方法、例えば、PCR、RT-PCR、定量的RT-PCR、等温核酸定量、又は次世代シークエンシング(NGS)によって決定又は測定することができる。別の例において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することは、1以上のマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を測定すること(すなわち、該発現を測定するためのアッセイを実施すること)を含むことができる。例えば、タンパク質レベルは、任意の公知の方法、例えば、マススペクトロメトリー、免疫組織化学、免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、alphaLISA、又は酵素結合免疫吸収スポット(ELISpot)アッセイによって決定又は測定することができる。
具体的な例において、検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子(すなわち、バイオマーカー)の発現レベルを決定することは、マススペクトロメトリーを用いて、1以上のマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を測定することを含む。マススペクトロメトリーは、ハイスループットでかつ多重化可能であり、複数の疾患特異的バイオマーカーを同時に評価する。
マススペクトロメトリーを用いて、1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定する場合、検査用食道組織試料を(例えば、検査用食道組織試料から粘膜組織又はバレット食道粘膜を選択的に単離した後に)、1以上のプロテイナーゼで消化することができ、その後、消化された試料(すなわち、消化されたペプチド)をマススペクトロメトリーによって解析することができる。プロテイナーゼは、トリプシン、キモトリプシン、LysC、LysN、AspN、GluC、又はArgCなどの、マススペクトロメトリー用の任意の好適なプロテイナーゼであることができる。特定の例において、プロテイナーゼは、ペプチド鎖を、主に、リジン及びアルギニンのカルボキシル側で切断するが、プロリンの前では切断しないセリンプロテアーゼである、トリプシンであることができる。別の例において、検査用食道試料を、トリプシン、次いで、キモトリプシン、LysC、LysN、AspN、GluC、又はArgCのうちのいずれか1つで順次消化することができる。
検査用食道組織試料がホルマリン固定されたもの(例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織)である場合、1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを測定する前に、試料を処理して、ホルマリン架橋を無効にすることもできる。具体的な例において、これは、1以上のプロテイナーゼで消化する前に行われる。これまで、ホルマリン固定組織は、典型的には、マススペクトロメトリープラットフォームと不適合であった。臨床的には、マススペクトロメトリープラットフォームは、通常、血清及び新鮮な又は凍結された組織標本をプロテオーム調査に使用する。ホルマリン架橋組織試料は、マススペクトロメトリーに適合するライセートへと完全には消化されず、そのため、高価な機械を故障させるリスクが増大することが分かっている。しかしながら、本明細書に開示される方法の一部は、新しい及び古いホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料におけるタンパク質発現の解析を可能にする。本明細書に開示されるそのような方法は、FFPE組織を完全に消化して、小さい、マススペクトロメトリーに適したペプチドにすることができる。マススペクトロメトリーは、検出されているマーカータンパク質にのみ存在する巨大タンパク質内の小さいユニークな識別ペプチドを測定することができるので、この方法は、外科手術後の不十分な組織固定の効果を失わせることができる。それゆえ、不適切な固定によるタンパク質分解又は破壊は、結果に関係がない。このプロセスは、約24時間かかることがあり、FFPE組織のホルマリン架橋を完全に無効にする一方、抗体認識のためのタンパク質エピトープ完全性の必要性を排除する。得られる液体生検は、将来の実験のために、無期限に保存することもできる。本明細書に開示されるそのような方法は、同一の新鮮な又は凍結された標本から回収されたタンパク質を適度に代表するものを生じるFFPE組織由来のペプチドを回収することを可能にする。
具体的な例において、FFPE組織を(例えば、洗剤を含まないバッファー中で)加熱し、その後、得られる試料をプロテイナーゼ(例えば、トリプシン)で処理する。加熱は、ホルマリン架橋を無効にする(例えば、固定によって生じた塊になったタンパク質を解く)ことができる。プロテイナーゼ処理は、巨大タンパク質を切断して、マススペクトロメトリーに適合する小さいペプチドにする。組織を、例えば、約90℃～約100℃に、又は約95℃に加熱することができる。加熱は、例えば、約60～約120分間、約70～約110分間、約80～約100分間、又は約90分間であることができる。具体的な例において、FFPE組織を、洗剤を含まないバッファー中で、約95℃まで(例えば、95℃まで)、約90分間(例えば、90分間)加熱して、ホルマリン架橋を無効にする。その後、プロテイナーゼ(例えば、トリプシン)を添加して、巨大タンパク質を切断し、マススペクトロメトリーに適合するより小さいペプチドにすることができる。プロテイナーゼ(例えば、トリプシン)を、例えば、約35℃～約40℃、又は約37℃で添加することができる。プロテイナーゼ(例えば、トリプシン)を、例えば、約14～約20時間、約15～約19時間、又は約16～約18時間添加することができる。具体的な例において、トリプシンを、約37℃(例えば、37℃)で約16～約18時間(例えば、16～18時間)添加して、巨大タンパク質を切断し、マススペクトロメトリーに適合するより小さいペプチドにすることができる。その後、各々の試料中のタンパク質の量を(例えば、BCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイによるか又はNanoDropハードウェア/ソフトウェアによって)定量することができる。その後、最後に、試料を(例えば、10％DTT(ジチオトレイトール)で)還元することができる。その後、選択された量の試料(例えば、約0.5μg～約1.5μg、約0.7μg～約1.3μg、約0.8μg～約1.2μg、約0.9μg～約1.1μg、又は約1μgの試料)をマススペクトロメトリー解析に使用することができる。
より具体的な例において、マススペクトロメトリーは、標的化マススペクトロメトリーであることができる。典型的な発見ベースのマススペクトロメトリー実験において、ペプチドイオンを、フラグメンテーション用に、そのシグナル強度に基づいて、マススペクトロメーターで自動的に選択する。フラグメンテーションは、各々のペプチド配列についての豊富ではあるが、複雑なタンデム質量スペクトルを生成させる。実験的スペクトルをライブラリースペクトルにマッチさせて、ペプチド配列、及び拡大解釈により、タンパク質を推測する－精緻なバイオインフォマティクスツール及び結果の慎重な精査を伴うプロセス。標的化ワークフローにおいて、マススペクトロメーターを、目的のタンパク質に由来する特異的ペプチドイオンを検出するようにプログラミングする。例えば、精度の高い定量を保証するために、1以上のマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質に特有の既知量の特異的ペプチドをスパイクインすることができる。ペプチドを容易に検出することができるように、それを同位体標識することができる。スパイクインされたタンパク質の量をシグナルから差し引き、全てのマーカーの正確でかつ精緻な定量を同時にもたらすことができる。
いくつかの方法において、トリプル四重極マススペクトロメーター(QQQ)が使用される。トリプル四重極マススペクトロメーター(QQQ)は、予め決められた質量の分子イオンが装置内でのフラグメンテーション用に選択されるのを可能にする二重質量フィルターとして動作する。標的化プロテオーム解析において、ペプチドイオンは、第一のQQQ質量フィルター内に移動し、このフィルターは、フラグメンテーション用に、そのm/z比に基づいて、特異的プリカーサーイオンを選択するようにプログラミングすることができる。第二の質量フィルターにおいて、標的プロダクトイオンが選択され、その後、定量用の検出器に誘導され、各々のプリカーサーイオン-プロダクトイオン対についてのシグナル強度対保持時間のトレースが得られる。このプロセスは、選択反応モニタリング(SRM)又は多重反応モニタリング(MRM)と呼ばれる。
SRMアッセイは、ペプチド断片座標のシグナチャーセットを定義することにより作製することができる。検出可能なプリカーサーイオン-プロダクトイオン対はトランジションと呼ばれ、いくつかの好適なトランジションは、標的ペプチド、及び拡大解釈により、標的タンパク質の検出及び定量のためのSRMアッセイを構成する。試料に重同位体標識参照ペプチドをスパイクすることにより、標的ペプチドの絶対定量を達成することが可能である。SRM法は、例えば、約50～約100個のタンパク質を同時に解析することができる。他のマススペクトロメトリーアッセイを使用することもできる。SWATHと呼ばれる手法を用いて、データ非依存型取得(ペプチドは、シグナル強度に関係なく、フラグメンテーション用に選択される)によって生成された複雑な質量スペクトルは、認定されたペプチド断片スペクトルのライブラリーを用いて、特異的ペプチドの存在について照会することができる。並列反応モニタリングと呼ばれる別の手法を用いて、全てのトランジションを単一の解析で並列してモニタリングすることができる。
全てのペプチドがマススペクトロメトリーによって同等に解析されるわけではない。その物理化学的性質のために、あるものは、他のものよりも良好に分離され、イオン化され、かつ検出される。ペプチド配列(プロテオティピックペプチド)はまた、それが標的化タンパク質のうちの1つを一意的に表すことを保証するために、慎重に選ばれなければならない。ひとたびプロテオティピックペプチドが選ばれれば、最適なSRMトランジションが決定され、かつ綿密に検証されなければならない。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はUBE2Nを含み、UBE2Nの発現レベルを決定することは、配列番号1又は5に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はUBE2Nを含み、かつUBE2Nの発現レベルを決定することは、配列番号1、5、又は6に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はDAD1を含み、かつDAD1の発現レベルを決定することは、配列番号7又は9に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はISG15を含み、かつISG15の発現レベルを決定することは、配列番号11又は12に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はCNDP2を含み、かつCNDP2の発現レベルを決定することは、配列番号20又は31に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はCNDP2を含み、かつCNDP2の発現レベルを決定することは、配列番号18、19、20、24、26、28、29、31、32、又は33に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はGPIを含み、かつGPIの発現レベルを決定することは、配列番号35又は39に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はGPIを含み、かつGPIの発現レベルを決定することは、配列番号35、39、40、42、43、又は44に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はSETを含み、かつSETの発現レベルを決定することは、配列番号50に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はLTFを含み、かつLTFの発現レベルを決定することは、配列番号54又は58に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はLTFを含み、かつLTFの発現レベルを決定することは、配列番号52、53、54、57、58、59、60、62、63、又は66に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。いくつかの方法において、1以上のマーカー遺伝子はS100Pを含み、かつS100Pの発現レベルを決定することは、配列番号67又は68に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリー(すなわち、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施すること)を含む。
また本明細書に提供されるのは、例えば、標的化マススペクトロメトリーで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための上で開示されているペプチド(例えば、単離されたペプチド)のいずれかである。例えば、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、本明細書の別所でより詳細に開示されている対象由来の検査用食道組織試料)におけるその発現を決定するために、標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための上で開示されているペプチド(例えば、単離されたペプチド)のいずれかである。1つの例において、配列番号1、5、6、7、9、11、12、18、19、20、24、26、28、29、31、32、33、35、39、40、42、43、44、50、52、53、54、57、58、59、60、62、63、66、67、及び68のいずれか1つに示される配列を含む単離されたペプチドを含む組成物が提供される。1つの例において、配列番号1、5、7、9、11、12、20、31、35、39、50、54、58、67、及び68のいずれか1つに示される配列を含む単離されたペプチドを含む組成物が提供される。そのようなペプチドは単離されたペプチドであることができ、かつ重同位体で標識されることができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるUBE2Nの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号1又は5に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるUBE2Nの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号1、5、又は6に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるDAD1の発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号7又は9に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるISG15の発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号11又は12に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるCNDP2の発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号18、19、20、24、26、28、29、31、32、又は33に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるCNDP2の発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号20又は31に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるGPIの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号35、39、40、42、43、又は44に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるGPIの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号35又は39に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるSETの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号50に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるLTFの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号52、53、54、57、58、59、60、62、63、又は66に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるLTFの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号54又は58に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
1つの例において、本明細書に提供されるのは、検査用試料(例えば、対象由来の検査用食道組織試料)におけるS100Pの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで(例えば、重同位体標識参照ペプチドとして)使用するための配列番号67又は68に示される配列を含む単離されたペプチドである。例えば、単離されたペプチドは、重同位体で標識することができる。
マススペクトロメトリーは、バレット食道の典型的な診断及び予後アッセイに対するいくつかの利点を有する。第一に、偽陽性の可能性がより低い。マススペクトロメトリーは、その質量/電荷によって全てのタンパク質を検出し、抗体に依存しない。抗体を含まない検出及び定量は、非特異的結合、過染色、及び主観的解釈を回避する。第二に、マススペクトロメトリーは、ごく少量の試料(例えば、適切な結果を出すために9枚以上のFFPEスライドを必要とする免疫蛍光又は突然変異荷重解析と比較して、実施当たり2枚のFFPEスライド又は8mm2の組織)しか必要としない。免疫組織化学及び免疫蛍光は、1点測定(singlet)で実施する場合、バイオマーカー当たり1枚のスライド、又は2点測定(duplicate)もしくは3点測定(triplicate)で実施する場合、バイオマーカー当たり2～3枚のスライドを必要とする。マススペクトロメトリーは、典型的には、1～2つのFFPEピンチ生検切片から回収することができるちょうど8mm2の組織から同時に、全てのバイオマーカーの同時定量を可能にする。第三に、マススペクトロメトリーは、迅速な所要時間(例えば、次世代シークエンシングによる突然変異荷重解析の場合の3週間又はマルチプロテオーム免疫組織病理学的手法の場合の4週間と比較して、生検標本が回収される日から1週間)を有する。第四に、腫瘍内科の薬物は、典型的には、遺伝子自体ではなく、タンパク質を標的とするので、DNA(突然変異)又はRNA発現で調べる診断及び予後アッセイと比較して、プロテオミクスは、臨床的により実用的である。
本明細書に記載される方法における対象が食道腺癌を発症するリスクが増大していると確認された場合、該方法は、任意に、該対象をより詳細にモニタリングすること、又は該対象を食道腺癌への進行もしくは食道腺癌の発症についてより頻繁に検査もしくはスクリーニングすることをさらに含むことができる。
本明細書に記載される方法における対象が食道腺癌を発症するリスクが増大していると確認された場合、該方法は、任意に、該対象由来の検査用食道組織試料中の1以上の細胞増殖マーカー遺伝子の発現レベルを決定すること、及び検査用食道組織試料中の該1以上の細胞増殖マーカー遺伝子の発現レベルを対照食道組織試料中の1以上の細胞増殖マーカー遺伝子の発現レベルと比較することをさらに含むことができ、ここで、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中の細胞増殖マーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも1つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。細胞増殖マーカー遺伝子は、例えば、HMGB1、KRT7、LGALS3BP、LTF、PRMT1、及びS100Pのうちの1つ又は複数を含むことができる。
本明細書に記載される方法における対象が食道腺癌を発症するリスクが増大していると確認された場合、該方法は、任意に、対象由来の検査用食道組織試料中の1以上の腫瘍サプレッサーマーカー遺伝子の発現レベルを決定すること、及び検査用食道組織試料中の1以上の腫瘍サプレッサーマーカー遺伝子の発現レベルを対照食道組織試料中の1以上の腫瘍サプレッサーマーカー遺伝子の発現レベルと比較することをさらに含むことができ、ここで、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中の腫瘍サプレッサーマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも1つの発現の減少は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す。腫瘍サプレッサーマーカー遺伝子は、例えば、ANXA1、CRNN、IL-1RA、S100A8、SFN、及びTXNのうちの1つ又は複数を含むことができる。
本明細書に記載される方法における対象が食道腺癌を発症するリスクが増大していると確認された場合、該方法は、任意に、対象由来の検査用食道組織試料中の1以上の分子腫瘍学マーカー遺伝子の発現レベルを決定すること、及び検査用食道組織試料中の1以上の分子腫瘍学マーカー遺伝子の発現レベルを対照食道組織試料中の1以上の分子腫瘍学マーカー遺伝子の発現レベルと比較することをさらに含むことができ、ここで、対照食道組織試料と比べた検査用食道組織試料中の分子腫瘍学マーカー遺伝子の発現レベルは、FDAにより承認された食道腺癌の療法に対する利益又は抵抗性の増大と関連するプロテオーム発現パターンを定量することにより、食道腺癌の治療的治療を最適化するための情報を提供する。分子腫瘍学マーカー遺伝子は、例えば、PD-L1、HER2、EGFR、TOPO-1、TUBB3、ERCC1、TS、TOPO2A、HMGB1、S100A8、PRMT、LGALS38P、IL-1RA、TXN、S100P、及びSFNのうちの1つ又は複数を含むことができる。
本明細書に記載される方法における対象が食道腺癌を発症するリスクが増大していると確認された場合、該方法は、任意に、該対象に1以上の阻害剤の治療有効量を投与することをさらに含むことができ、ここで、該1以上の阻害剤は、該対象の食道組織におけるISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIから選択される1以上の食道腺癌リスク因子/マーカー遺伝子の発現又は活性を低下させる。例えば、検査用食道組織試料中のUBE2Nの発現が対照食道組織試料と比べて増大している場合、阻害剤は、UBE2N(例えば、本明細書中の別所に開示されているUBE2N RNAi剤又はUBE2N ASO)の発現又は活性を低下させるものであることができる。同様に、検査用食道組織試料中のDAD1の発現が対照食道組織試料と比べて増大している場合、阻害剤は、DAD1(例えば、本明細書中の別所に開示されているDAD1 RNAi剤又はDAD1 ASO)の発現又は活性を低下させるものであることができる。同様に、検査用食道組織試料中のISG15の発現が対照食道組織試料と比べて増大している場合、阻害剤は、ISG15(例えば、本明細書中の別所に開示されているISG15 RNAi剤又はISG15 ASO)の発現又は活性を低下させるものであることができる。同様に、検査用食道組織試料中のCNDP2の発現が対照食道組織試料と比べて増大している場合、阻害剤は、CNDP2(例えば、本明細書中の別所に開示されているCNDP2 RNAi剤又はCNDP2 ASO)の発現又は活性を低下させるものであることができる。同様に、検査用食道組織試料中のGPIの発現が対照食道組織試料と比べて増大している場合、阻害剤は、GPI(例えば、本明細書中の別所に開示されているGPI RNAi剤又はGPI ASO)の発現又は活性を低下させるものであることができる。同様に、検査用食道組織試料中のSETの発現が対照食道組織試料と比べて増大している場合、阻害剤は、SET(例えば、本明細書中の別所に開示されているSET RNAi剤又はSET ASO)の発現又は活性を低下させるものであることができる。同様に、検査用食道組織試料中のLTFの発現が対照食道組織試料と比べて増大している場合、阻害剤は、LTF(例えば、本明細書中の別所に開示されているLTF RNAi剤又はLTF ASO)の発現又は活性を低下させるものであることができる。同様に、検査用食道組織試料中のS100Pの発現が対照食道組織試料と比べて増大している場合、阻害剤は、S100P(例えば、本明細書中の別所に開示されているS100P RNAi剤又はS100P ASO)の発現又は活性を低下させるものであることができる。そのような治療方法は、本明細書中の別所により詳細に開示されている。
(III.食道腺癌を治療もしくは予防するか、又は食道腺癌細胞の増殖もしくは遊走を阻害しもしくは減少させるか、又は食道腺癌細胞の細胞傷害性に対する感受性を増大させもしくは食道腺癌細胞の細胞死を誘導する方法)
食道腺癌を治療又は予防する方法、食道腺癌細胞の増殖を阻害し又は減少させる方法、食道腺癌細胞の遊走を阻害し又は減少させる方法、及び食道腺癌細胞の細胞傷害性に対する感受性を増大させ又は食道腺癌細胞の細胞死を誘導する方法も提供される。
食道腺癌を有する対象の食道腺癌を治療する又は食道腺癌を発症するリスクのある対象の食道腺癌を予防する方法は、該対象に1以上の阻害剤の治療有効量を投与することを含むことができ、ここで、該1以上の阻害剤は、該対象の食道組織におけるISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる。
治療有効量は、そのために投与される所望の効果を生じる量である。正確な量は、治療の目的によって決まり、公知の技法を用いて当業者により確認可能である。例えば、Lloydの文献(1999)、医薬配合の技術、科学、及び技法(The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)を参照されたい。
対象は、哺乳動物、好ましくは、哺乳動物(例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、齧歯類、マウス、又はラット)、より好ましくは、食道腺癌の改善、予防、及び/又は治療を必要としているヒトであることができる。この用語は、食道腺癌を有するか又は食道腺癌を有するリスクのある対象(例えば、ヒト対象)を含む。
治療する、治療すること、又は治療という用語は、それを必要としている対象への本明細書に開示される阻害剤などの治療剤の投与による食道腺癌の少なくとも1つの症状又は兆候の重症度の軽減又は改善を指す。これらの用語は、疾患の進行又は症状/兆候の悪化の阻害を含む。これらの用語は、疾患のポジティブな予後も含む(すなわち、対象は、治療剤の投与によって、疾患に罹っていない可能性があるか又は疾患が軽減される可能性がある)。治療剤は、治療用量で対象に投与することができる。予防する、予防すること、又は予防という用語は、治療剤の投与による食道腺癌の発現又は食道腺癌の任意の症状もしくは兆候の阻害を指す。
本発明における1以上の阻害剤は、1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる。食道腺癌リスク因子は、例えば、ISG15、DAD1、UBE2N、及びS100Pから選択されることができる。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15を含む。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、DAD1を含む。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、UBE2Nを含む。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、S100Pを含む。阻害剤は、任意の好適な手段によって投与されることができる。例えば、阻害剤は、対象の食道に又は対象の食道に到達するのに好適な手段によって投与されることができる。
食道腺癌細胞の増殖を阻害し又は減少させる方法は、1以上の阻害剤を食道腺癌細胞に投与することを含むことができ、ここで、該1以上の阻害剤は、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる。例えば、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、UBE2N、及びS100Pから選択されることができる。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15を含む。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、UBE2Nを含む。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、S100Pを含む。いくつかの方法において、食道腺癌細胞は、食道腺癌を有する対象(インビボ)のものである。いくつかの方法において、細胞は、インビトロ又はエクスビボのものである。
食道腺癌細胞の遊走を阻害し又は減少させる方法は、1以上の阻害剤を食道腺癌細胞に投与することを含むことができ、ここで、該1以上の阻害剤は、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる。例えば、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、DAD1、UBE2N、及びS100Pから選択されることができる。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15を含む。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、DAD1を含む。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、UBE2Nを含む。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、S100Pを含む。いくつかの方法において、食道腺癌細胞は、食道腺癌を有する対象(インビボ)のものである。いくつかの方法において、細胞は、インビトロ又はエクスビボのものである。
食道腺癌細胞の細胞傷害性に対する感受性を増大させ又は食道腺癌細胞の細胞死を誘導する方法は、1以上の阻害剤を食道腺癌細胞に投与することを含むことができ、ここで、該1以上の阻害剤は、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる。例えば、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15、UBE2N、及びS100Pから選択されることができる。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、ISG15を含む。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、UBE2Nを含む。1つの例において、1以上の食道腺癌リスク因子は、S100Pを含む。いくつかの方法において、食道腺癌細胞は、食道腺癌を有する対象(インビボ)のものである。いくつかの方法において、細胞は、インビトロ又はエクスビボのものである。
上記の方法のいずれかにおいて、1以上の阻害剤は、1以上の食道腺癌リスク因子の発現を低下させることができる。同様に、上記の方法のいずれかにおいて、1以上の阻害剤は、1以上の食道腺癌リスク因子の活性を低下させる。1つの例において、1以上の阻害剤は、RNAi剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことができる。
「RNAi剤」は、配列特異的な様式でメッセンジャーRNA(mRNA)などの標的RNAの翻訳の分解又は阻害を促進することができる小さい二本鎖RNA又はRNA様(例えば、化学修飾RNA)オリゴヌクレオチド分子を含む組成物である。RNAi剤中のオリゴヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドのポリマーであり、該ヌクレオシドの各々は、独立に、修飾されたもの又は未修飾のものであることができる。RNAi剤は、RNA干渉機構を通じて作動する(すなわち、哺乳動物のRNA干渉経路装置(RNA誘導サイレンシング複合体又はRISC)との相互作用を通じてRNA干渉を誘導する)。RNAi剤は、その用語が本明細書で使用されている通り、主としてRNA干渉機構を通じて作動すると考えられているが、開示されるRNAi剤は、任意の特定の作用の経路又は機構に束縛又は限定されない。本明細書に開示されるRNAi剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、限定されないが、短い干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)、及びdicer基質を含む。本明細書に記載されるRNAi剤のアンチセンス鎖は、標的RNA中の配列(すなわち、標準的な命名法を用いてある並びの文字で記載された、ある並び又は順序のヌクレオ塩基又はヌクレオチド)と少なくとも一部相補的である。
別の例において、阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を含むことができる。一本鎖ASO及びRNA干渉(RNAi)は、オリゴヌクレオチドがワトソン・クリック塩基対形成を通じて標的RNAに結合するという点において、基本原理を共有している。理論によって束縛されることを望むものではないが、RNAiの間、小さいRNA二重鎖(RNAi剤)は、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)と会合し、1つの鎖(パッセンジャー鎖)が失われ、残りの鎖(ガイド鎖)がRISCと協調して、相補的RNAに結合する。その後、RISCの触媒コンポーネントであるArgonaute 2(Ago2)が標的RNAを切断する。ガイド鎖は、常に、相補的センス鎖又はタンパク質(RISC)のいずれかと会合している。対照的に、ASOは、一本鎖として存続し、機能しなければならない。ASOは、標的RNAに結合し、かつリボソーム又はスプライシング因子などの他の因子がRNAに結合するか又はヌクレアーゼなどのタンパク質を動員するのを妨害する。様々な修飾及び標的領域が、所望の作用機序に基づいて、ASOのために選択される。gapmerは、DNAの中心の8～10塩基のギャップに隣接する各々の末端に2～5個の化学修飾ヌクレオチド(例えば、LNA又は2'-MOE)を含有するASOオリゴヌクレオチドである。標的RNAに結合した後、DNA-RNAハイブリッドは、RNアーゼHの基質として作用する。
上又は下に引用されている特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは全て、各々の個々の項目が具体的かつ個別的に引用によりそのように組み入れられることが示されている場合と同じ程度に、あらゆる目的のためにその全体が引用により組み込まれる。異なるバージョンの配列が異なる時点のアクセッション番号に関連している場合、本出願の有効な出願日におけるアクセッション番号に関連するバージョンが意味される。有効な出願日は、実際の出願日又は該当する場合にはアクセッション番号に言及している優先出願の出願日のいずれか早い方を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが異なる時点で公開された場合、別途指示されない限り、本出願の有効な出願日に最も近く公開されたバージョンが意味される。本発明の任意の特徴、工程、要素、実施態様、又は態様は、別途具体的に指示されない限り、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さ及び理解を目的として、図及び実施例により、少し詳しく記載されているが、特定の変更及び修正が添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。
(配列の簡単な説明)
添付の配列表に列挙されているヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略号、及びアミノ酸の3文字コードを用いて示されている。ヌクレオチド配列は、配列の5'末端から始まり、フォワード方向に(すなわち、各行の左から右に)3'末端まで進むという標準的な慣習に従う。各々のヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は提示されている鎖への何らかの言及によって含まれることが理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重変異体も提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、フォワード方向に(すなわち、各行の左から右に)カルボキシ末端まで進むという標準的な慣習に従う。
表1.配列の説明
Figure 2023530391000002
(実施例)
(実施例1.バレット食道発症及び食道腺癌進行の新規マーカーの同定)
大規模マススペクトロメトリー解析を用いて、食道腺癌(EAC)の攻撃性に寄与する過剰発現及び下方調節パターンを検出した。何らかの化学療法又は放射線が投与される前の食道切除手術から得られたホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料を、50人の患者由来のEAC組織、EACに進行した対象由来のバレット食道(BE)組織、及び正常食道扁平上皮の解析に使用した。本発明者らのプラットフォームは、病理学者の指導下の顕微解剖、FFPE組織を消化されたライセートにするLiquid Tissue(登録商標)プロセス、発見マススペクトロメトリー(TripleTOF 6600)、及び伝統的な生物統計学からなっていた。この疾患の攻撃性及び化学療法剤に抵抗するEACの傾向と相関する発病プロセスを特定した。腫瘍サプレッサーがオフになり、成長因子が過剰発現され、化学療法抵抗性マーカーが上方調節され、かつ化学療法感受性マーカーが下方調節される20の関連するプロテオーム事象を特定した。さらに、治療的拮抗作用がEACにおける緩徐な腫瘍発生を示すことができる8つの薬物候補を特定した。20のタンパク質のうち、8つ(CNDP2、DAD1、GPI、ISG15、LTF、S100P、SET、及びUBE2N)は、バレット食道の腺癌への発症と顕著に相関するマーカーであることが示された。8つのマーカーのうち、食道内発症の診断面及び治療面に関して共通の接点を有する4つのタンパク質DAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nをさらなる調査のために選択した。DAD1(10のうち10)、ISG15(9/10)、S100P(8/10)、及びUBE2N(8/10)の過剰発現がBE組織で発見された。隣接するEAC組織において、DAD1(20のうち20)、ISG15(19/20)、S100P(17/20)、及びUBE2N(18/20)タンパク質の顕著な過剰発現が観察された。これらの発現レベルは、正常扁平上皮から異形成度の高いBE組織に移行するときに急増し、より多くのグルコースをエネルギーに使用し(ワールブルグ効果)、増殖度合いを増大させ、かつアポトーシスを抑制すること(これらの特徴は、腺癌組織像に持ち込まれる)により、BEが癌のように作用し始めることを示した。ISG15、S100P、及びUBE2Nの個々のノックダウンは、未処理のEAC細胞株(OE-33)と比較して、細胞増殖の顕著な減少をもたらす一方、48時間にわたるより高いレベルの細胞傷害性を誘導した。DAD1ノックダウンは、最も遅いEAC細胞遊走速度を示した。DAD1、S100P、ISG15、及びUBE21Cの遺伝子ノックダウンは、相互接続する癌経路の全体的な腫瘍形成環境を改善し－関連する腫瘍促進遺伝子を顕著に下方調節する一方で、多くの抗癌因子を上方調節した。これらの発見をまとめると、バレット食道に関連する食道発癌の評価及び治療におけるCNDP2、DAD1、GPI、ISG15、LTF、S100P、SET、及びUBE2Nの診断的及び治療的臨床有用性が示されている。
(序論)
食道腺癌の転移及び化学療法抵抗性に寄与するプロテオーム環境を特定することにより、改善された診断法及び治療法を開発することができる。化学療法を一度も受けたことがない患者の食道切除術からの混じり物のないEAC試料を入手した。この試料を処理し、顕微解剖した。その後、顕微解剖試料を消化して、Liquid Tissue(登録商標)ライセートにし、発見マススペクトロメトリープラットフォーム(TripleTOF 6600)で解析した。化学療法抵抗性及び感受性、アポトーシス抑制、並びに増殖上方調節に関連する20の重要な標的を同定した。8つの標的(CNDP2、DAD1、GPI、ISG15、LTF、S100P、SET、及びUBE2N)を、分子腫瘍学の診断面及び治療面とのその交差に基づいて、さらなる調査のために選択した。特に、DAD1タンパク質の過剰発現は、シスプラチン抵抗性に寄与する。注目すべきことに、コロンビア大学メディカルセンター(Columbia University Medical Center)(CUMC)で食道切除の治療を受けた123人の患者のうちの95％は、その地域癌専門医によって、第一選択の設定でシスプラチン服用に置かれた4,5。S100P発現は、結腸直腸癌で5-FU(フルオロウラシル)に対する抵抗性を増大させることが分かった6。5-FUは、本発明者らのコホート(n=123)の患者の72％に処方された。本発明者らの発見により、EACは、EACの2つの最も処方される薬物に対する抵抗性を有する可能性が高いので、別の患者管理戦略が必要とされることが示唆されている4。さらに、本発明者らは、EACに対する臨床有用性を有する8つの診断及び治療バイオマーカーを特定した。これらの癌原遺伝子のうちの4つを標的とすることは、インビトロでEACの増殖及び転移能力を減少させることを示した。
(1.0. BE/EACマーカー)
CNDP2、DAD1、GPI、ISG15、LTF、S100P、SET、及びUBE2Nは、ヒト生理機能における重要な微生物学的機能を有する。S100タンパク質は、通常は炎症又は細胞損傷に応答して、増殖、分化、及びアポトーシスを管理する、細胞の調節的役割に関与する。ユビキチンは、破壊される損傷細胞をマーキングし、例えば、炎症時又は胆汁酸攻撃後に治癒を促進する細胞増殖手段のシグナルを送る調節タンパク質である7。これらのプロセスが機能不全であるか又は過度に活動的であるとき、発癌が生じ得る。
(1.1.)
DAD1(細胞死に対する防御因子)は、効率的なグリコシル化に必要とされる酵素である。DAD1は、プログラム細胞死の負の調節因子であることが分かっており、癌細胞がアポトーシスを回避するのを助けることに関係があるとされている8。DAD1は細胞アポトーシスを抑制するが、DAD1発現の低下は、小細胞肺癌マウスモデルでより容易に細胞死を引き起こすことが分かった9。本発明者らの医療センターのEAC患者の97％は、第一選択の設定でシスプラチンにより治療された4。しかしながら、DAD1タンパク質レベルの過剰発現は、シスプラチン抵抗性に寄与することが分かり、DAD1は、本発明者らのヒトEAC試料の100％で過剰発現されることが分かった。本発明者らは、DAD1が、正常食道組織と比較して、EAC腫瘍で5.08倍を超えるレベルで発現されることを見出した(P＜0.0001)。本発明者らの発見は、シスプラチンによる治療がDAD1の発現増加を有する患者の場合に不適切であり得ることを示している。EACにおけるDAD1の役割は、これまで不明であった。
(1.2.)
ISG15(インターフェロン刺激遺伝子15)は、自然免疫応答において重要な役割を果たすユビキチン様タンパク質である。Desaiの文献(2015)は、「[ISG15が]重要な癌タンパク質並びに癌の潜在的な診断及び治療標的として浮上している」ことを報告している10。膵腺癌において、腫瘍関連マクロファージはISG15を分泌し、それにより、腫瘍内の癌幹細胞の表現型を増強し－癌幹細胞の自己再生を強化し、浸潤能を増大させ、かつ腫瘍形成能を増大させる11。最近、癌幹細胞は、腺癌の発生及び転移進行において主要な役割を果たすことが分かった。ISG15は、乳房細胞の悪性形質転換に寄与することも分かり、結腸直腸癌におけるより悪い予後と関連している10,12。それにもかかわらず、EACにおけるISG15の役割は、現在、報告されていない。ISG15特異的小干渉RNA(siRNA)を用いたISG15発現のノックダウンは、ポリユビキチン化タンパク質のレベルを増大させることが示され、ユビキチン媒介性タンパク質代謝回転の調節におけるISG15の拮抗的役割を示唆した10。ISG15は、破壊されるようにマーキングされたタンパク質内のほとんど全てのペプチド結合が切断を受けやすいようにするプロセスを破壊する13。EACに対してFDAにより承認されたドキソルビシンは、ISG15が豊富に存在する腫瘍においてより大きい効力を有することが分かっているが、食道切除術のために本発明者らの医療センターに回された患者の6％のみが第一選択の設定でドキソルビシンを受けた。EAC腫瘍の約95％がISG15を過剰発現していたという本発明者らの発見は、ドキソルビシンが高レベルのISG15を発現するEAC患者で有益であり得ることを示唆している4,14。本発明者らは、ISG15が、正常食道組織と比較して、EAC腫瘍で7.29倍を超えるレベルで発現されることを見出した(P＜0.0001)。
(1.3.)
S100Pは、幅広い細胞の細胞質及び/又は核内に局在し、細胞周期進行及び分化などのいくつかの細胞プロセスの調節に関与する15。S100Pは、RAGEに結合し、それを活性化することにより、その機能を果たし、おそらくは、細胞分裂機構に、多くの固形腫瘍でしばしば上方調節される古典的なチロシンキナーゼ/KRAS増殖経路を迂回させる。S100P由来RAGE拮抗ペプチドは、膵癌で腫瘍成長及び転移を遅延させることが分かっている16。顕著な相関は、胃癌及び卵巣癌におけるS100Pの高発現とより短い全生存(OS)と薬物抵抗性の増大の間で見出された17。S100Pは、膵癌の攻撃性においても重要な役割を果たし、これは、RAGEを活性化するその能力によって媒介される可能性が高い18。S100Pノックダウンは、子宮内膜癌細胞株で細胞増殖を抑制する一方、細胞アポトーシスを強化することが分かった19。S100Pの発現は、胃癌における薬物抵抗性を増大させ、結腸直腸癌細胞におけるインビトロでの5-FUに対する化学療法感受性を減少させる6。本発明者らの医療センターでEACの治療を受けた患者の87％は、第一選択の設定で5-FUを処方された4。本発明者らは、S100Pが、正常食道組織と比較して、EAC腫瘍で6.42倍を超えるレベルで発現されることを見出した(P＜0.0001)。本発明者らの知る限り、EACにおけるS100Pの役割は、これまで報告されていない。本発明者らの発見は、EAC腫瘍をS100P発現についてモニタリングすることができること及びS100P発現の増大が5-FUによるもの以外の治療を示すことを示唆している。
(1.4.)
UBE2N(ユビキチン結合酵素E2 N)は、乳癌、膵臓癌、結腸癌、前立腺癌、及び卵巣癌で過剰発現されることが分かっている。UBE2Nの過剰発現は、乳癌の肺への転移に必要とされることが分かっている20。このマーカーの阻害は、神経芽腫で細胞死を引き起こした21。UBE2Nは、NFκβ炎症活性化という発癌と関連する機構にとって極めて重要であるユビキチン鎖を特異的に構築する。興味深いことに、UBE2N阻害は、自然免疫シグナル伝達、細胞生存、RNAスプライシング、及びDNA損傷応答に関与する～140個のタンパク質のユビキチン化を顕著に変化させた22。この研究の遺伝子発現部門からの本発明者らの発見は、UBE2Nの上流位置を確証した。siRNA媒介ノックダウンによるUBE2Nの阻害は、直接的及び周辺的な癌経路に対するこれらの試験されたマーカーの最大の効果を及ぼした。解析された経路のうちの50％超がUBE2Nノックダウンによってプラスの影響を受けた。本発明者らは、UBE2Nが、正常食道組織と比較して、EAC腫瘍で6.88倍を超えるレベルで発現されることを見出した(P＜0.0001)。したがって、UBE2Nの発現の増大は、正常組織からEACへの進行を示し、これを用いて、EACに対する易罹患性もしくはEACを発症するリスクをモニタリングするか、又はEACを診察することができる。本発明者らの知る限り、EAC進行におけるUBE2N役割の役割は、過去に報告されていない。
図2は、バレット食道の進行及び食道腺癌の攻撃性における様々な遺伝子の経路及び役割を示したイメージを示している。UBE2N及びS100Pは、遠位食道粘膜における細胞損傷への応答時に上方調節され、腫瘍促進プロセスをもたらす8,21,23-35。
(1.5.)
CNDP2(細胞質ゾル非特異的ジペプチダーゼ)は、MAPK経路を活性化することにより、胃癌において機能的腫瘍サプレッサーとして働く36。CNDP2は、逆タンパク質分解による乳酸塩及びアミノ酸からのN-ラクトイル-アミノ酸の生成を触媒する37。CNDP2のレベルの上昇は、p38及びJNK/MAPK経路を活性化して、細胞アポトーシスを誘導する。より低レベルのCNDP2は、ERK MAPK経路を活性化して、細胞増殖を促進する。CNDP2は、肝細胞癌細胞において腫瘍サプレッサーとしての役割を果たすことができる36。特に、CNPD2の上方調節は、結腸癌の増殖を促進し、逆に、CNDP2の過小発現は、胃癌を有する患者にとってより望ましい予後をもたらす36,38。本発明者らは、CNDP2が、正常食道組織と比較して、バレット組織で2.85倍を超えるレベルで発現されることを見出した(P＜0.0001)。したがって、CNDP2の発現の増大は、正常組織からバレット食道及び/又はEACへの進行を示し、これを用いて、バレット食道及び/もしくはEACに対する易罹患性又はバレット食道及び/もしくはEACを発症するリスクをモニタリングすることができる。本発明者らの知る限り、EAC進行におけるCNDP2の役割は、これまで報告されていない。
(1.6.)
GPI(グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ)は、ワールブルグ効果を伴う経路と関連する主要な解糖酵素であり、この経路では、癌細胞が解糖経由で高率にエネルギーを産生する。GPIは、内皮細胞運動を刺激する腫瘍分泌型サイトカイン及び血管新生因子(AMF)として機能することができる。GPIはHER2発現を増強し、HER2過剰発現はGPI発現を増強する。GPIは、乳癌細胞において、トラスツズマブを用いたHER2に基づく療法に対する抵抗性を付与する可能性が高く、患者を治療するときの追加の標的とみなされるべきである。正常食道組織が、前癌性食道組織に進行し、その後、癌性食道組織へと進行するにつれて、GPIが上方調節されるという発見は、ワールブルグ効果が食道内発症で生じていることを立証する。本発明者らの発見は、前悪性バレット食道組織由来の細胞が、通常癌細胞と関連するエネルギー代謝経路の変化を通じて、絶え間なく変化する選択的微小環境に適応し得ることを示唆している。GPIプロテオーム発現傾向は、まだEAC発症と関連付けられていない。
(1.7.)
LTF(ラクトトランスフェリン)は、母乳及び粘膜分泌物などの外分泌液中に見られる主要な鉄結合性かつ多機能性タンパク質であり、かつ抗微生物活性を保有する。LTFは、Cアデノウイルスという種の上皮細胞への結合を促進し、アデノウイルス感染を促進する。LTFは、TLR4シグナル伝達経路を刺激し、NFκB活性化及びその後の炎症促進性サイトカイン産生をもたらすと同時に、リポ多糖(LPS)刺激性TLR4シグナル伝達も妨害する。LTFは、アポトーシス細胞によって分泌されたとき、アポトーシスの部位への好中球顆粒球遊走を阻害し、VEGF媒介性内皮細胞遊走及び増殖を刺激する。LTFは、鼻咽頭癌、胃癌、及び子宮内膜癌の悪性形質転換と関連付けられている39-41。本発明者らは、正常食道組織と比較してBE及びEAC組織で8.8倍高く発現されることになるLTFを、BE及び/もしくはEACを評価する際の又はBE及び/もしくはEACを発症するリスクを評価する際のマーカーとして使用することができることを見出した。本発明者らの知る限り、LTF過剰発現がBEの腫瘍形成の促進と関連しないことはこれまで知られていない。
(1.8.)
SET核癌原遺伝子は、転写されて、アポトーシス、転写、ヌクレオソームアセンブリ、及びヒストンシャペロニングに関与するマルチタスクタンパク質になる。SETは、癌の開始及び進行を促進する42。SETは、アポトーシスと、それに続く、細胞傷害性Tリンパ球による攻撃(これは、発癌の顕著な特徴である)を阻害する。SETは、癌細胞における治療抵抗性の発生を促進することも示されている。SETアンタゴニストは、EACではない、いくつかの癌について、現在、臨床研究中である。SETは、正常食道組織と比較して、EACで2.5倍を超えるレベルで発現される。それゆえ、SET発現の解析を用いて、EAC又はEACを発症するリスクを評価することができる。本発明者らの知る限り、SET上方調節は、これまでBE異形成進行と関連付けられていない。
(2.0.材料及び方法)
(2.1.患者選択)
2004～2015年に収集されたネオアジュバント化学放射線療法を受けていない82人の患者由来の食道切除患者標本を入手した。ほとんどの症例により、遠位食道から採取された近位切除マージンに位置する腫瘍、バレット食道、及び正常食道粘膜の複数のブロックが提供された。これら82人の患者のうち、約12人が扁平上皮細胞癌及び胃癌組織像が原因で脱落した。本発明者らの研究のマススペクトロメトリー部門のために、本発明者らは、全て無作為に選択された、20個の食道腺癌試料、10個のバレット食道試料、及び20個の正常扁平上皮粘膜試料を使用した。50個の標本のうちの15個(30％)は、女性患者由来のものであり、これは、この疾患の性別発現の国内割合を反映している。20個の正常食道標本のうちの9個及び20個の腺癌標本のうちの10個は、目に見えるバレット食道を有さない患者由来のものであった。
(2.2.組織の取得及び処理)
ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織を10ミクロンで切り出し、1つの5μm切片をH＆Eで染色した。正常層状扁平上皮食道粘膜、バレット食道、及び浸潤性腺癌を標的とするために、標本の入手可能な肉眼所見に基づいて、パラフィンブロックを選択した。これらの肉眼病変に相当する部分の組織学検査スライドは、有資格病理学者によって調べられた。所望の病変に相当することが組織学的に確認された場合、目的の部分を丸で囲んだ。その後、その調べられたH＆Eの下の連続切片未染色スライドを丸で囲んだ部分から顕微解剖した。
バレット食道は、米国消化器病学会(American College of Gastroenterology)ガイドラインに従って、管状食道内のサーモン色の粘膜の部分における腸化生と定義される43。浸潤性腺癌部分を、基底膜から下層組織に明白に浸潤している悪性細胞に基づいて選択した。異形成、上皮内癌、又は不明瞭な浸潤を有する上皮癌の部分は、バレット食道又は浸潤性腺癌のいずれかとして解析の代表として選択されなかった44。付随する病理プロセスから遠く離れている組織を選択することが可能なときはいつでも、正常食道粘膜を近位切除マージンから採取した。いくらかの粘膜下組織を有する扁平上皮を、筋固有層を有する正常粘膜用に選択した。外膜は、解析に含めなかった。
(2.3.標本の調製及び染色)
マススペクトロメトリー解析に使用されるホルマリン固定パラフィン包埋ヒト組織試料を脱パラフィン処理し、再水和させ、ヘマトキシリンで染色し、それゆえ、組織標本のトポグラフィーを正確な顕微解剖に使用することができた。試料が病理学者の指定したマージン内にあるように、解剖前及び解剖後の画像を取得した(第2.2節を参照)。
(2.4.組織処理)
臨床的に、マススペクトロメトリープラットフォームは、通常、血清、尿、血液、及び新鮮な又は凍結された組織標本をプロテオーム調査に使用する。ホルマリン架橋組織試料は、マススペクトロメトリーに適合するライセートへと完全には消化されず、そのため、高価な機械を適切に稼働させないか又は故障させるリスクが増大することが分かっている。本明細書に開示される方法は、FFPE組織を完全に消化して、マススペクトロメトリーに適した小さいペプチドにすることができる。FFPE組織を処理して、マススペクトロメトリーに適合するライセートにする方法は、約24時間かかり、FFPE組織のホルマリン架橋を完全に無効にする。タンパク質を小さいペプチドに分解することは、外科手術又は内視鏡検査後の不十分な組織固定の効果を失わせる。標本は、患者から切除されるとすぐに、新鮮な固定剤又はホルマリン固定剤に入れられるという保証はなく、それゆえ、診断医のコントロールの範囲外であるタンパク質分解を受ける可能性がある。標的化マススペクトロメトリー解析は、検出されているマーカーにのみ存在する巨大タンパク質内の小さいユニークな識別ペプチドを測定する。したがって、不適切な固定によるタンパク質分解又は破壊は、結果に悪影響を及ぼさない45。マススペクトロメトリー解析は、抗体認識に必要とされるタンパク質エピトープ完全性の必要性を排除する。さらに、液体生検は、将来の実験のために、無期限に保存することができる。
(2.5. SWATH-MS)
(マススペクトロメトリー:)
データ非依存型取得(DIA) SWATH-MS実験を以前に記載されている通りに実施した46。試料は全て、市販の6600 TripleTOF(登録商標)(Sciex)マススペクトロメーターを用いる逆相高圧液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデムマススペクトロメトリー(RP-HPLC-ESI-MS/MS)によって解析した。マススペクトロメーターをnanoFlex cHiPLCシステム(Eksigent)と連動させた。試料は全て、100％溶媒A(HPLC水中0.1％(v/v)ギ酸)を用いる10μL/分で8.5分間及び2μL/分で1分間の段階的流量を用いてローディングした。試料を、5％溶媒B(0.1％(v/v)ギ酸を含むアセトニトリル)～35％溶媒Bの線形勾配を用いて、180分の期間にわたって、0.3μL/分の流量で分析カラムから溶出させた。カラムを90％溶媒Bで15分間洗浄することにより再生し、5％溶媒Bで15分間再平衡化した。スペクトルのオートキャリブレーションは、25fmolのβ-ガラクトシダーゼの動的LC-MS及びMS/MS取得を用いて、6つ毎の試料を取得した後に行われた。SWATH-MSスペクトルのライブラリーを作製するために使用された試料を従来のデータ依存型取得(DDA)に供し、ProteinPilotソフトウェアv.4.2(Sciex)を用いて、ライブラリーを作製した。実験試料を、可変swathを用いるマススペクトルの周期的DIAに供した。イオンを、ローリングコリジョンエネルギーを用いて、衝突セル中で各々のMS/MS実験用にフラグメント化した。
(標的化データ抽出:)
DIA試料のスペクトルアラインメント及び標的化データ抽出を、上で作製されたMDM参照スペクトルライブラリーを用いるPeakView v.1.2(Sciex)を用いて実施した。全てのDIAファイルをロードし、10分の抽出ウィンドウ及び以下のパラメータ: 5つのペプチド、5つのトランジション、＞99％のペプチド信頼度、共有ペプチドの除外、及び50ppmに設定されたXIC幅を用いて、.txtフォーマットで同時にエクスポートした。このエクスポートは、(1)個々のイオンの強度曲線下面積、(2)所与のペプチドの個々のイオンの合計強度、及び(3)所与のタンパク質のペプチドの合計強度についての定量的出力を含む3つの異なるファイルの作成をもたらす。実験的混入因子及び逆順は、統計解析の前に、データセットから除去した。
図3は、発見LT-SWATH-MSワークフローを示している。標本のH＆E染色切片を上記のように有資格病理学者によってマーキングしてもらい、ヘマトキシリンで染色された連続切片の顕微解剖のガイドとして使用した。純粋な腫瘍、バレット食道(前癌性組織)、又は正常扁平上皮食道上皮の10μm切片からの約2×4mmを各々の試料について入手した。組織回収が指定されたマージン内で行われるように、顕微解剖前及び顕微解剖後の画像を取得した。顕微解剖されたホルマリン固定パラフィン包埋組織をエッペンドルフチューブに入れ、おおよそ30μLの洗剤を含まないバッファーで覆い、一連の加熱及び消化段階を通じて処理して、マススペクトロメトリー解析に好適な試料を生成させた。この試料をまず95℃で90分間インキュベートし、その後、氷中で冷却する。その後、トリプシンを添加し、37℃で16～18時間インキュベートして、巨大なタンパク質を小さいペプチドへと破壊する。得られた消化物をnanodropによってタンパク質濃度について定量し、MCXによって清浄化し、10％DTTで、95℃で10分間還元し、TripleTOFマススペクトロメトリーによって解析した。SWATH解析及び本発明者らが概説した一連の生物統計学(ANOVA、ベンジャミーニ・ホッホベルク法、事後T-検定、テューキー・クレーマーの範囲検定)及び簡単なバイオインフォマティクスにより、EAC発症と関連する8つのマーカーのリストが得られた。これらのマーカーのうちの4つ: DAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nを、免疫蛍光、EAC細胞株におけるsiRNAノックダウンモデル、比色増殖アッセイ、蛍光細胞傷害性アッセイ、遺伝子発現RT-PCR、及びスクラッチ遊走アッセイを含むさらなる解析のために選択した。これらの解析の結果は、マススペクトロメトリー解析によって同定されたタンパク質のEAC発症における役割を果たすものとしての役割を立証した。それゆえ、これらのタンパク質は、EACを発症するリスクがあるか、EACを有することが疑われるか、又はEACに罹患していると以前に診断された患者のための診断マーカー及び治療標的として有用である。
(2.6.免疫蛍光)
標準的な脱パラフィン及び再水和法を用いて、本発明者らの組織を免疫蛍光に触れさせた。本発明者らは、抗原賦活化を、2Lの水に溶解させた2000mLのBoster Immunoleader抗原溶液中、95℃で20分間実施した。試料を5％ウマ血清及び0.25％tritonバッファー中で2時間ブロッキングした。本発明者らは、試料を、8つのタンパク質のうちの4つを標的とする一次抗体で、4℃で一晩染色した。本発明者らは、PBSで希釈したS100Pを除いて、全てブロッキング溶液に希釈した、DAD1(1:100希釈)抗ウサギポリクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific - PA5-20062)、ISG15(1:100希釈)抗ウサギポリクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific - PA5-31865)、S100P(1:30希釈)抗マウスモノクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific - MA5-24106)、及びUBE2N(1:200希釈)抗ウサギポリクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific - PA5-29687)を使用した。一次抗体を洗い流した後、DAD1、ISG15、及びUBE2N試料は、Alexa Fluor 594ロバ抗ウサギ二次抗体(Invitrogen - A21207)を受け、S100Pは、Alexa Fluor 488ロバ抗マウス抗体(Invitrogen - A21202)を受けた。両方の二次抗体を1:200の比でブロッキング溶液に希釈し、室温で1.5時間組織を染色させておいた。DAPI濃縮封入血清を添加した後、本発明者らの組織切片にカバースリップを付けた。免疫蛍光後のイメージングをOlympus VS120 Slide Scannerで行い、免疫蛍光定量を、国立衛生研究所(National Institute of Health)により利用可能にされた64-ビットのJava 1.8.0_112に付属しているImageJで完了した。
(2.7.細胞培養及びsiRNAノックダウン)
インビトロ研究に使用される食道腺癌細胞株は、AddexBio製のOE-33(No.C0013003)であった。この細胞を10％FBS中のRPMI-1640で増殖させた。細胞培養の前に、細胞をプレーティングし、70％コンフルエントのときに、OptiMEMと25nM siRNA又はRNAiMAX lipofectamineのみで増殖させた。siRNA処理は、siNEG、siPOS(GAPDH)、siDAD1(No.145787)、siS100P(No.142895)、siISG15(No.137859)、及びsiUBE2N(No.12328)であった。これらの実験に使用されたノックダウンsiRNA試薬は、Ambion(登録商標)製のSilencer(登録商標)プレデザインドsiRNA(Cat #. AM16708A)であった。細胞をsiRNAとともに48時間インキュベートし、その後、これをDPBSで洗浄し、溶解バッファーで溶解させた。その後、細胞ライセートを、DNA、RNA、及びタンパク質の同時抽出用に処理した。
(2.8. RNA単離、cDNA合成)
4つのマーカーのsiRNAノックダウンの後、本発明者らは、RNA、DNA、及びタンパク質を、インタラクトームの成分の同時精製用のQiagen製のAllPrepミニキットを用いて、食道腺癌細胞の様々な処理バッチから単離した。本発明者らは、QIAshredderを用いて、処理細胞を破壊し、ホモジナイズした。その後、RNA試料を用いて、遺伝子発現解析用のcDNAライブラリーを作製した。これらの試料由来のタンパク質及びDNA材料を-20℃で保存した。RNA濃度をThermo Fisher Scientific製のNanoDrop 2000c分光光度計で定量した。本発明者らは、RT2プロファイルPCRアレイと適合するQiagen製のRT2 First Strandキットを使用し、このプラットフォームに含まれる逆転写対照の検出の結果を最適化した。
(2.9.遺伝子発現解析)
本発明者らは、本発明者らのcDNA鋳型をすぐに使用できる適当なPCRマスターミックス(SYBR(登録商標) Green)と混合し、その後、同じプレートの各々のウェルに等量を分注し、その後、Bio-Rad製のC100(商標)サーマルサイクラーのCFX96(商標)リアルタイムシステムでリアルタイムPCRサイクリングプログラムを実行した。本発明者らは、Cancer PathwayFinder RT2 Profiler PCR Arrayを使用した。これは、血管新生、アポトーシス、細胞周期、DNA修復などと関連する遺伝子の上方調節及び下方調節パターンを同時に解析する。処理されたEAC細胞株を複数の未処理EAC対照に対して正規化した。熱サイクルプロトコルは、95℃で3分間温め、95℃で10秒間、その後、55℃で30秒間を40回循環させるものであった。
(2.10.増殖、細胞傷害性、及びスクラッチアッセイ)
OE-33腺癌細胞を増殖させ、トリプシン処理し、カウントし、1,000,000細胞/Lの濃度又は1,000細胞/μLになるように希釈した。これにより、本発明者らは、10,000個のOE-33細胞を含む各々のウェルをちょうど10μLの培地/細胞にして標準化することが可能になった。DAD1、ISG15、S100P、UBE2N、及び本発明者らのベクターなし陰性対照、及びGAPDH陽性対照についての本発明者らのsiRNAストックは、5マイクロモル濃度であった。以下の実験のために、本発明者らは、2.78ピコモル/cm2の濃度のsiRNAを、OE-33食道腺癌細胞株で、全ての標的ベクターに使用した。本発明者らは、プレート又はウェルのサイズに応じて、cm2当たり57μLの培地、siRNA、及びlipofectamineを用いて、全ての実験を標準化した。
(2.10.1. 96-ウェルプレートプレッププロトコル)
細胞をT75フラスコ中で70％コンフルエンシーまで増殖させた。細胞をT75中で16時間血清飢餓状態にし、細胞周期を同期させた。その後、細胞を、フラスコ当たり5mLを添加し、37℃で4分間インキュベートすることにより、1×トリプシンEDTAで剥離させた。その後、細胞を800rpmで5分間スピンダウンした。その後、OE-33細胞を1mLの無血清RPMI 1640に再懸濁させ、Countess II FL自動細胞カウンター(Thermo Fisher)を用いてカウントした。細胞を1,000,000細胞/mLの濃度に希釈し、10μL(10,000細胞)を96-ウェルプレート中の各々のウェルに添加した。各々のウェルは、1cm2当たり2.78ピコモルのsiRNAと1cm2当たり57μLの全容量(培地＋細胞＋lipofectamine＋siRNA)とを含む無血清培地を含有していた。その後、細胞をsiRNAとともに48時間インキュベートし、その後、アッセイした。
(2.10.2.増殖比色アッセイ)
遺伝子ノックダウンの後、細胞を48時間増殖させておいた。その後、培地をデカントし、新鮮な無血清培地を各々のウェルに添加した。本発明者らは、10μLのMTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)を添加した。これは、DNA合成の副生成物であるNADPHと接触したときにホルマザンに変換されて、紫色を生じる黄色いテトラゾリウム塩であり、その吸光度は、ある期間にわたる増殖率の代用物としての役割を果たすことができる。MTTを培地に直接添加し、37℃で3.5時間インキュベートしておいた。MTTがホルマザンに変換するのに十分な時間を許した後、本発明者らは、MTT/培地を除去し、100μLのDMSO(ジメチルスルホキシド)を添加して、ホルマザンを細胞から取り除き、これにより、信頼性のある比色読み取りが可能になる。プレートをゆっくりと旋回させて、室温で1時間置いた。可溶化の後、単層によって摂取された紫色の色素の量をプレートリーダーにて570nmで定量することができる。
(2.10.3.細胞傷害性アッセイ)
ある期間にわたる細胞死を、Vybrant(商標) G6PD放出細胞傷害性アッセイ(Thermo Fisher - V23111)を用いて測定した。このアッセイでは、レサズリンという青色の色素がレゾルフィンという赤色の色素に還元され、その後、蛍光プレートリーダーによって測定されて、処理後の細胞死の割合を定量することができる。レサズリンは、細胞膜が壊れたときに放出され、それにより、細胞死の割合の代用物としての役割を果たす分子であるG6PD(グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ)と接触するようになったときに還元される。細胞をそれぞれのsiRNAで処理し、48時間インキュベートした。その後、10,000個の細胞を96-ウェルプレートの各々のウェルに移して、各々の処理群についてn=12をもたらした。50μLのレサズリンをノックダウン処理細胞及び3つの対照(溶解した未処理細胞、陽性対照、及び陰性対照)のウェル当たり10,000個の細胞に添加し、37℃で24時間インキュベートしておいた。蛍光プレート読み取りを550nm(励起)及び590nm(放出)で行い、各々のウェル中のレゾルフィン(赤色)のレベルを測定した。その後、プレートを、T=0から始めて最初の30分間、10分間隔で、その後、1時間でアッセイした。
(2.10.4.スクラッチ遊走アッセイ)
スクラッチアッセイは、細胞遊走速度をインビトロで測定するための簡単で安価な手段である。2つの12-ウェルプレートに、処理したOE-33細胞及び未処理のOE-33細胞を播種した。その後、培地を、siRNA陰性対照、GAPDHを標的とするsiRNA陽性対照、及びsiDAD1、siUBE2N、siISG15、siS100Pを含む無血清RPMI-1640でトランスフェクトするか、又は未処理とし、90％コンフルエントまで約36時間増殖させた。縦のスクラッチを200μLピペット端で作り出した。培地を除去し、Opti-MEMと交換し、0時間、12時間、及び16時間の時点でイメージングして、創傷閉塞の速度を4×倍率でモニタリングした。
(2.11.ウェスタンブロット)
タンパク質濃度をNanoDrop(商標) One/OneC Microvolume UV分光光度計で定量した。25μgのタンパク質を各々の試料泳動用の各々のラインにローディングした。本発明者らは、その会社ウェブサイト(http://www.abcam.com/protocols/general-western-blot-protocol)に記載されているAbcamの一般的なウェスタンブロットプロトコルに従った。本発明者らは、SDS-PAGEゲル電気泳動を、70Vで30分間、その後、100Vで1時間実行した。本発明者らは、タンパク質を、ゲルから0.45μmニトロセルロース膜(Bio-Rad 162-0115)に、冷たい泳動水の下、30Vで一晩転写させた。次に、本発明者らは、TBST中の3％ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて、膜を室温で1時間ブロッキングした。一次抗体染色のために、本発明者らは、1:500の比で希釈したDAD1ポリクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific - PA5-20062)、1:1000の比で希釈したISG15ポリクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific - PA5-31865)、1:1000の比で希釈したS100Pモノクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific - MA5-24106)、及び1:1000の比で希釈したUBE2Nポリクローナル抗体(Thermo Fisher Scientific - PA5-29687)を用いて、ニトロセルロース膜におけるその存在について染色した。前後に穏やかに揺らしながら、一次抗体を膜と4℃で一晩反応させておいた。一次抗体をTBSTで、各々5分間、3回洗い流した。DAD1、ISG15、及びUBE2Nの二次抗体は、ブロッキングバッファーに、1:10000の比で、室温で1時間希釈したヤギ抗ウサギ(Novus Biologicals - NB7160)及びS100Pヤギ抗マウス(Novus Biologicals - NB7539)であった。イメージングシグナルの顕色のために、本発明者らは、イメージングから1分以内に膜上に同時に注がれる1mLのルミノールエンハンサー溶液と混合した1mLの過酸化物溶液を用いるPierce(登録商標) ECLウェスタンブロッティング基質(Thermo Scientific - 32209)を使用し、Bio-Rad製のChemiDoc(商標) MPイメージングシステムで画像を捕捉した。4つの標的タンパク質は全て、約17kDaに存在する。
(2.12.統計解析)
(2.12.1.マススペクトロメトリー)
合計617個のタンパク質を質量分光測定-SWATH解析によって同定及び定量した。マススペクトロメトリー値を、統計解析の前に、2を底とする対数に変換した。一元配置固定効果ANOVAを用いて、3つの組織型(正常扁平上皮食道上皮、バレット食道、及び腺癌腫瘍組織)間の差異を検出した。ベンジャミーニ・ホッホベルク法を用いて、これらのANOVA検定のうちのどれが、偽発見率を0.05以下に制御しながら、タンパク質発現と組織型の間の検出可能な関連を示すかを決定した。事後t-検定に、0.00085のアルファを割り当て、多重比較のためのテューキー・クレーマー調整を用いて調整した。本発明者らの計算は全て、SAS 9.4で処理した。
(2.12.2.免疫蛍光)
バレット食道、正常扁平上皮、及び腺癌腫瘍からの63の蛍光強度読み取りを、ランダムな組織区画内で始まり、(組織の間質部分を回避して)目的の部分を中心に時計回りに向かう各々の区域の5つの部分を定量するImageJバージョン1.8.0_112を用いて定量した。蛍光強度の定量後、値を平均化し、タンパク質及び処理群の各々についてのSD及びSEMを計算した。食餌の異なる4匹のユカタンミニブタ由来の47の健康な粘膜の蛍光強度読み取りを用いて、マーカーのうちの4つの発現レベルを非疾患対照コホートで計算した。
(2.12.3.遺伝子発現)
QIAGENデータ解析ツールを用いて、PCRデータを解析し、siNEG対照群と比較した。データを、5つのハウスキーピング対照(ACTB、B2M、GAPDH、HPRT1、及びRPLP0)の幾何平均を用いて正規化した。調節倍率、変化倍率、平均ΔCT、及び2-ΔC Tを全て計算した。対照と比較して有意な変化を有する遺伝子をここで強調した。
(2.12.4.増殖、細胞傷害性、及び遊走アッセイ)
処理群の平均を標準偏差及び標準誤差の計算とともに出した。ここから、本発明者らは、平均の差がANOVAを用いて群間で有意かどうかを決定し、その後、P-値をテューキー検定で出した。外れ値をグラブスの検定で決定したが、本発明者らは、これらの一連の実験で1つの外れ値(S100P、MTT増殖アッセイ)しか有さなかった。
(3.0.結果)
(3.1.一貫した顕著な過剰発現)
本発明者らは、全てマススペクトロメトリーを用いて、FFPE組織中の数千のタンパク質を精査する方法を設計した。FFPE組織試料を消化して、遠位食道の3つの異なる組織像(正常扁平上皮、前癌性バレット粘膜、及び食道腺癌腫瘍)中の腫瘍タンパク質の定量を同時に可能にするマススペクトロメトリー適合ライセートにした。マススペクトロメトリー解析は、その質量及び電荷によってペプチドを測定する際に、抗体ベースのアッセイを上回る利益を提供する。したがって、マススペクトロメトリー解析は、抗体ベースのアッセイに付随する問題、例えば、非特異的結合又は主観的解釈を回避する。
50の試料を3つの異なる組織型(20のEAC腫瘍、10のバレット食道、及び20の正常食道)を用いて解析し、これにより、約1,100個の定量可能なタンパク質のライブラリーが得られた。様々な組織像の発現レベルを比較したとき、179個のマーカーが統計的に有意とみなされた。一連のバイオインフォマティクスの後、8つのタンパク質をさらなる解析のために選択した。本発明者らのマススペクトロメトリーデータにより、DAD1が、正常食道粘膜と比較して、EACで5.08倍多く、BE組織で3.60倍多く発現されることが明らかになった(P＜0.0001)。ISG15は、正常対照と比較して、EACで7.29倍多く、BEで4.35倍多く発現された(P＜0.0001)。S100Pは、正常組織と比較して、EACで5.27倍多く、BEで6.42倍多く発現された(P＜0.0001)。UBE2Nは、隣接する正常扁平上皮と比較して、EACで6.88倍多く発現され(P＜0.0001)、BEで3.59倍多く発現された(P＜0.001)。図4Bのヒートマップは、本発明者らのコホートにおける極めて少ない外れ値を強調している。
(3.1.1.マススペクトロメトリープロテオーム発現定量)
図4Aは、正常扁平上皮食道上皮、バレット食道、及び食道腺癌におけるDAD1、S100P、ISG15、及びUBE2Nの発現を示したグラフを示している(****P＜0.0001、***P＜0.001、**P＜0.01、*P＜0.1)。図4Bは、正常扁平上皮食道上皮、バレット食道、及び食道腺癌におけるタンパク質の発現を示したヒートマップを示している。
表2.正常扁平上皮食道上皮、バレット食道、及び食道腺癌におけるDAD1、S100P、ISG15、及びUBE2Nの発現
Figure 2023530391000003
 an=20
bn=10
cP＜0.0001
(3.1.2.免疫蛍光プロテオーム発現定量)
免疫蛍光を用いて、マススペクトロメトリー解析から得られた定量的データの定性的確認を提供した。DAD1、S100P、ISG15、及びUBE2Nに対する抗体を用いて、タンパク質の発現を、正常組織、バレット食道組織、及び食道腺癌組織で可視化した。予想通り、各々の遺伝子について、蛍光シグナルの増大が、正常組織と比較して、バレット食道組織及び食道腺癌組織で観察された(表3及び図5を参照)。特に、S100Pは、食道腺癌組織と比較して、バレット組織で顕著により高い発現を有し、これは、それが前癌性粘膜から悪性組織像への進行においてより大きな役割を果たすことを示し得る。
本発明者らの結果は、DAD1癌原遺伝子が食道内発症時に上方調節されることを裏付けた。正常食道粘膜における34.167の平均FIUスコアと比較して、EAC試料は、平均すると91.242の蛍光強度単位になり、BE試料は、平均すると87.634 FIUのスコアになった。正常対照試料と比較したBEとEACの両方の平均FIUスコアの差は、p＜0.0001を有していた。この発現パターンは、マススペクトロメトリーによって観察されたヒトFFPE組織のプロテオーム定量と比較して区別できない。
本発明者らの結果は、ISG15癌原遺伝子が食道内発症時に上方調節されることも裏付けた。正常扁平上皮食道上皮における31.626の平均FIUスコアと比較して、EAC試料は、平均すると63.571の蛍光強度単位になり、BE試料は、平均すると71.827のスコアになった。正常対照試料と比較したBEとEACの両方の平均FIUスコアの差は、p＜0.0001を有していた。この発現パターンは、マススペクトロメトリーによって観察されたヒトFFPE組織のプロテオーム定量と同じである。
本発明者らの結果は、S100P癌原遺伝子が食道内発症時に上方調節されることも裏付けた。正常扁平上皮食道粘膜における32.339の平均FIUスコアと比較して、EAC試料は、平均すると110.255の蛍光強度単位になり、BE試料は、平均すると136.331 FIUのスコアになった。正常対照試料と比較したBEとEACの両方の平均FIUスコアの差は、p＜0.0001を有していた。この発現パターンは、マススペクトロメトリーによって観察されたヒトFFPE組織のプロテオーム定量と同じである。特に、S100Pは、食道腺癌組織と比較して、バレット組織で顕著により高い発現を有し、これは、それが前癌性粘膜から悪性組織像への進行においてより大きな役割を果たすことを示し得る。
本発明者らの結果は、UBE2N癌原遺伝子が食道内発症時に上方調節されることも裏付けた。正常扁平上皮食道粘膜における36.201の平均FIUスコアと比較して、EAC試料は、平均すると84.849の蛍光強度単位になり、BE試料は、平均すると72.402 FIUのスコアになった。正常対照試料と比較したBEとEACの両方の平均FIUスコアの差は、p＜0.0001を有していた。この発現パターンは、マススペクトロメトリーによって観察されたヒトFFPE組織のプロテオーム定量と同じである。
表3.免疫蛍光解析によって決定された組織におけるタンパク質発現
Figure 2023530391000004
 *p＜0.0001
(3.5.2.健康な遠位食道対照におけるDAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nの発現)
粘膜又は非疾患遠位食道におけるDAD1、ISG15、S100P、及びUBE2N発現を評価するために、動物モデルを使用した。この解析は、疾患組織で観察される増加発現が異常の結果ではない証拠を提供するために実施した。4匹の異なるユカタンミニブタに、高コレステロール、高フルクトース;ビタミンD欠乏;ビタミンD十分;又はビタミンD補充と分類された食餌を給餌した。4匹の動物からのデータを平均すると、遠位食道上皮において、DAD1は、22.48の平均IFスコアを有し、ISG15は、27.73の平均IFスコアを有し、S100Pは、22.33の平均IFスコアを有し、UBE2Nは、26.65の平均IFスコアを有していた。遠位食道におけるIFスコアは、正常組織試料で以前に観察されたスコアと同程度であり、S100P、DAD1、ISG15、及びUBE2Nのいずれも、正常食道組織でより高くは発現されないことを示した。DAD1は、4匹のブタの遠位食道上皮で観察された発現レベルを合わせた、22.48の平均IFスコアを有していた。本発明者らのヒトモデルにおいて、DAD 1は、EACで91.24、BEで87.63、正常粘膜で34.167の免疫蛍光スコアを受け取った。ISG15は、様々な食餌の4匹全てのブタのFIUを合わせたとき、27.73の平均IFスコアを有していた。本発明者らのヒトFFPE研究において、ISG15の免疫蛍光は、EAC試料で71.83、BE試料で63.57、正常扁平上皮食道上皮で31.626であった。S100Pは、本発明者らのヒト研究のEACでの110.25、BEでの136.33、及び正常扁平上皮食道粘膜での32.34と比較して、本発明者らのブタモデルにおいて22.33 FIUのスコアであった。UBE2Nは、EACでの84.85、BEでの72.40、及び正常ヒト組織での36.20と比較して、26.65 FIUのスコアであった。
(3.5.3. EAC細胞株で達成された遺伝子ノックダウン)
DAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nに特異的なsiRNAを、EAC細胞株におけるDAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nの発現をノックダウンするその能力について解析した。細胞を上記の通りに処理し、タンパク質発現についてウェスタンブロットにより解析した。3連のノックダウン試料の4つのウェスタンブロットを3連の未処理対照の隣で泳動させた。図6に示されているように、siRNAは、DAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nの各々の発現を顕著に阻害した。これらのノックダウンの定量をGAPDHに対して正規化した。4つのマーカーは全て、17kDaに近い分子量を有していた。
(3.5.4. S100P、UBE2N、及びISG15遺伝子ノックダウンはEAC細胞株における細胞増殖を阻害した)
MTT比色アッセイは、ISG15、S100P、及びUBE2Nに対するsiRNAで処理されたEAC細胞の細胞増殖の減少を示した(図7)。S100Pのノックダウンは、食道腺癌細胞株(OE-33)における細胞増殖を低下させるのに最大の効果を有した。UBE2N及びISG15のノックダウンも、未処理の細胞と比較して、細胞増殖の統計的に有意な阻害を示した。陽性対照(GAPDH)のノックダウンは、未処理対照及び陰性対照と比較して、細胞増殖の統計的に有意な低下を有した(P＜0.01)。DAD1のノックダウンは、対照と比較して統計的に有意なより遅い増殖速度をもたらした。
(3.5.5. DAD1ノックダウンはEAC細胞株における遊走を阻害した)
食道内発癌の顕著な特徴のうちの1つは、全身に急速に遊走し、拡散する腺癌細胞の能力である。癌細胞の遊走の阻害は、通常、患者における全生存率の延長をもたらし、癌を限局させ続けるのを助け、所属リンパ節又は遠位臓器への拡散を減速させる。OE-33細胞におけるDAD1、ISG15、S100P、及びUBE2NのsiRNA媒介性ノックダウンを用いて、これらの遺伝子の抑制が未処理対照及び処理対照と比較して細胞遊走を阻害するかどうかを決定した。細胞遊走をスクラッチアッセイを用いてモニタリングした。12-ウェルプレート中の細胞を90％コンフルエンスまで増殖させ、その後、スクラッチを200μLピペット端で細胞に対して縦に入れた。その後、画像を時間0で並びに12及び16時間後に取得して、創傷閉塞の割合を決定した。16時間にわたるより高いパーセンテージのスクラッチ閉塞は、より高い割合の遊走と相関している。表4に示されているように、閉塞の平均パーセンテージ(各々のノックダウンについて、N=3)は、4つの対照群(各々の群について、N=3)と比較して、4つのノックダウンでより低かった。スクラッチ閉塞の減少は、この初期実験で試験された4つの遺伝子のいずれについても、16時間では統計的に有意でなかったが、それでも、これらの結果は、これら4つの遺伝子の阻害が食道腺癌細胞における細胞遊走の速度を減少させ得ることを示唆している。DAD1ノックダウンは、対照及び他の4つのマーカーと比較して最も遅い遊走の速度を達成した。図8及び表4を参照されたい。ISG15及びUBE2Nノックダウンも、対照と比較して、より遅い遊走速度を示した。S100Pノックダウンは、遊走速度に対して最も少ない影響を及ぼし、OE-33腺癌細胞における他の4つの遺伝子ノックダウンと比較して16時間後の創傷閉塞は78.0％であったが、それでも、4つの対照よりも少ない遊走を示した。両方の未処理細胞株(lipofectamineあり又はなし)は、8つの群のうち最も高い割合の遊走を有しており、スクラッチから16時間後、創傷閉塞は、ほぼ完全であった。siNEG対照は、16時間後、39.1％(-DAD1)、73.2％(-ISG15)、78.0％(-S100P)、及び73.6％(-UBE2N)と比較して、94.6％の平均閉塞パーセンテージを有していた。siPOS対照は、89.8％の平均創傷閉塞パーセンテージを有しており、これは、4つのマーカー遺伝子ノックダウンの各々と比較して、より速い遊走の速度であった。
表4.細胞遊走アッセイ結果
Figure 2023530391000005
(3.5.6. ISG15、S100P、又はUBE2NノックダウンはEAC細胞株における細胞傷害性を強化する)
食道腺癌は、癌性細胞が細胞死を引き起こす正常な機構から逃れるのを可能にする回避機構をたびたび発達させる。siRNAを用いて、EAC OE-33細胞におけるDAD1、ISG15、S100P、及びUBE2N発現をノックダウンした。その後、処理された細胞を解析し、ノックダウンが細胞死を増大させるかどうか及び/又は細胞傷害性に対する感受性を増大させるかどうかを決定した。S100P(P＜0.0001)、UBE2N(P＜0.0001)、及びISG15(P＜0.01)のノックダウンは、各々、ノックダウンから48時間後に、本発明者らの陰性対照と比較して、増大した細胞傷害性の割合を示した(図9)。S100P及びUBE2Nのノックダウンは、特に、尋常でない割合の細胞傷害性を誘導した。
(3.5.7. DAD1、ISG15、S100P、又はUBE2Nの遺伝子ノックダウンによって影響を受ける癌及び免疫経路)
形質転換及び腫瘍形成に関与する6つの生物学的経路を代表する84個の遺伝子の下方調節及び過剰発現パターンを定量するQIAGEN製のCancer PathwayFinder PCRアレイを用いて、DAD1、ISG15、S100P、又はUBE2Nが腫瘍形成環境において果たす役割を解析した。DAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nを標的とするsiRNAでトランスフェクトされたOE-33腺癌細胞を使用した。図10A～10Dに示されているように、4つのマーカーのノックダウンは、腫瘍促進因子を下方調節する一方で、腫瘍抑制因子を上方調節するのに強いプラスの効果を有していた。これらのデータは、食道腺癌に関与する遺伝子を同定する際の記載されているマススペクトロメトリー解析法の有用性を示している。
UBE2N siRNAは、十分に記載されている癌経路において、腫瘍ドライバーを下方調節し、18個の増殖遺伝子を含む、42個の腫瘍ドライバーの発現を低下させるのに特に効果的である。逆に、ISG15ノックダウンは、アポトーシスの5つの誘導因子、4つの抗増殖遺伝子、及び2つの転移サプレッサーを含む、11個の腫瘍サプレッサーを上方調節するのに最も効果的であった。42個の腫瘍ドライバーを下方調節する際のUBE2N siRNAの効果及び11個の腫瘍サプレッサーを上方調節する際のISG15 siRNAの効果は、UBE2NノックダウンとISG15ノックダウンがどちらも、本発明者らの処理された細胞株において抗増殖効果を有し、その一方で、細胞傷害性を増大させたという本発明者らの観察を裏付けている。UBE2Nノックダウンは、MyD88を40.73倍下方調節することが分かった。MyD88の阻害は、バレット食道発症におけるCNDP2、DAD1、GPI、ISG15、LTF、S100P、SET、及びUBE2Nの役割を裏付けている47。UBE2Nノックダウンは、Cancer PathwayFinderアレイの遺伝子の51.2％(43/84)に影響を及ぼし、BE/EAS発病におけるこの遺伝子の上流の役割を示している。
EAC細胞株OE-33におけるDAD1及びS100Pのノックダウンは、DNA修復、増殖、解糖(ワールブルグ効果)、血管新生、及び抗アポトーシス因子に関与する腫瘍遺伝子の下方調節を表す好都合な抗癌作用も立証した。DAD1とS100Pのノックダウンは両方とも、3つの抗癌因子:アポトーシス誘導因子、抗増殖調節因子、及び抗転移遺伝子の上方調節を示した。S100Pノックダウンは、このアッセイで定量された腫瘍遺伝子の26.2％(22/84)に対してプラスの効果を有し、BE/EAS発病におけるその役割を裏付けた。S100P siRNAで細胞を処理した後の十分に記載されている腫瘍ドライバーの下方調節は、本発明者らのMTT実験で観察された抗増殖効果を推進し得る。
上記のことに加えて、各々の遺伝子ノックダウン試料における上記の遺伝子発現(RT-PCR)実験において、いくつかの腫瘍サプレッサーが下方調節され、いくつかの腫瘍ドライバーが上方調節されることが観察された。それにもかかわらず、EAC細胞が4つのマーカーの各々の別々のノックダウンを受けたとき、細胞増殖及び遊走は減少し、その一方で、細胞傷害性は増大した。
(4.0.考察)
CNDP2、DAD1、GPI、ISG15、LTF、S100P、SET、及びUBE2Nは、EACを発症するリスクを解析する際の有用な診断を提供する。これらの遺伝子の解析は、個々の対象に基づいて臨床行為を指導することができる情報も提供する。EACの課題のうちの1つは、多くの人々が、癌を発症することなく、BEを発症することである。EASを発症するリスクが最も高い対象を特定することを用いて、より早い段階で悪性形質転換を検出し、転帰を改善することができる。分子診断によって現在提供されている胃食道癌の8つの最も使用されるマーカーと比較して、DAD1、ISG15、S100P、UBE2Nは、遙かにより高いパーセンテージのEACに存在する(表5及び6並びに図11を参照)48-55。それゆえ、これらのマーカーは、病理学的解析及び臨床的患者管理戦略における改善された診断有用性を表す。本発明者らは、DAD1、ISG15、S100P、UBE2Nが癌原遺伝子であることを示した。これらの上方調節は、アポトーシスを低下させ、タンパク質破壊を阻害する一方で、転移を促進することにより、EAC細胞の増殖をもたらす。したがって、これらの遺伝子の発現レベルの解析は、治療的介入の有効な標的としての役割を果たし、これらの腫瘍を標的療法及び化学療法に対して敏感にするのに役立つことができる。
表5.食道腺癌(EAC)腫瘍で過剰発現されるマーカー
Figure 2023530391000006
表6.正常扁平上皮、BE、及びEACにおけるCNDP2、DAD1、GPI、ISG15、LTF、S100P、SET、及びUBE2Nの発現
Figure 2023530391000007
EACは、外科的摘出を除いて、有効な標準治療を欠く致死的疾患であり、その発生率の上昇は、相当な公衆衛生上の問題になっている。それゆえ、新たな薬物標的及び改善された診断法が開発されることが重要である。本明細書に開示される8つのマーカーであるCNDP2、DAD1、GPI、ISG15、LTF、S100P、SET、及びUBE2Nは、BE及びEACの85％～100％で上方調節されており、それらの上方調節を遠位食道粘膜試料で特定する方法は、正常扁平上皮から異形成バレット組織への進行又は該進行のリスクを特定する際及びBEから悪性腺癌病変への進行又は該進行のリスクを特定する際に有用である。
分子腫瘍学の観点から、本発明者らは、発癌性プロテオーム環境を形成し、増殖、浸潤、遊走、転移、及び細胞生存、並びにEACに対してFDAにより承認されている最も一般的な処方されるネオアジュバント薬に対する化学療法抵抗性の増大をもたらす際の開示されているマーカーの相互交差を提案している。これらのマーカーの治療的有用性は、癌原遺伝子ISG15、S100P、及びUBE2Nの発現のsiRNA媒介性ノックダウンを用いて示されている。これらの遺伝子のノックダウンは、未処理の食道腺癌細胞と比較して、細胞増殖の減少をもたらした。S100Pノックダウンは、EAC細胞増殖の最大の減少(P＜0.0001)をもたらし、未処理の対照細胞よりもおおよそ75％少ない割合で増殖した。UBE2N及びISG15ノックダウンも、対照と比較して統計的に有意な増殖の低下を示した。S100P及びUBE2Nのノックダウンは、食道腺癌細胞株OE-33における細胞傷害性の増強ももたらした(P＜0.0001)。DAD1ノックダウンは、G6PD細胞傷害性放出アッセイで細胞死の増大をもたらさなかったが、DAD1ノックダウンは、アポトーシスに対する防御因子としてのその役割のために、アポトーシス圧力(すなわち、化学療法)の存在下で細胞傷害効果を増強することができる。DAD1は、増殖低下又は細胞死誘導にほとんど影響がなかったが、DAD1のノックダウンは、遊走を減速させるのに有効であった。DAD1 siRNAによる細胞の処理は、陰性対照試料における94.6％の創傷閉塞と比較して、16時間後に39.3％しか創傷閉塞を示さなかった。DAD1、ISG15、S100P、及びUBE2Nの各々は、抗発癌の側面に寄与した。したがって、これら4つの遺伝子は、重要な診断マーカー及び治療標的に相当する。
参考文献:
Figure 2023530391000008
Figure 2023530391000009
Figure 2023530391000010
Figure 2023530391000011
Figure 2023530391000012
Figure 2023530391000013
(実施例2.標的実現可能性及び標的化マススペクトロメトリーのためのアッセイ開発)
標的実現可能性のために、及び標的化マススペクトロメトリーのためのアッセイを開発するために、UBE2N、DAD1、ISG15、CNDP2、GPI、SET、LTF、及びS100Pの標的ペプチドを設計、作製、及び評価した。
(UBE2N)
UBE2N(UniProt P61088)標的ペプチドを標的化マススペクトロメトリーの標的実現可能性について評価した。以下の除外基準:メチオニン(M)なし、システイン(C)なし、及びアルギニン(R)又はリジン(K)と、それに続くプロリン(P)なし(すなわち、RP又はKPなし)をインシリコマッピングに使用した。以下の組入れ基準:5～25アミノ酸のペプチド配列長、及び完全トリプシン消化配列のみをインシリコマッピングに使用した。これらの基準に基づいて、UBE2Nに特有である表7のペプチドを選択した。
表7.ユニークなUBE2Nペプチド
Figure 2023530391000014
これらのペプチドのうちの2つを用いたヒト試料中のUBE2Nタンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトルは、図12A～12Bに示されている。これらのスペクトルは、本発明者らがこれらのマーカーを不均一でかつホルマリン固定された標本中で高レベルで検出することができたことを示している。
その後、7つのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床食道腺癌(EAC)組織をスクリーニングした。組換え材料(組換えタンパク質、過剰発現ライセート、又は粗ペプチド)を用いて、FFPE細胞株又は臨床試料中の候補ペプチドをスクリーニングした。トリプシン消化したヒト組換えUBE2Nタンパク質を用いて、SRM開発のための独特なペプチドをスクリーニングした。具体的には、2μgのヒト組換えUBE2Nタンパク質を液体組織バッファーに添加し、20ng/μLの最終濃度のために、0.5μgのトリプシンで、37℃で16時間処理した。反応チューブを95℃で5分間加熱して、トリプシンを不活化した。加水分解後、2μLのUBE2Nトリプシン消化物を、20μLの担体ワーキング溶液(CWS)、5μLのHSM(試料を超えて保持時間を得るために)、及び23μLの0.1％ギ酸と混合し、そのうち10μLをMS解析のために注入した。表8のデータは、この比較的単純なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、2μLのUBE2Nトリプシン消化物を、5μgのパイロコッカス(より複雑なマトリックス中のペプチドの性能を観察するため)、5μLのHSM、及び0.1％ギ酸と50μLの最終容量になるように混合し、そのうち10μLを同様にMS解析のために注入した。表8のデータは、このより複雑なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、表8のデータは、食道腺癌腫瘍試料由来のFFPE組織を含有する非常に複雑なライセート中で観察された強度を示している。
表8.トリプシン消化マッピング
Figure 2023530391000015
タンパク質消化物中のペプチドの検出は、図13A～13Fに示されている。スクリーニングされた6つのユニークなペプチドのうち、3つのペプチドは、スクリーニングされた7つ全てのFFPE ECA組織で観察された。ペプチド
Figure 2023530391000016
 は、組換えタンパク質及びFFPE ECA組織において、高い強度及び一貫性のあるプロダクトイオン比を示した。
(DAD1)
DAD1(UniProt P61803)標的ペプチドを標的化マススペクトロメトリーの標的実現可能性について評価した。以下の除外基準:メチオニン(M)なし、システイン(C)なし、及びアルギニン(R)又はリジン(K)と、それに続くプロリン(P)なし(すなわち、RP又はKPなし)をインシリコマッピングに使用した。以下の組入れ基準:5～25アミノ酸のペプチド配列長、及び完全トリプシン消化配列のみをインシリコマッピングに使用した。これらの基準に基づいて、DAD1に特有である表9のペプチドを選択した。
表9.ユニークなDAD1ペプチド
Figure 2023530391000017
これらのペプチドを用いたヒト試料中のDAD1タンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトルは、図14A～14Cに示されている。これらのスペクトルは、本発明者らがこれらのマーカーを不均一でかつホルマリン固定された標本中で高レベルで検出することができたことを示している。
その後、7つのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床食道腺癌(EAC)組織をスクリーニングした。組換え材料(組換えタンパク質、過剰発現ライセート、又は粗ペプチド)を用いて、FFPE細胞株又は臨床試料中の候補ペプチドをスクリーニングした。トリプシン消化したヒト組換えDAD1タンパク質を用いて、SRM開発のための独特なペプチドをスクリーニングした。具体的には、2μgのヒト組換えDAD1タンパク質を液体組織バッファーに添加し、20ng/μLの最終濃度のために、0.5μgのトリプシンで、37℃で16時間処理した。反応チューブを95℃で5分間加熱して、トリプシンを不活化した。加水分解後、2μLのDAD1トリプシン消化物を、20μLの担体ワーキング溶液(CWS)、5μLのHSM(試料を超えて保持時間を得るために)、及び23μLの0.1％ギ酸と混合し、そのうち10μLをMS解析のために注入した。表10のデータは、この比較的単純なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、2μLのDAD1トリプシン消化物を、5μgのパイロコッカス(より複雑なマトリックス中のペプチドの性能を観察するため)、5μLのHSM、及び0.1％ギ酸と50μLの最終容量になるように混合し、そのうち10μLを同様にMS解析のために注入した。表10のデータは、このより複雑なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、表10のデータは、食道腺癌腫瘍試料由来のFFPE組織を含有する非常に複雑なライセート中で観察された強度を示している。
表10.トリプシン消化マッピング
Figure 2023530391000018
タンパク質消化物中のペプチドの検出は、図15A～15Cに示されている。スクリーニングされた3つのユニークなペプチドのうち、2つのペプチドが少なくとも1つのFFPE ECA組織で観察された。ペプチド
Figure 2023530391000019
 は、組換えタンパク質及びFFPE ECA組織において、高い強度及び一貫性のあるプロダクトイオン比を示した。
(ISG15)
ISG15(UniProt P05161)標的ペプチドを標的化マススペクトロメトリーの標的実現可能性について評価した。以下の除外基準:メチオニン(M)なし、システイン(C)なし、及びアルギニン(R)又はリジン(K)と、それに続くプロリン(P)なし(すなわち、RP又はKPなし)をインシリコマッピングに使用した。以下の組入れ基準:5～25アミノ酸のペプチド配列長、及び完全トリプシン消化配列のみをインシリコマッピングに使用した。これらの基準に基づいて、ISG15に特有である表11のペプチドを選択した。
表11.ユニークなISG15ペプチド
Figure 2023530391000020
これらのペプチドのうちの2つを用いたヒト試料中のISG15タンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトルは、図16A～16Bに示されている。これらのスペクトルは、本発明者らがこれらのマーカーを不均一でかつホルマリン固定された標本中で高レベルで検出することができたことを示している。
その後、7つのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床食道腺癌(EAC)組織をスクリーニングした。組換え材料(組換えタンパク質、過剰発現ライセート、又は粗ペプチド)を用いて、FFPE細胞株又は臨床試料中の候補ペプチドをスクリーニングした。トリプシン消化したヒト組換えISG15タンパク質を用いて、SRM開発のための独特なペプチドをスクリーニングした。具体的には、2μgのヒト組換えISG15タンパク質を液体組織バッファーに添加し、20ng/μLの最終濃度のために、0.5μgのトリプシンで、37℃で16時間処理した。反応チューブを95℃で5分間加熱して、トリプシンを不活化した。加水分解後、2μLのISG15トリプシン消化物を、20μLの担体ワーキング溶液(CWS)、5μLのHSM(試料を超えて保持時間を得るために)、及び23μLの0.1％ギ酸と混合し、そのうち10μLをMS解析のために注入した。表12のデータは、この比較的単純なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、2μLのISG15トリプシン消化物を、5μgのパイロコッカス(より複雑なマトリックス中のペプチドの性能を観察するため)、5μLのHSM、及び0.1％ギ酸と50μLの最終容量になるように混合し、そのうち10μLを同様にMS解析のために注入した。表12のデータは、このより複雑なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、表12のデータは、食道腺癌腫瘍試料由来のFFPE組織を含有する非常に複雑なライセート中で観察された強度を示している。
表12.トリプシン消化マッピング
Figure 2023530391000021
タンパク質消化物中のペプチドの検出は、図17A～17Gに示されている。スクリーニングされた7つのユニークなペプチドのうち、2つのペプチドが少なくとも1つのFFPE ECA組織で観察された。ペプチド
Figure 2023530391000022
 は、組換えタンパク質及びFFPE ECA組織において、高い強度及び一貫性のあるプロダクトイオン比を示した。
(CNDP2)
CNDP2(UniProt Q96KP4)標的ペプチドを標的化マススペクトロメトリーの標的実現可能性について評価した。以下の除外基準:メチオニン(M)なし、システイン(C)なし、及びアルギニン(R)又はリジン(K)と、それに続くプロリン(P)なし(すなわち、RP又はKPなし)をインシリコマッピングに使用した。以下の組入れ基準:5～25アミノ酸のペプチド配列長、及び完全トリプシン消化配列のみをインシリコマッピングに使用した。これらの基準に基づいて、CNDP2に特有である表11のペプチドを選択した。
表11.ユニークなCNDP2ペプチド
Figure 2023530391000023
これらのペプチドのうちの1つを用いたヒト試料中のCNDP2タンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトルは、図18に示されている。これらのスペクトルは、本発明者らがこれらのマーカーを不均一でかつホルマリン固定された標本中で高レベルで検出することができたことを示している。
その後、7つのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床食道腺癌(EAC)組織をスクリーニングした。組換え材料(組換えタンパク質、過剰発現ライセート、又は粗ペプチド)を用いて、FFPE細胞株又は臨床試料中の候補ペプチドをスクリーニングした。トリプシン消化したヒト組換えCNDP2タンパク質を用いて、SRM開発のための独特なペプチドをスクリーニングした。具体的には、2μgのヒト組換えCNDP2タンパク質を液体組織バッファーに添加し、20ng/μLの最終濃度のために、0.5μgのトリプシンで、37℃で16時間処理した。反応チューブを95℃で5分間加熱して、トリプシンを不活化した。加水分解後、2μLのCNDP2トリプシン消化物を、20μLの担体ワーキング溶液(CWS)、5μLのHSM(試料を超えて保持時間を得るために)、及び23μLの0.1％ギ酸と混合し、そのうち10μLをMS解析のために注入した。表14のデータは、この比較的単純なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、2μLのCNDP2トリプシン消化物を、5μgのパイロコッカス(より複雑なマトリックス中のペプチドの性能を観察するため)、5μLのHSM、及び0.1％ギ酸と50μLの最終容量になるように混合し、そのうち10μLを同様にMS解析のために注入した。表14のデータは、このより複雑なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、表14のデータは、食道腺癌腫瘍試料由来のFFPE組織を含有する非常に複雑なライセート中で観察された強度を示している。
表14.トリプシン消化マッピング
Figure 2023530391000024
タンパク質消化物中のペプチドの検出は、図19A～19Nに示されている。スクリーニングされた17個のユニークなペプチドのうち、10個のペプチドが少なくとも1つのFFPE ECA組織で観察された。ペプチド
Figure 2023530391000025
 は、組換えタンパク質及びFFPE ECA組織において、高い強度及び一貫性のあるプロダクトイオン比を示した。
(GPI)
GPI(UniProt P06744)標的ペプチドを標的化マススペクトロメトリーの標的実現可能性について評価した。以下の除外基準:メチオニン(M)なし、システイン(C)なし、及びアルギニン(R)又はリジン(K)と、それに続くプロリン(P)なし(すなわち、RP又はKPなし)をインシリコマッピングに使用した。以下の組入れ基準:5～25アミノ酸のペプチド配列長、及び完全トリプシン消化配列のみをインシリコマッピングに使用した。これらの基準に基づいて、GPIに特有である表13のペプチドを選択した。全15個のペプチドがGPIの全てのアイソフォームで共通している。
表13.ユニークなGPIペプチド
Figure 2023530391000026
これらのペプチドのうちの2つを用いたヒト試料中のGPIタンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトルは、図20A～20Bに示されている。これらのスペクトルは、本発明者らがこれらのマーカーを不均一でかつホルマリン固定された標本中で高レベルで検出することができたことを示している。
その後、7つのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床食道腺癌(EAC)組織をスクリーニングした。組換え材料(組換えタンパク質、過剰発現ライセート、又は粗ペプチド)を用いて、FFPE細胞株又は臨床試料中の候補ペプチドをスクリーニングした。トリプシン消化したヒト組換えGPIタンパク質を用いて、SRM開発のための独特なペプチドをスクリーニングした。具体的には、2μgのヒト組換えGPIタンパク質を液体組織バッファーに添加し、20ng/μLの最終濃度のために、0.5μgのトリプシンで、37℃で16時間処理した。反応チューブを95℃で5分間加熱して、トリプシンを不活化した。加水分解後、2μLのGPIトリプシン消化物を、20μLの担体ワーキング溶液(CWS)、5μLのHSM(試料を超えて保持時間を得るために)、及び23μLの0.1％ギ酸と混合し、そのうち10μLをMS解析のために注入した。表16のデータは、この比較的単純なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、2μLのGPIトリプシン消化物を、5μgのパイロコッカス(より複雑なマトリックス中のペプチドの性能を観察するため)、5μLのHSM、及び0.1％ギ酸と50μLの最終容量になるように混合し、そのうち10μLを同様にMS解析のために注入した。表16のデータは、このより複雑なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、表16のデータは、食道腺癌腫瘍試料由来のFFPE組織を含有する非常に複雑なライセート中で観察された強度を示している。
表16.トリプシン消化マッピング
Figure 2023530391000027
タンパク質消化物中のペプチドの検出は、図21A～21Fに示されている。スクリーニングされた15個のユニークなペプチドのうち、6つのペプチドがスクリーニングされた全てのFFPE ECA組織で観察された。ペプチド
Figure 2023530391000028
 は、組換えタンパク質及びFFPE ECA組織において、高い強度及び一貫性のあるプロダクトイオン比を示した。
(SET)
SET(UniProt Q01105)標的ペプチドを標的化マススペクトロメトリーの標的実現可能性について評価した。以下の除外基準:メチオニン(M)なし、システイン(C)なし、及びアルギニン(R)又はリジン(K)と、それに続くプロリン(P)なし(すなわち、RP又はKPなし)をインシリコマッピングに使用した。以下の組入れ基準:5～25アミノ酸のペプチド配列長、及び完全トリプシン消化配列のみをインシリコマッピングに使用した。これらの基準に基づいて、SETに特有である表17のペプチドを選択した。
表17.ユニークなSETペプチド
Figure 2023530391000029
これらのペプチドを用いたヒト試料中のSETタンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトルは、図22A～22Bに示されている。これらのスペクトルは、本発明者らがこれらのマーカーを不均一でかつホルマリン固定された標本中で高レベルで検出することができたことを示している。
その後、7つのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床食道腺癌(EAC)組織をスクリーニングした。組換え材料(組換えタンパク質、過剰発現ライセート、又は粗ペプチド)を用いて、FFPE細胞株又は臨床試料中の候補ペプチドをスクリーニングした。トリプシン消化したヒト組換えSETタンパク質を用いて、SRM開発のための独特なペプチドをスクリーニングした。具体的には、2μgのヒト組換えSETタンパク質を液体組織バッファーに添加し、20ng/μLの最終濃度のために、0.5μgのトリプシンで、37℃で16時間処理した。反応チューブを95℃で5分間加熱して、トリプシンを不活化した。加水分解後、2μLのSETトリプシン消化物を、20μLの担体ワーキング溶液(CWS)、5μLのHSM(試料を超えて保持時間を得るために)、及び23μLの0.1％ギ酸と混合し、そのうち10μLをMS解析のために注入した。表18のデータは、この比較的単純なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、2μLのSETトリプシン消化物を、5μgのパイロコッカス(より複雑なマトリックス中のペプチドの性能を観察するため)、5μLのHSM、及び0.1％ギ酸と50μLの最終容量になるように混合し、そのうち10μLを同様にMS解析のために注入した。表18のデータは、このより複雑なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、表18のデータは、食道腺癌腫瘍試料由来のFFPE組織を含有する非常に複雑なライセート中で観察された強度を示している。
表18.トリプシン消化マッピング
Figure 2023530391000030
タンパク質消化物中のペプチドの検出は、図23A～23Bに示されている。スクリーニングされた2つのユニークなペプチドのうち、ただ1つのペプチドがFFPE ECA組織で観察された。ペプチド
Figure 2023530391000031
 は、組換えタンパク質及びFFPE ECA組織において、高い強度及び一貫性のあるプロダクトイオン比を示した。
(LTF)
LTF(UniProt P02788)標的ペプチドを標的化マススペクトロメトリーの標的実現可能性について評価した。以下の除外基準:メチオニン(M)なし、システイン(C)なし、及びアルギニン(R)又はリジン(K)と、それに続くプロリン(P)なし(すなわち、RP又はKPなし)をインシリコマッピングに使用した。以下の組入れ基準:5～25アミノ酸のペプチド配列長、及び完全トリプシン消化配列のみをインシリコマッピングに使用した。これらの基準に基づいて、LTFに特有である表19のペプチドを選択した。全16個のペプチドが全てのアイソフォームで共通している。
表19.ユニークなLTFペプチド
Figure 2023530391000032
これらのペプチドのうちの2つを用いたヒト試料中のLTFタンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトルは、図24A～24Bに示されている。これらのスペクトルは、本発明者らがこれらのマーカーを不均一でかつホルマリン固定された標本中で高レベルで検出することができたことを示している。
その後、7つのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床食道腺癌(EAC)組織をスクリーニングした。組換え材料(組換えタンパク質、過剰発現ライセート、又は粗ペプチド)を用いて、FFPE細胞株又は臨床試料中の候補ペプチドをスクリーニングした。トリプシン消化したヒト組換えLTFタンパク質を用いて、SRM開発のための独特なペプチドをスクリーニングした。具体的には、2μgのヒト組換えLTFタンパク質を液体組織バッファーに添加し、20ng/μLの最終濃度のために、0.5μgのトリプシンで、37℃で16時間処理した。反応チューブを95℃で5分間加熱して、トリプシンを不活化した。加水分解後、2μLのLTFトリプシン消化物を、20μLの担体ワーキング溶液(CWS)、5μLのHSM(試料を超えて保持時間を得るために)、及び23μLの0.1％ギ酸と混合し、そのうち10μLをMS解析のために注入した。表20のデータは、この比較的単純なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、2μLのLTFトリプシン消化物を、5μgのパイロコッカス(より複雑なマトリックス中のペプチドの性能を観察するため)、5μLのHSM、及び0.1％ギ酸と50μLの最終容量になるように混合し、そのうち10μLを同様にMS解析のために注入した。表20のデータは、このより複雑なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、表20のデータは、食道腺癌腫瘍試料由来のFFPE組織を含有する非常に複雑なライセート中で観察された強度を示している。
表18.トリプシン消化マッピング
Figure 2023530391000033
タンパク質消化物中のペプチドの検出は、図25A～25Mに示されている。スクリーニングされた16個のユニークなペプチドのうち、10個のペプチドが少なくとも1つのFFPE ECA組織で観察された。ペプチド
Figure 2023530391000034
 は、組換えタンパク質及びFFPE ECA組織において、高い強度及び一貫性のあるプロダクトイオン比を示した。
(S100P)
S100P(UniProt P25815)標的ペプチドを標的化マススペクトロメトリーの標的実現可能性について評価した。以下の除外基準:メチオニン(M)なし、システイン(C)なし、及びアルギニン(R)又はリジン(K)と、それに続くプロリン(P)なし(すなわち、RP又はKPなし)をインシリコマッピングに使用した。以下の組入れ基準:5～25アミノ酸のペプチド配列長、及び完全トリプシン消化配列のみをインシリコマッピングに使用した。これらの基準に基づいて、S100Pに特有である表21のペプチドを選択した。
表21.ユニークなS100Pペプチド
Figure 2023530391000035
これらのペプチドのうちの2つを用いたヒト試料中のS100Pタンパク質の代表的なタンデムマススペクトロメトリースペクトルは、図26A～26Bに示されている。これらのスペクトルは、本発明者らがこれらのマーカーを不均一でかつホルマリン固定された標本中で高レベルで検出することができたことを示している。
その後、7つのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)臨床食道腺癌(EAC)組織をスクリーニングした。組換え材料(組換えタンパク質、過剰発現ライセート、又は粗ペプチド)を用いて、FFPE細胞株又は臨床試料中の候補ペプチドをスクリーニングした。トリプシン消化したヒト組換えS100Pタンパク質を用いて、SRM開発のための独特なペプチドをスクリーニングした。具体的には、2μgのヒト組換えS100Pタンパク質を液体組織バッファーに添加し、20ng/μLの最終濃度のために、0.5μgのトリプシンで、37℃で16時間処理した。反応チューブを95℃で5分間加熱して、トリプシンを不活化した。加水分解後、2μLのS100Pトリプシン消化物を、20μLの担体ワーキング溶液(CWS)、5μLのHSM(試料を超えて保持時間を得るために)、及び23μLの0.1％ギ酸と混合し、そのうち10μLをMS解析のために注入した。表22のデータは、この比較的単純なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、2μLのS100Pトリプシン消化物を、5μgのパイロコッカス(より複雑なマトリックス中のペプチドの性能を観察するため)、5μLのHSM、及び0.1％ギ酸と50μLの最終容量になるように混合し、そのうち10μLを同様にMS解析のために注入した。表22のデータは、このより複雑なマトリックス内のMS解析で観察された強度を示している。さらに、表22のデータは、食道腺癌腫瘍試料由来のFFPE組織を含有する非常に複雑なライセート中で観察された強度を示している。
表22.トリプシン消化マッピング
Figure 2023530391000036
タンパク質消化物中のペプチドの検出は、図27A～27Bに示されている。両方のペプチドがスクリーニングされた全てのFFPE ECA組織で観察された。ペプチド
Figure 2023530391000037
 は、組換えタンパク質及びFFPE ECA組織において、高い強度及び一貫性のあるプロダクトイオン比を示した。
(実施例3.標的化マススペクトロメトリーによるバレット食道発症及び食道腺癌進行の確認)
(材料及び方法)
(1.試薬及び溶液の調製)
1.1. 150mLの蒸留水を850mLのエタノール/試薬アルコールに添加することにより、1リットルの85％エタノール/試薬アルコールを調製する。
1.2. 300mLの蒸留水を700mLのエタノール/試薬アルコールに添加することにより、1リットルの70％エタノール/試薬アルコールを調製する。
1.3.処理されるスライドの数に十分なマイヤーヘマトキシリン染色液のアリコートを50mLチューブ中に調製する。チューブをホイルに包むか、又は使用しないときに、それを引き出しもしくはキャビネットの内側に入れることにより、遮光する。
(2.スライド及び処理の準備)
2.1.処理されるスライドの数に対して適切な容器及び試薬の容量については、下の表を参照されたい。
2.2.スライド1枚当たり最低5mLの試薬が提案される。追加のバッチのスライドを処理するとき、溶液の新鮮なアリコートを使用する。
Figure 2023530391000038
2.3.適切な容器を次のようにラベルし、充填する:
Figure 2023530391000039
2.4.ラベル処理されるスライドを収集する。
2.5.処理される切削組織切片を有するスライドを58℃～61℃のオーブン中のアルミニウムスライドトレー上に30～60分間置いて、パラフィンを融解させ、かつ該組織切片を該スライドに付着させる。オーブン温度、日付、インキュベーションの時間を記録する。
(3.脱パラフィン処理及び再水和)
注意1:ガラスのコプリンジャー又は緑色の染色皿などの、キシレンに適した容器を使用する。ポリスチレンのペトリ皿は、使用しない。キシレンを使用する場合、この試薬を用いる工程は全て、ヒュームフード内で実施する。
注意2:複数の組織のセットを処理している場合、試薬を各々の組織のセットの間に交換する。容器を点検して、試薬を交換しているときに、組織の残屑又は残渣が容器中に残っていないことを確認する。必要な場合、容器を100％エタノール/試薬アルコールですすいで、残屑を除去し、容器を風乾させる。
3.1.スライドを下記の各々の工程の始めから終わりまで順次処理する。ピンセット又はスライドホルダーを用いて、スライドを連続する容器に移す。余分な液体は、スライドを容器の側面に触れさせることにより、及び/又はスライドの端をきれいなペーパータオルに触れさせることにより除去することができる。
3.2.スライドを新しい容器中に入れたとき、それを溶液中で上下に3～4回動かして、試薬交換を促進する。インキュベーションの最後に、スライドを再び上下に動かし、その後、水気を切る。注意:切片が付着していないという理由で、これが可能でない場合、スライドを処理のためにペトリ皿に移す(キシレンをポリスチレンのペトリ皿で使用することはできない)。
3.2.1.スライドをキシレン又はSubX #1の容器中に5分間入れる。
3.2.2.スライドをキシレン又はSubX #2の容器に5分間移す。
3.2.3.スライドを100％エタノール#1の容器に5分間移す。
3.2.4.スライドを100％エタノール#2の容器に5分間移す。
3.2.5.スライドを85％エタノールの容器に1分間移す。
3.2.6.スライドを70％エタノールの容器に1分間移す。
3.2.7.スライドを蒸留水#1の容器に1分間移す。
注意3:染色皿を使用する場合、蒸留水#1によるすすぎの後に、スライドをスライドホルダーから取り出した後、スライドホルダーを100％エタノール/試薬アルコールの容器中ですすぎ、追加のスライドの処理に使用する前に、風乾させる。
(4.マイヤーヘマトキシリン染色液)
4.1 マイヤーヘマトキシリン染色液の適用は、スライドをペトリ皿の中に平らに置いて行うことができる。しかしながら、蒸留水及び段階的アルコール工程は、処理されている特定のセットのスライドの数に適切なものが何であるかに応じて、ペトリ皿、コプリンジャー、スライドマイヤー、又は染色皿のいずれかで行うことができる。
4.2.緩くなった組織切片を有するスライドを、全ての工程について、ペトリ皿の中で平らにして処理するので、緩んだ組織を制御し、損失を低下させることができる。
4.3.緩んだ組織の全ての観察を記録する。
4.4.ピンセットを用いて、ペーパータオルの上でスライドの水気を切って、余分な水を除去し、その後、スライドをきれいなペトリ皿の中で平らに置く。
4.5.組織のみを完全に覆うように、十分なマイヤーヘマトキシリン染色液をスライド上にピペッティングする。大部分の組織切片を覆うのに、約200μlの染色液で十分であるが、より大きい容量が大きい組織切片に必要とされる場合がある。
4.6.均一に染色するために、皿を穏やかに傾けて、液体を組織の上で動き回らせる。目盛り付きのタイマーを用いて、室温で3分間インキュベートする。
4.7.ピンセットを用いて、スライドをペトリ皿から取り出し、ペーパータオルの上でマイヤーヘマトキシリンを切る。或いは、染色液が組織から抜けるようにペトリ皿を傾け、ピペットで染色液を除去する。
4.8.ペトリ皿の中で処理を継続する場合:
4.8.1.ピンセットを用いて、スライドを皿の中で平らに置く。
4.8.2.スライドを完全に覆うように、蒸留水#2をペトリ皿に注意深く添加する。注意:水は、組織の上に直接添加するのではなく、水の流れをスライドの端に向ける。
4.8.3.スライドを蒸留水#2中で30秒間すすぐ。蒸留水によるすすぎを最低2回繰り返す。水が透き通っていない場合、再びすすいで、余分な色素を除去する。
4.8.4.ピンセットを用いて、スライドをペトリ皿から取り出し、Teflonのスライドラック中に真っ直ぐ立てて置き、室温で一晩(16～24時間)風乾させる。
4.9.コプリンジャー、スライドメーラー、又は染色皿の中で処理を継続する場合:
4.9.1.ピンセットを用いて、スライドを容器の中に入れる。
4.9.2.スライドを蒸留水#2中で30秒間すすぐ。蒸留水によるすすぎを最低2回繰り返す。水が透き通っていない場合、再びすすいで、余分な色素を除去する。
4.9.3.ピンセットを用いて、スライドを容器から取り出し、Teflonのスライドラック中に真っ直ぐ立てて置き、室温で一晩(16～24時間)風乾させる。
4.9.4.スライドを点検して、パラフィンが完全に除去されていることを確認する。
4.9.5.パラフィンの全てが除去されていない場合、工程3.2.1～3.2.4のみに従うことにより、スライドをSub-X及び100％エタノールに通して再処理し、その後、風乾させる。パラフィンがまだ残っている場合、キシレンを用いて、工程3.2.1～3.2.2を繰り返し、その後、工程3.2.3及び3.2.4のみを続け、その後、風乾させる。
4.10.スライドが完全に乾燥したとき、それをスライドボックスに移す。
4.11.スライドを室温で保存した後、スライド画像を文書作成用にスキャンする。
(レーザー顕微解剖を用いる標的化試料回収)
(6.顕微解剖)
6.1.目的の組織部分を有資格病理学者にマーキングしてもらい、レーザーマイクロダイセクター(CellCut, MMI, Germany)を用いて、レーザー顕微解剖して、組織ペレットを回収した。顕微解剖を、研究標的タンパク質の発現レベルの決定のための少なくとも8mm2の組織材料を提供するスケールで実施した。図29Aは、バレット粘膜の顕微解剖を示した図である。或いは、図29Bに示されているように、針解剖を使用することができる。
6.2.回収された細胞の「解剖容積(mm3)」を、顕微解剖された試料の総面積及びスライド上の試料切片の厚みから推定する。
(マススペクトロメトリー適合ライセート処理)
(7.一般的な情報)
7.1.汚染物を持ち込むことを回避するために、清潔な区域で作業し、清潔な手袋をプロトコル全体を通じて着用することができる。清潔な手袋が外来粒子を持ち込み得る表面に触れるのを回避する。皮膚、毛髪、衣服、ほこり、及び微粒子などの汚染源への試料、試薬、装置、及び補給品の曝露を減らす。
7.2.標準的なLT-MS調製物の反応サイズは、30μLの塩/洗剤を含まないバッファー中、0.12mm3の総顕微解剖容積である。この文書は、標準的な反応サイズのための処理装置を記載しており;反応容積は、細胞対バッファーの比が一定であり続ける限り、拡大縮小することができる。
7.3.各々の反応チューブを試料UIDでラベルする。この手順の実行中、必要とされる全ての情報を記録する。
7.4.トリプシン成分は不安定であり、再構成された試薬の再利用のための特定要件を有する。
7.5.成分:塩及び洗剤を含まないバッファー、トリプシン希釈剤、並びに還元試薬(100mM DTT)を使用期限前に使用し、最大5回、凍結及び解凍することができる。
(8.加熱工程)
8.1.総顕微解剖容積(mm3)を取得する。以下の等式:塩/洗剤を含まないバッファー(μL)＝総顕微解剖容積(mm3)÷0.004μL/mm3を用いて、各々のチューブに添加される塩/洗剤を含まないバッファーの容量を計算する。
8.2.処理前に、チューブの底を細胞ペレットの存在について観察する。この情報を記録する。
8.3.塩/洗剤を含まないバッファーを解凍する。チューブを混合し、その後、短く微量遠心分離して、チューブの底にバッファーを集める。
8.4.適当な容量の塩/洗剤を含まないバッファーをピペッティングして、反応チューブに入れる。チューブを混合して、細胞をバッファーに再懸濁させる。
8.5.未使用のバッファーを保存場所に戻す。
8.6. 1.5mLのスクリューキャップ反応チューブ中に回収された試料については、塩/洗剤を含まないバッファー中に入手された細胞を含有する反応チューブを、95℃(±1℃)に予熱したヒーティングブロックに入れ、タイマーを90分間に設定し、工程8.8に進める。日付、時間、及び温度を記録する。
8.7. 0.65又は0.5mLのPCR反応チューブ中の試料については、軽くボルテックス処理し、その後、チューブを95℃(±1℃)の予熱したサーマルサイクラーブロックに入れ、それらに、ブロック中で可能な限り均等に間隔を空ける。タイマーを90分間に設定し、工程8.8に進む。日付、時間、及び温度を記録する。
8.8. 20分毎に、チューブを取り出し、細胞を覆うように、濃縮しているバッファーを振り落とす。或いは、10,000rcfで5～10秒間、素早く微量遠心分離する。
8.9.細胞をバッファーに穏やかに再懸濁させ、チューブを95℃(±1℃)のヒーティングブロック又はサーマルサイクラーにすぐに戻し入れる。チューブを完全には冷却させない。サーマルサイクラーを使用する場合、全てのチューブを振盪させた後、蓋を閉めて、再びチューブを覆う。
8.11. 90分後、チューブを95℃(±1℃)のヒートブロック又はサーマルサイクラーから取り出し、チューブを、10,000rcfで1分間、微量遠心分離する。日付、時間、及び温度を記録し、いかなるペレットの存在も記入する。
8.11.1.サーマルサイクラーを使用する場合、運転を停止し、サーマルサイクラーの蓋を開けたままにして、冷却する。
8.12.チューブを氷上で1～2分間冷却する。
(9.プール段階)
9.1.複数のチューブを試料用に処理した場合、その試料用のチューブをまとめてプールすることができる。
(10.トリプシン消化)
10.1.消化されたライセート調製物の容量に基づいて、各々の反応チューブに添加されるトリプシンの容量を計算する。0.05μLの容量の1μg/μLトリプシン溶液を全ての1μLの塩/洗剤を含まないバッファーに使用する。情報を記録する。例えば:
Figure 2023530391000040
10.2.処理されている試料の数に必要とされるトリプシンの総量を決定する。
10.3.再構成されたトリプシンの凍結アリコートを使用する場合、部品/ロット番号及び日付情報に加えて、凍結/解凍サイクルの回数を記録する。
10.4.必要な場合、適切な数の20μgバイアルの凍結乾燥酵素を再構成する。
10.4.1.キットの20μlのトリプシン希釈液を各々のトリプシンのバイアルに添加し、その後、トリプシンが溶解するように、バイアルを短く混合する。バイアルを氷上に5分間置き、その後、再び短く混合する。再構成されたトリプシンは、15分以内に使用する。
10.4.2.部品/ロット番号及び日付情報を記録する。
10.4.3.未使用の再構成されたトリプシン溶液を含有するチューブをラベルし、-20℃のフリーザーに保存する。
10.4.4.未使用の溶液は、少なくとも3回の凍結解凍サイクルの間、安定である。
10.5.適切な容量のトリプシン溶液を各々の反応チューブに添加する。混合し、短く微量遠心分離して、溶液を反応チューブの底に集める。
10.6. 1.5mLのスクリューキャップ反応チューブについては、反応チューブを37℃(±1℃)の水浴中に入れ、その後、工程10.9に進む。
10.7. 0.65-又は0.5-mLのPCR反応チューブについては、反応チューブを37℃(±1℃)で加熱するためのサーマルサイクラーを用意する。
10.8.反応チューブを予熱したサーマルサイクラーブロックに入れ、それらに、ブロック中で可能な限り均等に間隔を空ける。蓋を閉めて、チューブを覆い、工程10.9に進む。
10.9.反応チューブを37℃(±1℃)で加熱し;チューブを37℃(±1℃)で置いたときの温度及び時刻を記録する。
10.10.最初の1時間は、20分毎に、チューブを取り出し、10～15秒間、激しくボルテックス処理する。バッファーを、細胞を覆うようにチューブの底に振り落とし、その後、チューブを37℃(±1℃)の水浴又はサーマルサイクラーに戻し入れる。サーマルサイクラーを使用する場合、全てのチューブをボルテックス処理した後、蓋を閉めて、再びチューブを覆う。
10.11. 37℃(±1℃)で一晩(16～18時間)インキュベートし続ける。チューブを水浴又はサーマルサイクラーから取り出した時刻を記録する。
10.12.チューブを、10,000rcfで1分間、微量遠心分離する。いかなるペレットの存在も記入する。
10.13. 1.5mLのスクリューキャップ反応チューブ中に回収された試料については、反応チューブを95℃(±1℃)の予熱したヒートブロックに5分間入れる。日付、時間、及び温度を記録する。
10.14. 0.65-又は0.5-mLのPCR反応チューブ中の試料については、チューブを95℃(±1℃)の予熱したサーマルサイクラーブロックに5分間入れる。日付、時間、及び温度を記録する。
10.15.チューブを、10,000rcfで1分間、微量遠心分離する。いかなるペレットの存在も記入する。
(11.タンパク質決定)
11.1.マイクロBCAアッセイを実施して、タンパク質濃度を決定する。
11.2.還元試薬(DTT)はタンパク質決定を妨害するので、DTTの添加前に、マイクロBCAアッセイをマススペクトロメトリー適合ライセート調製物のアリコートに対して実施する。残りのMSライセート調製物を、タンパク質決定アッセイが完了するまで、-20℃フリーザー中の反応チューブに保存する。
11.3.「タンパク質定量のためのマイクロBCAアッセイ」
11.4.トリプシン補正されたタンパク質濃度及びトリプシン補正された全タンパク質収率を含むまとめの表を作成する。トリプシン補正濃度の結果(μg/μ:)をフォームLM-010.01-F02の「Sample Calculations Workbook.xls」に入力し、工程12に進む。
(還元反応)
12.1.各々の反応チューブに添加される還元試薬(100mM DTT)の容量を、タンパク質決定のためのトリプシンの添加及びアリコートの除去後のMSライセート調製物の最終容量に基づいて計算する。
12.1.1. DTTの最終濃度は10mMでなければならない:
Figure 2023530391000041
12.1.2. 100mM DTTを解凍する。チューブを混合し、その後、短く微量遠心分離して、試薬をチューブの底に集める。
12.1.3.計算された容量の100mM DTTを各々の反応チューブに添加する。混合し、短く微量遠心分離して、溶液を反応チューブの底に集める。
12.1.4. DTTを添加した後の調整容量に基づいて、最終的なタンパク質濃度及び全タンパク質収率を決定する。
12.1.5.未使用の100mM DTTを保存場所に戻す。
12.2. 1.5mLのスクリューキャップ反応チューブ中に回収された試料については、反応チューブを95℃(±1℃)の予熱したヒートブロックに5分間入れる。日付、時間、及び温度を記録する。
12.3. 0.65-又は0.5-mLのPCR反応チューブ中の試料については、チューブを95℃(±1℃)の予熱したサーマルサイクラーブロックに5分間入れる。日付、時間、及び温度を記録する。
12.4.チューブを、10,000rcfで1分間、微量遠心分離する。
12.5.反応チューブを試料UIDでラベルするようにする。MSライセート調製物の反応チューブを、マススペクトロメトリー解析の準備が整うまで、-20℃のフリーザーに保存する。
(13.マススペクトロメーター解析)
13.1.品質管理システムチェック
13.1.1.研究試料解析の前に、いくつかの試料を、品質管理目的のシステムチェックとして、Nano-Flow HPLCを備えたTSQ-Quantivaマススペクトロメーターシステムで泳動して、このプラットフォームがデータ取得に許容できることを確認する。研究試料解析は、以下の試料を用いる良好なシステムチェックQCが完了すると開始される:
Figure 2023530391000042
13.2.定量解析のための試料処理
13.2.1.各々のマススペクトロメトリー適合ライセート調製物のアリコートを0.1％ギ酸で希釈し、重同位体標識内部標準ペプチドのカクテルを添加した。
13.2.2. 10,000×gで10分間の遠心分離工程の後、上清をマススペクトロメーターシステムオートサンプラーチャンバー中の96ウェルプレートの空のウェルに入れた。
13.2.3. 1.0μgの全タンパク質及び5fmolの内部標準ペプチドカクテルを含有する各々の試料の容積を5μL/分の流量でシステムに注入し、ペプチドを0.8μL/分で溶出させた。全ての研究試料を1回の注入で解析した。マススペクトロメーターを、1秒のサイクル時間を用いて、SRMモードで操作した。
13.2.4.アッセイを、アクチン及びチューブリンを内部手続的対照として用いて組織試料でモニタリングして、試料品質並びに解剖の完全性及び有効性を検証した。
13.3.データ解析プロセス
13.3.1. SRMデータを、Thermo Scientific製のXcaliburソフトウェアプログラムを用いて精査し、Pinnacleソフトウェア(Optys Tech;バージョン83)を用いて解析した。各々の試料から取得された個々のデータ点及びマススペクトロメトリーピークをPinnacleソフトウェアでの手作業によるデータの検査によって確認した。正確なピーク積分をプロダクトイオン比の直接の視覚化によって確認した。
13.3.2.全ての分析物の定量的測定を、内在性分析物シグナル対内部標準シグナルの比を計算し、試料中にスパイクされた内部標準の量を乗じることによる、スパイクされた内部標準ペプチドと内在性ペプチドの間のピーク面積(AUC)比較によって決定した。
13.3.3.各々の試料を1.0μgの注入物に対して正規化した。
全分析物(amol/μg)＝[(内在性分析物AUC)/(重い内部標準AUC)*(5fmolの重い内部標準)]/(1.0μg注入物)
例示的な標的化マススペクトロメトリーワークフローは、図28に示されている。
(結果)
正常食道及び食道腺癌FFPE試料を上記のように処理し、試料を、標的化マススペクトロメトリーを(上記の通りに)用いて及び実施例2に記載されているペプチドを用いて、CNDP2、DAD1、GPI、ISG15、LTF、S100P、SET、及びUBE2Nの発現について解析した。表23及び図30A～30Bに示されている結果は、実施例1の発見マススペクトロメトリーを用いて観察されたことを裏付けている。本発明者らは、食道腺癌におけるこれらの新規マーカーの一貫した過剰発現を見出した。標的療法用に承認されている唯一のバイオマーカーHER2が食道腺癌(EAC)腫瘍の18％でしか過剰発現されていないので、これは重要である。対照的に、ISG15は、試験されたEAC腫瘍の90％で過剰発現され、LTFは、試験されたEAC腫瘍の70％で過剰発現され、CNDP2は、試験されたEAC腫瘍の100％で過剰発現され、DAD1は、試験されたEAC腫瘍の70％で過剰発現され、SETは、試験されたEAC腫瘍の90％で過剰発現され、UBE2Nは、試験されたEAC腫瘍の70％で過剰発現され、S100Pは、試験されたEAC腫瘍の90％で過剰発現され、かつGPIは、試験されたEAC腫瘍の60％で過剰発現された。これは、発癌時のこれらのマーカーの一貫した上方調節を裏付けているだけでなく、標的療法によって阻害するための潜在的な新しい標的を明らかにしている。
表23.標的化マススペクトロメトリーの結果－正常対EAC
Figure 2023530391000043
 *発現中央値が正常組織で0である試料のセットについては、平均過剰発現比(腫瘍/正常)が示されている。
表23において、配列番号20に示されるペプチドを用いた標的化マススペクトロメトリーについて、11の正常組織試料のうちの9つは、2,900amol/μg未満であり、11の正常組織試料のうちの2つは、11,195及び14,351amol/μgであった。配列番号31に示されるペプチドを用いた標的化マススペクトロメトリーについて、11の正常組織試料のうちの9つは、2,220amol/μg未満であり、11の正常組織試料のうちの2つは、それぞれ、8,368及び9,534amol/μgであった。配列番号67に示されるペプチドを用いた標的化マススペクトロメトリーについて、11の正常組織試料のうちの9つは、742amol/μg未満であり、11の正常組織試料のうちの2つは、それぞれ、17,849及び73,589amol/μgであった。配列番号68に示されるペプチドを用いた標的化マススペクトロメトリーについて、11の正常組織試料のうちの9つは、1,312amol/μg未満であり、11の正常組織試料のうちの2つは、それぞれ、92,680及び21,546amol/μgであった。配列番号67に示されるペプチドを用いた標的化マススペクトロメトリーについて、10の食道腺癌試料のうちの9つは、2,040amol/μgを上回り、10の食道腺癌試料のうちの1つは、amol/μg単位での定量が0であった。配列番号68に示されるペプチドを用いた標的化マススペクトロメトリーについて、10の食道腺癌試料のうちの9つは、2,695amol/μgを上回り、10の食道腺癌試料のうちの1つは、amol/μg単位での定量が0であった。配列番号7に示されるペプチドを用いた標的化マススペクトロメトリーについて、11の正常組織試料のうちの9つは、2,900amol/μg未満であり、11の正常組織試料のうちの2つは、それぞれ、11,195及び14,351amol/μgであった。配列番号9に示されるペプチドを用いた標的化マススペクトロメトリーについて、11の試料のうちの9つは、1,215amol/μg未満であり、11の試料のうちの2つは、それぞれ、3,946及び4133amol/μgであった。
その後、10年にわたって一度も食道腺癌に進行しなかった対象由来のバレット食道のFFPE試料及び実際に食道腺癌に進行した対象由来のバレット食道のFFPE試料を上記のように処理し、試料を、標的化マススペクトロメトリーを(上記の通りに)用いて及び実施例2に記載されているペプチドを用いて、CNDP2、DAD1、GPI、ISG15、LTF、S100P、SET、及びUBE2Nの発現について解析した。食道腺癌に進行したバレット食道試料に関して、対象は、バレット食道試料を採取してから平均334日(中央値322日、下端30日、上端874日)後に、食道腺癌に進行した。4人は、高悪性度異形成の診断から1年以上後に、食道腺癌を発症し、5人は、高悪性度異形成の診断から1年未満で、上皮性悪性腫瘍を発症した。下の表24及び図31A～31Bに示されている結果は、本発明者らが、バレット食道試料がルーチンのスクリーニングプロトコル時に回収されたバレット組織において悪性形質転換の顕著な特徴を保有するかどうかを決定することができること、及び本発明者らが、バレット食道が食道腺癌に進行するかどうかを予測することができることを示している。
表24.標的化マススペクトロメトリーの結果－非進行性のBE対EACに進行しているBE
Figure 2023530391000044
マーカーのいずれか1つの上方調節又は過剰発現はそれ自体でバレット食道から食道腺癌への進行を予測するものであるが、LTF、ISG15、又はDAD1の上方調節又は過剰発現は、バレット食道から食道腺癌への進行を高度に予測するものである。発見マススペクトロメトリーは、正常食道上皮粘膜と比較したとき、これら3つのマーカーが食道腺癌で一貫して上方調節され、かつ活性が高いことを明らかにした。これは、標的化マススペクトロメトリー法でも確認された。これらのマーカーを、10年間にわたって安定な状態を維持したバレット組織における標的化マススペクトロメトリーで調べたとき、本発明者らは、これらのマーカーの低～無発現を見出した。1年以上の期間をかけて最終的に食道腺癌に進行したバレット組織において、これら3つのマーカーは、一貫して過剰発現されることが分かり、バレット組織が悪性形質転換を経るリスクを評価したときに、高い予測可能性及び感度を示した。正常標本、非進行性バレット食道標本、進行性バレット食道標本、及び食道腺癌標本における発現レベルを調べたとき、これらのマーカーの外れ値は、皆無か又はそれに近かった。
同様に、CNDP2、GPI、又はSETの上方調節又は過剰発現は、バレット食道から食道腺癌への進行を大いに予測するものである。発見マススペクトロメトリーは、正常食道扁平上皮粘膜と比較したとき、これら3つのマーカーが食道腺癌で一貫して上方調節され、かつ活性が高いことを明らかにした。これは、標的化マススペクトロメトリー法でも確認された。わずかな外れ値は存在したが、10年間にわたって悪化した疾患に進行していないバレット組織と比較したとき、生検回収から1年以上で食道腺癌に進行したバレット組織で一貫した過剰発現が観察された。
S100P又はUBE2Nの上方調節又は過剰発現も、バレット食道から食道腺癌への進行を予測するものである。発見マススペクトロメトリーは、正常食道扁平上皮粘膜と比較したとき、これら2つのマーカーが食道腺癌で一貫して過剰発現され、かつ活性が高いことを明らかにした。これは、標的化マススペクトロメトリー法でも確認された。これらのマーカーの高過剰発現は、バレット食道から食道腺癌への進行を予測するものであった。さらに、これらのマーカーの位置が、進行性疾患機序のシグナルを伝達する経路の上流にあるため、これらのマーカーの発現レベルを知ることは、臨床的に有益である。

Claims (118)

  1. 対象の食道腺癌を発症するリスクを評価する方法であって、
    (a)該対象由来の検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定すること(ここで、該1以上のマーカー遺伝子は、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、GPI、及びこれらの任意の組合せ:からなる群から選択される);並びに
    (b)該検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを対照食道組織試料中の該1以上のマーカー遺伝子の発現レベルと比較すること(ここで、該対照食道組織試料と比べた該検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子の1つ又は複数のうちの少なくとも1つの発現の増大は、食道腺癌を発症するリスクの増大を示す)
    :を含む、前記方法。
  2. 前記1以上のマーカー遺伝子がISG15を含む、請求項1記載の方法。
  3. 前記1以上のマーカー遺伝子がLTFを含む、請求項1又は2記載の方法。
  4. 前記1以上のマーカー遺伝子がCNDP2を含む、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  5. 前記1以上のマーカー遺伝子がDAD1を含む、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
  6. 前記1以上のマーカー遺伝子がSETを含む、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記1以上のマーカー遺伝子がUBE2Nを含む、請求項1～6のいずれか一項記載の方法。
  8. 前記1以上のマーカー遺伝子がS100Pを含む、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
  9. 前記1以上のマーカー遺伝子がGPIを含む、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
  10. (I)前記1以上のマーカー遺伝子が、ISG15、LTF、DAD1、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるか;
    (II)該1以上のマーカー遺伝子が、CNDP2、SET、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるか;
    (III)該1以上のマーカー遺伝子が、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるか;
    (IV)該1以上のマーカー遺伝子が、UBE2N、S100P、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるか、又は
    (V)該1以上のマーカー遺伝子が、ISG15、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、GPI、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択される
    :請求項1記載の方法。
  11. 前記対象が胃食道逆流症もしくはバレット食道を有するか、又はそれらを有する疑いがある、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  12. 前記対象がバレット食道を有し、前記検査用食道組織試料がバレット食道組織試料であり、前記方法がバレット食道から食道腺癌に進行するリスクを評価する、請求項11記載の方法。
  13. 前記対象がヒトである、請求項1～12のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記検査用食道組織試料が単離された食道組織試料を含む、請求項1～13のいずれか一項記載の方法。
  15. 前記検査用食道組織試料が生検試料を含む、請求項1～14のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記検査用食道組織試料が、新鮮な試料、凍結試料、保存試料、ホルマリン固定試料、又はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料を含む、請求項1～15のいずれか一項記載の方法。
  17. 前記検査用食道試料が顕微解剖試料を含む、前記請求項1～16のいずれか一項記載の方法。
  18. 前記検査用食道組織試料が粘膜試料又はバレット食道粘膜試料を含む、請求項1～17のいずれか一項記載の方法。
  19. 前記検査用食道組織試料が非粘膜組織から分離されている粘膜試料又はバレット食道粘膜試料を含み、ここで、該検査用食道組織試料が正常粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料を含むか、又は該検査用食道組織試料が非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料を含む、請求項1～18のいずれか一項記載の方法。
  20. 前記検査用食道組織試料が非粘膜組織から分離されているホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)粘膜試料又はFFPEバレット食道粘膜試料を含み、ここで、該検査用食道組織試料が正常粘膜組織から分離されているFFPEバレット食道粘膜試料を含むか、又は該検査用食道組織試料が非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されているFFPEバレット食道粘膜試料を含む、請求項19記載の方法。
  21. 工程(a)の前に、前記検査用食道組織試料から粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織から分離されている検査用食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ前記1以上のマーカー遺伝子の発現レベルが該検査用食道粘膜試料中で決定されるか、
    工程(a)の前に、該検査用食道組織試料からバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、正常粘膜組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ該1以上のマーカー遺伝子の発現レベルが該検査用バレット食道粘膜試料中で決定されるか、又は
    工程(a)の前に、該検査用食道組織試料からバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ該1以上のマーカー遺伝子の発現レベルが該検査用バレット食道粘膜試料中で決定される、
    請求項1～20のいずれか一項記載の方法。
  22. 粘膜組織を選択的に単離する工程が顕微解剖を含む、請求項21記載の方法。
  23. 前記検査用食道組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である、請求項21又は22記載の方法。
  24. 前記対照食道組織試料が正常食道粘膜を含む、請求項1～23のいずれか一項記載の方法。
  25. 前記対照食道組織試料が前記対象に由来するものである、請求項1～24のいずれか一項記載の方法。
  26. 前記対照食道組織試料が、胃食道逆流症、バレット食道、又は食道腺癌を有さない1以上の対照対象に由来するものである、請求項1～24のいずれか一項記載の方法。
  27. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、該1以上のマーカー遺伝子によってコードされたメッセンジャーRNA(mRNA)の発現を測定するためのアッセイを実施することを含む、請求項1～26のいずれか一項記載の方法。
  28. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、該1以上のマーカー遺伝子によってコードされたタンパク質の発現を測定するためのアッセイを実施することを含む、請求項1～27のいずれか一項記載の方法。
  29. 前記アッセイが、マススペクトロメトリーアッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、アルファLISAアッセイ、又は酵素結合免疫吸収スポット(ELISpot)アッセイを含む、請求項28記載の方法。
  30. 前記アッセイが前記マススペクトロメトリーアッセイを含む、請求項29記載の方法。
  31. 前記検査用食道組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料であり、前記方法が、前記マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、該FFPE試料を処理して、ホルマリン架橋を無効にすることをさらに含み、任意に、ここで、該処理が洗剤を含まないバッファー中で該FFPE試料を加熱することを含む、請求項30記載の方法。
  32. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、前記マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、該検査用食道組織試料を1以上のプロテイナーゼで消化することを含む、請求項30記載の方法。
  33. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、前記マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、該FFPE試料を処理して、ホルマリン架橋を無効にし、その後、該検査用食道組織試料を1以上のプロテイナーゼで消化することを含む、請求項31記載の方法。
  34. 前記1以上のプロテイナーゼがトリプシンを含む、請求項32又は33記載の方法。
  35. 前記マススペクトロメトリーアッセイが標的化マススペクトロメトリーアッセイを含む、請求項30～34のいずれか一項記載の方法。
  36. 前記マススペクトロメトリーアッセイがトリプル四重極マススペクトロメーターで行われる、請求項30～35のいずれか一項記載の方法。
  37. 前記1以上のマーカー遺伝子がISG15を含み、ISG15の発現レベルを決定することが配列番号11又は配列番号12に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項30～36のいずれか一項記載の方法。
  38. 前記1以上のマーカー遺伝子がLTFを含み、LTFの発現レベルを決定することが配列番号54又は配列番号58に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項30～37のいずれか一項記載の方法。
  39. 前記1以上のマーカー遺伝子がCNDP2を含み、CNDP2の発現レベルを決定することが配列番号20又は配列番号31に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項30～38のいずれか一項記載の方法。
  40. 前記1以上のマーカー遺伝子がDAD1を含み、DAD1の発現レベルを決定することが配列番号7又は配列番号9に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項30～39のいずれか一項記載の方法。
  41. 前記1以上のマーカー遺伝子がSETを含み、SETの発現レベルを決定することが配列番号50に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項30～40のいずれか一項記載の方法。
  42. 前記1以上のマーカー遺伝子がUBE2Nを含み、UBE2Nの発現レベルを決定することが配列番号1又は配列番号5に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項30～41のいずれか一項記載の方法。
  43. 前記1以上のマーカー遺伝子がS100Pを含み、S100Pの発現レベルを決定することが配列番号67又は配列番号68に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項30～42のいずれか一項記載の方法。
  44. 前記1以上のマーカー遺伝子がGPIを含み、GPIの発現レベルを決定することが配列番号35又は配列番号39に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項30～43のいずれか一項記載の方法。
  45. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの2つ以上の発現レベルを決定することを含む、請求項1～44のいずれか一項記載の方法。
  46. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの3つ以上の発現レベルを決定することを含む、請求項1～45のいずれか一項記載の方法。
  47. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの4つ以上の発現レベルを決定することを含む、請求項1～46のいずれか一項記載の方法。
  48. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの5つ以上の発現レベルを決定することを含む、請求項1～47のいずれか一項記載の方法。
  49. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの6つ以上の発現レベルを決定することを含む、請求項1～48のいずれか一項記載の方法。
  50. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの7つ以上の発現レベルを決定することを含む、請求項1～49のいずれか一項記載の方法。
  51. 前記検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIの発現レベルを決定することを含む、請求項1～50のいずれか一項記載の方法。
  52. 前記対照食道組織試料と比べた前記検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子のうちの1つ又は複数の大部分の発現の増大が食道腺癌を発症するリスクの増大を示す、請求項1～51のいずれか一項記載の方法。
  53. 前記対照食道組織試料と比べた前記検査用食道組織試料中のマーカー遺伝子のうちの1つ又は複数の各々の発現の増大が食道腺癌を発症するリスクの増大を示す、請求項1～52のいずれか一項記載の方法。
  54. 前記対象がヒトであり、かつバレット食道を有し、前記方法がバレット食道から食道腺癌に進行するリスクを評価し、
    ここで、前記検査用食道組織試料が単離されたバレット食道粘膜試料を含み、前記対照食道組織試料が正常食道粘膜を含み、
    ここで、該検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが該検査用食道組織試料をトリプシンで消化し、その後、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施して、該1以上のマーカー遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を測定することを含み、
    ここで、該検査用食道組織試料中の1以上のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIの発現レベルを決定することを含み、かつここで:
    (I)ISG15の発現レベルを決定することが配列番号11又は配列番号12に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (II)LTFの発現レベルを決定することが配列番号54又は配列番号58に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (III)CNDP2の発現レベルを決定することが配列番号20又は配列番号31に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (IV)DAD1の発現レベルを決定することが配列番号7又は配列番号9に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (V)SETの発現レベルを決定することが配列番号50に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (VI)UBE2Nの発現レベルを決定することが配列番号1又は配列番号5に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (VII)S100Pの発現レベルを決定することが配列番号67又は配列番号68に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;かつ
    (VIII)GPIの発現レベルを決定することが配列番号35又は配列番号39に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、
    請求項1～53のいずれか一項記載の方法。
  55. 前記検査用食道組織試料が非粘膜組織から及び正常粘膜組織から分離されているホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)バレット食道粘膜試料を含み、
    ここで、前記方法がバレット食道粘膜組織を顕微解剖によって該検査用食道組織試料から選択的に単離して、非粘膜組織から及び正常粘膜組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生し、その後、該検査用バレット食道粘膜試料を消化前に処理して、ホルマリン架橋を無効にすることをさらに含む、請求項54記載の方法。
  56. 対象における1以上の食道腺癌リスク因子の発現を決定する方法であって、該対象から得られた検査用食道組織試料中の該1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することを含み、ここで、該1以上の食道腺癌リスク因子が、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの1つ又は複数を含む、前記方法。
  57. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを対照食道組織試料中の該1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルと比較することをさらに含む、請求項56記載の方法。
  58. (I)前記1以上の食道腺癌リスク因子が、ISG15、LTF、及びDAD1のうちの1つもしくは複数を含むか;
    (II)該1以上の食道腺癌リスク因子が、CNDP2、SET、及びGPIのうちの1つもしくは複数を含むか;
    (III)該1以上の食道腺癌リスク因子が、ISG15、LTF、DAD1、CNDP2、SET、及びGPIのうちの1つもしくは複数を含むか;
    (IV)該1以上の食道腺癌リスク因子が、UBE2N及びS100Pのうちの1つもしくは複数を含むか;又は
    (V)該1以上の食道腺癌リスク因子が、ISG15、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、及びGPIのうちの1つもしくは複数を含む
    :請求項56又は57記載の方法。
  59. 前記対象が胃食道逆流症もしくはバレット食道を有するか、又はそれらを有する疑いがあり、或いは該対象がバレット食道を有し、かつ前記検査用食道組織試料がバレット食道組織試料である、請求項56～58のいずれか一項記載の方法。
  60. 前記対象がヒトである、請求項56～59のいずれか一項記載の方法。
  61. 前記検査用食道組織試料が単離された食道組織試料を含む、請求項56～60のいずれか一項記載の方法。
  62. 前記検査用食道組織試料が生検試料を含む、請求項56～61のいずれか一項記載の方法。
  63. 前記検査用食道組織試料が、新鮮な試料、凍結試料、保存試料、ホルマリン固定試料、又はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料を含む、請求項56～62のいずれか一項記載の方法。
  64. 前記検査用食道試料が顕微解剖試料を含む、請求項56～63のいずれか一項記載の方法。
  65. 前記検査用食道組織試料が粘膜試料又はバレット食道粘膜試料を含む、請求項56～64のいずれか一項記載の方法。
  66. 前記検査用食道組織試料が非粘膜組織から分離されている粘膜試料又はバレット食道粘膜試料を含み、ここで、該検査用食道組織試料が正常粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料を含むか、又は該検査用食道組織試料が非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されているバレット食道粘膜試料を含む、請求項56～65のいずれか一項記載の方法。
  67. 前記検査用食道組織試料が非粘膜組織から分離されているホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)粘膜試料又はFFPEバレット食道粘膜試料を含み、ここで、該検査用食道組織試料が正常粘膜組織から分離されているFFPEバレット食道粘膜試料を含むか、又は該検査用食道組織試料が非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されているFFPEバレット食道粘膜試料を含む、請求項66記載の方法。
  68. 前記1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施する前に、前記検査用食道組織試料から粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織から分離されている検査用食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ該1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルが該検査用食道粘膜試料中で測定されるか、
    該1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施する前に、該検査用食道組織試料からバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、正常粘膜組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ該1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルが該検査用バレット食道粘膜試料中で決定されるか、又は
    該1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施する前に、該検査用食道組織試料からバレット食道粘膜組織を選択的に単離して、非粘膜組織及び正常粘膜組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生することをさらに含み、かつ該1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルが該検査用バレット食道粘膜試料中で決定される、
    請求項56～67のいずれか一項記載の方法。
  69. 前記粘膜組織を選択的に単離する工程が顕微解剖を含む、請求項68記載の方法。
  70. 前記検査用食道組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料である、請求項68又は69記載の方法。
  71. 前記方法が、前記検査用食道組織試料中の前記1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを対照食道組織試料中の該1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルと比較することをさらに含む、請求項56～70のいずれか一項記載の方法。
  72. 前記対照食道組織試料が正常食道粘膜を含む、請求項71記載の方法。
  73. 前記対照食道組織試料が前記対象由来のものである、請求項71又は72記載の方法。
  74. 前記対照食道組織試料が、胃食道逆流症、バレット食道、又は食道腺癌を有さない1以上の対照対象由来のものである、請求項71又は72記載の方法。
  75. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが該1以上の食道腺癌リスク因子によってコードされるメッセンジャーRNA(mRNA)の発現を測定するためのアッセイを実施することを含む、請求項56～74のいずれか一項記載の方法。
  76. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが該1以上の食道腺癌リスク因子によってコードされるタンパク質の発現を測定するためのアッセイを実施することを含む、請求項56～75のいずれか一項記載の方法。
  77. 前記アッセイが、マススペクトロメトリーアッセイ、免疫組織化学アッセイ、免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、アルファLISAアッセイ、又は酵素結合免疫吸収スポット(ELISpot)アッセイを含む、請求項76記載の方法。
  78. 前記アッセイが前記マススペクトロメトリーアッセイを含む、請求項77記載の方法。
  79. 前記検査用食道組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料であり、前記方法が、前記マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、該FFPE試料を処理して、ホルマリン架橋を無効にすることをさらに含み、任意に、ここで、該処理が該FFPE試料を洗剤を含まないバッファー中で加熱することを含む、請求項78記載の方法。
  80. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、前記マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、該検査用食道組織試料を1以上のプロテイナーゼで消化することを含む、請求項78記載の方法。
  81. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、前記マススペクトロメトリーアッセイを実施する前に、前記FFPE試料を処理して、ホルマリン架橋を無効にし、その後、該検査用食道組織試料を1以上のプロテイナーゼで消化することを含む、請求項79記載の方法。
  82. 前記1以上のプロテイナーゼがトリプシンを含む、請求項80又は81記載の方法。
  83. 前記マススペクトロメトリーアッセイが標的化マススペクトロメトリーアッセイを含む、請求項78～82のいずれか一項記載の方法。
  84. 前記マススペクトロメトリーアッセイがトリプル四重極マススペクトロメーターで行われる、請求項78～83のいずれか一項記載の方法。
  85. 前記1以上の食道腺癌リスク因子がISG15を含み、かつISG15の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが配列番号11又は配列番号12に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項78～84のいずれか一項記載の方法。
  86. 前記1以上の食道腺癌リスク因子がLTFを含み、かつLTFの発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが配列番号54又は配列番号58に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項78～85のいずれか一項記載の方法。
  87. 前記1以上の食道腺癌リスク因子がCNDP2を含み、かつCNDP2の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが配列番号20又は配列番号31に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項78～86のいずれか一項記載の方法。
  88. 前記1以上の食道腺癌リスク因子がDAD1を含み、かつDAD1の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが配列番号7又は配列番号9に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項78～87のいずれか一項記載の方法。
  89. 前記1以上の食道腺癌リスク因子がSETを含み、かつSETの発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが配列番号50に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項78～88のいずれか一項記載の方法。
  90. 前記1以上の食道腺癌リスク因子がUBE2Nを含み、かつUBE2Nの発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが配列番号1又は配列番号5に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項78～89のいずれか一項記載の方法。
  91. 前記1以上の食道腺癌リスク因子がS100Pを含み、かつS100Pの発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが配列番号67又は配列番号68に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項78～90のいずれか一項記載の方法。
  92. 前記1以上の食道腺癌リスク因子がGPIを含み、かつGPIの発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが配列番号35又は配列番号39に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む、請求項78～91のいずれか一項記載の方法。
  93. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの2つ以上の発現レベルを測定することを含む、請求項56～92のいずれか一項記載の方法。
  94. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの3つ以上の発現レベルを測定することを含む、請求項56～93のいずれか一項記載の方法。
  95. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの4つ以上の発現レベルを測定することを含む、請求項56～94のいずれか一項記載の方法。
  96. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの5つ以上の発現レベルを測定することを含む、請求項56～95のいずれか一項記載の方法。
  97. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの6つ以上の発現レベルを測定することを含む、請求項56～96のいずれか一項記載の方法。
  98. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIのうちの7つ以上の発現レベルを測定することを含む、請求項56～97のいずれか一項記載の方法。
  99. 前記検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIの発現レベルを測定することを含む、請求項56～98のいずれか一項記載の方法。
  100. 前記対象がヒトであり、かつバレット食道を有しており、
    ここで、前記検査用食道組織試料が単離されたバレット食道粘膜試料を含み、
    ここで、該検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、該検査用食道試料をトリプシンで消化し、その後、標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み、
    ここで、該検査用食道組織試料中の1以上の食道腺癌リスク因子の発現レベルを測定するためのアッセイを実施することが、ISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIの発現レベルを測定することを含み、かつここで、
    (I)ISG15の発現レベルを測定することが配列番号11又は配列番号12に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (II)LTFの発現レベルを測定することが配列番号54又は配列番号58に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (III)CNDP2の発現レベルを測定することが配列番号20又は配列番号31に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (IV)DAD1の発現レベルを測定することが配列番号7又は配列番号9に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (V)SETの発現レベルを測定することが配列番号50に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (VI)UBE2Nの発現レベルを測定することが配列番号1又は配列番号5に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;
    (VII)S100Pの発現レベルを測定することが配列番号67又は配列番号68に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含み;かつ
    (VIII)GPIの発現レベルを測定することが配列番号35又は配列番号39に示される標的ペプチドの検出及び定量のための標的化マススペクトロメトリーアッセイを実施することを含む
    :請求項56～99のいずれか一項記載の方法。
  101. 前記検査用食道組織試料が非粘膜組織から及び正常粘膜組織から分離されているホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)バレット食道粘膜試料を含み、
    ここで、前記方法が、バレット食道粘膜組織を顕微解剖によって該検査用食道組織試料から選択的に単離して、非粘膜組織から及び正常粘膜組織から分離されている検査用バレット食道粘膜試料を産生し、その後、該検査用バレット食道粘膜試料を消化前に処理して、ホルマリン架橋を無効にすることをさらに含む、
    請求項100記載の方法。
  102. 対象由来の単離された検査用食道組織試料中のISG15の発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号11又は12に示される配列を含む単離されたペプチド。
  103. 対象由来の単離された検査用食道組織試料中のLTFの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号54又は58に示される配列を含む単離されたペプチド。
  104. 対象由来の単離された検査用食道組織試料中のCNDP2の発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号20又は31に示される配列を含む単離されたペプチド。
  105. 対象由来の単離された検査用食道組織試料中のDAD1の発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号7又は9に示される配列を含む単離されたペプチド。
  106. 対象由来の単離された検査用食道組織試料中における標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するためのSETの発現を決定するための配列番号50に示される配列を含む単離されたペプチド。
  107. 対象由来の単離された検査用食道組織試料中のUBE2Nの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号1又は5に示される配列を含む単離されたペプチド。
  108. 対象由来の単離された検査用食道組織試料中のS100Pの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号67又は68に示される配列を含む単離されたペプチド。
  109. 対象由来の単離された検査用食道組織試料中のGPIの発現を決定するための標的化マススペクトロメトリーアッセイで使用するための配列番号35又は39に示される配列を含む単離されたペプチド。
  110. 前記単離されたペプチドが重同位体で標識されている、請求項102～109のいずれか一項記載の単離されたペプチド。
  111. 食道腺癌を有する対象の食道腺癌を治療するか、又は食道腺癌を発症するリスクのある対象の食道腺癌を予防する方法であって、1以上の阻害剤の治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該1以上の阻害剤が、該対象の食道組織におけるISG15、LTF、CNDP2、DAD1、SET、UBE2N、S100P、及びGPIから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる、前記方法。
  112. 前記食道腺癌リスク因子が、ISG15、DAD1、UBE2N、及びS100Pから選択される、請求項111記載の方法。
  113. 食道腺癌細胞の増殖を阻害するか又は減少させる方法であって、1以上の阻害剤を該食道腺癌細胞に投与することを含み、ここで、該1以上の阻害剤が、ISG15、UBE2N、及びS100Pから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる、前記方法。
  114. 食道腺癌細胞の遊走を阻害するか又は減少させる方法であって、1以上の阻害剤を該食道腺癌細胞に投与することを含み、ここで、該1以上の阻害剤が、ISG15、DAD1、UBE2N、及びS100Pから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる、前記方法。
  115. 食道腺癌細胞の細胞傷害性に対する感受性を増大させ又は食道腺癌細胞の細胞死を誘導する方法であって、1以上の阻害剤を該食道腺癌細胞に投与することを含み、ここで、該1以上の阻害剤が、ISG15、UBE2N、及びS100Pから選択される1以上の食道腺癌リスク因子の発現又は活性を低下させる、前記方法。
  116. 前記食道腺癌細胞が食道腺癌を有する対象におけるのものである、請求項113～115のいずれか一項記載の方法。
  117. 前記1以上の阻害剤が前記1以上の食道腺癌リスク因子の発現を低下させる、請求項111～116のいずれか一項記載の方法。
  118. 前記阻害剤がRNAi剤又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項111～117のいずれか一項記載の方法。
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