JP5837630B2 - ガンの診断、予測、および予後試験 - Google Patents
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Description
わかっている。
試験はHer2免疫発現プロファイリングに限定されている。
増殖細胞または細胞成長の異常の有無を測定する方法であって、試料中のバイオマーカーを検出する工程を含み、前記バイオマーカーが、DNA複製ライセンス化因子、オーロラキナーゼ、Ki67、ジェミニン、ポロ様キナーゼ、およびその基質であるヒストンH3
(以下、「H3S10ph」と称する)、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される方法を提供する。
期速度論、細胞周期分布、異形成、新生物、または潜在的もしくは実際に前ガンもしくはガン性の状態の有無を測定する工程を含む方法を提供する。
とも1つから選択される第1バイオマーカーのレベルを評価する工程;および
(b)被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラA、Plk1、Ki67、およびH3S10phの少なくとも1つから選択される第2バイオマーカーのレベルを評価する工程
を含み、
所定値と比較した第1バイオマーカーのレベルと所定値と比較した第2バイオマーカーのレベルの組み合わせが、前記被験者のガンの進行を表す方法を提供する。
(a)被験者から採られた生物学的試料中のMcm2〜7の少なくとも1つから選択され
る第1バイオマーカーのレベルを評価する工程;および
(b)被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラA、Plk1、Ki67、およびH3S10phの少なくとも1つから選択される第2バイオマーカーのレベルを評価する工程
を含み、
所定値と比較した第1バイオマーカーのレベルと所定値と比較した第2バイオマーカーのレベルの組み合わせが、前記被験者に処方される治療法を表す方法を提供する。
(a)被験者から採られた生物学的試料中のMcm2〜7の少なくとも1つから選択され
る第1バイオマーカーのレベルを評価する工程;および
(b)被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラA、Plk1、Ki67、およびH3S10phの少なくとも1つから選択される第2バイオマーカーのレベルを評価する工程
を含み、
所定値と比較した第1バイオマーカーのレベルと所定値と比較した第2バイオマーカーの
レベルの組み合わせが、治療的処置の効力を表す方法を提供する。
臨床的有用性を含むバイオマーカーの有用性およびこれらバイオマーカーの分析が他の重要な細胞周期調節因子と組み合わされて患者の腫瘍試料中の細胞周期速度論および期の分布に関する情報を与える方法が提供される。この分析は、予後評価を改善するための診断アルゴリズムを与えることができ、細胞周期特異的薬剤に対する治療応答を予測する可能性も有する。これは、マルチパラメータ細胞周期分析が、DNA複製ライセンス化経路および有糸分裂機構のコア成分を形成するバイオマーカーを利用して、ルーチンの患者腫瘍生検材料に行われるアプローチである。このアルゴリズムは、予後ツールを与えるだけでなく、細胞周期特異的薬剤(放射を含む)または上流の成長調節経路を阻害する薬剤の予測試験としても利用できる。このアルゴリズムは、前臨床研究(インビボ異種移植腫瘍モデル)および臨床試験における新規薬剤候補の効力を評価するのにも利用できる。
、食道、気管支、リンパ節、および血液学的悪性腫瘍、転移性肉腫および癌腫のエビデンスには血液および血清のいずれかから誘導される。いくつかに実施形態において、本発明は、頸部腺上皮細胞(腺上皮内新生物、GIN)の前ガン状態異常または他の組織の前ガン状態異常の評価にさらに利用できる。
な洞察を与えることを示した。
トンステムループBP、Rb、P18−INK4C、アネキシンVIII、c−Myb、CDC25A、サイクリンD3、サイクリンE1、デオキシシトシンキナーゼ、DP−1、エンドセリン変換酵素、エノラーゼ2、P18 INK4C、リビヌクレオチドレダクターゼ、およびウラシルDNAグリコラーゼ2があるが、これらに限定されない。特別な実施形態において、対象となるバイオマーカーは、細胞周期制御およびDNA複製に関与するE2F転写因子により誘起される遺伝子であり、例えばサイクリンE2、p57KIP2、RANBPM、および複製タンパク質A1がある。対象となるE2F誘起遺伝子のいくつかはアポトーシスに関与しており、APAF1、Bcl−2、カスパーゼ3、MAP3キナーゼ5、およびTNF受容体関連因子がある。他のE2F誘起遺伝子は転写の制御に関与しており、例えば、アシュ(ash)2様、ポリホメオティック2、胚性外胚葉タン
パク質、ゼストのエンハンサー、スプリットのヘアリーエンハンサー、ホメオボックスA10、ホメオボックスA7、ホメオボックスA9、ホメオドメインTF1、前B細胞白血病FT3、YY1 TF、POUドメインTF、TAFII130、TBP−因子172
、基本TF3、ブロモドメイン/ジンクフィンガー、SWI/SNF、ID4、TEA−4、NFATC1、NFATC3、BT、CNC−1、MAF、MAFF、MAFG、コア結合タンパク質、E74様因子4、c−FOS、JUNB、ジンクフィンガーDNA BP、およびCbp/p300トランス活性化因子である。シグナル伝達に関与しているE2F誘起遺伝子も対象となる潜在的なバイオマーカーであり、TGFβ、フォリスタチン、骨形成タンパク質2、BMP受容体1A型、フリズルドホモログ1、WNT10B、スフィンゴシンキナーゼ1、二重特異性ホスファターゼ7、二重特異性(Y)ホスファターゼ、FGF受容体3、プロテインチロシンホスファターゼ、二重特異性(Y)ホスファターゼD6655、インスリン受容体、成熟T細胞増殖1、FGF受容体2、TGFα、CDC42エフェクタータンパク質3、Met、CD58、CD83、TACC1、およびTEAD4がある。
のリコンビナント発現の結果のことがある。
には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、およびテキサスレッドがある。好適な発色色素にはジアミノベンジジンがある。
る。
(a)被験者から採られた生物学的試料中のMcm2〜7の少なくとも1つから選択され
る第1バイオマーカーのレベルを評価する工程;および
(b)被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラA、Plk1、Ki67、およびH3S10phの少なくとも1つから選択される第2バイオマーカーのレベルを評価する工程
を含み、
所定値と比較した第1バイオマーカーのレベルと所定値と比較した第2バイオマーカーのレベルの組み合わせが、前記被験者のガンの進行を表す方法を提供する。
(a)被験者から採られた生物学的試料中のMcm2から7の少なくとも1つから選択さ
れる第1バイオマーカーのレベルを評価する工程;および
(b)被験者から採られた生物学的試料中のジェミニン、オーロラA、Plk1、Ki67、およびH3S10phの少なくとも1つから選択される第2バイオマーカーのレベルを評価する工程
を含み、
所定値と比較した第1バイオマーカーのレベルと所定値と比較した第2バイオマーカーのレベルの組み合わせが、前記被験者に処方される治療法を表す方法を提供する。
(a)モニタリング;および
(b)非細胞周期特異的化学療法薬剤による治療。
(a)モニタリング;
(b)G1または非細胞周期特異的薬剤による治療;および
(c)非SおよびG2/M細胞周期特異的化学療法薬剤による治療。
(a)手術;および
(b)SおよびG2/M細胞周期特異的化学療法薬剤による治療。
イソメラーゼII阻害剤(エトポシド、テニポシド、アントラサイクリン、エピルビシン)があるが、これらに限定されない。
整数、工程、構成成分、またはその群の存在または追加を排除しない。
研究コホート
浸潤性乳ガンと診断された182人の患者を、英国、ロンドンのUCL病院、外科に保管されている乳ガンデータベースから特定した。研究した全患者は、通常の術後臨床評価を受け、断面分析に貢献した。10人は追跡不能であり、5人はガンが再発し、そのうち2人は乳ガンで死亡した。167人の患者は生存期間および再発の前向き分析に貢献したが、そのうち24人(14%)は研究期間中にガンで死亡し、12人は他の無関係な原因で死亡し、131人は最近の経過観察時に生存していた。再発およびガンによる死亡を含む40(24%)の再発事象があった。経過観察期間中央値は47ヶ月(範囲:1〜92ヶ月)であった。再発した人の中で再発までの平均時間は26ヶ月(標準偏差(SD)=15ヶ月、範囲:2〜55ヶ月)。未だ再発していない人の平均経過観察時間は52ヶ月(SD=20ヶ月、範囲:2〜92ヶ月)であった。死亡した人の平均生存時間は21ヶ月(SD=12ヶ月、範囲:4〜44ヶ月)であった。死亡していない人の平均経過観察時間は50ヶ月(SD=21ヶ月、範囲:1〜92ヶ月)であった。これらの患者から採ったホルマリン固定パラフィン包埋手術乳房組織を、ブルームアンドリチャードソン法(
Bloom and Richardson method)のノッチンガム修飾(Nottingham modification)により決定された組織学的グレード(1〜3)を3種全て含む病理保管庫から取り出した。全ての症例で、組織学的な報告およびスライドが利用可能である。それらには、142例の充実腺管ガン、26例の小葉ガン、4例の粘液ガン、1例の微小乳頭ガン、および9例の混合型があった。記録されたパラメータには、組織学的グレード、腫瘍の大きさ、腫瘍の種類、リンパ節の状態、リンパ血管浸潤(LVI)、年齢、およびNPIがあった。発明者らは、乳房縮小術を受けた21人の閉経前女性の正常な乳房細胞を無作為に選択した症例も研究した。研究に対する地方研究倫理委員会の認可が、ヒトの研究に関する倫理のUCL/UCLHジョイント委員会(joint UCL/UCLH Committees on the Ethics of Human Research)から得られた。
ヒトのジェミニンに対するウサギのポリクローナル抗体を、記載のとおり(Wharton SB,
Hibberd S, Eward KL, et al. Br J Cancer 2004;91:262-9)発生させた。Ki67 M
Ab(clone MIB−1)をDAKO(グロストラップ、デンマーク)から、Mcm2 MAb(clone 46)をBD Transduction Laboratories(レキシントン、ケンタッキー州)から、エストロゲン受容体−α(ER)MAb(clone 1D5)およびプロゲステロン受容体MAb(clone PgR 636)をDAKOから、オーロラA MAb NCL−L−AK2(clone JLM28)をNovocastra Laboratories(ニューキャッスル、英国)から、ポロ様キナーゼ1(PLK1)MAb(clone 35−206)およびセリン10でリン酸化されたヒストンH3(H3S10ph) PAbをUpstate(レークプラシッド、ニューヨーク州)から入手した。
ヒトMCF−7乳房上皮腺ガン細胞(ATCC HTB−22)を、2mMのグルタミン、1%非必須アミノ酸、10%FCS、100U/mlのペニシリン、および0.1mg/mlのストレプトマイシンを補ったEMEM(Gibco−BRL、Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)中で培養した。
MCF7細胞をトリプシンによる処理により採取し、PBS中で洗浄し、溶解バッファ(50mMのTris−Cl pH 7.5、150mMのNaCl、20mMのEDTA、0.5%のNP40)に2×107細胞/mlで再懸濁させた。氷上で30分間イン
キュベーションした後、溶解物を遠心分離(13,000g、15分間、4℃)により澄ませた。溶解物を、4〜20%SDS−PAGE(75μgタンパク質/ウェル)により分離し、記載のとおり(Stoeber et al. J Cell Sci, 114:2027-41, 2001)免疫ブロットした。ブロッキング、抗体インキュベーション、および洗浄工程は、以下の条件で実施した:Mcm2、オーロラA、およびPLK1にはPBS/0.1%Tween−20/5%ミルク、ジェミニンにはPBS/1% Tween−20/10%ミルク、H3S10phにはPBS/5%ミルク。
最初の診断時に得られた保管所のホルマリン固定パラフィン包埋組織(PWET)は全患者で利用可能であり、各検体で浸潤性腫瘍の代表的な試料を含むブロックを選択した。3μmの切片をSuperfrost Plusスライド(Visions Biosystems、英国)に切り出し、キシレンでパラフィンを除き、濃度の異なったアルコールから水へ通して再水和した。組織切片を、pH6.0の0.1Mクエン酸バッファ中で2分間加圧処理し、Bond(商標)Polymer Refine DetectionキットおよびBond(商標)−Max自動化システム(Vision Biosys
tems、ニューカッスル・アポン・タイン、英国)を利用して免疫染色した。一次抗体を以下の希釈率で利用した:Ki67(1/300)、Mcm2(1/2000)、ジェミニン(1/600)、ER(1/200)、PR(1/200)、オーロラA(1/70)、PLK1(1/1000)およびH3S10ph(1/300)。HER−2免疫染色は、メーカーの説明に従い、DAKO HercepTest(商標)(DAKO)を利用して実施した。カバースリップを、Pertex封入液(Cell Path Ltd、ニュータウンポーイス、英国)とともに使用した。一次抗体なしのインキュベーションをネガティブコントロールとして使用し、結腸上皮切片をポジティブコントロールとして使用した。
タンパク質発現分析を、(Shetty et al. Br J Cancer 93:1295-300, 2005, Dudderidge
et al. Clin Cancer Res 11: 2510-7, 2005)に記載されるとおり、各腫瘍中のマーカー
の標識率(LI)を測定して実施した。スライドを低倍率(100倍)で評価し、染色強度の一番高い腫瘍の部分を特定した。選択されたこのような部分から、3〜5つの領域を400倍の倍率で荷電結合素子カメラおよび分析ソフトウェア(SIS、ミュンスター、ドイツ)により取り込んだ。その後、画像を定量分析のためにプリントしたが、定量分析は臨床病理変数を知らない観察者により実施された。領域中の陽性および陰性細胞の両方を数え、間質細胞または炎症細胞は除外した。陽性細胞の同定の基準は、バイオマーカーにより異なる:Ki67、Mcm2、ジェミニン、ER、PR、およびH3S10phでは、どのような程度でも核染色を示す細胞を陽性とした;オーロラAおよびPLK1では、どのような程度でも核染色または細胞質染色を示す細胞を陽性とした(Gritsko et al. Clin Cancer Res 9:1420-6, 2003)。各場合で、最低500の細胞を数えた。以下の式を
利用して、LIを計算した:LI=陽性細胞数/全細胞数×100。HER−2タンパク質過剰発現の評価には、DAKOにより推薦されるFDA認可評価システムに従い、細胞膜染色を評価した。
各場合で、IHCにより評価されたのと同じブロックから得られた40μmのPWET切片1つを使用して細胞核を(Sudbo et al. N Engl J Med 344:1270-8, 2001. Haroske et al. Anal Cell Pathol 1998; 17: 189-200, 1997)記載のとおり調製した。Fairf
ield DNA Ploidy System(Fairfield Imaging
Ltd、ノッチンガム、英国)を画像処理、分析および分類に、(Sudbo et al. 2001 supra.)記載のとおり使用した。リンパ球およびプラズマ細胞を内部コントロールとして含め、高グレード膀胱腫瘍および正常な結腸組織の40μm切片を、それぞれ異数体および二倍体集団の外部コントロールとして含めた。ヒストグラムは、発表されている基準により(Sudbo et al. 2001 supra, Haroske 1998 supra)分類した。ヒストグラムは、2人の
独立した評価担当者により、臨床病理変数の知識なしで高度に一致して分類された。統計分析には、四倍体および倍数体腫瘍を、異数体腫瘍と共に分類した。
バイオマーカーを中央値および四分位範囲によりまとめた。マン・ホイットニーのU検定を利用し、各マーカーを、正常試料に対して、リンパ節ステージ、倍数体状態、およびグレード3と比較した。ヨンクヒール・タプストラのノンパラメトリックトレンド検定を利用し、マーカーをグレードおよびHer2状態と比較した。スピアマンの順位相関係数を利用して、マーカーとNPIとの間の関連を評価した。自由度1のlinear by
linear連関カイ二乗検定を利用して、Her2と倍数体状態との間の関連を検定した。対応のないt検定を利用して、倍数体状態による平均NPIを比較した。
とガン死の分析においてコックス回帰を利用し、ハザード比を与え、単変量モデルおよびNPIに関して調整する多変量モデルの両方において、中央値で2つのカテゴリーに分かれたマーカーの予測を評価した。カプラン・マイヤープロットを利用し、NPIカテゴリーを無視し、またNPIカテゴリーにより分類してマーカーの評価される予測効果を示した。分析は全て両側検定であり、SPSSソフトウェア(バーション12.0.1)を使用して、効果を、信頼区間95%を利用してまとめ、5%レベルで統計的に有意であると評価した。
バイオマーカーマルチパラメータ分析およびその生物学的意味の確認
Mcm2、ジェミニン、オーロラA、PLK1、およびH3S10phに対する抗体の単一特異性は、非同期MCF7細胞からの全細胞抽出物において、対応するヒト抗原の報告済み電気泳動移動度と一致する分子量を持つ単一のタンパク質の検出により確認した(図5A)。HeLa S3細胞およびSK−OV3卵巣ガン細胞でのこのバイオマーカーセットの別な試験において、発明者らは、Mcm2レベルは細胞周期の間に大幅に変化しないが、ジェミニンの発現はS−G2−Mに限定されていることを示した。オーロラAおよびPLK1のレベルは、G1の間は無視でき、S期の間に上昇し、G2/Mの間に極大に達し、有糸分裂停止からの開放2〜4時間後分解が起こる。H3S10phの存在は有糸分裂に限定され、有糸分裂マーカーとしてそれを使用する原理を強固にする。増殖マーカーKi67は細胞周期全体で増殖細胞中に存在するので、Ki67に対するS−G2−M期またはM期マーカーの比(例えば、ジェミニン/Ki67、オーロラA/Ki67、またはH3S10ph/Ki67)は、G1期の相対的な長さの指標として、したがって細胞周期進行の速度の指標として使用できる。特に、ジェミニン発現増大は、侵襲性腫瘍においてすら、S−G2−M期に限定されている。
本研究の臨床病理特性を表2にまとめる。第1に、発明者らは、細胞周期バイオマーカー発現と腫瘍の分化状態との間の関係を検討した。6種のバイオマーカーの発現レベルはいずれも腫瘍グレードと強く関連(表3)していたが、グレードの間でバイオマーカーレベルの分布にいくらか重複がある(例えば、オーロラAおよびPLK1レベル、図6)。
これらのデータは、腫瘍退形成の増加とともに周期をなしている細胞の比率も増えることを示すが、バイオマーカーが、各グレード内の全患者に対してグレードの間を完全に区別しないことも示す。これらの知見と一致して、腫瘍グレードと倍数体状態のとの間に非常に有意な関連が見いだされた(p<0.001)。ジェミニン/Ki67、オーロラA/Ki67、オーロラB/Ki67、およびH3S10ph/Ki67の比は、グレードの上昇に伴う大幅な変化を示さず、停止した分化が、高グレード腫瘍中の加速された細胞周期進行速度と関連しないことを示している(表3)。これは、腫瘍退形成の増加と共に加速された細胞周期進行が見られた、卵巣ガンにおける発明者らの知見とは明らかに対照的である(ジェミニン/Ki67:p<0.007、オーロラA/Ki67:p<0.0002、H3S10ph/Ki67:p<0.0002)。対照的に、そして他の腫瘍タイプにおける発明者らの知見と一致して、Mcm2/Ki67比は、腫瘍グレードの上昇と共に低下し、高分化型腫瘍中のDNA複製ライセンス化されているが非増殖性の細胞から、低分化型腫瘍中の活発に周期をなす細胞への比率の変化を反映している(表3)。ジェミニン発現と腫瘍脱形成およびゲノム不安定性の増大との間の正の相関は、この開始点ライセンス化リプレッサーが、乳ガンの中で腫瘍抑制因子として振る舞っていないようであることを示す。これは、例えば末梢性B細胞リンパ腫および卵巣ガンなど他の腫瘍タイプでも観察されており、それらにおいてジェミニンを発現する細胞の数は、細胞増殖指数に比例する。
単変量分析
NPIスコアは、この患者コホートにおける乳ガン再発および死亡の強力な予測因子で
あり、再発のハザードはNPIスコアの単位あたりちょうど2倍未満に増え(HR=1.81[1.47−2.23]、p<0.001)、死亡のハザードはNPIスコアの単位あたりちょうど2倍超増えた(HR=2.15[1.61−2.88]、p<0.001)。患者の年齢は予測因子ではなかった(表9)(図7A)。Ki67、Mcm2、ジェミニン、オーロラA、PLK1、およびH3S10phを乳ガン再発の強力な予測因子であると同定した(それぞれ、HR=2.77[1.44−5.30]、p=0.002;HR=3[1.56−5.76]、p<0.001;HR=3.93[1.98−7.80]、p<0.001;HR=3.31[1.67−6.57]、p<0.001;HR=4.48[2.21−9.09]、p<0.001;HR=3.49[1.76−6.92]、p<0.001)(図7Bおよび7C)。これらの関連は生存期間にも見られたが、このコホートにおける事象数が小さいためそれほど強くはなかった(Mcm2:HR=2.32[0.99−5.43]、p=0.05;ジェミニン:HR=2.43[1.04−5.68]、p=0.04;オーロラA:HR=2.18[0.93−5.12]、p=0.07;PLK1:HR=3.46[1.37−8.71]、p=0.009;H3S10ph:HR=3.29[1.31−8.30]、p=0.01)。より低い再発ハザードが二倍体群に見られたが、これは有意でなかった(HR=0.62[0.33−1.18]、p=0.14)。Her2発現のカテゴリー増加により再発ハザードおよび死亡ハザードの有意な増加傾向があった(それぞれ、HR=1.44[1.13−1.83]、p=0.003およびHR=1.40[1.02−1.94]、p=0.04)。
多変量分析は、これらの細胞周期バイオマーカーの効果が、NPIに対して調整した後でも統計的に有意なままであり、ガン再発を予測するものであることを示している。Ki67、Mcm2、ジェミニン、オーロラA、PLK1、およびH3S10phを、NPI以上の、強力で独立した乳ガンの予測因子であると同定した(それぞれ、HR=2.13[1.08−4.23]、p=0.03;HR=2.22[1.12−4.41]、p=0.02;HR=2.64[1.27−5.49]、p=0.01;HR=2.82[1.37−5.80]、p=0.005;HR=3.31[1.57−6.97]、p=0.002;HR=2.07[1.02−4.20]、p=0.04)(図8および9)。1つの細胞周期バイオマーカーを使用して再発を予測することに有用性があったものの、2つ以上のマーカーを含めることにより追加される有用性はなかった。これは、部分的には、マーカーと臨床病理変数との間に相関があったためである。興味深いことに、有糸分裂キナーゼ、オーロラAおよびPLK1は、乳ガン再発の最も強力な独立した予測因子であると同定された。
発明者らは、個々の細胞周期特異的バイオマーカーが乳ガンにおける強力で独立した予後マーカーであることを見いだした。これにより、腫瘍の細胞周期速度論または細胞周期表現型が、この特定の腫瘍タイプの病理生物学に影響を与えるかどうかという疑問が起こる。発明者らは、インビトロDNA複製アッセイにおいて、DNAヘリカーゼの構成要素であるMcm2〜7ライセンス化因子のダウンレギュレーションが、いたるところで見られる下流機構であり、それにより、細胞が細胞分裂周期を出て、休止(G0)、分化された、または老化した周期外状態になる時に、細胞の増殖能力が低下することを既に示した(Williams and Stoeber, Curr Opin Cell Biol 19:672-679, 2007; Blow and Hodgson, Trends Cell Biol 12:72-78, 2002; Stoeber et al., EMBO J 17:7219-7229, 1998; Stoeber et al., J Cell Sci 114:2027-2041, 2001 ; Kingsbury et al., Exp Cell Res 309:56-67, 2005; Barkley et al., Exp Cell Res 313:3789-3799, 2007)。細胞周期表現型を
決定するために、Mcm2タンパク質発現に30%のカットポイントを選択し、腫瘍細胞の大部分が周期外状態にある群(Mcm2<30%、表現型I)を定義した9図13、図
14)。この群(表現型)は、全腫瘍の18%であり、ジェミニンレベルが7%未満であった。これは、細胞が休止(G0)および分化された周期外状態に入るとジェミニンも厳しくダウンレギュレーションされるという、インビトロアッセイおよび自己再生組織での発明者らの観察と一致する(Williams and Stoeber, 2007 supra; Eward et al., J Cell Sci 117:5875-5886, 2004; Kingsbury et al., 2005 supra; Barkley et al., 2007 supra)(図4、表1)。対照的に、ほとんどのガンではMcm2発現レベルは30%を越え(Mcm2>30%)、腫瘍細胞の大部分が周期中の状態にある(Williams and Stoeber, 2007 supra)(図13、図14、表15)。これらの腫瘍の58%(表現型III)は、周期外状態の標識率により定義されるカットポイントである7%を超えるジェミニンレベルにより示される活発な細胞周期進行を示した(図14、表15)。特に、多くの乳ガン(表現型II)、全腫瘍の24%は、周期中表現型(Mcm2>30%)を示すが、7%未満のジェミニンレベルを発現し、G1遅延または停止状態を表す(Williams and Stoeber, 2007 supra; Stoeber et al., 2001 supra; Blow and Hodgson, 2002 supra; Shetty et al., Br J Cancer 93:1295-1300, 2005; Dudderidge et al., Clin Cancer Res 11:25110-2517, 2005; Gonzalez et al., J Pathol 204:121-130, 2004)(図14、表15)。
重要なことに、前記3群の中の他のS−G2−Mバイオマーカーの分布は、ジェミニンで観察されたことを正確に再現しており、3つの異なる細胞周期表現型への分離をさらに強化している(図14)。
増殖、分化、アポトーシス、およびDNA損傷応答などの過程を制御する複雑で冗長な経路の全ゲノム的分析による分析は、乳ガンの予後ツールとして制約を受けていることが分かりつつある(Dunkler et al. Eur J Cancer, 43:745-751, 2007)。ここで、発明者らは、細胞周期進行に影響する複雑なシグナル伝達経路の下流にあり、したがってそのような経路を通って伝達される情報の統合点として見なすことのできる、進化的保存性の高い細胞周期機構に着目した。発明者らは、この新規な形態のマルチパラメータ細胞周期分析が、腫瘍の細胞周期速度論への新規な洞察を与えるだけでなく、前立腺ガン、腎ガン、お
よび卵巣ガンを含む、ある範囲の腫瘍タイプにおいて重要な予後的意義を持つことを示した。
分が乳ガンの予後評価を大きく向上させることができ、標準的な臨床病理変数および統合されたNPIスコアに追加の情報を与えることを示した。オーロラAおよびPLK1には、予後に関する特別な重要性があるようであり、したがって、治験に入りつつある選択的な有糸分裂キナーゼ阻害剤の予測マーカーとしての可能性があるかもしれない。
研究コホート
1999年1月1日から2004年12月31日の間EOCと診断された143人の患者を、腫瘍学部(ロンドン大学付属病院婦人科ガンセンター、UCL病院、ロンドン、英国)に保管されている卵巣ガンデータベースから特定した。利用可能な組織学的資料により患者を選択した。組織検体は、診断時に婦人科腫瘍病理医により調査されており、WHO基準に従い組織サブタイプおよび核のグレードに関して評価されていた。ほとんどの患者は、治療終了後3から6ヶ月毎に2年間、その後年に1回調査されていた。以下の臨床情報を、患者の病院記録から直接得た:生年月日、診断日、残存病変の量を含む手術による知見、診療および外科診査での知見に基づく世界産婦人科連合(FIGO)ステージならびに細胞学的結果、診断時および再発時のCA125値、化学療法開始時の活動状態、再発日、最新の経過観察の日、ならびに死亡の日および原因。143人の患者のうち、67人(47%)は研究期間内に再発した。再発した人の再発までの平均時間は、16.9ヶ月であった(SD、11.0ヶ月;範囲0−47ヶ月)。未だ再発していない人の平均経過観察時間は、33.2ヶ月であった(SD、18.5ヶ月;範囲5−75ヶ月)。34人の患者(24%)が研究期間中に死亡し、107人は最近の経過観察時に生存していた。死亡した患者の平均生存期間は、21.9ヶ月(SD、15.6ヶ月;範囲0−60ヶ月)であった。未だ死亡していない患者の平均経過観察時間は、33.3ヶ月(SD、18.8ヶ月;範囲、5−75ヶ月)。2人の患者は追跡不能であった。倫理委員会の認可が、ヒトの研究に関する倫理のUCL/UCLHジョイント委員会から得られた。
ヒトのジェミニンに対するウサギのポリクローナル抗体を、記載のとおり(Wharton et al. Br J Cancer 91:262-9, 2004)発生させた。Ki67モノクローナル抗体(clon
e MIB−1)をDAKOから、Mcm2モノクローナル抗体(clone 46)をBD Transduction Laboratoriesから、オーロラAモノクローナル抗体NCL−L−AK2(clone JLM28)をNovocastra Laboratoriesから、オーロラBポリクローナル抗体Ab2254をAbcam
PLCから、およびセリン10でリン酸化されたヒストンH3(H3S10ph)ポリクローナル抗体をUpstateから入手した。
HeLa S3細胞(European Collection of Animal
Cell Cultures 87110901)を、記載のとおり(Stoeber et al. 2001 supra)培養および同期化した。細胞周期の同期化は、先に報告されたとおり(Krude et al. Cell; 88:109-19, 1997)、単離した核のフローサイトメトリーにより確認した。
タンパク質抽出物の調製および免疫ブロッティング。HeLe S3細胞をトリプシンによる処理により採取し、PBS中で洗浄し、溶解バッファ(50mmol/LのTris−Cl(pH 7.5)、150mmol/LのNaCl、20mmol/LのEDTA、0.5%のNP40)に2×107細胞/mLで再懸濁させた。氷上で30分間インキ
ュベーションした後、溶解物を遠心分離(13,000×g、15分間、4℃)により澄ませた。溶解物を、4%から20%のSDS−PAGE(75μgタンパク質/ウェル)により分離し、記載のとおり(Stoeber et al. 2001 supra)免疫ブロットした。ブロッキ
ング、抗体インキュベーション、および洗浄工程は、以下の条件で実施した:Mcm2お
よびオーロラAにはPBS/0.1%Tween20/5%ミルク、ジェミニンにはPBS/1% Tween20/10%ミルク、オーロラBおよびH3S10phにはPBS/5%ミルク。
最初の診断時に得られた保管所のホルマリン固定パラフィン包埋組織は全患者で利用可能であり、各検体で浸潤性腫瘍の代表的な試料を含むブロックを選択した。各パラフィン包埋組織ブロックから切り出した連続的な一連の切片を免疫細胞化学のために使用した。3マイクロメートルの切片をSuperfrost Plusスライド(Visions
Biosystems)に切り出し、キシレンでパラフィンを除き、濃度の異なったアルコールから水へ通して再水和した。組織切片を、pH6の0.1mol/Lクエン酸バッファ中で2分間加圧処理し、Bond Polymer Define DetectionキットおよびBond−X自動化システム(Vision BioSystems)を利用して免疫染色した。一次抗体を以下の希釈率で利用した:Ki67(1:100)、Mcm2(1:2000)、ジェミニン(1:600)、オーロラA(1:50)、オーロラB(1:200)およびH3S10ph(1:300)。カバースリップを、Pertex封入液(Cell Path Ltd)とともに使用した。一次抗体なしのインキュベーションをネガティブコントロールとして使用し、結腸上皮切片をポジティブコントロールとして使用した。
タンパク質発現分析を、(Shetty et al. 2005 supra, Dudderidge et al. 2005 supra)に記載されるとおり、各腫瘍中のマーカーの標識率を測定して実施した。スライドを低倍率(100倍)で評価し、染色強度の一番高い腫瘍の部分を特定した。選択されたこのような部分から、3〜5つの領域を400倍の倍率で荷電結合素子カメラおよび分析ソフトウェア(SIS)により取り込んだ。その後、画像を定量分析のためにプリントしたが、定量分析は臨床病理変数を知らない観察者により実施された。領域中の陽性および陰性細胞の両方を数え、間質細胞または炎症細胞は除外した。陽性細胞の同定の基準は、バイオマーカーにより異なり、Ki67、Mcm2、ジェミニン、オーロラB、およびH3S10phでは、どのような程度でも核染色を示す細胞を陽性とした。オーロラAでは、どのような程度でも核染色または細胞質染色を示す細胞を陽性とした(Gritsko et al. 2003 supra)。各場合で、最低500の細胞を数えた。以下の式を利用して、標識率を計算した
:標識率=陽性細胞数/全細胞数×100。独立した評価担当者により無作為に選択された10の症例を再評価したところ、高度の一致を示した。
各場合で、免疫細胞化学により評価されたのと同じブロックから得られた40μmのパラフィン包埋組織切片1つを使用して、記載のとおり細胞核を調製した(Sudbo et al. 2001 supra, Haroske et al. 1997 supra)。Fairfield DNA Ploidy System(Fairfield Imaging Ltd)を、画像処理、分析および分類に、(Sudbo et al. 2001 supra.)記載のとおり使用した。リンパ球およびプラズマ細胞を内部コントロールとして含め、高グレード膀胱腫瘍および正常な結腸組織の40μm切片を、それぞれ異数体および二倍体集団の外部コントロールとして含めた。ヒストグラムは、発表されている基準により(Sudbo et al. 2001 supra, Haroske et al. 1998 supra)分類した。ヒストグラムは、2人の独立した評価担当者により、臨床病理変数の知識なしで高度に一致して分類された。統計分析には、四倍体および倍数体腫瘍を、異数体腫瘍と共に分類した。
スピアマンの順位相関係数を利用して、バイオマーカー間の関連を調べた。バイオマー
カー発現と腫瘍グレード、ステージ、倍数体状態との間の関係を、適宜、ノンパラメトリックヨンクヒール・タプストラ検定およびマン・ホイットニーのU検定を利用して評価した。次いで、データを、コホートにわたって観察された標識率の中央値および四分位範囲としてまとめた。無病生存期間および全生存期間データの分析を、カプラン・マイヤープロット(バイオマーカーの三分位値を使用)、ログラング検定、およびコックス回帰(特記しない限り、バイオマーカーを連続変数として処理)を利用して実施した。各バイオマーカーに対して、コホートを、標識率に基づき三分位群に分けた。各三分位群内で、無病または全生存期間に対し、それぞれ、無病または生存のいずれかのままである比率を、カプラン・マイヤー法により計算した。バイオマーカーの信頼区間95%(95%CI)のハザード比(HR)を、最初に調整せずに求め、次いで、年齢、グレード、およびステージについて調整した。不完全なデータを持つ患者は、多変量分析から除外した。候補バイオマーカーを、補足表S1に列記する。検定は全て両側であり、有意水準0.05を使用し、多重仮説検定を見込まなかった。分析は、SPSSソフトウェア12.0(SPSS,Inc.)を使用して実施した。
バイオマーカーマルチパラメータ分析およびその生物学的意味の確認
Mcm2、ジェミニン、オーロラA、オーロラB、およびH3S10phに対する抗体の単一特異性は、非同期HeLa S3細胞からの全細胞抽出物において、対応するヒト抗原の報告済み電気泳動移動度と一致する分子量を持つ単一のタンパク質の検出により確認した(図10A)。HeLa S3細胞系は、特徴がはっきりした細胞周期遷移時間および確立された同期化プロトコルを持つので、この細胞をインビトロ研究で第一に選択した。同期化細胞からの全細胞溶解物を、キャラクタリゼーションされた抗体により免疫ブロットした(図10B)。Mcm2レベルは細胞周期の通過の間に大幅に変化しなかったが、ジェミニンの発現はS−G2−Mに限定されていた。オーロラAレベルはS期の間に上昇し、有糸分裂の間に極大に達し、有糸分裂停止からの開放2〜4時間後分解が起きた。同様に、オーロラBレベルは、G1期の間に無視でき、S期の間に徐々に上昇し、G2−Mの間に極大に達し、有糸分裂後に低下した。H3S10phの存在は有糸分裂に限定され、有糸分裂マーカーとしてそれを使用する原理を強固にする。これらのバイオマーカーの全く同じ細胞周期依存的発現が、同期化SK−OV3卵巣ガン細胞に観察された(データ示さず)。Ki67は増殖細胞中で細胞周期全体にわたり発現され、ジェミニン発現はS−G2−M期に限定されているので、発明者らは、ジェミニン/Ki67比を、G1の相対的な長さの指標として、したがって細胞周期進行の速度の指標として使用できることを提案した。上述のデータは、オーロラAおよびオーロラBの細胞周期依存性発現により、Ki67に対するそれらの比を、細胞周期進行の指標として使用できることを確認する。ジェミニン発現増大は、高度に侵襲性腫瘍においてすら、常にS−G2−M期に限定されている。したがって、発明者らのインビトロの知見は、オーロラAまたはオーロラBとジェミニンとの間の相対比(比>1)の増加が、細胞周期の間のキナーゼの過剰発現を示すであろうことも示している。発明者らのインビトロの知見の予後的意義およびEOCにおけるその生物学的意味を評価するため、発明者らは、一連の143の症例におけるバイオマーカーの発現を分析した(図10C)。タンパク質発現を、正常卵巣組織の5例でも研究した。バイオマーカーの発現は、正常な卵巣表面上皮では非常に低く(<4%)、その低下した増殖能力と一致している(データ示さず)。対照的に、EOCは高レベルのバイオマーカー発現を示し、細胞周期への再進入および増殖を示している。
相関、それぞれ、0.73(95%CI、0.64−0.8);0.74(95%CI、0.66−0.81);および0.52(95%CI、0.39−0.63))、その増殖マーカーとしての役割を支持している。特に、ジェミニン/Ki67およびオーロラA/Ki67比は、正に、だがあまり強くなくH3S10phと相関しており(スピアマン相関、それぞれ、0.25(95%CI、0.09−0.40)および0.42(95%CI、0.27−0.55))、S内またはG2−Mチェックポイント経路の活性化により起こるかもしれない延長したS−G2−M遷移時間に対するG1の相対的な長さの変化を反映している。
研究コホートの臨床病理特性を表10にまとめる。バイオマーカーとゲノム不安定性との間の関係を調査するため、発明者らは、その発現プロファイルを腫瘍DNA含量と関連づけた。バイオマーカー全ての発現レベルおよびいくつかのバイオマーカー/Ki67比とゲノム不安定性との間に非常に有意な関連があり(表11)、二倍体腫瘍と比べ異数体腫瘍中での周期をなしている細胞の比率増加および加速した細胞周期進行を反映している。
単変量分析
オーロラA(p=0.01;図12A)、オーロラA/Ki67、オーロラB/Ki67、およびH3S10ph(表14)は、より短い無病生存期間と有意に関連していたが
、全生存期間とは関連していなかった。患者年齢、腫瘍グレード、およびステージも、若い患者、高分化型腫瘍で、特に再発までの時間が著しく長い初期の疾患で無病生存期間を予測するものであった(それぞれ、HR、1.02(1.00−1.05)、p=0.05;HR、1.59(1.03−2.45)、p=0.04;HR、2.07(1.58−2.71)、p<0.0001)。患者の年齢および腫瘍のステージは全生存期間も予測したが(それぞれ、HR、1.05(1.02−1.09)、p=0.003;HR、3.21(1.33−7.79)、p=0.01)、腫瘍グレードは全生存期間を予測せず(p=0.70)、現行のグレーディングシステムの限界を強調している。腫瘍倍数体状態も、無病生存期間と有意に相関しており(HR、1.80(1.05−3.08)、p=0.03;図12B)、異数体腫瘍を持つ患者の全生存期間が短くなる傾向があったが、これは統計的な有意には達しなかった(HR、1.95(0.88−4.31)、p=0.10)。
コックス回帰生存分析は、腫瘍ステージが無病生存期間の有意な独立した唯一の予測因子であることを示した(HR、2.06(1.49−2.85)、p<0.0001)。患者の年齢および腫瘍ステージは、より高齢の患者およびより短い全生存期間を持つ進行したステージの腫瘍では、全生存期間の独立した予測因子であった(それぞれ、HR、1.05(1.01−1.09)、p=0.007;HR、3.19(1.31−7.75)、p=0.01)。いくつかのバイオマーカーが単変量分析において有意な予後因子であったが、年齢、グレードおよびステージに対して調整した後、どれも無病生存期間または全生存期間の有意な予測因子でなかった。これは、部分的には、バイオマーカーと腫瘍のグレードおよびステージとの間に非常に有意な関連があり、それらの独立した効果を分離するのが困難であることによる。
本研究を実施して、予後および予測に関する重要性があり、その病理学へのより深い理解をもたらすかもしれない、EOCの生物学的マーカーへのさらなる洞察を得た。発明者らの知見は、Mcm2およびジェミニン複製ライセンス化因子ならびにオーロラAおよびBキナーゼは、その基質であるH3S10phと共に、EOCにおいて予後に関する重要
性があることを示す。腫瘍の分化とこのバイオマーカーの組との間に見いだされた関連は、現行のグレーディングシステムにおけるさらなる改善の可能性を持つ増殖マーカーとしての使用を意味する。発明者らのマルチパラメータ分析は、それが患者の腫瘍試料における細胞周期進行についての情報、重要な予後の情報に解釈されるデータを与えるかもしれないことを示している。
る患者において、これらのバイオマーカーは、真のステージIまたはより進行した疾患の支持的なエビデンスを提供するかもしれず、アジュバント化学療法の利用についての決断を支援する。ICON 1/ACTION試験の知見は、アジュバント化学療法に小さな全体的利益を示唆するが(Trimbos JB et al J Natl Cancer Inst 2003;95:105-12)、ステージI疾患を持つ適切にステージングされたどの患者が本当に化学療法を必要とするかは不明確なままである。
Claims (20)
- 被験者のガンの進行の予後を決定するためにバイオマーカーのレベルを測定する方法であって、前記バイオマーカーが、
(a)被験者から採られた生物学的試料中のMcm2〜7の少なくとも1つから選択され
る第1バイオマーカー;および
(b)被験者から採られた生物学的試料中のジェミニンである第2バイオマーカーであり、
所定値と比較した第1バイオマーカーのレベルと、所定値と比較した第2バイオマーカーのレベルとの組み合わせが、前記被験者のガンの進行を表し、
所定値と比較した前記第1バイオマーカーのレベルが低く、所定値と比較した前記第2バイオマーカーのレベルが低い場合、被験者の予後はガン進行の可能性が低いことを示し、
所定値と比較した前記第1バイオマーカーのレベルが高く、所定値と比較した前記第2バイオマーカーのレベルが低い場合、被験者の予後はガン進行の可能性が低いことを示し、
所定値と比較した前記第1バイオマーカーのレベルが高く、所定値と比較した前記第2バイオマーカーのレベルが高い場合、被験者の予後はガン進行の可能性が高いことを示し、
前記第1バイオマーカーのレベルとは第1バイオマーカーに陽性な細胞の割合であって第1バイオマーカーの所定値は30%であり、前記第2バイオマーカーのレベルとは第2バイオマーカーに陽性な細胞の割合であって第2バイオマーカーの所定値は7%である、方法。 - レベルを測定される前記バイオマーカーが、前記被験者から採られた生物学的試料中のH3S10phである第3バイオマーカーをさらに含み、前記第2バイオマーカーは前記第3バイオマーカーとは異なる、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、腫瘍生検、組織、全血、血漿、血清、子宮頸部スメア、尿、気管支肺胞洗浄検体、唾液、および消化管擦過検体からなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1および第2バイオマーカーのレベルが、免疫学的アッセイ法を利用して測定される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫学的アッセイ法が、ドットブロット分析、スロットブロット分析、RIA、ペプチドマイクロアレイ、およびELISAからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記第1および第2バイオマーカーのレベルが、分子生物学系アッセイ法を利用して測定される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分子生物学系アッセイ法が、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、RT−PCR、PCR、核酸配列系増幅アッセイ(NASBA)、転写媒介増幅(TMA)、およびコンピューター化検出マトリックスからなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記被験者が、乳ガン、子宮内膜ガン、卵巣ガン、上皮性卵巣ガン、肺ガン、前立腺ガン、腎ガン、膀胱ガン、口腔粘膜のガン、食道ガン、リンパ細網系のガン、脳腫瘍、尿生殖器ガン、皮膚ガン、結腸ガン、胃ガン、尿管のガン、および気道消化管のガンからなる群から選択されるガンを有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1および第2バイオマーカーが、連続的にも同時にも測定できる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1バイオマーカーのレベルが、前記第2バイオマーカーのレベル測定前に測定される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ガンの被験者の治療的処置の効力を測定するためにバイオマーカーのレベルを測定する方法であって、前記バイオマーカーが、
(a)被験者から採られた生物学的試料中のMcm2から7の少なくとも1つから選択さ
れる第1バイオマーカー;および
(b)被験者から採られた生物学的試料中のジェミニンである第2バイオマーカーであり、
所定値と比較した第1バイオマーカーのレベルと、所定値と比較した第2バイオマーカーのレベルとの組み合わせが、治療的処置の効力を表す方法。 - レベルを測定される前記バイオマーカーが、前記被験者から採られた生体学的試料中のジェミニン、オーロラA、Plk1、Ki67、およびH3S10phの少なくとも1つから選択される第3バイオマーカーをさらに含み、前記第2バイオマーカーは前記第3バイオマーカーとは異なる、請求項11に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、腫瘍生検、組織、全血、血漿、血清、子宮頸部スメア、尿、気管支肺胞洗浄検体、唾液、および消化管擦過検体からなる群から選択される、請求項11または12に記載の方法。
- 前記第1および第2バイオマーカーのレベルが、免疫学的アッセイ法を利用して測定される、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫学的アッセイ法が、ドットブロット分析、スロットブロット分析、RIA、ペプチドマイクロアレイ、およびELISAからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記第1および第2バイオマーカーのレベルが、分子生物学系アッセイ法を利用して測定される、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分子生物学系アッセイ法が、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、RT−PCR、PCR、核酸配列系増幅アッセイ(NASBA)、転写媒介増幅(TMA)、およびコンピューター化検出マトリックスからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記被験者が、乳ガン、子宮内膜ガン、卵巣ガン、上皮性卵巣ガン、肺ガン、前立腺ガン、腎ガン、膀胱ガン、口腔粘膜のガン、食道ガン、リンパ細網系のガン、脳ガン、尿生殖器ガン、皮膚ガン、結腸ガン、胃ガン、尿管のガン、および気道消化管のガンからなる群から選択されるガンを有する、請求項11〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1および第2バイオマーカーが、連続的にも同時にも測定できる、請求項11〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1バイオマーカーのレベルが、前記第2バイオマーカーのレベル測定前に測定される、請求項11〜19のいずれか1項に記載の方法。
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