CN110846413B - Mafg/mafg-as1/mafg正反馈环作为靶位点检测试剂的应用 - Google Patents

Mafg/mafg-as1/mafg正反馈环作为靶位点检测试剂的应用 Download PDF

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Abstract

“MAFG/MAFG‑AS1/MAFG”正反馈环作为靶位点的检测试剂在制备膀胱癌顺铂增敏药物中的应用。本发明研究表明，在膀胱癌细胞中MAFG‑AS1高表达并与预后呈负相关；实验证实，抑制MAFG‑AS1表达可通过促进肿瘤细胞铁死亡而增加膀胱癌细胞对顺铂的敏感性；MAFG作为转录因子可以调控MAFG‑AS1的表达；我们还证实了MAFG‑AS1可通过募集乙酰化酶EP300来顺式调控来刺激MAFG转录，从而形成“MAFG/MAFG‑AS1/MAFG”正反馈环。沉默MAFG‑AS1或MAFG可通过抑制肿瘤细胞铁死亡增加癌细胞对顺铂的敏感性。

Description

MAFG/MAFG-AS1/MAFG正反馈环作为靶位点检测试剂的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及“ MAFG/MAFG-AS1/MAFG”正反馈环、MAFG-AS1及MAFG作为靶位点检测试剂在制备膀胱癌顺铂增敏药物中的应用。
背景技术
顺铂（DDP）是治疗膀胱癌的一线化疗药物，DDP主要作用于细胞DNA的嘌呤和嘧啶碱基，与DNA形成顺铂-DNA加合物，导致DNA损伤，抑制DNA的复制和转录进而杀伤肿瘤细胞。近年来，膀胱癌细胞对顺铂耐药性的产生严重影响了顺铂的疗效。目前多认为顺铂耐药的机制主要存在两方面：肿瘤细胞DNA被破坏减少基于顺铂于DNA结合减少；损伤的DNA被DNA修复系统修复及细胞死亡逃逸机制启动，使得已经遭到顺铂破坏的细胞依旧存活。目前多种方式（包括促进凋亡、调控自噬等）尝试增加膀胱癌对顺铂的敏感性，但相当一部分膀胱癌患者对顺铂仍然耐药，严重影响膀胱癌患者的愈合。因此探索逆转膀胱癌细胞对顺铂耐药的方法是提高疗效的关键。
铁死亡是一种铁依赖性的，以细胞内活性氧堆积为特征的非细胞凋亡形式的细胞死亡。形态上发生铁死亡的细胞会出现比正常细胞小的线粒体，且线粒体膜皱缩，同时线粒体嵴减少、消失，外膜破碎。细胞外三价铁离子（Fe3+）与transferrin（TF）结合后形成TF-Fe3+，在膜蛋白transferrin receptor protein 1（TFR1）的介导下进入细胞内，并被还原成Fe2+。在divlent metal transporter （DMT1）、ZRT/IRT-like proteins 8/14( ZIP8/14)的协助下存储到细胞内的labile iron pool（LIP）中。另外，胞内Fe2+在PCBP2等铁伴侣蛋白的协助下经过膜蛋白运铁蛋白1 (FPN1)泵出铁离子，维持胞内铁平衡。铁过载与细胞膜脂质过氧化有关, 导致大量活性氧簇（ROS），促使细胞发生铁死亡。多项研究证实促进铁死亡能增加顺铂对肿瘤细胞的杀伤性。因此深入研究铁死亡在膀胱癌顺铂耐药中的作用及分子机制，对膀胱癌的治疗具有重要意义。
Long non-coding RNA (lncRNA)是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。LncRNAs能通过转录调控、组蛋白修饰、结合蛋白、ceRNA等机制参与多种生物学行为的调控。目前有少数文献报道LINC00336、P53RRA等lncRNAs参与肿瘤细胞铁死亡的调控。MAFBZIP Transcription Factor G Antisense RNA 1 （MAFG-AS1）是最新被报道的能促进肿瘤增殖及转移的lncRNA，但MAFG-AS1在膀胱癌中的作用尚不清楚。
发明内容
本发明旨在提供一种可以用于制备膀胱癌顺铂增敏药物的新靶点。在本研究中，抑制MAFG-AS1表达能诱导铁死亡进而增加顺铂对膀胱癌细胞的杀伤力。机制探究发现MAFG-AS1的表达可被转录因子MAFG转录调控。而非常有趣的是MAFG-AS1又可以通过顺式调控在MAFG的基因座上促进H3K27ac，从而激活MAFG的转录，形成“MAFG/MAFG-AS1/MAFG”正反馈环。本研究促进了我们对lncRNA在膀胱癌铁死亡中的理解，并提供了抑制膀胱癌顺铂耐药性的潜在治疗新靶点。
本发明还首次揭示膀胱癌中表达升高的MAFG-AS1能抑制膀胱癌细胞的铁死亡，且细胞及动物层面均证实MAFG-AS1能通过抑制铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。本发明从铁离子水平改变角度探索的MAFG-AS1诱导膀胱癌铁死亡抵抗的新机制。
我们发现MAFG蛋白与MAFG-AS1基因启动子区上游区域存在潜在的转录结合位点。通过双荧光素酶实验我们证实膀胱癌中MAFG能够与MAFG-AS1启动子区域结合。并通过ChIP-PCR实验在膀胱癌中过表达MAFG后MAFG-AS1的富集程度明显上升，而敲除MAFG后MAFG-AS1的富集程度则明显下降，证实膀胱癌中MAFG能转录激活MAFG-AS1的表达。收集的临床标本通过WB和免疫组化结果显示相对于癌旁组织，MAFG在癌组织表达相对增高；本发明首次证实MAFG能抑制膀胱癌细胞的铁死亡。
本发明通过沉默或过表达MAFG-AS1后发，膀胱癌细胞中MAFG的表达与MAFG-AS1呈正相关性，提示MAFG-AS1也可能调控MAFG的表达。发现MAFG-AS1能与MAFG基因上游启动子形成反义互补链，提示MAFG-AS1可能通过顺式凋节作用方式调控MAFG的表达。发现MAFG-AS1与MAFG两互补区域附近存在H3K27ac富集。发现EP300与MAFG的表达呈正相关，而沉默EP300表达后，MAFG的表达也随之下调。而沉默MAFG-AS1及EP300表达后，ChIP实验证实MAFG转录水平明显降低，首次证实在膀胱癌细胞中MAFG-AS1能招募乙酰化酶在MAFG的基因座上促进H3K27ac，以表观遗传学修饰方式促进MAFG的表达。
“MAFG/MAFG-AS1/ MAFG”正反馈环能通过拮抗铁死亡抵抗来增加膀胱癌细胞对顺铂的敏感性，可以降低顺铂耐药性。
附图说明
图1：MAFG-AS1抑制膀胱癌细胞铁死亡。A-B：MTT法检测MAFG-AS1敲除后T24/RT4细胞的增殖情况，联合应用凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK，自噬抑制剂3-MA，铁死亡抑制剂DFO或铁死亡诱导剂Erastin。C，D，E，F：用相应的试剂盒检测Iron和Lipid-ROS水平。G，H：PCR检测干扰MAFG-AS1后T24/RT4细胞中MAFG-AS1的表达。I，G：克隆形成实验检测改变MAFG-AS1后的细胞增殖。K，L：检测改变MAFG-AS1后T24/RT4细胞MDA、Iron和Lipid-ROS水平。p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图2：MAFG-AS1通过铁死亡途径调节膀胱癌细胞对顺铂的化疗敏感性。A-D：MTT和克隆形成试验检测经顺铂(DDP，IC50)处理的T24/RT4细胞在敲除MAFG-AS1和/或DFO处理后的细胞增殖。E-G：用相应的试剂盒检测MDA、Iron和Lipid-ROS的表达水平。H-K：MTT和克隆形成实验检测经顺铂(DDP，IC50)处理的T24/RT4细胞在过表达MAFG-AS1和/或Erastin后的细胞增殖。L-N：用相应的试剂盒检测MDA、Iron和Lipid-ROS的表达水平。ns p>0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图3：体内实验证实敲除MAFG-AS1可通过促进铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂化疗的敏感性。A，G：在T24/RT4细胞中敲除MAFG-AS1和/或DDP处理后，用PCR检测MAFG-AS1的表达。B，H：处死后从指定小鼠分离的肿瘤组织。C，I：处死后指定小鼠的肿瘤体积。D，J：采用免疫组化检测肿瘤组织中Ki67的表达。E，F，K，L：测定动物血清中MDA和铁的含量。ns p>0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图4：MAFG通过转录调控上调MAFG-AS1的表达，从而抑制膀胱癌细胞的铁死亡。A：UCSC数据库和JASPAR数据库发现MAFG和MAFG-AS1启动子之间的结合位点。B，C：GSE31189和GSE87304芯片发现MAFG和MAFG-AS1之间存在正相关。D：发现MAFG表达较高的患者的总生存时间和无病生存时间较短。E：WB法检测干扰MAFG后MAFG的表达。F：PCR法检测干扰MAFG后T24/RT4细胞中MAFG-AS1的表达。G：构建MAFG-AS1启动子MAFG结合区双荧光素酶报告质粒，在T24/RT4细胞中进行双荧光素酶报告基因检测。H，I：使用MAFG抗体在T24/RT4细胞中富集芯片蛋白/DNA复合物。用qPCR检测MAFG-AS1启动子序列在染色质免疫沉淀中的富集。J，N：克隆形成试验检测干扰MAFG后的增殖能力。K-M，O-Q：用相应的试剂盒检测MDA、Iron和Lipid-ROS的表达水平。ns p>0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图5：MAFG-AS1通过招募乙酰化酶EP300在MAFG的基因组位点上促进H3K27ac来促进MAFG的表达。A，E：WB法检测在T24/RT4细胞干扰MAFG-AS1表达后MAFG的表达。B，F：WB法检测EP300敲除后EP300的表达。C，G：WB法检测CREBBP基因敲除后CREBBP的表达。D，H：WB法检测EP300和CREBBP敲除后T24/RT4细胞中MAFG的表达。I-K：GSE5287，GSE87304和GSE124305芯片发现MAFG和EP300之间存在正相关。L，M：使用H3K27ac抗体在T24/RT4细胞中的芯片富集蛋白/DNA复合物。用qPCR检测染色质免疫沉淀中MAFG启动子序列的富集。ns p>0.05，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图6：3-MA、Z-DEVD-FMK对自噬及凋亡水平的影响。A，B：WB用于检测LC3B表达。C，D：使用Annexin V-Fict/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。
图7：MAFG-AS1上调PCBP2水平。A：通过GSE31189芯片分析膀胱癌中MAFG-AS1与PCBP2的相关性。B：MAFG-AS1过表达后用PCR检测MAFG-AS1的表达，并结合UCHL5敲除与否。C：用WB法检测新鲜临床膀胱癌及癌旁组织中MAFG和PCBP2的表达。D：用免疫组化方法检测MAFG和PCBP2在石蜡包埋BUC组织和癌旁组织中的表达。
图8：MAFG和PCBP2在异种移植小鼠模型肿瘤中的表达。A：MAFG下调表达和/或DDP干预后，WB检测肿瘤组织中MAFG和PCBP2的表达。B：上调MAFG-AS1和MAFG表达后，结合PCBP2下调与否，用WB检测肿瘤组织中MAFG和PCBP2的表达。
具体实施方式
下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明
1、材料及方法
细胞培养及转染，qRT-PCR分析，蛋白质印迹分析，免疫组化测定，MTT测定，流式细胞术，免疫沉淀，染色质免疫共沉淀，免疫荧光，双荧光素酶实验，铁比色法，丙二醛（MDA）测定，流式细胞仪测定Lipid-ROS，克隆形成测定，以上方法均是现有方法，在此不再累述。
、结果
2.1 MAFG-AS1能抑制膀胱癌细胞的铁死亡
我们我们在T24/RT4两株细胞中分别对MAFG-AS1敲除及过表达干预（图1G,H），在T24/RT4两株细胞敲除MAFG-AS1后MTT实验进一步证实细胞增殖能力明显受抑制，并且Iron、Lipid-ROS水平显著上升（图1A-F）。（图1C-F）。但加入凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK和自噬抑制剂3-MA对Iron、Lipid-ROS水平及敲除MAFG-AS1诱导的细胞死亡影响轻微（图1C-F）。3-MA、Z-DEVD-FMK对自噬及凋亡水平的影响见补充材料（图6A-D）。克隆形成实验发现敲除MAFG-AS1显著抑制细胞克隆能力以及上调MDA、Iron、Lipid-ROS水平，而过表达MAFG-AS1结果相反（图1I-L）。以上结果提示MAFG-AS1能抑制膀胱癌细胞的铁死亡。
通过铁死亡途径调节膀胱癌细胞对顺铂的化疗敏感性
有研究表明在肿瘤细胞内铁死亡抵抗是顺铂耐药的新机制之一，那么MAFG-AS1能否通过铁死亡来调节膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性呢,在顺铂（DDP）IC50处理下，在T24/RT4两株细胞中干扰MAFG-AS1表达，MTT实验及克隆形成实验证实敲除MAFG-AS1后促进DDP对细胞的杀伤能力及铁死亡相关指标的表达，加入DFO能抑制铁死亡相关指标及DDP的杀伤能力（图2A-G）。过表达MAFG-AS1后抑制DDP对细胞的杀伤能力及铁死亡相关指标的表达，而加入Erastin能促进铁死亡相关指标及DDP的杀伤能力（图2H-L）。上述结果证实MAFG-AS1通过铁死亡途径来调节膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性。
动物实验证实敲除MAFG-AS1能通过促进铁死亡增加膀胱癌细胞对顺铂化疗敏感性
为从体内实验进一步验证我们上述的结论。我们构建了裸鼠皮下成瘤模型，结果发现相对于对照组，DDP与敲除MAFG-AS1均能抑制对肿瘤的生长，而在DDP干预的同时，敲除MAFG-AS1（图3A、G）能进一步增强DDP对肿瘤组织的杀伤作用（图3B-C、H-I）。免疫组化检测肿瘤增殖相关指标Ki67，发现DDP干预及敲除MAFG-AS1后肿瘤组织中的Ki67阳性率下降，而DDP+MAFG-AS1敲除组瘤组织的Ki67阳性率下降更为明显（图3D、J）。以上表明敲除MAFG-AS1增加膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性。我们收集动物血液检测铁死亡相关指标，发现相对于对照组，敲除MAFG-AS1及DDP干预组中的MDA、Iron水平上升（图E-F，K-L）。以上结果证明MAFG-AS1在体内能通过铁死亡途径来调节膀胱癌细胞的顺铂化疗敏感性。
能通过转录调控作用上调MAFG-AS1的表达进而抑制膀胱癌细胞的铁死亡
发现MAFG与MAFG-AS1上游启动子形成反义互补链。因此我们猜测MAFG是否可作为转录因子与MAFG-AS1的启动子结合从而调控MAFG-AS1的表达水平。为了验证这个猜测，我们首先使用UCSC数据库找到MAFG-AS1 Promoter/Upstream by 1500 bases，再通过JASPAR数据库与转录因子MAFG进行预测，发现在632bp-652bp处与MAFG可能有结合位点，且评分高达15.5234分（图4A）。我们通过GSE31189、GSE87304芯片分析发现膀胱癌中MAFG与MAFG-AS1呈正相关（图4B-C）。过表达MAFG后MAFG-AS1的表达水平明显升高，而敲除MAFG则MAFG-AS1的表达下调（图4E）。双荧光素酶实验证实MAFG能够与MAFG-AS1启动子区域结合（图4F）。此外，ChIP-PCR实验进一步证实，在T24/RT4两株细胞中分别干扰MAFG后，以MAFG抗体沉淀复合物并抽提DNA，针对MAFG-AS1启动子区设计引物，行PCR检测MAFG-AS1的表达水平。结果显示过表达MAFG后MAFG-AS1的富集程度明显上升，而敲除MAFG后MAFG-AS1的富集程度则明显下降（图4G-H）。以上表明转录因子MAFG能够正向调控MAFG-AS1的表达。
我们通过GEPIA数据库发现MAFG与膀胱癌患者的预后呈负相关（图4D）。收集的临床标本通过WB和免疫组化结果显示相对于癌旁组织，MAFG在癌组织表达相对增高（图7C,D）。在T24/RT4两株细胞中分别干扰MAFG后，发现过表达MAFG后细胞增殖能力增强及铁死亡相关指标下降，但敲除MAFG后细胞增殖能力下降，而铁死亡相关指标显著上升（图4J-Q）。上述结果表明MAFG能通过转录调控作用上调MAFG-AS1的表达进而抑制膀胱癌细胞的铁死亡。
通过招募乙酰化酶EP300从而促进MAFG表达
我们在顺铂敏感性动物实验中有意思发现敲除MAFG-AS1后MAFG表达下降，提示MAFG-AS1影响MAFG表达（图8A）。我们通过UCSC数据库发现MAFG-AS1与MAFG上游启动子互补区域附近存在H3K27ac 富集。在此前已证实在膀胱癌中MAFG-AS1与MAFG互为正相关。为此我们推断MAFG-AS1可能通过招募乙酰化酶从而促进MAFG表达。我们通过GSE5287、GSE87304、GSE124305芯片分析发现在膀胱癌中MAFG与EP300呈正相关（图5B-D）。在T24/RT4两株细胞中分别干扰MAFG-AS1后，行WB检测MAFG表达，结果表明过表达MAFG-AS1上调MAFG蛋白表达水平，而敲除MAFG-AS1则结果相反（图5E,I）。而敲除CREBBP后MAFG表达下降程度没有敲除EP300明显（图5H,L），说明EP300可能起主导作用。分别干扰MAFG-AS1及敲除EP300后，以H3K27ac抗体沉淀复合物并抽提DNA，针对MAFG mRNA启动子区域设计引物，行PCR检测MAFG mRNA表达水平。结果显示敲除MAFG-AS1与敲除EP300后MAFG的富集程度均明显下降，而过表达MAFG-AS1同时敲除EP300后MAFG的富集程度则无明显改变（图5M）。上述结果表明MAFG-AS1通过招募乙酰化酶EP300从而促进MAFG表达。
综上所述，本发明证实MAFG-AS1在膀胱癌中发挥癌基因作用，并且诱导铁死亡抵抗。本发明还首次证实MAFG-AS1通过在MAFG的基因座上顺式调控促进H3K27ac，从而激活MAFG的转录，形成“MAFG/MAFG-AS1/MAFG”正反馈环。抑制MAFG-AS1或MAFG均能通过拮抗铁死亡抵抗增加膀胱癌细胞对顺铂的敏感性，是非常有价值的降低顺铂耐药性的潜在治疗靶点。因此，靶向“MAFG/MAFG-AS1/MAFG”正反馈环可能成为改善膀胱癌或其他癌症患者的治疗和存活的新的治疗靶点。

Claims (2)

1.敲除MAFG/MAFG-AS1/MAFG正反馈环中MAFG-AS1的试剂在制备膀胱癌顺铂增敏药物中的应用，所述膀胱癌是指BUC。
2.检测MAFG表达水平的试剂在制备预测膀胱癌顺铂敏感性的试剂中的应用，所述膀胱癌是指BUC。
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