CN106947010B - 一种利用光引发raft聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法。本发明属于生物高分子材料领域，具体涉及一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法。本发明是为了解决现有方法无法实现蛋白质纳米粒子构筑的同时又保持了构筑基元蛋白质的催化活性的问题。方法：一、PBS缓冲溶液的配制；二、制备蛋白质大分子链转移剂；三、光引发RAFT水相聚合诱导蛋白质原位自组装。本发明采用光引发RAFT水相聚合的方法，诱导蛋白质原位自组装，提供了一种操作简单、反应条件温和、不破坏蛋白质催化活性、适用范围广和高效率的蛋白质纳米粒子的制备方法。
Description
技术领域
本发明属于生物高分子材料领域，具体涉及一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法。
背景技术
分子自组装是一种在生物系统中普遍存在的现象，是生命科学中最重要的内容之一，通过分子自组装形成各种复杂的生物结构，如DNA合成、RNA转录。近些年来，通过设计合成不同结构及不同亲疏水比例的聚合物，采用超分子自组装的策略制备了具有不同形貌的纳米材料，也展现了其在食品、化妆品工业、催化剂及生物医药等诸多领域具有潜在的应用。但是这种经典的自组装方法，对聚合物的结构设计有很强的依赖性，部分特定结构聚合物的合成较为复杂，一定程度上限定了其大规模制备应用。近而，科研人员提出了一种聚合诱导自组装的新方法来解决上述问题，选择水溶性的大分子链转移剂和水溶性单体(聚合物为非水溶性)在高聚合物浓度条件下原位自组装成不同形貌的纳米材料。但是目前，所有不同形貌的纳米材料主要基于不同功能的聚合物进行设计构筑。然而考虑到其潜在应用于药物传输系统、生物成像及分子治疗等方面，其自身缺少生物相容性和降解性在一定程度上限制了该构筑纳米材料的使用。因此直接利用天然大分子材料，如碳水化合物，多肽和蛋白质等进行不同组装体形貌的构筑引起了研究者们极大的兴趣。其中，蛋白质因其具有好的生物降解性、免疫原性、稳定性、低毒性和易于功能化，成为一种极具吸引力的材料来制备纳米粒子。目前，利用紫杉醇和白蛋白在无溶剂条件下制备的纳米粒子，已经被美国食品药品监督管理局批准用于乳腺癌治疗。发展的制备蛋白质纳米粒子技术主要有：乳化法、热凝胶法、去溶剂化法、喷雾干燥法和在胶束中自组装法。然而上述所有方法都是将蛋白质结构分解或变性来制备纳米粒子。因此如何实现蛋白质纳米粒子构筑的同时又保持了构筑基元蛋白质的催化活性是该领域面临的又一科学挑战。
发明内容
本发明是为了解决现有方法无法实现蛋白质纳米粒子构筑的同时又保持了构筑基元蛋白质的催化活性的问题，而提供了一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法。
一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法具体是按以下步骤进行的：
一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH2PO4和Na2HPO4混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH2PO4与Na2HPO4的质量比为1:(10～12.5)；所述PBS缓冲溶液的浓度为45mmol/L～55mmol/L，pH值为7.4～7.6；
二、制备蛋白质大分子链转移剂：将牛血清白蛋白溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，得到牛血清白蛋白磷酸缓冲液；将α-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂溶于二甲基亚砜中，得到RAFT溶液；在磁力搅拌条件下将RAFT溶液逐滴滴加到牛血清白蛋白磷酸缓冲液中，反应10h～24h后透析2d，冷冻干燥，得到蛋白质大分子链转移剂固体粉末；所述牛血清白蛋白磷酸缓冲液的浓度为1.5mg/mL～2.4mg/mL；所述α-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂的质量与二甲基亚砜的体积比为1mg:(0.4～5)mL；
三、光引发RAFT水相聚合诱导蛋白质原位自组装：将步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末配置成浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液，向浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中依次加入甲基丙烯酸羟丙酯单体和浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液，然后转移至反应器中，除去反应器中的氧气，在可见光LED灯的照射下进行聚合反应1h～12h，得到蛋白质基纳米粒子；所述甲基丙烯酸羟丙酯单体与浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量比为1:(0.02～0.2)；所述浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量与浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液的体积比为1mg:(0.001～0.02)mL。
本发明的有益效果：
本发明采用光引发RAFT水相聚合的方法，诱导蛋白质原位自组装，提供了一种操作简单、反应条件温和、不破坏蛋白质催化活性、适用范围广和高效率的蛋白质纳米粒子的制备方法，该方法适用于多种可以进行RAFT试剂修饰的蛋白质，如牛血清白蛋白，人血清白蛋白，溶菌酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶等。
附图说明
图1为实施例一步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末的紫外光谱图；
图2为实施例一步骤三得到的蛋白质基纳米粒子的微观形貌图；
图3为实施例一步骤三得到的蛋白质基纳米粒子的粒径分布图；
图4为牛血清白蛋白、实施例四中未进行聚合反应的蛋白质基纳米粒子、实施例四中聚合反应2h的蛋白质基纳米粒子和实施例四中聚合反应6h的蛋白质基纳米粒子活性测试柱状对比图，其中1为牛血清白蛋白，2为实施例四步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末，3为实施例四中聚合反应2h的蛋白质基纳米粒子，4为实施例四中聚合反应6h的蛋白质基纳米粒子；
图5为实施例六步骤三得到的蛋白质基纳米粒子的微观形貌图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法具体是按以下步骤进行的：
一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH2PO4和Na2HPO4混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH2PO4与Na2HPO4的质量比为1:(10～12.5)；所述PBS缓冲溶液的浓度为45mmol/L～55mmol/L，pH值为7.4～7.6；
二、制备蛋白质大分子链转移剂：将牛血清白蛋白溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，得到牛血清白蛋白磷酸缓冲液；将α-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂溶于二甲基亚砜中，得到RAFT溶液；在磁力搅拌条件下将RAFT溶液逐滴滴加到牛血清白蛋白磷酸缓冲液中，反应10h～24h后透析2d，冷冻干燥，得到蛋白质大分子链转移剂固体粉末；所述牛血清白蛋白磷酸缓冲液的浓度为1.5mg/mL～2.4mg/mL；所述α-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂的质量与二甲基亚砜的体积比为1mg:(0.4～5)mL；
三、光引发RAFT水相聚合诱导蛋白质原位自组装：将步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末配置成浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液，向浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中依次加入甲基丙烯酸羟丙酯单体和浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液，然后转移至反应器中，除去反应器中的氧气，在可见光LED灯的照射下进行聚合反应1h～12h，得到蛋白质基纳米粒子；所述甲基丙烯酸羟丙酯单体与浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量比为1:(0.02～0.2)；所述浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量与浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液的体积比为1mg:(0.001～0.02)mL。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述NaH2PO4与Na2HPO4的质量比为1:12。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中所述所述PBS缓冲溶液的浓度为50mmol/L。其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中所述牛血清白蛋白磷酸缓冲液的浓度为2mg/mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中所述所述α-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂的质量与二甲基亚砜的体积比为1mg:1mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中将步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末配置成浓度为5mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中所述甲基丙烯酸羟丙酯单体与浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量比为1:0.01。其他步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中所述甲基丙烯酸羟丙酯单体与浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量比为1:0.1。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤三中所述浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量与浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液的体积比为1mg:0.01mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤三中在可见光LED灯的照射下进行聚合反应6h。其他步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果
实施例一：一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法具体是按以下步骤进行的：
一、PBS缓冲溶液的配制：将0.06242g NaH2PO4和0.75222gNa2HPO4混合溶解在50mL去离子水中配制成PBS缓冲溶液；pH值为7.5；
二、制备蛋白质大分子链转移剂：将50mg牛血清白蛋白溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，得到30mL牛血清白蛋白磷酸缓冲液；将3mgα-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂溶于3mL二甲基亚砜中，得到RAFT溶液；在磁力搅拌条件下将RAFT溶液逐滴滴加到牛血清白蛋白磷酸缓冲液中，反应20h后透析2d，冷冻干燥，得到蛋白质大分子链转移剂固体粉末；
三、光引发RAFT水相聚合诱导蛋白质原位自组装：将10mg步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末配置成浓度为10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液，向浓度为10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中依次加入50mg甲基丙烯酸羟丙酯单体和40μL浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液，然后转移至反应器中，除去反应器中的氧气，在可见光LED灯的照射下进行聚合反应12h，得到蛋白质基纳米粒子；并通过DLS、TEM和SEM对实验结果表征。
实施例二：本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤三中将2mg步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末配置成浓度为2mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液。其他与实施例一相同。
实施例三：本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤三中在可见光LED灯的照射下进行聚合反应1h。其他与实施例一相同。
实施例四：本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤三中在可见光LED灯的照射下进行聚合反应6h。其他与实施例一相同。
实施例五：本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤三中向浓度为10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中依次加入100mg甲基丙烯酸羟丙酯单体和40μL浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液。其他与实施例一相同。
实施例六：本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤三中向浓度为10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中依次加入150mg甲基丙烯酸羟丙酯单体和40μL浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液。其他与实施例一相同。
实施例七：本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤二中将1.5mgα-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂溶于3mL二甲基亚砜中；步骤三中向浓度为10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中依次加入50mg甲基丙烯酸羟丙酯单体和20μL浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液。其他与实施例一相同。
上述实施例中采用法国吉尔森移液枪进行溶剂的量取。采用梅特勒-托利多万分之一精密天平用于药品的称取。采用梅特勒-托利多SevenCompact系列pH计用于pH的测量。采用宁波新芝生物科技超声波清洗机用于溶质的溶解。采用美国珀金埃尔默Lambda 750S型紫外分光光度计用于蛋白质大分子链转移剂的表征。采用日本日本电子JEM-1400型透射电子显微镜对蛋白质纳米粒子进行形貌观察。采用日本日立FE-SEM SU8000型扫描电子显微镜对蛋白质纳米粒子进行表征。采用英国马尔文ZetasizerNano ZSP型动态光散射系统对蛋白质纳米粒子尺寸进行表征。
图1为实施例一步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末的紫外光谱图；从图中可以看出RAFT试剂成功修饰到蛋白质表面。设备为美国珀金埃尔默Lambda 750S型紫外分光光度计。
图2为实施例一步骤三得到的蛋白质基纳米粒子的微观形貌图；从图中可以看出蛋白质纳米粒子的形貌。设备为在日本电子JEM-1400型透射电子显微镜。
图3为实施例一步骤三得到的蛋白质基纳米粒子的粒径分布图；从图中可以看出蛋白质纳米粒子的粒径为255nm。设备为英国马尔文Zetasizer Nano ZSP型动态光散射系统。
图4为牛血清白蛋白、实施例四中未进行聚合反应的蛋白质基纳米粒子、实施例四中聚合反应2h的蛋白质基纳米粒子和实施例四中聚合反应6h的蛋白质基纳米粒子活性测试柱状对比图，其中1为牛血清白蛋白，2为实施例四步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末，3为实施例四中聚合反应2h的蛋白质基纳米粒子，4为实施例四中聚合反应6h的蛋白质基纳米粒子；从图中可以看出蛋白质纳米粒子在聚合之后依然保持了其催化活性。
图5为实施例六步骤三得到的蛋白质基纳米粒子的微观形貌图。从图中可以看出蛋白质纳米粒子的形貌。设备为日本日立FE-SEM SU8000型扫描电子显微镜。
Claims (9)
1.一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法，其特征在于利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法具体是按以下步骤进行的：
一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH2PO4和Na2HPO4混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH2PO4与Na2HPO4的质量比为1:(10～12.5)；所述PBS缓冲溶液的浓度为45mmol/L～55mmol/L，pH值为7.4～7.6；
二、制备蛋白质大分子链转移剂：将牛血清白蛋白溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，得到牛血清白蛋白磷酸缓冲液；将α-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂溶于二甲基亚砜中，得到RAFT溶液；在磁力搅拌条件下将RAFT溶液逐滴滴加到牛血清白蛋白磷酸缓冲液中，反应10h～24h后透析2d，冷冻干燥，得到蛋白质大分子链转移剂固体粉末；所述牛血清白蛋白磷酸缓冲液的浓度为1.5mg/mL～2.4mg/mL；所述α-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂的质量与二甲基亚砜的体积比为1mg:(0.4～5)mL；
三、光引发RAFT水相聚合诱导蛋白质原位自组装：将步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末配置成浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液，向浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中依次加入甲基丙烯酸羟丙酯单体和浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液，然后转移至反应器中，除去反应器中的氧气，在可见光LED灯的照射下进行聚合反应1h～12h，得到蛋白质基纳米粒子；所述甲基丙烯酸羟丙酯单体与浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量比为1:(0.02～0.2)；所述浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量与浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液的体积比为1mg:(0.001～0.02)mL。
2.根据权利要求1所述的一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法，其特征在于步骤一中所述NaH2PO4与Na2HPO4的质量比为1:12。
3.根据权利要求1所述的一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法，其特征在于步骤一中所述PBS缓冲溶液的浓度为50mmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法，其特征在于步骤二中所述牛血清白蛋白磷酸缓冲液的浓度为2mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法，其特征在于步骤二中所述α-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂的质量与二甲基亚砜的体积比为1mg:1mL。
6.根据权利要求1所述的一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法，其特征在于步骤三中将步骤二得到的蛋白质大分子链转移剂固体粉末配置成浓度为5mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液。
7.根据权利要求1所述的一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法，其特征在于步骤三中所述甲基丙烯酸羟丙酯单体与浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量比为1:0.1。
8.根据权利要求1所述的一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法，其特征在于步骤三中所述浓度为2mg/mL～10mg/mL的蛋白质大分子链转移剂水溶液中溶质的质量与浓度为1mg/mL的氯化三(2,2’-联吡啶)钌水溶液的体积比为1mg:0.01mL。
9.根据权利要求1所述的一种利用光引发RAFT聚合原位诱导自组装制备蛋白质基纳米粒子的方法，其特征在于步骤三中在可见光LED灯的照射下进行聚合反应6h。
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