WO2013022022A1 - 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 - Google Patents

効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 Download PDF

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WO2013022022A1
WO2013022022A1 PCT/JP2012/070199 JP2012070199W WO2013022022A1 WO 2013022022 A1 WO2013022022 A1 WO 2013022022A1 JP 2012070199 W JP2012070199 W JP 2012070199W WO 2013022022 A1 WO2013022022 A1 WO 2013022022A1
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expression cassette
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nucleic acid
expression
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圭介 沖田
伸弥 山中
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国立大学法人京都大学
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    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Definitions

  • the present invention relates to a method for establishing an efficient artificial pluripotent stem (hereinafter referred to as iPS) cell using an episomal vector and a vector set therefor. More specifically, the present invention relates to (a) an expression cassette comprising a nucleic acid encoding Oct3 / 4, (b) a nucleic acid encoding Sox2 and a nucleic acid encoding Klf4 in this order in the 5 ′ to 3 ′ direction.
  • iPS artificial pluripotent stem
  • the present invention also provides an early self-eliminating episomal vector containing the nucleic acid factors (a) to (d) in a specific permutation, and using the same, without involving integration of a foreign nucleic acid factor into the genome,
  • the present invention relates to a method for rapidly establishing iPS cells in which the nucleic acid factor has disappeared.
  • viral vectors such as retroviruses and lentiviruses are superior in that they have higher gene transfer efficiency than non-viral vectors, and therefore iPS cells can be easily produced.
  • retroviruses and lentiviruses are integrated into the chromosome, there are safety issues when considering the clinical application of iPS cells. For this reason, iPS cells that have not been integrated into chromosomes using non-viral vectors such as adenoviral vectors and plasmids have been reported (9-11), but their establishment efficiency is low compared to retroviruses and lentiviruses.
  • An object of the present invention is to efficiently establish safe human iPS cells suitable for clinical application. Therefore, the first object of the present invention is to provide a means for improving the establishment efficiency of iPS cells, particularly human iPS cells, and to provide an efficient method of producing iPS cells using the same. .
  • the second object of the present invention is to provide a method for rapidly establishing iPS cells from which the nucleic acid factor has disappeared without involving the integration of the foreign nucleic acid factor into the genome.
  • the third problem of the present invention is to increase the efficiency of disappearance of foreign nucleic acid factors and reduce the cost of GMP-grade vector production for regenerative medicine applications, without reducing the efficiency of iPS cell establishment. This is to reduce the number of vectors to be introduced.
  • the present inventors have mounted nucleic acids encoding shRNA against Oct3 / 4 (O), Sox2 and Klf4 (SK), L-Myc and Lin28 (UL), and p53, respectively.
  • G Glis1
  • the 5 ′ to 3 ′ direction [ A combination of two episomal vectors in which the reprogramming factors are arranged in the order of nucleic acid A]-[nucleic acid B], and the nucleic acid (O) encoding Oct3 / 4 is arranged at the position of nucleic acid B
  • iPS cell establishment efficiency equal to or higher than that obtained when 4 expression cassettes were mounted on separate vectors (4V) was obtained.
  • nucleic acids (SK) encoding Sox2 and Klf4 are arranged at the position of nucleic acid A
  • the establishment efficiency is further improved compared to the case of using 4V, and particularly with SK A first episomal vector in which O is located at the position of nucleic acid A and nucleic acid B, respectively, a nucleic acid (UL) encoding L-Myc and Lin28, and a nucleic acid (G) encoding Glis1, respectively.
  • the introduced episomal vector was maintained for a period required for reprogramming and quickly dropped out from the cells after expressing the reprogramming factor.
  • the present invention is as follows. [1] (a) An expression cassette containing a nucleic acid encoding Oct3 / 4, (b) A nucleic acid encoding Sox2 and a nucleic acid encoding Klf4 enable dicistronic expression in this order from 5 'to 3' An expression cassette linked via an intervening sequence, (c) an intervening that allows a nucleic acid encoding L-Myc and a nucleic acid encoding Lin28 in the 5 ′ to 3 ′ direction in this order to be dicistronic Equipped with a first episomal vector containing two expression cassettes selected from expression cassettes linked via sequences and (d) an expression cassette containing a nucleic acid encoding Glis1, and the remaining two expression cassettes
  • the first episomal vector is a protein that binds to a functional replication origin in mammalian cells and controls replication of the vector in mammalian cells.
  • the first episomal vector is 3 'to the gene encoding a protein that binds to a functional replication origin in mammalian cells and controls replication of the vector in mammalian cells.
  • the first episomal vector is 3 ′ of the gene
  • the expression cassette (c) or (d) and the expression cassette (a) are arranged in the 5 ′ to 3 ′ direction starting from the side, and the second episomal vector contains 3 of the gene.
  • the first episomal vector is arranged in the order of the expression cassette (b) and the expression cassette (a) in the 5 ′ to 3 ′ direction starting from the 3 ′ side of the gene
  • the second episomal vector is arranged in the order of the expression cassette (c) and the expression cassette (d) in the 5 ′ to 3 ′ direction starting from the 3 ′ side of the gene [1] The method described.
  • [4] The method according to any one of [1] to [3] above, wherein at least one of the expression cassettes (a) to (d) comprises a woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (WPRE) sequence.
  • WPRE woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element
  • the first and / or second episomal vectors are obtained by arranging loxP sequences in the same direction on the 5 ′ side and 3 ′ side of vector elements necessary for vector replication, The method according to any one of [4].
  • the functional replication origin in mammalian cells is oriP
  • a protein that binds to oriP and controls replication of the vector in mammalian cells is EBNA
  • [8] (a) An expression cassette containing a nucleic acid encoding Oct3 / 4, (b) A nucleic acid encoding Sox2 and a nucleic acid encoding Klf4 enable dicistronic expression in this order from 5 'to 3' An expression cassette linked via an intervening sequence, (c) an intervening that allows a nucleic acid encoding L-Myc and a nucleic acid encoding Lin28 in the 5 ′ to 3 ′ direction in this order to be dicistronic Equipped with a first episomal vector containing two expression cassettes selected from expression cassettes linked via sequences and (d) an expression cassette containing a nucleic acid encoding Glis1, and the remaining two expression cassettes
  • the first episomal vector is a protein that binds to a functional replication origin in mammalian cells and controls replication of the vector in mammalian cells.
  • the first episomal vector is 3 ′ of a gene encoding a protein that binds to a replication origin functional in mammalian cells and controls replication of the vector in mammalian cells.
  • the first episomal vector is 3 ′ of the gene
  • the expression cassette (c) or (d) and the expression cassette (a) are arranged in the 5 ′ to 3 ′ direction starting from the side, and the second episomal vector contains 3 of the gene.
  • the first episomal vector is arranged in the order of the expression cassette (b) and the expression cassette (a) in the 5 ′ to 3 ′ direction starting from the 3 ′ side of the gene
  • the second episomal vector is arranged in the order of the expression cassette (c) and the expression cassette (d) in the 5 ′ to 3 ′ direction starting from the 3 ′ side of the gene
  • the described vector set [11] The vector set according to any one of [8] to [10] above, wherein at least one of the expression cassettes (a) to (d) comprises a woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (WPRE) sequence.
  • WPRE woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element
  • the first and / or second episomal vector has loxP sequences arranged in the same direction on the 5 ′ side and 3 ′ side of vector elements necessary for vector replication.
  • the functional replication origin in mammalian cells is oriP
  • a protein that binds to oriP and controls replication of the vector in mammalian cells is EBNA
  • An iPS cell inducer comprising the vector set according to any one of [8] to [13] above.
  • Glis1 instead of a p53 function inhibitor can further increase the efficiency of iPS cell establishment without suppressing the expression of tumor suppressor genes, thus providing safer and more efficient human iPS cells. Is possible.
  • iPS cells can be established without involving the integration of foreign nucleic acid factors into the genome, and episomes can be quickly removed after iPS cell establishment. It is extremely useful in the application of regenerative medicine.
  • FIG. 1 shows the structures of plasmids pCXLE-hOct4, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL and pCXLE-Glis1.
  • FIG. 2 is a graph comparing the effects of p53shRNA and Glis1 on iPS cell establishment efficiency.
  • FIG. 3 is a diagram showing the general structure of the pCEB plasmid (upper) and a table showing the arrangement of reprogramming factors in each pCEB plasmid (lower). The numbers in the table indicate the vector numbers shown in this specification.
  • FIG. 4 shows the structures of plasmids pCEB-hSK-O and pCEB-hUL-G.
  • FIG. 5 is a photograph of an iPS cell colony at the time of establishment and passage 5 of an iPS cell line 836B-3 established from HDF1388 cells with a combination of K (pCEB-hSK-O and pCEB-hUL-G).
  • FIG. 4 shows the structures of plasmids pCEB-hSK-O and pCEB-hUL-G.
  • FIG. 5 is a photograph of an iPS cell colony at the time of establishment and passage 5 of an iPS cell line 836B-3 established from HDF1388 cells with a combination of K (pCE
  • FIG. 6 is a graph showing the results of establishing iPS cells using a combination of G, H, I, K and L plasmids using dental pulp stem cells DP74 and DP94.
  • black bars indicate the number of ES-like colonies (iPS cell colonies), and white bars indicate the number of non-ES-like colonies.
  • “4v” indicates a combination of pCXLE-hOct4, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL and pCXLE-Glis1
  • “-G + shRNA” indicates a combination of pCXLE-hOct4-p53shRNA, pCXLE-hSK and pCXLE-hUL.
  • “Cont” indicates introduction of pCXLE-EGFP.
  • FIG. 7 shows the structure of plasmid pCXWE-6F.
  • the present invention comprises (a) an expression cassette comprising a nucleic acid encoding Oct3 / 4, (b) a nucleic acid encoding Sox2 and a nucleic acid encoding Klf4 in this order in the 5 'to 3' direction.
  • a method for producing iPS cells comprising: contacting a somatic cell with a vector set in which the expression cassette is arranged in a specific permutation, the set being a second episomal vector having two expression cassettes.
  • Somatic cell sources Somatic cells that can be used as a starting material for the production of iPS cells are any cells other than germ cells derived from mammals (eg, humans, mice, monkeys, pigs, rats, etc.).
  • keratinized epithelial cells eg, keratinized epidermal cells
  • mucosal epithelial cells eg, epithelial cells of the tongue surface
  • exocrine glandular epithelial cells eg, mammary cells
  • hormone secreting cells eg, adrenal glands
  • Medullary cells cells for metabolism / storage (eg, hepatocytes)
  • luminal epithelial cells that make up the interface eg, type I alveolar cells
  • luminal epithelial cells of the inner chain eg, vascular endothelial cells
  • Ciliated cells with transport ability eg, airway epithelial cells
  • extracellular matrix secreting cells eg, fibroblasts
  • contractile cells eg
  • undifferentiated progenitor cells including somatic stem cells
  • terminally differentiated mature cells It can be used as the source of somatic cells in the invention.
  • undifferentiated progenitor cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • dental pulp stem cells can be isolated and prepared from teeth extracted due to wisdom teeth, periodontal disease, etc., so they are readily available and are expected to be used as somatic cell sources for iPS cell banks in the future. .
  • blood cells peripheral mononuclear cells, peripheral blood lymphocytes, umbilical cord blood cells, etc.
  • peripheral blood lymphocytes peripheral blood lymphocytes
  • umbilical cord blood cells etc.
  • somatic cells are collected from others who are the same or substantially the same.
  • the type of HLA is “substantially the same” means that when the cells obtained by inducing differentiation from iPS cells derived from the somatic cells are transplanted into a patient by using an immunosuppressant or the like, the transplanted cells are This means that the HLA types match to the extent that they can be engrafted.
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, and further 4 loci including HLA-Cw
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR, and further 4 loci including HLA-Cw
  • iPS cells when not being administered (transplanted) to humans, for example, when iPS cells are used as a source of screening cells for evaluating the patient's drug sensitivity and the presence or absence of side effects, It is desirable to collect somatic cells from others who have the same genetic polymorphism that correlates with side effects.
  • Somatic cells isolated from mammals can be pre-cultured in a medium known per se suitable for culturing according to the type of cells prior to being subjected to the nuclear reprogramming step.
  • a medium known per se suitable for culturing according to the type of cells prior to being subjected to the nuclear reprogramming step.
  • a medium include a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal calf serum (FCS), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 medium, and the like.
  • MEM minimum essential medium
  • FCS fetal calf serum
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI1640 medium fetal calf serum
  • 199 medium fetal calf serum
  • F12 medium fetal calf serum
  • it is not limited to them.
  • a medium for mesenchymal stem cells such as Mesenchymal stem cells basal medium (Lon
  • the vector set of the present invention Upon contact with the first and second episomal vectors of the present invention (also referred to as “the vector set of the present invention”) (and, if necessary, a substance for improving the establishment efficiency of iPS cells), for example, introduction of cationic liposomes, etc.
  • a substance for improving the establishment efficiency of iPS cells for example, introduction of cationic liposomes, etc.
  • a medium that does not contain non-human animal-derived components such as FCS.
  • a medium supplemented with human-derived components (particularly recombinant human proteins such as growth factors), non-essential amino acids, vitamins, etc. suitable for culturing various somatic cells in a basic medium is commercially available.
  • an appropriate xeno-free medium can be selected.
  • the somatic cells pre-cultured in the xeno-free medium are detached from the culture vessel using an appropriate xeno-free cell detachment solution, collected, and then subjected to contact with the vector set of the present invention.
  • nuclear reprogramming material (reprogramming factor)
  • “nuclear reprogramming substance” and “reprogramming factor” mean a proteinous factor (group) capable of inducing iPS cells from somatic cells.
  • the nuclear reprogramming substance (reprogramming factor) encoded by the nucleic acid mounted on the vector set of the present invention may be Oct3 / 4 (may be abbreviated as “O”) or Sox2 (may be abbreviated as “S”). ), Klf4 (may be abbreviated as “K”), L-Myc (may be abbreviated as “U”), Lin28 (may be abbreviated as “L”), and Glis1 (as “G”) 6 factors).
  • Lin28b can be used instead of Lin28.
  • Mouse and human cDNA sequence information of each nuclear reprogramming substance can be obtained by referring to NCBI accession numbers described in WO 2007/069666 (L-Myc, Lin28, Lin28b and Glis1 mouse and human cDNA sequence information can be obtained by referring to the following NCBI accession numbers), and those skilled in the art can easily isolate these cDNAs.
  • Expression cassette Nucleic acids encoding the above six reprogramming factors are mounted on episomal vectors as the following four expression cassettes.
  • (b) The nucleic acid (S) encoding Sox2 and the nucleic acid (K) encoding Klf4 are linked in the 5 'to 3' direction via an intervening sequence that enables dicistronic expression in this order (SK).
  • Expression cassette (c) via an intervening sequence that allows dicistronic expression of the nucleic acid encoding L-Myc (U) and the nucleic acid encoding Lin28 (L) in this order (UL) in the 5 'to 3' direction Linked expression cassette (d) an expression cassette containing a nucleic acid (G) encoding Glis1
  • examples of the “intervening sequence enabling dicistronic expression” include 2A sequences of foot-and-mouth disease virus (PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007), IRES sequences (US Patent No. 4,937,190). Etc.), preferably 2A sequences can be used.
  • An “expression cassette” includes, in addition to a nucleic acid encoding a reprogramming factor (ie, O, SK, U-L, and G), at least a promoter that is operably linked to the nucleic acid.
  • the promoter examples include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Moloney murine leukemia virus) LTR, HSV-TK ( Herpes simplex virus thymidine kinase) promoter and the like are used.
  • EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, MoMuLV LTR, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • the expression cassette may contain an enhancer sequence (for example, an early enhancer before CMV, etc.) for enhancing expression of reprogramming factor in addition to a basal promoter sequence.
  • the expression cassette of the present invention contains a polyA addition signal 3 ′ downstream of the nucleic acid encoding the reprogramming factor in addition to the promoter.
  • the expression cassette of the present invention contains, for example, a woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (for example, between the reprogramming factor coding region and the polyA addition signal) in order to improve the stability of the reprogramming factor mRNA. WPRE) sequences may be inserted.
  • the episomal vector used in the present invention includes, for example, a vector derived from EBV, SV40 or the like and containing a sequence necessary for autonomous replication in mammalian cells as a vector element.
  • vector elements necessary for autonomous replication in mammalian cells include a replication origin that is functional in mammalian cells and a gene that encodes a protein that binds to the replication origin and controls replication
  • the replication origin oriP and EBNA-1 gene and for SV40, the replication origin ori and SV40 large T antigen gene can be mentioned. More preferably, the oriP and EBNA-1 genes are used.
  • episomal vectors allow bacterial and yeast replication origins (eg, pUC ori, ColE1 ori, 2 ⁇ ori, etc.) and selectable marker genes to enable large-scale amplification in bacteria such as E. coli and yeast if desired.
  • bacterial and yeast replication origins eg, pUC ori, ColE1 ori, 2 ⁇ ori, etc.
  • selectable marker genes to enable large-scale amplification in bacteria such as E. coli and yeast if desired.
  • an ampicillin resistance gene, an auxotrophic complementary gene may be further contained.
  • the selection marker gene in mammalian cells may further include, for example, a dihydrofolate reductase gene, a neomycin resistance gene, and the like.
  • the episomal vector can contain a multicloning site so that an expression cassette of a nucleic acid encoding the reprogramming factor can be easily inserted.
  • the promoter, enhancer, polyA addition signal, WPRE sequence and the like in the above expression cassette are previously contained on an episomal vector, and the promoter and polyA addition signal (if the vector contains a WPRE sequence, the WPRE sequence).
  • An episomal vector can be designed so that a gene transfer vector can be constructed by inserting a nucleic acid encoding an reprogramming factor.
  • the episomal vector preferably includes a multiple cloning site between the promoter and a polyA addition signal (or a WPRE sequence if the vector includes a WPRE sequence).
  • the vector set of the present invention is constructed by mounting two expression cassettes (a) to (d) on two episomal vectors.
  • the present invention has much higher iPS cell establishment efficiency than the combination of 5 reprogramming factors (O / S / K / U / L) and p53 shRNA previously reported by the present inventors. Not only was achieved by the combination of 6 reprogramming factors (O / S / K / U / L / G) with the addition of 6 factors (4 expression cassettes) originally mounted on 4 episomal vectors.
  • the feature is that it has been successfully mounted on two episomal vectors while maintaining the above establishment efficiency. That is, the present invention is based, at least in part, on the discovery that iPS cell establishment efficiency differs significantly depending on the combination and the order in which the four expression cassettes are arranged on the episomal vector. is there.
  • the vector set of the present invention is constructed by mounting two expression cassettes (a) to (d) above on two episomal vectors according to the following rules.
  • a protein for example, EBNA-1, SV40 large T antigen, preferably EBNA-1
  • EBNA-1 SV40 large T antigen
  • EBNA-1 SV40 large T antigen
  • the expression cassette (a) (including the nucleic acid (O) encoding Oct3 / 4) is located at the position of expression cassette B; 2) The expression cassette (b) above (the nucleic acid (S) encoding Sox2 and the nucleic acid (K) encoding Klf4 enable dicistronic expression in this order (SK) in the 5 'to 3' direction) Are linked at the position of expression cassette A).
  • the expression cassette of (a) and the expression cassette of (b) may be mounted on the same episomal vector (i) ((b)- (ii) arranged on a different episomal vector (arranged on the first episomal vector in the order (c) or (d)-(a)) And (b)-(d) or (c) in this order on the second episomal vector).
  • the combination of (ia) above that is, the first episomal vector: (b)-(a) (SK-O as the arrangement of reprogramming factors) and the second expression vector : Combination with (c)-(d) UL (UL-G as the arrangement of initialization factors).
  • the transcription direction of each expression cassette is not particularly limited, and two expression cassettes may be inserted so as to be transcribed in the same direction (head-to-tail), or in opposite directions. (Head-to-head or tail-to-tail).
  • the transcription direction of each expression cassette is the same as the transcription direction of a gene encoding a protein that binds to a replication origin functional in mammalian cells and controls replication of the vector in mammalian cells. It may be in the opposite direction.
  • all expression cassettes are mounted on a vector so that they are transcribed in the same direction as the gene.
  • an episomal vector in which loxP sequences are arranged in the same direction on the 5 'side and 3' side of vector elements necessary for replication of the episomal vector in mammalian cells can be used.
  • Episomal vectors can autonomously replicate outside the chromosome, so they can provide stable expression in the host cell even if they are not integrated into the genome, but once the iPS cells are established, the vectors are removed quickly It is desirable.
  • a vector element necessary for replication of an episomal vector in a mammalian cell is sandwiched between two loxP sequences, and Cre recombinase is applied to the vector element to cut out the vector element, thereby losing the autonomous replication ability of the episomal vector. And the vector can be removed from the iPS cells early.
  • the loxP sequence used in the present invention is a wild type loxP sequence derived from bacteriophage P1, and when placed in the same direction at a position sandwiching a vector element required for replication of an episomal vector in a mammalian cell Include any mutated loxP sequence that can undergo recombination to delete sequences between loxP sequences.
  • Examples of the mutant loxP sequence include lox71 having a mutation in the 5 'repeat, lox66 having a mutation in the 3' repeat, lox2272 and lox511 having a mutation in the spacer portion, and the like.
  • the two loxP sequences arranged on the 5 ′ side and 3 ′ side of the vector element may be the same or different, but in the case of a mutant loxP sequence having a mutation in the spacer portion (for example, , Lox2272 and lox511) are used.
  • a mutant loxP sequence eg, lox71
  • a mutant loxP sequence eg, lox66
  • the loxP sequence that remains on the chromosome as a result of recombination has double mutations in the 5 'and 3' repeats, making it difficult to recognize by Cre recombinase, and chromosomal deletion mutations due to unnecessary recombination. The risk of causing this is reduced.
  • any of the mutant loxP sequences may be arranged on the 5 ′ side and 3 ′ side of the vector element, but the mutation site is mutated so that the mutation site is located at the outer end of the loxP sequence. It is necessary to insert the loxP sequence.
  • the preferred episomal vector of the present invention is a self-eliminating vector that drops off from cells early without the action of Cre recombinase. However, exceptional cases may take time to drop out of cells. In some cases, it may be preferable to design a loxP sequence in preparation for the risk of unnecessary recombination due to Cre recombinase treatment.
  • the two loxP sequences are vector elements necessary for replication of the episomal vector in mammalian cells (ie, origins of replication functional in mammalian cells (eg, EBV P, SV40 ori, etc., preferably oriP)),
  • a protein that binds to the replication origin and regulates replication for example, a gene sequence encoding EBNA-1, SV40 large T antigen, etc., preferably EBNA-1) is located on the 5 ′ side and 3 ′ side. Arranged in the direction.
  • the vector element sandwiched by the loxP sequence may be either the replication origin, or only one of the gene sequence encoding the protein that binds to the replication origin and controls replication, or both.
  • the present invention When the episomal vector used in the present invention is introduced into a somatic cell regardless of the presence or absence of the loxP sequence, the foreign nucleic acid factor (including the reprogramming gene) constituting the vector is transiently in the cell.
  • the present invention also provides a self-eliminating episomal vector that provides the expression of a reprogramming factor sufficient for the establishment of iPS cells and then drops off from the cells at an early stage.
  • “drop off” means the presence of the vector in the PCR analysis described in Example 6 or 10 of WO 2011/016588 A1 or the RT-PCR analysis described in Example 11, or mounted on the vector. This means that the expression of the reprogramming factor is not detected (below the detection limit).
  • a vector is characterized in that 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more of clones established by the introduction thereof are eliminated from iPS cells by 10 passages.
  • the self-eliminating episomal vector has an order of 10 6 copies per 1 ⁇ 10 4 cells within one week after introduction, whereas iPS cells are established (for example, about four weeks after vector introduction). ), The number of copies per 1 ⁇ 10 4 cells is 100 or less, preferably 50 or less, more preferably 30 or less.
  • the early self-elimination vector of the present invention comprises at least one of the following (i) to (vii), preferably two or more, more preferably three or more, particularly preferably four or more. It has structural features.
  • the array is arranged in the same direction.
  • the nucleic acid encoding the reprogramming factor is under the control of the CAG promoter.
  • the nucleic acid encoding the reprogramming factor is under the control of the CMV immediate early enhancer.
  • the nucleic acid encoding the reprogramming factor is under the control of a rabbit ⁇ -globin polyA addition signal.
  • a WPRE sequence is included between the nucleic acid encoding the reprogramming factor and the polyA addition signal.
  • (vi) contains a bacterial origin of replication (eg, pUC ori, ColE1 ori, preferably pUC ori) and a marker gene (eg, ampicillin resistance gene) that allows selection in bacteria.
  • Example 6 even when a gene transfer vector having four expression cassettes mounted on one episomal vector is introduced into a somatic cell, an iPS cell can be established. In this case as well, establishment efficiency may be further improved by examining the arrangement order of the expression cassettes.
  • a vector set comprising a combination of the above two episomal vectors includes, for example, lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, and microinjection method. It can be introduced into somatic cells using a gene gun method or the like. Specifically, for example, the method described in Science, 324: 797-801 (2009), WO 2011/016588 A1 or Nature Methods, 8 (5), 409-412 (2011) can be used.
  • Whether or not the vector element necessary for replication of the episomal vector in the mammalian cell from the iPS cell has been removed can be confirmed within the vector element and / or in the vicinity of the loxP sequence (if the loxP sequence is used).
  • a nucleic acid containing the base sequence as a probe or primer performing the Southern blot analysis or PCR analysis using the episomal fraction isolated from the iPS cells as a template, and checking the presence or absence of the band or the length of the detection band (See WO 2011/016588 A1, Nature Methods, 8 (5), 409-412 (2011)).
  • Episomal fractions may be prepared using methods well known in the art.For example, Science, 324: 797-801 (2009), WO 2011/016588 A1 or Nature Methods, 8 (5), 409-412 ( 2011) etc. can be used.
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • HDAC1 siRNA Smartpool registered trademark
  • HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 OriGene
  • Nucleic acid expression inhibitors of G9a include G9a histone methyltransferase inhibitors [eg BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)), small molecule inhibitors, siRNA and shRNA against G9a (eg, Nucleic acid expression inhibitors such as G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology) etc.)], L-calcium channel agonist (eg Bayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)), p53 inhibitor ( For example, siRNA against p53, shRNA, dominant negative etc.
  • G9a histone methyltransferase inhibitors eg BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)
  • small molecule inhibitors eg, Nucleic acid expression inhibitors such as G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology) etc.
  • L-calcium channel agonist eg Bayk8644
  • p53 inhibitor For example, siRNA against
  • Wnt Signaling activator eg soluble Wnt3a
  • MEK inhibitors 2i / LIF (2i is an inhibitor of mitogen-activated protein kinas
  • the nucleic acid expression inhibitor may be in the form of an expression vector containing DNA encoding siRNA or shRNA.
  • the contact of these iPS cell establishment efficiency improving substances with somatic cells may be carried out when the substance is (a) protein factor, (b) ⁇ a nucleic acid encoding the protein factor, or (c) low molecular weight compound. Can be carried out by a well-known and conventional method.
  • the substance for improving iPS cell establishment efficiency may be contacted with the somatic cell simultaneously with the vector set of the present invention as long as the iPS cell establishment efficiency from the somatic cell is significantly improved as compared with the absence of the substance. Alternatively, either one may be contacted first.
  • the iPS cell establishment efficiency can be further improved by culturing cells under hypoxic conditions in the somatic cell nuclear reprogramming step.
  • the “hypoxic condition” means that the oxygen concentration in the atmosphere when cells are cultured is significantly lower than that in the air. Specifically, the oxygen concentration condition is lower than the oxygen concentration in the atmosphere of 5-10% CO 2 / 95-90% air generally used in normal cell culture. For example, oxygen in the atmosphere Conditions with a concentration of 18% or less apply.
  • the oxygen concentration in the atmosphere is 15% or less (eg, 14% or less, 13% or less, 12% or less, 11% or less, etc.), 10% or less (eg, 9% or less, 8% or less, 7% or less) 6% or less), or 5% or less (eg, 4% or less, 3% or less, 2% or less, etc.).
  • the oxygen concentration in the atmosphere is preferably 0.1% or more (eg, 0.2% or more, 0.3% or more, 0.4% or more), 0.5% or more (eg, 0.6% or more, 0.7% or more, 0.8% or more, 0.95 Etc.), or 1% or more (eg, 1.1% or more, 1.2% or more, 1.3% or more, 1.4% or more, etc.).
  • a method for creating a hypoxic state in the cell environment is not particularly limited, but a method of culturing the cells in a CO 2 incubator in which the oxygen concentration can be adjusted is the easiest and is a preferable example.
  • CO 2 incubators with adjustable oxygen concentration are sold by various equipment manufacturers (for example, CO for low oxygen culture by manufacturers such as Thermo scientific, Ikemoto Rika Kogyo, Toji Field, and Waken Pharmaceutical Co., Ltd.) 2 incubators can be used).
  • the time when cell culture is started under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the iPS cell establishment efficiency from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%). It may be before contact with the vector set of the invention, simultaneously with the contact, or after the contact. For example, immediately after contacting the vector set with a somatic cell or after contact It is preferable to culture under hypoxic conditions after a certain period (for example, 1 to 10 (eg, 2,3,4,5,6,7,8 or 9) days).
  • the period for culturing cells under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the establishment efficiency of iPS cells from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%). Examples include, but are not limited to, a period of not less than 7 days, not less than 10 days, not more than 50 days, not more than 40 days, not more than 35 days, or not more than 30 days.
  • a preferable culture period under low oxygen conditions varies depending on the oxygen concentration in the atmosphere, and those skilled in the art can appropriately adjust the culture period according to the oxygen concentration used. In one embodiment, when selection of iPS cell candidate colonies is performed using drug resistance as an index, it is preferable to return from a low oxygen condition to a normal oxygen concentration before drug selection is started.
  • the preferred time and preferred culture period for starting cell culture under hypoxic conditions also vary depending on the iPS cell establishment efficiency under normoxic conditions.
  • the cells After contacting with the vector set of the present invention (and a substance for improving the establishment efficiency of iPS cells if necessary), the cells can be cultured under conditions suitable for culturing ES cells, for example.
  • Leukemia® Inhibitory® Factor LIF
  • LIF Leukemia® Inhibitory® Factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • SCF stem cell factor
  • STO cell line As fibroblasts derived from mouse fetuses, STO cell line (ATCC CRL-1503) is usually used as a feeder. However, for induction of iPS cells, neomycin resistance gene and LIF gene were stably integrated into STO cells. SNL cells (SNL76 / 7 STO cells; ECACC 07032801) (McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) are often used. Moreover, primary fibroblasts (MEF) derived from mouse fetuses can also be used. Mitomycin C-treated MEF is commercially available from Millipore and Reprocell. Co-culture with these feeder cells may be started before the contact of the vector set of the present invention, or may be started at the time of contact or after the contact (for example, after 1-10 days). .
  • the vector set of the present invention By using the vector set of the present invention, from the introduction of the vector set into somatic cells until iPS cells are established and further maintained as iPS cells, they are cultured without any non-human animal-derived components ( That is, it is possible to produce human iPS cells (under completely xeno-free conditions). When inducing human iPS cells under xeno-free conditions, after contacting the vector set of the present invention (and, if necessary, a substance that improves the establishment efficiency of iPS cells), the cells may be FCS or other non-human animals. It is cultured in a medium that does not contain derived components.
  • a human-derived purified protein preferably a recombinant protein
  • feeder cells any human-derived somatic cells can be used.
  • human dermal fibroblasts (HDF) and human dental pulp stem cells can be preferably used.
  • HDF human dermal fibroblasts
  • a commercially available xeno-free coating agent can be used instead of matrigel or gelatin as the coating agent for the cell container.
  • the selection of iPS cell candidate colonies includes a method using drug resistance and reporter activity as indicators and a method using visual morphological observation.
  • the former include a drug resistance gene and / or a gene locus that is specifically highly expressed in differentiated pluripotent cells (for example, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, etc., preferably Nanog or Oct3 / 4).
  • a recombinant cell targeted with a reporter gene is used to select colonies that are drug resistant and / or reporter activity positive.
  • Such recombinant cells include, for example, MEF (Takahashi & naka Yamanaka, Cell, 126, 663) derived from a mouse in which a ⁇ geo (encoding a fusion protein of ⁇ -galactosidase and neomycin phosphotransferase) gene is knocked in at the Fbx15 locus. -676 (2006)), or MEFs derived from transgenic mice incorporating the green fluorescent protein (GFP) gene and puromycin resistance gene at the Nanog locus (Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)) Etc.
  • MEF green fluorescent protein
  • examples of a method for selecting candidate colonies by visual morphological observation include the methods described in Takahashi et al., Cell, 131, 861-872-8 (2007).
  • a method using a reporter cell is simple and efficient, when iPS cells are produced for the purpose of human therapeutic use, visual colony selection is desirable from the viewpoint of safety.
  • iPS cells can also be performed by the above-described Nanog (or Oct3 / 4) reporter positive (puromycin resistance, GFP positive, etc.) and visual formation of ES cell-like colonies.
  • tests such as alkaline phosphatase staining, expression of various ES cell-specific genes, and transplantation of selected cells to mice to confirm teratoma formation can also be performed. .
  • the iPS cells thus established can be used for various purposes.
  • the differentiation induction method reported for ES cells is used to induce differentiation of iPS cells into various cells (eg, cardiomyocytes, blood cells, nerve cells, vascular endothelial cells, insulin secreting cells, etc.). be able to. Therefore, if iPS cells are induced using somatic cells collected from the patient or another person who has the same or substantially the same type of HLA, the desired cells (ie, the organ in which the patient is affected) Stem cell therapy by autologous or allogeneic transplantation is possible, in which cells and cells that exhibit therapeutic effects on diseases are differentiated and transplanted into the patient.
  • Example Example 1 Comparison of the effects of p53shRNA and Glis1 on iPS cell establishment efficiency Okita et al., Nature Methods, 8 (5), 409-412 (2011), and a combination of six genes described in International Publication WO2011 / 016588 ( Human Oct3 / 4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28, and p53 shRNA) and 6 gene combinations using Glis1 (Nature, 474, 225-229 (2011) doi: 10.1038 / nature10106) instead of p53 shRNA Then, iPS cell establishment efficiency was compared. Specifically, the following plasmid introductions were compared.
  • FIG. 2 shows the results of counting the number of ES-like colonies (iPS colonies) and non-ES-like colonies on the 25th day after plasmid introduction. It was revealed that the use of Glis1 instead of p53shRNA increases iPS cell establishment efficiency.
  • Example 2 Preparation of various episomal plasmids for reprogramming Reduce the number of plasmids while maintaining iPS cell establishment efficiency equal to or higher than the introduction of four types of plasmids, pCXLE-hOct4, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL and pCXLE-Glis1 Study was carried out. Specifically, various episomal plasmids were prepared using plasmids described in Okita et al., Nature Methods, 8 (5), 409-412 (2011) and International Publication WO2011 / 016588 to establish iPS cell An efficiency comparison was made. Finally, the following 12 types of episomal plasmids 1) to 12) were prepared (FIG. 3).
  • pCEB-hO-SK A construct in which the translation region of human Oct3 / 4 and the translation region of human Sox2 and human Klf4 are linked via the foot-and-mouth disease virus (FMV) 2A sequence (PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007) And an expression cassette placed under the control of a separate CAG promoter (including a WPRE sequence and a rabbit ⁇ -globin polyA addition signal downstream of each translation region; the same applies hereinafter) 3 of the EBNA-1 gene (sense strand) A plasmid placed in this order from the 5 'to 3' direction starting from the side (the same applies below) 2) pCEB-hO-UL: An expression cassette in which a translation region of human Oct3 / 4 and a construct in which each translation region of human L-Myc and human Lin28 are connected via a 2A sequence is placed under the control of separate CAG promoters from 5 ′ Plasmid placed in this order in the 3
  • pCEB-hG-UL An expression cassette in which a translation region of human Glis1 and a construct in which translation regions of human L-Myc and human Lin28 are joined with a 2A sequence sandwiched between them are placed under the control of separate CAG promoters.
  • pCEB-hG-O A plasmid in which an expression cassette in which the translation region of human Glis1 and the translation region of human Oct3 / 4 are placed under the control of separate CAG promoters is placed in this order in the 5 'to 3' direction 7)
  • pCEB-hSK-UL A separate CAG promoter of a construct in which each translation region of human Sox2 and human Klf4 is joined with a 2A sequence and a construct in which each translation region of human L-Myc and human Lin28 is joined with a 2A sequence
  • a plasmid in which expression cassettes placed under control are placed in this order in the 5 'to 3' direction 8)
  • pCEB-hSK-O An expression cassette consisting of a human Sox2 and human Klf4 translation region linked with a 2A sequence and a human Oct3 / 4 translation region placed under the control of separate CAG promoters, 5 'to 3' Plasmids arranged in orientation 6
  • pCEB-hUL-SK A separate CAG promoter is composed of a construct in which each translation region of human L-Myc and human Lin28 is linked with a 2A sequence and a construct in which each translation region of human Sox2 and human Klf4 is joined with a 2A sequence.
  • a plasmid in which expression cassettes placed under control are placed in this order in the 5 'to 3' direction 11)
  • pCEB-hUL-O From 5 ′, an expression cassette in which each of the translation regions of human L-Myc and human Lin28 is connected via a 2A sequence and the translation region of human Oct3 / 4 is placed under the control of separate CAG promoters.
  • Plasmid placed in this order in the 3 'direction 12) pCEB-hUL-G A 5 'to 3' expression cassette consisting of a human L-Myc and human Lin28 translation region linked by a 2A sequence and a human Glis1 translation region placed under the control of separate CAG promoters. Plasmids arranged in this order in orientation
  • a WPRE sequence was inserted into the 5 'side of the pA sequence of pCX-EGFP (provided by Dr. Masaru Okabe, Osaka University, FEBS Letters, 407, 313-319, 1997), and further treated with the restriction enzyme BamHI. Removed SV40ori.
  • This vector was designated as pCXWB.
  • the EGFP part of this vector was removed with EcoRI, and the translation region of the human gene excised with EcoRI was similarly inserted from pCXLE-hOCT4, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL and pCXLE-hGLIS1.
  • Example 3 Establishment of human fibroblast-derived iPS cells using various episomal plasmids (1) Twelve types of plasmids prepared in Example 2 were introduced into human skin cells using various combinations of two types of plasmids shown in A to L of Table 1, and the establishment efficiency of iPS cells was compared. At that time, for comparison, introduction of four conventional plasmids (pCXLE-hOct4, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL and pCXLE-Glis1: “4v” in the table) and introduction of pCXLE-EGFP as a negative control ( "Cont” in the table) was also performed.
  • four conventional plasmids pCXLE-hOct4, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL and pCXLE-Glis1: “4v” in the table
  • introduction of pCXLE-EGFP as a negative control "Cont” in the table
  • fibroblasts (Cell Applications, Lot1388) established from the skin of the face of a 36-year-old white female. These fibroblasts were cultured in DMEM / 10% FCS (DMEM (Nacalai tesque) plus 10% fetal calf serum) as a culture medium in a 100 mm culture dish at 37 ° C and 5% CO 2. And maintained. At the time of plasmid introduction, the medium was removed, and the cells were washed by adding 5 mL of PBS. After removing PBS, 0.25% Trypsin / 1 mM EDTA (Invitrogen) was added and reacted at 37 ° C. for about 5 minutes.
  • DMEM / 10% FCS DMEM (Nacalai tesque) plus 10% fetal calf serum)
  • the cells were transferred to a 6-well culture plate (Falcon) containing 3 mL of DMEM / 10% FCS in advance and cultured for 6 days at 37 ° C. and 5% CO 2 . Thereafter, the medium was removed, and 2 mL of PBS was added to wash the cells. After removing PBS, 0.25% Trypsin / 1 mM EDTA (Invitrogen) was added and reacted at 37 ° C. for about 5 minutes. When the cells floated, DMEM / 10% FCS was added and suspended, and 1 ⁇ 10 5 cells were seeded in a 100 mm dish on which feeder cells had been seeded in advance.
  • Falcon 6-well culture plate
  • MEF mitomycin C
  • MSTO mitomycin C
  • Reprocell primate ES cell medium
  • bFGF bFGF
  • G pCEB-hG-SK and pCEB-hUL-O
  • H pCEB-hG-UL and pCEB-hSK-O
  • I pCEB-hG-O and pCEB-hSK-UL
  • J pCEB-hG-O and pCEB-hUL-SK
  • K pCEB-hSK-O and pCEB-hUL-G
  • L pCEB-hSK-G and pCEB-hUL-O
  • FIG. 5 shows photographs of iPS cell colonies at the time of establishment of the iPS cell line 836B-3 established by the combination of K and at the fifth passage.
  • Example 4 Establishment of human dental pulp stem cell-derived iPS cells using various episomal plasmids Using the combination of G, H, I, K, and L, which gave good results in Example 3, from dental pulp stem cells DP74 and DP94 iPS cells were established.
  • the feeder cells used were SNL76 / 7 treated with mitomycin C, and iPS cells were established in the same manner as in Example 3.
  • FIG. 6 shows the results of counting the number of ES-like colonies (iPS cell colonies) and non-ES-like colonies on the 24th day after plasmid introduction.
  • K pCEB-hSK-O and pCEB-hUL-G
  • L pCEB-hSK-G and pCEB-hUL-O
  • Example 5 Establishment of iPS cells derived from human peripheral mononuclear cells (PMNC) Using the combination of K (pCEB-hSK-O and pCEB-hUL-G), which has the highest iPS cell establishment efficiency in Examples 3 and 4, IPS cells were established from mononuclear cells (PMNC). Blood collected from Japanese men in their 30s was used for the experiment. Mononuclear cells from which red blood cells and platelets were removed were collected from this blood by density gradient centrifugation, and 5 ⁇ 10 6 cells were placed in a 1.5 mL centrifuge tube.
  • K pCEB-hSK-O and pCEB-hUL-G
  • each plasmid was introduced into the cells using Nucleofector II (Lonza).
  • Amaxa (registered trademark) Human T Cell Nucleofector (registered trademark) Kit was used for introduction.
  • the cells were transferred to a 6-well culture plate (Falcon) in which feeder cells had been plated in advance, and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the medium is ⁇ MEM / 10% FCS with 10 ng / mL IL-3, 10 ng / mL IL-6, 10 ng / mL G-CSF and 10 ng / mL GM-CSF, and the feeder cells are mitomycin C-treated MEF was used.
  • the medium was replaced with a medium in which bFGF (Wako) was added to the primate ES cell medium (Reprocell) at 4 ng / mL, and thereafter the medium was changed every two days.
  • bFGF Wako
  • Reprocell primate ES cell medium
  • Example 6 Establishment of human fibroblast-derived iPS cells using one kind of episomal plasmid Using the plasmid described in Example 2, 6 genes of human Oct3 / 4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28 and Glis1 Episomal plasmid pCXWE-6F loaded on one plasmid was prepared. The structure of the plasmid is shown in FIG. Using this plasmid, iPS cells were established from human skin fibroblasts (Cell Applications, Lot 1419). The feeder cells used were SNL76 / 7 treated with mitomycin C, and iPS cells were established in the same manner as in Example 3. As a result of seven experiments, it was revealed that an average of 5 ES-like colonies (iPS cell colonies) were obtained on days 22-29 after plasmid introduction, and that iPS cells could be established from one kind of plasmid.
  • Example 7 Establishment of iPS cells derived from human fibroblasts using various episomal plasmids (2) Plasmids (pCLE series) from which the WPRE sequence was removed from the 12 types of episomal plasmids prepared in Example 2 and plasmids (pCE series) from which the WPRE and loxP sequences were removed were prepared.
  • IPS cells were established from human fibroblasts HDF1419 using a combination of two types of plasmids similar to A to L of Example 3.
  • the feeder cells used were SNL76 / 7 treated with mitomycin C, and iPS cells were established in the same manner as in Example 3.
  • a combination of K having the highest iPS cell establishment efficiency in Examples 3 and 4, and a sequence of similar factors with no WPRE sequence ( pCLE-hSK-O and pCLE-hUL-G), WPRE sequence and those without loxP sequence (pCE-hSK-O and pCE-hUL-G) It was revealed that iPS cells can be established even after removing the loxP sequence.

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Abstract

　本発明は、(a) Oct3/4をコードする核酸を含む発現カセット、(b) Sox2をコードする核酸とKlf4をコードする核酸とが5'から3'方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、(c) L-Mycをコードする核酸とLin28をコードする核酸とが5'から3'方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、並びに(d) Glis1をコードする核酸を含む発現カセットから選択される2つの発現カセットを搭載する第1のエピソーマルベクターと、残りの2つの発現カセットを搭載する第2のエピソーマルベクターとのセットであって、第1のエピソーマルベクターは、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の3'側を起点として、5'から3'方向に発現カセット(b)～(d)のいずれか及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであることを特徴とする、ベクターセット、該ベクターセットを含んでなるiPS細胞誘導剤、並びに該ベクターセットを体細胞に接触させることを含む、iPS細胞の製造方法を提供する。

Description

効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
　本発明は、エピソーマルベクターを用いた効率的な人工多能性幹（以下、iPSという）細胞の樹立方法及びそのためのベクターセットに関する。より詳細には、本発明は、(a) Oct3/4をコードする核酸を含む発現カセット、(b) Sox2をコードする核酸とKlf4をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、(c) L-Mycをコードする核酸とLin28をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、並びに(d) Glis1をコードする核酸を含む発現カセットから選択される2つの発現カセットを搭載する第1のエピソーマルベクターと、残りの2つの発現カセットを搭載する第2のエピソーマルベクターとのセットであって、各発現カセットが特定の順序で配置された2つのベクターのセットを、体細胞に接触させることによる、iPS細胞の樹立方法、並びに、各発現カセットが当該順序で配置された2つのベクターのセットを含むiPS細胞誘導剤に関する。本発明はまた、上記(a)-(d)の核酸因子を特定の順列にて含む早期自己消失型エピソーマルベクター、及びそれを用いて、外来核酸因子のゲノムへの組込みを介さずに、該核酸因子の消失したiPS細胞を迅速に樹立する方法に関する。
　近年、マウス及びヒトのiPS細胞が相次いで樹立された。Yamanakaらは、マウス及びヒト由来の線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4及びc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、iPS細胞を誘導した（1-3）。一方、Thomsonらのグループは、Klf4とc-Mycの代わりにNanogとLin28を使用してヒトiPS細胞を作製した（4, 5）。
　iPS細胞の樹立効率を高めるために様々な試みがなされている。その1つは初期化因子の組合せの最適化である。本発明者らは、初期化因子としてOct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc及びLin28の5因子の組合せを用い、さらにRNAi技術によりp53の発現をノックダウンすることにより、iPS細胞の樹立効率を顕著に改善し得ることを報告した（6, 7）。しかし、一過的とはいえ、がん抑制遺伝子であるp53を抑制することは、特にヒトiPS細胞の再生医療への応用を考慮すれば、腫瘍化リスクを最小限にするという意味で避ける方が望ましいとの見方もある。一方、Maekawaらは、Glis1をOct3/4、Sox2及びKlf4（OSK）とともに体細胞に導入することにより、OSKの3因子を用いた場合よりも顕著にiPS細胞樹立効率を改善できることを報告している（8）。
　ところで、レトロウイルスやレンチウイルスなどのウイルス性ベクターは、非ウイルス性ベクターに比べて遺伝子導入効率が高く、そのためiPS細胞を容易に作製することができるという点で優れたベクターである。しかし、レトロウイルスやレンチウイルスは染色体中に組み込まれてしまうため、iPS細胞の臨床応用を考慮すると安全面で問題がある。そのため、アデノウイルスベクターやプラスミドなどの非ウイルス性ベクターを用いて染色体への組込みがないiPS細胞が報告されているが（9-11）、レトロウイルスやレンチウイルスに比べると樹立効率は低い。また、iPS細胞の選択下では初期化因子の持続的な高発現が要求されるためか、一般的に組込みが起こりにくいとされているプラスミドベクターを用いても、ある頻度で初期化因子が染色体に組み込まれた安定発現株が得られる場合がある（10, 12）。一方、染色体外で安定に自律複製可能なエピソーマルベクターを用いる方法では、上記したiPS細胞樹立効率の低さに加え、薬剤選択の中止によるベクターの自然消失効率も低頻度で、かつ時間を要するため（11）、iPS細胞の樹立効率の改善とともに、短時間で効率よくベクターを除去する方法が求められる。これに関して本発明者らは、速やかに細胞から脱落する早期自己消失型ベクターを見出している（6, 7）。
引用文献：
1. WO 2007/069666 A1
2. Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)
3. Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)
4. WO 2008/118820 A2
5. Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)
6. WO 2011/016588 A1
7. Okita, K. et al., Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011)
8. Maekawa, M. et al., Nature, 474: 225-229 (2011)
9. Stadtfeld, M. et al., Science, 322: 945-949 (2008)
10. Okita, K. et al., Science, 322: 949-953 (2008)
11. Yu, J. et al., Science, 324: 797-801 (2009)
12. Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)
発明の要約
　本発明の目的は、臨床応用に適した安全なヒトiPS細胞を効率よく樹立することである。したがって、本発明の第一の課題は、iPS細胞、特にヒトiPS細胞の樹立効率を改善する手段を提供することであり、それを用いた効率的なiPS細胞の製造方法を提供することである。また、本発明の第二の課題は、外来核酸因子のゲノムへの組込みを介さずに、該核酸因子の消失したiPS細胞を迅速に樹立する方法を提供することである。さらに、本発明の第三の課題は、外来核酸因子の消失効率を高めるとともに、再生医療応用へ向けたGMPグレードのベクター作製におけるコスト削減のため、iPS細胞の樹立効率を低下させることなく体細胞へ導入するベクター数を減ずることである。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく、Oct3/4（O）、Sox2及びKlf4（S-K）、L-Myc及びLin28（U-L）、並びにp53に対するshRNAをコードする核酸をそれぞれ搭載した4つのエピソーマルベクターと、p53 shRNAをコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターをGlis1（G）をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターに置換した4つのエピソーマルベクターとを用いて、ヒト皮膚線維芽細胞（HDF）からヒトiPS細胞を誘導したところ、O/S/K/U/Lの5因子にp53 shRNAを組み合わせるよりも、O/S/K/U/L/Gの6因子を用いた方が、約2倍の効率でヒトiPS細胞が樹立された。
　次に、O/S/K/U/L/Gの6因子を、Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011)及びWO 2011/016588 A1にて好適であることが確認されているO、S-K及びU-Lの3つの発現カセットとGlis1（G）発現カセットの4つに分け、そのうちの2つを種々の順列でエピソーマルベクターに搭載して12種の遺伝子導入ベクターを作製し、そのうちの2つを選択してO/S/K/U/L/Gの6因子がすべて含まれるような12通りの組合せをすべて試験し、iPS細胞の樹立効率を比較した。その結果、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合してベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に［核酸A］－［核酸B］の順序で初期化因子が配置される、2種のエピソーマルベクターの組合せであって、Oct3/4をコードする核酸（O）が核酸Bの位置に配置されたベクターを含む組合せを用いた場合に、4つの発現カセットをそれぞれ別個のベクターに搭載した場合（4V）と同等以上のiPS細胞樹立効率が得られた。それらのうち、Sox2及びKlf4をコードする核酸（S-K）が核酸Aの位置に配置されたベクターを含む組合せを用いた場合に、4Vを用いた場合よりも樹立効率がさらに改善され、特にS-KとOとがそれぞれ核酸Aと核酸Bの位置に配置された第1のエピソーマルベクターと、L-Myc及びLin28をコードする核酸（U-L）とGlis1をコードする核酸（G）とがそれぞれ核酸Aと核酸Bの位置に配置された第2のエピソーマルベクターとの組合せ、並びにS-KとGとがそれぞれ核酸Aと核酸Bの位置に配置された第1のエピソーマルベクターと、U-LとOとがそれぞれ核酸Aと核酸Bの位置に配置された第2のエピソーマルベクターとの組合せを用いた場合に、樹立効率は著しく改善された。
　しかも、このようにして得られたiPS細胞では、導入されたエピソーマルベクターは、初期化に必要な期間維持され初期化因子を発現した後は、速やかに細胞から脱落することが確認された。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
[1] (a) Oct3/4をコードする核酸を含む発現カセット、(b) Sox2をコードする核酸とKlf4をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、(c) L-Mycをコードする核酸とLin28をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、並びに(d) Glis1をコードする核酸を含む発現カセットから選択される2つの発現カセットを搭載する第1のエピソーマルベクターと、残りの2つの発現カセットを搭載する第2のエピソーマルベクターとのセットであって、第1のエピソーマルベクターは、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)～(d)のいずれか及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであることを特徴とする、ベクターセットを、体細胞に接触させることを含む、iPS細胞の製造方法。
[2] (i) 第1のエピソーマルベクターが、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであるか、あるいは(ii) 第1のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(c)もしくは(d)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであり、且つ第2のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(d)もしくは(c)の順序で配置されたものである、上記[1]記載の方法。
[3] 第1のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであり、且つ第2のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(c)及び発現カセット(d)の順序で配置されたものである、上記[1]記載の方法。
[4] 発現カセット(a)～(d)の少なくとも1つがウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）配列を含むものである、上記[1]～[3]のいずれかに記載の方法。
[5] 第1及び／又は第2のエピソーマルベクターが、ベクターの複製に必要なベクター要素の5’側及び3’側にloxP配列を同方向に配置したものである、上記[1]～[4]のいずれかに記載の方法。
[6] 第1及び第2のエピソーマルベクターにおいて、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点がoriPであり、oriPに結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質がEBNA-1である、上記[1]～[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 体細胞がヒト由来である、上記[1]～[6]のいずれかに記載の方法。
[8] (a) Oct3/4をコードする核酸を含む発現カセット、(b) Sox2をコードする核酸とKlf4をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、(c) L-Mycをコードする核酸とLin28をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、並びに(d) Glis1をコードする核酸を含む発現カセットから選択される2つの発現カセットを搭載する第1のエピソーマルベクターと、残りの2つの発現カセットを搭載する第2のエピソーマルベクターとのセットであって、第1のエピソーマルベクターは、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)～(d)のいずれか及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであることを特徴とする、ベクターセット。
[9] (i) 第1のエピソーマルベクターが、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであるか、あるいは(ii) 第1のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(c)もしくは(d)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであり、且つ第2のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(d)もしくは(c)の順序で配置されたものである、上記[8]記載のベクターセット。
[10] 第1のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであり、且つ第2のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(c)及び発現カセット(d)の順序で配置されたものである、上記[8]記載のベクターセット。
[11] 発現カセット(a)～(d)の少なくとも1つがウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）配列を含むものである、上記[8]～[10]のいずれかに記載のベクターセット。
[12] 第1及び／又は第2のエピソーマルベクターが、ベクターの複製に必要なベクター要素の5’側及び3’側にloxP配列を同方向に配置したものである、上記[8]～[11]のいずれかに記載のベクターセット。
[13] 第1及び第2のエピソーマルベクターにおいて、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点がoriPであり、oriPに結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質がEBNA-1である、上記[8]～[12]のいずれかに記載のベクターセット。
[14] 上記[8]～[13]のいずれかに記載のベクターセットを含んでなる、iPS細胞誘導剤。
[15] 上記[1]～[7]のいずれかに記載の方法により得られる、外来核酸がゲノムに組み込まれることなく除去されたiPS細胞。
[16] ヒト由来である、上記[15]記載のiPS細胞。
[17] 体細胞の製造における、上記[15]又は[16]記載のiPS細胞の使用。
[18] 体細胞の製造における細胞ソースとしての、上記[15]又は[16]記載のiPS細胞。
　p53の機能阻害物質に代わるGlis1の使用は、がん抑制遺伝子の発現を抑制することなくiPS細胞の樹立効率をさらに増大させることができるので、より安全に且つ効率よくヒトiPS細胞を提供することが可能となる。また、独自のエピソーマルベクターを使用することで、外来核酸因子のゲノムへの組込みを介さずにiPS細胞を樹立することができ、且つiPS細胞樹立後速やかにエピソームが脱落するので、ヒトiPS細胞の再生医療への応用において極めて有用である。
図1は、プラスミドpCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-Glis1の構造を示す図である。 図2は、p53shRNA及びGlis1がiPS細胞樹立効率に及ぼす効果を比較したグラフである。横軸左から、以下のプラスミド導入を行った結果を示す。・DsRed: pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-DsRed・p53shRNA: pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-shp53・GLIS1： pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-Glis1・EGFP: pCXLE-EGFP・OCT3/4-shp53: pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK及びpCXLE-hUL　各カラムについて、左側がES様コロニー、右側が非ES様コロニーを示す。 図3は、pCEBプラスミドの一般構造を示す図（上）及び各pCEBプラスミドにおける初期化因子の配置を示す表（下）である。表中の数字は、本明細書中に示したベクター番号を示す。 図4は、プラスミドpCEB-hSK-O及びpCEB-hUL-Gの構造を示す図である。 図5は、HDF1388細胞から、Kの組み合わせ（pCEB-hSK-O及びpCEB-hUL-G）で樹立したiPS細胞株836B-3の樹立時及び5継代目のiPS細胞コロニーの写真である。 図6は、歯髄幹細胞DP74株及びDP94株を用いてG、H、I、K及びLのプラスミドの組み合わせでiPS細胞を樹立した結果を示すグラフである。図中、黒棒はES様コロニー（iPS細胞コロニー）の数を、また白棒は非ES様コロニーの数を示す。また図中「4v」はpCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-Glis1の組み合わせを示し、「-G+shRNA」はpCXLE-hOct4-p53shRNA、pCXLE-hSK及びpCXLE-hULの組み合わせを示す。「cont」はpCXLE-EGFPの導入を示す。 図7は、プラスミドpCXWE-6Fの構造を示す図である。
発明の詳細な説明
　本発明は、(a) Oct3/4をコードする核酸を含む発現カセット、(b) Sox2をコードする核酸とKlf4をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、(c) L-Mycをコードする核酸とLin28をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、並びに(d) Glis1をコードする核酸を含む発現カセットから選択される2つの発現カセットを搭載する第1のエピソーマルベクターと、残りの2つの発現カセットを搭載する第2のエピソーマルベクターとのセットであって、当該発現カセットが特定の順列で配置されたベクターセットを、体細胞に接触させることを含む、iPS細胞の製造方法を提供する。
(A) 体細胞ソース
　iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、及びそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞 (体性幹細胞も含む) であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。特に歯髄幹細胞は、智歯や歯周病等で抜いた歯から単離、調製することができるため、入手が容易であり、今後、iPS細胞バンクのための体細胞ソースとしての利用が期待される。また血液細胞（末梢単核細胞、末梢血リンパ球、臍帯血細胞など）も、入手が容易でありかつ侵襲を伴わないため、同様にiPS細胞バンクのための体細胞ソースとしての利用が期待される。
　体細胞を採取するソースとなる哺乳動物個体は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人又はHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。たとえば主たるHLA（例えばHLA-A、HLA-B及びHLA-DRの3遺伝子座、さらにHLA-Cwを含む4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。また、ヒトに投与（移植）しない場合、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてiPS細胞を使用する場合には、同様に患者本人又は薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取することが望ましい。
　哺乳動物から分離した体細胞は、核初期化工程に供するに先立って、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5～20%の胎仔ウシ血清（FCS）を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、体細胞として歯髄幹細胞を用いる場合には、Mesenchymal stem cells basal medium (Lonza社) などの間葉系幹細胞用培地を用いることが好ましい。本発明の第1及び第2のエピソーマルベクター（「本発明のベクターセット」ともいう）（さらに必要に応じて、iPS細胞の樹立効率改善物質）との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。
　ヒト臨床応用に適した完全xeno-freeのヒトiPS細胞を得る目的においては、FCSなどの非ヒト動物由来成分を含有しない培地を用いることがより望ましい。基本培地に種々の体細胞の培養に適したヒト由来成分（特に、増殖因子などの組換えヒトタンパク質）や非必須アミノ酸、ビタミン類等を補充した培地が市販されており、当業者は体細胞ソースに応じて適切なxeno-free培地を選択することができる。xeno-free培地で前培養された体細胞は、適当なxeno-freeの細胞剥離液を用いて培養容器から剥離し、回収後、本発明のベクターセットとの接触に供される。
(B) 核初期化物質（初期化因子）
　本発明において「核初期化物質」や「初期化因子」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができるタンパク性因子（群）を意味する。本発明のベクターセットに搭載される核酸にコードされる核初期化物質（初期化因子）は、Oct3/4（「O」と略記する場合がある）、Sox2（「S」と略記する場合がある）、Klf4（「K」と略記する場合がある）、L-Myc（「U」と略記する場合がある）、Lin28（「L」と略記する場合がある）及びGlis1（「G」と略記する場合がある）の6因子である。上記において、Lin28に代えてLin28bを用いることもできる。
　上記の各核初期化物質のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（L-Myc、Lin28、Lin28b及びGlis1のマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
遺伝子名　　マウス　　　　　ヒト　　　
L-Myc　　　 NM_008506　　　 NM_001033081
Lin28　　　 NM_145833　　　 NM_024674
Lin28b　　　NM_001031772　　NM_001004317
Glis1　　　 NM_147221　　　 NM_147193
(C) 発現カセット
　上記6つの初期化因子をコードする核酸は、以下の4つの発現カセットとしてエピソーマルベクターに搭載される。
(a) Oct3/4をコードする核酸（O）を含む発現カセット
(b) Sox2をコードする核酸（S）とKlf4をコードする核酸（K）とが5’から3’方向にこの順序（S-K）でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット
(c) L-Mycをコードする核酸（U）とLin28をコードする核酸（L）とが5’から3’方向にこの順序（U-L）でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット
(d) Glis1をコードする核酸（G）を含む発現カセット
　ここで「ジシストロニックな発現を可能にする介在配列」としては、例えば、口蹄疫ウイルスの2A配列（PLoS ONE 3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007）、IRES配列（U.S. Patent No. 4,937,190）など、好ましくは2A配列を用いることができる。「発現カセット」は初期化因子をコードする核酸（即ち、O、S-K、U-L及びG）に加えて、少なくとも該核酸に機能的に連結するプロモーターを含む。該プロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。さらに該発現カセットはbasalなプロモーター配列に加えて、初期化因子の発現を増強するためのエンハンサー配列（例えば、CMV前初期エンハンサー等）を含んでいてもよい。
　好ましくは、本発明の発現カセットは、プロモーターの他に、初期化因子をコードする核酸の3’下流にpolyA付加シグナルを含有する。また、本発明の発現カセットには、初期化因子のmRNAの安定性を向上させる目的で、例えば、初期化因子のコーディング領域とpolyA付加シグナルとの間に、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）配列を挿入してもよい。
(D) エピソーマルベクター
　本発明に用いられるエピソーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する、哺乳動物細胞内での自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。哺乳動物細胞内での自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点と、該複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA-1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。より好ましくはoriPとEBNA-1遺伝子が使用される。
　また、エピソーマルベクターは、所望により、大腸菌などの細菌や酵母での大量増幅を可能にするために、細菌や酵母の複製起点（例えば、pUC ori、ColE1 ori、2μ ori等）と選択マーカー遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子）などをさらに含有していてもよい。また、所望により、哺乳動物細胞での選択マーカー遺伝子として、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等をさらに含むこともできる。さらに、初期化因子をコードする核酸の発現カセットを簡便に挿入できるように、エピソーマルベクターはマルチクローニングサイトを含むことができる。一実施態様においては、上記発現カセットにおけるプロモーター、エンハンサー、polyA付加シグナル、WPRE配列等は、予めエピソーマルベクター上に含まれており、プロモーターとpolyA付加シグナル（ベクターがWPRE配列を含む場合はWPRE配列）との間に初期化因子をコードする核酸を挿入することにより、遺伝子導入ベクターを構築し得るようにエピソーマルベクターをデザインすることもできる。そのような場合、エピソーマルベクターは、プロモーターとpolyA付加シグナル（ベクターがWPRE配列を含む場合はWPRE配列）との間に、マルチクローニングサイトを含むことが好ましい。
　本発明のベクターセットは、2つのエピソーマルベクターに、上記(a)～(d)の発現カセットをそれぞれ2つずつ搭載することにより構築される。本発明は、以前に本発明者らが報告した5初期化因子（O/S/K/U/L）とp53 shRNAとの組合せよりもはるかに高いiPS細胞樹立効率を、該5因子にGlis1を加えた6初期化因子（O/S/K/U/L/G）の組合せにより達成しただけでなく、当初4つのエピソーマルベクターに搭載されていた6因子（4発現カセット）を、同等以上の樹立効率を維持したままで、2つのエピソーマルベクター上に搭載することに成功した点にその特徴がある。即ち、本発明は、少なくとも部分的には、4つの発現カセットを、どの組合せで、しかもどの順序でエピソーマルベクター上に配置するかによって、iPS細胞樹立効率が著しく異なることの発見に基づくものである。
　本発明のベクターセットは、上記(a)～(d)の発現カセットをそれぞれ2つずつ、以下の規則に従って2つのエピソーマルベクターに搭載することにより構築される。
　哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質（例えば、EBNA-1、SV40 large T antigen等、好ましくはEBNA-1）をコードする遺伝子（センス鎖）の3’側を起点として（以下、発現カセットのベクター上での位置を示す場合は、すべてこの起点を用いる。）、5’から3’方向に［発現カセットA］－［発現カセットB］の順序で発現カセットが配置されるとした場合（図3を参照）、
1) 上記(a)の発現カセット（Oct3/4をコードする核酸（O）を含む）は発現カセットBの位置に配置される；好ましくは、
2) 上記(b)の発現カセット（Sox2をコードする核酸（S）とKlf4をコードする核酸（K）とが5’から3’方向にこの順序（S-K）でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結されている）は発現カセットAの位置に配置される。
　ここで、上記(a)の発現カセットと上記(b)の発現カセットとは、(i) 同一のエピソーマルベクター上に搭載されてもよいし（第1のエピソーマルベクター上に(b)-(a)の順序で配置される）、(ii) 異なるエピソーマルベクター上に搭載されてもよい（第1のエピソーマルベクター上に(c)もしくは(d)-(a)の順序で配置され、第2のエピソーマルベクター上に(b)-(d)もしくは(c)の順序で配置される）。即ち、上記(i)の場合には、(ia) 第1のエピソーマルベクター：(b)-(a)（初期化因子の配置としてはSK-O）と、第2の発現ベクター：(c)-(d) （初期化因子の配置としてはUL-G）との組合せ、及び(ib) 第1のエピソーマルベクター：(b)-(a)（初期化因子の配置としてはSK-O）と、第2の発現ベクター：(d)-(c)（初期化因子の配置としてはG-UL）との組合せの2通りの組合せであり、上記(ii)の場合には、(iia) 第1のエピソーマルベクター：(c)-(a)（初期化因子の配置としてはUL-O）と、第2の発現ベクター：(b)-(d) （初期化因子の配置としてはSK-G）との組合せ、及び(iib) 第1のエピソーマルベクター：(d)-(a)（初期化因子の配置としてはG-O）と、第2の発現ベクター：(b)-(c)（初期化因子の配置としてはSK-UL）との組合せの2通りの組合せである。
　後述の実施例中の表1を例にとれば、上記1)の規則を満たすのはG～Lの組合せであり、そのうち上記2)の規則をも満たすのは、H（上記(ib)に相当）、I（上記(iib)に相当）、K（上記(ia)に相当）及びL（上記(iia)に相当）の組合せである。
　なかでも、特に好ましい組合せとして、上記(ia)の組合せ、即ち、第1のエピソーマルベクター：(b)-(a)（初期化因子の配置としてはSK-O）と、第2の発現ベクター：(c)-(d) （初期化因子の配置としてはUL-G）との組合せが挙げられる。
　上記の発現カセットの配置において、各発現カセットの転写方向は特に制限されず、2つの発現カセットが同一方向に転写されるように挿入されていてもよいし（head-to-tail）、反対方向に転写されるように挿入されていてもよい（head-to-head又はtail-to-tail）。また、各発現カセットの転写方向は、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の転写方向と同一方向であってもよいし、反対方向であってもよい。好ましい一実施態様においては、すべての発現カセットが該遺伝子と同一方向に転写されるようにベクター上に搭載される。
　本発明の一実施態様においては、エピソーマルベクターの哺乳動物細胞内での複製に必要なベクター要素の5’側及び3’側にloxP配列を同方向に配置したエピソーマルベクターが使用され得る。エピソーマルベクターは染色体外で自律複製可能なため、ゲノムに組み込まれなくとも宿主細胞内での安定な発現を提供し得るが、いったんiPS細胞が樹立された後は、当該ベクターは速やかに除かれることが望ましい。エピソーマルベクターの哺乳動物細胞内での複製に必要なベクター要素を2つのloxP配列で挟み、これにCreリコンビナーゼを作用させて当該ベクター要素を切り出すことにより、エピソーマルベクターの自律複製能を喪失させることができ、該ベクターを早期にiPS細胞から脱落させることができる。
　本発明で使用されるloxP配列としては、バクテリオファージP1由来の野生型loxP配列の他、エピソーマルベクターの哺乳動物細胞内での複製に必要なベクター要素を挟む位置に同方向で配置された場合に、組換えを起こしてloxP配列間の配列を欠失させ得る任意の変異loxP配列が挙げられる。変異loxP配列としては、例えば、5’側反復配列に変異のあるlox71、3’側反復配列に変異のあるlox66、スペーサー部分に変異のあるlox2272やlox511などが挙げられる。該ベクター要素の5’側及び3’側に配置される2つのloxP配列は、同一であっても異なっていてもよいが、スペーサー部分に変異のある変異loxP配列の場合は同一のもの（例、lox2272同士、lox511同士）が用いられる。好ましくは、5’側反復配列に変異のある変異loxP配列（例、lox71）と3’側反復配列に変異のある変異loxP配列（例、lox66）との組合せが挙げられる。この場合、組換えの結果染色体上に残るloxP配列は5’側及び3’側の反復配列に二重変異を有するため、Creリコンビナーゼに認識されにくく、不必要な組換えにより染色体の欠失変異を起こすリスクが低減される。lox71とlox66とを用いる場合、前記ベクター要素の5’側及び3’側にいずれの変異loxP配列を配置してもよいが、変異部位がloxP配列の外端に配置されるような向きで変異loxP配列を挿入する必要がある。尚、本発明の好ましいエピソーマルベクターはCreリコンビナーゼを作用させなくても、早期に細胞から脱落する自己消失型ベクターであるが、例外的に細胞からの脱落に時間がかかる場合も想定されるので、Creリコンビナーゼ処理による不必要な組換えなどのリスクに備えてloxP配列を設計しておくことが好ましい場合もある。
　2つのloxP配列は、エピソーマルベクターの哺乳動物細胞内での複製に必要なベクター要素（即ち、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点（例えば、EBV oriP、SV40 ori等、好ましくはoriP）、又は該複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質（例えば、EBNA-1、SV40 large T antigen等、好ましくはEBNA-1）をコードする遺伝子配列）の5’側及び3’側に、同方向に配置される。loxP配列が挟むベクター要素は、複製開始点、又は複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子配列のいずれか一方だけであってもよいし、両方であってもよい。
　本発明で用いられるエピソーマルベクターは、loxP配列の存在の有無にかかわらず、体細胞に導入した際に、該ベクターを構成する外来核酸因子（初期化遺伝子を含む）が一過的にも細胞のゲノム中に組み込まれないというエピソーマルベクター本来の効果だけでなく、Creリコンビナーゼ処理を施すことなく、早い段階でエピソームとして存在する該ベクターがiPS細胞から脱落するという予期せぬ効果を奏するものである。即ち、本発明はまた、iPS細胞の樹立に十分な初期化因子の発現を提供した後、早期に細胞から脱落する自己消失型のエピソーマルベクターを提供する。ここで「脱落する」とは、WO 2011/016588 A1の実施例6もしくは10に記載されるPCR分析又は実施例11に記載されるRT-PCR分析において、該ベクターの存在又は該ベクターに搭載された初期化因子の発現が検出されない（検出限界以下である）ことを意味する。かかるベクターは、その導入により樹立されるiPS細胞クローンの50%以上、好ましくは60%以上、より好ましくは70%以上のクローンにおいて、10継代までにiPS細胞から脱落することを特徴とする。あるいは、該自己消失型エピソーマルベクターは、導入後1週間以内における1x104細胞あたりのコピー数が106個のオーダーであるのに対し、iPS細胞樹立時（例えば、ベクター導入から約4週間後）における1x104細胞あたりのコピー数が100個以下、好ましくは50個以下、より好ましくは30個以下にまで減衰する程度に細胞内で不安定であることを特徴とする。
　具体的には、本発明の早期自己消失型ベクターは以下の(i)～(vii)のうちの少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上、特に好ましくは4つ以上の構造的特徴を有するものである。
(i) エピソーマルベクターの哺乳動物細胞内での複製に必要なベクター要素（例えば、EBNA-1遺伝子やSV40 Large T antigen遺伝子、好ましくはEBNA-1遺伝子）の5’側及び3’側にloxP配列が同方向に配置されている。
(ii) 初期化因子をコードする核酸がCAGプロモーターの制御下にある。
(iii) 初期化因子をコードする核酸がCMV前初期エンハンサーの制御下にある。
(iv) 初期化因子をコードする核酸がウサギβ-グロビンpolyA付加シグナルの制御下にある。
(v) 初期化因子をコードする核酸とpolyA付加シグナルとの間にWPRE配列を含む。
(vi) 細菌で機能的な複製起点（例えば、pUC ori、ColE1 ori、好ましくはpUC ori）、及び細菌での選択を可能にするマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）を含む。
(vii） エピソーマルベクターの哺乳動物細胞内での複製に必要なベクター要素（例えば、EBNA-1遺伝子やSV40 Large T antigen遺伝子、好ましくはEBNA-1遺伝子）と、ベクター上に搭載される各初期化因子をコードする核酸とが、同一方向に転写される。
　尚、後述の実施例6に示されるとおり、4つの発現カセットを1つのエピソーマルベクター上に搭載した遺伝子導入ベクターを体細胞に導入した場合でも、iPS細胞を樹立することができる。この場合についても、発現カセットの配置順を検討することにより、さらに樹立効率が改善される可能性がある。
(E) ベクターセットの体細胞への導入方法
　上記2つのエピソーマルベクターの組合せからなるベクターセットは、例えばリポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて体細胞に導入することができる。具体的には、例えばScience, 324: 797-801 (2009)、WO 2011/016588 A1またはNature Methods, 8(5), 409-412 (2011)等に記載される方法を用いることができる。
　iPS細胞からエピソーマルベクターの哺乳動物細胞内での複製に必要なベクター要素が除去されたか否かの確認は、該ベクター要素内部及び／又は（loxP配列を用いた場合には）loxP配列近傍の塩基配列を含む核酸をプローブ又はプライマーとして用い、該iPS細胞から単離したエピソーム画分を鋳型としてサザンブロット分析又はPCR分析を行い、バンドの有無又は検出バンドの長さを調べることにより実施することができる（WO 2011/016588 A1、Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011)参照）。エピソーム画分の調製は当該分野で周知の方法を用いて行えばよく、例えば、Science, 324: 797-801 (2009)、WO 2011/016588 A1またはNature Methods, 8(5), 409-412 (2011)等に記載される方法を用いることができる。
(F) iPS細胞の樹立効率改善物質
　公知のiPS細胞樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をさらに高めることが期待できる。そのようなiPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNA及びshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標) (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNA及びshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-calcium channel agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNA、shRNA、ドミナントネガティブ体など (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008); Nature 460, 1132-1135 (2009))）、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、細胞内シグナル伝達の修飾剤［例えば、Wnt Signaling活性化剤（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、TGF-βの阻害剤、MEK阻害剤、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signalling及びglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))］、他の天然もしくは合成低分子化合物（例、5’-azacytidine、thiazovivin、ビタミンC等）、ES細胞特異的miRNA（例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08、WO2009/075119)、miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10)、miR-291-3p, miR-294及びmiR-295 (以上、Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009))）等が挙げられるが、それらに限定されない。前記において核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
　これらiPS細胞樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク性因子である場合、(b) 該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、それぞれ周知慣用の方法により、実施することができる。
　iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、本発明のベクターセットと同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。
(G) 培養条件による樹立効率の改善
　体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下（例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など）、10%以下（例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など）、又は5%以下（例、4%以下、3%以下、2%以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上（例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など）、0.5%以上（例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など）、又は1%以上（例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など）である。
　細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Thermo scientific社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用CO2インキュベーターを用いることができる）。
　低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、体細胞への本発明ベクターセットの接触より前であっても、該接触と同時であっても、該接触より後であってもよいが、例えば、体細胞に該ベクターセットを接触させた直後から、あるいは接触後一定期間（例えば、1ないし10（例、2,3,4,5,6,7,8又は9）日）おいた後に低酸素条件下で培養することが好ましい。
　低酸素条件下で細胞を培養する期間も、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、例えば3日以上、5日以上、7日以上又は10日以上で、50日以下、40日以下、35日以下又は30日以下の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。低酸素条件下での好ましい培養期間は、雰囲気中の酸素濃度によっても変動し、当業者は用いる酸素濃度に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。また、一実施態様において、iPS細胞の候補コロニーの選択を、薬剤耐性を指標にして行う場合には、薬剤選択を開始する迄に低酸素条件から正常酸素濃度に戻すことが好ましい。
　さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期及び好ましい培養期間は、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率などによっても変動する。
　本発明のベクターセット（さらに必要に応じてiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）及び／又は幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞の共存下で培養される。マウス胎仔由来の線維芽細胞としては、通常STO細胞株（ATCC CRL-1503）等がフィーダーとしてよく使われるが、iPS細胞の誘導には、STO細胞にネオマイシン耐性遺伝子とLIF遺伝子を安定に組み込んだSNL細胞（SNL76/7 STO細胞; ECACC 07032801）（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。また、マウス胎仔由来の初代線維芽細胞（MEF）も用いることができる。マイトマイシンC処理済のMEFは、ミリポア社やリプロセル社から市販されている。これらのフィーダー細胞との共培養は、本発明のベクターセットの接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。
　本発明のベクターセットの使用により、体細胞への該ベクターセットの導入から、iPS細胞を樹立し、さらにiPS細胞として維持するまでの間、非ヒト動物由来成分を一切用いずに培養して（即ち、完全xeno-freeの条件下で）、ヒトiPS細胞を作製することが可能である。xeno-freeの条件下でヒトiPS細胞を誘導する場合、本発明のベクターセット（さらに必要に応じてiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞は、FCSや他の非ヒト動物由来成分を含まない培地中で培養される。分化抑制因子として培地に添加される物質（例、bFGF、SCF等）としては、ヒト由来の精製されたタンパク質、好ましくは組換えタンパク質が使用される。フィーダー細胞としては、ヒト由来の任意の体細胞を用いることができるが、例えばヒト皮膚線維芽細胞（HDF）やヒト歯髄幹細胞などが好ましく用いられ得る。また、フィーダー細胞を用いることなくヒトiPS細胞を誘導することも可能であり、この場合、細胞容器のコーティング剤として、マトリゲルやゼラチンに代えて市販のxeno-freeのコーティング剤を用いることができる。
　iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanog又はOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)）、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)）等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。
　選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）及び目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、アルカリフォスファターゼ染色や、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
　このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患者本人やHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家もしくは同種異系移植による幹細胞療法が可能となる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞（例、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
実施例
実施例1
p53shRNAとGlis1とのiPS細胞樹立効率に及ぼす効果の比較
　Okita et al., Nature Methods, 8(5), 409-412(2011)、及び国際公報WO2011/016588に記載の6種類の遺伝子の組み合わせ（ヒトOct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28及びp53shRNA）と、p53shRNAの代わりにGlis1（Nature, 474, 225-229 (2011) doi: 10.1038/nature10106）を用いた6種類の遺伝子の組み合わせとで、iPS細胞樹立効率の比較を行った。具体的には、以下の各プラスミド導入の比較を行った。
・pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK及びpCXLE-hULの3種のプラスミド（Nature Methods, 8(5), 409-412(2011)
・pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-shp53の4種のプラスミド
・pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-Glis1の4種のプラスミド（プラスミドの構造は図1参照）
　導入はヒト線維芽細胞HDF1419を用い、Nature Methods, 8(5),409-412(2011)及び国際公報WO2011/016588に記載の方法で行った。プラスミド導入から25日目にES様コロニー（iPSコロニー）及び非ES様コロニーの数を数えた結果を図2に示す。p53shRNAの代わりにGlis1を用いることで、iPS細胞樹立効率が上昇することが明らかとなった。
実施例2
初期化に用いる各種エピソーマルプラスミドの作製
　pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-Glis1の4種のプラスミド導入と同等もしくはそれ以上のiPS細胞樹立効率を保持したままプラスミドの数を減らす検討を行った。具体的には、Okita et al., Nature Methods, 8(5), 409-412(2011)及び国際公報WO2011/016588に記載のプラスミド等を用いて種々のエピソーマルプラスミドを作製し、iPS細胞樹立効率の比較を行った。最終的に以下の12種類のエピソーマルプラスミド1)～12)を作製した（図３）。
1) pCEB-hO-SK:
　ヒトOct3/4の翻訳領域と、ヒトSox2及びヒトKlf4の各翻訳領域を口蹄疫ウイルス（FMV）2A配列 (PLoS ONE 3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007)をはさんで繋げたコンストラクトとを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット（各翻訳領域の下流にWPRE配列とウサギβ-グロビンpolyA付加シグナルを含む。以下同じ）を、EBNA-1遺伝子（センス鎖）の3’側を起点にして（以下同じ）、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
2) pCEB-hO-UL:
　ヒトOct3/4の翻訳領域と、ヒトL-Myc及びヒトLin28の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトとを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
3) pCEB-hO-G:
　ヒトOct3/4の翻訳領域とヒトGlis1の翻訳領域とを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
4) pCEB-hG-SK:
　ヒトGlis1の翻訳領域と、ヒトSox2及びヒトKlf4の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトとを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
5) pCEB-hG-UL:
　ヒトGlis1の翻訳領域と、ヒトL-Myc及びヒトLin28の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトとを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
6) pCEB-hG-O:
　ヒトGlis1の翻訳領域とヒトOct3/4の翻訳領域とを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
7) pCEB-hSK-UL:
　ヒトSox2及びヒトKlf4の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトと、ヒトL-Myc及びヒトLin28の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトとを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
8) pCEB-hSK-O:
　ヒトSox2及びヒトKlf4の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトと、ヒトOct3/4の翻訳領域とを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
9) pCEB-hSK-G:
　ヒトSox2及びヒトKlf4の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトと、ヒトGlis1の翻訳領域とを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
10) pCEB-hUL-SK:
　ヒトL-Myc及びヒトLin28の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトと、ヒトSox2及びヒトKlf4の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトとを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
11) pCEB-hUL-O:
　ヒトL-Myc及びヒトLin28の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトと、ヒトOct3/4の翻訳領域とを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
12) pCEB-hUL-G:
　ヒトL-Myc及びヒトLin28の各翻訳領域を2A配列をはさんで繋げたコンストラクトと、ヒトGlis1の翻訳領域とを、別々のCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド
　具体的にはpCX-EGFP（大阪大学、岡部勝博士より供与された, FEBS Letters, 407, 313-319, 1997）のpA配列の5’側にWPRE配列を挿入し、さらに制限酵素BamHI処理によりSV40oriを取り除いた。このベクターをpCXWBとした。このベクターのEGFP部分をEcoRIで取り除き、換わりにpCXLE-hOCT4, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL及びpCXLE-hGLIS1より同様にEcoRIで切り出したヒト遺伝子の翻訳領域を挿入した。これらはそれぞれpCXWB-hOCT4, pCXWB-hSK, pCXWB-hUL及びpCXWB-hGLIS1と名付けた。これらのpCXWBベクターをSalIで処理して、そこに同様にSalI処理したpCXLE-hOCT4, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL又はpCXLE-hGLIS1を挿入することにより上記12種のpCEBベクターを作製した（図3）。
　これら12種類のプラスミドのうち、pCEB-hSK-O及びpCEB-hUL-Gのプラスミドの構造を図4に示す。
実施例3
各種エピソーマルプラスミドを用いたヒト線維芽細胞由来のiPS細胞の樹立（1）
　実施例2で作製した12種類のプラスミドを、表1のA～Lに示す様々な2種類のプラスミドの組み合わせでヒト皮膚細胞に導入し、iPS細胞の樹立効率を比較した。その際、比較のために、従来の4種のプラスミド（pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-Glis1：表中「4v」）の導入と、ネガティブコントロールとしてpCXLE-EGFPの導入（表中「cont」）も併せて行った。
　実験には36歳白人女性の顔の皮膚より樹立した線維芽細胞 (Cell Applications, Lot1388) を使用した。この線維芽細胞はDMEM/10% FCS (DMEM (Nacalai tesque) にウシ胎仔血清を10%加えたもの) を培養液として使用し、100 mm 培養ディッシュで37℃、5% CO2の条件で培養し、維持した。プラスミド導入時には、培地を除き、PBS 5 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、6x105細胞を15 mL遠心チューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。各プラスミド1.5 μg（pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-Glis1は各0.75μg、pCXLE-EGFPは3μg）を、Microporator（エアブラウン）を用いて細胞に導入した。導入時の条件は100 μLチップを用い、1650 V, 10 ms, 3回のパルスで行った。導入後の細胞はあらかじめDMEM/10% FCSを3 mL入れておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件で6日間培養した。その後培地を除き、PBS 2 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、1x105の細胞を、あらかじめフィーダー細胞を蒔いておいた100 mm dishに蒔いた。フィーダー細胞としては、マイトマイシンC処理をしたMEF（表１中「MEF」）、又はマイトマイシンC処理をしたSNL76/7（表１中「MSTO」）を使用した。翌日に霊長類ES細胞用培地（リプロセル）に4 ng/mLとなる様にbFGF (Wako) を加えた培地に交換し、以後2日おきに培地交換を続けた。プラスミド導入から24日目にES様コロニー（iPS細胞コロニー、表1中「ES」）及び非ES様コロニー（表1中「non-ES」）の数を数えた結果を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　　（表中「－」は検討を行わず）
　その結果、pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-Glis1の4種のプラスミドを導入した場合（表中4v）に比べ、以下の6種のプラスミドの組合せを導入した場合に、多数のES様コロニーが出現した。
G: pCEB-hG-SK及びpCEB-hUL-O
H: pCEB-hG-UL及びpCEB-hSK-O
I: pCEB-hG-O及びpCEB-hSK-UL
J: pCEB-hG-O及びpCEB-hUL-SK
K: pCEB-hSK-O及びpCEB-hUL-G
L: pCEB-hSK-G及びpCEB-hUL-O
　フィーダーとしてMEFを用いた場合はpCEB-hSK-O及びpCEB-hUL-Gの組み合わせ(表中K)が最も多数のES様コロニーが出現し、またフィーダーとしてMSTOを用いた場合はpCEB-hSK-O及びpCEB-hUL-Gの組み合せ（表中K）、及びpCEB-hSK-G及びpCEB-hUL-Oの組み合わせ（表中L）が、最も多数のES様コロニーが出現した。コロニーは典型的なES細胞様（iPS細胞）の形態を示した。Kの組み合わせで樹立したiPS細胞株836B-3の樹立時及び5継代目のiPS細胞コロニーの写真を図5に示す。代表例として、このKの組み合わせで樹立したiPS細胞株について、外来核酸がゲノムに組み込まれていないことを確認した。
　同様の実験を36歳日本人男性の皮膚より樹立した線維芽細胞（TIG114）を用いて行ったところ、HDF1388の場合と同じくG、H、I、J、K及びLの組み合わせで良好な結果が得られ、Kの組み合わせで最も良い結果が得られた。
実施例4
各種エピソーマルプラスミドを用いたヒト歯髄幹細胞由来のiPS細胞の樹立
　実施例3で良好な結果が得られたG、H、I、K及びLの組み合わせを用いて、歯髄幹細胞DP74株及びDP94株からiPS細胞の樹立を行った。フィーダー細胞はマイトマイシンC処理をしたSNL76/7を用い、実施例3と同様の手法にてiPS細胞の樹立を行った。プラスミド導入24日目にES様コロニー（iPS細胞コロニー）及び非ES様コロニーの数を数えた結果を図6に示す。pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL及びpCXLE-Glis1の組み合わせ（図中4v）、及びNature Methods, 8(5), 409-412(2011)の組み合わせ（pCXLE-hOct4-p53shRNA、pCXLE-hSK及びpCXLE-hUL）(図中-G+shRNA)と比べ、以下の3種のプラスミドの組合わせを導入した場合に、多数のES様コロニーが出現した。
H: pCEB-hG-UL及びpCEB-hSK-O
K: pCEB-hSK-O及びpCEB-hUL-G
L: pCEB-hSK-G及びpCEB-hUL-O
　特に、Kの組み合わせ（pCEB-hSK-O及びpCEB-hUL-G）により最も多数のES様コロニーが出現した。
実施例5
ヒト末梢単核細胞（PMNC)由来のiPS細胞の樹立
　実施例3及び4で最もiPS細胞樹立効率が高かったKの組み合わせ（pCEB-hSK-O及びpCEB-hUL-G）を用いて、ヒト末梢単核細胞（PMNC)からiPS細胞の樹立を行った。
　実験には30代日本人男性より採取した血液を使用した。この血液より、密度勾配遠心法にて赤血球や血小板などを除いた単核球細胞を回収し、5x106個の細胞を1.5 mL遠心チューブに入れた。200xgで5分間遠心して上清を除いた後に、各プラスミド1.5 μgを、NucleofectorII（Lonza）を用いて細胞に導入した。導入にはAmaxa(登録商標) Human T Cell Nucleofector(登録商標) Kitを用いた。導入後の細胞はあらかじめフィーダー細胞を蒔いておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件で培養した。培地にはαMEM/10% FCSに10 ng/mL IL-3, 10 ng/mL IL-6, 10 ng/mL G-CSF及び10 ng/mL GM-CSFを添加して用い、フィーダー細胞はマイトマイシンC処理をしたMEFを使用した。播種の4日後に霊長類ES細胞用培地（リプロセル）に4 ng/mLとなる様にbFGF (Wako) を加えた培地に交換し、以後2日おきに培地交換を続けた。その結果、プラスミド導入20日目でES様コロニー（iPS細胞コロニー）が得られ、血球細胞からもiPS細胞が樹立できることが明らかになった。
実施例6
１種のエピソーマルプラスミドを用いたヒト線維芽細胞由来のiPS細胞の樹立
　実施例2に記載のプラスミドを用いて、ヒトOct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28及びGlis1の6遺伝子を１つのプラスミドに搭載したエピソーマルプラスミド：pCXWE-6Fを作製した。プラスミドの構造を図7に示す。このプラスミドを用いて、ヒトの皮膚線維芽細胞(Cell Applications, Lot1419)からiPS細胞の樹立を行った。フィーダー細胞はマイトマイシンC処理をしたSNL76/7を用い、実施例3と同様の手法にてiPS細胞の樹立を行った。7回の実験の結果、プラスミド導入22-29日目で平均5個のES様コロニー（iPS細胞コロニー）が得られ、1種のプラスミドからもiPS細胞が樹立できることが明らかになった。
実施例7
各種エピソーマルプラスミドを用いたヒト線維芽細胞由来のiPS細胞の樹立（2）
　実施例2で作製した12種類のエピソーマルプラスミドからWPRE配列を除去したプラスミド（pCLEシリーズ）、及び、WPRE配列とloxP配列を除去したプラスミド（pCEシリーズ）を作製した。実施例3のA～Lと同様の2種のプラスミドの組み合わせにより、ヒト線維芽細胞HDF1419からiPS細胞の樹立を行った。フィーダー細胞はマイトマイシンC処理をしたSNL76/7を用い、実施例3と同様の手法にてiPS細胞の樹立を行った。プラスミド導入から21日目にES様コロニー（iPS細胞コロニー）及び非ES様コロニーの数を数えた。
　結果を表2に示す。WPRE配列、loxP配列を除去してもiPS細胞を樹立できることが明らかになった。具体的には、例えば実施例3及び4で最もiPS細胞樹立効率が高かったKの組み合わせ（pCEB-hSK-O及びpCEB-hUL-G）と、同様の因子の並びでWPRE配列がないもの（pCLE-hSK-O及びpCLE-hUL-G）、WPRE配列とloxP配列が無いもの（pCE-hSK-O及びpCE-hUL-G）とを比較した場合、Kの組み合わせほどではなかったものの、WPRE配列、loxP配列を除去してもiPS細胞を樹立できることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神及び範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、2011年8月8日付で出願された米国仮特許出願第61/521,153号を基礎としており、ここで言及することにより、その内容は全て本明細書に包含される。
 

Claims (18)

  1. 　(a) Oct3/4をコードする核酸を含む発現カセット、(b) Sox2をコードする核酸とKlf4をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、(c) L-Mycをコードする核酸とLin28をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、並びに(d) Glis1をコードする核酸を含む発現カセットから選択される2つの発現カセットを搭載する第1のエピソーマルベクターと、残りの2つの発現カセットを搭載する第2のエピソーマルベクターとのセットであって、第1のエピソーマルベクターは、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)～(d)のいずれか及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであることを特徴とする、ベクターセットを、体細胞に接触させることを含む、iPS細胞の製造方法。
  2. 　(i) 第1のエピソーマルベクターが、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであるか、あるいは(ii) 第1のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(c)もしくは(d)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであり、且つ第2のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(d)もしくは(c)の順序で配置されたものである、請求項1記載の方法。
  3. 　第1のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであり、且つ第2のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(c)及び発現カセット(d)の順序で配置されたものである、請求項1記載の方法。
  4. 　発現カセット(a)～(d)の少なくとも1つがウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）配列を含むものである、請求項1～3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 　第1及び／又は第2のエピソーマルベクターが、ベクターの複製に必要なベクター要素の5’側及び3’側にloxP配列を同方向に配置したものである、請求項1～4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 　第1及び第2のエピソーマルベクターにおいて、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点がoriPであり、oriPに結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質がEBNA-1である、請求項1～5のいずれか1項に記載の方法。
  7. 　体細胞がヒト由来である、請求項1～6のいずれか1項に記載の方法。
  8. 　(a) Oct3/4をコードする核酸を含む発現カセット、(b) Sox2をコードする核酸とKlf4をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、(c) L-Mycをコードする核酸とLin28をコードする核酸とが5’から3’方向にこの順序でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット、並びに(d) Glis1をコードする核酸を含む発現カセットから選択される2つの発現カセットを搭載する第1のエピソーマルベクターと、残りの2つの発現カセットを搭載する第2のエピソーマルベクターとのセットであって、第1のエピソーマルベクターは、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)～(d)のいずれか及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであることを特徴とする、ベクターセット。
  9. 　(i) 第1のエピソーマルベクターが、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであるか、あるいは(ii) 第1のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(c)もしくは(d)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであり、且つ第2のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(d)もしくは(c)の順序で配置されたものである、請求項8記載のベクターセット。
  10. 　第1のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(b)及び発現カセット(a)の順序で配置されたものであり、且つ第2のエピソーマルベクターが、該遺伝子の3’側を起点として、5’から3’方向に発現カセット(c)及び発現カセット(d)の順序で配置されたものである、請求項8記載のベクターセット。
  11. 　発現カセット(a)～(d)の少なくとも1つがウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）配列を含むものである、請求項8～10のいずれか1項に記載のベクターセット。
  12. 　第1及び／又は第2のエピソーマルベクターが、ベクターの複製に必要なベクター要素の5’側及び3’側にloxP配列を同方向に配置したものである、請求項8～11のいずれか1項に記載のベクターセット。
  13. 　第1及び第2のエピソーマルベクターにおいて、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点がoriPであり、oriPに結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質がEBNA-1である、請求項8～12のいずれか1項に記載のベクターセット。
  14. 　請求項8～13のいずれか1項に記載のベクターセットを含んでなる、iPS細胞誘導剤。
  15. 　請求項1～7のいずれか1項に記載の方法により得られる、外来核酸がゲノムに組み込まれることなく除去されたiPS細胞。
  16. 　ヒト由来である、請求項15記載のiPS細胞。
  17. 　体細胞の製造における、請求項15又は16記載のiPS細胞の使用。
  18. 　体細胞の製造における細胞ソースとしての、請求項15又は16記載のiPS細胞。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013176233A1 (ja) * 2012-05-23 2013-11-28 国立大学法人京都大学 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
WO2015030111A1 (ja) * 2013-08-28 2015-03-05 国立大学法人岐阜大学 人工多能性幹細胞の作製方法
US9404124B2 (en) 2009-08-07 2016-08-02 Kyoto University Method of producing induced pluripotent stem cells using inhibitors of P53
EP4306635A1 (en) * 2022-07-13 2024-01-17 La Fondation Cardiométabolisme et Nutrition Method for obtaining induced pluripotent stem cells (ipsc)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009149233A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Stem Cell Products, Inc. Methods for the production of ips cells using non-viral approach
WO2009157201A1 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Osaka University Method and kit for preparing ips cells
WO2011016588A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-10 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2011056971A2 (en) * 2009-11-04 2011-05-12 Cellular Dynamics International, Inc. Episomal reprogramming with chemicals

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009149233A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Stem Cell Products, Inc. Methods for the production of ips cells using non-viral approach
WO2009157201A1 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Osaka University Method and kit for preparing ips cells
WO2011016588A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-10 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2011056971A2 (en) * 2009-11-04 2011-05-12 Cellular Dynamics International, Inc. Episomal reprogramming with chemicals

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAEKAWA, M. ET AL.: "Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glisl.", NATURE, vol. 474, no. 7350, 9 June 2011 (2011-06-09), pages 225 - 9 *
OKITA, K. ET AL.: "A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.", NAT. METHODS, vol. 8, no. 5, May 2011 (2011-05-01), pages 409 - 12 *
YU, J. ET AL.: "Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.", SCIENCE, vol. 324, no. 5928, 8 May 2009 (2009-05-08), pages 797 - 801 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9404124B2 (en) 2009-08-07 2016-08-02 Kyoto University Method of producing induced pluripotent stem cells using inhibitors of P53
WO2013176233A1 (ja) * 2012-05-23 2013-11-28 国立大学法人京都大学 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
US10519425B2 (en) 2012-05-23 2019-12-31 Kyoto University Highly efficient method for establishing induced pluripotent stem cell
WO2015030111A1 (ja) * 2013-08-28 2015-03-05 国立大学法人岐阜大学 人工多能性幹細胞の作製方法
EP3040416A4 (en) * 2013-08-28 2017-03-01 Gifu University Method for producing induced pluripotent stem cells
JPWO2015030111A1 (ja) * 2013-08-28 2017-03-02 国立大学法人岐阜大学 人工多能性幹細胞の作製方法
US9890360B2 (en) 2013-08-28 2018-02-13 Gifu University Method for producing induced pluripotent stem cells
EP4306635A1 (en) * 2022-07-13 2024-01-17 La Fondation Cardiométabolisme et Nutrition Method for obtaining induced pluripotent stem cells (ipsc)

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