JPWO2015030111A1

JPWO2015030111A1 - 人工多能性幹細胞の作製方法

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Publication number: JPWO2015030111A1
Application number: JP2015534283A
Authority: JP
Inventors: 建一手塚; 也剛玉置; 一規飯田; 知子川口; 仁美青木; 隆弘 ▲国▼貞; 敏之柴田; 直樹五島
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Gifu University
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Gifu University
Priority date: 2013-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2017-03-02
Anticipated expiration: 2034-08-28
Also published as: JP6617231B2; EP3040416B1; US9890360B2; US20160208218A1; EP3040416A4; EP3040416A1; WO2015030111A1

Abstract

核初期化物質（ＤＬＸ４遺伝子、ＯＣＴ３／４遺伝子及びＳＯＸ２遺伝子）を細胞に導入し、ｉＰＳ細胞を作製する。

Description

本出願は、２０１３年８月２８日に出願された日本国特許出願である特願２０１３−１７６６４７の関連出願であり、この日本出願に基づく優先権を主張するものであり、この日本出願に記載された全ての内容を参照に組み込まれたものとするものである。
本明細書は、人工多能性幹細胞の作製に関する。

従来から、体細胞に、核初期化物質として４因子（ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、及び、ｃ−ＭＹＣ遺伝子）を導入し、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）を作製することが知られている。しかしながら、４因子のうち、例えば、ｃ−ＭＹＣ遺伝子は、腫瘍形成のリスクとなり得るため、利用しないことが望まれる。即ち、核初期化物質の組み合わせを検討することが求められている。

特許文献１では、歯髄幹細胞に、核初期化物質として３因子（ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、及び、ＫＬＦ４遺伝子）を接触させ、ｉＰＳ細胞を作製している。また、非特許文献１では、体細胞に、核初期化物質として４因子（ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子、及び、Ｇｌｉｓ１遺伝子）を導入し、ｉＰＳ細胞を作製している。

国際公開第２０１０／０１３３５９号

Momoko Maekawaら, Nature, vol. 474, 225-229

本明細書では、新規の組み合わせの核初期化物質を利用することによる、誘導効率のよいｉＰＳ細胞の作製方法を開示する。

本発明者らは、ある種のＤＰＣ（Dental Pulp Cell、歯髄細胞）に核初期化物質として３因子（ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、及び、ＫＬＦ４遺伝子）を接触させるとｉＰＳ細胞の誘導率が高くなることを見出した。さらに、本発明者らは、当該ＤＰＣにＤＬＸ４遺伝子が多く発現していることを見出した。そこで、本発明者らは、ＤＬＸ４遺伝子を含む核初期化物質を利用して、ｉＰＳ細胞を作製したところ、効率良くｉＰＳ細胞を得ることができた。即ち、本明細書の開示は、本発明者らが、ＤＬＸ４遺伝子を含む核初期化物質を利用して、ｉＰＳ細胞を作製し、誘導効率を評価したことに基づくものである。

（１）少なくともＤＬＸ４遺伝子又はその翻訳産物を含む核初期化物質と細胞とを接触させる工程を含む、人工多能性幹細胞の作製方法。
（２）前記核初期化物質は、さらに、ＯＣＴファミリー遺伝子又はその翻訳産物と、ＳＯＸファミリー遺伝子又はその翻訳産物と、を含む、（１）に記載の作製方法。
（３）前記核初期化物質は、さらに、ＫＬＦ４ファミリー遺伝子又はその翻訳産物を含む（１）又は（２）に記載の作製方法。
（４）前記細胞は、歯髄細胞である（１）から（３）のいずれかに記載の作製方法。
（５）前記歯髄細胞は、歯根完成期前の歯髄細胞である（４）に記載の作製方法。
（６）ＤＬＸ４遺伝子、ＯＣＴ３／４遺伝子及びＳＯＸ２遺伝子を保持する、１又は２以上の組換えベクターを含むベクターセット。
（７）（６）に記載のベクターセットを含む人工多能性幹細胞作製剤。
（８）（６）に記載のベクターセットにより作製されたｉＰＳ細胞。
（９）歯根完成期前の歯髄細胞を含む人工多能性幹細胞を作製するための剤。
（１０）ＤＬＸ４遺伝子を含む人工多能性幹細胞作製剤。

各ＤＰＣにおける相対リプログラミング効率を示す。各ＤＰＣにおけるＤＬＸ４遺伝子の相対発現量の結果を示す。ｐＭＸｓ−ＧＷレトロウイルスベクターのベクターマップを示す。各遺伝子が導入されたＤＰ３１においてカウントされたＥＳ細胞様コロニーの数を示す。各遺伝子が導入されたＨＤＦにおいてカウントされたＥＳ細胞様コロニーの数を示す。ＤＰ３１及びＤＰ３１−ｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４でのＤＬＸ４遺伝子の相対発現量を示す。ＤＰ３１及びＤＰ３１−ｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４でのｉＰＳ細胞の相対誘導効率を示す。各遺伝子が導入されたＤＰ３１におけるＥＳ細胞様コロニーの数を示す。

本明細書は、ＤＬＸ４遺伝子又はその翻訳産物を用いたｉＰＳ細胞の作製に関する。ＤＬＸ４遺伝子の体細胞における発現が体細胞からのｉＰＳ細胞誘導に寄与することは、これまで知られていなかった。本明細書の開示によれば、誘導効率よくｉＰＳ細胞を作製することができる。また、ＤＬＸ４遺伝子の発現が促進されている体細胞がｉＰＳ細胞の誘導に適している。こうした体細胞の利用により、さらに誘導効率よくｉＰＳ細胞を作製することができる。

以下、本明細書の開示に関し、核初期化物質、ＤＬＸ４遺伝子、組換えベクター、ベクターセット、細胞、ＤＰＣ、ｉＰＳ細胞作製剤、ｉＰＳ細胞の作製方法等について順次詳細に説明する。

（核初期化物質）
本明細書では、核初期化物質を開示する。核初期化物質は、体細胞の核を初期化して多能性を誘導する物質である。

以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本発明の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された人工多能性幹細胞の作製方法を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。

また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。

本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。

（ＤＬＸ４遺伝子）
本明細書で開示する核初期化物質は、少なくともＤＬＸ４遺伝子を含む。ＤＬＸ４遺伝子は、ｉＰＳ細胞の誘導効率を効果的に高めることができる。より具体的には、ＳＯＸ２遺伝子を含むＳＯＸファミリーに属する遺伝子、ＯＣＴ３／４遺伝子を含むＯＣＴファミリーに属する遺伝子との組合せにより、ｉＰＳ細胞の誘導効率を確実かつ飛躍的に高めることができる。さらに、ＤＬＸ４遺伝子は、特にＫＬＦ４遺伝子などのＫＬＦファミリーに属する遺伝子との相乗効果により、一層ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めることができる。

ＤＬＸ４遺伝子は、歯髄細胞、なかでも、歯根完成期前の歯髄細胞においてその発現が促進されている。このため、後述するように歯髄細胞、特には歯根完成期前の歯髄細胞を対象細胞とすることにより、一層効果的に、ＤＬＸ４遺伝子によるｉＰＳ細胞の誘導効率を高めることができる。

ＤＬＸ４遺伝子としては、例えば、ヒト由来ＤＬＸ４遺伝子を用いることができる。ヒト由来ＤＬＸ４遺伝子としては、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いることができる。以下、マウス由来ＤＬＸ４遺伝子としては、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いることができる。ＤＬＸ４遺伝子の翻訳産物であるＤＬＸ４タンパク質（Ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓｈｏｍｅｏｂｏｘ４、ＢＰ１と呼ばれる場合もある）は、ホメオドメインを有する転写因子であり、β−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子の転写を抑制することが知られている（Mol. Cell. Biol. 22, 2505-2514, 2002）。なお、ＤＬＸ遺伝子のファミリーとして、ＤＬＸ１遺伝子〜ＤＬＸ７遺伝子が知られている。本明細書に開示する技術においては、ＤＬＸ４遺伝子だけではなく、これらの遺伝子ファミリーを、ＤＬＸ４遺伝子と同様の機能を有しうる限りにおいて単独であるいは組み合わせて利用し得る。

また、核初期化物質は、さらに、ＯＣＴファミリーに属する遺伝子、ＳＯＸファミリーに属する遺伝子を含むことができる。さらに、ＫＬＦファミリーに属する遺伝子を含むこともできる。核初期化物質として、さらに他の遺伝子を含んでいてもよい。なお、以下では、核初期化物質である複数の遺伝子を単に各遺伝子と呼ぶことがある。なお、本明細書において遺伝子というとき、当該遺伝子の翻訳産物であるタンパク質をコードする核酸（好ましくはＤＮＡ）を意図している。細胞への導入の容易さを考慮すると、核初期化物質は、その翻訳産物であるタンパク質自体としてよりも、それをコードする遺伝子の形態で用いることが好ましい。

（ＯＣＴファミリー遺伝子）
ＯＣＴファミリーとしては、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＯＣＴ１Ａ遺伝子及びＯＣＴ６遺伝子等が挙げられる。これらのＯＣＴファミリーは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。ＯＣＴファミリーの中では、ｉＰＳ細胞への効率的な誘導という観点から、ＯＣＴ３／４遺伝子が好適に使用される。ＯＣＴ３／４の塩基配列は、公知（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００２７０１（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿０１３６３３（Ｍｏｕｓｅ））である。また、ＯＣＴ１Ａ遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００２６９７（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿１９８９３４（Ｍｏｕｓｅ））、ＯＣＴ６遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００２６９９（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿０１１１４１（Ｍｏｕｓｅ））についても公知である。

（ＳＯＸ２ファミリー）
ＳＯＸファミリーとしては、ＳＯＸ１遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＳＯＸ７遺伝子、ＳＯＸ１５遺伝子、ＳＯＸ１７遺伝子及びＳＯＸ１８遺伝子が挙げられる。これらのＳＯＸファミリーは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。ＳＯＸファミリーの中では、ｉＰＳ細胞への効率的な誘導という観点から、ＳＯＸ２遺伝子が好適に使用される。ＳＯＸ２遺伝子の塩基配列は、公知（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００３１０６（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿０１１４４３（Ｍｏｕｓｅ））である。また、ＳＯＸ１遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００５９８６（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿００９２３３（Ｍｏｕｓｅ））、ＳＯＸ３遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００５６３４（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿００９２３７（Ｍｏｕｓｅ））、ＳＯＸ７遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿０３１４３９（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿０１１４４６（Ｍｏｕｓｅ））、ＳＯＸ１５遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００６９４２（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿００９２３５（Ｍｏｕｓｅ））、ＳＯＸ１７遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿０２２４５４（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿０１１４４１（Ｍｏｕｓｅ））、ＳＯＸ１８遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿０１８４１９（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿００９２３６（Ｍｏｕｓｅ））についても公知である。

（ＫＬＦファミリー）
核初期化物質としては、さらに、ＫＬＦファミリーに属する遺伝子を含むこともできる。ＫＬＦファミリーとしては、ＫＬＦ１遺伝子、ＫＬＦ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子及びＫＬＦ５遺伝子等が挙げられる。これらのＫＬＦファミリーは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。ＫＬＦファミリーの中では、ｉＰＳ細胞への効率的な誘導という観点から、ＫＬＦ４遺伝子が好適に使用される。ＫＬＦ４遺伝子の塩基配列は公知（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００４２３５（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿０１０６３７（Ｍｏｕｓｅ））である。また、ＫＬＦ１遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００６５６３（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿０１０６３５（Ｍｏｕｓｅ））、ＫＬＦ２遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿０１６２７０（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿００８４５２（Ｍｏｕｓｅ））、及びＫＬＦ５遺伝子の塩基配列（ＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００１７３０（ｈｕｍａｎ）、ＮＭ＿００９７６９（Ｍｏｕｓｅ））についても公知である。

核初期化物質としては、ＤＬＸ４遺伝子のほか、ＯＣＴ３／４遺伝子などのＯＣＴファミリー遺伝子及びＳＯＸ２遺伝子などのＳＯＸファミリー遺伝子を組み合わせて用いることが好ましい。より好ましくは、さらに、ＫＬＦ４遺伝子などのＫＬＦファミリー遺伝子を組み合わせる。こうした組合せであると、ｉＰＳ細胞をヒト等の治療用途に用いるのに適している。一方、ｉＰＳ細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など）は、ＤＬＸ４遺伝子のほか、ＯＣＴ３／４遺伝子などのＯＣＴファミリー遺伝子及びＳＯＸ２遺伝子などのＳＯＸファミリー遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子などのＫＬＦファミリー遺伝子に加えてＬｉｎ２８などのＬＩＮファミリー遺伝子を用いることが好ましい。さらに、Ｎａｎｏｇ遺伝子を加えた６因子とすることも好ましい。

Ｎａｎｏｇ遺伝子のマウス及びヒトｃＤＮＡ配列情報は、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載のＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．を参照することにより取得することができ（Ｎａｎｏｇ遺伝子は当該公報中では「ＥＣＡＴ４」との名称で記載されている。なお、Ｌｉｎ２８遺伝子のマウス及びヒトｃＤＮＡ配列情報は、それぞれＮＣＢＩａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿１４５８３３及びＮＭ＿０２４６７４を参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのｃＤＮＡを単離することができる。

上記した各遺伝子には、これらの相同遺伝子が含まれる。ここで、相同遺伝子とは、遺伝子がコードするタンパク質と同一の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を意味している。こうした遺伝子は、通常、上記各遺伝子の塩基配列に対して、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９１％以上、さらにまた好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらにまた好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにまた好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性の塩基配列からなるＤＮＡを有している。

相同遺伝子がコードするタンパク質は、上記遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９１％以上、さらにまた好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらにまた好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにまた好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド鎖を有している。また、各遺伝子は、細胞に対して、異種の遺伝子であってもよいし、同種の遺伝子であってもよい。当業者であれば、必要な動物種の上記遺伝子をデータベースを検索することにより取得することができる。

本明細書において塩基配列又はアミノ酸配列の同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２種以上のタンパク質あるいは２種以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。

ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち、所定の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、さらに一層好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。なお、以上のことから、さらなる他の一態様として、所定の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、さらに一層好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を有する。

核初期化物質の他の一態様として、ＤＬＸ４遺伝子の翻訳産物、ＯＣＴ３／４遺伝子などのＯＣＴファミリーに属する遺伝子の翻訳産物及びＳＯＸ２遺伝子などのＳＯＸファミリーに属する遺伝子の翻訳産物が挙げられる。さらに、ＫＬＦ４遺伝子などのＫＬＦファミリーに属する遺伝子の翻訳産物が挙げられる。ここで、遺伝子の翻訳産物とはタンパク質を意図している。

例えば、ＤＬＸ４タンパク質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するヒト由来ＤＬＸ４タンパク質を用いることができる。また、マウス由来ＤＬＸ４タンパク質としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を用いることができる。

核初期化物質としては、上記した各遺伝子の翻訳産物と機能的同等である他のタンパク質であってもよい。通常、機能的同等のタンパク質は、特定タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９１％以上、さらにまた好ましくは９２％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９４％以上、さらにまた好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにまた好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸からなるペプチド鎖を有している。

機能的同等のタンパク質には、野生型の分化多能性誘導能よりも優れた能力を発揮するものも含まれる。このようなより優れた能力を発揮するタンパク質は、野生型のタンパク質のアミノ酸配列中に欠失、置換若しくは付加などの改変を、当該技術分野で公知の手法により導入することで調製することが可能である。改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴａＫａＲａ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴａＫａＲａ社））等を使用し、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により、分化多能性因子の遺伝子に適当な塩基置換を導入して行うことができる。

また、核初期化物質は、遺伝子のみを使用してもよいし、遺伝子の翻訳産物のみを使用してもよいが、遺伝子と遺伝子の翻訳産物とを適宜組み合わせたものであってもよい。

核初期化物質としてタンパク質自体を用いる場合には、単離したｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組み換えタンパク質を回収することにより調製することができる。

（ｉＰＳ細胞の誘導効率改善物質）
本明細書においては、上記した核初期化物質に加えて、公知の誘導効率改善物質を用いてもよい。ｉＰＳ細胞の誘導効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１ｓｉＲＮＡＳｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ２９ｍｅｒｓｈＲＮＡＣｏｎｓｔｒｕｃｔｓａｇａｉｎｓｔＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、ＢＩＸ−０１２９４（Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)）等の低分子阻害剤、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、Ｇ９ａｓｉＲＮＡ（ｈｕｍａｎ）（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等）等の核酸性発現阻害剤など］等が挙げられるが、それらに限定されない。核酸性の発現阻害剤はｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態であってもよい。

ｉＰＳ細胞の誘導効率改善物質の細胞への接触は、該物質が（ａ）タンパク性因子である場合、（ｂ）該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは（ｃ）低分子化合物である場合に応じて、核初期化物質についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。

（組換えベクター）
核初期化物質である各遺伝子及び誘導効率改善物質を細胞に供給するためには、組換えベクターが利用される。各遺伝子は、宿主となる細胞で機能し得るプロモーターを含む適当なベクターに導入される。ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、ｐＡ１−１１，ｐＸＴ１，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲｃ／ＲＳＶ，ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）などが用いられ得る。用いるベクターの種類は、得られるｉＰＳ細胞の用途に応じて適宜選択することができる。なお、各遺伝子は、１のベクターに全て導入されてもよいし、２以上のベクターに別々に導入されてもよい。

ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＳＲα プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＭｏＭｕＬＶＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＳＲα プロモーターなどが好ましい。ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、ＳＶ４０複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。

ベクターにおいて使用されるターミネーターは、転写終結配列としてのポリＡ化シグナルである。特に限定されないが、ポリＡ化シグナル配列として、ヒトＢＧＨポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβアクチンポリＡ、ウサギβグロブリンポリＡ及び免疫グロブリンκポリＡが例示される。

（ベクターセット）
上述したように、各遺伝子は、１又は２以上のベクターに導入される。本明細書は、各遺伝子が導入された１又は２以上の組換えベクターを含むベクターセットも開示する。即ち、ベクターセットは、１の組換えベクターでもよいし、２以上の組換えベクターの混合物であってもよい。また、２以上の組換えベクターを含むベクターセットの場合において、ベクターセット内に各遺伝子が全て含まれるのであれば、各組換えベクターの数の比率は問わない。しかし、各遺伝子が同量含まれるような、組換えベクターの数の比率とすることが好ましい。

（細胞）
本明細書においてｉＰＳ細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよい。例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。なお、細胞としては、好ましくは、ＤＬＸ４遺伝子の発現量の多い細胞が利用される。ＤＬＸ４遺伝子の発現量が多い細胞の例として、ＤＰＣが挙げられる。特に歯根完成期前のＤＰＣが挙げられる。

本明細書で利用される細胞は、当該細胞に核初期化物質を接触させることによりｉＰＳ細胞を誘導することができるいかなる動物種（哺乳動物を含む）由来のものであってもよい。具体的にはヒトおよびマウス由来等のものが挙げられるが、好ましくはヒト由来の細胞である。細胞は任意の動物種から採取することができるが、得られるｉＰＳ細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、本人またはＨＬＡの型が同一である他人から細胞を採取することが特に好ましい。また、ヒトに投与（移植）しない場合でも、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてｉＰＳ細胞を使用する場合には、患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から細胞を採取する必要がある。

（ＤＰＣ（Dental Pulp Cell、歯髄細胞））
ＤＰＣとは、歯の中核にみられる血管と神経に富んだ結合組織の細胞群である。本発明において、ＤＰＣとは、このような生体内での解剖学的な位置で特定される細胞群を意味する。

以下では、主にヒト由来のＤＰＣの入手方法について説明する。

ＤＰＣは、当業界で既知の方法によって採取することができる。特に、歯の治療に伴う抜歯により得られた歯、又は抜歯の際に歯と共に歯肉から分離されたものに由来することが好ましい。多くの場合、抜歯は歯における異常／問題が原因で行われるため、抜歯に伴い入手可能な歯髄細胞自体は、細胞の有する特性をそのまま保持している。このため、このような歯髄細胞を使用することが有利である。

ＤＰＣとしては、若年者（個体差があるが、およそ１６歳以下）のＤＰＣを利用することが好ましい。智歯は、１２〜１６歳で矯正目的にて抜歯することがあり、このような細胞の入手方法を採用することによって、従来、廃棄物として処理されていた歯髄細胞を有効に利用することができる。また、細胞の入手を目的としての「追加の処置」を伴うことなく所望の細胞を得ることができる。

なお、回収された歯関連細胞に、例えば結合組織やデブリスなどが含まれている場合には、適当な酵素、例えばディスパーゼ、トリプシンなどや、ナイロンメッシュなどを用いて除去することができる。

ＤＰＣの成長段階は、歯冠完成期、歯根形成期及び歯根完成期が含まれる。本明細書においては、歯根完成期前のＤＰＣを利用することが好ましい。歯冠とは、口腔内で実際に歯肉から萌出している部分であり、最表面がエナメル質、その内側が象牙質となっている。歯根とは、歯肉に埋まっている部分であり、最表面がセメント質、その内側が象牙質となっている。歯冠完成期は、エナメル質、象牙質等の硬組織が形成されている段階であり、歯根形成期は、セメント質が形成されている段階、即ち、歯根が形成されている段階であり、歯根完成期は、歯根が完成されている段階である。これらの成長段階は、例えば、Ｘ線写真を撮影することによって区別することができる。

また、好ましいＤＰＣは、ＤＬＸ４遺伝子の発現量からも区別することができる。例えば、同種の皮膚線維芽細胞と同条件で培養したときのＤＰＣによるＤＬＸ４遺伝子の発現量が皮膚線維芽細胞の同発現量に対して２００倍以上であることが好ましく、より好ましくは３００倍以上であり、さらに好ましくは５００倍以上であり、より一層好ましくは８００倍以上であり、一層好ましくは１０００倍以上である。また同種のＥＳ細胞と同条件で培養したときのＤＰＣによるＤＬＸ４遺伝子の発現量がＥＳ細胞の同発現量に対し５０％以上２００％以下であることも好ましい。なお、こうした培養条件は、後述する実施例における培養条件を採用することができる。

上述したように、ＤＰＣは、比較的、例えば、ＤＬＸ４遺伝子の発現量が多いことを特徴とする。特に、歯根完成期前（即ち歯冠完成期又は歯根形成期）のＤＰＣは、歯根完成期のＤＰＣよりもＤＬＸ４遺伝子の発現量が多く、各遺伝子を導入する細胞として好ましく利用される。歯根完成期前のＤＰＣは、若年者（およそ１６歳以下）から採取可能である。ＤＰＣ由来（即ち内在性）のＤＬＸ４遺伝子を利用すると、外来性のＤＬＸ４遺伝子のみを利用する場合に比べて、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めることができる。

抜歯もしくは自然脱落した歯から、上述の方法により調製した歯髄細胞は、直ぐに核初期化物質と接触させてｉＰＳ細胞を誘導してもよいし、あるいは常法により凍結保存し、用時融解して培養した後に核初期化物質と接触させて、ｉＰＳ細胞を誘導することもできる。従って、例えば、自身の乳歯や比較的若い時期に抜歯した永久歯もしくは智歯から調製した歯髄細胞を長期間凍結保存しておき、後年細胞・臓器移植が必要となった際に、該歯髄細胞からｉＰＳ細胞を誘導し、そこから分化誘導して得られた細胞、組織、臓器等を自家移植するということも可能である。

歯髄細胞は、矯正手術により抜歯した歯・智歯、また虫歯、歯周病、智歯周囲炎等により抜いた歯・智歯などから調製することができるため、多数の人の歯髄細胞を容易に収集することができる。

（ｉＰＳ細胞作製剤）
本明細書では、上記のベクターセットを含むｉＰＳ細胞作製剤、歯根完成期前の歯髄細胞を含むｉＰＳ細胞を作製するための剤、及び、ＤＬＸ４遺伝子を含むｉＰＳ細胞作製剤も開示する。また、これらのｉＰＳ細胞作製剤を組み合わせて、ｉＰＳ細胞作製剤としてもよい。

（ｉＰＳ細胞の作製方法）
本明細書は、ｉＰＳ細胞の作製方法も提供する。当該作製方法は、核初期化物質と細胞とを接触させる工程を含む。

（核初期化物質と細胞とを接触させる工程）
核初期化物質と細胞とを接触させる工程では、核初期化物質を細胞に接触させることにより、核初期化物質が細胞に導入された状態にすることができる。その結果、ｉＰＳ細胞を誘導することができる。当該工程において、核初期化物質が遺伝子の場合には、各遺伝子をベクターに組み込み、当該ベクターを直接あるいはウイルスを介して細胞に導入することができる。一方において、核初期化物質がタンパク質の場合には、公知のタンパク質導入法により、当該タンパク質を細胞に導入することができる。核初期化物質を細胞に接触させる方法について、以下で詳細に説明する。

（細胞へのベクターの接触）
核初期化物質である遺伝子を含むベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞と接触させることで細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、当該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞）や相補細胞株（例、２９３細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、ベクターを細胞に感染させる。一方、プラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。

（核初期化物質であるタンパク質の細胞への接触）
核初期化物質の細胞への接触は、当該物質がタンパク質である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙＳｙｓｔｍｅｓ）、Pro-JectT M Protein Transfection Reagent（ＰＩＥＲＣＥ）及びProVectin（ＩＭＧＥＮＥＸ）、脂質をベースとしたProfect-1（ＴａｒｇｅｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）及びChariot Kit（ＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒（例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で５−１５分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して３７℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。

なお、ＰＴＤとしては、ショウジョウバエ由来のＡｎｔＰ、ＨＩＶ由来のＴＡＴ、ＨＳＶ由来のＶＰ２２等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。

なお、細胞は、その培養に適した自体公知の培地（例えば、特表平１１−５０６６１０号公報、特表２０００−５１５０２３号公報参照。例えばMesenchymal stem cells basal medium（Ｌｏｎｚａ社）、MesenPRO RS Medium（ＧＩＢＣＯ）等が市販されている）で前培養することができる。また、例えば約５〜２０％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地またはＦ１２培地等で前培養することも可能である。

また、核初期化物質（及びｉＰＳ細胞の誘導効率改善物質）との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。核初期化物質（及びｉＰＳ細胞の誘導効率改善物質）を接触させた後、細胞を、例えばＥＳ細胞の培養に適した条件化で培養することができる。ヒト細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加して培養を行うことが好ましい。一方、マウス細胞の場合には、ｂＦＧＦの代わりにＬｅｕｋｅｍｉａＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＦａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ）の共存下で培養される。ＭＥＦとしては、通常ＳＴＯ細胞等がよく使われるが、ｉＰＳ細胞の誘導には、ＳＮＬ細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085(1990)）等がよく使われている。

ｉＰＳ細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、ＯＣＴ３／４遺伝子）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、ｉＰＳ細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。核初期化物質としてＤＬＸ４遺伝子、ＯＣＴ３／４遺伝子及びＳＯＸ２遺伝子の３因子を用いた場合、誘導クローン数は減少するものの、生じるコロニーのほとんどがＥＳ細胞と比較して遜色のない高品質のｉＰＳ細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくｉＰＳ細胞を誘導することが可能である。特に、本発明は３因子の導入によるｉＰＳ細胞の誘導効率を格段に改善させる作用効果を奏することから、目視による形態観察で十分効率よくｉＰＳ細胞の候補コロニーを選択することができる。

選択されたコロニーの細胞がｉＰＳ細胞であることの確認は、自体公知の種々の試験方法、例えばＥＳ細胞特異的遺伝子の発現解析などにより行うことができる。さらに正確を期す場合は、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認すればよい。

核初期化物質と細胞とを接触させる工程を経て、作製されたｉＰＳ細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ＥＳ細胞で報告されている分化誘導法を利用して、ｉＰＳ細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、網膜細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）・組織・臓器への分化を誘導することができる。

以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。

（各種ＤＰＣ株におけるｉＰＳ細胞の誘導効率の評価）
種々のＤＰＣの誘導効率を判断するために、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子及びｃ−ＭＹＣ遺伝子の４種類を，９種類のＤＰＣ株（ＤＰ１，ＤＰ３１，ＤＰ７５，ＤＰ８７，ＤＰ９４，ＤＰ１３３，ＤＰ１６５，ＤＰ１６６，ＤＰ１９３）のそれぞれに導入し、ｉＰＳ細胞を作製した。ｉＰＳ細胞の作製は以下のようにして行った。

１４〜６０歳のヒトの抜歯した歯から歯髄細胞を調製した（ＤＰ１，ＤＰ３１，ＤＰ７５，ＤＰ８７，ＤＰ９４，ＤＰ１３３，ＤＰ１６５，ＤＰ１６６，ＤＰ１９３）。具体的には、矯正または智歯周囲炎の患者から抜歯した智歯より歯髄組織を摘出し、眼科クーパーにて約1〜2mm大の組織片に刻んだ後、Collagenase type I（1mg/ml）で37℃、0.5〜1時間処理をした。これをMesenchymal stem cells basal medium（Lonza社製）中で、培養することにより歯髄細胞のセルラインを樹立した。

これらの細胞(8×10⁵個)に対して、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、レンチウイルスを用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた。

これらの細胞に対して、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来の4因子 (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) を、ポリブレン（ヘキサジメチリンブロマイド）４μｇ／ｍｌの存在下、レトロウイルスで導入した。ウイルス感染から6日後に細胞を回収し、フィーダー細胞上への蒔き直しを行った（5 x 10⁴個または 5 x 10⁵個/100 mmディッシュ）。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）を用いた。翌日から霊長類ES細胞培養用培地(ReproCELL) に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO）を加えた培地で培養を行った。

ウイルス感染から２１日後、感染した５×１０⁴個のＤＰＣから得られたＥＳ細胞様コロニーを形態的に判断してその数を数えた。評価を３回行い、ＥＳ細胞様コロニーの平均値を各ＤＰＣ株から計算し、ＤＰ３１から得られた平均値で規格化した。なお、ＤＰ３１の相対誘導効率を１．０とした。結果を図１に示す。

図１に示すように、ＤＰ１，３１，８７，９４は、歯冠完成期又は歯根形成期の（即ち歯根完成期前の）ＤＰＣであり、ＤＰ７５，１３３，１６５，１６６，１９３は、歯根完成期後のＤＰＣである。歯根完成期前の各ＤＰＣは、総じて、歯根完成期後のＤＰＣよりも誘導効率が高いことが分かった。

（ＤＰＣにおける遺伝子発現量の評価）
実施例１で評価した各ＤＰＣのほか、コントロールとして３６歳の成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦ）及びヒトＥＳ細胞（ｋｈＥＳ）に関し、遺伝子発現の評価を行った。なお、ｋｈＥＳは、京都大学再生医科学研究所より入手した。Real-time PCRによって、各ＤＰＣ、ＨＤＦ及びヒトＥＳ細胞（ｋｈＥＳ）から得られた各遺伝子の発現量を評価した。具体的には、RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)を用いて各ＤＰＣ、ＨＤＦ及びヒトＥＳ細胞（ｋｈＥＳ）のTotal RNAを採取した。Rever Tra Ace-α(Toyobo) を用いて、Total RNA (500 ng)からcDNA合成を行った。PCR反応は、SYBR Premix Ex Taq (Takara)と、各遺伝子用に設計されたプライマーDLX4 (S)（配列番号５）、DLX4 (AS)（配列番号６）（Takara）を用いて、Thermal Cycler Dice Real Time System (Takara)で行った。発現量の解析もThermal Cycler Dice Real Time Systemを用いて行った。その結果、歯根完成前後において複数の遺伝子の増減があったが、なかでも、ＤＬＸ４遺伝子についての結果を図２に示す。図２では、ＤＰ３１から得られたＤＬＸ４遺伝子の発現量で規格化して示す。なお、ＤＰ３１での相対発現量を１．０とした。

DLX4 (S): TAA ACC AGC GTT TCC AGC AC（配列番号５）
DLX4 (AS): CTT ATA CTT GGA GCG TTT GTT CTG A（配列番号６）

図２に示すように、歯根完成期前の各ＤＰＣは、歯根完成期後の各ＤＰＣに比較してＤＬＸ４遺伝子の相対発現量が高いことがわかった。例えば、歯根完成期後のＤＰＣ平均に対して約１１倍〜約３７倍の発現量を示した。また、ＨＤＦでは、ＤＰ３１と対比するとＤＬＸ４遺伝子の発現はほとんど見られなかった。歯根完成期前のＤＰＣは、ＨＤＦに比較して約３４０倍〜約１１００倍の発現量を示していることがわかった。

さらに、歯根完成期前の各ＤＰＣは、ｋｈＥＳと対比すると、ＤＬＸ４遺伝子の相対発現量がほぼ同等（約６０％〜約１９０％）であることが分かった。

以上のことから、歯根完成期前のＤＰＣは、ＤＬＸ４遺伝子の発現が顕著に促進されていることがわかった。

本実施例では、歯根完成期前のＤＰＣについて発現の促進が観察されたＤＬＸ４遺伝子について、ｉＰＳ細胞の誘導効率への寄与を評価した。

本実施例では、実施例１で用いたＤＰＣであるＤＰ３１を用いた。また、コントロールとして、３６歳の成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦ）を用いた。

（ベクターの作製）
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ反応を用いて、ヒト由来のＤＬＸ４遺伝子（配列番号１）を図３に示すｐＭＸｓ−ＧＷレトロウイルスベクターのＯＲＦ領域に導入して組み換えｐＭＸｓ−ＧＷレトロウイルスベクター（以下、ＤＬＸ４ベクターという。）を作製した。

ＤＬＸ４ベクター、別途入手したＯＣＴ３／４遺伝子を保持するｐＭＸｓベクター、ＳＯＸ２遺伝子を保持するｐＭＸｓベクター、及びＫＬＦ４遺伝子を保持するｐＭＸｓベクターを適宜組み合わせて、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ製）を用いて、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞（ecotropic retrovirus packaging cells）にトランスフェクトした。

これにより、遺伝子を感染可能に保持する以下に示す５種類のＰｌａｔ−Ｅ細胞を調製した。
（１）ＯＣＴ３／４遺伝子及びＳＯＸ２遺伝子（ＯＳ）がトランスフェクトされたＰｌａｔ−Ｅ細胞１
（２）ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子及びＤＬＸ４遺伝子（ＯＳＤ）がトランスフェクトされたＰｌａｔ−Ｅ細胞２
（３）ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子及びＫＬＦ４遺伝子（ＯＳＫ）がトランスフェクトされたＰｌａｔ−Ｅ細胞３
（４）ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子及びＤＬＸ４遺伝子（ＯＳＫＤ）がトランスフェクトされたＰｌａｔ−Ｅ細胞４
（５）ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子、ＫＬＦ４遺伝子及びｃ−ＭＹＣ遺伝子がトランスフェクトされたＰｌａｔ−Ｅ細胞５（ＯＳＫＭ）

次いで、ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター（Beckton Dickinson製）による蛍光活性化細胞分析に従い、ＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）をエンコードするｐＭＸｓベクターを用いて、各種Ｐｌａｔ−Ｅ細胞について遺伝子導入効率をモニターした。

その後、実施例１と同様にして上記した各種のＰｌａｔ−Ｅ細胞からウイルス上清を回収してＤＰ３１及びＨＤＦに感染させ、各培地に出現したＥＳ細胞様（ｉＰＳ細胞）コロニーを形態的に判断してその個数を計測した。図４に、ＤＰ３１においてカウントされたＥＳ細胞様コロニーの数を示す。

図４に示すように、ＯＳＤでは、ＯＳでの場合に比べて５０倍程度のＥＳ細胞様コロニーが出現し、ＯＳＫＤでは、ＯＳＫでの場合に比べて４．３倍程度のＥＳ細胞様コロニーが出現していた。これらのことから、核初期化物質としてＤＬＸ４遺伝子を加えることによって、ｉＰＳ細胞の誘導効率が飛躍的に高くなることが分かった。すなわち、ＤＬＸ４遺伝子は、ＫLＦ４遺伝子とほぼ同等の誘導作用を有していることがわかった。また、ＯＳＫＤでは、ＯＳＤでの場合に比べて、５．４倍程度のＥＳ細胞様コロニーが出現していた。このことから、核初期化物質がＤＬＸ４遺伝子を含む場合に、さらＫＬＦ４を加えることによって、相乗的にｉＰＳ細胞の誘導効率が向上することがわかった。

また、図５にＨＤＦにおいてカウントされたＥＳ細胞様コロニー数を示す。ＨＤＦでは、ＯＳＫの場合に比較してＯＳＫＤの場合のＥＳ細胞様コロニー数が相乗的に増大していた。ＤＬＸ４遺伝子とＫＬＦ４遺伝子との相乗作用は、ＤＰ３１よりもＨＤＦにおいてより大きかった。また、ＯＳＫＤでのコロニー数は、ＯＳＫＭでのコロニー数と有意差はなかった。すなわち、ＤＬＸ４遺伝子は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子と同等のｉＰＳ細胞誘導効率の向上効果を有していることがわかった。

本実施例では、ＤＬＸ４遺伝子のノックダウンＤＰＣを調製して、ＤＬＸ４遺伝子のｉＰＳ細胞誘導効果を確認した。

（ＤＬＸ４ノックダウンＤＰ３１株の樹立）
ＤＬＸ４遺伝子の異なる２個の領域をターゲットとする２個のｓｉＲＮＡ配列を設計した（配列番号７、配列番号８）。当該２個のｓｉＲＮＡ配列を、２種類のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（ヒトＵ６及びヒトＨ１）を同時に用いて、２種類のｓｉＲＮＡを発現し得るｐＳＩＮｓｉ−ＤＫＩレトロウイルスベクター（タカラ製）に導入した。Retrovirus Packaging Kit Eco（タカラ製）を用いて、このｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４発現レトロウイルスベクターをＧ３Ｔ−ｈｉ細胞（タカラ製）にトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４発現レトロウイルスベクターの感染後、ＤＰ３１／Ｓｌｃ細胞をネオマイシン処理し、安定したｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４発現ＤＰ３１を得た。

siRNA-1 : GAA ACC TGG TAA AGT AAC A（配列番号７）
siRNA-2 : CGA ATT GGA GCT TGA GCT T（配列番号８）

（ＤＬＸ４遺伝子発現量の評価）
実施例３と同様にして、ＤＰ３１及びｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４発現ＤＰ３１（ＤＰ３１−ｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４）についてＤＬＸ４遺伝子の遺伝子発現量の評価を行った。これら２種の細胞から得られた発現量をＤＰ３１から得られた発現量で規格化した。なお、ＤＰ３１の相対発現量を１．０とした。図６に、ＤＰ３１及びＤＰ３１−ｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４でのＤＬＸ４遺伝子の相対発現量を示す。

（ｉＰＳ細胞の誘導効率の評価）
実施例１と同様にして、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子及びＫＬＦ４遺伝子を、ＤＰ３１、ＤＰ３１−ｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４にそれぞれ導入して、実施例１と同様の操作を行った。なお、コロニーのカウントは、実施例１とは異なり、３０日後に行った。また、図７には、ＤＰ３１及びＤＰ３１−ｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４でのｉＰＳ細胞の相対誘導効率を示す。

図６に示すように、ＤＰ３１−ｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４では、ＤＸＬ４遺伝子の発現量が顕著に減少していることが分かった。また、図７に示すように、ＤＰ３１−ｓｉＲＮＡ―ＤＬＸ４では、ｉＰＳ細胞の誘導効率が顕著に減少していることがわかった。以上のことから、ＤＬＸ４遺伝子がｉＰＳ細胞の誘導に大きく寄与していることがわかった。

実施例３に準じて、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子及びＫＬＥＦ４遺伝子の組合せ（ＯＳＫ）と、ＯＣＴ３／４遺伝子、ＳＯＸ２遺伝子及びＮＡＮＯＧ遺伝子（Addgene社）の組合せ（ＯＳＮ）で、これらの遺伝子をＤＰ３１に導入して、実施例３と同様、ＥＳ様細胞コロニーを計数した。結果を図８に示す。

図８に示すように、ＯＳＫでは、ＯＳＮの場合に比べて多くのＥＳ細胞様コロニーが出現していた。このことから、ＯＳＫはＯＳＮに対してｉＰＳ細胞の誘導効率が高いことが分かった。すなわち、ＫＬＦ４遺伝子は、ＤＰ３１において誘導効率の向上に極めて効果的であった。このようにＫＬＦ４遺伝子は、ＮＡＮＯＧ遺伝子に比較してｉＰＳ誘導効率に寄与が大きいことが支持された。ＤＰ３１では、ＤＬＸ４遺伝子が本来的に発現されていることから、ＯＳＫにおける高い誘導効率は、ＫＬＦ４遺伝子とＤＬＸ４遺伝子との相乗効果を示しているといえる。さらに、実施例３におけるＯＳＫとＯＳＫＤの結果（ＤＰ３１及びＨＤＦ）を考慮すると、ＤＬＸ４遺伝子は、ＫＬＦ４遺伝子と相乗作用によりさらに一層ｉＰＳ細胞誘導率を向上させることができる点において極めて有用性が高いことがわかった。

配列番号５，６：プライマー
配列番号７，８：ｓｉＲＮＡ

Claims

少なくともＤＬＸ４遺伝子又はその翻訳産物を含む核初期化物質と細胞とを接触させる工程を含む、人工多能性幹細胞の作製方法。
前記核初期化物質は、さらに、ＯＣＴファミリー遺伝子又はその翻訳産物と、ＳＯＸファミリー遺伝子又はその翻訳産物と、を含む、請求項１に記載の作製方法。
前記核初期化物質は、さらに、ＫＬＦ４ファミリー遺伝子又はその翻訳産物を含む請求項１に記載の作製方法。
前記核初期化物質は、さらに、ＫＬＦ４ファミリー遺伝子又はその翻訳産物を含む請求項２に記載の作製方法。
前記細胞は、歯髄細胞である請求項１〜４のいずれかに記載の作製方法。
前記細胞は、歯髄細胞である請求項２に記載の作製方法。
前記歯髄細胞は、歯根完成期前の歯髄細胞である、請求項５に記載の作製方法。
前記歯髄細胞は、歯根完成期前の歯髄細胞である、請求項６に記載の作製方法。
ＤＬＸ４遺伝子、ＯＣＴ３／４遺伝子及びＳＯＸ２遺伝子を保持する、１又は２以上の組換えベクターを含むベクターセット。
請求項９に記載のベクターセットを含む人工多能性幹細胞作製剤。
請求項９に記載のベクターセットにより作製されたｉＰＳ細胞。
歯根完成期前の歯髄細胞を含む人工多能性幹細胞を作製するための剤。
ＤＬＸ４遺伝子を含む人工多能性幹細胞作製剤。