CN116286661A - 一种诱导性多能干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导性多能干细胞及其制备方法和应用。所述方法包括向体细胞导入重编程因子基因并提高FOS蛋白或其变体表达，进行培养，得到所述诱导性多能干细胞。本发明发现在体细胞中同时过表达OSKM四因子(OCT4(NM_002701)、SOX2(NM_003106)、KLF4(NM_004235)、c‑MYC(NM_002467))和FOS(NM_005252)基因，OSKM四因子和FOS蛋白协同配合，能够显著提高诱导重编程效率，实现高效制备诱导性多能干细胞。

Description

一种诱导性多能干细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种诱导性多能干细胞及其制备方法和应用。
背景技术
诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS细胞)，是指体细胞经导入多能遗传基因或在其他诱导因子的作用下进行基因的重新编程，从而得到的具有多向分化潜能的干细胞。2006年8月，日本京都大学Yamanaka研究小组将Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc(OSKM)这4个基因转入小鼠成纤维细胞，首次将体细胞直接重编程为胚胎干细胞样的多潜能干细胞，标志着体细胞重编程为iPS细胞技术的诞生。2007年底，Yamanaka小组和Thomson小组先后成功将人成纤维细胞重编程为iPS细胞。这项研究对于人类干细胞领域的研究和应用起到了巨大的推动作用，它规避了胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)异体移植免疫排斥的风险以及ESCs所带来的伦理学问题等，使得iPS细胞在再生医学领域展现出广阔的应用前景。
尽管iPS细胞有着广阔的应用前景，然而在整个iPS研究过程中，iPS转化效率低以及易分化现象始终是研究中较大的障碍。在此前的常规转化方法中，如CN109576226A公开一种所述方法包括如下步骤：(1)收集尿液，离心弃上清，洗涤沉淀，重悬细胞；(2)将步骤(1)所得重悬细胞接种于包被的培养皿中，过夜培养，之后换液培养，直到长出UDCs克隆，传代培养；(3)吸弃传代培养的培养基，胰酶消化，收集细胞计数，利用电转染方法转染质粒，加入到复苏培养板中过夜培养，之后换液培养，筛选iPS克隆；其中，质粒包括pCXLE-hOCT3/4-shp53、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL。iPS细胞重编程的效率较低，而且这一过程需要数周时间，一定程度限制了iPS细胞的广泛应用。
综上所述，如何提供一种高效的促进体细胞重编程的方法，是诱导性多能干细胞领域亟需解决问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种诱导性多能干细胞及其制备方法和应用，本发明在体细胞中同时过表达OSKM四因子基因(OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC)和FOS基因，利用其协同配合，能够显著提高诱导重编程效率，实现高效制备诱导性多能干细胞。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括：
向体细胞导入重编程因子基因并提高FOS蛋白或其变体表达，进行培养，得到所述诱导性多能干细胞。
本发明发现在体细胞中过表达重编程诱导因子以及提高FOS(NM_005252)蛋白表达，重编程诱导因子和FOS蛋白协同配合，能够显著提高诱导重编程效率，实现高效制备诱导性多能干细胞。
本发明中，FOS基因为原癌基因，基因ID为2353，该基因编码的蛋白可以与JUN家族的蛋白二聚化，从而形成转录因子复合物AP-1。因此，FOS蛋白被认为是细胞增殖、分化和转化的调节因子，在某些情况下，FOS基因的表达也与凋亡细胞的死亡有关。
其中，FOS蛋白的氨基酸序列为：
MMFSGFNADYEASSSRCSSASPAGDSLSYYHSPADSFSSMGSPVNAQDFCTDLAVSSANFIPTVTAISTSPDLQWLVQPALVSSVAPSQTRAPHPFGVPAPSAGAYSRAGVVKTMTGGRAQSIGRRGKVEQLSPEEEEKRRIRRERNKMAAAKCRNRRRELTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHRPACKIPDDLGFPEEMSVASLDLTGGLPEVATPESEEAFTLPLLNDPEPKPSVEPVKSISSMELKTEPFDDFLFPASSRPSGSETARSVPDMDLSGSFYAADWEPLHSGSLGMGPMATELEPLCTPVVTCTPSCTAYTSSFVFTYPEADSFPSCAAAHRKGSSSNEPSSDSLSSPTLLAL。
FOS(NM_005252)基因核酸序列为：
ATGATGTTCTCGGGCTTCAACGCAGACTACGAGGCGTCATCCTCCCGCTGCAGCAGCGCGTCCCCGGCCGGGGATAGCCTCTCTTACTACCACTCACCCGCAGACTCCTTCTCCAGCATGGGCTCGCCTGTCAACGCGCAGGACTTCTGCACGGACCTGGCCGTCTCCAGTGCCAACTTCATTCCCACGGTCACTGCCATCTCGACCAGTCCGGACCTGCAGTGGCTGGTGCAGCCCGCCCTCGTCTCCTCCGTGGCCCCATCGCAGACCAGAGCCCCTCACCCTTTCGGAGTCCCCGCCCCCTCCGCTGGGGCTTACTCCAGGGCTGGCGTTGTGAAGACCATGACAGGAGGCCGAGCGCAGAGCATTGGCAGGAGGGGCAAGGTGGAACAGTTATCTCCAGAAGAAGAAGAGAAAAGGAGAATCCGAAGGGAAAGGAATAAGATGGCTGCAGCCAAATGCCGCAACCGGAGGAGGGAGCTGACTGATACACTCCAAGCGGAGACAGACCAACTAGAAGATGAGAAGTCTGCTTTGCAGACCGAGATTGCCAACCTGCTGAAGGAGAAGGAAAAACTAGAGTTCATCCTGGCAGCTCACCGACCTGCCTGCAAGATCCCTGATGACCTGGGCTTCCCAGAAGAGATGTCTGTGGCTTCCCTTGATCTGACTGGGGGCCTGCCAGAGGTTGCCACCCCGGAGTCTGAGGAGGCCTTCACCCTGCCTCTCCTCAATGACCCTGAGCCCAAGCCCTCAGTGGAACCTGTCAAGAGCATCAGCAGCATGGAGCTGAAGACCGAGCCCTTTGATGACTTCCTGTTCCCAGCATCATCCAGGCCCAGTGGCTCTGAGACAGCCCGCTCCGTGCCAGACATGGACCTATCTGGGTCCTTCTATGCAGCAGACTGGGAGCCTCTGCACAGTGGCTCCCTGGGGATGGGGCCCATGGCCACAGAGCTGGAGCCCCTGTGCACTCCGGTGGTCACCTGTACTCCCAGCTGCACTGCTTACACGTCTTCCTTCGTCTTCACCTACCCCGAGGCTGACTCCTTCCCCAGCTGTGCAGCTGCCCACCGCAAGGGCAGCAGCAGCAATGAGCCTTCCTCTGACTCGCTCAGCTCACCCACGCTGCTGGCCCTGTGA。
可以理解，一般来说，“变体”一词指的是具有一个或多个添加、替换和/或删除突变的原始序列的分子，只要突变不破坏其生物活性，且与原始分子“本质上同源”。
优选地，所述变体至少有一个氨基酸发生突变，且氨基酸序列同源性至少为50％，包括但不限于51％、52％、53％、54％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，可以理解，满足上述数值范围均适用于本发明，不再逐一列举。
本发明中，理论上，在体细胞中同时过表达重编程因子和FOS蛋白均能实现诱导重编程，对于体细胞类型不作特殊限制。
本发明中，所述体细胞可选自尿液细胞、皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞。
可以理解，本领域提高蛋白表达的方法均适用于本发明，不作特殊限制。
本发明中，所述提高FOS蛋白或其变体表达的方法可选自向体细胞中导入FOS基因、mRNA或蛋白质中任意一种。
本发明中，本领域常规的外源基因导入方法如构建质粒、慢病毒等均适用于本发明，不作特殊限制。
优选地，所述重编程因子包括Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、LIN28、L-MYC、N-MYC或Mir302-367簇中任意一种或至少两种的组合。
本发明一具体实施例中可在体细胞中同时过表达OSKM四因子基因(OCT4(NM_002701)、SOX2(NM_003106)、KLF4(NM_004235)、c-MYC(NM_002467))和FOS(NM_005252)基因，OSKM四因子和FOS基因产物协同配合，能够显著提高诱导重编程效率，实现高效制备诱导性多能干细胞。
优选地，所述将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法包括：
向体细胞中导入重编程因子基因及FOS基因，进行培养，得到所述诱导性多能干细胞。
本发明中，导入重编程因子基因以及FOS基因的方法可选自电转导或者病毒转染。
进一步优选地，所述将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法包括：
采用体细胞培养基培养体细胞并向体细胞中导入重编程因子基因及FOS基因，将导入后体细胞置于重编程培养基中培养，待出现ES样克隆后更换为多能干细胞培养基培养。
所述多能干细胞培养基包括E8培养基或mTeSR1培养基。
第二方面，本发明提供一种诱导性多能干细胞，所述诱导性多能干细胞由第一方面所述的将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法制备得到。
第三方面，本发明提供第二方面所述的诱导性多能干细胞在制备医用功能材料中的应用。
第四方面，本发明提供第二方面所述的诱导性多能干细胞在制备细胞、组织或器官中的应用。
本发明中，所制备的诱导性多能干细胞具备多向分化潜能，可通过诱导分化培养，进一步分化为目标细胞，进而制备组织或器官。
第五方面，本发明提供一种制备细胞、组织或器官的方法，所述方法包括：
利用第一方面所述的将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法制备诱导性多能干细胞，根据需求将所述诱导性多能干细胞置于诱导分化培养基中培养，得到目标细胞、组织或器官。
本发明中，所述细胞可选自脂肪细胞、心肌细胞或软骨细胞中任意一种。
本发明中，所述诱导分化培养基为促进诱导性多能干细胞分化为目标细胞的培养基。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明发现在体细胞中同时过表达OSKM四因子(OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC)基因和FOS基因，OSKM四因子和FOS蛋白协同配合，能够显著提高诱导重编程效率，实现高效制备诱导性多能干细胞，所制备诱导性多能干细胞具备多向分化潜能，可通过诱导分化培养，进一步分化为目标细胞，进而制备组织或器官。
附图说明
图1为重编程质粒载体结构示意图；
图2为FOS促进尿细胞重编程效率统计结果图；
图3为诱导多能干细胞的形态图；
图4为q-PCR鉴定FOS基因在尿液细胞及过表达FOS的尿液细胞中的表达图；
图5为qPCR鉴定多能干细胞标记物OCT4和SOX2在尿液细胞、OSKM诱导产生的iPSC以及FOS促进产生的诱导多能干细胞中的表达图；
图6为FOS促进产生的诱导多能干细胞的核型鉴定结果图；
图7为流式鉴定多能性标记物OCT4及SSEA在诱导多能干细胞的表达情况图；
图8为诱导多能干细胞产生的畸胎瘤切片HE染色显示的三胚层细胞图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
本发明具体实施例中，以尿液来源的细胞(尿细胞)为例验证本发明的方法。
实施例1
本实施例提供一种诱导性多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)慢病毒载体的构建
如图1所示，将OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC和FOS基因分别导入pGC.lenti慢病毒载体骨架，其中重编程因子OCT4和SOX2被置于同一个慢病毒载体骨架，中间由T2A序列相连；而KLF4和c-MYC同样被置于同一个慢病毒载体骨架，中间由T2A序列相连。
(2)慢病毒载体包装产生病毒
按照以下方式使用慢病毒载体来产生病毒。首先，采用过表达SV40-LT抗原蛋白的293T细胞产生病毒，转染前一天将生长状态良好的293T细胞进行传代，10cm培养皿每皿接种800万细胞，16h后细胞大约达到80％的汇合度。转染当天，先换液，每个10cm培养皿加入9mL293T培养基(90％DMEM/高糖+10％FBS)，以单独转染方式制备编码重编程因子OCT4-T2A-SOX2、KLF4-T2A-MYC以及FOS蛋白或对照GFP蛋白的4种慢病毒载体中的每一种。将12μg每种慢病毒载体各自与pRSV-REV(6μg)、pMDLg/pRRE(6μg)和VSVG(6μg)的DNA混合，然后将DNA与1mLOptiMem混合，静置2min，加入80μL聚乙烯亚胺(1mg/mL)后涡旋震荡混合后静置15min，制备成DNA-聚乙烯亚胺复合物溶液，然后向细胞中逐滴加入DNA-聚乙烯亚胺复合物溶液，转染8h后换液；转染48h后，通过收集转染培养皿中培养基上清来收获病毒。将培养基上清通过45μm的针筒过滤器过滤后使用50,000×g的超高速离心机离心2h浓缩病毒。
(3)尿液细胞的感染及铺板
感染病毒前将尿液细胞接种至预先包被有0.1％gelatin的6孔板中，每孔约30万细胞，24h后加入浓缩后的病毒，按照10cm培养皿一个培养皿感染6孔板6个孔的病毒滴度加入含有重编程因子基因OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC的病毒，同时分为两组，一组加入对照GFP病毒，另外一组实验组加入FOS病毒，感染48h后使用重编程培养基：E7培养基加入组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(丁酸钠)培养，隔天换液，直至ES样克隆出现后换成干细胞培养基E8培养。
结果如图2所示，相较于对照组仅过表达OSKM四因子及GFP诱导重编程(OSKM)，同时在尿细胞中过表达OSKM四因子基因(OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC)和FOS基因(OSKM+FOS)，能够显著提高尿细胞重编程效率，实现高效制备诱导性多能干细胞。
(4)对得到的诱导性多能干细胞进行鉴定
使用玻璃针(赛默飞1367820C)将形态致密，边缘清晰的胚胎干细胞的单克隆挑取出来，用1mL移液枪轻轻吹成小团块，转移至提前铺好的基质胶(康宁354277)的培养板中培养，培养体系使用干细胞培养基E8培养。传代过程与普通胚胎干细胞传代相同。FOS促进产生的诱导多能干细胞有着与胚胎干细胞类似的细胞形态(图3)，图4为原始尿液细胞(UC)及过表达FOS的尿液细胞中(UC-FOS)FOS基因表达水平，尿液细胞在重编程过程中高表达FOS基因。
对通过过表达FOS基因促进产生的诱导多能干细胞进行多能性鉴定实验，其内容包括：定量聚合酶链式反应(qPCR)、核型分析、流式分析、畸胎瘤HE染色鉴定等。
经鉴定FOS促进产生的诱导多能干细胞(OSKM-FOS-iPSC)高表达多能性基因OCT4，SOX2(图5)，有正常的46，XY核型(图6)，99％以上细胞都表达OCT4及SSEA4等人多能干细胞标记物(图7)，UC-iPSC能在NSG小鼠(广州南模生物)中产生完整的畸胎瘤，组织切片HE染色能看到明显三个胚层的细胞(图8)。
综上所述，本发明发现在体细胞中同时过表达重编程因子(例如OSKM四因子)和FOS基因，重编程因子和FOS蛋白协同配合，能够显著提高诱导重编程效率，实现高效制备诱导性多能干细胞，诱导产生的多能干细胞同胚胎干细胞类似具有多能性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
向体细胞导入重编程因子基因并提高FOS蛋白或其变体表达，进行培养，得到所述诱导性多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述变体至少有一个氨基酸发生突变，且氨基酸序列同源性至少为50％；
优选地，所述体细胞包括尿液细胞、皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞。
3.根据权利要求1或2所述的将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述提高FOS蛋白或其变体表达的方法包括基因过表达、外源导入mRNA或者蛋白质中的任意一种；
优选地，所述重编程因子包括Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、LIN28、L-MYC、N-MYC或Mir302-367簇中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
向体细胞中导入重编程因子基因及FOS基因，进行培养，得到所述诱导性多能干细胞。
5.一种诱导性多能干细胞，其特征在于，所述诱导性多能干细胞由权利要求1-4任一项所述的将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法制备得到。
6.如权利要求5所述的诱导性多能干细胞在制备医用功能材料中的应用。
7.如权利要求5所述的诱导性多能干细胞在制备细胞、组织或器官中的应用。
8.一种制备细胞、组织或器官的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用权利要求1-4任一项所述的将体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法制备诱导性多能干细胞，将所述诱导性多能干细胞置于诱导分化培养基中培养，得到目标细胞、组织或器官。
9.根据权利要求8所述的制备细胞、组织或器官的方法，其特征在于，所述细胞选自脂肪细胞、心肌细胞或软骨细胞、自然杀伤细胞、神经细胞、T细胞、巨噬细胞、粒细胞、肝细胞或胰岛细胞中任意一种。
10.根据权利要求8所述的制备细胞、组织或器官的方法，其特征在于，所述诱导分化培养基为促进诱导性多能干细胞分化为目标细胞的培养基。
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