JP2005511046A - 膵島由来の培養細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、糖尿病および膵島の分野に関し、より詳しくは、機能性インスリン生産性β細胞へと分化する可能性を有する膵島細胞由来の内分泌始原(progenitor)/前駆(precursor)細胞に関する。
真性糖尿病は、米国において約1600万人を襲っている有意の健康課題である。膵島β細胞による充分なインスリン生産の損失は、I型およびII型双方の糖尿病の特徴である。再生または移植によるこれら細胞の置換は、糖尿病のための終生処置を与えることができるだろう。しかしながら、処置を行う場合の主な課題は、移植のための充分な小島細胞組織の不足である。米国では、毎年僅か約3,000のヒトドナー膵臓が求めに応じることができると報告されてきているが、さらに毎年新たに35,000例を超えるI型糖尿病が診断される。インスリン生産性膵島細胞として機能するであろう細胞の移植によって糖尿病患者を処置する方法が継続して要求されている。
本発明は、哺乳動物膵臓、好ましくは、ヒト膵臓、典型的には、成体膵臓由来の内分泌始原/前駆細胞であって、規定培地中において連続継代で培養されていて、しかも小島始原マーカーpdx1およびネスチンを発現する細胞を含む細胞組成物である。これら内分泌始原/前駆細胞を、規定培地中において多数回の継代にわたって培養して、細胞数を増加させる。細胞は、増加するにつれて、一層増殖性になり且つ一層少なく分化するようになる。充分な細胞数が得られた時点で、内分泌始原/前駆細胞を含む本発明の細胞組成物を用いて、インスリン欠乏性糖尿病の一人またはそれを超える患者を処置する生細胞インプラントを作成することができる。
本発明の一つの特徴は、規定培地中において連続継代で培養する前の初期の由来細胞より少ない分化を特徴とする、哺乳動物の膵島(pancreatic islet)、典型的には、成体膵島細胞由来の内分泌始原/前駆細胞の細胞組成物である。
本発明のもう一つの特徴は、哺乳動物膵島由来の細胞を培養して、培養物の初期細胞より少なく分化している内分泌始原/前駆細胞を生じる方法である。
実施例1:死体のヒト膵臓からの膵臓小細胞の単離:
ヒト膵島単離を、Ricordi(Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, et al. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes 1988 37:413-420)によって最初に提案された半自動法によって行った。入手した膵臓を、Liberase HI(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)または Serva Collagenase(Cresent Chemical, Brooklyn, NY)の管内注入によって広げ(Linetsky E, Bottno R, Ehmann R, et al. Improved human islet isolation using a new eyzyme blend, Liberase. Diabetes 1997 46:1120-1123)、そして次に、自動法(Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, et al. Automated method for isolation of human pancreatic islets. Diabetes 1988 37:413-420)を用いて分離した。この分離は、約12〜30分間続く連続消化工程中に生じ、その後、消化回路を冷却し、そして組織を約8リットルの冷ハンクス液中に集め、洗浄した。遊離した小島を、Cobe 2991細胞分離器中において Euroficoll の連続勾配で非島組織から分離した。
膵島細胞を、ブタドナーから単離し、規定培地を用いてプレーティングして、上皮様表現型を有する培養物を得た。ブタ小島細胞単離手順は、次の通りである。2個の Nalgene 容器、数個の50mL丸底遠心管、トレーおよびスクリーンを、オートクレーブ処理した。2種類の溶液、すなわち、UW−D臓器保存溶液と、27%、24.6%および11%の3種類の濃度のFICOLL溶液を調製した。
次に、実施例1の方法によって得られた小島細胞を、60mm組織培養処理済み培養皿にプレーティングした。この実施例で用いられる培地には、次のものが含まれた。Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)(グルコース不含、カルシウム不含、4mMのL−グルタミン含有)および Hams F−12培地の3:1混合物基剤であって、次の成分を各々指示される最終成分濃度で補給されている基剤。2mMのL−グルタミン(または同等物)、10ng/mlの上皮増殖因子、0.4μg/mlのヒドロコルチゾン、1x10-4Mエタノールアミン、1x10-4M o−ホスホリルエタノールアミン、5μg/mlのインスリン、5μg/mlのトランスフェリン、20pMトリヨードチロニン、6.78ng/mlのセレン、24.4μg/mLのアデニン、266.6μg/mLの塩化ストロンチウム、100mMピルビン酸ナトリウム、10mM非必須アミノ酸、12.5mg/mLのダイズトリプシンインヒビター(SBTI)および5mMグルコース。
増加した細胞手段を特性決定するために、小島幹/始原マーカーpdx1およびネスチン並びに小島ホルモンインスリンの発現を、実施例2に示されるようにRT−PCRによって調べた。0、2、4および8継代によるH297細胞は全て、pdx1発現について陽性であった。そのpdx1発現レベルは、培養期間の間中、比較的一定であるように見える。ネスチンの同様の発現パターンも、これら継代全てによる細胞で検出された。増加した細胞中でのpdx1およびネスチン双方の継続した発現は、培養物中の小島幹/始原細胞の存在の可能性を示唆し、そして細胞ベースの療法のための増加戦略の可能性を示している。期待されるインスリンの発現は、初期継代による細胞から検出されうるにすぎない。4継代では、実際上、インスリンmRNAシグナルを検出することができない。この結果は、4継代による細胞において僅かなインスリン陽性細胞しか認められなかった免疫蛍光法結果(データは示されていない)と一致する。インスリンシグナルの減少は、増加している細胞が、一層増殖性であり且つ一層少なく分化することを示唆している。
Claims (3)
- 哺乳動物膵島細胞に由来する内分泌前駆細胞を含む細胞組成物であって、規定培地中で連続継代後の該細胞が哺乳動物膵島細胞に由来する初期培養細胞より少ない分化を有し、そして該内分泌前駆細胞がマーカーpdx1およびネスチンを発現する、前記細胞組成物。
- 哺乳動物膵島細胞を培養して内分泌前駆細胞を産生する方法であって、
(a)ドナーの膵臓から哺乳動物膵島細胞を単離し;
(b)工程(a)の細胞を規定培地中で連続的に培養して該細胞を増加させ;そして
(c)該細胞を培養し続けて内分泌前駆細胞を産生する
工程を含み、
このとき、該内分泌前駆細胞が工程(a)の細胞より少ない分化を有し、そして該内分泌前駆細胞がマーカーpdx1およびネスチンを発現する、前記方法。 - 糖尿病を有する患者を処置する方法であって、
(a)哺乳動物膵島細胞に由来する細胞を規定培地中で連続的に培養して細胞を増加させ、且つ内分泌前駆細胞を産生し、
このとき、該内分泌前駆細胞が初期培養細胞より少ない分化を有し、そして該内分泌前駆細胞がマーカーpdx1およびネスチンを発現し;そして
(b)糖尿病を有するレシピエント患者へ該内分泌前駆細胞を移植する
ことを含む、前記方法。
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