KR101857724B1 - 탈세포화 각막실질과 콜라겐을 함유하는 세포의 지지체 및 이를 포함하는 인공 각막 시트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈세포화된 각막실질과 콜라겐을 포함하는 인공 각막시트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 환자로부터 얻어진 각막실질, 즉 렌티큘(lenticule)을 탈세포화 하여 얻어진 조직과 콜라겐 겔을 함께 압축시켜 얻어진 인공각막 시트에 관한 것이다.

Description

탈세포화 각막실질과 콜라겐을 함유하는 세포의 지지체 및 이를 포함하는 인공 각막 시트 {Cell scaffold including collagen and decellularized lenticule and artificial cornea sheet}

본 발명은 탈세포화된 각막실질과 콜라겐을 포함하는 각막 유래 세포의 지지체 및 이를 포함하는 각막 이식용 시트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 환자로부터 얻어진 각막실질, 즉 렌티큘(lenticule)을 탈세포화 하여 얻어진 조직과 콜라겐 겔을 함께 압축시켜 얻어진 각막유래 세포의 지지체에 관한 것이다.

인간 각막은 상피, 각막실질 및 내피를 포함하는 3개의 주요 층으로 구성된다. 각막의 두께는 통상 500 내지 600 um이고, 90%가 각막실질이다. 상피는 대략 50 um 두께이고, 세포들 간에 긴밀한 접합을 갖는 5 내지 6개 층의 세포를 함유하고, 특히 처음 2개의 층은 평평한 판 모양의 표면 세포이다. 다음 2 내지 3개의 층은 일렬로 배열된 원주형 기저 세포 상의 날개 모양 또는 다각형의 세포를 함유한다.

상피는 특히 극성 및 이온성 분자에 대해 투과성 장벽을 형성한다. 상피 아래의 다음 장벽은 보우만 막(Bowman's Membrane)이다. 보우만 막은 8 내지 14 um 두께의 균질한 시트이고 상피를 하부 무세포 각막실질(각막고유질)로부터 분리한다.

각막실질은 200 내지 250개의 교번하는 라멜라(층) 유형의 콜라겐 섬유로 구성된다. 각각의 라멜라는 약 1 um 두께이고 10 내지 25 um 너비이다. 각막실질은 물을 70% 함유하고 약 500,000 달톤 초과의 분자의 이동을 방해한다. 프로테오글리칸 및 섬유 결합 콜라겐은 콜라겐 섬유에 연결되어 각막실질 구조의 지름을 조절하고 각막실질 구조를 안정화시킨다. 섬유 결합 프로테오글리칸은 소 류신-풍부 프로테오글리칸(SLRP)이라 불리는 범주를 포함하고, 데코린, 바이글리칸, 케라토칸, 루미칸, 미미칸 및 피브로모듈린을 포함한다. 섬유 결합 콜라겐은 불연속 3중 나선을 갖는 피브릴 결합 콜라겐 분자(FACIT)로서, 유형 VI, 유형 X, 유형 XII 및 유형 XIV 콜라겐을 포함한다.

스티븐슨 존슨 증후군이나 안천포창, 화학 화상 등에 의한 안구 표면 질환은 각막과 결막이 망가지면서 각막상피와 각막의 간세포(윤부)도 손상을 받게 되며, 손상된 안구표면으로 혈관들이 자라게 되고 각막에 혈관화 및 혼탁을 일으켜서 결국 실명에 이르는 치명적인 질환들이다. 이러한 질환들로 인한 시력상실에 대한 치료법으로 과거 10년 동안 동종 각막 이식술(타인의 기증각막을 이용한 이식술), 자가 각막 윤부(각막줄기세포가 있는 부분, 각막의 가장자리)이식술, 양막 이식술, 배양된 각막상피세포 이식술 등이 발전하였으나 여러 가지 한계점으로 인해 현실적으로 불가능한 경우가 많다.

동종 이식의 경우, 각막 이식이 필요한 환자 중 각막 기증을 통해 각막 이식을 받을 수 있는 환자는 약 1% (WHO 보고)에 불과하며, 이식 후 장기적인 면역억제제의 사용으로 여러 부작용이 초래될 수 있다.

자가 각막 윤부 이식술 경우, 손상되지 않은 안구의 자가 윤부를 이식하는 시술로써, 대개의 경우 양쪽 눈을 침범하기 때문에 자가 이식이 힘들고, 만약 자가 이식이 가능하다고 하여도 공여조직이 충분하지 못하고, 손상되지 않은 안구의 간세포에도 손상을 주는 단점을 가지고 있다.

이에 인공각막 개발의 필요성이 제기되었고, 고분자로 이루어진 연질의 부드러운 합성 인공 각막(AlphaCor, 호주)등이 상용화 되었으나 인공 각막으로의 세포의 침윤, 단백질 침착으로 인해 인공각막 투명도 유지의 문제, 각막 하층인 기저층의 손실등과 같은 부작용이 일어나 영구적으로 안구에 이식되지 못하고 제한적인 수명을 가진 것으로 보고 되었다.

근래에 생분해성 고분자 지지체(scaffold)를 이용하여 손상된 생체조직이나 장기를 재생하는 조직공학(tissue engineering)이 활발히 연구되고 있다. 이때에 생분해성 고분자 지지체는 다공성(porous)으로서 내외부에 세포가 부착 성장하면서 지지체가 서서히 분해 소멸된다. 현재 지지체의 화학적 성질/표면 물성과 세포의 부착/성장의 상관 관계, 지지체의 공극(pore) 크기의 효과, 세포의 부착 및 양육 조건 등에 관하여 많은 연구가 진행되고 있다.

일반적으로 합성 고분자는 소수성이므로 세포 부착(또한 세포가 함유된 배양액의 젖음(wetting))이 적다. 반면에 콜라겐, 히알루론산, 키토산 등의 천연 고분자는 친수성이 커서 세포 부착이 많으나 기계적 강도가 약하고 분해 속도 조절이 어렵다.

콜라겐은 동물의 다양한 결합조직을 구성하는 단백질로 조직 내에서 세포의 지지 및 세포와 조직의 기능을 돕는 역할을 수행한다. 특히, 원섬유성 콜라겐은 생체 내에서 콜라겐 섬유를 형성하고 세포 외 기질로써 각막, 피부, 인대, 혈관, 뼈 등 많은 조직에 분포한다. 또한 콜라겐 섬유는 각각의 조직에서 다른 단백질들의 도움과 함께 서로 다른 섬유 구조체를 형상하여 각 조직이 다른 특성을 갖도록 한다.

이러한 원섬유성 콜라겐은 생체 조직으로부터 추출하여 체외에서 사용 가능하다. 생체 조직으로부터 추출된 콜라겐은 산성용액에 용해하여 보관이 가능하며, 일반적으로 쥐, 돼지, 소로부터 이러한 콜라겐을 추출하여 사용한다. 또한, 용해된 콜라겐을 이용하여 다시 원섬유형성 과정을 통해 미시적으로 수십 나노 수준의 섬유가 형성되어, 거시적으로는 콜라겐 겔 형태를 이루게 된다. 이를 재조합 콜라겐 겔(Recombinant collagen gel) 이라 하며 생적합성 및 세포 기능발현에 있어 우수한 재료로써, 조직공학 분야에서 각광을 받고 있다.

더불어 콜라겐 겔 내부에 세포를 포함시키는 것이 가능하기 때문에 인공 조직 및 세포 지지체로서 조직 재생에 효과적인 물질로 여겨지고 있다. 하지만 추출된 콜라겐을 통하여 재조합된 콜라겐 겔의 경우 형성된 나노 섬유가 물리적으로 매우 느슨하게 얽혀있는 구조를 이루고 있으며, 많은 물을 포함하고 있기 때문에 기계적 강도가 낮아 물질을 다루기가 힘들며 원하는 형태나 구조로 만드는데 어려움이 있다.

이러한 단점을 극복하기 위하여, 화학적 가교제를 통해 콜라겐 섬유간 공유결합을 형성하여 기계적 특성을 향상시키는 방법이 이용되고 있으나 가교제의 독성으로 인해 콜라겐 겔 자체의 생체 적합성을 떨어뜨릴 뿐 아니라 세포를 겔 내부에 포함시킬 수 없다는 단점을 갖고 있다.

가교제의 문제점을 해결하고자, 물리적 압축 공정을 이용한 콜라겐 시트를 제조하는 기술이 있으나, 하지만 이렇게 제작된 압축 콜라겐 시트는 본래 생체 내 조직이나 화학적 가교제를 이용한 콜라겐 구조보다는 여전히 낮은 기계적 강도를 갖기 때문에 인공각막 시트로써 각막 재생을 위한 이식 수술 시 봉합에 의해 시트가 손상될 수 있을 뿐 아니라 조직 자체로서의 역할을 충분히 수행하기에는 부족한 실정이다.

따라서, 콜라겐 압축 방식에서 더 나아가 화학적 가교제의 사용 없이 재조합 콜라겐의 기계적 특성을 향상시킬 수 있으며, 각막 유래 세포의 세포 부착 및 증식을 향상시킨 세포의 지지체 및 이를 포함하는 인공각막 시트의 연구개발이 요구되고 있다.

본 발명은 탈세포화된 각막 실질을 압축 콜라겐 시트 내부에 하나의 복합체로 결합시켜 기존 탈세포화 각막 실질 상에서 보다 세포 증식을 향상시킬 뿐 아니라 기존 압축 콜라겐 시트의 낮은 기계적 특성을 향상시킴으로써 각각의 단점을 상호 보완적으로 극복한 각막 유래 세포의 지지체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 화학적 가교제의 사용 없이 재조합 콜라겐의 기계적 특성을 향상시킬 수 있는 각막 유래 세포의 지지체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 기존에 사용되었던 탈세포화 각막실질 상에서 보다 세포의 부착 및 증식을 향상시킨 각막 유래 세포의 지지체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 각막 유래 세포의 지지체에 각막 유래 세포를 배양하여 제조된 각막 이식용 세포 시트 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 화학적 가교제를 사용하지 않고, 기존 콜라겐 겔의 기계적인 특성을 달성하고자, 탈세포화 각막 실질과 콜라겐을 함께 사용하고 압축 공정을 이용한 각막유래 세포의 지지체 시트, 상기 지지체 시트에 부착된 각막 유래 세포를 포함하는 각막 이식용 세포 시트에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명에 따른 세포 지지체 시트는 탈세포화 각막 실질과 상기 각막 실질의 적어도 일부를 둘러싼 콜라겐 겔을 압축하여 제조되며, 구체적으로 상기 압축된 콜라겐의 밀도는 5~30 mg/mL이고, 상기 전체 시트의 두께는 100~600 um이며 콜라겐 겔만의 두께는 50~550 um이다.

본 발명의 일 예는 탈세포화 각막실질과 콜라겐이 복합체 형태로 결합된 각막유래 세포의 지지체에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 일 예는 탈세포화 각막실질과 콜라겐을 포함하는 각막유래 세포의 지지체를 제조하는 방법으로서, 구체적으로 탈세포화 각막실질과 콜라겐이 겔 실린더 형태로 제조하고, 상기 겔 실린더에 압력을 가하여 콜라겐 내부의 물이 제거됨과 동시에 콜라겐 섬유가 물리적으로 얽히게 되어 높은 기계적 강도를 가진 각막유래 세포의 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 일예는 탈세포화 각막실질과 콜라겐 용액을 준비하고, 상기 탈세포화 각막실질과 콜라겐 용액을 몰드에 주입하여 성형체를 제조하고, 상기 성형체에 가압하여 압축 및 탈수공정을 수행하는 단계를 포함하는, 탈세포화 각막실질과 상기 각막실질의 적어도 일부를 둘러싼 콜라겐 겔을 포함하는 압축 세포 지지체 시트를 제조하는 방법에 관한 것이다.

인간 눈의 각막은 대체로 평행한 상대적으로 탄탄한 조직의 층으로 구성된 특화된 구조이다. 각막의 가장 바깥쪽 또는 대부분의 표면층은 상피층이다. 이는 상해시에 재생되는 조직의 보호층이다. 눈 내부로 들어가면 보우만 막(Bowman's membrane)이라 알려진 상피층의 기저(base) 표면이 나온다. 산존하는(scattered) 케라토사이트(keratocyte)가 있는 세포외 콜라겐 구조 기질인 각막의 각막기질(stroma)은 보우만 막에 바로 가까이에 인접해 있다. 각막기질층은 데스메막(Descemet's membrane)이라 불리워지는 표피의 세포막에 의해서, 각막기질의 맨 아래에서 경계지어지고, 각막의 후부(posterior) 표면을 형성하는 특화된 내피세포의 단일세포 두께를 가지는 단일층(monolayer)이 이어진다.

각막 등의 다양한 조직공학에 사용되는 생분해성 다공성 고분자 지지체는 독성이 없고 조직에 대한 생체적합성이 우수하여야 하며, 기계적 강도가 충분하여 세포가 부착 성장하는 동안에 형태를 유지하여야 하는 반면에 분해속도가 적당하여 세포 성장과 더불어 분해되어 없어져야 하는 조건을 만족해야 한다.

탈세포화 각막실질을 이용한 경우, 세포의 구조적 지지체로서 인공각막 시트를 이식할 때 구조를 유지할 수 있으며, 기존의 각막실질이 포함되어 있지 않은 콜라겐만을 이용하여 제작된 콜라겐 시트보다 생분해되지 않고 지속되는 기간이 더 길어 각막이 재생되는 과정에서 더 오랫동안 세포를 지지할 수 있다. 또한 기존의 각막실질만을 이용한 세포 지지체에 비해 세포의 부착 및 증식이 우수하다.

본 발명에 있어서 각막 실질은 탈세포화 처리된 것이 바람직하다. 이에 따라 면역반응을 유도하는 항원으로서 작용할 수 있는 세포를 제거함으로써 동종이식 (allograft) 또는 이종이식 (xenograft)시 면역반응을 최소화하는 효과가 있다. 조직에 따라 세포의 종류와 수, 조직 자체의 물리적 특성이 다르기 때문에 산, 염기, 저장액, 고장액, 세제 등 다양한 화학물질을 이용하여 탈세포화가 이루어진다. 또한 탈세포화 과정만을 거쳐 조직 자체의 구조를 유지한 채로 사용하기도 하지만, 동결건조와 분쇄과정을 거쳐 산성 용액에 녹여 액상으로 사용하거나 이를 다시 중화 과정을 거쳐 겔 형태로 만들어 사용하기도 한다.

인공조직 제작에 있어서, 재료 내에 세포를 포함시킬 경우 세포의 기능 발현 및 조직재생 측면에 있어서 효과적이다. 하지만 화학적 가교제 방법을 통해서는 콜라겐 분자나 콜라겐 나노섬유간의 공유결합을 유도하여 높은 기계적 강도를 갖는 콜라겐 겔을 얻을 수 있으나, 가교제 사용 조건 및 가교제 자체의 독성 때문에 세포가 포함된 콜라겐 겔을 제작할 수 없다는 단점을 갖고 있다. 반면 압축방법을 통해서는 여타 세포의 영향을 줄 수 있는 화학 물질을 사용하지 않고 물리적인 힘만을 이용해 콜라겐 겔의 기계적 특성을 향상시킬 수 있기 때문에 세포를 지지체 내부에 포함시킬 수 있다. 그러나 기존의 압축 방법만을 이용한 경우에는 화학적 가교제만큼의 기계적 특성을 얻을 수 없다는 문제가 있었으며, 탈세포화 각막실질을 포함을 통해서 이러한 문제점을 해결하였다.

상기 압축 공정은 화학적 가교제를 사용하지 않기 때문에, 각막유래 세포를 함유하는 각막 세포 시트를 통해 각막을 포함한 조직 재생에 있어 더욱 큰 효과를 기대할 수 있다.

본원 발명에 따른 탈세포화 각막실질과 콜라겐을 포함하는 세포 지지체는 압축 시트내 콜라겐의 밀도는 5~30 mg/mL 이다. 압축 시트의 탈세포화 각막실질을 둘러싼 콜라겐 자체의 두께는 50~550 um 이고, 상기 세포의 지지체의 두께는 상기 전체 시트의 두께는 100~600 um이다. 상기 세포 지지체 시트의 탈수율은 바람직하게는 70 내지 99 중량% 이다. 시트의 탈수율 계산식은 다음과 같다.

탈수율 = [(압축 전 무게 - 압축 후 무게)/(압축 전 무게)]×100 (중량%)

본 발명의 일예에 따르면, 상기 시트는 탈수된 것이고, 임의로 탈수된 수성 겔은 또한 또 다른 세포 유형, 예를 들면 각막 또는 점막 상피 세포 및/또는 내피 세포를 배양하는 데도 적합하다.

본 발명에 따른 탈세포화 각막실질과 콜라겐을 포함하는 세포의 지지체의 기계적 강도는 0.7 MPa 내지 2.5 MPa 범위, 바람직하게는 2.1 MPa 내지 2.5 MPa이다. 각막과 유사한 기계적 물성을 갖는 탈세포화 각막실질을 압축 콜라겐 내에 포함시킬 경우 기존 압축콜라겐보다 훨씬 향상된 기계적 물성을 복합체 형태로 제공할 수 있다.

본 발명의 지지체는 3차원적으로 조직이 부착 성장할 수 있고 세포 성장 및 새로운 조직 형성에 필요한 영양분과 특정 성장인자들을 전달하는 것이다. 궁극적으로는 세포의 증식, 성장과 더불어 세포외 기질이 분비되어 새로운 조직이 형성되고 고분자 지지체는 서서히 분해되어 완전히 소멸되므로 세포군과 세포외 기질만으로 구성된 새로운 조직 대체물이 완성된다. 따라서, 이러한 생분해성 고분자 지지체는 독성이 없고 조직에 대한 생체적합성(tissue compatibility)이 우수하여야 하며, 기계적 강도가 충분하여 세포가 부착 성장하는 동안에 형태를 유지하나 분해속도가 적당하여 세포 성장과 더불어 분해 소멸되어야 한다.

따라서, 본 발명에 따른 세포의 지지체는 각막-유래 세포의 부착율 및 증식율이 우수하며, 탈세포화 각막실질과 콜라겐을 함께 포함함으로써 생분해속도가 낮아져 기존 콜라겐 단독 시트보다 분해되지 않고 지속되는 기간이 더 길어 각막이 재생되는 과정에서 더 오랫동안 세포를 지지할 수 있다.

콜라겐 겔의 원재료가 되는 콜라겐의 종류는 특별히 한정되지 않으며, I형 콜라겐, III형 콜라겐, IV형 콜라겐 등을 사용할 수 있다. 복수 종의 혼재된 콜라겐을 사용할 수도 있다. 콜라겐은 돼지, 소, 양 등의 동물의 피부, 연골 등의 결합 조직으로부터, 산 가용화법, 알칼리 가용화법, 효소 가용화법 등에 의해 추출 및 정제할 수 있다.

본 발명에 사용된 각막 실질은 사람 유래 조직일 수 있으며, 시력교정수술 특별히 라식수술(laser in-situ keratomileusis, LASIK)로부터 얻어진 조직일 수 있다. 또한 이와 같이 얻어진 조직상에서 면역반응을 유도하는 항원으로서 작용할 수 있는 세포를 제거함으로써 동종이식 (allograft) 또는 이종이식 (xenograft)시 면역반응을 최소화 하기 위해 탈세포화 처리가 필요하다. 이와 같이 얻어진 각막실질의 크기는 6 mm 직경의 두께는 50 um 내지 100 um 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 각막 유래 세포의 지지체에 포함되는 콜라겐과 탈세포화 각막실질의 사용량은 각막실질을 잘 둘러싸서 세포가 부착성을 높일 수 있는 정도면 충분하다. 따라서, 압축을 통하여 얻어진 콜라겐의 밀도는 5~30 중량% 이다. 또한, 상기 전체 시트의 두께는 100~600 um이며 탈세포화 각막실질을 덮고 있는 콜라겐 겔만의 두께는 50~550 um 이다.

본 발명에 따른 콜라겐과 탈세포화 각막 실질을 포함하는 시트상에 각막 유래 세포, 예를 들면 각막 내피세포, 각막 상피세포 및 각막 실질세포로 이루어지는 군에서 선택된 세포를 배양하여 얻어지는 각막-유래 세포를 포함하는 인공 각막 시트를 제공한다.

본 명세서에 있어서 인공 각막 시트란, 각막과 유사한 특징을 가지며, 각막의 대체제로서 이식에 제공되는 세포층 또는 세포층을 포함하는 구조물을 의미하는 용어로서 사용된다. 시트상에, 각막 유래 세포를 접종 및 배양하여 얻어질 수 있으며, 이러한 시트는 한 종류의 각막 유래 세포를 배양하거나, 여러 종류의 세포를 배양하여 인공 각막으로 제조할 수도 있다.

예를 들면, 각막 내피 세포를 포함하는 각막 세포 시트인 경우, 각막 내피세포를 접종 및 배양하여 각막 내피세포가 컨플루언트가 되고 나서 각막 내피세포를 포함한 시트를 배양 용기로부터 박리함으로써 얻어진다.

각막 상피세포는 각막 윤부 조직으로부터 채취할 수 있다. 예를 들면, 각막 윤부 조직으로부터 내피세포를 박리 및 제거하고, 결막을 절제하여 단일 세포 현탁액을 제조한다. 그리고 이것을 질소 탱크에서 보존시키고, 이후 신속하게 37℃에서 융해시켜 각막 상피세포 현탁액을 준비한다. 필요에 따라 이차배양을 실시한다. 이차배양에는, 예를 들면, 무혈청 배지인 EpiLife^TM(Cascade Biologics), CnT-PR(CELLnTEC Advanced Cell Systems AG)나 이들의 배지의 아미노산 조성 등을 변형시킨 배지 등을 사용할 수 있다.

각막 유래 세포는, 예를 들면 세포 밀도가 약 1 x 10⁴ 개/cm² 이상, 바람직하게는 약 1 x 10⁴ 개/cm² - 약 5 x 10⁴ 개/cm², 더욱 바람직하게는 약 2 x 10⁴ 개/cm² - 약 1 x 10⁵ 개/cm²로 시트위에 접종되어 컨플루언트가 되도록 배양된다.

상기 각막 유래 세포는 인체 세포, 예를 들면 1차 인체 세포 또는 세포주로 부터 유래된 세포일 수 있으며, 각막내피세포, 각막상피세포 및 각막실질세포로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

각막 상피 세포를 배양할 때에 이용되는 배지는 당해 세포를 증식시키는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 생체 유래 세포 배양용 배지는 상기 세포를 증식시키는 임의의 것으로, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, CnT-PR(CELLnTEC Advanced Cell Systems AG), EpiLifeTM(Cascade Biologics), 또는 이들의 배지의 아미노산 조성 등을 변경한 배지, 상피세포의 성장에 통상적으로 사용할 수 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 햄 F12 배지(Ham's F12 medium)를 소정 비율로 혼합한 배지 등을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 무혈청성 배지이며, 동시에 이종 동물 세포에서 유래된 단백질을 포함하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다.

특히, 본 발명에서는 무혈청으로 이종 동물 유래의 단백질을 포함하지 않은 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 성장 인자나 항생 물질 등이 첨가된 배지를 사용해도 괜찮다. 단, 혈청을 포함하지 않은 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 배양 방법으로서 무혈청 배양법을 채용하는 것이 바람직하다. 혈청 유래의 성분의 혼입에 의한 면역 거절 등의 문제를 회피할 수 있기 때문이다. 상, 혈청을 포함한 배지안에서 배양해도 되지만, 그 경우에는 동종 유래의 혈청(사람의 각막 상피 세포를 배양할 때에는 인간 유래의 혈청)을 사용하거나, 자가 혈청을 사용하는 것이 바람직하다. 물론, 가능하면, 면역 거절반응의 야기의 우려가 없어지는 자가 혈청을 사용하는 것이 바람직하다.

각막 상피 세포의 양호한 증식 및 중층화를 목적으로 해 배양 스텝의 도중에 배양 조건을 변경할 수도 있다.

본 발명에 따른 이러한 각막 시트는, 각막이 손상, 결손된 환자에 대한 이식 재료(각막 상피의 대체)로서 이용될 수 있다. 이식 시에는, 수술용 봉합사를 이용해 이식편을 주위 조직에 고정하여 생존을 촉진하는 것이 바람직하다. 각막 상피의 이식이 필요한 안구 표면 질환에 적용 가능한 이식용 재료(각막 상피형 시트)를 제공한다.

본 발명의 생체 조직 시트는, 각막 상피 등의 재생(재건)에 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 생체 조직 시트를 생체의 조직 결손부에 직접 이식할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는 콜라겐과 탈세포화 각막 실질을 포함하는 세포 지지체 시트 및 상기 시트와 각막-유래 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인공 각막 시트를 제조하는 방법을 제공한다.

일예에서, 상기 세포 지지체 시트의 제조방법은,

탈세포화 각막실질과 콜라겐 용액을 준비하고,

상기 탈세포화 각막실질과 콜라겐 용액을 몰드에 주입하여 탈세포화 각막실질과 콜라겐 겔을 함유하는 성형체를 제조하고,

상기 성형체에 가압하여 압축 및 탈수공정을 수행하는 단계를 포함하는, 탈세포화 각막실질과 이를 둘러싼 콜라겐 겔을 포함한다.

상기 성형체를 제조하는 공정은 실린더형 몰드를 사용하여, 탈세포화 각막실질과 상기 각막실질을 적어도 일부를 둘러싼 콜라겐 겔을 포함하도록 제조할 수 있다. 예를 들면, 실리더형 몰드에 콜라겐 겔의 일부를 먼저 주입한 후에, 각막실질을 투입하고, 마지막으로 콜라겐 겔을 주입하여 제조된 성형체의 내부에 각막 실질이 위치하도록 성형체를 제조할 수 있다.

본 발명에 다른 압축 시트의 구조는 각막실질의 적어도 일부를 콜라겐 겔이 둘러싼 형태로서, 전체 시트가 모두 같은 층 구성을 가지거나, 다른 층 구조를 갖는 여러 개의 상이한 영역을 포함할 수 있으며, 층구성의 예를 들면, 각막실질과 콜라겐층, 콜라겐-각막실질-콜라겐층, 각막실질 단독층, 또는 콜라겔 단독층 등을 포함할 수 있다.

상기 세포 지지체는 탈세포화 각막실질과 이를 둘러싼 콜라겐 겔의 성형체를 가압하여 압축 및 탈수처리된 것이다. 가압공정은 콜라겐 겔의 밀도가 5~30 mg/mL 또는 탈수율이 70 내지 99 중량%가 되도록 수행할 수 있다.

상기 가압 공정은, 30 gf 내지 2,000 gf의 압력으로 상기 성형체에 압력을 가하여 수행될 수 있다. 가압공정은 압축기를 이용하여 수행할 수 있으며, 압축기는 그 사이에 성형체를 두어 압축할 수 있도록 평행하게 배치되며, 수분을 통과하나 각막실질과 콜라겐 겔 성분은 통과하지 못하는 멤브레인이 부착된 한쌍의 압축판; 및 상기 압축판중 적어도 하나에 부착되며 압력을 가하는 장치를 구비할 수 있다. 압축기의 일예를 도 2 및 도 3에 나타냈다.

상기 제조된 세포 지지체 시트에 각막 유래 세포를 배양하여 인공 각막 시트를 제공할 수 있다. 각막 유래 세포의 종류, 배양된 세포의 밀도, 세포 배양방법 등은 상술한 바와 같다.

본 발명에 따라 탈세포화 각막실질을 압축 콜라겐 시트 내부에 복합체 형태로 결합시킬 경우 탈세포화 각막실질 자체의 높은 기계적 특성에 의해 전체 제작된 인공각막 시트의 기계적인 안정성을 도모할 수 있으며, 또한 기존의 콜라겐과의 결합 없이 사용되었던 탈세포화 각막실질 상에서 보다 세포의 부착 및 증식을 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 각막으로부터 탈세포화 각막실질을 얻어 이를 포함한 겔을 만드는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2은 본 발명의 일실시예에 따라 탈세포화 각막실질을 포함한 콜라겐 겔의 탈수 압축 공정을 통해 탈세포화 각막실질이 포함된 콜라겐 시트를 제작하는 과정과 제작된 시트의 단면에 대한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일예에서 탈세포화 각막실질를 함유하는 콜라겐 겔의 탈수 압축을 위한 장비의 일예를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일예에 따라 제작된 탈세포화 각막실질을 포함한 콜라겐 겔의 탈수 압축 공정을 통해 탈세포화 각막실질이 포함된 콜라겐 시트의 사진이다.
도 5는 본 실시예에 따른 콜라겐 시트에 대한 테플론 막대의 선형운동에 따른 Indentation 힘을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 실시예에 따른 콜라겐 시트에 대한 시간에 따른 시편의 형상변화와 degradation ratio를 나타낸다.
도 7는 탈세포화 각막실질을 포함한 콜라겐 시트상에서 배양된 각막 상피세포를 보여준다. 순서대로 탈세포화 각막실질과 압축 콜라겐 상에서 2일간 배양된 각막 상피 세포의 DAPI 염색 결과와 탈세포화 각막실질을 포함한 압축 콜라겐 상에서 8일간 배양된 각막 상피세포의 Phalloidin 염색결과를 보여준다.
도 8은 세포가 배양된 탈세포화 각막실질을 이용한 동물실험 과정을 나타내며, NaOH를 이용하여 각막상피세포가 회복되지 못하는 동물 모델을 구현하고, 본 발명의 인공 각막시트를 결손부위에 이식한 뒤 그 경과를 관찰한 사진이다.
도 9는 동물의 정상 각막, NaOH를 이용하여 각막상피세포가 회복되지 못한 동물 모델의 Alkali burn 상태의 결손 각막, 상기 동물 모델에 각막실질만을 이식한 사진, 상기 동물 모델에 본 발명에 따른 각막상피세포가 배양된 인공각막 시트를 이식한 각막을 나타내며 본 발명의 인공 각막시트를 이식했을 경우 각막실질(렌티큘)만 이식했을 때 보다 더 투명해진 결과를 살펴볼 수 있다.

본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 예시적인 의미로 제공되는 것일 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

< 실시예 1> 탈세포화 각막실질을 함유하는 콜라겐 시트

1-1: 탈세포화 각막실질의 준비

펨토초 레이저를 이용하여 각막 렌티큘(실질 절편)을 회수하여, 0.25 % Trypsin-EDTA가 녹아있는 저장성 Tris 용액 (10 mM tris)에 2일 동안 37 ℃, 80 rpm의 조건으로 반응시켰다. 상기 처리된 각막실질 절편을 DNase I (500 Unit)/RNase A (1 unit)이 녹아있는 저장성 Tris 용액 (10 mM tris)에 24시간 동안 37 ℃, 80 rpm의 조건으로 반응시킨다. 탈세포화된 실질 절편은 사용 전까지 Optisol™에 넣은 후 4 ℃에 보관한다.

1- 2:콜라겐 용액의 준비

실시예 1-1에서 준비된 탈세포화 각막 실질을 재조합 콜라겐과 결합한 각막 시트를 제작하기 위해서는 일련의 단계가 필요하다.

아세트산 용액 (0.02 N)에 용해되어 있는 3~4 mg/mL의 Rat tail type I 콜라겐(Corning®)을 1 M 수산화 나트륨을 이용해 중화시킴과 동시에 PBS 또는 세포배양배지 를 첨가하여 2.5 ~ 3.5 mg/mL 정도의 농도를 갖는 (예, 3.4 mg/mL의 농도를 갖는 콜라겐 2.6 mL에 1M 수산화 나트륨 0.06 mL 와 세포배양배지 0.3 mL를 첨가하여 최종적으로 3 mg/mL의 농도를 갖는) 중화 콜라겐 용액(Neutralized collagen solution)을 제조하였다.

1-3: 탈세포화 각말실질을 포함한 콜라겐 실린더 겔 제조

탈세포화 각막실질을 포함한 콜라겐 겔의 성형체를 제조하기 위하여, 10 mm 직경을 갖는 실린더 형태의 몰드에 상기 중화 콜라겐 용액을 채워 용액 내부에 실시예 1-2에서 얻어진 탈세포화 각막실질을 위치시키고 (예, 최종적으로 탈세포화 각막실질을 제외한 나머지 콜라겐의 부피가 300 uL 되도록), 세포 배양기 내에서 30분에서 1시간 정도 37℃를 유지하여 탈세포화 각막실질을 포함한 콜라겐 겔의 성형체를 제조하였다. 결과적으로 10 mm 직경, 4 mm 의 높이를 갖는 실린더 형상의 콜라겐 겔의 성형체를 제조하였다.

1-4: 탈세포화 각말실질을 포함한 콜라겐 시트의 제조

상기 제작된 겔 성형체의 경우 기공탄성(Poroelastic) 특성을 갖고 있으며 콜라겐 섬유 구조체 사이사이에 수분이 채워져 있는 두 개의 상으로 이루어진 물질로서, 기계적 강도가 낮은 무른 상태이기 때문에 적절한 압력 하에서 탈수/압축을 진행하여야 한다. 따라서 겔의 압축을 진행과정에서 지속적으로 겔이 받는 힘을 피드백 받아 균일한 힘을 가할 수 있는 저압 탈수/압축 장비를 통해 압축을 진행하였다.

본 실시예에 따른 가압에 의한 압축 및 탈수 과정을 나타내는 모식도를 도 2에 도시하고, 압축장비의 일예를 도 3에 나타냈다.

구체적으로, 스텝모터를 통해 최소 2 um 의 스텝으로 작동하는 선형 스테이지의 움직임을 PID control 방식을 통해 움직임을 제어함으로써 상기 제작된 겔에 힘을 가하게 된다. 겔의 경우 상판과 하판 사이에 콜라겐으로부터 수분만을 투과시키기 위한 나일론 멤브레인, 수분을 흡수하기 위한 용지와 함께 위치하게 되며, 겔에 가해지는 힘은 로드셀을 통하여 지속적으로 피드백을 받아 PID 제어를 위한 결과값으로 이용함으로써 보다 정밀한 압축이 이루어지도록 하였다. 상판과 하판의 경우 하판의 하단에 위치한 goniometer를 이용하여 평행을 이루도록 하였다. 이와 같은 압축장비를 통해 100 gf의 힘을 가해 겔의 탈수화와 함께 탈세포화 각막실질을 재조합 콜라겐으로 감싼 형태의 압축 시트로서 두께 약 200 um 및 10~15 mm 정도의 직경을 갖는 시트를 제작하였다. 이렇게 제작된 시트에서 각막실질을 중심으로 필요한 크기의 직경을 갖도록 원형칼을 이용하여 잘라내었다. 이후 실험에서는 예, 시트 내부에 포함된 각막실질의 크기는 6 mm이고, 전체 시트 직경은 8 mm를 갖는 시트이다. 상기 얻어진 세포 지지체 시트의 사진을 도 4에 나타냈다.

1-5: 콜라겐 시트의 물성평가

실시예 1-4에서 제작된 시트의 기계적 특성을 파악하기 위하여 Spherical indentation test를 실시하였다.

실시예 1-4에서 제작된 시트를 Poly(methyl methacrylate) 지그로 고정한 뒤 반구 형상의 끝 단을 갖는 테플론 막대를 이용해 60 um/s의 속도로 indentation 힘을 가하였다. 테플론 막대의 선형 운동에 따라 시트에 가해지는 힘은 막대와 연결된 로드셀 및 인디케이터를 통해 제작된 시트의 파단이 일어나는 시점까지 측정하였다. 상기 제조된 압축 후 시트가 파단 될 때의 힘은 약 4.6 N이며 콜라겐 만을 이용한 시트의 파단 힘이 약 0.5 N임을 감안할 때, 약 9배 이상 증가했음을 확인할 수 있으며, 같은 힘에 대해서 각각의 변형을 고려하였을 때 기계적 강도 또한 크게 향상되었음을 확인할 수 있다. 본 실시예에 따른 테플론 막대의 선형운동에 따른 Indentation 힘을 도 5에 도시하였다.

제작된 시트의 Degradation 경향을 살펴보기 위해 collagenase를 이용한 in vitro enzymatic degradation test를 수행하였다. 제작된 시트를 collagenase 용액 (20 U/ml in PBS)에 넣고 36℃를 유지시키며 시간 별로 그 형상을 관찰하였다. 그 결과 렌티큘과 결합된 시트의 경우 3시간 이후에도 형상을 잘 유지하는 반면, 콜라겐만을 이용했을 경우 2시간 이내에 degradation에 의해 형상이 사라지는 것을 확인할 수 있다. 또한 각 시간대별로 degradation된 용액을 채취하여 hydroxyproline assay를 이용해 용액 상의 hydroxyproline 양을 정량화하고 시편이 완전히 다 degradation 됐을 때의 양 대비 각 시간 대별 양을 비교하여 degradation 비율을 정량화 하였다. 그 결과 앞선 관찰 결과와 동일하게 콜라겐만을 이용한 시편보다 렌티큘을 포함한 압축 콜라겐이 collagenase에 의한 degradation에 대해 더 오래 형상을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 본 실시예에 따른 시간에 따른 시편의 형상변화와 degradation ratio을 도 6에 도시하였다.

제작된 시트 두께의 경우 시트 단면의 이미지 분석을 통해 측정하였다. 제작된 시트는 단면도를 이용하여 잘라 슬라이드글라스 끝 단에 단면이 위치하도록 하였다. 시트의 단면은 측면의 렌즈를 통해 형상의 측정이 가능한 접촉각 측정기(SmartDrop; FEMTOFAB)을 이용하여 이미지를 얻을 수 있으며, 장비를 통해 측정된 이미지의 단위 픽셀당 길이로부터 시트 단면의 두께를 추정할 수 있다. 상기 제조된 압축 후 시트의 두께는 약 200 um 이다.

< 실시예 2> 각막 상피시트의 제조

2-1: 각막상피 세포의 준비

각막 상피세포는 각막 이식 후 남은 각막 윤부 조직에서 분리 및 배양하였다. 구체적으로, Dispase II (4 mg/ml) 용액에 각막 윤부 조직을 넣은 후 10분간 37℃에서 반응시키고, 각막 윤부 조직을 0.25% trypsin-EDTA 용액에 넣은 후 10분간 37℃에서 반응시켰다. 상기 각막 윤부 조직을 수술용 칼을 이용하여 각막 상피세포를 분리하고, 분리된 각막 상피세포는 CnT-PR 배양액을 이용하여 37℃, 5% CO₂의 조건으로 세포배양기에서 배양하였다.

2-2: 탈세포화 각말실질을 포함한 콜라겐 시트상 세포배양

8 mm 원형칼을 이용하여 실시예 1에서 제조된 시트를 절단하여 원형의 모양으로 준비하였다. 상기 배양된 각막 상피세포는 0.25% 트립신-EDTA 용액을 10분간 37℃에서 처리하여 배양조로부터 분리하여 탈세포화 각막 실질과 콜라겐이 결합된 각막 시트 위에 6 × 10⁵ 개의 세포를 접종하고 8일간 배양을 실시하였다.

기존 탈세포화 각막실질 상에서의 세포 배양을 통해 비교를 진행하였다.

2-3: 세포배양 결과 확인

2-2에서 얻어진 배양된 세포는 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) 염색과 Phalloidin (F-actin) 염색을 진행하였으며 형광 현미경을 통해 부착 및 증식을 확인하였다.

구체적으로, Phalloidin (F-actin) 염색의 경우, DAPI 염색과 동일하게 4% paraformaldehyde를 이용한 세포고정 및 PBS 수세를 진행하였으며 0.1% Triton X-100 의 PBS 수용액을 이용해 5분간 처리 후 33 nM 의 Alexa Fluor® 488 Phalloidin (life technology)을 30분간 처리하여 염색을 진행하였다. Phalloidin 염색 이후 추가적으로 PBS를 이용해 3회 수세한 이후에 Prolong gold (life technology)로 포매하였다. 염색된 세포는 Nikon Eclipse 801 현미경을 이용해 DAPI의 경우 DAPI 필터(435~485 nm), Phalloidin의 경우 FITC 필터를 이용하여 이미지를 측정하여 그 결과를 도 7에 나타냈다.

도 7는 탈세포화 각막실질을 포함한 콜라겐 시트상에서 배양된 각막 상피세포를 나타내며, 대조군으로서 탈세포화 각막실질만 사용하여 2일간 배양된 각막 상피 세포의 DAPI 염색한 결과이고, 실시예 1의 콜라겐 시트상에서 2일간 배양된 각막 상피 세포의 DAPI 염색 결과이고, 실시예 1의 콜라겐 시트상에서 8일간 배양된 각막 상피세포의 Phalloidin 염색결과를 보여준다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 배양 2일차에서의 세포 부착 및 증식을 DAPI 염색을 통해 살펴 본 결과, 실시예 1의 압축 콜라겐 시트 상에서의 세포 수가 대조군인 탈세포화 각막실질만을 사용한 세포 배양보다 훨씬 더 많다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 탈세포화 각막실질상에서는 세포 부착이 잘 이루어지지 않아 세포의 증식 또한 제한적인 반면에 본 발명에 따라 콜라겐 시트로 둘러싼 각막실질을 포함하는 시트의 경우에는 세포의 부착이 잘 이루어져 phalloidin 염색을 통해 확인한 결과와 같이 세포가 시트전체에 고르게 증식이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 각막 상피시트를 이용한 동물실험

실험동물은 웅성 뉴질랜드 백색 가토 (New Zealand white rabbit)로 생후 6개월, 체중 4 kg 정도의 성숙 가토를 사용하였다. 실험 동물은 전 실험기간 중 동일한 환경에서 자유롭게 표준 사료와 물을 먹게 하였다.

1 N NaOH를 적신 필터 페이퍼를 가토의 각막 윤부에 1분간 처리하여 윤부 결손을 실시하였다. 줄기세포가 존재하는 윤부의 결손은 지속적인 각막 상피의 결손을 초래하였다.

상기 각막 상피가 결손된 가토에, 대조군으로 탈세포화 각막 실질만을 이식, 및 실시예 2의 각막 상피 세포를 배양한 콜라겐 시트를 윤부 결손된 각막에 이식한 후에, 3주간 회복시킨 후 각막 상태를 관찰하였다. 상기 동물 모델의 각막 처리과정을 단계별로 도 8에 나타냈다.

도 8는 세포가 배양된 탈세포화 각막실질을 이용한 동물실험 과정을 나타내며, NaOH를 이용하여 각막상피세포가 회복되지 못하는 동물 모델을 구현하고, 실시예 2의 각막 상피 세포를 배양한 콜라겐 시트를 윤부 결손된 각막에 이식한 후에, 3주간 회복시킨 후 그 경과를 관찰한 사진이다.

각막 상피가 결손된 가토에, 대조군으로 탈세포화 각막 실질만을 이식, 및 실시예 2의 각막 상피 세포를 배양한 콜라겐 시트를 윤부 결손된 각막에 이식한 후에, 3주간 회복시킨 후 각막 상태를 관찰한 사진을 도 7에 나타냈다. 도 7는 가토의 정상 각막, 결손 각막, 세포 및 압축 콜라겐을 포함하지 않는 탈세포화 각막실질만을 이식한 각막, 실시예 2의 각막 상피 세포를 배양한 콜라겐 시트를 이식한 각막을 나타낸다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 탈세포화 각막실질을 포함한 압축 콜라겐 시트가 정상 각막보다는 투명하지 않지만 세포 증식 이후 이식하였을 때 각막 상피 결손(Alkali burn) 상태의 결손각막과 탈세포화 각막실질만을 이식하였을 때보다 각막상피의 재생으로 인해 훨씬 투명해진 것을 살펴볼 수 있다.

또한 동물실험결과 각막상피가 잘 재생이 되었는지 확인하기 위하여, 각막 조직의 조직학적 분석(histological analysis)을 수행하였다.

Claims (11)

1. 탈세포화 각막실질과 상기 각막실질의 적어도 일부를 둘러싼 콜라겐 겔을 포함하는 세포 지지체 시트로서,
   탈세포화 각막실질과 상기 각막실질의 적어도 일부를 둘러싼 콜라겐 겔을 30 gf 내지 2,000 gf의 압력을 가하여 압축 및 탈수처리하여 제조되며,
   5~30 mg/ml의 밀도, 70 내지 99 중량%의 탈수율, 및 0.7 MPa 내지 2.5 MPa의 기계적 강도를 갖는 세포 지지체 시트.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 지지체 시트의 두께는 100~600 um이며 콜라겐 겔만의 두께는 50~550 um인 세포 지지체 시트.
3. 삭제
4. 삭제
5. 탈세포화 각막실질과 콜라겐 겔 용액을 준비하고,
   상기 탈세포화 각막실질과 콜라겐 겔 용액을 몰드에 주입하여 콜라겐 겔 성형체를 제조하고,
   압축기를 사용하여 상기 성형체에 30 gf 내지 2,000 gf의 압력으로 가압하여 압축 및 탈수공정을 수행하는 단계를 포함하며,
   상기 압축기는, 그 사이에 성형체를 두어 압축할 수 있도록 평행하게 배치되며, 수분을 통과하나 각막실질과 콜라겐 겔 성분은 통과하지 못하는 멤브레인이 부착된 한쌍의 압축판; 및 상기 압축판중 적어도 하나에 부착되며 압력을 가하는 장치를 구비한 것인,
   탈세포화 각막실질과 상기 각막실질의 적어도 일부를 둘러싼 콜라겐 겔을 포함하며, 0.7 MPa 내지 2.5 MPa의 기계적 강도를 갖는 세포 지지체 시트를 제조하는 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 5 항에 있어서, 상기 가압공정은 콜라겐 겔의 밀도가 5~30 mg/ml 가 되도록 수행되는 것인 방법.
9. 제 5 항에 있어서, 상기 성형체는 실린더형 몰드를 사용하여 내부에 각막실질을 포함하고 이를 둘러싼 콜라겐 겔을 포함하도록 제조하는 것인 방법.
10. 제1항 또는 제2항에 따른 세포 지지체 시트와
    상기 세포 지지체 시트에 접종하여 배양한 각막 유래 세포를 포함하는 인공 각막 시트.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 각막 유래 세포는 각막내피세포, 각막상피세포 및 각막실질세포로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 인공 각막 시트.

Images