CN111249520A - 一种装载小干扰rna纳米粒的复合水凝胶敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料，所述敷料按照质量百分比包括以下组分：泊洛沙姆407：10～20％；甲基纤维素：2～8％；超支化阳离子多糖衍生物/siRNA复合物：0.01～0.5％；溶剂：71.5～87.99％。所述敷料的制备方法为首先制备甲基纤维素与泊洛沙姆407的混合水凝胶溶液，然后制备超支化阳离子多糖衍生物与MMP‑9 siRNA复合的基因纳米粒溶液，最后将两者混合得到装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。本发明制备的敷料可以在低温下流动以贴合不规则伤口，接着在人体体温下快递形成凝胶，不仅为伤口提供湿润的环境，还可缓释基因纳米粒，通过RNA干扰的作用抑制糖尿病伤口中MMP‑9的异常过量表达，从而有效加快糖尿病足溃疡的愈合速度。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，更具体地，涉及一种装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病足是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，不仅是非创伤性截肢的重要原因，而且与糖尿病患者的死亡密切相关，给患者和社会带来沉重负担。因此，糖尿病足溃疡的治疗研究是目前临床关注的热点问题之一，目前敷料的使用是对糖尿病足溃疡治疗主要方式。
水凝胶具有吸收和保留大量水的三维网状交联结构，能吸收伤口的渗液，同时附着于创面并维持有利于伤口愈合的湿性环境。但是，糖尿病患者的皮肤易损，且伤口难以愈合，其重要的因素是伤口微环境中生物因子的失衡，目前临床应用的水凝胶敷料多为单纯水凝胶基质或添加某些生长因子，仍缺乏针对伤口局部微环境的功能性敷料。同时，水凝胶敷料长期依赖进口，价格非常昂贵。因此，急需研发具有我国自主知识产权、针对糖尿病伤口局部微环境的糖尿病足新型专用系列敷料。
皮肤创面修复依赖于细胞与细胞外基质的相互作用，创面愈合过程与细胞外基质的动态平衡密切相关，在维持细胞外机制合成和降解的动态平衡中，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)发挥了重要作用，尤以基质金属蛋白酶-9(MMP-9)能降解细胞外基质，是参与皮肤组织细胞外基质降解和重构过程的主要基质金属蛋白酶之一。然而，与正常的伤口相比，糖尿病患者伤口微环境中的MMP-9水平异常升高，导致基质过度降解，影响伤口愈合过程中细胞的迁移和上皮的形成，延缓伤口创面的愈合。因此，开发具有抑制伤口局部MMP-9功能的敷料，是促进糖尿病足溃疡愈合的重要方法之一。
前期研究【Li N.,et al.ACS Applied Materials&Interfaces,2017,9,17417-17426】发现在伤口周围局部注射MMP-9siRNA纳米复合物能明显加快糖尿病大鼠的伤口愈合过程，但是，直接涂抹的MMP-9siRNA纳米粒溶液难以长期附着在伤口，同时伤口周围局部皮肤多次注射的MMP-9siRNA纳米粒会出现分布不均匀的情况，且注射这一操作可能对伤口产生二次损伤。因此，单一的MMP-9siRNA纳米粒溶液在治疗糖尿病足溃疡方面依然存在较大的困难。
因此，针对糖尿病伤口局部微环境的病理变化，目前亟待找到一种能有效增强MMP-9siRNA纳米复合物在伤口的保留率，并实现缓释功能，从而更好地发挥其治疗效果的方法，以拓展RNA干扰在治疗糖尿病足方向的应用。
发明内容
本发明旨在获得一种新型的糖尿病足溃疡愈合药物，提供了一种装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料及其制备方法和应用，该敷料可有效增强MMP-9siRNA纳米复合物在伤口的保留率，并实现缓释功能，从而更好地发挥其治疗效果的方法，本发明结合了RNAi技术与水凝胶敷料以优势互补的方式开发多功能敷料，拓展了基因疗法在治疗糖尿病足溃疡领域的应用。
本发明的目的是提供一种装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
本发明的另一目的是提供所述装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料的制备方法。
本发明的再一目的是提供所述装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料在制备治疗糖尿病足溃疡药剂中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料，所述敷料按照质量百分比，包括以下组分：
泊洛沙姆407：10～20％；
甲基纤维素：2～8％；
超支化阳离子多糖衍生物/siRNA纳米粒：0.01～0.5％；
溶剂：71.5～87.99％。
本发明上述装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶溶液可用于治疗糖尿病足，其凝胶基质由甲基纤维素和泊洛沙姆407溶于磷酸盐缓冲溶液后混合均匀形成，具有较强的吸水、保水性能，柔软润湿的特点极大降低了对皮肤组织的刺激性，并且为伤口提供一个湿润的环境。该辅料在低温下流动贴合不规则伤口或者进入伤口窦道，在人体温度下快速形成稳定的凝胶，同时该凝胶基质作为超支化阳离子多糖衍生物/siRNA复合物纳米粒的负载基质，不仅保护超支化阳离子多糖衍生物/siRNA复合物纳米粒被伤口渗液中的蛋白酶降解，而且使超支化阳离子多糖衍生物/siRNA复合物纳米粒持续缓慢地释放出来，超支化阳离子多糖衍生物作为基因载体可以携带siRNA进入细胞发挥RNA干扰作用进而抑制MMP-9的表达，最终降低糖尿病伤口微环境中异常升高的MMP-9水平，促进糖尿病足溃疡的愈合。
优选地，所述超支化阳离子多糖衍生物中的多糖为糖原或支链淀粉。
优选地，所述超支化阳离子多糖衍生物中的阳离子取代基为乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、3-二甲胺基丙胺、N-氨乙基哌嗪、第四代聚酰胺-胺树枝状聚合物中的一种。
更优选地，所述超支化阳离子多糖衍生物中的阳离子取代基为二乙烯三胺或三乙烯四胺。
优选的，所述超支化阳离子多糖衍生物中的阳离子取代基的取代度为0.1～3.0。
优选地，所述siRNA为MMP-9siRNA，为能够抑制MMP-9表达的特异性siRNA。
优选地，所述超支化阳离子多糖衍生物与siRNA的质量比为1～50：1。
最优选地，所述超支化阳离子多糖衍生物与siRNA的质量比为10：1。
优选地，所述溶剂为pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液或水。
更优选地，所述水是RNAase-Free水，配置磷酸盐缓冲溶液的水也是RNAase-Free水，其目的是确保制备过程中siRNA不被RNA酶降解。
本发明还提供了一种装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料的制备方法，首先将甲基纤维素分散在溶剂中，再加入泊洛沙姆407，匀混，得到混合水凝胶溶液；然后制备超支化阳离子多糖衍生物/siRNA复合纳米粒溶液；最后将混合水凝胶溶液和复合纳米粒溶液混匀得到装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
所述复合水凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
S1.将甲基纤维素分散在0～100℃的溶剂中，于50～70℃下溶胀4～10分钟，再在0～15℃静置1～10h，然后加入泊洛沙姆407，于0～15℃静置6～48h后，旋涡震荡1～3min，震荡速率为1000～3000rpm，得到混合水凝胶溶液；
S2.将超支化阳离子多糖衍生物和siRNA溶解在溶剂中，旋涡振荡5～30s，静置10～40min，得到阳离子超支化多糖衍生物/siRNA复合纳米粒溶液；
S3.将步骤S1制备的混合水凝胶溶液和步骤S2制备的复合纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5～30min，振荡速率为500～3000rpm，温度为0～25℃，制备得到装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
优选地，步骤S1和步骤S2所述溶剂的质量比为：2～4：1～3。
更优选地，步骤S1和步骤S2所述溶剂的质量比为：3：2。
具有正电性的超支化阳离子多糖衍生物和负电性的siRNA在不同质量比下通过静电相互作用形成复合物纳米粒，从而得到阳离子超支化多糖衍生物/siRNA复合纳米粒溶液。
最后本发明还提供给了所述复合水凝胶敷料在制备治疗糖尿病足溃疡药剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的复合水凝胶敷料在低温下呈现容易涂抹的粘稠状液体，涂抹伤口后可以流动贴合糖尿病足患者的不规则伤口或者伤口窦道，而后在人体温度下能快速形成稳定的凝胶，能有效增强MMP-9siRNA纳米复合物在伤口的保留率，且使用方便，还能避免对伤口造成二次的机械损伤。
2、本发明提供的复合水凝胶敷料在伤口原位形成凝胶后，直接作用于皮肤伤口组织，实现长时间地缓慢释放具有RNA干扰功能的纳米粒，更好地发挥siRNA纳米粒抑制MMP-9的功能，通过降低伤口微环境中MMP-9的水平，减少细胞外基质的降解，促进细胞的增殖和迁移，改善伤口愈合。
3、本发明提供的复合水凝胶敷料能为伤口提供一个湿润和透气的环境，并吸收过量渗出液，可实现减少换药次数，降低患者不适感或疼痛感，提高患者的依从性促进糖尿病足溃疡的愈合。
4、本发明提供的复合水凝胶敷料制备条件温和，工艺简单，操作方便，有利于实现产业化生产。
附图说明
图1为电镜扫描图；
图2为流变分析温度扫描图；
图3为超支化阳离子糖原衍生物/siRNA复合纳米粒的累计释放率随时间变化的曲线；
图4为第1天、第4天和第7天收集的释放液处理角质形成细胞后的细胞存活率；
图5为第1天、第4天和第7天累计释放出来的超支化阳离子糖原衍生物/siRNA复合纳米粒能转染的细胞百分比；
图6为第1天、第4天和第7天累计释放出来的超支化阳离子糖原衍生物/siRNA复合纳米粒降低角质形成细胞MMP-9mRNA的能力；
图7为涂抹糖尿病大鼠伤口模型后在第1天、第4天和第7天进行活体成像所观察到的伤口周围纳米粒留存情况；
图8为涂抹糖尿病大鼠伤口模型后在第0天、第4天和第7天的伤口愈合情况；
图9为涂抹糖尿病大鼠伤口模型后第7天的伤口愈合率；
图10为涂抹糖尿病大鼠伤口模型后第7天的伤口皮肤组织MMP-9的表达情况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1、装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料的制备
(1)称取420mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入1200mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取8mg含有三乙烯四胺基团的超支化阳离子糖原衍生物(TETA-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的TETA-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以10:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到TETA-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和TETA-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
2、复合水凝胶敷料性质分析及结果
(1)将得到的复合水凝胶敷料进行扫描电镜观察，所得分析结果如图1所示，从图中可以看出制备得到的敷料微观结构呈现三维多孔的凝胶网状结构。
(2)对得到的复合水凝胶敷料的流变学性质进行测定，探究其弹性模量和粘性模量对温度的变化规律，结果如图2所示，从图中可以看出随着温度的升高，其弹性模量(G′)和粘性模量(G″)逐渐增大，弹性模量(G′)和粘性模量(G″)的交点为凝胶化的温度，因此可以看出温度在25℃后，G′大于G″，表明敷料呈现出弹性体，意味着敷料在高于该温度下会快速形成稳定的凝胶。
(3)将得到的复合水凝胶敷料进行释放曲线的分析，了解其释放所负载的纳米粒的效率。结果如图3所示，从图中可以看出复合水凝胶敷料具有缓慢释放纳米粒的效果，并且在7天内可以释放出80％的纳米粒，释放效率较高。
(4)分别收集所得到的复合水凝胶敷料在第1天、第4天和第7天的释放液，处理角质形成细胞24小时后用CCK-8法进行细胞存活率的检测，与未经任何处理的角质形成细胞进行比较，进而了解复合水凝胶敷料的生物安全性。结果如图4所示，从图中可以看出第1天、第4天和第7天的释放液处理后，角质形成细胞的存活率和阴性对照组没有差异，揭示该复合水凝胶敷料没有细胞毒性，安全性较高。
(5)分别收集所得到的复合水凝胶敷料在第1天、第4天和第7天的释放液，处理角质形成细胞4个小时后进行流式细胞术的检测，并与未经任何处理的角质形成细胞进行比较，了解释放纳米粒进入细胞的情况，了解其转染效率。结果如图5所示，从图中可以看出第1天、第4天和第7天的释放液的转染效率均高达95％以上，提示该复合水凝胶敷料所释放的纳米粒能够高效地进入细胞。
(6)分别收集所得到的复合水凝胶敷料在第1天、第4天和第7天的释放液，处理角质形成细胞4个小时后，换成新鲜培养基处理20小时，然后进行q-RT-PCR检测MMP-9mRNA情况，并与未经任何处理的角质形成细胞进行比较。结果如图6所示，从图中可以看出第1天、第4天和第7天的释放液均能有效抑制细胞中MMP-9mRNA的水平，抑制效率达到50％左右。
(7)用所得到的复合水凝胶敷料涂抹糖尿病大鼠伤口，分别在第1天、第4天和第7天进行活体成像观察伤口周围的荧光情况，并与空白对照组和纳米粒溶液组进行比较，了解纳米粒在伤口的留存时间。结果如图7所示，从图中可以看出空白对照组未见荧光；纳米粒溶液处理的伤口只能在第1天观察到较微弱的荧光；而复合水凝胶敷料处理的伤口在第1天呈现强荧光，荧光强度随时间增加而减少，但是第7天依然有微弱的荧光存在；提示复合水凝胶敷料的缓释作用使纳米粒对伤口皮肤组织的作用时间高达7天。
(8)用所得到的复合水凝胶敷料涂抹糖尿病大鼠伤口，相机记录第0天、第4天和第7天的伤口情况，分别与空白对照组、不负载纳米粒的单纯水凝胶敷料组和纳米粒溶液组比较。结果如图8所示，从图中可以看出与空白对照组相比，复合水凝胶敷料、单纯水凝胶敷料和纳米粒溶液均能明显促进伤口的愈合。其中复合水凝胶敷料促进伤口愈合的能力明显强于单纯水凝胶敷料和纳米粒溶液，提示复合水凝胶敷料敷料结合了siRNA疗法和水凝胶两者的优势。
(9)分别统计空白对照组、不负载纳米粒的单纯水凝胶敷料、纳米粒溶液和复合水凝胶敷料涂抹糖尿病大鼠伤口后第7天的伤口愈合率。结果如图9所示，从图中可以看出空白对照组的伤口愈合率为45％，单纯水凝胶敷料组和纳米粒溶液组的伤口愈合率为60％，复合水凝胶敷料的伤口愈合率为76％。
(10)留取空白对照组、不负载纳米粒的单纯水凝胶敷料、纳米粒溶液和复合水凝胶敷料涂抹糖尿病大鼠伤口后第7天的皮肤组织，用Western Blot检测MMP-9蛋白的表达情况。结果如图10所示，相比空白对照组，纳米粒溶液组和复合水凝胶敷料组的MMP-9明显下降；同时，复合水凝胶敷料组的MMP-9水平明显低于纳米粒溶液组。提示复合水凝胶敷料通过缓释纳米粒能明显抑制糖尿病皮肤MMP-9的表达。
实施例2
(1)称取420mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于50℃的水浴锅中溶胀10分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入1670mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取8mg含有三乙烯四胺基团的超支化阳离子糖原衍生物(TETA-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的TETA-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以10:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到TETA-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和TETA-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例3
(1)称取420mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于70℃的水浴锅中溶胀4分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入2080mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取8mg含有三乙烯四胺基团的超支化阳离子糖原衍生物(TETA-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的TETA-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以10:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到TETA-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和TETA-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例4
(1)称取420mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入1200mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取8mg含有二乙烯三胺基团的超支化阳离子糖原衍生物(DETA-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的DETA-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以10:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到DETA-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和DETA-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例5
(1)称取420mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入1670mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取8mg含有二乙烯三胺基团的超支化阳离子糖原衍生物(DETA-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的DETA-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以10:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到DETA-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和DETA-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例6
(1)称取280mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入2080mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取8mg含有二乙烯三胺基团的超支化阳离子糖原衍生物(DETA-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的DETA-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以10:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到DETA-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和DETA-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例7
(1)称取420mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入1200mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取40mg含有三乙烯四胺基团的超支化阳离子支链淀粉衍生物(TETA-Amyp)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的TETA-Amyp和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以50:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到TETA-Amyp/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和TETA-Amyp/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例8
(1)称取840mg甲基纤维素粉末加入6mL水溶液中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入2080mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取8mg含有三乙烯四胺基团的超支化阳离子糖原衍生物(TETA-Gly)粉末溶解在4mL水溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的TETA-Gly和负电性的siRNA在水溶液中以10:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到TETA-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和TETA-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例9
(1)称取420mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入1200mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取16mg含有二乙烯三胺基团的超支化阳离子糖原衍生物(DETA-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的DETA-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以20:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到DETA-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和DETA-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例10
(1)称取420mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入1200mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取1mg含有3-二甲胺基丙胺基团的超支化阳离子糖原衍生物(DMAPA-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的DMAPA-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以1:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到DMAPA-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和DMAPA-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例11
(1)称取420mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入1200mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取24mg含有乙二胺基团的超支化阳离子糖原衍生物(EDA-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的EDA-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以30:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到EDA-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和EDA-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例12
(1)称取420mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入1200mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取8mg含有N-氨乙基哌嗪基团的超支化阳离子糖原衍生物(AEP-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的AEP-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以10:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到AEP-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和AEP-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
实施例13
(1)称取945mg甲基纤维素粉末加入6mL磷酸盐缓冲溶液(pH值＝7.4)中，并置于60℃的水浴锅中溶胀5分钟，然后于4℃冷却并静置2h，甲基纤维素完全溶解后，继续加入2400mg泊洛沙姆407粉末，于4℃静置12h后，旋涡振荡1分钟，振荡速率为1000rpm，得到混合水凝胶溶液。
(2)称取4mg含有第四代聚酰胺-胺树枝状聚合物基团的超支化阳离子糖原衍生物(PAMAM D4-Gly)粉末溶解在4mL磷酸盐缓冲溶液中，然后继续加入0.8mg的siRNA粉末，旋涡振荡5秒，静置20分钟，正电性的PAMAM D4-Gly和负电性的siRNA在磷酸盐缓冲溶液中以10:1的质量比通过静电相互作用形成纳米复合物，从而得到PAMAM D4-Gly/siRNA纳米粒溶液。
(3)将上述制备的水凝胶溶液和PAMAM D4-Gly/siRNA纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5分钟，振荡速率为1000rpm，温度为4℃，制备得到的复合水凝胶敷料为装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料，其特征在于，所述敷料按照质量百分比，包括以下组分：
泊洛沙姆407：10～20％；
甲基纤维素：2～8％；
超支化阳离子多糖衍生物/siRNA复合物：0.01～0.5％；
溶剂：71.5～87.99％。
2.根据权利要求1所述复合水凝胶敷料，其特征在于，所述超支化阳离子多糖衍生物中的多糖为糖原或支链淀粉。
3.根据权利要求1所述复合水凝胶敷料，其特征在于，所述超支化阳离子多糖衍生物中的阳离子取代基为乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、3-二甲胺基丙胺、N-氨乙基哌嗪、第四代聚酰胺-胺树枝状聚合物中的一种。
4.根据权利要求1所述复合水凝胶敷料，其特征在于，所述siRNA为MMP-9siRNA。
5.根据权利要求1所述复合水凝胶敷料，其特征在于，所述超支化阳离子多糖衍生物与siRNA的质量比为1～50：1。
6.根据权利要求1所述复合水凝胶敷料，其特征在于，所述溶剂为pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液或水。
7.权利要求1～6任一所述复合水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，首先将甲基纤维素分散在溶剂中，再加入泊洛沙姆407，匀混，得到混合水凝胶溶液；然后制备超支化阳离子多糖衍生物/siRNA复合纳米粒溶液；最后将混合水凝胶溶液和复合纳米粒溶液混匀得到装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将甲基纤维素分散在0～100℃的溶剂中，于50～70℃下溶胀4～10分钟，再在0～15℃静置1～10h，然后加入泊洛沙姆407，于0～15℃静置6～48h后，旋涡震荡1～3min，震荡速率为1000～3000rpm，得到混合水凝胶溶液；
S2.将超支化阳离子多糖衍生物和siRNA溶解在溶剂中，旋涡振荡5～30s，静置10～40min，得到阳离子超支化多糖衍生物/siRNA复合纳米粒溶液；
S3.将步骤S1制备的混合水凝胶溶液和步骤S2制备的复合纳米粒溶液充分混合，旋涡振荡5～30min，振荡速率为500～3000rpm，温度为0～25℃，制备得到装载小干扰RNA纳米粒的温度响应型复合水凝胶敷料。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，步骤S1和步骤S2所述溶剂的体积比为：2～4：1～3。
10.权利要求1～6任一所述复合水凝胶敷料或权利要求7～9任一所述方法制备得到的复合水凝胶敷料在制备治疗糖尿病足溃疡药剂中的应用。
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