CN103550830A - 一种海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架及其制备方法。所述制备方法包括：用生理盐水或生理缓冲液分别将海藻酸或其衍生物和透明质酸或其衍生物配成溶液，将上述两种溶液中的任意一种与所需载负的细胞混合后，再与剩下的另外一种溶液混合，室温平衡一段时间后即得海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架。本发明制备的海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架有效延长了海藻酸和透明质酸在体内的降解时间，通过适度的分子交联大大提高了支架的力学性能、组织填充/支撑性能，具有良好的安全性、有效性。本发明提供的海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架的制备方法不涉及有机试剂，反应体系简单温和，临床应用安全性好。

Description

一种海藻酸-透明质酸原位组织工程细胞支架及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种原位组织工程细胞支架及其制备方法。

背景技术

随着组织工程和再生医学的发展，细胞移植或细胞治疗已逐渐成为临床治疗的研究热点。将自体或异体细胞植入病变组织以替代或部分恢复肌体功能，但对正常细胞或组织无任何副作用，是细胞移植区别于常规治疗方法的优势。已有许多研究对于细胞移植进行了广泛探讨，而且胰岛细胞移植术治疗糖尿病业已在临床取得了很好效果，也有报道认为干细胞移植对于肿瘤、神经疾病等传统医学难以解决的临床难题具有突破性进展。迄今，细胞移植或细胞治疗已经作为最有潜力的临床新技术，探讨用于解决多种临床难题。

业已证实，单纯将细胞移植到所需部位后，细胞在位性不强，易分散到其他部位而大大减少在标靶部位的有效数量，不仅造成了种子细胞的浪费而且减弱了治疗效果，可控性较差。此外，注入机体内的外源性移植细胞由于难以获得良好的微环境，活性大大降低同时死亡率提高，也减弱了细胞治疗的效果。将细胞负载到支架材料上再植入目标部位，则可以提高细胞的在位性并为细胞提供生长支架增加其存活率。将细胞与支架复合物用于细胞移植主要包括两种方法：（1）体外组织工程法，即将细胞在体外接种到支架材料上，生长一段时间后用于体内移植。该方法的缺点是周期较长，而且支架材料多为片状、膜状、海绵状或其他固态立体形态，因此植入手术窗较大，在一定程度上增加了手术创伤。（2）体内原位组织工程法，即将细胞与支架材料直接复合或混合，植入目标部位后，可在体内原位形成细胞-支架复合物，该方法所用的支架材料多为可注射的水凝胶，属于微创手术，创面小，而且可与手术导航系统联用用于介入手术治疗。目前，用于体内原位组织工程支架的材料已有许多研究报道，如透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白胶、壳聚糖、海藻酸、PLGA、羟基磷灰石、硫酸钙等，虽然可显著改善移植细胞的在位性和存活率，但也存在尚需改进的不足，如天然材料的组织支撑性不足和降解过快、高分子材料和无机材料的组织相容性欠佳等。

发明内容

本发明的目的是提供一种可注射型的原位组织工程支架，该支架可用于载负细胞植入特定组织部位进行原位再生修复，尤其适用于软组织的再生修复。

本发明的一个目的是提供一种海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架的制备方法，包括以下步骤：

用生理盐水或生理缓冲液分别将海藻酸或其衍生物和透明质酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明质酸或其衍生物的溶液，将上述两种溶液与所需载负的细胞混合后，室温平衡一段时间后即得海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架。

所述生理盐水或生理缓冲液为无菌无热原的生理盐水或生理缓冲液。

所述所需载负的细胞包括生物体所有组织的细胞；优选软组织细胞；

所述混合的具体过程为：将上述两种溶液中的任意一种与所需载负的细胞，灌装入注射器中；将剩下的另外一种溶液灌装入另外一只注射器中；将上述两种溶液通过三通注射器混合。

所述注射器为无菌注射器。

所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的质量体积百分浓度为0.5－5.0％；优选的，质量体积百分浓度为1.5－5.0％；再优选的，质量体积百分浓度为3.0－5.0％；最优选的，质量体积百分浓度为3.0％、4.0％或5.0％；

所述含透明质酸或其衍生物的溶液中，透明质酸或其衍生物的质量体积百分浓度为0.5－5.0％；优选的，质量体积百分浓度为1.5－3.5％；再优选的，质量体积百分浓度为2－3.5％；最优选的，质量体积百分浓度为3.5％、2.5%或2.0%；

所述质量以克单位计算，所述体积以毫升单位计算。

所述含海藻酸或其衍生物的溶液与所述含透明质酸或其衍生物的溶液的体积比为1：4—4：1；优选的，体积比为1：3—3：1；再优选的，体积比为1：3—2：1；最优选的，体积比为1：3、1:2或2：1。

所述室温平衡的时间为1－50min；优选的，室温平衡的时间为1-20min；再优选的，室温平衡的时间为3-5min；最优选的，室温平衡的时间为3min、4min或5min。

所述室温具体为20℃-25℃。

所述海藻酸或其衍生物重均分子量为5－25万Da；优选的，重均分子量为12－15万Da；最优选的，重均分子量为15KD或12KD；

所述透明质酸或其衍生物重均分子量为100－300万Da；优选的，重均分子量为150－250万Da；最优选的，重均分子量为200万Da。

所述海藻酸或其衍生物的M/G比例为0.65、醛基化度为0.5；所述透明质酸或其衍生物醛基化度为0.5。

所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵、海藻酸钙或氧化醛基化海藻酸钠中的任意一种物质或两种以上物质的任意组合；

所述透明质酸或其衍生物包括透明质酸钠、氧化醛基化透明质酸钠或硫化透明质酸钠中的任意一种物质或两种以上物质的任意组合。

本发明的另一个目的是提供上述任一所述方法制备得到的海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架。

本发明的还一个目的是提供海藻酸或其衍生物，和透明质酸或其衍生物在制备原位组织工程细胞支架中的应用；

海藻酸或其衍生物，和透明质酸或其衍生物作为支架材料在制备原位组织工程中细胞支架中的应用。

所述应用中，所述海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架为一次性使用的无菌产品。

所述应用中，所述海藻酸或其衍生物重均分子量为5－25万Da；优选的，重均分子量为12－15万Da；最优选的，重均分子量为15KD或12KD；

所述应用中，所述透明质酸或其衍生物重均分子量为100－300万Da；优选的，重均分子量为150－250万Da；最优选的，重均分子量为200万Da。

所述应用中，所述海藻酸或其衍生物的M/G比例为0.65、醛基化度为0.5；所述透明质酸或其衍生物醛基化度为0.5。

所述应用中，所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵、海藻酸钙或氧化醛基化海藻酸钠中的任意一种物质或两种以上物质的任意组合；

所述透明质酸或其衍生物包括透明质酸钠、氧化醛基化透明质酸钠或硫化透明质酸中的任意一种物质或两种以上物质的任意组合。

本发明的再一个目的是提供用于制备原位组织工程中细胞支架的材料，包含海藻酸或其衍生物，和透明质酸或其衍生物。

所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的质量体积百分浓度为0.5－5.0％；优选的，质量体积百分浓度为1.5－5.0％；再优选的，质量体积百分浓度为3.0－5.0％；最优选的，质量体积百分浓度为3.0％、4.0％或5.0％；

所述含透明质酸或其衍生物的溶液中，透明质酸或其衍生物的质量体积百分浓度为0.5－5.0％；优选的，质量体积百分浓度为1.5－3.5％；再优选的，质量体积百分浓度为2－3.5％；最优选的，质量体积百分浓度为3.5％、2.5%或2.0%；

所述质量以克单位计算，所述体积以毫升单位计算。

所述溶液的溶剂为生理盐水或生理缓冲液；所述生理盐水或生理缓冲液为无菌无热原的生理盐水或生理缓冲液。

所述材料中，所述海藻酸或其衍生物重均分子量为5－25万Da；优选的，重均分子量为12－15万Da；最优选的，重均分子量为15KD或12KD；

所述材料中，所述透明质酸或其衍生物重均分子量为100－300万Da；优选的，重均分子量为150－250万Da；最优选的，重均分子量为200万Da。

所述材料中，所述海藻酸或其衍生物的M/G比例为0.65、醛基化度为0.5；所述透明质酸或其衍生物醛基化度为0.5。

所述材料中，所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵、海藻酸钙或氧化醛基化海藻酸钠中的任意一种物质或两种以上物质的任意组合；

所述材料中，所述透明质酸或其衍生物包括透明质酸钠、氧化醛基化透明质酸钠或硫化透明质酸中的任意一种物质或两种以上物质的任意组合。

所述材料还包括说明书，所述说明书中记载有如下内容：

使用前，用生理盐水或生理缓冲液分别将海藻酸或其衍生物和透明质酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明质酸或其衍生物的溶液，将上述两种溶液与所需载负的细胞混合后，室温平衡一段时间后即得海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架；

所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的质量体积百分浓度为0.5－5.0％；优选的，质量体积百分浓度为1.5－5.0％；再优选的，质量体积百分浓度为3.0－5.0％；最优选的，质量体积百分浓度为3.0％、4.0％或5.0％；

所述含透明质酸或其衍生物的溶液中，透明质酸或其衍生物的质量体积百分浓度为0.5－5.0％；优选的，质量体积百分浓度为1.5－3.5％；再优选的，质量体积百分浓度为2－3.5％；最优选的，质量体积百分浓度为3.5％、2.5%或2.0%；

所述质量以克单位计算，所述体积以毫升单位计算；

所述生理盐水或生理缓冲液为无菌无热原的生理盐水或生理缓冲液；

所述所需载负的细胞包括生物体所有组织的细胞；优选软组织细胞；再优选软骨组织的细胞；最优选成骨细胞MC3T3-E1或心肌细胞H9C2；

所述混合的具体过程为：将上述两种溶液中的任意一种与所需载负的细胞，灌装入注射器中；将剩下的另外一种溶液灌装入另外一只注射器中；将上述两种溶液通过三通注射器混合；

所述注射器为无菌注射器；

所述含海藻酸或其衍生物的溶液与所述含透明质酸或其衍生物的溶液的体积比为1：4—4：1；优选的，体积比为1：3—3：1；再优选的，体积比为1：3—2：1；最优选的，体积比为1：3、1:2或2：1；

所述室温平衡的时间为1－50min；优选的，室温平衡的时间为1-20min；再优选的，室温平衡的时间为3-5min；最优选的，室温平衡的时间为3min、4min或5min；

所述室温具体为20℃-25℃。

本发明采用海藻酸基生物材料和透明质酸基生物材料制备一种可注射型的原位组织工程细胞支架。海藻酸和透明质酸已作为生物医用材料广泛用于多个临床科室，具有良好的安全性和有效性。本发明制备的支架不仅兼具上述两种材料的良好生物学性能，与多种细胞、组织具有良好相容性，而且通过适度的交联大大提高了支架的力学性能、组织填充/支撑性能，延长了其在体内的降解时间。

将本发明制备的原位组织工程细胞支架注入标靶部位，可原位形成具有良好力学性能和空间结构的凝胶支架，该支架载负细胞到所需部位，原位形成细胞-支架复合物对组织进行再生修复，不仅可实现微创方式的细胞移植，而且可有效改善移植细胞的在位性，维持细胞活性，有效支撑或填充组织，促进组织修复；该支架可载负多种细胞用于不同组织尤其是软组织包括软骨的修复。

本发明提供的一种海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架的制备方法不涉及有机试剂或有机化学反应，反应体系温和，条件可控，仅通过海藻酸和透明质酸衍生化产生的交联基团进行相互作用，避免了交联剂毒性风险，不存在毒性交联剂或助剂等残留问题，大大提高了临床应用的安全性。

本发明提供的一种海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架的制备工艺简单可控，大幅度降低了制备过程中风险管理的难度，工艺重复性好，具有良好的产品转化可行性。

附图说明

图1为实施例1制备的海藻酸－透明质酸原位组织工程支架与成骨细胞MC3T3-E1的相容性实验结果。

图2为实施例1制备的海藻酸－透明质酸原位组织工程支架与心肌细胞H9C2的相容性实验结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的固体液体百分比为质量体积百分比，其中，质量单位以克（g）计，体积单位以毫升（ml）计；下述实施例中的液体与液体的比值为体积比。

下述实施例中的成骨细胞MC3T3-E1和心肌细胞H9C2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

实施例1、一种海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架的制备

采用海藻酸钠和氧化醛基化透明质酸为原料，制备步骤如下：

1）溶液的配制

溶液1的配制：称取海藻酸钠粉末适量，以生理盐水配制成4％（w/v）的溶液；所述的海藻酸钠重均分子量约为15万Da，M/G比例约为0.65。

溶液2的配制：称取氧化醛基化透明质酸粉末适量，以生理盐水配制成3.5％（w/v）的溶液；所述的氧化醛基化透明质酸重均分子量约为200万Da，醛基化度约为0.5。

2）使用前的配制

将所需载负的细胞共10⁶个与0.5ml上述溶液1混合，灌装入无菌注射器中；将上述溶液2灌装入另外一只注射器中。

将上述溶液1和溶液2以体积比2：1比例通过三通注射器混合，室温平衡3min，可形成所需的海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架与待载负的细胞的混合液。

实施例2、一种海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架的制备

采用氧化醛基化海藻酸钠和透明质酸钠为原料，制备步骤如下：

1）溶液的配制

溶液1的配制：称取氧化醛基化海藻酸钠粉末适量，以生理盐水配制成4％（w/v）的溶液；所述的海藻酸钠重均分子量约为15万Da，M/G比例约为0.65，醛基化度约为0.5。

溶液2的配制：称取透明质酸钠粉末适量，以生理盐水配制成3.5％（w/v）的溶液；所述的透明质酸钠重均分子量约为200万Da。

2）使用前的配制

将所需载负的细胞与上述溶液1混合，灌装入无菌注射器中；将上述溶液2灌装入另外一只注射器中。

将上述溶液1和溶液2以体积比1：3比例通过三通注射器混合，室温平衡5min，可形成所需的海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架与待载负的细胞的混合液。

实施例3、一种海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架的制备

采用氧化醛基化海藻酸钠和透明质酸钠为原料（原料的重均分子量与实施例2相同），制备步骤同实施例2，不同的是：

溶液1的浓度为3.0％（w/v）；溶液2的浓度为2.5%（w/v）；

将溶液1和溶液2以体积比1:2比例通过三通注射器混合，室温平衡4min，可形成所需的海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架与待载负的细胞的混合液。

实施例4、一种海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架的制备

采用海藻酸钠和氧化醛基化透明质酸为原料，制备步骤如下：

1）溶液的配制

溶液1的配制：称取海藻酸钠粉末适量，以生理盐水配制成5％（w/v）的溶液；所述的海藻酸钠重均分子量约为12万Da，M/G比例约为0.65。

溶液2的配制：称取氧化醛基化透明质酸粉末适量，以生理盐水配制成2.0％（w/v）的溶液；所述的氧化醛基化透明质酸重均分子量约为200万Da，醛基化度约为0.5。

2）使用前的配制

将所需载负的细胞与上述溶液1混合，灌装入无菌注射器中；将上述溶液2灌装入另外一只注射器中。

将上述溶液1和溶液2以体积比2：1比例通过三通注射器混合，室温平衡5min，可形成所需的海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架与待载负的细胞的混合液。

实施例5、实施例1制备的海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架的细胞相容性和细胞增殖实验

按照实施例1所述的使用前的配制方法，将成骨细胞MC3T3-E1、心肌细胞H9C2分别海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架混合。根据GB/T16886.5-2003规定的标准方法检测细胞增殖率，评价该支架对成骨细胞活性的影响，结果见图1和图2。图1和图2中，实验组使用的细胞支架是按照实施例1所述的使用前的配制方法配制的海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架；对照组采用常规培养液培养。

图1-2结果显示，实验组与对照组相比，OD值不小于对照组的80％，说明实施例1制备的支架与成骨细胞、心肌细胞有良好的相容性，并能在一定程度上促进细胞增殖，证实该支架作为原位组织工程支架具有良好的细胞相容性，无细胞毒性，安全性良好。

Claims (10)

1.一种海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架的制备方法，包括以下步骤：

用生理盐水或生理缓冲液分别将海藻酸或其衍生物和透明质酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明质酸或其衍生物的溶液，将上述两种溶液与所需载负的细胞混合后，室温平衡一段时间后即得海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的质量体积百分浓度为0.5－5.0％；优选的，质量体积百分浓度为1.5－5.0％；再优选的，质量体积百分浓度为3.0－5.0％；最优选的，质量体积百分浓度为3.0％、4.0％或5.0％；

所述含透明质酸或其衍生物的溶液中，透明质酸或其衍生物的质量体积百分浓度为0.5－5.0％；优选的，质量体积百分浓度为1.5－3.5％；再优选的，质量体积百分浓度为2－3.5％；最优选的，质量体积百分浓度为3.5％、2.5%或2.0%。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含海藻酸或其衍生物的溶液与所述含透明质酸或其衍生物的溶液的体积比为1：4—4：1；优选的，体积比为1：3—3：1；再优选的，体积比为1：3—2：1；最优选的，体积比为1：3、1:2或2：1。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：

所述海藻酸或其衍生物重均分子量为5－25万Da；优选的，重均分子量为12－15万Da；最优选的，重均分子量为15KD或12KD；

所述透明质酸或其衍生物重均分子量为100－300万Da；优选的，重均分子量为150－250万Da；最优选的，重均分子量为200万Da。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：

所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵、海藻酸钙或氧化醛基化海藻酸钠中的任意一种物质或两种以上物质的任意组合；

所述透明质酸或其衍生物包括透明质酸钠、氧化醛基化透明质酸钠或硫化透明质酸钠中的任意一种物质或两种以上物质的任意组合。

6.权利要求1-6任一所述方法制备得到的海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架。

7.海藻酸或其衍生物，和透明质酸或其衍生物在制备原位组织工程细胞支架中的应用；

或，海藻酸或其衍生物，和透明质酸或其衍生物作为支架材料在制备原位组织工程中细胞支架中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述海藻酸或其衍生物包括海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸铵、海藻酸钙或氧化醛基化海藻酸钠中的任意一种物质或两种以上物质的任意组合；

所述透明质酸或其衍生物包括透明质酸钠、氧化醛基化透明质酸钠或硫化透明质酸中的任意一种物质或两种以上物质的任意组合。

9.用于制备原位组织工程中细胞支架的材料，包含海藻酸或其衍生物，和透明质酸或其衍生物。

10.根据权利要求9所述的材料，其特征在于：

所述材料还包括说明书，所述说明书中记载有如下内容：

使用前，用生理盐水或生理缓冲液分别将海藻酸或其衍生物和透明质酸或其衍生物配成溶液，得到含海藻酸或其衍生物的溶液和含透明质酸或其衍生物的溶液，将上述两种溶液与所需载负的细胞混合后，室温平衡一段时间后即得海藻酸－透明质酸原位组织工程细胞支架；

所述含海藻酸或其衍生物的溶液中，海藻酸或其衍生物的质量体积百分浓度为0.5－5.0％；优选的，质量体积百分浓度为1.5－5.0％；再优选的，质量体积百分浓度为3.0－5.0％；最优选的，质量体积百分浓度为3.0％、4.0％或5.0％；

所述含透明质酸或其衍生物的溶液中，透明质酸或其衍生物的质量体积百分浓度为0.5－5.0％；优选的，质量体积百分浓度为1.5－3.5％；再优选的，质量体积百分浓度为2－3.5％；最优选的，质量体积百分浓度为3.5％、2.5%或2.0%；

所述生理盐水或生理缓冲液为无菌无热原的生理盐水或生理缓冲液；

所述所需载负的细胞包括生物体所有组织的细胞；优选软组织细胞；再优选软骨组织的细胞；最优选成骨细胞MC3T3-E1或心肌细胞H9C2；

所述混合的具体过程为：将上述两种溶液中的任意一种与所需载负的细胞，灌装入注射器中；将剩下的另外一种溶液灌装入另外一只注射器中；将上述两种溶液通过三通注射器混合；

所述含海藻酸或其衍生物的溶液与所述含透明质酸或其衍生物的溶液的体积比为1：4—4：1；优选的，体积比为1：3—3：1；再优选的，体积比为1：3—2：1；最优选的，体积比为1：3、1:2或2：1；

所述室温平衡的时间为1－50min；优选的，室温平衡的时间为1-20min；再优选的，室温平衡的时间为3-5min；最优选的，室温平衡的时间为3min、4min或5min。

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