KR20200112741A

KR20200112741A - 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 주사형 조성물 및 이의 제조, 동결 및 해동방법

Info

Publication number: KR20200112741A
Application number: KR1020200034515A
Authority: KR
Inventors: 이성구; 김미형
Original assignee: (주)안트로젠
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2020-10-05
Also published as: CN113507921A; EP3943065A1; EP3943065A4; KR102473820B1

Abstract

본 발명은 주사형 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 방법으로 제조된 주사용 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물은 하이드로겔 비드의 스캐폴드 내에 줄기세포가 부착되어 있으므로 주사 후에도 줄기세포가 쉽게 소실되거나 사멸되지 않으므로 줄기세포의 파라크린(paracrine) 효과가 지속적으로 발휘되고 하이드로겔이 분해되면서 줄기세포가 서서히 방출되므로 생착률이 증가된다는 장점이 있으며, 또한 단백분해효소를 처리하지 않고 주사제형으로 제조할 수 있으므로 세포막의 손상없이 건강한 세포를 이용할 수 있고, 아울러 동결 및 해동 후에도 중간엽줄기세포-하이드로겔 비드로부터 동결보관액의 제거가 용이하다는 장점이 있다.

Description

중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 주사형 조성물 및 이의 제조, 동결 및 해동방법{injectable composition comprising mesenchymal stem cells-hydrogel and preparation, freeze and thaw method thereof}

본 발명은 주사형 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물 및 이의 제조, 동결 및 해동 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 줄기세포-하이드로겔을 직경 5 mm 이하의 일정한 형태로 제조함으로써 주사기에 충진이 용이한 제형으로의 개발 및 이를 동결보관이 가능하여 필요시 즉시 해동하여 사용하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 줄기세포를 단독으로 체내에 주사할 경우 주사부위에서 줄기세포가 쉽게 소실되고 생착률이 낮다는 문제점이 있었다. 본 발명의 방법으로 제조된 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물은 하이드로겔 비드의 스캐폴드 내에 줄기세포가 부착되어 있으므로 주사 후에도 줄기세포가 쉽게 소실되거나 사멸되지 않으므로 줄기세포의 파라크린(paracrine) 효과가 지속적으로 발휘되고 하이드로겔이 분해되면서 줄기세포가 서서히 방출되므로 생착률이 증가된다는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 방법으로 제조함으로써 부착성인 중간엽줄기세포를 단백분해효소를 처리하지 않고 주사제형으로 제조할 수 있으므로 세포막의 손상없이 건강한 세포를 이용할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 해동 후에도 중간엽줄기세포-하이드로겔 비드로부터 동결보관액의 제거가 용이하다는 장점이 있다.

종래의 1세대 줄기세포치료제는 트립신 또는 디스파아제 등의 단백질 분해효소를 처리하여 얻은 단리된 세포로 단백질 분해효소를 처리하는 동안 세포막에 노출되어 있는 모든 단백질을 비선택적으로 분해하기 때문에 세포간 결합과 기저막 단백질 등이 거의 유지되지 않는다. 또한, 단백질분해효소를 비활성화시키기 위하여 FBS 등의 동물유래 물질을 첨가하게 되며, 이를 제거하기 위해 수회에 걸쳐 세척-원심분리과정을 수행하게 되는데, 통상적으로 1회 세척-원심분리 과정 동안 5~10% 정도의 세포 손실이 발생한다. 따라서 단백질분해효소를 사용한 세포수집과정은 매우 비효율적인 방법이다.

또한, 단리된 단일세포를 질환부위에 이식하면 확산 및 흡수 등을 통해 타겟 부위에서 유출되기 때문에 정착된 세포의 비율이 낮다. 이외에도 중간엽줄기세포는 부착성이 강한 세포이기 때문에 단일 세포로 분리하였을 때 6~24시간 내에 사멸하게 되며 생착률이 아주 낮다는 결점을 가지고 있다.

WO 2006/004951호에는 생체적합성 스캐폴드 내의 성체 중간엽 줄기세포(MSC)로부터 소정 형태와 규모의 연조직을 de novo 생체 내(in vivo) 합성하는 방법 및 이러한 방법으로 제조된 조성물에 대하여 개시하고 있다. 상기 문헌에는 생체적합성 스캐폴드로 하이드로겔 중합체, 보다 구체적으로 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트를 사용하는 방법이 제시되어 있다. 그러나 상기 조성물은 연조직 결합의 복구를 위한 것으로서 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트가 스캐폴드로 사용되었을 경우 직경의 변화가 거의 없어야 한다는 점을 예정하고 있을 뿐, 배양 후 주사기에 충진하여 바로 투여가 가능하도록 하는 제조과정에 대하여는 개시 또는 암시하고 있지 않다.

한국등록특허 제1,289,834호에는 양수 유래 줄기세포를 함유하는 괄약근 재생 세포치료제가 개시되어 있고, 상기 세포치료제가 하이드로겔 복합체, 구체적으로는 알기네이트/PF-127/히알루론산에 주입되어 그 효과가 증대될 수 있다는 점이 제시되어 있다. 그러나 상기 문헌에는 줄기세포와 하이드로겔을 사용시 섞어서 주사하는 것으로, 하이드로겔 복합체에 주입하여 제조된 형태만이 개시되어 있을 뿐, 하이드로겔 비드내에서 줄기세포를 배양한다는 점에 대해서는 개시하고 있지 않다.

한국등록특허 684,940호에는 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법이 개시되어 있으며, 더욱 구체적으로는 중간엽 줄기세포를 생분해성 고분자인 피브린/HA를 함유하는 혼합지지체에 고정하여 배양하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 상기 문헌에서는 피브린/HA를 지지체로 사용하는 경우 종래 세포분화를 위해 첨가되었던 TGF-beta를 첨가하지 않아도 중간엽 줄기세포가 연골세포로 분화가 촉진될 수 있다는 점이 개시되어 있을 뿐이다.

한국등록특허 제10-1814440호에는 연골세포 및 연골분화능을 갖는 세포를 안정적으로 대량 제조하는 방법에 관한 것이 개시되어 있다. 더욱 구체적으로 세포를 v자 모양 바닥을 갖는 96-웰 플레이트에 분주, 초고밀도 배양, 펠렛을 회수하는 과정을 거쳐 지지체 없는 연골세포 치료제를 균일하게 대량으로 제조하여 연골손상 부위에 이식하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 이는 지지체 없이 연골세포만을 이용하여 구슬형태로 만드는 것이므로 줄기세포를 하이드로겔 비드 지지체에서 배양하는 본 발명과는 구성상의 차이가 있다.

또한, 종래 방법의 경우, 줄기세포치료제를 제조하는 과정에서 단백분해효소 처리를 하게 되므로 세포간 결합과 기저막단백질이 손상될 수 있고, 세포 수집, 세척, 바이알 충전단계 및 바이알에서 다시 주사기에 충진하는 각 단계에서 세포 손실이 발생할 수 있으며, 또한 효소처리 후 단일세포만을 수집하여 주사하게 되므로 세포배양 동안 합성된 콜라겐과 같은 활성물질은 대부분 제거된다는 문제가 있었다.

한편, 이를 해결하기 위해 대한민국 등록특허 제10-1613478호에서는 줄기세포를 포함하는 하이드로겔 매스(hydrogel mass)를 만들고 하이드로겔 매스를 주사기에 충진하는 방법을 개시하고 있으나, 하이드로겔 매스는 주사기에 충진하고 주사하는 과정에서 하이드로겔의 모양이 불규칙해지고 일관된 제형을 갖추지 못하는 단점이 있고, 또한 하이드로겔 스캐폴드내에서 세포의 성장이 가능하면서도 주사기에 충진이 가능한 정도의 단단함(stiffness)을 갖는 하이드로겔의 농도의 제한이 있었다.

한국등록특허 제10-1687291호에는 줄기세포 혹은 일차배양세포를 다공성막 및 하이드로겔을 이용하여 배양하는 방법이 개시되어 있다. 더욱 구체적으로는 다공성막을 세포 배양 용기 내부에 비접촉적으로 위치시키고 그 위에 하이드로겔을 코팅하여 세포를 3차원으로 배양하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 상기 문헌에서는 이 시스템상에서 세포의 증식 및 생장이 증대된다는 것을 명시하고 있을 뿐, 세포를 포함하는 하이드로겔을 비드형태로 만들어 배양하는 것이나 이를 주사기에 충진한 후 투여할 수 있다는 것에 대해서는 개시하고 있지 않다.

이러한 문제점을 해결하고자 최근에는 세포 혹은 줄기세포를 지지체에 넣어 비드 형태로 만드는 방법에 대한 연구가 진행되고 있다(Elizabeth 등, 2012; Christian 등, 2013; Havva 등, 2016; Medi 등, 2017). 비드의 종류는 Alginate bead가 가장 흔하게 사용되고 있다.

한국등록특허 제10-1740298호에는 연골-형성세포를 포함하는 하이드로겔 매트릭스 제조 방법 및 비드로 만드는 방법이 개시되어 있다. 상기 문헌에는 알기네이트 용액과 키토산 용액을 만든 후, 연골-형성 세포와 혼합하여 하이드로겔 매트릭스를 제조하여 비드로 만들어 배양하는 방법이 제시되어 있다. 그러나 이는 줄기세포가 아닌 일반 연골세포를 이용한 연구이며, 바늘의 직경을 조절하여 비드의 평균크기를 조절하기 때문에 비드의 크기를 일정하게 만들 수 없어 연골세포-하이드로겔 복합체내의 세포의 수를 일정하게 만들 수 없다는 한계점을 가지고 있다.

한국등록특허 제10-1585032호에는 중간엽 줄기세포와 하이드로겔 용액을 혼합하여 배양하는 방법 및 주사기에 충진하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 이는 원하는 수의 세포를 주사기에 충진하는 것이 어렵다는 한계점이 있다. 반면에 본 발명은 일정 수의 세포를 하나의 비드에 넣어 배양하는 방법을 사용하여 원하는 세포수만큼 연골손상부위에 투여할 수 있는 장점이 있다.

줄기세포 혹은 세포를 비드형태로 만들어서 체내에 주사하는 것도 중요하지만, 이를 동결하여 장시간 보관이 가능하며, 언제 어디서나 필요한 곳에서 해동하여 쉽게 사용하는 것 또한 치료제 개발에 중요한 요인이 될 수 있다. 따라서 세포손상은 줄이고 세포 생존율을 높이는 동결 및 해동방법에 관한 연구가 진행되고 있다 (Dominique 등 2017).

한국등록특허 10-1321144호와 10-1407355호에는 줄기세포의 동결보존용 조성물에 대한 내용이 개시되어 있다. 그러나 이는 2D 컬쳐한 줄기세포의 동결/해동 시 세포 생존율을 높이기 위한 방법을 제시한 것으로, 하이드로겔-비드 세포 혼합물의 동결 및 해동 방법을 제시하는 본 발명과는 차별점이 있다.

기존의 동결보관하여 사용하는 줄기세포치료제는 해동 후 동결보관액을 제거할 방법이 마땅치 않아 동결보관액과 함께 주사하는 방법으로 사용되고 있다. 이럴 경우 동결보관액 성분인 DMSO가 체내에서 여러 가지 부작용을 유발할 수 있다는 문제점이 있었다. 본 발명에 따른 하이드로겔-비드 세포 혼합물은 약 0.1~5 mm의 크기를 가지므로 물리적으로 간단한 방법으로 동결보관액을 제거할 수 있다는 장점이 있다.

이에, 본 발명에서는 줄기세포-하이드로겔을 직경 5 mm 이하의 일정한 형태로 제조함으로써 주사기에 충진이 용이한 제형을 개발하였고, 동결 및 해동하여 치료제로 사용하는 상기 주사형 제형은 목적에 맞게 하이드로겔의 물성 또는 물리적 강도를 다양하게 조정할 수 있어 다양한 치료목적에 맞게 사용될 수 있음을 새로이 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 줄기세포-하이드로겔을 직경 5 mm 이하의 일정한 형태로 제조함으로써 주사기에 충진이 용이하고, 물리적으로 간단한 방법으로 동결보관액 제거가 가능하며, 장기 동결보관이 가능한 ready-made 제제인 주사형 줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물 및 이의 제조방법 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환의 예방, 치료 또는 개선방법을 제공하기 위한 것이다.

아울러, 본 발명은 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물의 용도를 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 세포 및 하이드로겔을 포함하고,

비드(bead) 형태인

세포-하이드로겔 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

(a) 세포를 배양하는 단계;

(b) 상기 배양된 세포와 하이드로겔 용액을 혼합하여 세포-하이드로겔 비드를 형성하는 단계;

(c) 상기 세포-하이드로겔 비드를 배양하는 단계를 포함하는,

세포-하이드로겔 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 세포-하이드로겔 비드를 동결 및 해동하는 단계를 추가적으로 포함하는 세포-하이드로겔 조성물 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 세포-하이드로겔 비드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환의 예방 또는 개선방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 세포-하이드로겔 비드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환의 치료방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 세포-하이드로겔 비드의 용도를 제공한다.

본 발명의 방법으로 제조된 주사용 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물은 하이드로겔 비드의 스캐폴드 내에 줄기세포가 부착되어 있으므로 주사 후에도 줄기세포가 쉽게 소실되거나 사멸되지 않으므로 줄기세포의 파라크린(paracrine) 효과가 지속적으로 발휘되고 하이드로겔이 분해되면서 줄기세포가 서서히 방출되므로 생착률이 증가된다는 장점이 있으며, 또한 단백분해효소를 처리하지 않고 주사제형으로 제조할 수 있으므로 세포막의 손상없이 건강한 세포를 이용할 수 있고, 아울러 동결 및 해동 후에도 중간엽줄기세포-하이드로겔 비드로부터 동결보관액의 제거가 용이하다는 장점이 있다.

도 1a는 배양한 세포-하이드로겔 비드를 관찰한 사진을 나타낸 도이다.
도 1b는 -80℃에 동결 보관된 세포-하이드로겔 비드를 해동한 후 주사기에 충진하고 17 게이지 니들을 이용하여 분사한 현미경 사진을 나타낸 도이다.
도 2는 세포-하이드로겔 비드 내 세포 특성을 확인한 도이다.
도 3은 세포-하이드로겔 비드 내 캡쳐되어 있는 활성인자를 확인한 도이다.
도 4은 세포-하이드로겔 비드의 파라크린 인자 분비 효과를 확인한 도이다:
y축: 상대값(fold increase).
도 5는 본 발명의 세포-하이드로겔 비드를 마우스에 피하 주사한 후, 7일동안 부피 변화를 측정한 도이다.
도 6은 본 발명의 세포-하이드로겔 비드의 산화적 스트레스로 인한 연골세포 사멸 억제 효과를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 세포-하이드로겔 비드의 염증 억제 효과를 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세포 및 하이드로겔을 포함하고,

비드(bead) 형태인

세포-하이드로겔 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한

세포 및 하이드로겔을 포함하고

비드(bead) 형태인

세포-하이드로겔 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 세포 및 하이드로겔은 직경이 0.1 내지 5 mm 인 것이 바람직하고, 0.5 mm 이상 5 mm 이하인 것이 보다 바람직하고, 1 mm 이상 4 mm 이하인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 세포는 줄기세포, 체세포 및 생식세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 키토산, 셀룰로오스, 펙틴, 2-히드록시에틸 메타아크릴레이트 유도체 및 이의 공중합체, 폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리비닐 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 또는 2종 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 근골격계질환은 관절의 외상, 뼈의 질환, 근육약화, 관절의 신경손상에 따른 근염, 근막통 증후군, 건염, 건초염, 점액낭염, 결절종, 수근관 증후군, 기욘관 증후군, 손목건염, 수완진동 증후군, 방아쇠수지, 결절종, 백지병, 레이노이드 증후군, 외상과염, 내상과염, 요골관 증후군, 척골관 증후군, 주두 점액낭염, 정중신경 포착증, 견관절 충돌증후군, 유착성견관절염, 퇴행성 관절염, 거북목 증후군, 경추 신경병증, 요부 염좌, 추간판 탈출증, 척추분리증, 척추 전방 전위증, 퇴행성 요추질환, 퇴행성 질환, 요실금, 인대 및 힘줄손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 누공성질환은 누공성 크론병일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 염증성질환은 아토피피부염, 전신 홍반성 루프스, 루프스, 동창성 루프스, 결핵성 루프스, 루프스 신염, 이영양성 수포성 표피박리증, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 반응성 관절염, 골관절염, 공피증, 골다공증, 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증질환, 대장염, 궤양성 대장염, 염증성 장질환, 곰팡이감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 당뇨족부궤양, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병, 궤양성 피부질환, 부비동염, 비염, 결막염, 천식, 피부염, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 뇌염, 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 패혈증, 패혈성 쇼크증, 폐섬유증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임병(Lyme disease), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크론씨병, 쇼그랜 증후군, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파키슨병, 다발성경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물은 직경 5 mm 이하의 일정한 비드 형태를 나타내므로, 주사기에 충진이 용이하고, 물리적으로 간단한 방법으로 동결보관액의 제거가 가능하므로, 체내에서 다양한 부작용을 유발할 수 있는 동결보관액 성분인 DMSO를 투여 전 용이하게 제거 가능하다. 구체적으로 상기 물리적으로 간단한 방법의 일예는 동결보관액과 비드 혼합액을 주사기에 담고 주사기 앞단에 약 100 ul pore size를 가진 필터를 장착한 후 용액을 밀어주면 비드는 필터에 걸리고 동결보관액만 제거가 가능하다.

또한, 주사기에 충진한 후, 경피 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 점막하주사, 복강주사 등으로 투여 가능하다.

또한, 본 발명은 하이드로겔의 농도는 특별히 제한되는 것이 없이 사용할 수 있으며, 다양한 치료목적에 따라 조절 가능하며, 바람직하게는 1.8 내지 90 mg/mL의 농도의 피브리노겐을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 세포를 배양하는 단계;

(b) 상기 배양된 세포와 하이드로겔 용액을 혼합하여 세포 하이드로겔 비드를 형성하는 단계;

(c) 상기 세포 하이드로겔 비드를 배양하는 단계를 포함하는,

세포-하이드로겔 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 양태에서, 하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 키토산, 셀룰로오스, 펙틴, 2-히드록시에틸 메타아크릴레이트 유도체 및 이의 공중합체, 폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리비닐 알코올로 이루어진 하이드로겔 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 또는 2종 이상의 복합체를 사용할 수 있고, 보다 구체적으로 보다 구체적으로 피브린 글루를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 피브린 글루는 1.8 내지 90 mg/mL의 농도의 피브리노겐을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 세포 하이드로겔 비드는 0.1 내지 5 mm 인 것이 바람직하고, 0.5 mm 이상 5 mm 이하인 것이 보다 바람직하고, 1 mm 이상 4 mm 이하인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (c) 이후, 세포-하이드로겔 조성물을 주사기에 충진하는 단계 (d)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 세포-하이드로겔 조성물은 10 내지 25 게이지의 니들을 사용하여 바로 국소투여가 가능하다.

한편, 본 발명의 방법은 단계 (c)의 세포 하이드로겔을 배양한 후, 추가적으로 동결 및 해동하는 단계를 포함할 수 있으며, 동결 및 해동 후 동결보관액은 물리적으로 간단한 방법으로 제거할 수 있다.

아울러, 본 발명의 세포-하이드로겔 조성물을 주사용으로 사용할 경우, 목적에 맞게 하이드로겔의 물성 또는 물리적 강도를 다양하게 조정하여 사용할 수 있으므로, 특정 하이드로겔 농도로 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자는 인간 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양한 후, 트롬빈 용액에 첨가한 다음, 디스펜서를 이용하여 배양 용기에 피브리노겐과 세포-트롬빈 용액을 각각 1 ~ 10 uL의 용량으로 점적하여 세포를 포함하는 피브린글루 하이드로겔 비드(이하 세포-하이드로겔 비드)를 제조하였다(도 1 참고).

또한, 본 발명자는 세포-하이드로겔 비드 내 세포수, 생존율 및 세포의 특성을 확인한 결과, 본 발명에 따라 하이드로겔 비드 내에서 배양한 세포는 대표적인 중간엽줄기세포 마커인 CD73, CD90, CD105에 양성반응을 보였으며, 조혈세포 마커인 CD34, CD45에 음성인 면역학적 특성을 유지하는 것을 확인하였다(표 1, 도 2 참조).

또한, 본 발명자들은 세포-하이드로겔 비드 제조 공정에서 세포에서 분비하는 활성인자가 비드내 캡처되어 있는지 활성인자를 확인한 결과, 중간엽줄기세포에서 분비되는 HGF 및 콜라겐 type 2가 유의적으로 캡처되어 있음을 확인하였다(도 3 참조).

아울러, 본 발명자는 세포-하이드로겔 비드의 파라크린 인자 분비 효과를 확인한 결과, 본 발명의 세포-하이드로겔 비드는 인터루킨 1β 로 유발한 염증환경에서 파라크린 인자를 서서히 분비하여 유의적인 치료효과를 나타냄을 확인하였다(도 4 참조).

따라서, 본 발명의 방법으로 제조된 주사용 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물은 하이드로겔 비드의 스캐폴드 내에 줄기세포가 부착되어 있으므로 주사 후에도 줄기세포가 쉽게 소실되거나 사멸되지 않으므로 줄기세포의 파라크린(paracrine) 효과가 지속적으로 발휘되고 하이드로겔이 분해되면서 줄기세포가 서서히 방출되므로 생착률이 증가된다는 장점이 있으며(도 5 참고), 또한 단백분해효소를 처리하지 않고 주사제형으로 제조할 수 있으므로 세포막의 손상없이 건강한 세포를 이용할 수 있고, 아울러 동결 및 해동 후에도 중간엽줄기세포-하이드로겔 비드로부터 동결보관액의 제거가 용이하다는 장점이 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 유효성분으로 함유하는, 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환 예방 및 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에서 용어 “세포치료제”란 사람으로부터 분리, 배양 및 특수 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 특히 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 보다 구체적으로는 지방유래 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "개체"란 본 발명에 따른 세포치료제의 투여를 통해 예방 또는 치료할 수 있는 질환이 이미 발병되었거나, 발병될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.

상기 조성물은 관절의 외상, 뼈의 질환, 근육약화, 관절의 신경손상에 따른 퇴행성 질환, 요실금, 퇴행성 관절염, 인대 및 힘줄손상, 당뇨족부궤양, 하지허혈성궤양, 누공성질환 등 다양한 질환에 적용가능하다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의

세포 및 하이드로겔을 포함하고,

비드(bead) 형태이며,

상기 세포 및 하이드로겔은 직경이 0.1 mm 이상 5 mm 이하인,

세포-하이드로겔 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환의 예방 또는 개선방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의

세포 및 하이드로겔을 포함하고,

비드(bead) 형태이며,

상기 세포 및 하이드로겔은 직경이 0.1 mm 이상 5 mm 이하인,

세포-하이드로겔 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환의 치료방법을 제공한다.

상기 세포-하이드로겔, 근골격계질환, 누공성질환 및 염증성질환은 상기 세포-하이드로겔 조성물에 대한 설명과 동일한 바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용한다.

한편, 본 발명의 방법으로 제조된 주사용 중간엽줄기세포-하이드로겔 조성물은 하이드로겔 비드의 스캐폴드 내에 줄기세포가 부착되어 있으므로 주사 후에도 줄기세포가 쉽게 소실되거나 사멸되지 않으므로 줄기세포의 파라크린(paracrine) 효과가 지속적으로 발휘되고 하이드로겔이 분해되면서 줄기세포가 서서히 방출되므로 생착률이 증가된다는 장점이 있으며, 또한 단백분해효소를 처리하지 않고 주사제형으로 제조할 수 있으므로 세포막의 손상없이 건강한 세포를 이용할 수 있고, 아울러 동결 및 해동 후에도 중간엽줄기세포-하이드로겔 비드로부터 동결보관액의 제거가 용이하다는 장점을 확인하였으므로, 본 발명의 세포-하이드로겔 조성물을 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환 예방, 치료 또는 개선을 위해 유용하게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다.

다만 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이고, 본 발명의 권리범위가 이로 한정되는 것을 의도하지 않는다.

실시예 1. 인간 지방유래 중간엽 줄기세포의 배양 방법

지방 조직은 보통 지방 흡입술로 얻을 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

지방 흡입에 의해 얻어진 지방 조직으로부터 다음과 같이 지방유래 중간엽 줄기세포를 분리하였다: 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 PBS로 3~4 회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20℃, 1500 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 세포배양배지를 넣어 현탁시킨 후, 20℃, 1200 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획으로, 상층액을 제거하였다. 스트로마-혈관 분획을 세포배양배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 세포배양배지, 또는 세포배양배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 또는 표피세포 성장인자(EGF)와 같은 세포성장인자가 포함된 배지를 이용하여 증식시켰다. 지방유래 중간엽 줄기세포가 배양용기의 80~90% 정도로 자라면 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다.

실시예 2. 세포-피브린글루 하이드로겔 비드 제조 및 동결

1) 세포-피브린글루 하이드로겔 비드 제조

상기 실시예 1에서 얻은 지방유래 중간엽줄기세포 1~3 × 10⁵개/mL 에 트롬빈 용액을 첨가하였다. 피브리노겐은 1.8 ~ 90 mg/mL로 준비하였다. 디스펜서를 이용하여 배양 용기에 피브리노겐과 세포-트롬빈 용액을 각각 1 ~ 10 uL의 용량으로 점적하여 세포를 포함하는 피브린글루 하이드로겔 비드(이하 세포-하이드로겔 비드)를 제조하였다.

2) 배양 용기 부착 배양 방법

세포-하이드로겔 비드가 배양용기상에서 완전히 굳으면 그대로 세포배양배지를 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 4~8일 동안 배양하였으며, 반구형 형태를 나타냄을 확인하였다.

3) 부유배양 방법

또한, 상기 2)의 배양 용기 부착 배양 방법 대신, 부유배양 방법을 사용할 수 있으며, 세포-하이드로겔 비드가 완전히 굳으면 배양용기 바닥에서 비드를 떼어낸 후 배양용기에 옮겨 넣었다. 세포배양배지를 첨가하여 비드를 부유시킨 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 4~8일 동안 배양하였다. 한편 부유배양의 경우 대용량 배양이 용이한 장점을 가진다.

4) 세포-하이드로겔 비드의 세척 및 동결

배양액을 제거하고 배양용기로부터 세포-하이드로겔 비드를 수집하였다. 수집된 비드는 10%~20% DMSO가 포함된 인간혈청알부민과 1:1의 비율로 혼합한 후 -80 ℃에 동결 보관하였다.

한편, 동결보관액과 비드 혼합액을 주사기에 담고 주사기 앞단에 약 100 ul pore size를 가진 필터를 장착한 후 용액을 밀어주면 비드는 필터에 걸리고 동결보관액만 물리적으로 간단한 방법으로 제거할 수 있다.

도 1a는 배양한 세포-하이드로겔 비드를 관찰한 사진으로 비드의 직경은 3 ~ 5 mm 이었으며, 비드 내에 세포가 잘 증식하고 피브린글루 하이드로겔과 잘 융화되었음을 확인하였다.

도 1b는 -80℃에 동결 보관된 세포-하이드로겔 비드를 해동한 후 주사기에 충진하고 17 게이지 니들을 이용하여 분사한 현미경 사진이다. 동결, 해동 및 니들을 이용해 주사한 이후에도 비드의 형태 및 크기가 모두 일정하게 유지되고 있음을 확인하였다.

실시예 3. 세포-하이드로겔 비드 내 세포수, 생존율 및 세포의 특성

실시예 2에 따라 배양-세척-동결-해동한 세포-하이드로겔 비드를 현미경으로 관찰한 결과 비드 내 세포가 균질하게 분포하는 것을 확인하였다(도 1). 그런 다음, 실시예 2에 따라 배양-세척-동결-해동한 세포-하이드로겔 비드에 효소를 첨가하여 피브린글루를 녹인 후 세포를 수득하였다. 트리판 블루로 염색하여 세포수 및 세포 생존율을 분석한 결과 비드 당 약 15,000 개의 세포가 포함되어 있고, 세포 생존율은 95% 이상이었다.

상기 수득 세포를 CD73, CD90, CD105 및 CD34, CD45로 염색한 후 유세포분석기로 분석하였다. 그 결과 도 1 에서 보여주는 것과 같이 본 발명에 따라 하이드로겔 비드 내에서 배양한 세포는 대표적인 중간엽줄기세포 마커인 CD73, CD90, CD105에 양성반응을 보였으며, 조혈세포 마커인 CD34, CD45에 음성인 면역학적 특성을 유지하는 것을 확인하였다(표 1 및 도 2).

CD90	97.4
CD73	98.8
CD105	95.4
CD45	1.4
CD34	0.2

실시예 4. 세포-하이드로겔 비드내 활성인자 함유

중간엽줄기세포는 배양하는 동안 다양한 활성인자를 분비하는 것으로 알려져 있다. 이에, 세포-하이드로겔 비드 제조 공정에서 세포에서 분비하는 활성인자가 비드내 캡처되어 있는지 활성인자를 확인하기 위하여 실시예 2에 따라 배양-세척-동결-해동한 세포-하이드로겔 비드에 효소를 첨가하여 피브린글루를 녹인 용출액을 취하여 세포-하이드로겔 비드 내 활성인자를 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 중간엽줄기세포에서 분비되는 대표적인 활성인자인 간세포성장인자(Hepatocyte growth factor; HGF)는 비드당 약 10 pg, 주요연골구성성분인 콜라겐 type 2는 비드당 약 2 pg이 캡처되어 있음을 확인하였다(도 3).

실시예 5. 세포-하이드로겔 비드의 파라크린 인자 분비

중간엽줄기세포는 분비작용(paracrine action)을 통해 항염증 효능, 항세포사멸 효능, 세포증식 촉진효능을 가진 것으로 알려져 있다.

이에, 실시예 2에 따라 배양-세척-동결-해동한 세포-하이드로겔 비드에 DMEM을 첨가한 72시간 동안 배양한 후 배양 상층액을 취한 후 남은 세포-하이드로겔 비드에는 효소를 첨가하여 피브린글루를 녹인 용출액을 취하여 세포-하이드로겔 비드에서 분비되는 인자를 분석하였다.

또한, 병변부위 미세환경 (염증 환경)을 만들어주기 위해 인터루킨 1β (Interleukin 1 beta; IL-1β)를 처리한 후 동일하게 배양 상층액과 용출액을 취하여 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 중간엽줄기세포에서 분비되는 대표적인 염증조절인자로 알려진 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; PGE2)의 경우 정상 환경에서는 분비되지 않았으나 염증환경에서 분비가 촉진되는 것을 확인하였다(도 4).

또한, 중간엽줄기세포에서 분비되는 대표적인 성장인자 중 항염증, 항세포사멸, 세포증식 촉진, 혈관형성 촉진 효과를 나타내는 간세포성장인자 (Hepatocyte growth factor; HGF)와 혈관내피세포성장인자 (Vascular endothelial growth factor; VEGF)는 정상환경과 염증환경에서 모두 유사하게 분비되었으며, 정상환경에서는 미비하게 분비되던 관절연골의 주요구성 단백질인 콜라겐 Type 2는 염증환경에서 분비량이 급격히 증가하는 것을 확인하였다(도 4).

따라서, 본 발명의 세포-하이드로겔 비드는 병변환경 투여 시 파라크라인 인자를 서서히 분비하여 유의적인 치료효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

실시예 6. 동물실험

실시예 2에 따라 배양-세척-동결-해동한 세포-하이드로겔 비드 30개를 마우스의 왼쪽, 오른쪽 두 군데 피하주사한 후, 7일 동안 부피변화를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 피하주사 후에도 줄기세포가 쉽게 소실되거나 사멸되지 않으므로 줄기세포의 파라크린(paracrine) 효과가 지속적으로 발휘되고 하이드로겔이 분해되면서 줄기세포가 서서히 방출되는 것을 확인하였다.

실시예 7. 세포-하이드로겔 비드의 연골세포 사멸 억제능력

대표적인 근골격계질환인 골관절염은 연골세포가 사멸함으로써 더욱 악화되는 것으로 알려져 있다. 이에 실시예 2에 따라 제조한 세포-하이드로겔 비드의 연골세포 사멸 억제능을 확인하였다.

구체적으로, 인간 연골세포를 48-웰플레이트(48-well plate)에 접종하여 부착한 후, 실시예 2에 따라 제조한 세포-하이드로겔 비드 또는 세포가 포함되지 않은 하이드로겔 비드를 첨가한 뒤 24시간 동안 공동배양하였다. 그다음, t-부틸 하이드로퍼옥사이드(T-butyl hydroperoxide, tBOOH)를 100 μM, 200 μM 및 400 μM의 농도로 각각 16시간 동안 처리하여 인간 연골세포의 산화적 사멸을 유도하였다. 이후 수용성 테트라졸륨(water soluble tetrazolium salt, WST-1)을 첨가하고 약 3시간 동안 배양한 뒤 살아있는 세포 수를 측정하기 위하여 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 6 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 세포-하이드로겔 비드가 산화적 스트레스로 인한 연골세포의 사멸을 억제하는 것을 확인하였다(표 2 및 도 6).

	tBOOH 처리
	0 μM 농도	100 μM 농도	200 μM 농도	400 μM 농도
무처치 대조군	1.00	0.42	0.07	0.00
세포-하이드로겔 비드	1.00	1.32	0.72	0.56
하이드로겔 비드	1.00	0.41	0.05	0.01

실시예 8. 세포-하이드로겔 비드의 항염증 대식세포 분화 촉진능력

인간 단핵구 세포에 포볼12-미리스테이트 13-아세트산(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)을 24시간 동안 처리하여 대식세포로 분화를 유도한 후, 실시예 2에 따라 제조한 세포-하이드로겔 비드를 첨가한 뒤 48시간 동안 추가로 배양하였다. 이후 상등액을 수집하여 전염증(pro-inflammatory)의 특성을 가지는 활성화된 M1 대식세포에서 분비되는 TNF-α 및 항염증(anti-inflammatory)의 특성을 가지는 활성화된 M2 대식세포에서 분비되는 IL-10의 양을 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 인간 단핵구 세포에 PMA를 첨가한 경우 분비되는 TNF-α 양이 1.00일 때, 여기에 추가로 세포-하이드로겔 비드를 첨가하면 0.73으로 감소되는 반면에, PMA를 첨가한 경우 분비되는 IL-10의 양이 1.00일 때, 여기에 추가로 세포-하이드로겔 비드를 첨가하면 1.61로 증가하는 것을 확인하여, 세포-하이드로겔 비드가 염증반응을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다(도 7).

Claims

세포 및 하이드로겔을 포함하고,
비드(bead) 형태이며,
상기 세포 및 하이드로겔은 직경이 0.1 mm 이상 5 mm 이하인,
세포-하이드로겔 조성물.
제1항에 있어서,
세포 및 하이드로겔은 직경이 1 mm 이상 4 mm 이하인, 조성물.
제1항에 있어서,
세포는 줄기세포, 체세포 및 생식세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 조성물.
제1항에 있어서,
하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 키토산, 셀룰로오스, 펙틴, 2-히드록시에틸 메타아크릴레이트 유도체 및 이의 공중합체, 폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리비닐 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 또는 2종 이상의 복합체인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는, 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 근골격계질환은 관절의 외상, 뼈의 질환, 근육약화, 관절의 신경손상에 따른 관절의 외상, 뼈의 질환, 근육약화, 관절의 신경손상에 따른 근염, 근막통 증후군, 건염, 건초염, 점액낭염, 결절종, 수근관 증후군, 기욘관 증후군, 손목건염, 수완진동 증후군, 방아쇠수지, 결절종, 백지병, 레이노이드 증후군, 외상과염, 내상과염, 요골관 증후군, 척골관 증후군, 주두 점액낭염, 정중신경 포착증, 견관절 충돌증후군, 유착성견관절염, 퇴행성 관절염, 거북목 증후군, 경추 신경병증, 요부 염좌, 추간판 탈출증, 척추분리증, 척추 전방 전위증, 퇴행성 요추질환, 퇴행성 질환, 요실금, 인대 및 힘줄손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 염증성질환은 아토피피부염, 전신 홍반성 루프스, 루프스, 동창성 루프스, 결핵성 루프스, 루프스 신염, 이영양성 수포성 표피박리증, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 반응성 관절염, 골관절염, 공피증, 골다공증, 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증질환, 대장염, 궤양성 대장염, 염증성 장질환, 곰팡이감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 당뇨족부궤양, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병, 궤양성 피부질환, 부비동염, 비염, 결막염, 천식, 피부염, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 뇌염, 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 패혈증, 패혈성 쇼크증, 폐섬유증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임병(Lyme disease), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크론씨병, 쇼그랜 증후군, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파키슨병, 다발성경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 근골격계질환, 누공성질환 또는 염증성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 주사제.
제8항에 있어서,
상기 주사제는 경피 주사, 피하 주사, 근육내 주사, 점막하주사 및 복강주사로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 투여되는 것을 특징으로 하는 주사제.
(a) 세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 세포와 하이드로겔 용액을 혼합하여 0.1 mm 이상 5 mm 이하인 세포 하이드로겔 비드를 형성하는 단계; 및
(c) 상기 세포 하이드로겔 비드를 배양하는 단계를 포함하는,
세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서,
하이드로겔은 피브린 글루, 히알루론산, 젤라틴, 콜라겐, 알긴산, 키토산, 셀룰로오스, 펙틴, 2-히드록시에틸 메타아크릴레이트 유도체 및 이의 공중합체, 폴리에틸렌 옥사이드 및 폴리비닐 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 또는 2종 이상의 복합체인 것을 특징으로 하는, 세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서,
하이드로겔은 피브린 글루인 것을 특징으로 하는, 세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서,
피브린 글루는 1.8 내지 90 mg/mL의 농도의 피브리노겐을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서,
세포 하이드로겔 비드는 1 mm 이상 내지 4 mm 이하인 것을 특징으로 하는, 세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서,
단계 (C)의 세포 하이드로겔 비드를 배양한 후, 동결 및 해동하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.
제10항에 있어서,
단계 (c) 이후, 세포-하이드로겔 조성물을 주사기에 충진하는 단계 (d)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포-하이드로겔 조성물의 제조방법.