CN102068327B - 一种气管替代物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种气管替代物的制备方法，本发明采用动物源性气管组织的去抗原处理、气管替代物外壁复合血管内皮生长因子和替代物内壁复合表皮细胞生长因子的步骤；其中去抗原处理包括气管外壁软骨层和气管内壁粘膜层下肌肉层的去抗原处理；本发明所制备的气管替代物来源于动物气管组织，具有天然气管特有的C型软骨环结构，由致密结缔组织连接在一起，有弹性能够纵向伸缩，气体通过时可适度扩张；所制备的气管替代物在移植后能够长期保持气管通畅，不会塌陷，替代物与宿主整合效果良好，未发现明显的排斥反应。本发明方法简单、原料来源广泛且低廉，大规模的产业化生产可降低医疗成本、减轻患者的经济负担。
Description
技术领域
本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及天然脱细胞气管替代物的制备方法。
背景技术
气管肿瘤、气管瘢痕等疾病引起的气管狭窄会造成严重的呼吸困难，甚至窒息死亡。这类气管病变有时需要切除一段气管，并行气管再建术。当切除气管的长度超过6cm时，需要气管替代物或异体气管替代原病变气管。常用的气管替代物主要有自体组织来源的气管替代物、异体气管和人工气管。
自体组织和异体气管的来源有限，且异体气管有免疫排斥的风险，而人工气管很难具有正常气管的结构与功能。随着组织工程学的发展，使构建组织工程化气管作为移植材料成为可能。目前对组织工程化气管的研发主要包括：①细胞外基质替代物即细胞支架的研究；②种子细胞的选择、培养和生长；③组织工程化气管的构建。
组织工程气管支架材料的主要作用是提供细胞生长的三维空间，易于细胞附着与生长，为所构建的气管组织提供最初形态。选择合适的支架材料需要考虑：①具有较好的生物降解性；②具有较好的生物相容性；③不诱发机体的免疫排斥反应；④具有弹性，能够与周围组织的位移保持一致。现有的一些高分子合成材料基本能满足上述需求，包括有：聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、及两者的共聚物(PLGA)。但这类材料在体内降解后会造成酸性微环境，引起非菌性炎症反应，阻碍移植物与宿主的融合，最终导致移植失败。正常的气管是由透明软骨、弹性纤维、结缔组织、平滑肌及富含腺体的黏膜组成，人工合成的气管材料很难达到正常气管如此复杂的结构，只是简单模拟气管的管状结构，不能与周围组织建立有效的营养供应。将这样的气管植入缺损位点仍然有塌陷及坏死的风险。
中国专利02145460.4公开了一种组织工程化气管及其制备方法，是利用各种来源血管内皮细胞与组织工程皮肤支架材料构建组织工程化上皮组织，构建的上皮组织中的真皮层具有毛细血管网，将这种上皮组织贴附到人工气管内表面，为移植气管提供血供。其人工气管支架材料与体外构建的真皮层仅仅通过放入的金属支架使两者贴附一起，并未能够有效地融合为一体，移植的气管替代物能否与周围组织建立有效的血供，尚未可知；并且气管组织在气体通过时会发生形变，如果因此内层的真皮层脱落，会造成堵塞气管，有窒息的风险；由于使用的是人工支架材料，其气管替代物不具有正常气管组织的弹性，并不是理想的替代品。
中国专利200710042032.8公开了一种组织工程气管移植物及其构建方法，其制备的气管移植物是由软骨形成细胞和可降解生物材料复合后经体外与体内联合培养构建，是将体外构建的气管移植物在植入气管缺损前先植入患者的组织瓣中，使气管与周围组织建立丰富的血供后再移植入气管缺损位点，这样有利于移植气管的存活。但该方法的构建周期过长(体外构建5～90天，体内构建7～70天)，并且体内构建需要将替代物植入患者的组织瓣下，增加患者痛苦；另外，在整个构建过程中未涉及促进移植物内表面上皮化的步骤，在气管移植物植入气管缺损位点后，仅仅依靠两端吻合气管组织的上皮细胞爬入气管替代物内表面来完成移植物内表面的上皮化，这是一个漫长的过程，在未能形成上皮层之前，气管移植物就有堵塞的风险。
“Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffoldfor tracheal reconstruction”(《Biomaterials》2010年第5月31(13)：3520-6)，介绍了组织工程气管领域最新的研究进展——去细胞的猪气管组织的制备方法及异种间气管重建的短期疗效观察。文章作者也坦承按其介绍的方法处理猪气管组织，其中的软骨细胞并不能去除，可观察到完整的软骨细胞存在于去细胞气管支架的软骨环结构中；随后在修复狗气管缺损的过程中，气管的软骨环结构有明显吸收，随着植入时间的延长，软骨环会进一步吸收降解，不能达到气管重建的效果。可见文章中的猪气管组织去细胞方法并未能有效去除软骨环内的抗原成分，有引起受体免疫排斥的风险，导致软骨环降解，气管重建失败。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种气管替代物的制备方法，具有方法简单、原料来源广泛且低廉的优点；所制备的气管替代物由天然成分组成，具有天然气管特有的软骨环结构和弹性，无明显的排斥反应。
本发明所提出气管替代物的制备方法，包括动物源性气管组织的去抗原处理，气管替代物外壁复合血管内皮生长因子，替代物内壁复合表皮细胞生长因子；其中去抗原处理包括气管外壁软骨层和气管内壁粘膜层下肌肉层的去抗原处理；其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
步骤一、动物气管的去抗原处理按以下步骤依次进行
原料预处理：将7～15cm长的动物气管组织去除表面血污及附带软组织，获得具有软骨环结构的气管组织，用磷酸盐缓冲液(PBS)震荡清洗3次；
脱脂处理：将预处理后的气管组织置入乙醚溶液中，采用超声波震荡处理0.3～1小时，流水冲洗3小时；
内壁去抗原处理：在脱脂后的气管管腔内加入g/L浓度为0.05％～0.3％的胰蛋白酶溶液，将气管组织两端封闭，震荡处理半小时后换入g/L浓度为2％的NaCl溶液震荡清洗半小时，再换入g/L浓度为0.9％的NaCl溶液震荡清洗半小时；由于气管组织外壁与内壁具有完全不同的组织结构和成分，所以对于内外壁的去抗原处理采用不同方法；内壁的粘膜层主要由柱状上皮细胞形成，所以使用胰酶溶液和高渗溶液短时间处理以去除贴附在粘膜固有层上的柱状上皮细胞，短时间处理不会破坏粘膜层下固有层的结构，固有层的保留能够促进上皮细胞长入气管内壁，形成新的柱状上皮构成的粘膜层；
外壁去抗原处理：将经内壁去抗原处理、管腔内注有生理盐水、管口封闭的气管组织放入g/L浓度为0.1％～0.5％的胰酶溶液中，4℃震荡处理24小时后再以流水冲洗最少3小时；由于气管外壁存在C型软骨环结构，软骨组织内的软骨细胞被周围细胞外基质紧密包围，需采用较长时间的胰酶消化处理来达到去细胞的效果；通过组织学检测证明，采用推荐浓度的胰酶处理后，去细胞气管组织软骨环内未见完整软骨细胞残留；
外壁十二烷基磺酸钠(SDS)处理：采用g/L浓度为0.1～2％的SDS溶液震荡处理管口封闭的气管组织外壁3小时后，用PBS溶液震荡清洗10分钟，再以纯水清洗3分钟，PBS与纯水的清洗步骤反复4～8次；本发明人研究发现，采用推荐浓度的SDS溶液处理气管组织外壁的软骨环结构，能够彻底清除软骨环内的残留软骨细胞碎片和游离蛋白，并且不会破坏软骨环的微观多孔三维结构；但SDS会使粘膜层下固有层的层粘连蛋白变性，而层粘连蛋白的活性保持有利于上皮细胞的贴附生长，所以SDS不适合处理气管内壁的粘膜层；由于SDS又是细胞毒性较强的物质，所以后续的清洗需要多次重复，来保证SDS的彻底清除；
气管组织的曲拉通处理：采用曲拉通100(Triton X-100)体积浓度为0.2％～3％的pH7.4的Tris-HCL缓冲液震荡处理气管组织(同时处理内外壁)，再用PBS溶液震荡清洗1小时后，以清水冲洗3小时；由于Triton X-100是比较温和的表面活性剂，可以同时作用于气管组织的内外壁，达到去除残余的免疫原性蛋白的作用；
经低温真空冻干后，得到去抗原的动物气管组织；采用低温真空冻干的方法，可以保持软骨环结构及气管组织内壁的粘膜下固有层结构。
步骤二、气管外壁复合生长因子：将含有浓度为5～50ng/ml的血管内皮细胞生长因子的PBS溶液均匀滴加到去抗原气管的外壁；气管组织外壁的软骨环经过去抗原处理后具有微观多孔结构，能够迅速吸附含有血管内皮细胞生长因子的PBS溶液；其在植入体内后，能够缓释生长因子、较长时间地促进气管组织外植床的血管形成，保证移植气管的存活；
步骤三、气管内壁复合表皮细胞生长因子：将含有表皮细胞生长因子的pH7.4的胶原溶液均匀涂布到气管组织内壁，其中，表皮细胞生长因子的浓度为5～50ng/ml，胶原浓度为2mg/ml；经低温真空冻干后，得到气管替代物。
本发明采用针对气管组织结构特点的去抗原处理方法，保留了天然气管的结构特点；所制备的气管替代物来源于动物气管组织，具有天然气管特有的C型软骨环结构，由致密结缔组织连接在一起，有弹性能够纵向伸缩，气体通过时可适度扩张；替代物外壁利用软骨环的微观多孔结构，复合有血管内皮细胞生长因子，达到缓释生长因子的效果，有利于气管移植后血管网络的形成，保证移植物的营养供应；其内壁具有复合表皮细胞生长因子的粘膜层下固有层，有利于上皮细胞生长形成纤毛上皮结构，实现气管功能的恢复。
本发明制备方法简单、原料来源广泛且低廉，大规模的产业化生产可降低医疗成本、减轻患者的经济负担。通过大量的动物实验证实，所制备的气管替代物在移植后能够长期保持气管通畅，不会塌陷，替代物与宿主整合效果良好，未发现明显的排斥反应。
附图说明
附图1为采用本发明方法所制备的气管替代物的大体照片，图中可见天然气管组织特有的软骨环结构；附图2为本发明方法所制备的气管替代物与细胞复合后用于体内移植前的大体照片，可以看见复合细胞后组织呈现良好的纵向伸缩性及扩张性。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。
实施例1、
步骤一、动物气管的去抗原处理
原料预处理：截取山羊气管组织10cm，去除表面血污及附带软组织，获得具有软骨环结构的气管组织；用PBS溶液震荡清洗3次；(气管组织外壁包绕的结缔组织须去除彻底，其会影响移植气管与周围组织建立血供)。
脱脂处理：将预处理后的气管组织放入乙醚溶液中，采用超声波震荡处理30分钟，以流水冲洗3小时；(乙醚具有脱脂作用，采用超声波处理可以加快游离脂滴的溶解)。
内壁去抗原处理：将脱脂后的气管组织两端封闭，封闭前在气管管腔内加入g/L浓度为0.2％的胰蛋白酶溶液，震荡处理半小时后换入g/L浓度2％的NaCl溶液震荡清洗半小时，再换入g/L浓度0.9％的NaCl溶液震荡清洗半小时；
外壁去抗原处理：将经内壁去抗原处理、管腔内注有生理盐水、管口封闭的气管组织放入0.25％(m/v)的胰酶溶液中，于4℃震荡处理24小时后再以流水冲洗5小时。
外壁十二烷基磺酸钠(SDS)处理：使用g/L浓度为0.5％的SDS溶液震荡处理管口封闭的气管组织外壁3小时，再使用PBS溶液震荡清洗10分钟，以纯水清洗3分钟，PBS溶液和纯水清洗的步骤反复6次；
气管组织的Triton处理：采用Triton X-100体积浓度为0.5％的pH7.4的Tris-HCL缓冲液震荡处理气管组织(内外壁同时处理)，再用PBS溶液震荡清洗1小时后，以清水冲洗3小时；经低温真空冻干后，获得去抗原的动物气管组织，备用；
步骤二、气管外壁复合生长因子：将含有浓度为30ng/ml的血管内皮细胞生长因子的PBS溶液均匀滴加到去抗原气管组织的外壁；
步骤三、气管内壁复合表皮细胞生长因子：将含有表皮细胞生长因子的pH7.4的胶原溶液均匀涂布到气管组织内壁，其中，胶原浓度为2mg/ml，表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml；经低温真空冻干后，得到气管替代物。
本实例制备的气管替代物再于其外壁复合自体软骨细胞、内壁复合气管上皮细胞后，能够用于气管肿瘤切除后，病变气管的替代。替代物具有正常气管的生理结构，内壁复合的上皮生长因子有利于内壁绒毛上皮生长，绒毛上皮能够清洁吸入体内的气体，促进病变气管的功能恢复。
实施例2、
步骤一、动物气管的去抗原处理
原料预处理：截取猪气管组织7cm，去除表面血污及附带软组织，获得具有软骨环结构的动物气管组织，用PBS溶液震荡清洗3次；
脱脂处理：将预处理后的气管组织放入乙醚溶液中，采用超声波震荡处理1小时，流水冲洗3小时；
内壁去抗原处理：将脱脂后的气管组织两端封闭，封闭前在气管管腔内加入g/L浓度为0.1％的胰蛋白酶溶液，震荡处理半小时后换入g/L浓度2％的NaCl溶液震荡清洗半小时，再换入g/L浓度0.9％的NaCl溶液震荡清洗半小时；
外壁去抗原处理：将经内壁去抗原处理、管腔内注有生理盐水、管口封闭的气管组织放入g/L浓度为0.4％的胰酶溶液中，4℃震荡处理24小时后用流水冲洗3小时；
外壁十二烷基磺酸钠(SDS)处理：使用浓度为1％(m/v)的SDS溶液震荡处理管口封闭的气管组织外壁3小时，再使用PBS溶液震荡清洗10分钟，以纯水清洗3分钟，PBS溶液和纯水清洗的步骤反复5次；
气管组织的Triton处理：采用Triton X-100体积浓度为1％的pH7.4的Tris-HCL缓冲液震荡处理气管组织(内外壁同时处理)，再用PBS溶液震荡清洗1小时后，以清水冲洗3小时；经低温真空冻干后，获得去抗原的动物气管组织，备用；
步骤二、气管外壁复合生长因子：将含有浓度为20ng/ml的血管内皮细胞生长因子的PBS溶液均匀滴加到去抗原气管组织的外壁；
步骤三、气管内壁复合表皮细胞生长因子：将含有表皮细胞生长因子的pH7.4的胶原溶液均匀涂布到气管组织内壁，其中，胶原浓度为2mg/ml，表皮细胞生长因子的浓度为50ng/ml；经低温真空冻干后，得到气管替代物。
将本实例制备的气管替代物与自体细胞复合后能够用于气管瘢痕切除后病变气管的替代。替代物具有正常气管的软骨环结构，弹性好，能在体内长期保持通畅，不会塌陷；并且外壁复合的血管内皮生长因子有利于移植气管与周围组织建立血液供应，提高替代物移植后的存活率。
Claims (1)
1.一种气管替代物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、动物气管的去抗原处理按以下步骤依次进行
原料预处理：将7～15cm长的动物气管组织去除表面血污及附带软组织，获得具有软骨环结构的气管组织，用磷酸盐缓冲液震荡清洗3次；
脱脂处理：将预处理后的气管组织置入乙醚溶液中，采用超声波震荡处理0.3～1小时，流水冲洗3小时；
内壁去抗原处理：在脱脂后的气管管腔内加入g/L浓度为0.05％～0.3％的胰蛋白酶溶液，将气管组织两端封闭，震荡处理半小时后换入g/L浓度为2％的NaCl溶液震荡清洗半小时，再换入g/L浓度为0.9％的NaCl溶液震荡清洗半小时；
外壁去抗原处理：将经内壁去抗原处理、管腔内注有生理盐水、管口封闭的气管组织放入g/L浓度为0.1％～0.5％的胰酶溶液中，4℃震荡处理24小时后再以流水冲洗最少3小时；
外壁十二烷基磺酸钠处理：采用g/L浓度为0.1～2％的十二烷基磺酸钠溶液震荡处理管口封闭的气管组织外壁3小时后，用磷酸盐缓冲液震荡清洗10分钟，再以纯水清洗3分钟，磷酸盐缓冲液与纯水清洗的步骤反复4～8次；
气管组织的曲拉通处理：采用曲拉通100体积浓度为0.2％～3％的pH7.4的Tris-HCL缓冲液震荡处理气管组织，再用磷酸盐缓冲液震荡清洗1小时后，以清水冲洗3小时；再经低温真空冻干后，得到去抗原的动物气管组织；
步骤二、气管外壁复合生长因子：将含有浓度为5～50ng/ml的血管内皮细胞生长因子的磷酸盐缓冲液均匀滴加到去抗原气管的外壁；
步骤三、气管内壁复合表皮细胞生长因子：将含有表皮细胞生长因子的pH7.4的胶原溶液均匀涂布到气管组织内壁，其中，表皮细胞生长因子的浓度为5～50ng/ml，胶原浓度为2mg/ml；再经低温真空冻干后，得到气管替代物。
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