CN111714700B - 透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片的制备方法及其应用 - Google Patents

透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及内膜增生技术领域，具体涉及一种透明质酸‑肝素黏附的去细胞大隐静脉补片的制备方法及其应用。一种透明质酸‑肝素黏附的大隐静脉补片的制备方法，包括以下步骤：（1）将体内的大隐静脉取出后置于4℃的肝素盐水中，采用1%SDS去细胞处理后；对去细胞后的大隐静脉先采用透明质酸表面粘附，再用肝素表面黏附，制得透明质酸‑肝素黏附的去细胞大隐静脉补片；（2）将上述透明质酸‑肝素黏附的去细胞大隐静脉补片植入体内。本发明将透明质酸‑肝素黏附于去细胞大隐静脉后，使得大隐静脉表面变得平滑；透明质酸‑肝素黏附的去细胞人大隐静脉补片在体外有较强的抗血栓作用；在体内，在静脉和动脉补片成型后，能够显著减少内膜增生厚度。

Description

透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及血管内膜增生技术领域，具体涉及一种透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片的制备方法及其应用。
背景技术
血管内膜增生及其由此所造成的官腔狭窄是高血压和血管成形术后再狭窄等心血管疾病共同的生理特征，与血管重塑密切相关，最终将影响靶器官的功能。血管内膜增生发病机制十分复杂，目前认为可能与内皮功能障碍与损伤、血小板聚集与血栓形成、血管平滑肌细胞向内膜迁移、增殖及合成大量细胞外基质等多种因素有关。血管内膜增生长期折磨着患者，也给家庭和社会带来了沉重的负担。
血管内膜增生及其由此所造成的官腔狭窄及其阻塞，一直是困扰血管外科的一大难题，在血管外科中的植入物的材料取得了长足发展，植入物失败是一个长期没有得到解决的问题。血管移植在心血管疾病、肿瘤、创伤、器官移植再造和显微外科等领域得到广泛的应用，常用的移植替代血管包括自体血管（自体动脉和自体静脉）、同种异体管道和人工合成材料管道。自体血管和同种异体管道是较为理想的替代血管，但是来源有限。自体静脉血管供应相对多一些，但是其血管弹性较差，易于形成血栓和动脉瘤。而且部分患者合并有静脉曲张和动脉粥样硬化，也影响了自体血管的应用。
随着表面修饰和去细胞技术的发展，植入物的成功率和有效率也取得了进步。去细胞化技术是组织工程支架材料研究的一门新技术，该技术将细胞破坏为碎片并将该碎片白细胞外基质上移除，而细胞外基质成分被保留。去细胞化的目标是移除所有的细胞及细胞核，同时将对保留细胞外基质的组成成分的生化结构、生物学活性及机械完整性的影响降低到最低限度。常用获得去细胞的方法主要包括物理、化学、酶学的方法。物理方法主要包括快速冻融、搅拌、超声波；化学方法主要为运用酸性、碱性溶液、去污剂（曲拉通x-100，十二烷基磺酸钠，熊去氧胆酸）等化学溶剂及利用高渗与低渗溶液；酶学的方法常利用胰蛋白酶与核酸内切酶、核酸外切酶。细胞外基质由于其在细胞的生长、繁殖、迁移、分化、发育等生物学行为方面起到重要作用而受到生物学家的重视，同时由于细胞外基质成分在不同的物种之间具有高度保守性，所以去细胞化技术得到的细胞外基质支架具有良好的生物相容性及低免疫原性。由于具有以上优点，细胞外基质成分在组织工程的支架制备中成为常用的材料。去细胞化技术在心血管、输尿管、膀胱等细胞外基质含量丰富的组织器官的组织工程的研究中已经得到应用，并在实验与临床研究中证明其具有良好的生物相容性，低免疫原性。但是该研究对于肝脏、肾脏等细胞含量丰富的器官的研究较少。
在静脉干预中，急性血栓形成和管腔堵塞在24-72小时发生率约45%-100%。迄今为止还没有有效的方法来有效预防。ePTFE和Dacron 血管带来了改变，但去细胞的人血管（组织工程学血管）在人体应用依旧较少，去细胞血管保存了细胞外基质，结构性能，机械性，并且减少了抗原性。在2012年进行的一个应用去细胞人髂静脉肝外门静脉血栓置换手术，依旧是唯一一例手术。
因此，需要提供一种减少膜增生厚度的有效方法。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一是提供一种透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片的制备方法。
本发明的目的之二是提供一种透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片在减少内膜增生厚度上的应用。
本发明的目的之三是提供一种透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片在抗血栓中的应用。
为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片的制备方法，包括以下步骤：
（1）组织材料预处理，将体内的大隐静脉取出后置于4℃的肝素盐水中，采用1%SDS去细胞处理后；在37℃下，对去细胞后的大隐静脉先采用pH=7的2mg/mL透明质酸进行表面粘附15min，再用pH=7的2mg/mL肝素进行表面黏附15min，制得透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片；
（2）植入体内，将上述透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片采用电镜改变分析后，确定透明质酸-肝素成功黏附后，将上述透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片植入体内。
一种透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片在内膜增生中的应用。
优选地，透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片用于减少血管内膜增生的厚度。
一种透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片在抗血栓中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将透明质酸-肝素黏附于去细胞大隐静脉后，使得大隐静脉表面变得平滑，水接触角较小；透明质酸-肝素黏附的去细胞人大隐静脉补片在体外有较强的抗血栓作用；在体内，在静脉和动脉补片成型后，能够显著减少内膜增生厚度。
附图说明
图1为试验例中，腹主动脉补片修补术14天后，未黏附透明质酸-肝素的大隐静脉补片的电镜图；
图2为试验例中，腹主动脉补片修补术14天后，黏附透明质酸-肝素的大隐静脉补片的电镜图；
图3为试验例中，下腔动脉补片修补术14天后，未黏附透明质酸-肝素的大隐静脉补片的电镜图；
图4为试验例中，下腔动脉补片修补术14天后，黏附透明质酸-肝素的大隐静脉补片的电镜图；
图5为试验例中，在植入前，未黏附透明质酸-肝素的大隐静脉补片形成血栓的电镜图；
图6为试验例中，在植入前，黏附透明质酸-肝素的大隐静脉补片不形成血栓的电镜图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例
一种透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片的制备方法，包括以下步骤：
（1）组织材料预处理，将体内的大隐静脉取出后置于4℃的肝素盐水中，采用1%SDS去细胞处理后，在温度为37℃的条件下，对去细胞处理后的大隐静脉先采用pH=7的2mg/mL透明质酸进行表面粘附15min，再用pH=7的2mg/mL肝素进行表面黏附15min，制得透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片；
（2）植入体内，将上述透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片采用电镜、水接触角改变分析后，确定透明质酸-肝素成功黏附后，将上述透明质酸-肝素黏附的去细胞化大隐静脉补片植入体内。
试验例
1 试验对象
分别选取大鼠腹主动脉试验组、大鼠腹主动脉对照组、大鼠下腔静脉试验组和大鼠下腔静脉对照组，每组6个。
2 试验方法
（1）试验组试验步骤
① 将大鼠腹主动脉试验组大鼠体内的腹主动脉和大鼠下腔静脉试验组大鼠体内的下腔静脉取出后置于4℃的肝素盐水中，采用1% SDS进行去细胞处理；
② 在37℃的条件下，对去细胞处理后的上述大鼠腹主动脉试验组的腹主动脉和大鼠下腔静脉试验组的下腔静脉分别先采用pH=7的2mg/mL透明质酸进行表面粘附15min，再用pH=7的2mg/mL肝素进行表面黏附15min，分别制得透明质酸-肝素黏附的去细胞腹主动脉补片和透明质酸-肝素黏附的去细胞下腔静脉补片；
③ 上述透明质酸-肝素黏附的去细胞腹主动脉补片和透明质酸-肝素黏附的去细胞下腔静脉补片分别采用电镜观察，观察到表面有一层新的透明质酸涂层后，确定透明质酸-肝素成功黏附；
④ 将上述透明质酸-肝素黏附的去细胞腹主动脉补片和透明质酸-肝素黏附的去细胞下腔静脉补片分别植入体内，不给与任何肝素、抗生素、抗血小板药物，14后取出。
（2）对照组试验步骤
① 将大鼠腹主动脉对照组大鼠体内的腹主动脉和大鼠下腔静脉对照组大鼠体内的下腔静脉取出后置于4℃的肝素盐水中，采用1% SDS去细胞处理；
② 将上述对照组未黏附透明质酸-肝素黏附的腹主动脉和对照组未黏附透明质酸-肝素黏附的下腔静脉补片分别植入体内，不给与任何肝素、抗生素、抗血小板药物，给予常规食物和水，14后取出。
3 电镜结果与分析
如图1所示，腹主动脉补片修补术14天后，未黏附透明质酸-肝素的大隐静脉补片的内膜较厚；如图3所示，下腔动脉补片修补术14天后，未黏附透明质酸-肝素的大隐静脉补片内膜较厚；如图2所示，腹主动脉补片修补术14天后，黏附透明质酸-肝素的大隐静脉补片内膜较薄；如图4所示，下腔动脉补片修补术14天后，黏附透明质酸-肝素的大隐静脉补片内膜较薄。由图1和图3对比以及图2和图4对比可知，将透明质酸-肝素黏附于去细胞大隐静脉后，使得大隐静脉表面变得平滑，在体内，透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片能够显著减少内膜增生厚度。
如图5所示，在植入前，未黏附肝素的人大隐静脉补片吸附血液形成血栓；如图6所示，在植入前，黏附肝素的人大隐静脉补片不形成血栓，透明质酸-肝素黏附的去细胞人大隐静脉补片在体外有较强的抗血栓作用。
90%的人工合成的血管植入物和16-30%的大隐静脉植入物大多在植入后1-3年狭窄。人工血管在大口径的静脉中应用广泛，但在小口径血管中的应用极易血栓形成。这项专利为小口径的去细胞人的大隐静脉应用提供了一个比较好的临床应用前景。
本发明将透明质酸-肝素黏附于去细胞大隐静脉后，使得大隐静脉表面变得平滑，水接触角较小；透明质酸-肝素黏附的去细胞人大隐静脉补片在体外有较强的抗血栓作用；在体内，在静脉和动脉补片成型后，能够显著减少内膜增生厚度。
最后说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
组织材料预处理，将体内的大隐静脉取出后置于4℃的肝素盐水中，采用1% SDS去细胞处理后；在37℃下，对去细胞后的大隐静脉先采用pH=7的2mg/mL透明质酸进行表面粘附15min，再用pH=7的2mg/mL肝素进行表面黏附15min，制得透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片；
植入体内，将上述透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片采用电镜改变分析后，确定透明质酸-肝素成功黏附后，将上述透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片植入体内。
2.一种如权利要求1所述的透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片在内膜增生中的应用。
3.根据权利要求2所述的透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片在内膜增生中的应用，其特征在于，所述透明质酸-肝素黏附的去细胞大隐静脉补片用于减少血管内膜增生的厚度。
4.一种如权利要求1所述的透明质酸-肝素黏附的大隐静脉补片在抗血栓中的应用。
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