CN117467741A - 核酸释放剂、快速释放核酸的方法 - Google Patents

核酸释放剂、快速释放核酸的方法 Download PDF

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CN117467741A CN202311463998.4A CN202311463998A CN117467741A CN 117467741 A CN117467741 A CN 117467741A CN 202311463998 A CN202311463998 A CN 202311463998A CN 117467741 A CN117467741 A CN 117467741A
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Abstract

本发明公开了一种核酸释放剂、快速释放核酸的方法。所述核酸释放剂包括如下组分：Chelex‑100、柠檬酸钠、氯化锂和水；所述Chelex‑100的质量体积分数为5％～40％，所述柠檬酸钠的浓度为0.1mM～1mM，所述氯化锂的浓度为1mM～10mM。进一步地，所述核酸释放剂还包括乙基苯基聚乙二醇，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为0.1％～2.0％。本发明的核酸释放剂具有常温释放、操作简单、释放速度快、不抑制后续核酸扩增反应、无需依赖仪器的特点，并且适配样本类型广泛、能够应用于多种核酸扩增技术。

Description

核酸释放剂、快速释放核酸的方法
技术领域
本发明属于分子检测技术领域中的核酸样本处理领域，特别是涉及一种通用样本的核酸释放剂以及快速释放核酸的方法。
背景技术
分子诊断技术是一种基于待测物核酸序列的检测技术，通过对待测的特异性核酸序列的识别，检测基因的存在、缺陷或表达异常。得到适合检测的核酸是分子诊断的关键步骤，核酸的质量与浓度直接影响诊断的准确性和灵敏度，核酸制备的速度也是限制诊断速度的重要环节。常规的核酸提取方法包括柱式提取法和磁珠提取法，费时长、需要专业操作，还需要离心机、核酸提取仪等特殊仪器。
基于恒温扩增体系的分子快检和分子家庭自检由于其简单易用、无需复杂仪器的特点逐渐受到关注并已在国内外进行应用。这就要求核酸样本的制备需要简单、快速、不依赖复杂仪器，同时核酸释放效率高、不对后续扩增反应产生抑制。市面上的核酸释放剂多为PCR技术开发，配方对恒温扩增兼容性不佳，对于恒温扩增反应有抑制或者核酸释放效率差，影响了整体检测的灵敏度，限制了分子快检的普及。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种通用的核酸释放剂，其具有常温释放、操作简单、释放速度快、不抑制后续核酸扩增反应、无需依赖仪器的特点，并且适配样本类型广泛、能够应用于多种核酸扩增技术。
为了达到上述发明目的，本发明包括如下技术方案。
一种核酸释放剂，包括如下组分：Chelex-100、柠檬酸钠、氯化锂和水；所述Chelex-100的质量体积分数为5％～40％，所述柠檬酸钠的浓度为0.1mM～1mM，所述氯化锂的浓度为1mM～10mM。
在其中一些实施例中，所述Chelex-100的质量体积分数为10％～40％。
在其中一些实施例中，所述Chelex-100的质量体积分数为15％～40％。
在其中一些实施例中，所述Chelex-100的质量体积分数为20％～40％。
在其中一些实施例中，所述Chelex-100的质量体积分数为20％～35％。
在其中一些实施例中，所述Chelex-100的质量体积分数为25％～30％。
在其中一些实施例中，所述Chelex-100的质量体积分数为22％～28％。
在其中一些实施例中，所述Chelex-100的质量体积分数为24％～26％。
在其中一些实施例中，所述Chelex-100的质量体积分数为25％。
在其中一些实施例中，所述柠檬酸钠的浓度为0.3mM～1mM。
在其中一些实施例中，所述柠檬酸钠的浓度为0.4mM～1mM。
在其中一些实施例中，所述柠檬酸钠的浓度为0.5mM～0.9mM。
在其中一些实施例中，所述柠檬酸钠的浓度为0.5mM～0.7mM。
在其中一些实施例中，所述柠檬酸钠的浓度为0.6mM～0.8mM。
在其中一些实施例中，所述柠檬酸钠的浓度为0.7mM。
在其中一些实施例中，所述氯化锂的浓度为3mM～10mM。
在其中一些实施例中，所述氯化锂的浓度为4mM～10mM。
在其中一些实施例中，所述氯化锂的浓度为5mM～9mM。
在其中一些实施例中，所述氯化锂的浓度为5mM～7mM。
在其中一些实施例中，所述氯化锂的浓度为6mM～8mM。
在其中一些实施例中，所述氯化锂的浓度为7mM。
在其中一些实施例中，所述核酸释放剂还包括：乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为0.1％～2.0％。
在其中一些实施例中，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为0.5％～1.8％。
在其中一些实施例中，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为0.8％～1.5％。
在其中一些实施例中，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为0.9％～1.4％。
在其中一些实施例中，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为1.0％～1.3％。
在其中一些实施例中，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为1.2％。
在其中一些实施例中，所述核酸释放剂的pH为10～12。
在其中一些实施例中，所述核酸释放剂的pH为10.5～11.5。
在其中一些实施例中，所述核酸释放剂由Chelex-100、柠檬酸钠、氯化锂、乙基苯基聚乙二醇和水组成；所述Chelex-100的质量体积分数为25％～30％，所述柠檬酸钠的浓度为0.5mM～0.7mM，所述氯化锂的浓度为5mM～7mM，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为1.0％～1.3％。
本发明还提供了一种从生物样本中快速释放核酸的方法，包括如下步骤：将待测生物样本与本发明所述核酸释放剂混匀，于常温下静置裂解2min～10min，待颗粒物充分沉降后，所得上清液即为释放后的核酸溶液。
在其中一些实施例中，所述待测生物样本与核酸释放剂的体积比为1：1-9。
在其中一些实施例中，所述待测生物样本与核酸释放剂的体积比为1：3-5。
在其中一些实施例中，所述待测生物样本是来自鼻拭子、咽拭子、肛拭子、痰液、唾液、血清、血浆、全血、尿液、粪便、肠道灌洗液、植物组织或动物组织的生物样本。
其中，如果待测生物样本是来自鼻拭子、咽拭子、肛拭子、痰液、唾液、血清、血浆、全血、尿液时，直接将样本与核酸释放剂按比例混匀，于常温下静置裂解2～10min，待颗粒物充分沉降后，所得上清液即为释放后的核酸溶液；对于粪便样本，先用10倍以上体积的无核酸酶水溶解稀释，取稀释后的液体样本与核酸释放剂按比例混匀，于常温下静置裂解2～10min，待颗粒物充分沉降后，所得上清液即为释放后的核酸溶液；对于植物种子、植物组织、动物组织等固体样本，先使用研磨器研磨至粉末状或泥状，取芝麻大小加入核酸释放剂，于常温下静置裂解2～10min，待颗粒物充分沉降后，所得上清液即为释放后的核酸溶液。
本发明提供的核酸释放剂，其主要成分包括Chelex-100、氯化锂和柠檬酸钠。其中，Chelex-100是一种阳离子螯合剂，包含配对亚氨基二乙酸离子(在结合多价金属离子过程中用作螯合基团)的苯乙烯二乙烯基苯共聚物，可以抑制样本中核酸酶的活性，保护核酸不被降解，同时，促进细胞膜破裂和蛋白质沉淀，帮助样本中核酸的释放；氯化锂是强脱水剂，可以从染色质中剥离蛋白，使蛋白质与核酸分离；柠檬酸钠可螯合溶液中的二价金属离子，抑制依赖于二价离子的核酸酶活性。在这三种主成分的协同配合下，本发明的核酸释放剂具有优异的裂解性能，核酸释放效率高，同时抑制效果低，不会对后续扩增反应产生抑制作用，对复杂体系的核酸扩增不产生干扰，极大地提高了灵敏度，且检测特异性好。
本发明的核酸释放剂解决了现有核酸释放剂对多种来源样本释放效果差以及抑制扩增反应的问题，同时解决了现有核酸释放剂需依赖仪器，要求加热的问题；还解决了现有技术中复杂的样本裂解、洗涤、洗脱等核酸提取纯化步骤操作复杂、污染概率大、医疗垃圾多的问题。本发明的核酸释放剂具有常温释放、操作简单、释放速度快、不抑制后续核酸扩增反应、无需依赖仪器的特点，并且适配样本类型广泛、能够应用于多种核酸扩增和检测技术，同时能够大大提升检测灵敏度和准确性。所述核酸扩增和检测技术包括PCR、RPA、LAMP、RCA、RAA等核酸检测方法，所述核酸包括细胞或病原体来源的DNA或RNA。
进一步地，在本发明的核酸释放剂中添加表面活性剂乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，其可以破坏细胞膜，并使细胞内的核酸释放出来，也能提高核酸的溶解度，其添加配合Chelex-100、氯化锂和柠檬酸钠进一步提高了本发明核酸释放剂的核酸释放效果以及对不同样本的兼容性、检测灵敏度和准确性。
本发明从生物样本中快速释放核酸的方法仅需一步完成，不需要进行复杂的样本裂解、洗涤、洗脱等核酸提取纯化步骤，也无需高温加热，降低了使用难度，减少了对仪器的需求，同时也减少了提取过程中操作时间过久和转移次数多带来的污染问题以及导致的核酸样本的损失，减少了试剂和耗材等医疗废物的产生，同时提高了对样本检测的灵敏度和准确性。
附图说明
图1为实施例5中本发明核酸释放剂对新冠假病毒的核酸释放效果及恒温扩增反应的核酸释放产物加样量验证。
图2为实施例8中本发明核酸释放剂对植物组织样本的核酸释放效果。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
以下为具体实施例。
以下实施例中，“w/v”表示质量体积分数，当质量对应的单位为g时，则体积对应的单位为mL，例如浓度为1％(w/v)，表示其浓度为0.01g/mL。
实施例1
1、本实施例的核酸释放剂按表2所示组分浓度，用水为溶剂配制各组核酸释放剂。
2、核酸检测试剂盒(恒温扩增-免疫层析法)：
(1)新型冠状病毒恒温扩增冻干球试剂：选择针对新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab基因，引物探针序列信息见表1，将合成的引物探针和市购的常州安普未来生物科技有限公司的RNA恒温快速扩增混合液(胶体金试纸条型)一起进行冻干生产。
表1
(2)免疫层析试纸条和稀释液：本实施例中的免疫层析试纸条的主要组成为：样品垫、结合垫、膜、吸水垫。其制造方法为：所述样品垫中含有PB溶液、BSA、PVP40和Tween20。应量取1M PB溶液20mL、BSA粉末0.5g、PVP40粉末0.5g和Tween20液体0.5mL于试剂瓶中，ddH2O定容至1L，充分混匀，取30mL混匀后溶液均匀涂抹于25cm×30cm的玻璃纤维膜，55℃烘干4h以上，得到样品垫。所述结合垫中含有氯化金，柠檬酸钠，碳酸钾，FITC抗体。将400mLddH2O、4mL 1％(w/v)氯化金，4mL 1％(w/v)柠檬酸三钠水溶液，在搅拌下加热至沸腾，随后冷却至室温，得到纳米金溶液。每10mL上述胶体金溶液，按4μL/mL的比例加入0.1M K2CO3溶液，混匀后再加入10μg/mL抗FITC抗体，混匀，反应10min，得到胶体金标记抗FITC抗体的结合物。将上述抗FITC抗体的结合物稀释10倍，随后按2.5μL/cm的量喷在玻璃纤维纸上，烘干，得到胶体金结合垫。所述膜包括T线和C线。配制T线包被液：使用10mM磷酸盐缓冲溶液作为包被稀释液，将SA稀释至浓度为1.0mg/mL的工作液。配制C线包被液：使用10mM磷酸盐缓冲溶液作为包被稀释液，将羊抗兔IgG抗体稀释至浓度为0.5mg/mL的工作液。然后将T、C线的包被工作液以0.1μL/mm的速度喷于硝酸纤维素膜上，烘干，得到包被目标材料的硝酸纤维素膜。所述吸水垫为加厚的吸水滤纸。
(3)稀释液：本实施例中的稀释液的主要成分为：PB溶液、氯化钠、Tween20。量取1MPB溶液100mL，NaCl粉末5g，Tween20液体5mL于试剂瓶中，ddH2O定容至1L，充分混匀。
3、样本释放及检测方法：
(1)样本准备：取市购于广州邦德盛生物科技有限公司的新冠假病毒，用深圳市梓健生物科技有限公司非灭活保存液保存的新冠阴性样本进行稀释，稀释至10000copies/mL备用，阴性质控为深圳市梓健生物科技有限公司非灭活保存液保存的新冠阴性样本。
(2)吸取125μL稀释后的浓度为10000copies/mL的新冠假病毒和阴性质控分别加入到500μL表2所示组成的核酸释放剂中，盖上管盖，轻弹管身混匀，按表2所示核酸释放条件处理，使管内分离成上下两层，打开盖子，每个样本分别吸取10μL的释放产物上清液加入到新型冠状病毒恒温扩增冻干球试剂中(扩增体系体积为50μL，上清液加入量不足50μL的用无核酸酶水补齐至50μL)，上下颠倒混匀后，用低速离心机进行瞬时离心，在恒温金属浴上进行恒温扩增反应(反应条件为42℃，12min)，恒温扩增反应结束后，吸取10μL扩增产物到装有90μL稀释液的离心管中，混匀后，吸取65μL混合液加在免疫层析试纸条的样垫上，5-10min内读取结果。
测试结果如表2所示：含柠檬酸钠、氯化锂和Chelex-100的核酸释放剂(组别3)，其检出率最好，能对所有样本完全检出，不会抑制扩增反应，缺少任一组分都对检出率有很大影响。并且该组核酸释放剂的释放条件为常温反应2min即可，非常快速便捷。
表2各组核酸释放剂的组分浓度、pH、使用条件以及检出率结果
实施例2
1、本实施例的核酸释放剂按表3所示组分浓度，用水为溶剂配制各组核酸释放剂。
2、核酸检测试剂盒(恒温扩增-免疫层析法)：本实施例采用实施例1的核酸检测试剂盒(恒温扩增-免疫层析法)。
3、样本释放及检测方法：
(1)样本准备：本实施例采用实施例1相同的样本准备方法。
(2)吸取125μL稀释后的浓度为10000copies/mL的新冠假病毒和阴性质控分别加入到500μL表3所示组成的核酸释放剂中，盖上管盖，轻弹管身混匀，竖直管身静置2min，使管内分离成上下两层，打开盖子，每个样本分别吸取50μL的释放产物上清液加入到新型冠状病毒恒温扩增冻干球试剂中(扩增体系体积为50μL)，上下颠倒混匀后，用低速离心机进行瞬时离心，在恒温金属浴上进行恒温扩增反应(反应条件为42℃，12min)，恒温扩增反应结束后，吸取10μL扩增产物到装有90μL稀释液的离心管中，混匀后，吸取65μL混合液加在免疫层析试纸条的样垫上，5-10min内读取结果。
测试结果如表3所示：Chelex-100浓度为25％，柠檬酸钠的浓度为0.7mM，氯化锂的浓度为7mM时，抑制效果最低，扩增反应全体积上样时的检出率最佳。
表3各组核酸释放剂的组分浓度、pH以及检出率结果
实施例3
本发明的核酸释放剂中，Chelex-100是一种阳离子螯合剂，包含配对亚氨基二乙酸离子(在结合多价金属离子过程中用作螯合基团)的苯乙烯二乙烯基苯共聚物，可以抑制样本中核酸酶的活性，保护核酸不被降解，同时，促进细胞膜破裂和蛋白质沉淀，帮助样本中核酸的释放；氯化锂是强脱水剂，可以从染色质中剥离蛋白，使蛋白质与核酸分离；柠檬酸钠可螯合溶液中的二价金属离子，抑制依赖于二价离子的核酸酶活性；在这三种主成分的协同配合下，其具有优异的裂解性能，核酸释放效率高，同时抑制效果低，不会对后续扩增反应产生抑制作用。
本实施例将Chelex-100替换为具有类似作用的离子螯合树脂Bio-rex 70和AG50W-X2；将氯化锂替换为同样具有可沉淀剥离蛋白作用的硫酸铵；以及将柠檬酸钠替换为羟基羧酸类螯合剂酒石酸钠，测试了成分替换后的核酸释放剂的释放效果以及对扩增反应的影响。
按表4所示组分及浓度，用水为溶剂配制各组核酸释放剂。
以实施例2相同的方法，针对全体积50μL上样量，测试各组核酸释放剂的释放效果以及对扩增反应的影响。
测试结果如表4所示：成分替换后的核酸释放剂的检出率均远低于本发明的含有Chelex-100、氯化锂和柠檬酸钠的核酸释放剂，说明本发明的Chelex-100、氯化锂和柠檬酸钠三者配合具有优异的协同作用，可以获得优异的核酸释放效果并且对扩增反应的影响最低。
表4各组核酸释放剂的组分浓度以及检出率结果
实施例4
本实施例针对灵敏度加强的需求进行优化，使用1000copies/mL的更低浓度样本实验，添加表面活性剂，并对Chelex-100、氯化锂、柠檬酸钠和表面活性剂的浓度进行进一步优化。表面活性剂可以破坏细胞膜，并使细胞内的核酸释放出来，也能提高核酸的溶解度。
按表5所示组分及浓度，用水为溶剂配制各组核酸释放剂。
以实施例2相同的方法(仅样本稀释浓度不同，本实施例的样本浓度为1000copies/mL)，针对全体积50μL上样量，测试各组核酸释放剂的释放效果以及对扩增反应的影响。
测试结果如表5所示：表面活性剂为1.2％的NP-40时，所得核酸释放剂的检出率最高，阴性符合率最好。并且，Chelex-100浓度为25％或40％，柠檬酸钠的浓度为0.7mM，氯化锂浓度为7mM，NP-40浓度为1.2％的第5组和第12组的检出率最高，阴性符合率最好。由于Chelex-100成本高，且为固体成分，影响可用于测试的释放核酸上清的量，故25％Chelex-100，0.7mM柠檬酸钠，7mM氯化锂，1.2％NP-40为最优核酸释放剂配比。
表5：各组核酸释放剂的组分浓度以及检出率结果
实施例5恒温扩增反应的核酸释放产物加样量验证
1、本实施例的核酸释放剂为含有如下组分浓度的水溶液：Chelex-100浓度为25％(w/v)，柠檬酸钠浓度为0.7mM，氯化锂浓度为7mM，乙基苯基聚乙二醇(NP-40)的浓度为1.2％(v/v)，其pH为10.86。
2、核酸检测试剂盒(恒温扩增-免疫层析法)：本实施例采用实施例1的核酸检测试剂盒(恒温扩增-免疫层析法)。
3、检测方法：
(1)样本准备：取市购于广州邦德盛生物科技有限公司、广东和信健康科技有限公司、菁良基因科技(深圳)有限公司的三种新冠假病毒，分别用深圳市梓健生物科技有限公司非灭活保存液保存的阴性样本进行稀释，稀释至5000copies/mL备用，阴性质控为深圳市梓健生物科技有限公司非灭活保存液保存的阴性样本。
(2)吸取125μL三种稀释后的浓度为5000copies/mL的新冠假病毒和阴性质控分别加入到500μL本发明的核酸释放剂中，盖上管盖，轻弹管身混匀，竖直管身静置2min，使管内分离成上下两层，打开盖子，每个样本分别吸取10μL、25μL、50μL的释放产物上清液加入到新型冠状病毒恒温扩增冻干球试剂中(扩增体系体积为50μL，上清液加入量不足50μL的用无核酸酶水补齐至50μL)，上下颠倒混匀后，用低速离心机进行瞬时离心，在恒温金属浴上进行恒温扩增反应(反应条件为42℃，12min)，恒温扩增反应结束后，吸取10μL扩增产物到装有90μL稀释液的离心管中，混匀后，吸取65μL混合液加在免疫层析试纸条的样垫上，5-10min内读取结果。
结果见图1。图中C线显色，T线不显色，结果为阴性，C线、T线同时显色为阳性；显色越强，代表释放效果越好，与恒温扩增反应适配度越高。结果显示：核酸释放产物加样量与恒温扩增反应的适配度强弱为25μL＞50μL＞10μL。恒温扩增反应体系的体积为50μL，本发明能够实现核酸释放产物在恒温扩增反应中的全体系上样，且对扩增效率影响较低，避免了在操作中额外添加缓冲液或无核酸酶水，简化了操作步骤。
实施例6新型冠状病毒临床样本的核酸释放效果验证
1、核酸释放剂：本实施例采用本发明实施例5的核酸释放剂。
2、核酸检测试剂盒(恒温扩增-免疫层析法)：本实施例采用实施例1的核酸检测试剂盒(恒温扩增-免疫层析法)。
3、核酸提取纯化试剂：广州万孚生物技术股份有限公司的核酸提取或纯化试剂，备案号：粤穗械备20210234号。
4、荧光PCR检测试剂：广州达安基因股份有限公司的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，注册号：国械注准20203400063。
5、样本释放及检测方法：
(1)样本准备：收集新型冠状病毒临床样本共50例，其中阳性样本40例(涵盖一定数量的强、中、弱阳性样本)，阴性样本10例，在常温条件下解冻混匀后备用，样本均保存在友康生物科技(北京)股份有限公司的非灭活保存液中。
(2)吸取125μL临床样本加到500μL本发明的核酸释放剂中，盖上管盖，轻弹管身混匀，竖直管身静置2min，使管内分离成上下两层，打开盖子，每个样本吸取50μL的释放产物上清液加入到新型冠状病毒恒温扩增冻干球试剂中，上下颠倒混匀后，用低速离心机进行瞬时离心，在恒温金属浴上进行恒温扩增反应(反应条件为42℃，12min)，恒温扩增反应结束后，吸取10μL扩增产物到装有90μL稀释液的离心管中，混匀后，吸取65μL混合液加在免疫层析试纸条的样垫上，5-10min内读取结果，结果见表6。
(3)同样以市购的核酸提取纯化试剂按说明操作要求对50例临床样本平行进行核酸提取纯化后，用市购的荧光PCR检测试剂按说明书操作进行检测，结果见表6。
表6
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注：B表示不显色，结果为阴性；C1-C9编号越大表示显色深度越浅，扩增产物浓度越低，显色≥C8判为显色，结果为阳性，C9为疑似显色，需复查。
(4)结果显示，以传统核酸提取纯化试剂提取纯化后进行荧光PCR的检测结果作为参考，本发明的核酸释放剂对临床样本进行核酸释放后，用恒温扩增检测的效果较好，阴性符合率和阳性符合率均达到100％，其中强、中和弱阳样本均能达到较好的核酸释放与检测效果。
实施例7猫细小病毒肠道灌洗液和粪便稀释液样本的核酸释放效果验证
1、核酸释放剂：本实施例采用本发明实施例5的核酸释放剂。
2、核酸检测试剂盒(恒温扩增-免疫层析法)：
(1)猫细小病毒恒温扩增冻干球试剂：选择针对猫细小病毒Capsidprotein2基因中一段保守序列，试剂盒的引物探针序列信息见表7，将合成的引物探针和常州安普未来生物科技有限公司DNA恒温快速扩增混合液(胶体金试纸条型)一起进行冻干生产。
表7
(2)免疫层析试纸条与稀释液：本实施例采用实施例1中的免疫层析试纸条与稀释液。
3、核酸提取纯化试剂：广州万孚生物技术股份有限公司的核酸提取或纯化试剂，备案号：粤穗械备20210234号。
4、荧光PCR检测试剂：广州方舟生物科技有限公司的直扩猫细小病毒(FPV)DNA核酸检测冻干试剂盒，产品编号：TAC01T08S1。
检测方法：
(1)样本准备：本实施例收集猫细小病毒样本共25例，其中阳性样本15例，包含8例肠道灌洗液和7例粪便稀释液，阴性样本10例，包含5例肠道灌洗液和5例粪便稀释液，在常温条件下解冻混匀后备用。
(2)吸取125μL临床样本加到500μL本发明的核酸释放剂中，盖上管盖，轻弹管身混匀，竖直管身静置2min，使管内分离成上下两层，打开盖子，每个吸取50μL的释放产物上清液分别加入到猫细小病毒恒温扩增冻干球试剂中，上下颠倒混匀后，用低速离心机进行瞬时离心，在恒温金属浴上进行恒温扩增反应(反应条件为42℃，12min)，恒温扩增反应结束后，吸取10μL扩增产物到装有90μL稀释液的离心管中，混匀后，吸取65μL混合液加在免疫层析试纸条的样垫上，5～10min内读取结果，结果见表8。
(3)同样以市购的核酸提取纯化试剂按说明操作要求对25例猫细小病毒样本平行进行核酸提取纯化后，用市购的荧光PCR检测试剂按说明书操作进行检测，结果见表8。
表8
注：B表示不显色，结果为阴性；C1-C9编号越大表示显色深度越浅，扩增产物浓度越低，显色≥C8判为显色，结果为阳性，C9为疑似显色，需复查。
(4)结果显示，本发明核酸释放剂对猫肠道灌洗液和粪便稀释液样本中的猫细小病毒的核酸释放效果好，阴性符合率和阳性符合率均达到100％。
实施例8植物组织样本的核酸释放效果验证
1、核酸释放剂：本实施例采用本发明实施例5的核酸释放剂。
2、核酸检测试剂盒(恒温扩增-免疫层析法)：
转基因玉米DBN9936恒温扩增冻干球试剂：选择针对转基因玉米DBN9936的特异性序列，引物探针序列见表9，合成引物探针后和常州安普未来生物科技有限公司DNA恒温快速扩增混合液(胶体金试纸条型)进行冻干生产。
表9
转基因大豆GTS 40-3-2恒温扩增冻干球试剂：选择针对转基因大豆GTS 40-3-2的特异性序列，引物探针序列见表10，合成引物探针后和常州安普未来生物科技有限公司DNA恒温快速扩增混合液(胶体金试纸条型)进行冻干生产。
表10
3、免疫层析试纸条与稀释液：本实施例采用实施例1中的免疫层析试纸条与稀释液。
4、检测方法：
(1)样本信息：市购于农业农村部科技发展中心转基因检测标准品，均为植物种子粉末，其中转基因玉米标准品有MON810、DBN9936、瑞丰125，转基因大豆标准品有GTS 40-3-2、ZH10-6、DBN9004。
(2)取芝麻粒大小的标准品粉末加到500μL本发明的核酸释放剂中，盖上管盖，轻弹管身混匀，竖直管身静置2min，使管内分离成上下两层，打开盖子，吸取50μL的释放产物上清液分别加入到对应的恒温扩增冻干球试剂，上下颠倒混匀后，用低速离心机进行瞬时离心，在恒温金属浴上进行恒温扩增反应(反应条件为42℃，15min)，恒温扩增反应结束后，吸取10μL扩增产物到装有90μL稀释液的离心管中，混匀后，吸取65μL混合液加在免疫层析试纸条的样垫上，5-10min内读取结果，结果图见2。
(3)结果显示，本发明核酸释放剂对检测靶标玉米DBN9936和大豆GTS 40-3-2样本的核酸释放灵敏度高，对非检测靶标的植物样本的释放特异性高，说明本发明核酸释放剂对植物组织样本的核酸释放总体效果好。
实施例9：核酸释放剂与常规核酸提取纯化试剂效果对比验证
1、核酸释放剂：本实施例采用本发明实施例5的核酸释放剂。
2、核酸提取纯化试剂：广州万孚生物技术股份有限公司的核酸提取或纯化试剂，备案号：粤穗械备20210234号。
3、荧光PCR检测试剂：达安基因的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)，注册号：国械注准20203400063。
4、样本释放及检测方法：
(1)样本准备：取市购于广州邦德盛生物科技有限公司的新冠假病毒用深圳市梓健生物科技有限公司非灭活保存液保存的阴性样本进行稀释，稀释至10000、5000、2000、1000copies/mL备用，阴性质控为深圳市梓健生物科技有限公司非灭活保存液保存的阴性样本。
(2)吸取125μL稀释后的假病毒和阴性质控分别加到500μL本发明的核酸释放剂中，盖上管盖，轻弹管身混匀，竖直管身静置2min，使管内分离成上下两层，同样以市购的核酸提取纯化试剂按说明操作要求稀释后的假病毒和阴性质控平行进行核酸提取纯化，将释放产物上清液和提取纯化核酸产物用市购的用荧光PCR检测试剂进行对比检测，结果见表11。
表11
(3)结果显示，通过对比核酸纯化试剂和本发明核酸释放剂处理的样本的荧光PCR检测结果可知，本发明核酸释放剂与核酸提取纯化试剂的核酸提取释放性能相当，对PCR反应适配性高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种核酸释放剂，其特征在于，包括如下组分：Chelex-100、柠檬酸钠、氯化锂和水；所述Chelex-100的质量体积分数为5％～40％，所述柠檬酸钠的浓度为0.1mM～1mM，所述氯化锂的浓度为1mM～10mM。
2.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，所述Chelex-100的质量体积分数为15％～40％；和/或，
所述柠檬酸钠的浓度为0.3mM～1mM；和/或，
所述氯化锂的浓度为3mM～10mM。
3.根据权利要求2所述的核酸释放剂，其特征在于，所述Chelex-100的质量体积分数为20％～40％；和/或，
所述柠檬酸钠的浓度为0.4mM～1mM；和/或，
所述氯化锂的浓度为4mM～10mM。
4.根据权利要求3所述的核酸释放剂，其特征在于，所述Chelex-100的质量体积分数为20％～30％；和/或，
所述柠檬酸钠的浓度为0.5mM～0.9mM；和/或，
所述氯化锂的浓度为5mM～9mM。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂还包括：乙基苯基聚乙二醇，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为0.1％～2.0％。
6.根据权利5所述的核酸释放剂，其特征在于，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为0.8％～1.5％。
7.根据权利要求1-4任一项所述的核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂的pH为10～12。
8.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂由Chelex-100、柠檬酸钠、氯化锂、乙基苯基聚乙二醇和水组成；所述Chelex-100的质量体积分数为25％～30％，所述柠檬酸钠的浓度为0.5mM～0.7mM，所述氯化锂的浓度为5mM～7mM，所述乙基苯基聚乙二醇的体积浓度为1.0％～1.3％。
9.一种从生物样本中快速释放核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：将待测生物样本与权利要求1-8任一项所述的核酸释放剂混匀，于常温下静置裂解2min～10min，待颗粒物充分沉降后，所得上清液即为释放后的核酸溶液。
10.根据权利要求9所述的从生物样本中快速释放核酸的方法，其特征在于，所述待测生物样本与核酸释放剂的体积比为1：1-9，优选为1：3-5；和/或，
所述待测生物样本是来自鼻拭子、咽拭子、肛拭子、痰液、唾液、血清、血浆、全血、尿液、粪便、肠道灌洗液、植物组织或动物组织的生物样本。
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