JP3516655B2 - Ｂｎｐの免疫測定法 - Google Patents
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Description
【０００１】技術分野
本発明は、ナトリウム利尿ペプチドファミリーの１つで
ある脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の免疫測定
法に関し、さらに詳しくはγ−ＢＮＰおよびその誘導体
の免疫測定法に関する。
ある脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の免疫測定
法に関し、さらに詳しくはγ−ＢＮＰおよびその誘導体
の免疫測定法に関する。
【０００２】背景技術
ナトリウム利尿ペプチドファミリーには心房性（ＡＮ
Ｐ）、脳性（ＢＮＰ）およびＣタイプ（ＣＮＰ）ナトリ
ウム利尿ペプチドの３種が含まれており、これらのう
ち、ＡＮＰおよびＢＮＰは主として心臓で生合成され、
分泌される心臓ホルモンである。ＡＮＰとＢＮＰは構造
上類似しており、ＡＮＰは２８アミノ酸からなる、第７
および第２３位システイン間のジスルフィド結合により
形成されるリング部分を有するペプチドであり、他方Ｂ
ＮＰは３２アミノ酸からなる、第１０および第２６位シ
ステイン間のジスルフィド結合によって形成されるリン
グ部分を有するペプチドである。これら２８および３２
アミノ酸からなる成熟ペプチドは、細胞内で、または細
胞からの分泌に際してそれぞれの前駆体からリーダー配
列が切り離されて生成すると考えられていた。即ち、ヒ
トＢＮＰについては、心筋細胞中でプレプロホルモン
（以下、プレプロＢＮＰという）として産生され、分泌
前または分泌に際してＳｅｒ２６−Ｈｉｓ２７間で開裂
され、プロＢＮＰ（以下、γ−ＢＮＰという）となった
後、Ａｒｇ１０２−Ｓｅｒ１０３の間で開裂され、ＢＮ
Ｐ３２（以下、α−ＢＮＰという）とＢＮＰ（１−７
６）になり、前者が活性を示すと報告されていた。これ
らの活性発現には、少なくともリング部分が必要である
と考えられている。
Ｐ）、脳性（ＢＮＰ）およびＣタイプ（ＣＮＰ）ナトリ
ウム利尿ペプチドの３種が含まれており、これらのう
ち、ＡＮＰおよびＢＮＰは主として心臓で生合成され、
分泌される心臓ホルモンである。ＡＮＰとＢＮＰは構造
上類似しており、ＡＮＰは２８アミノ酸からなる、第７
および第２３位システイン間のジスルフィド結合により
形成されるリング部分を有するペプチドであり、他方Ｂ
ＮＰは３２アミノ酸からなる、第１０および第２６位シ
ステイン間のジスルフィド結合によって形成されるリン
グ部分を有するペプチドである。これら２８および３２
アミノ酸からなる成熟ペプチドは、細胞内で、または細
胞からの分泌に際してそれぞれの前駆体からリーダー配
列が切り離されて生成すると考えられていた。即ち、ヒ
トＢＮＰについては、心筋細胞中でプレプロホルモン
（以下、プレプロＢＮＰという）として産生され、分泌
前または分泌に際してＳｅｒ２６−Ｈｉｓ２７間で開裂
され、プロＢＮＰ（以下、γ−ＢＮＰという）となった
後、Ａｒｇ１０２−Ｓｅｒ１０３の間で開裂され、ＢＮ
Ｐ３２（以下、α−ＢＮＰという）とＢＮＰ（１−７
６）になり、前者が活性を示すと報告されていた。これ
らの活性発現には、少なくともリング部分が必要である
と考えられている。
【０００３】心臓ホルモンの分泌は様々な心疾患により
刺激を受けるため、心機能の変化を良好に反映できる。
ＡＮＰの分泌は主に心房への負荷で亢進され、ＢＮＰは
心室への負荷で生合成、分泌が亢進され、従ってＡＮＰ
およびＢＮＰは共に心疾患診断の指標として有用であ
る。それぞれの生体内における役割が解明されるにつ
れ、ＢＮＰを心疾患診断の指標とすることの利点が明ら
かにされてきた。例えば、正常な血中濃度を比較すると
ＢＮＰはＡＮＰの６分の１の濃度にすぎないが、心不全
などの場合には、ＡＮＰよりも血中濃度が高くなるこ
と； 心不全の症例では血中ＢＮＰ濃度がＡＮＰ濃度と
ともに上昇するが、重症例ほど血漿ＢＮＰ濃度はＡＮＰ
濃度を上回ることが多いこと： 末梢血レベルでの血漿
ＡＮＰ、ＢＮＰ濃度はともに心不全の重症度に伴い増加
するが、その増加率はＡＮＰよりもＢＮＰのほうが大き
いことなどである。しかも、心不全症例でのＢＮＰ値は
健常者の数十倍〜数百倍に増加することもあり、心不全
におけるＢＮＰの変動は他のホルモンに類を見ないほど
顕著であることから、ＢＮＰ測定の有用性が示唆されて
いる（斎藤能彦ほか、Mebio, 12(5), 28, (1995)）。
刺激を受けるため、心機能の変化を良好に反映できる。
ＡＮＰの分泌は主に心房への負荷で亢進され、ＢＮＰは
心室への負荷で生合成、分泌が亢進され、従ってＡＮＰ
およびＢＮＰは共に心疾患診断の指標として有用であ
る。それぞれの生体内における役割が解明されるにつ
れ、ＢＮＰを心疾患診断の指標とすることの利点が明ら
かにされてきた。例えば、正常な血中濃度を比較すると
ＢＮＰはＡＮＰの６分の１の濃度にすぎないが、心不全
などの場合には、ＡＮＰよりも血中濃度が高くなるこ
と； 心不全の症例では血中ＢＮＰ濃度がＡＮＰ濃度と
ともに上昇するが、重症例ほど血漿ＢＮＰ濃度はＡＮＰ
濃度を上回ることが多いこと： 末梢血レベルでの血漿
ＡＮＰ、ＢＮＰ濃度はともに心不全の重症度に伴い増加
するが、その増加率はＡＮＰよりもＢＮＰのほうが大き
いことなどである。しかも、心不全症例でのＢＮＰ値は
健常者の数十倍〜数百倍に増加することもあり、心不全
におけるＢＮＰの変動は他のホルモンに類を見ないほど
顕著であることから、ＢＮＰ測定の有用性が示唆されて
いる（斎藤能彦ほか、Mebio, 12(5), 28, (1995)）。
【０００４】このような状況下、心不全の診断に利用で
きる、ＢＮＰ抗体を用いる免疫アッセイが開示されてい
る。特表平７−５０７２１０はプロテアーゼなどで生体
内分解されたγ−ＢＮＰ（１−７６）を測定する方法を
開示しているが、その方法の測定対象であるγ−ＢＮＰ
（１−７６）はＢＮＰ活性発現に必要なリング部分など
を含んでいないため、ＢＮＰのホルモン活性を直接に測
定するものでない。
きる、ＢＮＰ抗体を用いる免疫アッセイが開示されてい
る。特表平７−５０７２１０はプロテアーゼなどで生体
内分解されたγ−ＢＮＰ（１−７６）を測定する方法を
開示しているが、その方法の測定対象であるγ−ＢＮＰ
（１−７６）はＢＮＰ活性発現に必要なリング部分など
を含んでいないため、ＢＮＰのホルモン活性を直接に測
定するものでない。
【０００５】ナトリウム利尿活性を有するα−ＢＮＰを
測定する手法を提供するものとしてポリクローナル抗体
を用いた測定キット（「ＢＮＰ−３２」：ペニンシュラ
社製）が市販されている。しかし、この測定では血中に
て分解を受けてＣ末端などが欠損し活性を失ったα−Ｂ
ＮＰ分解物をも測定してしまうおそれがある。ＢＮＰの
血中濃度が低いことを勘案すると、この分解物に対する
測定値は無視できないものであり、よって本手法は心不
全等を正確に診断するためのＢＮＰ測定法としては不都
合を内包すると思われる。
測定する手法を提供するものとしてポリクローナル抗体
を用いた測定キット（「ＢＮＰ−３２」：ペニンシュラ
社製）が市販されている。しかし、この測定では血中に
て分解を受けてＣ末端などが欠損し活性を失ったα−Ｂ
ＮＰ分解物をも測定してしまうおそれがある。ＢＮＰの
血中濃度が低いことを勘案すると、この分解物に対する
測定値は無視できないものであり、よって本手法は心不
全等を正確に診断するためのＢＮＰ測定法としては不都
合を内包すると思われる。
【０００６】一方、上記の不都合のないＢＮＰ測定キッ
ト（「シオノリアＢＮＰ」：塩野義製薬社製）が市販さ
れており、これは活性発現に必要な構造を認識する抗体
を用いることを特徴としている。しかし、この測定では
α−ＢＮＰが採血後、血中で極めて不安定であることか
ら、検体の採血および保存方法などが測定結果に大きく
影響することが危惧される。そのため、本手法において
信頼性あるデータを得るために、検体に特別な処理、例
えば採血管に分解抑制剤を添加したり、検体を低温に保
つなどが推奨されている。このような処理は本件ＢＮＰ
測定キットの広範な臨床応用への障害となるおそれがあ
った。
ト（「シオノリアＢＮＰ」：塩野義製薬社製）が市販さ
れており、これは活性発現に必要な構造を認識する抗体
を用いることを特徴としている。しかし、この測定では
α−ＢＮＰが採血後、血中で極めて不安定であることか
ら、検体の採血および保存方法などが測定結果に大きく
影響することが危惧される。そのため、本手法において
信頼性あるデータを得るために、検体に特別な処理、例
えば採血管に分解抑制剤を添加したり、検体を低温に保
つなどが推奨されている。このような処理は本件ＢＮＰ
測定キットの広範な臨床応用への障害となるおそれがあ
った。
【０００７】発明の開示
本発明者らは、ＢＮＰが関与する心疾患の正確な診断法
を確立するために研究を重ねる過程で、血中でのＢＮＰ
の形態は、従来考えられていたようなα−ＢＮＰが主で
はなく、γ−ＢＮＰおよび少なくとも構造上α−ＢＮＰ
を含むγ−ＢＮＰ分解物（以下、これらをγ−ＢＮＰ誘
導体という）で構成されていることを見出した。また、
血中においてγ−ＢＮＰはα−ＢＮＰよりも安定である
こと、即ち、γ−ＢＮＰのＮ−末端構造の役割の１つが
ＢＮＰ分子の安定化であることを見出した。これらのこ
とは、生体が半減期の異なる少なくとも２種類のＢＮＰ
活性を有するＢＮＰ分子を生合成していることを示して
いる。このような知見を得て、本発明者らは、心疾患の
正確な診断のためには、α−ＢＮＰのみならず、γ−Ｂ
ＮＰ誘導体を特異的に測定する必要があるとの見解に達
し、本発明を完成した。
を確立するために研究を重ねる過程で、血中でのＢＮＰ
の形態は、従来考えられていたようなα−ＢＮＰが主で
はなく、γ−ＢＮＰおよび少なくとも構造上α−ＢＮＰ
を含むγ−ＢＮＰ分解物（以下、これらをγ−ＢＮＰ誘
導体という）で構成されていることを見出した。また、
血中においてγ−ＢＮＰはα−ＢＮＰよりも安定である
こと、即ち、γ−ＢＮＰのＮ−末端構造の役割の１つが
ＢＮＰ分子の安定化であることを見出した。これらのこ
とは、生体が半減期の異なる少なくとも２種類のＢＮＰ
活性を有するＢＮＰ分子を生合成していることを示して
いる。このような知見を得て、本発明者らは、心疾患の
正確な診断のためには、α−ＢＮＰのみならず、γ−Ｂ
ＮＰ誘導体を特異的に測定する必要があるとの見解に達
し、本発明を完成した。
【０００８】即ち、本発明は、哺乳類のα−ＢＮＰに反
応する第１の抗体とプレプロＢＮＰもしくはγ−ＢＮＰ
誘導体に反応するがα−ＢＮＰには反応しない第２の抗
体とを用いることを特徴とする哺乳類のγ−ＢＮＰ誘導
体に特異的な免疫測定方法を提供するものである。
応する第１の抗体とプレプロＢＮＰもしくはγ−ＢＮＰ
誘導体に反応するがα−ＢＮＰには反応しない第２の抗
体とを用いることを特徴とする哺乳類のγ−ＢＮＰ誘導
体に特異的な免疫測定方法を提供するものである。
【０００９】本明細書中、「哺乳類のα−ＢＮＰ」と
は、哺乳類のプレプロＢＮＰまたはγ−ＢＮＰがそのプ
ロセッシングシグナル配列のカルボキシ末端からプロセ
スされ、Ｎ−末端側のペプチドが分離されることにより
生成されるナトリウム利尿活性を有する低分子量のペプ
チドを意味する。α−ＢＮＰは、ヒトの場合、配列表の
配列番号１におけるカルボキシ末端側３２アミノ酸（第
１０３−１３４位）からなり、環状構造を有するペプチ
ドである。プレプロＢＮＰのプロセッシングシグナル配
列のカルボキシ末端の位置は種により若干異なり、例え
ばヒトＢＮＰの場合、配列表の配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列における第１０２位のアミノ酸残基Ａrg、ブタ
およびイヌでは第１００位のアミノ酸残基に相当する。
は、哺乳類のプレプロＢＮＰまたはγ−ＢＮＰがそのプ
ロセッシングシグナル配列のカルボキシ末端からプロセ
スされ、Ｎ−末端側のペプチドが分離されることにより
生成されるナトリウム利尿活性を有する低分子量のペプ
チドを意味する。α−ＢＮＰは、ヒトの場合、配列表の
配列番号１におけるカルボキシ末端側３２アミノ酸（第
１０３−１３４位）からなり、環状構造を有するペプチ
ドである。プレプロＢＮＰのプロセッシングシグナル配
列のカルボキシ末端の位置は種により若干異なり、例え
ばヒトＢＮＰの場合、配列表の配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列における第１０２位のアミノ酸残基Ａrg、ブタ
およびイヌでは第１００位のアミノ酸残基に相当する。
【００１０】「哺乳類のγ−ＢＮＰ」とは、カルボキシ
末端にα−ＢＮＰに相当する３２アミノ酸ペプチド部分
を有し、ヒトの場合には、配列表の配列番号１に記載の
アミノ酸配列の２７位Ｈisから１３４位Ｈisまでの１０
８アミノ酸からなるプロＢＮＰを意味する。「プレプロ
ＢＮＰ」とはヒトの場合、配列表の配列番号１に記載の
アミノ酸配列の１位Ｍetから１３４位Ｈisまでの１３４
アミノ酸からなるペプチドを意味する。
末端にα−ＢＮＰに相当する３２アミノ酸ペプチド部分
を有し、ヒトの場合には、配列表の配列番号１に記載の
アミノ酸配列の２７位Ｈisから１３４位Ｈisまでの１０
８アミノ酸からなるプロＢＮＰを意味する。「プレプロ
ＢＮＰ」とはヒトの場合、配列表の配列番号１に記載の
アミノ酸配列の１位Ｍetから１３４位Ｈisまでの１３４
アミノ酸からなるペプチドを意味する。
【００１１】「哺乳類のγ−ＢＮＰ誘導体」とは、哺乳
類のプレプロＢＮＰまたはγ−ＢＮＰから、主として生
体内のプロテアーゼ作用により生成される、α−ＢＮＰ
を含み、該α−ＢＮＰよりも大きいペプチド断片を指
す。それは、通常、γ−ＢＮＰよりも小さいが、それよ
りも大きい分子であってもよい。本明細書中では、特記
しない限り、「γ−ＢＮＰ誘導体」という場合、γ−Ｂ
ＮＰ自身も該誘導体に包含される。
類のプレプロＢＮＰまたはγ−ＢＮＰから、主として生
体内のプロテアーゼ作用により生成される、α−ＢＮＰ
を含み、該α−ＢＮＰよりも大きいペプチド断片を指
す。それは、通常、γ−ＢＮＰよりも小さいが、それよ
りも大きい分子であってもよい。本明細書中では、特記
しない限り、「γ−ＢＮＰ誘導体」という場合、γ−Ｂ
ＮＰ自身も該誘導体に包含される。
【００１２】本発明において、ＢＮＰに関して「安定で
ある」とは、プロテアーゼによる分解を受けるものの、
少なくともカルボキシ末端側のリング構造とＣ末端は残
存してナトリウム利尿活性を保持しており、採血後２４
時間経過してもそのナトリウム利尿活性に有意な減少が
見られない状態であることを意味する。この定義に照ら
して、本発明の測定対象であるγ−ＢＮＰ誘導体は安定
である。一方、不安定であるとは、プロテアーゼなどに
よりＣ末端が分解を受け、採血後２４時間経過すればナ
トリウム利尿活性に有意な減少が見られる状態を意味
し、この定義に照らして、α−ＢＮＰは不安定である。
ある」とは、プロテアーゼによる分解を受けるものの、
少なくともカルボキシ末端側のリング構造とＣ末端は残
存してナトリウム利尿活性を保持しており、採血後２４
時間経過してもそのナトリウム利尿活性に有意な減少が
見られない状態であることを意味する。この定義に照ら
して、本発明の測定対象であるγ−ＢＮＰ誘導体は安定
である。一方、不安定であるとは、プロテアーゼなどに
よりＣ末端が分解を受け、採血後２４時間経過すればナ
トリウム利尿活性に有意な減少が見られる状態を意味
し、この定義に照らして、α−ＢＮＰは不安定である。
【００１３】発明を実施するための最良の形態
本発明は第１の態様として、哺乳類のα−ＢＮＰに反応
する第１の抗体とプレプロＢＮＰもしくはγ−ＢＮＰ誘
導体に反応するがα−ＢＮＰには反応しない第２の抗体
とを用いる方法に関する。この方法に使用する抗体は、
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれ
でもよく、第１の抗体としては市販されている、または
当業者に既知の方法により化学的に合成したヒトα−Ｂ
ＮＰもしくはその部分ペプチドを免疫原として当業者既
知の方法で製造することができる。或いは、市販のα−
ＢＮＰ測定キット「シオノリアＢＮＰ」（塩野義製薬社
製）に用いられているα−ＢＮＰカルボキシ末端部分に
反応するモノクローナル抗体を用いることもできる。
する第１の抗体とプレプロＢＮＰもしくはγ−ＢＮＰ誘
導体に反応するがα−ＢＮＰには反応しない第２の抗体
とを用いる方法に関する。この方法に使用する抗体は、
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれ
でもよく、第１の抗体としては市販されている、または
当業者に既知の方法により化学的に合成したヒトα−Ｂ
ＮＰもしくはその部分ペプチドを免疫原として当業者既
知の方法で製造することができる。或いは、市販のα−
ＢＮＰ測定キット「シオノリアＢＮＰ」（塩野義製薬社
製）に用いられているα−ＢＮＰカルボキシ末端部分に
反応するモノクローナル抗体を用いることもできる。
【００１４】第２の抗体としては、上記の条件を満たす
任意の抗体を用いることができるが、例えば配列表の配
列番号１に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２
７−１０２で示されるアミノ酸配列およびその代謝物に
特異的な抗体であることが好ましい。本発明の測定対象
であるγ−ＢＮＰ誘導体は、ヒトの場合、少なくとも配
列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７−１
３４で示される部分アミノ酸配列を包含することが好ま
しい。よって、好ましい態様では、本発明方法に使用さ
れる第２の抗体製造に際し、配列番号１のアミノ酸番号
２７−１０２を認識する抗体が作製できるよう抗原を選
定する等の注意が必要であろう。このような抗体の製造
は当業者既知の方法で行うことができる。γ−ＢＮＰは
プロテアーゼによる切断可能な部位として、該配列番号
１の第４７位のＡrg、５３位のＬysおよび７２位のＡrg
を含有すると理論上考えられる。よって、配列番号１の
アミノ酸番号７３−１０２を認識する抗体を第２の抗体
として用いることもできる。
任意の抗体を用いることができるが、例えば配列表の配
列番号１に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２
７−１０２で示されるアミノ酸配列およびその代謝物に
特異的な抗体であることが好ましい。本発明の測定対象
であるγ−ＢＮＰ誘導体は、ヒトの場合、少なくとも配
列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７−１
３４で示される部分アミノ酸配列を包含することが好ま
しい。よって、好ましい態様では、本発明方法に使用さ
れる第２の抗体製造に際し、配列番号１のアミノ酸番号
２７−１０２を認識する抗体が作製できるよう抗原を選
定する等の注意が必要であろう。このような抗体の製造
は当業者既知の方法で行うことができる。γ−ＢＮＰは
プロテアーゼによる切断可能な部位として、該配列番号
１の第４７位のＡrg、５３位のＬysおよび７２位のＡrg
を含有すると理論上考えられる。よって、配列番号１の
アミノ酸番号７３−１０２を認識する抗体を第２の抗体
として用いることもできる。
【００１５】本発明の測定法は競合法またはサンドイッ
チ法のいずれでもよく、用いる抗体はモノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい。第１の
抗体および第２の抗体のうち、少なくとも一方は検出可
能に標識されているか、または固相化されていてもよ
い。抗体の標識および固相化法は当業者に既知である。
標識としては、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物
質または粒子等を用いることができるが、これらに限定
されない。抗体の標識法も既知であり、例えば河野ら
（核医学技術、13(1), 2, (1993)）の方法により標識す
ることができる。
チ法のいずれでもよく、用いる抗体はモノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい。第１の
抗体および第２の抗体のうち、少なくとも一方は検出可
能に標識されているか、または固相化されていてもよ
い。抗体の標識および固相化法は当業者に既知である。
標識としては、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物
質または粒子等を用いることができるが、これらに限定
されない。抗体の標識法も既知であり、例えば河野ら
（核医学技術、13(1), 2, (1993)）の方法により標識す
ることができる。
【００１６】本発明はまた、哺乳類のα−ＢＮＰに反応
する第１の抗体とプレプロＢＮＰもしくはγ−ＢＮＰ誘
導体に反応するがα−ＢＮＰには反応しない第２の抗体
とを含むことを特徴とする、哺乳類のγ−ＢＮＰ誘導体
に特異的な免疫測定のためのキットを提供する。
する第１の抗体とプレプロＢＮＰもしくはγ−ＢＮＰ誘
導体に反応するがα−ＢＮＰには反応しない第２の抗体
とを含むことを特徴とする、哺乳類のγ−ＢＮＰ誘導体
に特異的な免疫測定のためのキットを提供する。
【００１７】本発明のキットは競合法またはサンドイッ
チ法のいずれでもよく、用いる抗体はモノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい。第１の
抗体および第２の抗体のうち、少なくとも一方は検出可
能に標識されていてよく、また固相化されていてよい。
さらに、本発明キットは標識を検出する手段を含んでい
てもよい。該標識としては、放射性同位体、酵素、蛍光
物質、発光物質または粒子を用いることができるが、こ
れらに限定されない。
チ法のいずれでもよく、用いる抗体はモノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい。第１の
抗体および第２の抗体のうち、少なくとも一方は検出可
能に標識されていてよく、また固相化されていてよい。
さらに、本発明キットは標識を検出する手段を含んでい
てもよい。該標識としては、放射性同位体、酵素、蛍光
物質、発光物質または粒子を用いることができるが、こ
れらに限定されない。
【００１８】以下に実施例および試験例を挙げて本発明
をさらに詳細に説明するが、これらは本発明を限定する
ものではない。
をさらに詳細に説明するが、これらは本発明を限定する
ものではない。
【００１９】実施例１
サンドイッチＩＲＭＡ法によるγ−ＢＮＰ誘導体の測定
以下の実施例において、一般の試薬は和光純薬社または
ナカライテスク社の特級試薬を使用した。牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）はシグマ社製を使用した。
ナカライテスク社の特級試薬を使用した。牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）はシグマ社製を使用した。
【００２０】（１）血漿検体の調製
１）心疾患患者もしくは健常人ボランティアから牛肺由
来アプロチニン（シグマ社製）（５００ＫＩＵ／Ｌ）添
加ＥＤＴＡ採血管に静脈血を採取し、４℃、×２０００
ｇで５分間遠心分離（コクサン社製Ｈ−１０７ＲＧＡ）
し、血球分離を行った。得られた血漿検体は使用するま
で−８０℃で凍結保存した。 ２）上記１）で調製した心疾患患者および健常人由来の
血漿をゲルろ過ＨＰＬＣシステムＬＣ１０Ａ（島津製作
所社製）にＳuperdex７５ １０／３０カラム（ファル
マシア社）を用いて分画した。０.1Ｍりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.5、０.3Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）を用い、
流速１ｍｌ／minでカラムを平衡化した後、血漿検体１
ｍｌを注入し、カラムからの溶出液１ｍｌづつを捕集す
る。各分画を用い、下記（２）−２）のα−ＢＮＰの測
定法および（２）−３）のγ−ＢＮＰ測定法に従い、そ
れぞれ測定を行った。
来アプロチニン（シグマ社製）（５００ＫＩＵ／Ｌ）添
加ＥＤＴＡ採血管に静脈血を採取し、４℃、×２０００
ｇで５分間遠心分離（コクサン社製Ｈ−１０７ＲＧＡ）
し、血球分離を行った。得られた血漿検体は使用するま
で−８０℃で凍結保存した。 ２）上記１）で調製した心疾患患者および健常人由来の
血漿をゲルろ過ＨＰＬＣシステムＬＣ１０Ａ（島津製作
所社製）にＳuperdex７５ １０／３０カラム（ファル
マシア社）を用いて分画した。０.1Ｍりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.5、０.3Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）を用い、
流速１ｍｌ／minでカラムを平衡化した後、血漿検体１
ｍｌを注入し、カラムからの溶出液１ｍｌづつを捕集す
る。各分画を用い、下記（２）−２）のα−ＢＮＰの測
定法および（２）−３）のγ−ＢＮＰ測定法に従い、そ
れぞれ測定を行った。
【００２１】（２）α−ＢＮＰ測定系およびγ−ＢＮＰ
誘導体測定系の構築 １）測定には、以下のペプチド、抗体およびキットを用
いた。 ・ヒトα−ＢＮＰ（ペプチド研究所社製） ・γ−ｈＢＮＰアミノ末端部分（配列番号１におけるア
ミノ酸番号２７−６４）に対する抗体（ペプチド研究所
社製） ・α−ＢＮＰカルボキシ末端部分に対するモノクローナ
ル抗体（ＢＣ２０３）。ＢＣ２０３はシオノリアＢＮＰ
キット（塩野義製薬社製）に添付されているα−ＢＮＰ
のカルボキシ末端（１２９−１３４）に対するモノクロ
ーナル抗体であり、ビーズに固定化されており、固定化
抗体として用いる。 ・α−ＢＮＰリング構造部分に対するモノクローナル抗
体（ＫＹ−ＢＮＰＩＩ）。 ＫＹ−ＢＮＰＩＩはシオノリアＢＮＰキット（塩野義製
薬社製）に添付されているα−ＢＮＰのリング構造（１
１２−１２８）に対するモノクローナル抗体であり、
１２５Ｉで標識されている。
誘導体測定系の構築 １）測定には、以下のペプチド、抗体およびキットを用
いた。 ・ヒトα−ＢＮＰ（ペプチド研究所社製） ・γ−ｈＢＮＰアミノ末端部分（配列番号１におけるア
ミノ酸番号２７−６４）に対する抗体（ペプチド研究所
社製） ・α−ＢＮＰカルボキシ末端部分に対するモノクローナ
ル抗体（ＢＣ２０３）。ＢＣ２０３はシオノリアＢＮＰ
キット（塩野義製薬社製）に添付されているα−ＢＮＰ
のカルボキシ末端（１２９−１３４）に対するモノクロ
ーナル抗体であり、ビーズに固定化されており、固定化
抗体として用いる。 ・α−ＢＮＰリング構造部分に対するモノクローナル抗
体（ＫＹ−ＢＮＰＩＩ）。 ＫＹ−ＢＮＰＩＩはシオノリアＢＮＰキット（塩野義製
薬社製）に添付されているα−ＢＮＰのリング構造（１
１２−１２８）に対するモノクローナル抗体であり、
１２５Ｉで標識されている。
【００２２】２）α−ＢＮＰ測定系による血漿画分の測
定 α−ＢＮＰ測定には市販の「シオノリアＢＮＰキット」
（塩野義製薬社製）を用いた。この系では、α−ＢＮＰ
のリング構造に対するモノクローナル抗体（ＫＹ−ＢＮ
ＰＩＩ）およびカルボキシ末端に対するモノクローナル
抗体（ＢＣ２０３）を用い、供給者の指示に従い、サン
ドイッチＩＲＭＡ(ImmunoRadioMetric Assay)法で測定
する。すなわち、各測定検体および各種標準物質（α−
ＢＮＰ溶液；０、４、１０、１５０、６００、２０００
ｐｇ／ｍｌ）をポリスチレン製の試験管に１００μｌ分
注し、２００μｌのヨウ化ＢＮＰ抗体（１２５Ｉ）溶液
を添加し、ＢＣ２０３抗体固相化ポリスチレンビーズを
１個加えて攪拌後、４℃で１８時間静置して反応させ
た。２mlの洗浄液で２回洗浄を行った後、放射活性をγ
カウンターＡＲＣ−６００（アロカ社製）で測定した。
その結果を図１および図２に示す。
定 α−ＢＮＰ測定には市販の「シオノリアＢＮＰキット」
（塩野義製薬社製）を用いた。この系では、α−ＢＮＰ
のリング構造に対するモノクローナル抗体（ＫＹ−ＢＮ
ＰＩＩ）およびカルボキシ末端に対するモノクローナル
抗体（ＢＣ２０３）を用い、供給者の指示に従い、サン
ドイッチＩＲＭＡ(ImmunoRadioMetric Assay)法で測定
する。すなわち、各測定検体および各種標準物質（α−
ＢＮＰ溶液；０、４、１０、１５０、６００、２０００
ｐｇ／ｍｌ）をポリスチレン製の試験管に１００μｌ分
注し、２００μｌのヨウ化ＢＮＰ抗体（１２５Ｉ）溶液
を添加し、ＢＣ２０３抗体固相化ポリスチレンビーズを
１個加えて攪拌後、４℃で１８時間静置して反応させ
た。２mlの洗浄液で２回洗浄を行った後、放射活性をγ
カウンターＡＲＣ−６００（アロカ社製）で測定した。
その結果を図１および図２に示す。
【００２３】３）γ−ＢＮＰ誘導体測定系による血漿画
分の測定 まず、γ−ｈＢＮＰアミノ末端部分（２７−６４位）に
対する抗体の１２５Ｉによる標識を行った。γ−ｈＢＮ
Ｐアミノ末端部分（配列番号１のアミノ酸番号２７−６
４部分）に対する抗血清（ペプチド社製）からＭＡＳＰ
ＩＩキット（バイオラッド社製）を用いてＩｇＧを精製
し、セントリコン３０（アミコン社製）を用いて０.5Ｍ
りん酸緩衝液（ｐＨ７.5）に置換した。抗体標識はクロ
ラミンＴ法を用いて行った。精製ＩｇＧ溶液１７０μｌ
（７７.6μｇＩｇＧ）をガラスチューブに分注し、Ｎa
１２５Ｉ溶液（アマシャム社製）を１０μｌ（３４.2Ｍ
Ｂｑ）添加した。０.1％クロラミンＴ溶液２０μｌを添
加し、室温で３０秒間激しく撹拌した後、０.25％ピロ
亜硫酸ナトリウム溶液および５％ヨウ化カリウム水溶液
をそれぞれ２０μｌずつ加えて反応を停止した。Ａmpur
eＳＡカラム（アマシャム社製）により未反応の１２５
Ｉの除去および脱塩を行い、１２５Ｉ標識抗体を含む溶
液を得た。
分の測定 まず、γ−ｈＢＮＰアミノ末端部分（２７−６４位）に
対する抗体の１２５Ｉによる標識を行った。γ−ｈＢＮ
Ｐアミノ末端部分（配列番号１のアミノ酸番号２７−６
４部分）に対する抗血清（ペプチド社製）からＭＡＳＰ
ＩＩキット（バイオラッド社製）を用いてＩｇＧを精製
し、セントリコン３０（アミコン社製）を用いて０.5Ｍ
りん酸緩衝液（ｐＨ７.5）に置換した。抗体標識はクロ
ラミンＴ法を用いて行った。精製ＩｇＧ溶液１７０μｌ
（７７.6μｇＩｇＧ）をガラスチューブに分注し、Ｎa
１２５Ｉ溶液（アマシャム社製）を１０μｌ（３４.2Ｍ
Ｂｑ）添加した。０.1％クロラミンＴ溶液２０μｌを添
加し、室温で３０秒間激しく撹拌した後、０.25％ピロ
亜硫酸ナトリウム溶液および５％ヨウ化カリウム水溶液
をそれぞれ２０μｌずつ加えて反応を停止した。Ａmpur
eＳＡカラム（アマシャム社製）により未反応の１２５
Ｉの除去および脱塩を行い、１２５Ｉ標識抗体を含む溶
液を得た。
【００２４】次いで、この抗体およびα−ＢＮＰカルボ
キシ末端認識抗体（ＢＣ２０３）を固相したポリスチレ
ンビーズを用い、血漿画分に対してサンドイッチＩＲＭ
Ａ法で行った。各測定検体１００μｌをポリスチレン製
の試験管に分注し、２００μｌの０．１Ｍりん酸緩衝液
（pH７.5、０.3Ｍ、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、０.2％ＢＳＡ、５００ＫＩＵ／ｌ牛肺由来ア
プロチニン（シグマ社製）を添加し、ＢＣ２０３抗体固
相ポリスチレンビーズを１個加えて撹拌後、４℃で１８
時間静置して反応させた。２mlの洗浄液で２回洗浄を行
った後、１２５Ｉ標識抗体溶液３００μｌを加えて撹拌
し、４℃で１８時間静置して反応させた。２mlの洗浄液
で２回洗浄を行った後、放射活性をγカウンターＡＲＣ
−６００（アロカ社製）で測定した。その結果を図３に
示す。
キシ末端認識抗体（ＢＣ２０３）を固相したポリスチレ
ンビーズを用い、血漿画分に対してサンドイッチＩＲＭ
Ａ法で行った。各測定検体１００μｌをポリスチレン製
の試験管に分注し、２００μｌの０．１Ｍりん酸緩衝液
（pH７.5、０.3Ｍ、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、０.2％ＢＳＡ、５００ＫＩＵ／ｌ牛肺由来ア
プロチニン（シグマ社製）を添加し、ＢＣ２０３抗体固
相ポリスチレンビーズを１個加えて撹拌後、４℃で１８
時間静置して反応させた。２mlの洗浄液で２回洗浄を行
った後、１２５Ｉ標識抗体溶液３００μｌを加えて撹拌
し、４℃で１８時間静置して反応させた。２mlの洗浄液
で２回洗浄を行った後、放射活性をγカウンターＡＲＣ
−６００（アロカ社製）で測定した。その結果を図３に
示す。
【００２５】（３）結果
患者血漿のゲルろ過ＨＰＬＣによるクロマトグラムの測
定結果を図１、図２および図３に示している。これらの
図においてＡはα−ＢＮＰの溶出位置である。図１は、
上記（２）−２）のα−ＢＮＰ測定キットによる測定結
果を示している。図中、縦軸は各分画中のシオノリアＢ
ＮＰで測定したＢＮＰ様物質の濃度、横軸はカラムから
の溶出容量を表す。黒三角、白四角および白菱形はそれ
ぞれ異なる血漿検体の測定結果を示している。図２は、
図１と異なる検体を用いて、上記（２）−２）のα−Ｂ
ＮＰ測定系で測定した結果を示している。図中、縦軸は
各分画中のシオノリアＢＮＰで測定したＢＮＰ様物質の
濃度、横軸はカラムからの溶出容量を表す。また、黒三
角および黒四角は異なる血漿検体を示す。図１および図
２から、心疾患患者血漿中にはα−ＢＮＰよりも分子量
の大きなＢＮＰ免疫活性様の物質が存在し、それがＢＮ
Ｐ免疫活性をもつ主要物質であることが分かる。
定結果を図１、図２および図３に示している。これらの
図においてＡはα−ＢＮＰの溶出位置である。図１は、
上記（２）−２）のα−ＢＮＰ測定キットによる測定結
果を示している。図中、縦軸は各分画中のシオノリアＢ
ＮＰで測定したＢＮＰ様物質の濃度、横軸はカラムから
の溶出容量を表す。黒三角、白四角および白菱形はそれ
ぞれ異なる血漿検体の測定結果を示している。図２は、
図１と異なる検体を用いて、上記（２）−２）のα−Ｂ
ＮＰ測定系で測定した結果を示している。図中、縦軸は
各分画中のシオノリアＢＮＰで測定したＢＮＰ様物質の
濃度、横軸はカラムからの溶出容量を表す。また、黒三
角および黒四角は異なる血漿検体を示す。図１および図
２から、心疾患患者血漿中にはα−ＢＮＰよりも分子量
の大きなＢＮＰ免疫活性様の物質が存在し、それがＢＮ
Ｐ免疫活性をもつ主要物質であることが分かる。
【００２６】図３は、図２と同じ検体を用いて上記
（２）−３）に記載の本発明のγ−ＢＮＰ測定系による
測定結果を示し、縦軸は本発明のγ−ＢＮＰ免疫測定系
で測定した放射活性を、横軸はカラムからの溶出容量を
表している。また、黒丸はα−ＢＮＰを示す。図３中、
黒丸はヒトα−ＢＮＰ溶液を血漿の場合と同様にＨＰＬ
Ｃにって分画して測定された結果である。図３から、本
発明のγ−ＢＮＰ誘導体特異的免疫測定法では、ＢＮＰ
免疫活性をもつ主要物質を検出することができるが、α
−ＢＮＰは全く検出されないことが分かる。
（２）−３）に記載の本発明のγ−ＢＮＰ測定系による
測定結果を示し、縦軸は本発明のγ−ＢＮＰ免疫測定系
で測定した放射活性を、横軸はカラムからの溶出容量を
表している。また、黒丸はα−ＢＮＰを示す。図３中、
黒丸はヒトα−ＢＮＰ溶液を血漿の場合と同様にＨＰＬ
Ｃにって分画して測定された結果である。図３から、本
発明のγ−ＢＮＰ誘導体特異的免疫測定法では、ＢＮＰ
免疫活性をもつ主要物質を検出することができるが、α
−ＢＮＰは全く検出されないことが分かる。
【００２７】以上の結果は、本発明のγ−ＢＮＰ免疫測
定法がα−ＢＮＰを認識せず、γ−ＢＮＰ誘導体に特異
的な測定方法であることを示している。また、ＢＮＰ免
疫活性をもつ主要物質がγ−ＢＮＰであることも明らか
となった。
定法がα−ＢＮＰを認識せず、γ−ＢＮＰ誘導体に特異
的な測定方法であることを示している。また、ＢＮＰ免
疫活性をもつ主要物質がγ−ＢＮＰであることも明らか
となった。
【００２８】試験例１
γ−ＢＮＰ誘導体およびα−ＢＮＰの血漿中での安定性
上記実施例１における心疾患患者由来の血漿検体のゲル
ろ過ＨＰＬＣの結果から、γ−ＢＮＰ誘導体を含むと思
われる分画を採取した。牛肺由来アプロチニン未添加の
ＥＤＴＡ採血管を用い、健常人ボランティアから静脈血
を採取し、上記（１）−１）と同様の操作により血漿検
体（α−ＢＮＰ最小検出限界（４pg／ｍｌ）未満）を
得、それに上記分画を添加後、室温（２５℃）にて０、
２、６、２４時間放置し、ＢＮＰ免疫活性を、α−ＢＮ
Ｐを測定するためのシオノリアＢＮＰキットで測定し、
γ−ＢＮＰ誘導体の安定性を調べた。一方、上記と同様
の牛肺由来のアプロチニンを含まない健常人ボランティ
ア血漿に化学的に合成したα−ＢＮＰを添加後、４℃で
０、２、６、２４時間放置し、そのＢＮＰ免疫活性を同
様にシオノリアＢＮＰキットで測定し、α−ＢＮＰの安
定性を調べた。γ−ＢＮＰ誘導体およびα−ＢＮＰの血
漿検体中での免疫活性の安定性の結果を図４および図５
にそれぞれ示す。
ろ過ＨＰＬＣの結果から、γ−ＢＮＰ誘導体を含むと思
われる分画を採取した。牛肺由来アプロチニン未添加の
ＥＤＴＡ採血管を用い、健常人ボランティアから静脈血
を採取し、上記（１）−１）と同様の操作により血漿検
体（α−ＢＮＰ最小検出限界（４pg／ｍｌ）未満）を
得、それに上記分画を添加後、室温（２５℃）にて０、
２、６、２４時間放置し、ＢＮＰ免疫活性を、α−ＢＮ
Ｐを測定するためのシオノリアＢＮＰキットで測定し、
γ−ＢＮＰ誘導体の安定性を調べた。一方、上記と同様
の牛肺由来のアプロチニンを含まない健常人ボランティ
ア血漿に化学的に合成したα−ＢＮＰを添加後、４℃で
０、２、６、２４時間放置し、そのＢＮＰ免疫活性を同
様にシオノリアＢＮＰキットで測定し、α−ＢＮＰの安
定性を調べた。γ−ＢＮＰ誘導体およびα−ＢＮＰの血
漿検体中での免疫活性の安定性の結果を図４および図５
にそれぞれ示す。
【００２９】図４から、γ−ＢＮＰ誘導体は２５℃で２
４時間放置しても初期値の免疫活性に比較して有意な低
下が見られないのに対し、図５から、α−ＢＮＰは４℃
で２４時間放置した場合、初期値の約４０％にまで免疫
活性が低下することが分かる。以上から、α−ＢＮＰは
γ−ＢＮＰ誘導体よりも血液中で著しく不安定であり、
心疾患の診断には、後者が適することが示された。
４時間放置しても初期値の免疫活性に比較して有意な低
下が見られないのに対し、図５から、α−ＢＮＰは４℃
で２４時間放置した場合、初期値の約４０％にまで免疫
活性が低下することが分かる。以上から、α−ＢＮＰは
γ−ＢＮＰ誘導体よりも血液中で著しく不安定であり、
心疾患の診断には、後者が適することが示された。
【００３０】産業上の利用の可能性
上記のように心不全症例でのＢＮＰ値は健常者の数十倍
〜数百倍に増加することもあり、心不全におけるＢＮＰ
の変動は他のホルモンに類を見ないほど顕著であること
から、ＢＮＰ測定の有用性が示唆されている。本発明の
免疫測定法は、α−ＢＮＰは測定せずにγ−ＢＮＰ誘導
体を特異的に測定できる方法である。よって本発明測定
法によれば、従来のＢＮＰ測定により判断されていた心
不全診断およびモニタリング予後の判定とは異なる臨床
上の意義を提供できると考えられる。また、本発明測定
法の測定対象であるγ−ＢＮＰは本明細書にて初めて明
らかにされたように血中にて安定である。よって本発明
測定法は測定検体の採取法、保存法および測定までの時
間による影響を受けることなく安定な信頼性ある臨床デ
ータを提供でき、しかも採血試料に特別な処理を施す必
要がないので、簡便に臨床データが得られ、心疾患のさ
らなる正確な診断に貢献し得る。
〜数百倍に増加することもあり、心不全におけるＢＮＰ
の変動は他のホルモンに類を見ないほど顕著であること
から、ＢＮＰ測定の有用性が示唆されている。本発明の
免疫測定法は、α−ＢＮＰは測定せずにγ−ＢＮＰ誘導
体を特異的に測定できる方法である。よって本発明測定
法によれば、従来のＢＮＰ測定により判断されていた心
不全診断およびモニタリング予後の判定とは異なる臨床
上の意義を提供できると考えられる。また、本発明測定
法の測定対象であるγ−ＢＮＰは本明細書にて初めて明
らかにされたように血中にて安定である。よって本発明
測定法は測定検体の採取法、保存法および測定までの時
間による影響を受けることなく安定な信頼性ある臨床デ
ータを提供でき、しかも採血試料に特別な処理を施す必
要がないので、簡便に臨床データが得られ、心疾患のさ
らなる正確な診断に貢献し得る。
【００３１】
［図面の簡単な説明］
【図１】 α−ＢＮＰ測定系で測定した、血漿検体のＳ
uperdex７５によるゲルろ過ＨＰＬＣでのクロマトグラ
ム。図中、Ａはα−ＢＮＰの溶出位置を示す。
uperdex７５によるゲルろ過ＨＰＬＣでのクロマトグラ
ム。図中、Ａはα−ＢＮＰの溶出位置を示す。
【図２】 α−ＢＮＰ測定系で測定した、図１と異なる
血漿検体のＳuperdex７５によるゲルろ過ＨＰＬＣでの
クロマトグラム。図中、Ａはα−ＢＮＰの溶出位置を示
す。
血漿検体のＳuperdex７５によるゲルろ過ＨＰＬＣでの
クロマトグラム。図中、Ａはα−ＢＮＰの溶出位置を示
す。
【図３】 γ−ＢＮＰ特異的免疫測定法で測定した、図
２と同じ血漿検体のＳuperdex７５によるゲルろ過ＨＰ
ＬＣでのクロマトグラム。図中、Ａはα−ＢＮＰの溶出
位置を示す。
２と同じ血漿検体のＳuperdex７５によるゲルろ過ＨＰ
ＬＣでのクロマトグラム。図中、Ａはα−ＢＮＰの溶出
位置を示す。
【図４】 γ−ＢＮＰをヒト血漿中、２５℃で保存した
ときの保存時間と、ＢＮＰの免疫活性との関係を示すグ
ラフ。
ときの保存時間と、ＢＮＰの免疫活性との関係を示すグ
ラフ。
【図５】 α−ＢＮＰをヒト血漿中、４℃で保存した時
の保存時間と、α−ＢＮＰの免疫活性との関係を示すグ
ラフ。
の保存時間と、α−ＢＮＰの免疫活性との関係を示すグ
ラフ。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平３−297392（ＪＰ，Ａ)
特表 平７−507210（ＪＰ，Ａ)
ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ，1997年,
Ｖｏｌ．400， Ｎｏ．２，ｐ177−182
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/48 - 33/98
Claims (8)
- 【請求項１】 哺乳類のα−ＢＮＰに反応する第１の抗
体とプレプロＢＮＰもしくはγ−ＢＮＰ誘導体に反応す
るがα−ＢＮＰには反応しない第２の抗体とを用いるこ
とを特徴とする哺乳類のγ−ＢＮＰ誘導体に特異的な免
疫測定方法。 - 【請求項２】 γ−ＢＮＰ誘導体が、配列表の配列番号
１に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７−１
０２で示されるアミノ酸配列を包含するものである請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 第２の抗体が、配列表の配列番号１に記
載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２７−１０２で
示されるアミノ酸配列に特異的な抗体である請求項１記
載の方法。 - 【請求項４】 第１の抗体および第２の抗体のうち、少
なくとも一方が検出可能に標識されているか、あるいは
固相化されていることを特徴とする請求項１〜３のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項５】 検出可能な標識が放射性同位体、酵素、
蛍光物質、発光物質または粒子である請求項１〜３のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 哺乳類のα−ＢＮＰに反応する第１の抗
体とプレプロＢＮＰもしくはγ−ＢＮＰ誘導体に反応す
るがα−ＢＮＰには反応しない第２の抗体とを含むこと
を特徴とする、哺乳類のγ−ＢＮＰ誘導体に特異的な免
疫測定のためのキット。 - 【請求項７】 第１の抗体および第２の抗体のうち、少
なくとも一方が検出可能に標識されているか、固相化さ
れていることを特徴とする請求項６記載のキット。 - 【請求項８】 標識を検出する手段をさらに含むことを
特徴とする請求項７記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-246684 | 1997-09-11 | ||
| JP24668497 | 1997-09-11 | ||
| PCT/JP1998/004063 WO1999013331A1 (fr) | 1997-09-11 | 1998-09-10 | Procede de dosage immunologique pour bnp |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3516655B2 true JP3516655B2 (ja) | 2004-04-05 |
Family
ID=17152093
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000511064A Expired - Fee Related JP3516655B2 (ja) | 1997-09-11 | 1998-09-10 | Ｂｎｐの免疫測定法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6828107B2 (ja) |
| EP (1) | EP1016867B1 (ja) |
| JP (1) | JP3516655B2 (ja) |
| KR (1) | KR100563358B1 (ja) |
| CN (1) | CN1161609C (ja) |
| AT (1) | ATE315228T1 (ja) |
| AU (1) | AU731858B2 (ja) |
| CA (1) | CA2304263C (ja) |
| DE (1) | DE69833118T2 (ja) |
| DK (1) | DK1016867T3 (ja) |
| ES (1) | ES2256952T3 (ja) |
| NO (1) | NO325020B1 (ja) |
| WO (1) | WO1999013331A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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