CN116640675A - 一株过表达clb2的重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
一株过表达clb2的重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株过表达CLB2的重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法和应用。所述重组毕赤酵母基因工程菌是在出发毕赤酵母Komagataella phaffii GS115‑xyn中过表达细胞周期相关基因CLB2。本发明的重组毕赤酵母基因工程菌对比出发菌在发酵过程中，细胞的细胞周期随着发酵时间的增加，不断向G2/M期富集，G2/M期细胞的增多有助于毕赤酵母成膜能力的增强，而且改造后的毕赤酵母基因工程菌在连续发酵过程中发酵性能更高，产酶酶活性更强，在发酵上具有明显优势。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一株过表达CLB2基因的毕赤酵母菌及其构建方法与在产木聚糖酶中的应用。
背景技术
生物膜是自然界中微生物群落的一种形态。微生物聚集在一起，并分泌有机物，如多糖类物质覆盖其表面，形成一层膜状物质。微生物通过形成这种群落结构能够更好的适应外界环境，抵抗不利于生存的因素。在医学领域，由于致病菌常形成生物膜使得菌体耐药性提高，对于生物膜的研究已持续了较长的时间。而生物膜发酵作为一种新的固定化策略，具有优异的耐环境性、高产率和连续发酵等优点，在工业大生产中有着巨大的发展潜力。细胞周期是生命活动的基础，一般是指从一次细胞有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束期间的整个过程。细胞周期分为间期和分裂期(M期)，间期又分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)。有研究发现，在生物膜固定化发酵过程中，随着发酵批次的增加，细胞群不断向G2/M期富集，而包埋固定化的细胞则停滞在G1/G0期(Appl.Microbiol.Biot.,2020,104:7495-7505)。这说明细胞周期的状态与生物膜固定化发酵效果具有一定的关联性。但是，目前关于细胞周期与细胞生物成膜的调控关系研究较少，生物成膜效果与细胞周期状态关联性不明确。例如，Leszek Potocki等人(Genes,2020,11(8):848)的研究提到，用高浓度杀菌剂或杀虫剂(/>或/>)分别处理热带假丝酵母，虽然热带假丝酵母的生物膜形成均受到抑制，但细胞周期分析表明其G2/M期细胞数展现出不同的变化趋势。
巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。毕赤酵母作为高效表达外源蛋白的真核表达系统，具有遗传稳定、表达高效及对蛋白进行翻译后加工等优点，其在工业生产上有重要的应用前景，然而其生物成膜能力较弱，难以进行固定化连续发酵。CN113046256A通过构建了一株过表达HSF1的毕赤酵母基因工程菌，加强了毕赤酵母菌的生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，不能用于连续固定化发酵的问题。CN112592844A构建了一株过表达LMAN2的毕赤酵母基因工程菌，加强了毕赤酵母菌的生物成膜能力，解决现有技术中毕赤酵母菌成膜能力弱，不能用于连续固定化发酵的问题。上述两种方法都是通过基因工程的方法提高毕赤酵母菌的生物成膜能力使其适用于连续固定发酵，这促使本领域技术人员继续探究细胞周期与细胞生物膜的具体关系，从而更好的利用生物膜固定发酵，实现缩短发酵周期、循环使用细胞的目的。
发明内容
发明目的：为了探究细胞周期与细胞生物膜之间的关系，本申请提供一种过表达CLB2基因的重组毕赤酵母基因工程菌，利用其促进在发酵中生物被膜的形成，进而提高发酵效率和发酵能力。
本发明还要解决的技术问题是提供上述重组毕赤酵母基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组毕赤酵母基因工程菌的应用。
具体地，本发明公开了一种重组毕赤酵母基因工程菌，所述重组基因工程菌通过在出发毕赤酵母菌中过表达细胞周期相关基因CLB2得到，所述细胞周期相关基因CLB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述出发毕赤酵母菌为能够产木聚糖酶的毕赤酵母表达菌Komagataella phaffii GS115-xyn。
本发明公开了上述重组毕赤酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)以能够产木聚糖酶的毕赤酵母表达菌Komagataella phaffii GS115-xyn的基因组为模板，扩增出CLB2目的基因片段；
(2)将步骤(2)获得的CLB2基因片段克隆到线性化质粒pGAPZ A上，得到重组质粒pGAPZ A-CLB2；
(3)将步骤(2)获得的重组质粒线性化后导入毕赤酵母菌中，筛选得到重组毕赤酵母基因工程菌，命名为重组毕赤酵母基因工程菌CLB2*。
步骤(1)中，所述PCR扩增所用的引物其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
步骤(2)中，用限制性内切酶对获得质粒进行酶切验证，利用凝胶电泳对取得质粒进行可视化初筛。
步骤(3)中，利用含有100μg/mL Zeocin抗性的YPD平板筛选获得阳性转化子，得到过表达CLB2基因的重组毕赤酵母基因工程菌CLB2*。
本发明进一步提出了所述重组毕赤酵母基因工程菌在生物膜固定化发酵中的应用。本申请研究结果表明，所述过表达CLB2基因的重组毕赤酵母基因工程菌有利于细胞生物膜的形成，有望应用于生物膜固定化发酵中。
进一步地，本发明公开了上重组毕赤酵母基因工程菌在产木聚糖酶中的应用。
具体地，所述重组毕赤酵母基因工程菌通过固定发酵的方式产木聚糖酶。
其中，所述重组毕赤酵母基因工程菌的活化液接种到种子培养基中，将培养得到的种子液离心得到菌泥。在游离培养中，向发酵培养基中接入重组毕赤酵母基因工程菌菌泥，发酵，得到木聚糖酶酶液；在固定化发酵中，向含有固定化载体的发酵培养基中接入重组毕赤酵母基因工程菌菌泥，发酵，得到木聚糖酶酶液。
其中，所述固定化载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜中的任意一种或几种的组合；优选为棉纤维织物。
其中，所述固定化载体的用量为2-80g/L发酵培养基，优选为40g/L发酵培养基。
其中，所述的活化培养基中，各组分的浓度为蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-15g/L、葡萄糖10-30g/L、生物素0.1-5mg/L；优选为蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L、生物素0.4mg/L，溶剂为水。
其中，所述的种子培养基中，各组分的浓度为蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-15g/L、甘油5-15g/L、YNB 10-20g/L、磷酸氢二钾0.1-1g/L、磷酸二氢钾1-5g/L、生物素0.1-5mg/L，优选为蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、甘油10g/L、YNB 13.4g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、磷酸二氢钾1.18g/L、生物素0.4mg/L，溶剂为水。
其中，所述的发酵培养基中，各组分的浓度为：蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-15g/L、无氨基酵母氮源(YNB)10-20g/L、磷酸氢二钾0.1-1g/L、磷酸二氢钾1-5g/L、生物素0.1-5mg/L；优选为蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、YNB 13.4g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、磷酸二氢钾1.18g/L、生物素0.4mg/L，溶剂为水。
其中，所述活化液与种子液的培养为在28-30℃，200-300rpm条件下培养16-24h，优选为为在30℃，250rpm条件下培养24h。
其中，所述发酵液培养为28-30℃，200-300rpm条件下培养3-5d，优选为30℃，250rpm，5d。
优选地，在上述发酵过程中加入甲醇诱导木聚糖酶的表达。发酵过程中每24h加入甲醇，甲醇的加入量为发酵培养基的0.1-2％v/v。
有益效果：本发明公开了的重组毕赤酵母基因工程菌是在所述毕赤酵母菌中过表达细胞周期相关基因CLB2，该重组菌对比出发菌在发酵过程中，细胞的细胞周期随着发酵时间的增加，不断向G2/M期富集，成功使毕赤酵母成膜能力增强，木聚糖酶酶活增加。具体地，发酵至72h时，与出发菌相比，重组菌中停留在G2/M期的细胞数量高出33.70％；在单次固定化发酵条件下，毕赤酵母基因工程菌产木聚糖酶酶活是出发菌GS115-xyn的1.49倍；从固定化连续发酵结果可以看出，重组菌至少可以稳定发酵至第五批次，第五批次结束时，重组菌酶活仍可以到达1908.07U/mL的水平，而出发菌从第三批次开始，产酶酶活下降明显。由此看出，重组菌在固定化连续发酵上具有明显优势。
附图说明
图1为表达质粒pGAPZ A-CLB2示意图；
图2A为CLB2目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M为DL 2000DNA Marker，泳道1为目的基因CLB2；B为pGAPZ A载体片段的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M为DL 5000DNAMarker，泳道1为pGAPZ A载体片段；C为重组质粒pGAPZ A-CLB2电泳图，其中泳道M为DL5000DNA Marker，泳道1为重组质粒pGAPZ A-CLB2；
图3为重组菌CLB2*的验证图，其中泳道M为DL 2000DNA Marker泳道1为CLB2*阴性对照，泳道2为CLB2*验证基因片段，泳道3为CLB2*阳性对照；
图4为利用荧光显微镜检测出发菌GS115-xyn和重组菌CLB2*细胞爬片结果图，其中图A为出发菌GS115-xyn的细胞爬片检测图，图B为重组菌株CLB2*的细胞爬片检测图；
图5为出发菌和重组菌结晶紫染色法半定量测生物膜量实验结果图；
图6为出发菌与重组菌固定化单次发酵产木聚糖酶活力对比图；
图7为出发菌与重组菌连续固定化发酵产木聚糖酶活力对比图；
图8为出发菌与重组菌细胞周期对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1出发菌产木聚糖酶重组毕赤酵母GS115-xyn的构建
将来自厌氧真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶(PDB No.:3WP4_A)基因片段插入pPIC9K质粒EcoR I和Not I酶切位点之间，构建了pPIC9K-xyn质粒，密码子优化和质粒亚克隆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。使用Sal I限制性内切酶来线性化pPIC9K-xyn质粒，将线性化片段导入毕赤酵母GS115感受态细胞中，转化子在MD平板(MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源，0.4mg/L生物素，20g/L葡萄糖，20g/L的琼脂)上30℃培养至长出单菌落。将MD平板上的单菌落转接至含有4mg/mL G418的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)抗性平板上进行筛选，28-30℃培养2-3d至长出菌落。
将上述菌落转接至装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，在30℃，250rpm条件下培养24h，得到种子液。将种子液在4500rpm条件下离心5min，弃去上清，菌泥接入发酵培养基(500mL摇瓶，装液量100mL)当中，在30℃，250rpm条件下游离发酵。发酵过程中每隔24h加入1％v/v的甲醇(相对于发酵培养基的体积)进行木聚糖酶表达的诱导。取发酵72h后发酵液样品检测木聚糖酶的酶活为3025U/mL。出发毕赤酵母菌GS115-xyn构建成功，用于后续实验。
实施例2木聚糖酶活性的测定。
木聚糖酶酶活测定采用3.5-二硝基水杨酸(DNS)试剂法：木聚糖酶水解木聚糖(榉木)生成的单糖与3.5-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应，使用紫外分光光度法于540nm处检测吸光值，通过测定酶促反应所生成的还原性木糖来定量的计算酶活性。
测定方法如下：于0.225mL磷酸钾缓冲液中加入25μL适当稀释的酶液，再加入0.5mL的木聚糖底物，于50℃条件下准确反应15min后，加入1mL DNS试剂充分混合煮沸5min，反应液迅速用冷水冷却至室温，补加蒸馏水至5mL，以不加粗酶液的空白对照调零，于540nm处测吸光值。酶活定义为：在此测定的条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活单位(U/mL)。
木糖标准曲线的测定如下：
取10mL离心管，逐个加入各组分，进行木糖标准曲线的绘制。
其中，DNS试剂每升组分如下：3.5-二硝基水杨酸7.5g，氢氧化钠14.0g，酒石酸钾钠216.0g，苯酚5.0g，偏重亚硫酸钠6.0g，溶剂为水。
其中，木糖标准液每升组分如下：木糖10g，溶剂为水。
其中，磷酸钾缓冲液每升组分如下：三水磷酸氢二钾3g、磷酸二氢钾11.8g，溶剂为水。
其中，木糖标准曲线反应体系见表1。
表1木糖标准曲线反应体系
按上述体系，于10mL的离心管中逐个加入各组分；充分混匀后，置于沸水中煮沸5min，反应液迅速用冷水冷却至室温，补加蒸馏水至5mL，以空白对照调零，于540nm处测吸光值。以木糖含量为纵坐标，吸光值为横坐标，制作标准曲线，并拟合出回归方程。
实施例3CLB2基因过表达质粒的构建。
(1)以出发毕赤酵母GS115-xyn基因组为模板，利用普通PCR扩增得到CLB2基因片段(扩增引物序列CLB2-F、CLB2-R分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示)，PCR反应体系见表2，PCR反应条件如下：1)预变性94℃，5min；2)变性98℃，10s；3)退火55℃，5s；4)延伸72℃，15s，共35个循环；5)完全延伸72℃，10min。
表2目的基因CLB2扩增PCR体系
目的基因CLB2的扩增产物大小为1378bp(SEQ ID NO.1)，电泳图如附图2A所示。PCR产物经TAKARA胶回收试剂盒纯化后，用于后续实验。
(2)PCR获得线性化质粒pGAPZ A，扩增引物分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
PCR反应体系见表3，PCR条件：1)预变性94℃，5min；2)变性98℃，10s；3)退火50℃，15s；4)延伸72℃，10s，共35个循环；5)完全延伸72℃，10min。PCR产物经TAKARA胶回收试剂盒纯化后，用于后续实验。
表3线性化质粒pGAPZ A的扩增PCR体系
pGAPZ A片段的扩增产物大小为2857bp(SEQ ID NO.6)，电泳图如附图2B所示。PCR产物经TAKARA胶回收试剂盒纯化后，用于后续实验。
3、重组质粒的构建
将步骤1得到的目的基因片段与步骤2得到的pGAPZ A片段按照Peasy-BasicSeamless Cloning and Assembly Kit试剂盒的说明书的步骤相连接，得到重组质粒pGAPZA-CLB2。克隆反应体系见表4，在试剂盒中提供的Trans-T1感受态细胞中加入重组产物，在冰上放置30分钟，42℃水浴中热激30秒，之后马上转至冰上冷却2min。
表4连接反应体系
将上述得到的连接液转入到450μL LB培养基中，复苏后涂布于LB抗性平板(含25μg/mL Zeocin)，37℃培养12h至长出明显单菌落。
挑取上述平板单菌落，接种于LB液体培养基(含25μg/mL Zeocin)中37℃过夜培养12h后，提取质粒，经测序表明序列无误。
重组质粒大小为4066bp(SEQ ID NO.7)，pGAPZ A-CLB2示意图见附图1，其电泳图见附图2C。
实施例4构建过表达CLB2基因的毕赤酵母基因工程菌。
1、重组质粒的转化
使用AvrⅡ将质粒pGAPZ A-CLB2酶切线性化。
重组质粒pGAPZ A-CLB2线性化体系见表5。
表5重组质粒pGAPZ A-CLB2线性化体系
酶切的条件为37℃，1h，酶切反应结束后将酶切产物进行胶回收，用于后续的实验.
将上述线性化的的重组质粒pGAPZ A-CLB2导入GS115-xyn感受态细胞，其中，得到方法：将GS115-xyn甘油菌在YPD固体培养基上划线，30℃培养36-48h，长出明显单菌落后，接种单克隆于5mL的YPD液体培养基中，30℃，250rpm下培养至OD600为1。将菌液以2％的接种量接种至50mL新鲜无抗YPD液体培养基中继续进行培养，直至OD600达到1-1.5。于冰上静置10min后，离心收集菌体。用10mL预冷灭菌水重悬菌体，继续离心收集菌体，并重复该操作一遍。最后加入10mL预冷1M山梨醇溶液，轻柔重悬菌体，离心收集菌体，加0.5mL预冷1M山梨醇悬浮菌体，制备得感受态细胞。)中，在含有100μg/mL Zeocin的YPD平板上进行筛选，28-30℃培养2-3d至长出单菌落。
2、重组菌株CLB2*的验证
挑取上述单菌落，以引物5(SEQ ID NO.8)和引物6(SEQ ID NO.9)进行菌落PCR，验证重组菌基因组上是否含有Zeocin抗性基因片段。
PCR反应体系见表6。
表6重组菌株CLB2*的菌落PCR体系
按上述体系，每管50μL。
PCR条件：1)预变性94℃，5min；2)变性98℃，10s；3)退火55℃，5s；4)延伸72℃，15s，共35个循环；5)完全延伸72℃，10min。PCR产物以2.0％核酸胶验证。验证基因片段PCR产物大小为1287bp(SEQ ID NO.10)，重组菌验证结果电泳图如附图3所示。
实施例5生物膜的成膜表征检测。
图4是进行的细胞爬片实验，在6孔板中分别放入无菌盖玻片，加入5mL的YPD液体培养基和200μL的出发菌和重组菌的菌液，30℃培养3d，经4％多聚甲醛固定液固定后，在显微镜下观察细胞爬片。A和B分别是出发菌GS115-xyn和重组菌株CLB2*，可以明显看出重组菌株成膜效果比出发菌成膜效果好。
图5是进行的结晶紫染色法半定量测生物膜量实验，在每孔装有190μL的YPD的96孔板中分别加入10μL的出发菌和重组菌的菌液，培养到1-3d时，每隔24h用结晶紫染色法和酶标仪测其OD570。从图中可以看出重组菌株CLB2*成膜效果要比出发菌GS115-xyn好。
实施例6重组菌固定化单批次发酵产木聚糖酶实验。
1、活化培养基每升组分如下：蛋白胨20g、酵母粉10g、葡萄糖20g、生物素0.4mg，溶剂为水。
种子培养基每升组分如下：蛋白胨20g、酵母粉10g、甘油10g、YNB 13.4g、三水磷酸氢二钾0.3g、磷酸二氢钾1.18g、生物素0.4mg，溶剂为水。
发酵培养基每升组分如下：蛋白胨20g、酵母粉10g、YNB 13.4g、磷酸氢二钾0.3g、磷酸二氢钾1.18g、生物素0.4mg，溶剂为水，加入预处理过的棉纤维织物载体(40g/L发酵培养基)。其中，所述预处理为将棉纤维织物剪成4cm×4cm的正方形，用纯水洗净干燥后于乙醇中浸泡1h，再用纯水清洗后沸水浴30min后干燥。
2、活化：将CLB2*从-80℃冰箱取出，试管中准备5mL活化培养基，接种量50μL，于30℃摇床中培养24h，转速为250rpm。
转接：活化完成后分别倒入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，在30℃，250rpm条件下培养24h，得到种子液。
发酵：将发酵液分装于500mL摇瓶，装液量100mL，115℃，20min。将种子液在4500rpm条件下离心5min，弃去上清，菌泥接入发酵培养基当中，在30℃，250rpm条件下发酵5d。发酵过程中每隔24h加入1％v/v的甲醇(相对于发酵培养基的体积)进行木聚糖酶表达的诱导。
重组菌单次固定化发酵产木聚糖酶的酶活见附图6。同时，将重组菌更换为出发菌GS115-xyn，其余步骤同上，检测得发酵产物酶活见图6。从图6可以看出，相比于重组菌，出发菌固定化单次发酵所得的木聚糖酶酶活较低，在单次固定化发酵条件下，毕赤酵母基因工程菌产木聚糖酶酶活是出发菌GS115-xyn的1.49倍。
对比例1出发菌固定化单批次产酶
将实施例4中接入的重组菌更换为出发菌GS115-xyn，其余步骤同实施例5，检测得发酵产物酶活见图6。
实施例7生物膜固定化连续发酵实验。
第一批次活化、发酵步骤同例5，共进行5批次连续发酵，每一批次发酵时长为5d，24h取样一次测定发酵液酶活。每一批次发酵结束后将固定化载体在超净环境中转移至下一批灭菌发酵液中培养。固定化连续发酵实验结果如图7所示，从固定化连续发酵结果可以看出，重组菌至少可以稳定发酵至第五批次，第五批次结束时，重组菌酶活仍可以到达1908.07U/mL的水平。而出发菌从第三批次开始，酶活下降明显。
对比例2出发菌固定化产酶
将实施例6中接入的重组菌更换为出发菌GS115-xyn，其余步骤同实施例6，检测得发酵产物酶活见图7。
实施例8细胞周期检测。
1、样品处理
将实施例5、对比例1中发酵产物在6000rpm条件下离心5min，在处理好的样品中加入4℃预冷的PBS重悬细胞，6000rpm，2min，4℃离心收集细胞。在沉淀中缓慢加入-20℃预冷的70％乙醇重悬细胞，冰浴过夜。PBS重悬，6000rpm，2min，4℃离心收集细胞。
2、碘化丙啶染料染色上机：
碘化丙啶染色液的配制方法见表7
表7碘化丙啶染色液的配制方法
每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，室温避光孵育15-30min，染色完成后使用流式细胞仪进行细胞周期检测。
对比例3出发菌及重组菌细胞周期分布
将实施例5中发酵至72h样品检测细胞周期结果对比见图8。
从图8中可以看出，与出发菌相比，重组菌停留在G2/M期的细胞数量高出33.70％，过表达CLB2基因后的重组菌，随着发酵时间的增加，明显向G2/M期富集。
本发明提供了一种重组毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与在产木聚糖酶中增加生物膜的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一株过表达CLB2的重组毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述重组毕赤酵母基因工程菌通过在出发毕赤酵母菌中过表达细胞周期相关基因CLB2得到，所述细胞周期相关基因CLB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述出发毕赤酵母菌为能够产木聚糖酶的毕赤酵母表达菌Komagataella phaffii GS115-xyn。
2.权利要求1 所述的重组毕赤酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取毕赤酵母表达菌Komagataella phaffii GS115-xyn的基因组；
（2）以步骤（1）得到的基因组DNA为模板，扩增出CLB2基因片段；
（3）将步骤（2）获得的CLB2基因片段克隆到线性化质粒pGAPZ A上，得到重组质粒pGAPZA-CLB2；
（4）将步骤（3）获得的重组质粒线性化后转化至毕赤酵母感受态细胞中，筛选得到重组毕赤酵母基因工程菌，命名为重组毕赤酵母基因工程菌CLB2*。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）得到的重组质粒核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，利用含有Zeocin抗性的YPD平板筛选获得阳性转化子，得到过表达CLB2基因的重组毕赤酵母基因工程菌CLB2*。
5.权利要求1所述的重组毕赤酵母基因工程菌在生物膜固定化发酵中的应用。
6.权利要求1所述的重组毕赤酵母基因工程菌在发酵产木聚糖酶中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组毕赤酵母基因工程菌通过固定发酵的方式产木聚糖酶。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在固定化发酵中，向含有固定化载体的发酵培养基中接入包含所述重组毕赤酵母基因工程菌的菌泥，发酵，得到木聚糖酶酶液，其中，在发酵过程中加入甲醇诱导木聚糖酶的表达。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固定化载体为棉纤维织物、无纺布、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、沸石、细菌纤维素膜中的任意一种或几种的组合，固定化载体用量为2-80 g/L发酵培养基。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：蛋白胨10-30g/L、酵母粉5-15 g/L、无氨基酵母氮源10-20 g/L、磷酸氢二钾0.1-1 g/L、磷酸二氢钾1-5g/L、生物素0.1-5 mg/L，溶剂为水；发酵培养条件为：28-30℃，200-300 rpm条件下培养3-5d，发酵过程中每24 h加入甲醇，甲醇的加入量为发酵培养基体积的0.1-2%。
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