저분자 합성 화합물이나 또는 천연 화합물들은 쉽게 세포 내로 전달 될 수 있는 반면에 단백질, 펩티드, 및 핵산 같은 거대분자들은 분자량의 크기 때문에 이중 지질막 구조인 세포막 안으로 투과하지 못한다. 이러한 거대 분자들이 세포의 원형질막을 통과하지 못하는 취약점을 극복하기 위한 방법으로‘거대분자 세포 내 전송 기술(Macromolecule Intracellular Transduction Technology: MITT, 대한민국 공개특허 제10-2009-0103957호)이 개발되었다.
상기 기술의 경우 물질 전송 도메인이 소수성의 아미노산만으로 구성되어있어 heparan sulfate proteoglycans (HSPGs)등과 같이 음전하를 띠는 탄수화물과 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan)및 시알 산(sialic acid) 등과 같은 음전하를 띠는 당류에 적용 시 음전하와 친수성의 성격을 가지고 있는 세포막으로 접근하는 능력에 있어서 제한적일 수 있다.
본 발명자들은 상기 기술에 사용된 N-말단의 시그널 펩티드가 단백질의 후-번역 운반(post-translational transport)을 지시하는 짧은 펩티드이고, 다양한 단백질들에 대한 신호 펩티드의 일반적인 구조는 단백질의 시작 코돈인 M을 포함한 양친매성의 도메인으로 구성되어 있으며, 양친매성 분자는 두 개의 도메인: 친수성(극성) 도메인 및 소수성(비-극성) 도메인으로 구성되어 있는 것으로 정의할 수 있으므로, 시그널 펩티드의 양친매성의 특성을 고려해 볼 때, 두 개의 도메인으로서의 역할이 분명하기 때문에 시그널 펩티드의 연속성이 잘 보존되어있을 것이라고 예상하였다.
하지만, 양전하를 띄는 아미노산이 연속되었거나 연속된 또는 5개의 아미노산 서열에 3개 이상의 양전하를 띄는 아미노산이 포함된 서열이 소수성의 펩티드와 결합을 한다면 오히려 소수성의 펩티드가 직접 세포막을 투과하여 세포 안으로 전송되는 것이 아니라 PTD와 같이 식세포작용(endocytosis)에 의해 세포내로 전송될 것으로 예상하였다.
이러한 가설을 바탕으로, 본 발명자들은 기존에 발명된 소수성 거대분자 전달 도메인(MTD)에 양전하를 띄는 1~2개의 친수성(극성) 아미노산을 소수성 도메인에 적용하여 음전하를 띄고 있는 세포막으로의 접근성을 높임으로써, 결과적으로 보다 효율적으로 생물학적 활성 분자를 세포내로 전달하는 새로운 개량형 거대분자 전달 도메인을 제공함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 하기 식 1로 기재되는 펩티드로서,
A1은 메티오닌(M, Met)이고;
A2는 아르기닌(R, Arg), 히스티딘(H, His) 및 라이신(K, Lys)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
MTD는 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 펩티드:
[식 1]
A1-A2-MTD; 및 상기 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
상기 펩티드는 생물학적 활성 분자의 세포 내로의 운반을 매개할 수 있는 펩티드로서, 대한민국 공개특허 제 10-2009-0103957호에 기재된 MTD에 비해 우수한 세포 투과능을 나타내는 펩티드로, 본 발명에서는 이를 "개량형 MTD"라 명명하였다.
상기 펩티드는 서열번호 15 내지 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 펩티드는 대한민국 공개특허 제 10-2009-0103957호에서 개발된 193개의 거대분자 전달 도메인(MTD) 중에서, 정량화되어 상대 비교가 가능한 서열 중, 하기의 조건을 충족하는 서열인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다:
1) Proline의 위치가 서열의 중앙에 위치하고;
2) Signal P 프로그램을 이용한 세포 외 분비 유도 가능성 평가 결과값이, 각 도메인에 대해 60% 이상으로 평가되며;
3) Protparam 프로그램(http://web.expasy.org/protparam/ 참조)을 이용하여 평가된 aliphatic index가 100 내지 300 사이의 값으로 평가되고;
4) Protscale (Average flexibility) 프로그램(http://web.expasy.org/protscale/ 참조)을 이용하여 평가된 flexibility가 0.36 이상으로 평가되며;
5) Protparam 프로그램을 이용하여 평가된 hydropathicity가 3.0 이하로 평가되고;
6) Protparam 프로그램을 이용하여 평가된 instability index가 30 내지 60사이의 값으로 평가되며;
7) Protscale (polarity) 프로그램을 이용한 polarity의 평가 결과가 0.1 이상으로 평가되는 서열.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 서열번호 5의 아미노산 서열은 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 서열번호 6의 아미노산 서열은 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열은 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있는데, 상기 DNA는 cDNA 및 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 만약 단일 가닥이라면, 이는 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있다. 상기 코딩 서열은 서열번호 36 내지 56으로부터 선택되는 염기 서열과 동일할 수 있고, 또는 다른 코딩 서열일 수 있는데, 상기 코딩 서열은, 유전적 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 중복성(redundancy)의 결과로서, 동일한 폴리펩티드를 인코딩한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 상기에 기술된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함하는데, 이는 서열번호 15 내지 35의 연역된(deduced) 아미노산 서열을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드의 단편, 유사체, 및 유도체를 인코딩한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 자연적으로 발생하는 대립(allelic) 변이체 또는 폴리뉴클레오티드의 비-자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 36 내지 56으로부터 선택되는 염기 서열을 특징으로 하는 코딩 서열의 자연적으로 발생하는 대립 변이체인 코딩 서열을 가질 수 있다. 대립 변이체는, 인코딩되는 폴리뉴클레오티드의 기능을 실질적으로 변경하지 않는, 하나 이상의 뉴클레오티드들의 치환, 결실, 또는 부가를 가질 수 있는 폴리염기 서열의 교대(alternate) 형태이다.
단일 아미노산이 하나 이상의 뉴클레오티드 코돈에 의해 인코딩될 수 있고 상기 폴리뉴클레오티드가 동일한 펩티드를 인코딩하는 교대 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 용이하게 변형될 수 있음이 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 앞서 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 교대 염기 서열을 포함한다. 상기 청구된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 상기 청구된 서열과 청구된 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 위치한 임의의 아미노산들의 임의의 조합을 인코딩하는 염기 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 개량형 MTD를 이용하여 세포 투과성을 갖도록 생물학적 활성 분자를 유전적으로 조작하는 방법에 관한 것이다.
생물학적 활성 분자의 치료적 용도는 이들의 낮은 세포 투과성에 의해 종종 제한된다. 생물학적 활성 분자가 세포내 이입(endocytic) 과정을 통해 세포 내로 유입되는 것처럼 보인다고 하더라도, 이러한 방식으로 세포 내로 들어오는 분자는 일반적으로 세포내 이입 소포(vesicle) 내에 포획되고 리소좀(lysosome) 내에서 분해된다.
본 발명의 개량형 MTD는 기존 MTD에 비해 효과적인 세포 투과능을 갖는 것으로 나타났다. 본 발명의 개량형 MTD는 키트의 형태로 제공될 수 있는데, 이는 표적 폴리펩티드에 대한 펩티드의 연결을 용이하게 하기 위해 당업계의 숙련자에게 공지된 필요한 구성요소를 포함한다. 이러한 방식으로 개량형 MTD에 부착되는 표적 단백질은 이어서 세포내 유입을 위하여 in vitro 또는 in vivo로 세포에 전달될 수 있다.
상기에 기술된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 개량형 MTD의 작용에 의해 세포의 외부에서 내부로 유입될 수 있는 단백질을 생산하도록 단백질 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.
발현 벡터는 생물학적 활성 분자로서 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 관심 대상의 전장 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 N-말단 및/또는 C-말단 방향으로, 그리고 거대분자 전달 도메인과 표적 생물학적 활성 분자로 이루어지는 재조합 단백질이 발현될 수 있도록 정확한 해독틀(reading frame) 내로 개량형 MTD를 인코딩하는 핵산 서열을 도입하기 위해 유전적으로 조작된다. 발현 벡터는 원핵(prokaryotic) 또는 진핵(eukaryotic) 발현 시스템에서 사용하기에 손쉽게 이용가능한 것들 중에서 선택될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, MTD는 세포의 외부로부터 내부로 표적 단백질의 세포내 운반을 지시하는, 거대분자 전달 도메인이고, 개량형 MTD는 기존 MTD에서 세포 투과능이 향상된 거대분자 전달 도메인이다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 개량형 MTD는 세포막을 관통하여 세포의 내부로 펩티드 또는 폴리펩티드의 유입을 매개하는 교대 서열을 포함할 수 있다.
표적 단백질은 일반적으로 세포막을 관통하는 최적 이하의 투과성을 나타내지만, 본 발명의 개량형 MTD의 N-말단 및/또는 C-말단에 부착되면, 세포의 외부로부터 내부로 운반되는 단백질이다.
상기 표적 단백질은 개량형 MTD와 표적 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 전장 단백질 사이에 절단 부위(cleavage site)가 위치할 수 있으며, 이는 대안적으로 대상 펩티드 또는 폴리펩티드로부터 개량형 MTD를 물리적으로 제거하기 위해 재조합 단백질의 절단과 관련하여 당업계의 숙련자에게 공지되어 있는 인자(factor) X 부위 또는 다른 부위일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성 분자"는, 세포 내로 유입되는 경우, 생물학적 효과를 나타낼 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 약 100,000 내지 약 100만 범위의 분자량을 갖는 매우 큰 단백질들(예컨대, 항체, 피브리노겐, 및 마크로글로불린)은 세포에 의해 유출(export)되기 때문에, 매우 큰 단백질들은 본 발명의 방법에 의해 세포 내로 유입될 수 있다. 생물학적 활성 분자의 예시에는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드가 포함되고, 이들은 성장인자(growth factor), 효소, 전사인자(transcription factor), 독소, 항원 펩티드(백신용), 항체, 및 항체 단편과 같은, 생물학적 활성 분자의 기능적 도메인이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 생물학적 활성 분자의 부가적인 예시에는 플라스미드(plasmid), 코딩 핵산 서열, mRNAs 및 안티센스 RNA 분자와 같은 핵산, 탄수화물, 지질 및 당지질이 포함된다. 생물학적 활성 분자의 다른 예시에는 질병의 진단, 치료 및/또는 예방, 구체적으로 낮은 세포막 투과성을 갖는 것들이 포함된다. 이러한 치료제의 일부 예시에는 다우노루비신(Daunorubicin)과 같은 항암제, 및 이 방법에 의해 투여될 때 사용될 수 있는 보다 낮은 투여량으로 인해, 더 안전하게 투여될 수 있는, 독성 화합물이 포함된다. 생물학적 활성 분자의 또 다른 예시는 항원성(antigenic) 펩티드이다. 항원성 펩티드는 면역반응에 관여하는 세포에 의해 유입될 때 면역학적 보호를 제공하도록 투여될 수 있다. 다른 예시에는 면역억제(immunosuppressive) 펩티드(예컨대, 당업계에 공지된, 자가반응(autoreactive) T 세포를 차단하는 펩티드)가 포함된다. 수많은 다른 예시들이 숙련된 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 적합한 생물학적 활성 분자의 대표적인 예시에는 이들의 기능면에서 효소, 호르몬, 운반 단백질 면역글로불린 또는 항체, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질 및 저장 단백질; 및 이들의 위치 및 역할면에서 막 또는 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 또는 분비 단백질, 바이러스 단백질, 선천성(native) 단백질, 당단백질, 절단된 단백질, 이황화 결합을 갖는 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질 및 프리온(prions)이 포함될 수 있다.
표준 재조합 핵산 방법이 유전적으로 조작된 재조합 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 개량형 거대분자 전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 예컨대, 적합한 신호 및 처리(processing) 서열 및 전사 및 번역을 위한 조절 서열을 갖는, 핵산 발현 벡터 내로 클로닝 될 수 있으며, 단백질은 자동화(automated) 유기 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 단백질을 생산하기 위한 합성 방법은, 예를 들어, 문헌[Methods in Enzymology, Volume 289: Solid-Phase Peptide Synthesis by Gregg B. Fields (Editor), Sidney P. Colowick, Melvin I. Simon (Editor), Academic Press (1997)]에 기술되어 있다.
클로닝된 유전자 또는 핵산, 예컨대 MTD를 인코딩하는 cDNA의 높은 수준의 발현을 얻기 위하여, MTD 서열은 전형적으로 전사를 유도하는 강력한 프로모터, 전사/번역 종결인자(terminator), 및 단백질을 인코딩하는 핵산의 경우에는, 전사 개시를 위한 리보솜 결합 부위(ribosome binding site)를 포함하는 발현 벡터 내로 서브클로닝(subcloned)될 수 있다. 적합한 세균성 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989)]에 개시되어 있다. 본 발명의 개량형 MTD를 발현하기 위한 세균성 발현 시스템은 예컨대, 대장균(E. coli), 바실러스 종(Bacillus sp.), 및 살모넬라(Salmonella)(Palva 등, Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach 등, Nature 302: 543-545 (1983))에서 이용가능하다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트가 상업적으로 이용가능하다. 포유동물 세포, 효모, 및 곤충 세포용 진핵 발현 시스템이 당업계에 잘 알려져 있고 또한 상업적으로 이용가능하다. 상기 진핵 발현 벡터는 아데노바이러스(adenoviral) 벡터, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated) 벡터, 또는 레트로바이러스(retroviral) 벡터일 수 있다.
일반적으로 본 발명의 개량형 MTD의 N-말단, C-말단 또는 양말단에 단백질을 부착한 세포 투과성 재조합 단백질을 발현하기 위한 발현 벡터는 예를 들어, 거대분자 전달 도메인을 인코딩하는 서열에 작동적으로(operably) 부착된, 프로모터를 포함하는 조절 서열을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 유도성(inducible) 프로모터의 비-제한적인 예시에는 스테로이드-호르몬 반응성 프로모터(예컨대, 엑디손(ecdysone)-반응성, 에스트로겐(estrogen)-반응성, 및 글루타코르티코이드(glutacorticoid)-반응성 프로모터), 테트라사이클린(tetracycline) "Tet-On" 및 "Tet-Off" 시스템, 및 금속-반응성 프로모터가 포함된다. 상기 컨스트럭트(construct)는 적합한 숙주 세포, 예컨대, 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 조직 배양 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 컨스트럭트는 또한 모델 대상으로서 형질전환(transgenic) 유기체를 형성하기 위하여 배아 줄기 세포 내로 도입될 수 있다. 매우 많은 적합한 벡터 및 프로모터가 당업계의 숙련자에게 공지되어 있으며 본 발명의 재조합 컨스트럭트를 형성하기 위해 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 적합한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 벡터를 제작하기 위해 공지된 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법에는 in vitro 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 in vivo 재조합/유전적 재조합이 포함된다. 예를 들어, 이러한 기술은 문헌[Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (2001); 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)]에 기술되어 있다.
세포 투과성 재조합 단백질을 생산하기에 적합한 숙주 세포에는 세균 세포 및 진핵 세포(예컨대, 진균, 곤충, 식물, 및 포유동물 세포)가 포함된다. 숙주 세포는 냉동-해동 순환(freeze-thaw cycling), 초음파처리(sonication), 기계적 파괴, 또는 세포 용해제(cell lysing agents)의 사용을 포함하는, 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다. 문헌[Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, New York: Springer-Verlag (1994)]은 재조합 (및 비-재조합) 단백질을 정제하기 위한 수많은 일반적인 방법을 기술한다. 상기 방법으로, 예컨대 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 크기-배제(size-exclusion) 크로마토그래피, 친화성(affinity) 크로마토그래피, 선택적 침전, 투석, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피가 포함될 수 있다. 이들 방법은 세포 투과성 재조합 단백질을 위한 정제 전략을 고안하도록 개조될 수 있다. 만약 상기 세포 투과성 재조합 단백질이 에피토프 태그(epitope tag) 또는 금속 킬레이트(chelating) 서열과 같은, 정제 도구(handle)를 포함한다면, 친화 크로마토그래피가 상기 단백질을 손쉽게 정제하는데 사용될 수 있다.
생산된 단백질의 양은 직접적으로(예컨대, 웨스턴(Western) 분석 이용) 또는 간접적으로(예컨대, 전기영동 운동성 이동 분석(electrophoretic mobility shift assay) 특이적 DNA 결합 활성에 대해 세포 유래 물질을 분석함에 의해) 거대분자 전달 도메인을 검출함으로써 평가될 수 있다. 단백질은 정제 전에, 정제의 임의의 단계 중에, 또는 정제 후에 검출될 수 있다. 일부 실행에서는, 정제 또는 완벽한 정제가 필요하지 않을 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 유전적으로 조작된 재조합 단백질은 세포 투과성 단백질이고, 특히 사멸된 또는 약독화된(attenuated) 전(whole) 유기체 백신이 실용적이지 못한 경우에, 단백질-계 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포 투과성 단백질은 또한 다양한 질환 특히 면역질환, 또는 암의 치료에 사용될 수 있다. 세포 투과성 단백질은 재조합 벡터로 세포를 형질감염(transfect) 또는 형질전환(transform)시키는 필요성을 배제하면서, 세포의 내부로 전달될 수 있다. 본 발명의 세포 투과성 단백질은 단백질 기능을 조사하기 위해 in vitro 상에서 사용될 수 있거나 세포를 바람직한 상태로 유지하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 개량형 MTD는 in vitro 또는 in vivo로 표적 세포의 내부에 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 단백질을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 상기 개량형 MTD는 재조합 DNA 또는 RNA 분자로부터 재조합 단백질의 발현에 의해 형성된 펩티드 결합(linkage)을 통해 표적 단백질에 부착될 수 있거나 MTD에 공유적으로 부착되는 링커(linker)에 의해 표적 단백질에 부착될 수 있다. 공유 결합은 세포 내로의 유입을 위하여, 폴리뉴클레오티드와 같은, 비-단백질 분자에 본 발명의 개량형 MTD를 부착하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 세포막 투과성을 갖는 단백질을 유전적으로 조작하는 방법은 세포 내로 치료적 단백질 생성물을 전달하는 수단을 제공한다. 본 발명과 세포외 단백질 전달의 이전에 기술된 방법과의 조합은 제어-분비(controlled-release) 방식으로 안정화된, 기능성 형태로 세포 내로의 유입을 위한 단백질을 전달하는 방법을 제공한다.
폴리펩티드가 적합한 발현 벡터 및 발현 시스템을 이용하여 제조된다. 세포 투과성이 상기 발현된 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 위치한 MTD와 재조합 단백질의 발현에 의해 단백질 또는 폴리펩티드에 부여된다. 덜 안정한 단백질은 당업계의 숙련자에게 공지되고 앞서 기술된 방법에 의해 안정화된다. 세포외 환경으로의 전달은 마이크로스피어(microsphere) 담체와 같은, 적당한 담체 내에 안정화된 재조합 단백질을 제공함으로써 달성된다. 정선한 단백질은 적당한 안정화 및 전달 기술뿐만 아니라, 적당한 벡터 및 발현 시스템을 지정할 것이다. 약물 전달 시스템 분야의 통상의 지식을 가진 자는 기술된 것들로부터 적당한 기술을 선택할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포막"은 세포외 공간으로부터 세포 또는 세포 집단을 분리하는 지질-함유 장벽(lipid-containing barrier)을 지칭한다. 세포막은 원형질막, 세포벽, 세포내 소기관(organelle) 막, 예컨대 미토콘드리아막, 핵막 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성 분자"는 체계 내에서 생물학적 반응을 촉발시키거나 변형시킬 수 있는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 생물학적 활성 분자의 비-제한적인 예시에는 항체(예컨대, 단일클론, 키메라(chimeric), 인간화(humanized) 등), 콜레스테롤, 호르몬, 항바이러스제(antivirals), 펩티드, 단백질, 화학요법제(chemotherapeutics), 소분자, 비타민, 보조인자(co-factors), 뉴클레오시드(nucleosides), 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 효소적(enzymatic) 핵산, 안티센스 핵산, 삼중체 형성(triplex forming) 올리고뉴클레오티드, 2,5-A 키메라(chimeras), siNA, siRNA, miRNA, RNAi 억제제, dsRNA, 알로자임(allozymes), 앱타머(aptamers), 이들의 유인물(decoys) 및 유사체가 포함된다. 본 발명의 생물학적 활성 분자는 또한 다른 생물학적 활성 분자. 예를 들어, 지질 및 폴리아민(polyamines), 폴리아미드(polyamides), 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 폴리에테르와 같은 중합체의 약물동태학(pharmacokinetics) 및/또는 약동학(pharmacodynamics)을 조절할 수 있는 분자를 포함하다. 특정 실시형태에서, 용어 생물학적 활성 분자는 용어 "거대분자"와 호환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "거대분자"는 펩티드, 단백질, 및 생물학적 또는 합성 기원의 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드로 예시되는 큰 분자(1000 달톤 이상의 분자량)를 지칭하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "펩티드"는 단일 사슬의 D- 또는 L-아미노산 또는 펩티드 결합에 의해 연결된 D- 및 L-아미노산의 혼합물로 만들어진 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 펩티드는 두 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고 길이가 약 50개 아미노산 이하이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 부착된 선형적으로(linearlly) 배열된 아미노산들로 구성되지만, 펩티드와는 달리, 뚜렷한(well-defined) 형태를 갖는다. 펩티드와는 대조적으로, 단백질은 바람직하게는 50개 이상의 아미노산 사슬을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "폴리펩티드"는 하나 이상의 펩티드 결합을 포함하는 두 개 이상의 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드가 뚜렷한 형태를 갖는지 여부와 상관없이, 폴리펩티드는 펩티드 및 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "핵산"은, 예를 들어 그들 모두가 단일 또는 이중 가닥 형태인 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어지는, RNA 또는 DNA의 유사체뿐만 아니라, 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 및 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)과 같은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
아미노산 잔기는 이들의 표준 1-문자 또는 3-문자 표시법에 의해 또는 이들의 완전한 이름에 의해 본원에서 언급된다: A, Ala, 알라닌; C, Cys, 시스테인; D, Asp, 아스파르트산; E, Glu, 글루탐산; F, Phe, 페닐알라닌; G, Gly, 글리신; H, His, 히스티딘; I, Ile, 아이소류우신; K, Lys, 라이신; L, Leu, 류우신; M, Met, 메티오닌; N, Asn, 아스파라긴; P, Pro, 프롤린; Q, Gln, 글루타민; R, Arg, 아르기닌; S, Ser, 세린; T, Thr, 트레오닌; V, Val, 발린; W, Trp, 트립토판; X, Hyp, 하이드록시프롤린; 및 Y, Tyr, 티로신.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "거대분자 전달 도메인(MTD)"은 세포 내로 거대분자의 운반을 용이하게 하는 펩티드를 지칭한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당업계의 통상적인 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명을 실행하거나 검사하는데 사용될 수 있다고 하더라도, 특정 방법 및 물질이 본원에 기술된다. 본원에 언급된 모든 간행물은 상기 간행물이 인용된 것과 관련하여 방법 및/또는 물질을 기술하고 설명하기 위해 그 전체로서 참고로 본원에 포함된다. 본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an", 및 "the"는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 online으로 분석 가능한 PEP FOLD server 서비스 프로그램으로 MTD 펩티드에 EGFP 형광 단백질의 N-말단 서열을 융합한 서열을 이용하여 시그널 펩티드로부터 파생된 세포투과성 펩티드 선행 특허 ‘공개번호 10-2009-0103957: 신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도’에 공지된 거대 분자 전달 도메인(MTD)의 구조적 특징이 훼손되지 않음을 증명하였다(도 1 내지 도 4 참조).
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, MTD 펩티드의 세포투과성을 정량적으로 결정하기 위하여 MTD에 FITC 형광물질을 연결한 복합체를 제조하였으며, FITC-MTD 펩티드를 세포에 처리한 후 유세포측정(flow cytometry)기로 분석하였다. 분석결과, 기존의 MTD보다 본 발명을 통해 개선된 MTD에서 보다 높은 형광 신호를 나타내었으며, 더불어, MTD가 PTD(protein transduction domain)에 비해 매우 효율적으로 FITC를 세포 내로 전달하였음을 확인함으로써, 개선된 MTD의 세포 내 침투 효과를 입증하였다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, MTD에 FITC 형광물질을 연결한 복합체를 사용하여 공초점 현미경(Confocal Microscope) 분석을 통하여 세포투과성 및 세포 내 국소화(Intracellular Localization)를 시각적으로 확인하였다. 그 결과, 유세포측정 결과와 동일하게 기존의 MTD보다 개선된 MTD에서 높은 세포투과성을 나타내었으며, 역시 MTD가 PTD(protein transduction domain)에 비해 세포투과도가 높음을 확인 할 수 있었다.
아울러, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, MTD2173A와 융합된 LacZ siRNA-Cy3의 경우, 마우스를 이용하여 정맥으로 투여한 결과 폐의 조직 투과성을 공초점 현미경 분석을 통하여 시각적으로 확인하였으며, 이와 더불어 적출한 폐의 조직을 X-gal 염색을 수행한 후 현미경으로 관찰한 결과, LacZ siRNA에 의해 마우스에서 지속적으로 발현되는 베타갈락토시다제 단백질 생성이 감소되었음을 확인함으로써, 개선된 MTD의 장기 조직내 침투 효과를 입증하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 개량형 MTD의 고안을 위한, 대상 MTD 펩티드의 선별
본 발명자들은 기존에 본 발명자들에 의해 개발된 기술인 대한민국 공개특허 제110-2009-0103957호)에서 개발된 193개의 MTD 중에서, 정량화되어 상대 비교가 가능한 서열 중 하기의 조건을 충족하는 서열에서 전송능 개량을 위한 대상 MTD 서열을 선별하였다.
상기 선별을 위한 조건은 하기와 같다.
1) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, proline의 위치가 서열의 중앙에 위치하는 서열을 선별한다.
2) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 세포 외 분비 유도 가능성이 높은 서열을 선별한다.
3) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 aliphatic index의 특정 수준을 만족하는 서열을 선별한다.
4) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 flexibility가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별한다.
5) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 hydropathicity가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별한다.
6) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 instability index가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별한다.
7) 거대분자 전달 도메인의 서열 중, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 polarity가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별한다.
이를 구체적으로 설명하면 하기와 같다.
특정한 대표 서열을 선별하기 위하여, 상기 단계 1)에 기술된 바와 같이, 프롤린의 유무와 그 위치에 근거하여 대표 서열을 결정하였다. 거대 분자 전달 도메인의 서열을 구성하는 아미노산인 알라닌, 발린, 프롤린, 류신 및 아이소류신 중, 곁가지의 서열이 짧고 크기가 작은 프롤린은 아미노산 서열의 이차구조 형성의 자유도에 영향을 미치며 이는 거대분자 전달 도메인의 세포막 투과에 기여한다. ‘대한민국 공개번호 제10-2009-0103957호: 신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도’에 공지된 거대 분자 전달 도메인 (MTD) 중, 이를 구성하는 서열 상에 프롤린이 존재하며 그 프롤린의 위치가 거대분자 전달 도메인의 아미노산 서열의 중앙에 위치하여 아미노산 서열의 이차구조 형성의 자유도가 높을 것으로 분류되는 49개 거대분자 전달 도메인을 결정하였다.
이어서, 단계 1)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 세포 외 분비 가능성이 높은 서열을 선별하였다. 일부 수용성 단백질은 수송을 매개하는 수용체와 상호작용 할 수 있는 신호를 갖고 있는데, 신호 매개 수송에서 단백질은 전달되는 타겟을 지정하는 하나 또는 그 이상의 신호서열을 가지고 있다. 따라서, 세포 외 분비 유도 서열과 유사성이 높으면 전송능을 향상시킬 수 있다는 가정 하에 Signal P 프로그램을 이용하여 세포 외 분비 유도 가능성을 평가하였다. 각 도메인에 대해 10 % 에서 90 % 사이의 가능성이 평가되는데, 단계 1)에서 결정된 거대분자 전달 도메인 중, 60 % 이상으로 평가된 서열을 개량형 대상 서열로 선별하였다.
이어서, 단계 2)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 단계 3)에 기술된 바와 같이, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 aliphatic index의 특정 수준을 만족하는 서열을 선별하였다. Aliphatic index는 아미노산의 곁가지의 탄소 체인에 의해 결정되는 전체 분자의 부피를 결정하는 물리적 특징으로 거대분자 전달 도메인이 세포막을 투과할 때 세포막의 구조를 변형하는 특징으로서 평가된다. Aliphatic index는 거대분자 전달 도메인의 아미노산 서열의 각각의 고유한 값과 전체 서열의 평균으로 결정되며, Protparam 프로그램(http://web.expasy.org/protparam/ 참조)을 이용하여 결정되었다. Protparam 프로그램은 아미노산으로 구성되는 단백질 내지 펩티드의 물리적 특성을 수치화하여 나타내는 유용한 도구로써 aliphatic index는 100에서 300 사이로 평가된 서열을 전송능 개량을 위한 대표 서열로 선별하였다.
이어서, 단계 3)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 단계 4)에 기술된 바와 같이, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 flexibility가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별하였다. Flexibility는 거대분자 전달 도메인의 N 말단의 아미노산과 C 말단의 아미노산 사이의 상관 정도 및 자유도를 의미하는 물리화학적 특징으로 구조적으로 유연성을 부여하고, 세포막에 대한 친화력과 연관되어 있다. Flexibility는 아미노산 서열의 길이와 아미노산의 곁가지 서열의 구성에 따라 평가되며, Protscale (Average flexibility) 프로그램(http://web.expasy.org/protscale/ 참조)을 이용하여 평가되었다. Protscale 프로그램은 아미노산으로 구성되는 단백질 내지 펩티드의 물리적 특성을 수치화하여 나타내는 도구로 이용되었으며, 단계 3)에서 결정된 거대분자 전달 도메인 중, Protscale (Average flexibility) 프로그램을 이용한 flexibility의 평가 결과가 0.36 이상으로 평가된 서열을 전송능 개량을 위한 대표 서열로 선별하였다.
이어서, 단계 4)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 단계 5)에 기술된 바와 같이, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 hydropathicity가 특정 수준을 만족하는 서열을 선별하였다. Hydropathicity는 아미노산의 고유한 특징에 의해 결정되는 물리적 특징으로 물성을 결정하는 특징으로 여겨지며, 3.0 이상에서 심각한 엉김현상을 초래하는 것으로 알려져있다. 또한, Hydropathicity는 거대분자 전달 도메인의 아미노산 서열의 각각의 고유한 값과 전체 서열의 평균으로 결정되며, Protparam 프로그램을 이용하여 평가하였다. 이에 1.3 에서 3.8 사이의 값으로 나타나는 hydropathicity 결과중 단계 4)에서 선별한 거대분자 전달 도메인 내에서 hydropathicity가 3.0 이하로 평가된 서열을 개량을 위한 대표 서열로 결정하였다.
이어서, 단계 5)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 단계 6)에 기술된 바와 같이, 거대분자 전달 도메인의 instability index가 특정 수준을 만족하는 서열을 결정하였다. Instability index는 아미노산 서열의 안정성을 의미하는 특성으로 서열 상의 아미노산의 배열 순서에 의해 결정되며 그 수치가 높을수록 불안정성을 갖는다. 이는 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소로 도메인의 세포내 안정성에 영향을 미치는 특징으로 여겨지며, Protparam 프로그램을 이용하여 평가하였다. 이에 분석결과 instability index 0 에서 130 사이의 값으로 나타나는 거대분자 전달 도메인중 단계 5)에서 결정된 거대분자 전달 도메인 내에서 instability index가 30 에서 60 사이에 위치한 서열을 개량을 위한 대표 서열로 선별하였다.
이어서 단계 6)에서 선별된 거대분자 전달 도메인 중에서 단계 7)에 기술된 바와 같이, 거대분자 전달 도메인의 물리화학적 특성을 결정하는 요소인 Polarity가 특정 수준을 만족하는 서열을 결정하였다. Polarity는 아미노산의 구성 성분 중 탄소 사슬의 길이 및 수산기의 유무로 판단되는 것으로 물에 대한 친화도를 나타내는 척도이다. 이는 hydropathicity와 함께 거대분자 전달 도메인의 물성을 결정하는 특징이며 세포막에 대한 친화도에도 영향을 미치는 것으로 생각된다. Polarity는 거대분자 전달 도메인의 아미노산 서열 각각의 고유한 값과 전체 서열의 평균으로 결정되며, Protscale (polarity) 프로그램을 이용하여 평가되었다. 이에 단계 6)에서 결정된 거대분자 전달 도메인 중, Protscale (polarity) 프로그램을 이용한 polarity의 평가 결과가 0.1 이상으로 평가된 서열을 개량을 위한 대표 서열로 선별하였다.
구체적으로, 대한민국 공개특허 제10-2009-0103957호에 기재된 거대 분자 전송 도메인 중 개량형 MTD의 고안을 위한 대상 MTD인 JO-103(서열번호 3)는 하기 과정에 의해 결정되었다.
i) ‘대한민국 공개특허 10-2009-0103957: 신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도’에 공지된 거대 분자 전달 도메인 (MTD) 중, JO-103은 LALPVLLLA의 서열로 구성되어 있고;
ii) Singal P 프로그램을 이용한 세포 외 분비 가능성 평가에서 90 %의 가능성을 보이며;
iii) Protparam 프로그램을 이용한 aliphatic index 평가에서 271의 값을 나타내고;
iv) Protscale 프로그램을 이용한 flexibility 평가에서 0.38로 평가되며;
v) Protparam 프로그램을 이용한 hydrophobicity 결정에서 2.8로 결정되고;
vi) Protparam 프로그램을 이용한 instability index 결정에서 52로 결정되며;
vii) Protscale 프로그램을 이용한 polarity 평가에서 0.13으로 평가되므로,
따라서, 전송능 개선을 위한 대상 서열로 결정된 JO-103은 상기 7단계를 모두 만족하는 대상 도메인임을 알 수 있다.
동일한 방식을 통해, 개량형 MTD의 고안을 위한 5개의 대상 MTD가 선별되었으며, 구체적으로, 선별된 대상 MTD는 MTD JO-018(서열번호 1), MTD JO-067(서열번호 2), MTD JO-103(서열번호 3), MTD JO-159(서열번호 4) 및 MTD JO-173(서열번호 5)이다.
이중 MTD JO-173번에 대하여 프롤린의 위치를 변경하여 추가적인 유연성을 확보하고; 중간단계 펩티드인 MTD 173A(서열번호 7)를 제작하였으며, 이렇게 제작된 MTD 173A도 상기 7단계의 선별 조건을 모두 만족하므로, 개량형 MTD의 고안을 위한 대상 MTD 서열에 포함하였다.
또한, 대상으로 선별된 MTD 중 JO-18번에 대하여 서열을 hydropathicity가 낮은 아미노산으로 치환하여 물성을 개선하고자 중간단계 펩티드 MTD 18m(서열번호 6)을 도출하였으며, 이 역시 상기 7단계의 선별 조건을 만족하고 있어, 개량형 MTD의 고안을 위한 대상 MTD 서열에 포함하였다.
실시예 2. 개량형 MTD의 고안
상기 실시예 1에서 선별된 7개의 대상 MTD를 토대로, 1~2개의 친수성(극성) 아미노산을 첨가하여 소수성 도메인에 적용하여 세포막으로의 접근성을 높임으로써, 보다 효율적으로 생물학적 활성 분자를 세포내로 전달하는 새로운 개량형 거대분자 전달 도메인을 제작하고자 하였으며, 이를 통해 하기의 식 1로 기재되는 펩티드를 고안하였다;
[식 1]
A1-A2-MTD:
A1은 메티오닌(M, Met)이고;
A2는 양전하를 띠는 아르기닌(R, Arg), 히스티딘(H, His) 및 라이신(K, Lys)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며;
MTD는 상기 실시예 1에서 선별된 서열번호 1 내지 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 7개의 아미노산 서열.
상기 식 1을 통해 고안된 개량형 MTD의 서열은 서열번호 15 내지 35에 기재된 아미노산 서열과 같으며, 고안된 아미노산 서열을 토대로 펩티드를 합성하여 그 세포 투과능을 확인하였다.
실시예 3. 개량형 MTD의 2차구조 분석
상기 실시예 2에서 고안된 개량형 MTD의 서열에 대하여, PEP FOLD server 프로그램을 이용하여 2차 구조를 분석하였다.
그 결과, 도 1 내지 도 4에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 2에서 고안된 개량형 MTD가 대한민국 공개특허 제10-2009-0103957호(신규한 거대분자 전달 도메인 및 이의 동정 방법 및 용도)에 공지된 거대 분자 전달 도메인(MTD)의 구조적 특징을 훼손시키지 않고, 세포막의 투과성을 높일 수 있는 α-helix 구조를 유지하고 있음을 확인하였다.
실시예 4. 개량형 MTD의 합성
상기 실시예 2에서 고안된 개량형 MTD의 합성은 일반적인 Fmoc SPPS (solid phase peptide synthesis)방법을 이용하여 C-term 부터 하나씩 커플링(coupling) 하였다.
구체적으로 먼저, 펩티드의 C-말단 첫 번째 아미노산이 레진(resin)에 부착된(attached) 것을 사용하였다. 사용가능한 레진은 NH2-Lys(Dde)-2-chloro-Trityl 레진, NH2-Met-2-chloro-Trityl 레진, 또는 NH2-Ser(tBu)-2-chloro-Trityl 레진 중에서 필요에 따라 적절한 레진을 선정하여 합성에 사용하였다.
둘째, 펩티드합성에 사용하는 모든 아미노산 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu 등으로 보호된 것을 사용하였다 (Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Met-OH). 특수 아미노산의 경우에는 Fmoc-Lys(Ac)-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH를 사용하였다.
셋째, 20% piperidine in DMF를 이용하여 상온에서 5분간 2회 반응하여 Fmoc을 제거하였다.
넷째, DMF, MeOH, MC, DMF 순으로 세척하였다.
다섯째, 합성된 펩티드를 레진에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 TFA/EDT/Thioanisole/TIS/H2O=90/2.5/2.5/2.5/2.5을 사용한다 (TFA = trifluoroacetic acid, EDT = 1,2-ethanedithiol, TIS = triisopropylsilane). 마지막으로 HPLC로 정제 후, 질량 분석기(mass spectromoter)로 확인하고 동결건조하여 개량형 MTD를 얻었다.
또한, 형광물질(FITC)이 붙은 MTD를 합성하기 위하여 상기의 합성방법으로 MTD 합성을 진행한 후에 마지막으로 라이신(K, Lysine)을 추가하여 펩티드합성을 진행한 후 라이신의 프리 아민 잔기에 FITC를 결합시켰다. 합성된 MTD-FITC를 레진에서 분리하고 HPLC로 정제 후, 질량분석기로 펩티드의 분자량을 확인하고 동결건조하여 MTD-FITC 를 제조하였다. 이후, 합성된 개량형 MTD-FITC는 차광 상태에서 1 mM 농도가 되도록 멸균증류수로 녹인 후 1.5 mL 원심분리용 용기에 소량으로 분주하고 사용직전까지 냉동보관 하였다.
실시예 5. 유세포 측정을 이용한 개량형 MTD의
in vitro
세포 투과능 확인
본 발명의 개량형 MTD와 기존 MTD(개량형 대상 MTD)의 in vitro 세포 투과성을 확인하기 위하여, 유세포 측정을 이용하였다.
구체적으로 1, 5 또는 10 μM 농도의 MTD에 FITC를 labelling하여, 합성한 시료를 대장암 유래세포(HCT116, Human colon cancer, Cat No. CCL-247, ATCC, USA)에 각각 처리하고, 4 시간 동안 배양하였다. 상기 HCT116 세포를 10% 우태아혈청 (Fetal bovine serum: FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units penicillin 및 10,000 μg/mL streptomycin, Invitrogen)을 함유하는 RPMI1640 배지에, 5% CO2의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 배양이 종결된 후, 각각의 시료가 처리된 HCT116 세포의 세포막에 노출되어 있는 유리 MTD-FITC를 제거하기 위해 트립신을 처리하고, 냉장 보관한 인산완충용액(Phosphate buffer)으로 3회 세척하였다.
세척한 세포를 회수하여, 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 분석 (FACS Calibur , Beckton-Dickinson, San Diego CA, USA)에 적용하였다. 각각의 시료에 대하여, 세포(1X104)를 셀퀘스트 프로 세포측정 분석(CellQues Pro cytometric analysis) 소프트웨어를 이용하여 개량한 MTD-FITC와 기존 MTD-FITC의 세포투과성을 정량적으로 비교분석 하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었으며, 구체적으로, 유세포측정(flow cytometry) 분석 결과를 나타낸 도 5에서 회색으로 채워진 곡선은 세포 단독을 나타내고, 녹색 곡선은 1 μM의 처리농도군, 주황색 곡선은 5 μM의 처리농도군, 적색 곡선은 10 μM 처리농도군의 세포투과성을 나타낸다.
도 5에서 보는 바와 같이, 10 μM의 MTD-FITC의 기하 평균(Geometric mean) 값을 비교해 보았을 때 개량형 MTD가 기존 MTD보다 최소 140%에서 최대 270%까지 높은 형광신호를 나타내었으며, 개량형 MTD의 경우 낮은 농도에서도 높은 농도의 기존 MTD와 비슷한 수준으로 세포투과도가 향상되었음을 보여주고 있다.
이를 통해, 본 발명에서 고안된 개량형 MTD는 기존 MTD에 비해 세포의 원형질막-침투 능력이 현저히 향상되었음을 알 수 있다.
실시예 6. 유세포 측정을 이용한 개량형 MTD의
in vitro
세포 투과능 확인(HEK293 cell)
추가적으로, 인간 배아의 신장세포에서 유래한 HEK293 cell에 대하여, 유세포 측정을 이용하여 in vitro 세포 투과성을 확인하였다. 본 발명의 개량형 MTD와 선행의 공지된 MTD에 FITC를 연결한 각각의 시료와 세포투과성이 낮다고 간주되는 scrambled peptide 및 세포투과성이 이미 검증된 kFGF4에서 유래한 MTS (Marcomolecule Transduction Sequence)를 대조군으로 사용하여 실험하였다.
구체적으로, 5 μM 농도의 시료를 인간 배아의 신장세포(HEK293, Human embryonic kidney)에 각각 처리하고, 6시간 동안 배양하였다. 상기 HEK293 세포를 10% 우태아혈청 (Fetal bovine serum: FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units penicillin 및 10,000 μg/mL streptomycin, Invitrogen)을 함유하는 RPMI1640 배지에, 5% CO2의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 배양이 종결된 후, 각각의 시료가 처리된 HCT116 세포의 세포막에 노출되어 있는 유리 MTD-FITC를 제거하기 위해 트립신을 처리하고, 냉장 보관한 인산완충용액(Phosphate buffer)으로 3회 세척하였다.
세척한 세포를 회수하여, 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 분석 (FACS Calibur , Beckton-Dickinson, San Diego CA, USA)을 위해 세포(1X104)를 셀퀘스트 프로 세포측정 분석(CellQues Pro cytometric analysis) 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행하였다. 개량한 MTD-FITC와 선행기술의 MTD-FITC의 세포투과성을 정량적으로 비교분석 하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었으며, 그 결과 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 JO-103 MTD 펩티드는 개량 후 150~190 %의 세포투과성 향상이 확인되었으며, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 JO-159 MTD 펩티드는 개량 후 180-210 %의 향상된 세포투과성을 나타냄을 확인하였다. 또한, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 JO-173A MTD 펩티드를 개량한 MTD 펩티드의 경우, 190-230 %까지 세포투과성이 개선되었음을 확인하였다,
이를 통해, 본 발명에서 고안된 개량형 MTD는 기존 MTD에 비해 세포투과능이 현저히 향상되었음을 알 수 있다.
실시예 7. 공초점 레이저 주사 현미경을 이용한 개량형 MTD의
in vitro
세포 투과능 확인
본 발명의 기존의 MTD 대비 개량형 MTD의 기능성 개선을 확인하기 위하여, 피부 유래 세포와 암 유래 세포에 대하여 공초점 레이저 주사현미경을 이용한 가시적 세포투과성을 확인하였다.
7-1. 피부 유래 세포에서 세포 투과능 확인
피부 유래 세포로는 피부 유래 각질형성세포 (HaCaT cell, immortalized human keratinocyte, Cat No. 300493, CLS, Germany)를 이용하였고, 대조군으로는 세포투과성이 없는 scrambled peptide와 세포투과성이 있다고 간주되는 Tat 및 MTS를 함께 실험하였다.
구체적으로, 실험 전일 HaCaT 세포를 글래스 커버슬립이 들어있는 12-웰 플레이트(12-well culture plate) 내에서 24 시간동안 배양한다. HaCaT 세포는 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum: FBS), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units penicillin 및 10,000 μg/mL streptomycin, invitrogen)을 함유하는 DMEM 배지에서, 5% CO2의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. HaCat 세포에 5 μM의 농도로 각각의 펩티드를 1시간 동안 처리한 후, 세포투과도 관찰을 위하여 세포를 실온에서 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde, PFA)로 20 분간 고정하고, 이를 공초점 현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, 도 7 내지 도 9와 같이 본 발명의 펩티드 개량을 통해 개량형 MTD 의 세포투과능이 현저히 개선되었음을 가시적으로 확인하였다.
7-2. 자궁경부암 세포에서 세포 투과능 확인
암 유래 세포로는 자궁경부암 유래 세포인 HeLa 세포(HeLa cell, Human cervix adenocarcinoma, Cat No. CCL-2, ATCC, USA)에 대하여, 공초점현미경(confocal microscopy, Carl Zeisse , Germany)을 이용하여 세포 투과능을 비교하였다.
구체적으로, 실험 전일 HeLa 세포를 글래스 커버슬립이 들어있는 12-웰 플레이트(12-well culture plate) 내에서 24 시간동안 배양한다. HeLa 세포는 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum: FBS), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units penicillin 및 10,000 μg/mL streptomycin, invitrogen)을 함유하는 DMEM 배지에서, 5% CO2의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. HeLa 세포에 5 μM의 농도로 각각의 MTD-FITC를 6시간 동안 처리 하였다. 처리 6시간 후, 현미경 관찰을 위하여 세포를 실온에서 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde, PFA)로 20 분간 고정하였다.
내재화된(internalzed) MTD-FITC의 직접적인 검출을 위하여 상기 세포를 인산완충용액으로 3회 세척하고 핵 형광 염색 용액인 5 μM 농도의 DAPI( 4',6-diamidino-2-phenylindole)로 대조염색(counterstain)을 수행하였다. 10 분간의 DAPI 염색 후, 상기 세포를 인산완충용액으로 3회 세척하고 단백질의 형광표지를 보존하기 위해 20 ㎕의 중첩 배지(mounting media)를 슬라이드 위에 점적하고 관찰하였다. 상기 각각의 MTD-FITC가 처리된 세포는 세포 내 전달부위의 구별이 용이하도록 DAPI 염색을 통해 핵으로의 전달 및 세포투과성 여부를 확인하였다. 또한 공초점 현미경 관찰 시 노마스키 필터(nomarski filter)를 이용하여 세포의 원형을 관찰하였으며, FITC 형광 및 DAPI 형광을 각각의 플루오로크롬(fluorochrome)에 맞는 필터로 관찰하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 실험에 사용한 기존 MTD 펩티드(18m, 67, 103, 159 및 173) 보다 개량형 MTD들이 세포내 전송능이 현저히 우수하다는 것을 알 수 있었다. 또한, 펩티드가 세포막 바깥에 부착되어 있는 PTD(Tat) 결과와는 다르게 실험에 사용한 개량형 MTD(1018m, 1067, 1103, 1159, 1173A, 2103, 및 2159)들은 분명하게 세포질내로 분포되는 것을 확인하였으며, 이를 통해, 본 발명에서 새롭게 고안한 개량형 MTD의 세포투과능이 현저히 개선되었음을 암세포에서도 가시적으로 확인하였다.
실시예 8. 개량형 MTD의
Ex vivo
피부 조직 투과능 확인
본 발명의 개량형 MTD의 Ex vivo 조직 투과 능력을 분석하기 위하여, EpiOral 피부 모델(MatTek, MA, USA)을 사용하여, FITC를 접합시킨 기존 MTD(18m, 173)와 개량형 MTD(1018m과 1173A)를 선별하여 처리하고, 공초점현미경(confocal microscopy, Carl Zeisse , Germany)을 이용하여 가시적으로 관찰하였다.
구체적으로, 실험 전일 MatTek사에서 제공하는 실험 배지가 0.5 ml 들어있는 12-웰 플레이트(12-well plate)에 EpiOral 피부 모델을 15시간 동안 5% CO2의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 다음날 새로운 배지로 교환하고, 50 μM 농도의 각각의 MTD 40 ㎕를 EpiOral 피부 위쪽에 처리하고 5 시간동안 5% CO2의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)에 15시간 이상 넣어 EpiOral 피부모델을 고정한 후, 마이크롬 냉동박절기(Microm HM520 cryostat, Thermo)를 이용하여 동결절편(Cryosection)(6 μm)을 제조하고, 이를 글래스 슬라이드 위에 올려 현미경 관찰용 슬라이드를 제작하였다. 제작된 슬라이드는 10분 동안 인산완충용액으로 절편을 세척하고 0.5 mM DAPI 용액으로 5분간 조직 내 세포핵을 염색하였다. 염색된 조직을 다시 10분간 3번씩 인산완충용액으로 세척한 후, 중첩배지(mounting media)를 이용하여 슬라이드에 고정한 뒤 공초점 현미경으로 관찰하였고 그 결과를 도 11에 나타내었다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 음성 대조군(Vehicle)에서는 어떠한 유의미한 수준의 형광도 관찰되지 않은 반면, 실험에 사용한 개량형 MTD의 경우 시간이 경과함에 따라 EpiOral 피부모델 안쪽으로 투과가 일어나는 것을 확인하였다. 또한, 실험에 사용한 기존 MTD(18m, 및 173)에 비해 개량형 MTD(1018m, 및 1173A)에서 보다 효과적으로 심부 조직까지 전달되었을 뿐 아니라, 형광의 밝기도 증가되는 것을 확인하였다.
실시예 9. 개량형 MTD의
in vivo
피부 조직 투과능 확인
본 발명의 개량형 MTD의 in vivo 피부 조직 투과 능력을 분석하기 위하여, 8주령의 암컷 ICR mouse (오리엔트바이오, 한국)를 대상으로 개체 당 2.5 cm X 2.5 cm 크기의 멸균거즈에 형광표시자 (FITC)가 부착된 개량형 MTD(M1067)-FITC, Tat-FITC 및 FITC 단독을 각각 100 ㎍의 농도의 용액 100 ㎕를 점적하여 마우스 등 부위에 Tegarderm (3M, USA)를 이용하여 고정시켰다. 1, 3, 6, 12 시간 경과 후, 마우스를 경추탈골의 방법으로 희생시키고, 약물이 도포된 부위의 피부를 적출하였다. 이후, 4% paraformaldehyde에 24시간 이상 넣어 조직을 고정한 다음, 6 ㎛ 두께로 냉동 절편을 얻어 슬라이드를 제작하였다. 제작된 슬라이드는 10분 동안 PBS 완충용액으로 절편을 세척하여 0.5 mM DAPI 용액에 5분 간 노출하여 조직 내 세포핵을 염색하였다. 염색된 조직을 다시 10분 간 3번씩 PBS 완충용액으로 세척을 한 후, 중첩 배지 (mounting media)를 이용하여 고정한 후에 공초점 현미경으로 관찰하였으며, 이를 도 12에 나타내었다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 음성대조군 (vehicle)에서는 형광신호가 전혀 검출되지 않았으며, FITC 단독 및 Tat-FITC 처리군에서는 피부 최상위층인 각질층에 형광신호가 특이적으로 관찰되는 것을 통해 피부 투과가 일어나지 않았음을 확인하였다. 반면, 실험에 사용한 개량형 MTD인 MTD 1067의 경우, 도포 시간이 경과함에 따라 깊은 조직까지 피부 투과가 일어났으며, 투과된 펩티드는 피부 모낭세포의 세포질에도 특이적으로 존재하는 것을 확인하였다. 이로써 본 발명의 개량형 MTD가 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 에서도 현저하게 우수한 조직 투과능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 10. 개량형 MTD에 acetylhexapeptide를 연결한 펩티드 복합체의
in vitro
세포투과능 확인
본 발명의 개량형 MTD의 방향성 및 cargo의 조합에 따른 세포투과능을 비교하기 위하여, 저분자 펩티드 acetylhexapeptide를 연결한 펩티드 복합체를 합성 제조하고, 이의 in vitro 세포 투과능 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세포투과능 확인을 위해 사람의 피부 유래 악성흑색종 세포 (A375SM, human melanoma, KCLB No. 80004, KCLB, Korea)를 이용하였고, 저분자 펩티드로 Acetyl Hexapeptide (AH, 주름개선 및 노화 방지기능의 6개 아미노산으로 구성된 펩티드)를 적용하였으며, 개량형 MTD로는 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 M1067 펩티드와 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지는 M1103 펩티드를 이용하였다.
구체적으로, 실험 전일 A375SM 세포를 글래스 커버슬립이 들어있는 12-웰 플레이드(12-well culture plate) 내에서 24 시간 동안 배양한다. A375SM 세포는 10 % 우태아혈청 (Fetal Bovine Serum: FBS), 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신 (10,000 units penicillin 및 10,000 μg/mL streptomycin, Invitrogen)을 함유하는 MEM 배지에서 5 % CO2의 습윤(humidified) 대기 하에서 37 ℃로 배양하였다. A375SM 세포에 5 μM의 농도로 MTD가 연결되어 있지 않은 AH와 개량형 MTD가 연결된 MTD-AH를 6 시간 동안 처리하였다. 펩티드 처리 후, 시험 물질의 세포투과도 관찰을 위하여 세포를 실온에서 4 % 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde, PFA)로 20분간 고정하였다.
내재화된(internalized) MTD-AH의 직접적인 검출을 위하여 상기 세포를 인산완충용액으로 3회 세척하고 핵 형광 염색 용액인 5 μM 농도의 DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)로 대조염색(counterstain)을 수행하였다. 10분간의 DAPI 염색 후, 상기 세포를 인산완충용액으로 3회 세척하고, 세포막 염색 용액인 5 μg/mL 농도의 Con A (Concanavalin A)로 추가 대조염색을 수행하였다. 10분간의 Con A 염색 후, 상기 세포를 인산완충용액으로 3회 세척하고, 단백질의 형광표지를 보존하기 위해 20 μL의 중첩 배지(mounting media)를 슬라이드 위에 점적하고 관찰하였다. 상기 각각의 처리된 세포는 세포내 전달부위의 구별이 용이하도록 DAPI와 Con A 염색을 통해 핵으로의 전달 및 세포투과성 여부를 확인하였다. 또한 공초점 현미경 관찰 시, 노마스키 필터 (nomarski filter)를 이용하여 세포의 원형을 관찰하였으며, FITC 형광 및 DAPI 형광, Con A 형광을 각각의 플루오로크롬 (fluorochrome)에 맞는 필터로 관찰하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 개량형 MTD인 M1067이 acetylhexapeptide에 정방향으로 연결된 M1067F-AH와 acetylhexapeptide의 c-term에 역방향으로 연결된 M1067R-AH 또한, 개량형 MTD인 M1103의 아미노산 서열이 acetylhexapeptide에 정방향으로 연결된 M1103F-AH와 acetylhexapeptide의 c-term에 역방향으로 연결된 M1103R-AH가 MTD가 연결되지 않은 acetylhexapeptide 대조군에 비하여, 세포투과성이 현저히 우수하게 나타남을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명에서 고안된 개량형 MTD는 생물학적 활성 분자에 부착됨에 있어, 상기 개량형 MTD의 아미노산 서열이 정방향으로 연결되거나, 역순으로 배열된 형태로 부착될 경우에도 우수한 세포투과능을 나타내므로, 그 연결방향에 의해 제한되지 않음을 알 수 있었다.
실시예 11. 개량형 MTD의
in vivo
폐 조직투과능 확인
11-1. siRNA가 결합된 MTD의 제조
본 발명의 개량형 MTD의 in vivo 폐 조직 투과 능력 분석을 위해 우선적으로 siRNA가 결합된 MTD를 제조하였다. 이때, 펩티드와 siRNA의 공유결합은 solulink사의 Oligonucleotide/peptide conjugation 방법에 따라 4FB-siRNA와 HyNic-펩티드를 이용하여 공유결합을 진행하였다.
구체적으로 먼저, DMF 용액에 S-4FB(N-succinimidyl-4-formylbenzamide)를 용해시키고 LacZ siRNA와 LacZ siRNA 농도의 20배가 되게 S-4FB를 conjugation buffer(100 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, pH 6.0)에 넣은 후 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 혼합물에 존재하는 잉여 S-4FB와 완충용액 교환을 위하여 탈염 정제(desalting purification)를 진행하였다.
둘째, DMF에 6-Boc-Hynic (succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide)과 HBTU (O-Benzotriazol-1-yl-tetramethyluroniume)를 용해시키고 DiPEA(diisopropylethylamine)를 넣은 후, 즉시 Fmoc로 protection된 펩티드레진에 첨가하였다. 1시간 동안 반응을 시킨 후 Hynic-펩티드Resin에서 분리하기 위해 TFA/TIS/acetone/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5)을 사용하였다. HPLC로 정제 후, MS 확인을 통하여 Hynic-peptide를 준비하였다.
셋째, 준비된 4FB-modified LacZ siRNA와 이의 molar 비율 5배에 해당하는 Hynic-펩티드를 TurboLink Catalyst Buffer (10 mM Phosphate, 15 mM Sodium Chloride, 10 mM aniline, pH 6.0) 용액에서 혼합하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다.
마지막으로, Sartorius Vivaspin diafiltration을 이용하여 반응물에서 잉여 펩티드를 제거하고 2% NuSieve GTG 아가로즈 젤(argarose gel)로 확인한 후 질량분석기로 분자량을 확인하고 동결 건조하여 siRNA-peptide 공유결합체를 제조하였다.
11-2. 개량형 MTD의
in vivo
폐 조직 투과능 확인
본 발명의 개량형 MTD의 in vivo 조직 투과 능력의 분석을 위하여, 베타갈락토시다제가 지속적으로 발현되는 B6 ROSA26 마우스에 상기 실시예 10-1의 방법으로 제조된 개량형 MTD 2173A에 융합된 LacZ-siRNA-Cy3 200 ug/head를 3일간 정맥으로 투여하고, 이틀 후에 마우스를 희생시켜 폐를 적출하였다. 적출된 폐는 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)에 15시간 이상 넣어 고정한 후, 동결절편(Cryosection)을 마이크롬 냉동박절기(Microm HM520 cryostat, Thermo)를 이용하여 제조하고, 이를 글래스 슬라이드 위에 올려 현미경 관찰용 슬라이드를 제작하였다. 제작된 슬라이드는 10분 동안 인산완충용액으로 절편을 세척하고 0.5 mM DAPI 용액으로 5분간 조직 내 세포핵을 염색하였다. 염색된 조직을 다시 10분간 3번씩 인산완충용액으로 세척한 후, 중첩 배지(mounting media)를 이용하여 고정한 뒤 공초점 현미경으로 관찰하였고, 그 결과는 도 15에 나타내었다. 이후, 상기와 같이 제작된 슬라이드를 X-gal 염색용액에서 밤 동안 반응시킨 이후 헤마토자일렌에오신 염색(HE staining)으로 조직을 염색시킨 다음 베타갈락토시다제 활성을 관찰하였고, 그 결과는 도 16에 나타내었다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 음성 대조군(Vehicle)에서는 어떠한 유의미한 수준의 형광도 관찰되지 않은 반면, 실험에 사용한 MTD-LacZ siRNA-Cy3의 경우, 폐 조직의 세포 내의 투과가 일어나는 것을 관찰할 수 있었다.
또한, 도 16에 나타난 바와 같이, 음성 대조군에서는 대부분의 장기 절편 전반에 베타갈락토시다제 활성이 관찰되었지만, MTD-LacZ siRNA-Cy3를 투여한 마우스 장기 절편에서의 경우, 베타갈락토시다제 활성이 거의 관찰되지 않음을 확인하였다.
이를 통하여, 본 발명의 개량형 MTD는 세포내 전달이 어려운 siRNA와 같은 물질 또는 약물의 전달에 사용할 수 있으며, 이를 장기 조직내에 효과적으로 전달시킬 뿐 아니라, 전달된 물질 또는 약물이 전달된 조직 내에서 그 효능을 효과적으로 발휘할 수 있음을 알 수 있다.
이로써 본 발명에서 고안된 개량형 MTD는 기존 MTD보다 세포내 투과능 뿐만 아니라 in vivo 조직내 투과능 또한 향상되었음을 알 수 있었다.
실시예 12. 피부 생리 활성이 물질이 결합된 개량형 MTD의 피부 안전성 평가
12-1. 개량형 MTD-쿠마릭산의 합성
N-말단의 아미노산까지 커플링 된 상기 실시예 4에서 합성된 개량형 MTD(M1067)에 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(Piperidine/N-methylpyrrolidone) 용액을 가하여 Fmoc기를 제거하고 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichloromethane)으로 세척한 다음 상업적으로 판매되고 있는 화합물인 쿠마릭산(coumaric acid, Sigma, USA)을 커플링시켰다. 커플링이 끝난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichlorometnane)으로 여러 번 세척한 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산 : 페놀 :치오아니솔 : 물 : 트리이소프로필실란 (trifluoroacetic acid: phenol: thioanisole: water: triisopropylsilane)의 90 : 2.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 (v/v) 용액으로 2 내지 3시간 반응시켜 펩타이드 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드가 결합된 쿠마릭산을 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩티드를 침전시켰다. 쿠마릭산의 C의 9번 탄소에 결합된 알코올기를 보호하고 있는 벤질기를 제거하기 위하여 10% Pd/C을 메탄올에 첨가하고, 수소 하에서 약 1시간 동안 실온에서 교반한 후, 셀라이트를 사용하여 Pd/C를 제거하고 얻은 여액을 감압 농축하였다. 이렇게 얻은 개량형 MTD-쿠마릭산 유도체는 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토나이트릴를 구배로 하여 정제 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(purified reverse phase high performance liquid chromatography column, Zobax, C8 300Å, 21.1mm X 25cm)을 이용하여 정제함으로써 하기 식 2에서와 같이 서열번호 16번의 아미노산 서열을 갖는 개량형 MTD에 쿠마릭산이 결합된 개량형 MTD-쿠마릭산 유도체를 합성하였다.
[식 2]
(4-Hydroxycinnamoyl) Ala Ala Val Ala Pro Ala Ala Ala Arg Met
12-2. 개량형 MTD-아세틸펜타펩티드의 합성
N-말단의 아미노산까지 커플링 된 상기 실시예 4에서 합성된 서열번호 16번 아미노산 서열을 갖는 개량형 MTD(M1067)에 화장품업계에서 상업적으로 사용되고 있는 펩타이드인 아세틸펜타펩티드 (acetylated Lys Ther Ther Lys Ser)를 순차적으로 합성하고, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(Piperidine/N-methylpyrrolidone) 용액을 가하여 Fmoc기를 제거하고 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichloromethane)으로 여러 번 세척한 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) : 페놀(phenol) : 치오아니솔(thioanisole) : 물(water) : 트리이소프로필실란(triisopropylsilane)을 90 : 2.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 (v/v) 비율로 혼합한 용액으로 2 내지 3시간 반응시켜 펩티드 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩티드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩티드를 침전시켰다. 이렇게 얻은 개량형 MTD-아세틸펜타펩티드 유도체는 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토나이트릴를 구배로 하여 정제 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(purified reverse phase high performance liquid chromatography column, Zobax, C8 300Å, 21.1mm X 25cm)을 이용하여 정제함으로써 하기 식 3에서와 같이 서열번호 16번 아미노산 서열을 갖는 개량형 MTD(M1067)에 아세틸펜타펩티드가 결합된 아세틸펜다펩티드 유도체를 합성하였다.
[식 3]
Met Arg Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Lys* Ther Ther Lys Ser
* : acetylated lysine
12-3. 개량형 MTD(M1067)-쿠마릭산 함유 화장료 조성물의 제조
개량형 MTD(M1067)-쿠마릭산 또는 개량형 MTD(M1067)를 함유한 에센스 조성물은 상기 표 1의 조성으로 아래와 같이 제형화하였다.
수상용해조에 1 ~ 6을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 7 ~ 11을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 12, 13, 15을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 개량형 MTD(M1067)-쿠마릭산을 함유하는 조성물을 제조하였다.
비교예 1 : 수상용해조에 1 ~ 6을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 7 ~ 11을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 12 ~ 14을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 개량형 MTD(M1067)를 함유하는 조성물을 제조하였다.
비교예 2 : 수상용해조에 1 ~ 6을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 7 ~ 11과 16을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 12, 13을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 쿠마릭산을 함유하는 조성물을 제조하였다.
표 1
개량형 MTD(M1067)-쿠마릭산 함유 에센스 조성(단위 : 중량 %) No | 원 료 | 실시예 12-1 | 비교예 1 | 비교예 2 |
1 | 정제수 | 84.480 | 84.480 | 64.480 |
2 | 알코올 | 0.000 | 0.000 | 20.000 |
3 | 글리세린 | 5.000 | 5.000 | 5.000 |
4 | 디프로필렌 글리콜 | 3.000 | 3.000 | 3.000 |
5 | 알라토인 | 0.100 | 0.100 | 0.100 |
6 | 다이소디움 이디티에이 | 0.020 | 0.020 | 0.020 |
7 | 올리브 오일 | 2.000 | 2.000 | 2.000 |
8 | 카프릭/카프릭 트리글리세라이드 | 2.000 | 2.000 | 2.000 |
9 | 소디움 아크릭레이드/소디움 아크릭디메틸 타우레이트 코폴리머 | 0.667 | 0.667 | 0.667 |
10 | 이소헥사데칸 | 0.667 | 0.667 | 0.667 |
11 | 폴리소르베이트 80 | 0.667 | 0.667 | 0.667 |
12 | 클로르페네신 | 0.250 | 0.250 | 0.250 |
13 | 메칠파라벤 | 0.150 | 0.150 | 0.150 |
14 | 세포내 분자 전송 펩티드 | 0.000 | 1.000 | 0.000 |
15 | 세포내 분자 전송 펩티드-쿠마릭산 | 1.000 | 0.000 | 0.000 |
16 | 쿠마릭산 | 0.000 | 0.000 | 1.000 |
12-4. 개량형 MTD(M1067)-아세틸펜타펩타이드 함유 화장료 조성물의 제조
개량형 MTD(M1067)-아세틸펜타펩타이드 또는 개량형 MTD(M1067)를 함유한 에센스 조성물은 표 2의 조성으로 아래와 같이 제형화하였다.
수상용해조에 1 ~ 5을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 6 ~ 10을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 11, 12, 14을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 개량형 MTD(M1067)-아세틸펜타펩타이드를 함유하는 조성물을 제조하였다.
비교예 3 : 수상용해조에 1 ~ 5을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 6 ~ 10을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 11 ~ 13을 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 개량형 MTD(M1067)를 함유하는 조성물을 제조하였다.
비교예 4 : 수상용해조에 1 ~ 5을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 뒤 유화조로 투입한다. 유상용해조에 6 ~ 10을 넣고 70℃까지 가온하면서 완전 용해시킨 후 유화조에 넣고 혼합한다. 내용물을 40℃까지 냉각한 뒤 원료 11, 12, 15를 유화조로 투입한 뒤 혼합한 후 내용물을 실온까지 냉각시켜 아세틸펜타펩타이드를 함유하는 조성물을 제조하였다.
표 2
개량형 MTD(M1067)-아세틸펜타펩타이드 함유 에센스 조성(단위 : 중량 %) No | 원 료 | 실시예 12-2 | 비교예 3 | 비교예 4 |
1 | 정제수 | 100까지 | 100까지 | 100까지 |
2 | 글리세린 | 5.000 | 5.000 | 5.000 |
3 | 디프로필렌 글리콜 | 3.000 | 3.000 | 3.000 |
4 | 알라토인 | 0.100 | 0.100 | 0.100 |
5 | 다이소디움 이디티에이 | 0.020 | 0.020 | 0.020 |
6 | 올리브 오일 | 2.000 | 2.000 | 2.000 |
7 | 카프릭/카프릭 트리글리세라이드 | 2.000 | 2.000 | 2.000 |
8 | 소디움 아크릭레이드/소디움 아크릭디메틸 타우레이트 코폴리머 | 0.667 | 0.667 | 0.667 |
9 | 이소헥사데칸 | 0.667 | 0.667 | 0.667 |
10 | 폴리소르베이트 80 | 0.667 | 0.667 | 0.667 |
11 | 클로르페네신 | 0.250 | 0.250 | 0.250 |
12 | 메칠파라벤 | 0.150 | 0.150 | 0.150 |
13 | 세포내 분자 전송 펩티드 | 0.000 | 0.100 | 0.000 |
14 | 세포내 분자 전송 펩티드-아세틸펜타펩타이드 | 0.100 | 0.000 | 0.000 |
15 | 아세틸펜타펩타이드 | 0.000 | 0.000 | 0.100 |
12-5. 개량형 MTD와 피부 생리 활성물질이 결합된 복합체의 피부 안전성 평가
상기 실시예 4에서 합성된 개량형 MTD(M1067), 실시예 12-1과 실시예 12-2에서 합성된 개량형 MTD(M1067)-쿠마릭산과 개량형 MTD(M1067)-아세틸펜타펩티드의 안전성을 확인하기 위하여 인체 피부를 이용한 일차자극 시험을 수행하였다. 전문 임상 시험 기관인 (주)더마프로에 의뢰하여 수행하였으며, 임상용 조성물은 하기에 기재된 바와 같이 준비하였다.
임상 시험 선정 기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 피험자 30명 이상을 선정하였다. 피험자를 대상으로 등 부위에 시료물질을 도포한 후 48시간 후에 제거하였다. 제거 후 30분, 24시간 후에 시험부위를 관찰하였다. 피부 평가는 Frosch & Kligman 법(Frosch P.J and Kligman A.M. J Am Acad Dermatol, 1(1):35-41 (1979))과 The Cosmetic, Toiletry, and Frangrance Association (CTFA) guideline (The Cosmetic, Toiletry and Frangrance Association, Inc. Washington, D.C. 20005 (1981))을 반영한 표 3의 기준으로 평가하였고, 48시간 및 72시간의 평균 반응도를 비교하였으며, 각 조성물에 대한 평균 반응도를 기준으로 하여 그 결과를 판정하였다.
표 3
Recording of patch test reactions Symbol | Grade | Clinical Description |
+ | 1 | Slight erythema, either spotty or diffuse |
++ | 2 | Moderate uniform erythema |
+++ | 3 | Intense erythema with edema |
++++ | 4 | Intense erythema with edema & vesicles |
표 4
인체 피부 일차 자극 시험 결과(n=30) 번호 | 시험물질명 | No. of responder | 48시간 | 72시간 | 반응도 |
1+ | 2+ | 3+ | 1+ | 2+ | 3+ | 47h | 72h | Mean |
1 | 개량형 MTD(M1067) 0.1% 함유 | 0 | - | - | - | - | - | - | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
2 | 개량형 MTD(M1067) 1% 함유 | 0 | - | - | - | - | - | - | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
3 | 개량형MTD(M1067)-쿠마릭산 1% 함유 | 0 | - | - | - | - | - | - | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
4 | 쿠마릭산 1% 함유 | 0 | - | - | - | - | - | - | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
5 | 개량형MTD(M1067)-아세틸펜타펩타이드 0.1% 함유 | 0 | - | - | - | - | - | - | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
6 | 아세틸펜타펩타이드 0.1% 함유 | 0 | - | - | - | - | - | - | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
7 | 대조군 (Squalane) | 0 | - | - | - | - | - | - | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
상기 표 4에 나타난 바와 같이 개량형 MTD(M1067), 개량형 MTD(M1067)-쿠마릭산 및 개량형 MTD(M1067)-아세틸펜타펩타이드는 인체 피부 일차 자극 측면에서 저자극 범주의 물질로 나타났다. 이로써, 전문시험기관의 임상시험을 통해 개량형 MTD(M1067)가 인체에 대해서 안전하게 이용될 수 있음을 입증하였다.
뿐만 아니라, 본 발명에서 고안된 개량형 MTD는 기존 MTD보다 세포내 투과능 및 in vivo 조직내 투과능 또한 향상되었음을 전술된 실시예를 통해 알 수 있었다. 아울러, 인체에 있어서도 안전함이 입증되었으므로, 본 발명의 개량형 MTD는 다양한 연구분야 뿐만 아니라, 효율적인 약물전달이 요구되는 특정 질환 환자의 치료를 위해서도 효과적으로 이용될 수 있어, 신약개발 및 개량신약 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
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