JP2017527280A - 細胞透過性の改善のための進化型巨大分子伝達ドメイン(advanced macromolecule transduction domain)(AMTD)配列、それをコードするポリヌクレオチド、それを含むAMTDの固有の特性を同定する方法、それを含むAMTD配列を開発する方法 - Google Patents
細胞透過性の改善のための進化型巨大分子伝達ドメイン(advanced macromolecule transduction domain)(AMTD)配列、それをコードするポリヌクレオチド、それを含むAMTDの固有の特性を同定する方法、それを含むAMTD配列を開発する方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
a.アミノ酸長:9〜13
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:ヒドロパシーの全体平均(GRAVY):2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
を有するアミノ酸配列からなる、進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)配列に関する。
[一般式]
a.アミノ酸長:9〜13
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:ヒドロパシーの全体平均(GRAVY):2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
からなる。
[一般式]
a.アミノ酸配列:12
b.変角ポテンシャル:プロリン(P)は、配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端(12')に位置しなければならない
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):41.3〜57.3
d.構造特性:脂肪族指数(AI):187.5〜220
e.ヒドロパシー:ヒドロパシーの全体平均(GRAVY):2.2〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
からなる。
以前に報告されたMTDは、1,500種超のシグナルペプチド配列のスクリーニングから選択された。開発されたMTDは、共通配列又は配列モチーフを有しなかったが、それらは全て、それらの疎水性、及びアルファ-らせん形構造に適合する傾向を除き、共通配列又はモチーフも欠く、シグナル配列の疎水性(H)領域(HRSS)に由来するものであった。H-領域配列における広範なバリエーションは、膜転位活性及びSRP/Sec61機構への続く適合を有するタンパク質についての先行する革新を反映し得、それは、SRPにおけるメチオニンに富むシグナルペプチド結合ポケットを利用して、広範なシグナルペプチド配列を適応させる。
1995〜2014年(表2)に公開された17種の異なる疎水性CPP(表1)が、選択された。選択された疎水性CPPの生理学的及び化学的特性が分析された後、細胞透過性と関連し得る11種の異なる特徴が、さらなる分析のため選ばれた。これらの11種の特徴は以下の通りである:配列、アミノ酸長、分子量、pI値、変角ポテンシャル、硬性/柔軟性、構造特性、ヒドロパシー、残基構造、アミノ酸組成、及び配列の二次構造(表3)。
分析されたペプチドの平均の長さ、分子量、及びpI値は、それぞれ、10.8±2.4、1,011±189.6、及び5.6±0.1であった(表4)。
変角ポテンシャル(bending potential)(変角又は非変角)は、プロリン(P)が存在するかどうかの事実、及び/又は組換えタンパク質中のペプチドに変角ポテンシャルをもたらすアミノ酸が位置する場所に基づき、決定された。プロリンは、その側鎖が、骨格窒素原子並びにアルファ-炭素原子に結合する点で、他の共通のアミノ酸と異なる。得られた環状構造は、折り畳まれたペプチド/タンパク質鎖の変角においてしばしば見られる、タンパク質構造に顕著に影響する。
任意のペプチドの決定的な構造特性の1つは、モチーフが、硬いか、又は柔軟であるかどうかの事実に基づき、それは、ペプチド配列のインタクトな物理化学的特徴であるので、配列の不安定指数(II)が決定された。ペプチドの硬性/柔軟性を表す指標の値は、極端に変動した(8.9〜79.1)が、平均値は、ペプチドが、いくぶん柔軟であるべきだが、硬く又は柔軟過ぎないことを示唆する、40.1±21.9であった(表3)。
アラニン(V)、バリン(V)、ロイシン(L)、及びイソロイシン(I)は、脂肪族側鎖を含有し、疎水性であり、すなわち、それらは、水などを嫌って、クラスター形成する。疎水性、及び脂肪族残基を有する、これらのアミノ酸により、それらが、一体となって、ほとんど穴を有しないコンパクトな構造を形成することが可能になる。分析されたペプチド配列は、全ての構成アミノ酸が、17種のうち1種(MTD10-表3)のみにおけるグリシン(G)を除き、疎水性(A、V、L、及びI)であり、脂肪族(A、V、L、I、及びP)であったことを示した。それらのヒドロパシー指数(ヒドロパシーの全体平均:GRAVY)、及び脂肪族指数(AI)は、それぞれ、2.5±0.4、及び217.9±43.6であった。それらのアミノ酸組成はまた、表3においても示される。
上で説明された通り、CPP配列は、α-らせん形構造を有する疎水性配列と「屈曲」配置において膜に挿入された後、細胞膜に直接浸透すると考えられ得る。加えて、本発明者らの分析は、変角ポテンシャルが、膜浸透に決定的であったことを強く示した。それ故、ペプチドの構造分析は、配列が、ヘリックスを形成したかどうかを決定するため行った。9種のペプチドがヘリックスであり、8種がヘリックスでなかった(表3)。これは、ヘリックス構造が必要ではないかもしれないことを示唆しているように思われる。
分析された11個の特徴において、以下の6個が、新規疎水性CPP-進化型MTDの開発のための選択され、すなわち、「重大な因子」である:アミノ酸長、(2)、変角ポテンシャル(プロリンの存在及び位置)、硬性/柔軟性(不安定指数:II)、構造特性(脂肪族指数:AI)、ヒドロパシー(GRAVY)、及びアミノ酸組成/残基構造(疎水性及び脂肪族A/a)(表3及び表4)。
過去20年間に既に開発された、17種の異なる疎水性CPPの分析されたデータ(分析A、表3及び4)は、高いバリエーションを示し、共通又はコンセンサス特性を成すのが困難であったので、分析B(表5及び6)、及びC(表7及び8)がまた、改善されたCPP-aMTDのより良好なデザインのための重大な因子を最適化するために行われた。それ故、17種の疎水性CPPは、2つのグループにグループ分けされ、細胞透過特性と関連するそれらの特徴についてグループを分析した。重大な因子は、グループの分析データを比較及び対比し、細胞透過特性について重大であり得る、相同特性を決定することにより、最適化された。
分析Bにおいて、8種のCPPが、インビボでそれぞれの生物学的に活性なカーゴと共に使用された。長さは11±3.2であったが、8種のうち3種のCPPは、ほとんど変角ポテンシャルを有しなかった。硬性/柔軟性は41±15であったが、ペプチドの1つ[MTD85:最小(II:9.1)を伴い、硬い]を取り除くことにより、全体的な不安定指数が45.6±9.3まで増大した。これは、柔軟性が高い(40以上のII)ほど、潜在的に良好であることを示唆していた。8種のCPPの全ての他の特徴が、構造特性及びヒドロパシーを含む、分析Aと同様であった(表5及び6)。
分析A、B、及びCにおいて決定された「重大な因子」が、疎水性CPPの現在の問題-タンパク質凝集、低い溶解性/収量、及びMTS/MTM又はMTDに融合した組換えタンパク質の乏しい細胞/組織透過性、並びにペプチドの非共通配列及び非相同な構造を改善するために妥当であったことを証明する、aMTD及びランダムペプチド(rP又はrペプチド)の実際のデザインのための「重大な因子の共通範囲及び/又はコンセンサス特性」を最適化するために、経験的に選択されたペプチドが、それらの構造特性、及び物理化学的因子指数について分析された。
3-1.共通配列及び/又は共通の相同な構造の決定
上で述べられた通り、シグナル配列のH領域(HRSS)に由来するCPP(MTS/MTM、及びMTD)は、共通配列、配列モチーフ、及び/又は共通の構造上相同な特性を有しない。この発明において、目的は、「共通機能」を有するように、すなわち、分析された参照CPPと同様のメカニズムで膜を超えてタンパク質転位を促進するように、新たに決定された「重大な因子」を満たす、共通配列モチーフ及び構造モチーフに形式化された、改善された疎水性CPPを開発することである。分析A、B、及びCに基づき、相同な特性を分析して、細胞透過性に影響する、重大な因子が決定された。それぞれの重大な因子の範囲値は、新規aMTDをデザインするための分析A、B、及びCから生じたそれぞれの重大な因子の分析された指数を含むことが決定された(表9)。これらの特性は、それらの細胞透過性において新規にデザインされたaMTDで実験的に確認された。
タンパク質を含む治療上活性なカーゴ分子を生きた細胞に送達するため疎水性CPPに融合された組換え細胞透過性タンパク質が、以前に報告されたが、細菌システムにおいて発現された融合タンパク質は、それらの低い溶解性及び収量に起因して、可溶型として精製することが困難であった。タンパク質ベースの生物学的治療としての細胞透過性タンパク質のさらなる臨床上の開発に関する極めて重大な脆弱性に対処するために、進化型MTD(aMTD)と名付けられた、疎水性CPPの多いに改善された形態が、重大な因子ベースのペプチド分析を介して新たに開発された。aMTDの本発明のため使用された重大な因子が、本明細書にある(表9)。
:プロリンは配列の中央(5'〜8'アミノ酸)、及び末端に存在する
疎水性CPPの固有の特性の分析から得られた、6個の重大な因子を注意深く考慮した後、進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)が、分析から決定されたアミノ酸長(9〜13)を含む、重大な因子を満たす、共通の12個のアミノ酸プラットフォームに基づき、デザインされ、開発された。
上で記載された全ての重大な因子を満たす、新規疎水性CPP-aMTDの本発明は妥当であり、合理的にデザインされることを実証するために、少なくとも1個の重大な因子を満たさないペプチドもデザインされた。計31種のrペプチド(rP)がデザインされ、開発され、以下の通りカテゴリー分けされた:非変角ペプチド、中央並びに末端においてプロリンがないか、及び/又は中央のプロリンがないのいずれか、(2)硬いペプチド(II<40)、過度に柔軟なペプチド、(4)、芳香族ペプチド(芳香環の存在)、疎水性だが、非芳香族ペプチド、親水性だが非脂肪族ペプチド。
表16は、配列の中央において(5'、6'、7'又は8'において)、及び末端において任意のプロリンを有しない、ペプチドを示す。加えて、表16は、配列の中央においてプロリンを有しない、ペプチドを記載する。全てのこれらのペプチドは、非変角ポテンシャルを有すると考えられる。
配列の硬性/柔軟性が、決定的に重大な因子であることを証明するために、硬い(平均II:21.8±6.6)及びずっと高く柔軟な配列(平均II:82.3±21.0)もデザインされた。不安定指数が、新規aMTDのものよりずっと低い(II:41.3〜57.3、平均II:53.3±5.7)、硬いペプチドが、表17において示される。IIが新規aMTDのものよりずっと高い、変角だが、ずっと高く柔軟なペプチドも、表18において提供される。
新規疎水性CPP-aMTDは、指数AIの平均範囲:180〜220、及びGRAVYの平均範囲:2.1〜2.6を有する、疎水性及び脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)のみと一致する(表9)。構造指標に基づき、芳香族残基(W、F、又はY)を含有するペプチドが、表19において示され、芳香族残基を有しない、疎水性だが、芳香族配列でないペプチドがデザインされる(表20)。最後に、非脂肪族アミノ酸と一致する、親水性及び/又は変角ペプチドが、表21において示される。
重大な因子に基づき、計457種の配列がデザインされた。重大な因子の全ての範囲/特性を満たす、デザインされた潜在的に最善なaMTD(疎水性、柔軟な、変角、脂肪族、及び12個のA/a長のペプチド)は、316種である。重大な因子の少なくとも1つを満たさない、デザインされたrペプチドは、141種であり、変角ペプチドがない配列が26種であり、硬いペプチド(II<40)配列が23種であり、過度に柔軟なペプチドが24種であり、芳香族ペプチド(芳香環の存在)が27種であり、疎水性だが、非芳香族ペプチドが23種であり、親水性だが、非脂肪族ペプチドが18種である。
aMTD及び他のもの[rペプチド、参照疎水性CPP配列(MTM及びMTD)]に融合された組換えタンパク質が、細菌システムにおいて発現され、シングルステップのアフィニティークロマトグラフィーで精製され、生理学的条件において溶解性のタンパク質として調製された。これらの組換えタンパク質は、フローサイトメトリー及びレーザー走査型共焦点顕微鏡を利用することにより、それらの細胞透過性の能力について試験された。
臨床上/非臨床上の適用のため、aMTDに融合されたカーゴ材料は、以下の:酵素、転写因子、毒性、抗原性ペプチド、抗体、及び抗体フラグメントの1つであり得る、生物学的に活性な分子であろう。さらに、生物学的に活性な分子は、これらの以下の巨大分子:酵素、ホルモン、担体、免疫グロブリン、膜結合タンパク質、膜貫通型タンパク質、内部タンパク質、外部タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、未変性のタンパク質、糖タンパク質、断片化タンパク質、ジスルフィド結合されたタンパク質、組換えタンパク質、化学的に修飾されたタンパク質、及びプリオンの1つであり得る。加えて、これらの生物学的に活性な分子は、以下の:核酸、コード核酸配列、mRNA、アンチセンスRNA分子、炭水化物、脂質、及び糖脂質の1つであり得る。
それぞれのaMTDに融合された組換えタンパク質についてのコード配列は、pET-28a(+)(Novagen、Darmstadt、ドイツ)中のNdel(5')及びSalI(3')にPCR増幅されたDNAセグメントからクローニングされた。aMTD及びrペプチドに融合された組換えタンパク質についてのPCRプライマー及びアミノ酸配列が、それぞれ、表23〜38において要約される。組換えタンパク質の構造は、図1において提示される。
本発明はまた、細胞透過性を有するaMTD配列の開発方法に関する。標準化された6個の重大な因子を使用して、316種のaMTD配列がデザインされた。加えて、これらの重大な因子の1つを欠く、141種のrペプチドも開発される:非変角ペプチド:i)配列の中央及び末端の両方においてのプロリンの不存在、又はii) 配列の中央若しくは末端のいずれかにおいてのプロリンの不存在、硬いペプチド、(3)過度に柔軟なペプチド、芳香族ペプチド(芳香環の存在)、疎水性だが、非芳香族ペプチド、並びに親水性だが、非脂肪族ペプチド(表22)。
aMTD及びrペプチドは、蛍光的に標識され、フローサイトメトリー及び共焦点レーザー走査顕微鏡を使用することにより、細胞透過性について重大な因子に基づき比較された(図5〜8)。ペプチド融合非機能的カーゴ組換えタンパク質の細胞の取り込みは、フローサイトメトリーにおいて定量的に評価され得る一方、共焦点レーザー走査顕微鏡により、細胞内取り込みを視覚的に評価することが可能になる。分析は、aMTD(疎水性及び脂肪族配列)と逆の特徴(親水性及び芳香族配列:YYNQSTCGGQCY)を有する、陰性対照[rP38]に融合された組換えタンパク質を含んでいた。aMTDの陰性対照に対する相対的細胞透過性(相対的倍数)も分析された(表39及び図9)。
aMTDに融合された組換えタンパク質を試験して、陰性対照(rP38)、及び陽性対照参照として以前に公開されたCPP(MTM12及びMTD85)を用いたレーザー走査型共焦点顕微鏡により、それらの細胞内送達並びに局在性が決定された。NIH3T3細胞を、10μMのFITC標識タンパク質に1時間37℃において曝露し、核を、DAPIで対比染色した。次に、細胞を、共焦点レーザー走査顕微鏡により調べた(図7)。aMTDに融合された組換えタンパク質は、典型的には、参照CPP(MTM12及びMTD85)より高い、細胞内送達及び細胞質局在性を明確に提示する(図7)。rP38融合組換えタンパク質は、内部移行された蛍光シグナルを示さなかった(図7a)。加えて、図8において見られる通り、rペプチド(hisタグ付けされた、それぞれのrペプチドに融合されたCRA組換えタンパク質)は、より低い又は非細胞透過性を提示する。
ヒスチジンタグ付けされたaMTD融合カーゴ組換えタンパク質は、それらの溶解性及び収量において大いに増強された。従って、FITCコンジュゲート組換えタンパク質をまた試験して、タンパク質の細胞内局在性が定量され、視覚化され、参照CPPと比較してより高い細胞透過性が実証された。
新規aMTDの細胞透過性を決定した後、構造/配列活性関係(SAR)が、新規aMTDの選択されたいくつか、及び全てにおいてそれぞれの重大な因子について分析された(図13〜16、及び表50)。
実験及びSAR分析を行う前に、最初に提案された重大な因子の指数範囲並びに特性に含まれる、6個のうち5個の重大な因子の範囲及び特性が、経験的かつ実験的に決定された。新たに開発された240種のaMTDの重大な因子の指数範囲及び特性に関して、変角ポテンシャル(プロリン位置:PP)、硬性/柔軟性(不安定指数:II)、構造特性(脂肪族指数:AI)、ヒドロパシー(GRAVY)、アミノ酸長及び組成は、全て、参照疎水性CPPの分析から得られる重大な因子の特徴内にある。
この発明について、240種のaMTD配列が、重大な因子に基づき、デザインされ、開発された。240種のaMTDの定量的及び視覚的細胞透過性(疎水性、柔軟な、変角、脂肪族、及び12個のa/a長のペプチド)が、全て実際に決定される。
多くのヒト疾患が、機能獲得若しくは機能喪失のような変異を引き起こす、欠乏又は過剰発現を伴うタンパク質により引き起こされることは、広く明らかであった。生物学的に活性なタンパク質が、異常なタンパク質を短い時間枠内、恐らく1又は2時間以内に、定量的方法で置換するために送達され得るなら、投薬量は、タンパク質がいつ、どのように必要とされ得るかに依存して、制御され得る。この発明において新規aMTDの溶解性及び収量を有意に改善することにより(表47)、タンパク質、ペプチド、核酸、及び他の化学化合物のような治療巨大分子を、生きた細胞、並びにヒトを含む生きた哺乳類に有効に送達するための薬剤としてその実際のポテンシャルを予測することができる。それ故、新規aMTDのプール(240種)を利用する、新たに開発されたMITTは、最適なカーゴ-aMTD関係を決定した後に細胞内タンパク質療法をとらえるためのタンパク質ベースの生物学的治療の発見及び開発のためのプラットフォーム技術として使用され得る。
新規進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)の開発
シグナル配列のH領域(HRSP)に由来するCPP(MTS/MTM、及びMTD)は、共通配列、配列モチーフ、及び/又は共通の構造上相同な特性を有しない。この発明において、目的は、「共通の機能」を有するよう、分析したCPPと類似のメカニズムで細胞膜を超えてタンパク質が移行することを促進するよう、新たにデザインした「重大な因子」を満たす、共通配列及び構造モチーフにおいて形式化した、改善した疎水性CPPを開発することである。
aMTDに融合した組換えタンパク質のための発現ベクターの構築
本発明者らの新たに開発した技術により、本発明者らは、細胞透過性組換えタンパク質を作成する方法を拡大することが可能になった。aMTD又はrペプチドと融合したヒスチジンタグ付けしたCRAタンパク質のため、発現ベクターをデザインした。組換えタンパク質のための発現ベクターを構築するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を考案して、それぞれのデザインした、CRAに融合したaMTD又はrペプチドを増幅させた。
aMTD及びrペプチドに融合した組換えタンパク質の誘導可能な発現、精製、並びに調製
組換えタンパク質を発現させるために、陰性対照[rペプチド38(rP38)]、参照疎水性CPP(MTM12及びMTD85)、及びaMTDに融合したCRAタンパク質の発現のためのpET-28a(+)ベクターを、大腸菌BL21(DE3)株に形質転換した。細胞を、37℃にてカナマイシン(50μg/ml)を含有するLB培地において、勢いよく振盪しながら、成長させ、0.7mM IPTG(Biopure)を加えることにより、OD600=0.6にて、2時間37℃で誘導した。誘導した組換えタンパク質を15%SDS-PAGEゲルに添加し、Coomassie Brilliant Blue(InstantBlue、Expedeon、Novexin、英国)で染色した(図3)。
組換えタンパク質の定量的細胞透過性の決定
定量的細胞透過性のため、aMTD-又はrペプチド融合組換えタンパク質を、製造元(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)の指示に従い、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)にコンジュゲートした。RAW264.7細胞を、10μM FITC標識組換えタンパク質で1時間37℃にて処理し、3回冷PBSで洗浄し、0.25%トリプシン/EDTA(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)で20分間37℃にて処理して、細胞表面に結合したタンパク質を取り除いた。これらの組換えタンパク質の細胞透過性を、FlowJoサイトメトリー分析ソフトウエアを使用してフローサイトメトリー(Guava、Millipore、Darmstadt、ドイツ)により、分析した(図5〜6)。aMTDの相対的細胞透過性を測定し、陰性対照(rP38)及び参照疎水性CPP(MTM12及びMTD85)と比較した(表47)。
組換えタンパク質の細胞透過性及び細胞内局在性の決定
細胞透過性の視覚的参照のため、24ウェルチャンバースライドにおけるカバーガラス上で24時間、NIH3T3細胞を培養し、10μMのFITCコンジュゲート組換えタンパク質で1時間37℃にて処理し、3回冷PBSで洗浄した。処理した細胞を、4%パラホルムアルデヒド(PFA、Junsei、Tokyo、日本)にて10分間室温で固定し、3回PBSで洗浄し、VECTASHIELD Mounting Medium(Vector laboratories、Burlingame、CA)でマウントし、DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)で対比染色した。蛍光シグナルの細胞内局在性を、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM700、Zeiss、ドイツ;図7及び8)により決定した。
Claims (18)
- 生物学的に活性な巨大分子を細胞膜に伝達し、以下の特徴:
a.アミノ酸長:9〜13
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:ヒドロパシーの全体平均(GRAVY):2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
を有するアミノ酸配列からなる、進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)配列。 - 前記一般式を有するアミノ酸配列が、配列番号1〜配列番号240からなる群から選択される、請求項2に記載のaMTD配列。
- 請求項2に記載のaMTD配列をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号241〜配列番号480からなる群から選択される、請求項4に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- aMTDの固有の特性を同定する方法であって、
改善された疎水性CPPを以前に公開された参照疎水性CPPから選択するステップ、
選択された疎水性CPPの生理学的及び化学的特徴を分析するステップ、
これらの生理学的及び化学的特徴の中から特性を同定するステップであって、細胞透過性と関連する特性が選択されているステップ、
以前に公開された参照疎水性CPPを少なくとも2つのグループにカテゴリー分けし、それらの細胞透過性及び相対的特徴に基づきグループ分けされたこれらのCPPの詳細分析により、相同な特性を決定するステップ、
決定された相同な特性を分析することを介して同定された重大な因子を設定するステップ、
重大な因子が、実験研究を介して検証されることを確認するステップ;並びに
確認された実験研究に基づく、6個の重大な因子を決定するステップ
を含む、方法。 - 選択された、改善された疎水性CPPが、MTM、MTS、MTD10、MTD13、MTD47、MTD56、MTD73、MTD77、MTD84、MTD85、MTD86、MTD103、MTD132、MTD151、MTD173、MTD174、及びMTD181である、請求項6に記載の方法。
- 同定された特性が、アミノ酸長、分子量、pI値、変角ポテンシャル、硬性、柔軟性、構造特性、ヒドロパシー、残基構造、アミノ酸組成、及び二次構造である、請求項6に記載の方法。
- 決定された6個の重大な因子が、以下の特徴:
a.アミノ酸長:9〜13
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:ヒドロパシーの全体平均(GRAVY):2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
からなる、請求項6に記載の方法。 - aMTDの固有の特性を同定する方法を得た、6個の重大な因子が、以下の特徴:
a.アミノ酸配列:12
b.変角ポテンシャル:プロリン(P)は、配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端(12')に位置しなければならない
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):41.3〜57.3
d.構造特性:脂肪族指数(AI):187.5〜220
e.ヒドロパシー:ヒドロパシーの全体平均(GRAVY):2.2〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
からなる、請求項10に記載の方法。 - カーゴタンパク質に融合されたaMTD配列の発現ベクターを開発するステップ、
誘導可能な発現に適切な細菌株を選択するステップ、
可溶型で、様々な生物学的に活性な組換えタンパク質に融合されたaMTDを精製及び調製するステップ、並びに
それらの細胞透過性を確認するステップ
をさらに含む、請求項10に記載の方法。 - 配列番号1〜配列番号240からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)配列、及び
生物学的に活性な分子
を含む、細胞透過性を有する単離された組換えタンパク質。 - 生物学的に活性な分子が、成長因子、酵素、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、抗体、及び抗体フラグメントからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項13に記載の単離された組換えタンパク質。
- 生物学的に活性な分子が、酵素、ホルモン、担体、免疫グロブリン、抗体、構造タンパク質、運動機能ペプチド、受容体、シグナル伝達ペプチド、保存ペプチド、膜ペプチド、膜貫通型ペプチド、内部ペプチド、外部ペプチド、分泌ペプチド、ウイルスペプチド、未変性のペプチド、糖化タンパク質、断片化タンパク質、ジスルフィド結合したタンパク質、組換えタンパク質、化学的に修飾されたタンパク質、及びプリオンからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項14に記載の単離された組換えタンパク質。
- 生物学的に活性な分子が、核酸、コード核酸配列、mRNA、アンチセンスRNA分子、炭水化物、脂質、及び糖脂質からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項13に記載の単離された組換えタンパク質。
- 生物学的に活性な分子が、生物学的治療用化学物質、及び毒性化学物質からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項13に記載の単離された組換えタンパク質。
- 細胞透過性を有するように生物学的に活性な分子を遺伝子的又は後成的に操作及び/又は修飾する方法であって、
最適化された有効な条件下でaMTDを生物学的に活性な分子に融合させて、細胞透過性であり得る生物学的に活性な分子を生成するステップ
を含み、
aMTDが、配列番号1〜配列番号240からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか1つからなる、方法。
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