KR20170031243A - 세포 투과성의 향상을 위한 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법, 이를 포함하는 aMTD 서열을 개발하는 방법 - Google Patents

세포 투과성의 향상을 위한 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법, 이를 포함하는 aMTD 서열을 개발하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 특히 생물학적 활성 분자를 원형질 막 내로 효과적으로 전달하는 향상된 소수성 세포 투과성 펩타이드(CPP)인 고급 거대분자 전달 도메인(aMTD)을 개발함으로써, 생물학적 활성 거대분자를 세포내로 전달하기 위한 거대분자 세포내 전달 기술(MITT)을 수행하는 것, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 확인하는 방법, 이를 이용하여 매우 향상된 세포 투과성을 갖는 생물학적 활성 물질을 유전적으로 조작하는 시스템, 이를 이용하여 생물학적 활성 분자를 세포 내로 도입하는 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

세포 투과성의 향상을 위한 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법, 이를 포함하는 aMTD 서열을 개발하는 방법{ADVANCED MACROMOLECULE TRANSDUCTION DOMAIN (AMTD) SEQUENCES FOR IMPROVEMENT OF CELL-PERMEABILITY, POLYNUCLEOTIDES ENCODING THE SAME, METHOD TO IDENTIFY THE UNIQUE FEATURES OF AMTDS COMPRISING THE SAME, METHOD TO DEVELOP THE AMTD SEQUENCES COMPRISING THE SAME}
본 발명은 생물학적 활성 거대분자를 세포 내로 전달하기 위한 거대분자 세포내 전달 기술(MITT)에 관한 것으로서, 구체적으로, 생물학적 활성 분자를 원형질 막을 통해 효과적으로 전달하는 향상된 소수성 세포 투과성 펩타이드(CPP)인 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD), 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 확인하는 방법, 이를 이용하여 매우 향상된 세포 투과성을 갖는 생물학적 활성 분자를 유전적으로 조작하는 시스템, 이를 이용하여 생물학적 활성 분자를 세포 내로 도입하는 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
새로운 의약품의 발견 및 개발을 위한 강력한 플랫폼 기술은, 시험관내 및 생체내에서 거대 분자의 세포 투과성을 제공하는 세포 투과성 펩타이드(CPP)로 가능하게 된 거대분자 세포내 전달 기술(MITT)이다. 소분자의 공통적인 문제는 오프타겟(off-target) 약물 상호작용 가능성이다. 또한, 거대분자의 한계는 단백질 및 핵산이 세포내로 전달될 수 없다는 사실이다. 이러한 문제를 해결하기 위해, MITT는 치료용 단백질을 포함하는 생물학적 활성 거대분자를 배양된 세포 및 동물 조직 내로 전달하는 향상된 방법을 제공한다.
원형질 막은 일반적으로 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 펩타이드 및 단백질과 같은 거대 분자의 세포 내재화(cellular internalization)를 제한하는 불투과성 장벽(impermeable barrier)으로서 작용한다. 세포 및/또는 조직 내로의 투과 불량; 특정 세포 및/또는 조직을 표적화하는 특이성 부족으로 인해 전신 전달될 때의 독성; 제한된 양이 표적화된 영역으로 전달되어 바람직하지 않은 부작용을 야기할 수 있는 분해; 및 특정 표적 세포 및/또는 조직에서 충분한 국소 농도를 달성하기 위해 고농도로 전달될 때의 부작용과 같은 많은 어려움이 이러한 거대분자를 원하는 표적으로 전달하는 것을 제한하였다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 몇 가지 캐리어(carrier) 매개 전달 시스템이 개발되었다. 가장 최근의 개발은 펩타이드 기반의 전달 시스템의 사용을 포함하였다. 소수성 CPP의 사용은 다양한 펩타이드 서열 변형을 포함하는 몇 가지 이점이 있다. 이것은 상이한 세포 서브도메인에 들어갈 수 있고/있거나 다양한 유형의 카고(cargo) 분자를 이동시킬 수 있는 캐리어의 조작을 가능하게 한다.
원칙적으로, 단백질 기반의 치료제는 불안정 상태(non-steady state) 조건 하에 살아있는 세포에서 생화학적 과정을 제어하고 종래 소분자 치료제보다 적은 오프타겟 효과를 갖는 방법을 제공한다. 그러나, 동물에서 전신 단백질 전달은 불량한 조직 투과 및 빠른 제거(clearance)로 인해 어려운 것으로 입증되었다. 세포내 거대분자 전달은 포유동물 세포에 의한 단백질 및 다른 거대분자의 투과를 향상시키는 특정 염기성, 양친매성, 및 소수성 펩타이드 서열과 같은 다양한 CPP의 능력을 이용한다. 세포내 거대분자 전달이 널리 사용되어 왔음에도 불구하고, 동물에서 단백질의 전신 전달은 내재화된 단백질의 비효율적인 세포질 전달 및 불량한 조직 투과로 인해 어려운 것으로 입증되었다. 이 문제는 양이온성 단백질 전달 도메인(PTD, 예컨대 HIV Tat, Hph-1, 안테나피디아(antennapedia), 폴리아르기닌, 등)의 경우 특히 사실이었고, 이곳에서 단백질 흡수의 주요 기전인 흡착성 세포내함입(absorptive endocytosis) 및 거대음세포 작용(macropinocytosis)이 상당량의 단백질을 막 결합된 구획 및 엔도솜 구획 내로 격리시켜 단백질 생체이용률을 제한한다. 친수성, 염기성 및 소수성 아미노산과 같은 혼합된 유형의 서열들을 함유하는 키메라 CPP는 독성이 있는 것으로 밝혀졌고, 따라서, 이러한 유형의 CPP는 그 사용이 제한되었다. 섬유아세포 성장인자 4(FGF4)의 소수성 신호 펩타이드로부터 유래된 막 전좌 서열(MTS) 또는 막 전좌 모티프(MTM)와 같은 서열이 더 성공적인 것으로 보고되었다. MTS/MTM은 동물에서 전신(특히 간, 폐, 췌장 및 림프양 조직)으로 생물학적 활성 펩타이드 및 단백질을 전달하는데 사용되어 왔으며, 치명적인 염증 질환 및 폐 전이를 극적으로 예방한다.
종래에, 소수성 CPP(MTS/MTM) 또는 거대분자 전달 도메인(MTD)이 보고되었다. 그러나, 이러한 레퍼런스 소수성 CPP 서열을 이용하여 세포 투과성 치료용 단백질을 개발하기 위한 많은 노력들은 생리학적 버퍼 조건에서 재조합 단백질의 불량한 용해도 및 추가 임상 개발 및 적용을 위한 상대적으로 낮은 세포 투과성에 의해 좌절되었다. 단백질 카고의 소수성 CPP 의존적 흡수가 단백질 기반의 바이오치료제를 개발하기 위한 강력한 방법이라는 합의가 있었음에도 불구하고, 재조합 CPP 융합된 단백질의 단백질 응집, 낮은 용해도/수율, 및 불량한 세포/조직 투과성과 같은 비카고(non-cargo) 특이적 인자에 의해 영향을 받는 중요한 문제들을 해결하기 위해 추가적인 향상이 요구된다. 이들 CPP는 비공통 서열 및 서열의 비상동 구조를 갖는다.
한계를 극복하고 시험관내 및 생체내에서 거대 분자의 세포 투과성을 제공하는 CPP를 향상시키기 위해, CPP의 세포내 전달 잠재성을 결정하는 이론적 결정 인자(critical factor; CF)가 본 발명에서 확인되고 경험적으로 검증된다. 결정된 CF에 기초하여, 신규한 소수성 CPP 서열이 새롭게 생성되고, 세포 투과성이 정량적으로 평가되며, 살아있는 세포에서 이들의 세포내 전달 잠재성에서 레퍼런스 CPP 서열과 상호 비교된다. 본 발명에서, 새롭게 개발된 소수성 CPP가 제시된다. '개선된 거대분자 전달 도메인'(aMTD)으로 불리는 신규 펩타이드 서열은 다양한 상이한 치료용 단백질에 융합되어 aMTD 융합된 재조합 단백질을 살아있는 세포 및 동물 조직으로 전신적으로 전달할 수 있으며, 이들 단백질은 단백질 요법과 관련하여 다양한 인간 질환을 치료하기 위한 단백질 기반의 바이오치료제의 임상 개발 및 적용에 큰 영향을 미칠 것이다.
본 발명은 240개의 새로운 소수성 CPP 서열인 aMTD를 개발하였고, 재조합 단백질의 aMTD 매개 세포내 전달 활성을 결정하였으며, 살아있는 세포에 의한 향상된 단백질 흡수를 FGF4 유래의 MTS/MTM 및 HRSS 유래의 MTD 서열보다 크거나 동일한 수준에서 비교하였다. 새롭게 개발된 aMTD의 이러한 장점은 임상 개발 및 적용을 위한 레퍼런스 소수성 CPP의 어려움을 해결할 수 있다.
본 발명은 생물학적 활성 거대분자를 원형질 막 내로 전달하며 하기 특성(characteristic)을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열에 관한 것이다:
a. 아미노산 길이: 9 - 13
b. 굽힘 잠재성(Bending Potential): 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단(12')에 위치한 프롤린(P)
c. 강성(Rigidity)/유연성(Flexibility): 불안정성 지수(II): 40 - 60
d. 구조적 특징(feature): 지방족 지수(AI): 180 - 220
e. 소수성 지수(Hydropathy): 소수성 지수의 전체 평균(Grand Average of Hydropathy; GRAVY): 2.1 - 2.6
f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임.
일 구현예에 따르면, 아미노산 서열은 12개의 아미노산 서열로 구성된 하기 일반식을 갖는다.
[일반식]
Figure pct00001
상기 식에서, X(들)는 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 지칭하고; 프롤린(P)이 U(들) 중 하나(5', 6', 7' 또는 8')에 위치할 수 있다. 나머지 U(들)는 A, V, L 또는 I로 구성된다. 12'에 있는 P는 프롤린이다.
일 구현예에 따르면, 상기 일반식을 갖는 아미노산 서열은 서열번호: 1 내지 서열번호: 240으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 전술한 aMTD 서열을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 241 내지 서열번호: 480으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 종래 공개된 레퍼런스 소수성 CPP로부터 향상된 소수성 CPP를 선택하는 단계; 상기 선택된 소수성 CPP의 생리학적 및 화학적 특성을 분석하는 단계; 이러한 생리학적 및 화학적 특성 중에서 특징을 확인하는 단계로서, 세포 투과성과 연관되어 있는 특징이 선택된 것인 단계; 종래 공개된 레퍼런스 소수성 CPP를 적어도 2개의 그룹으로 분류하고 세포 투과성 및 상대적 특성에 기초하여 그룹화된 이러한 CPP를 심층 분석하여 상동성 특징(homologous feature)을 결정하는 단계; 상기 결정된 상동성 특징의 분석을 통해 확인된 결정 인자(critical factor)를 구성하는 단계; 실험적 연구를 통해 상기 결정 인자가 유효한지 확인하는 단계; 및 상기 확인된 실험적 연구에 기초하여 6개의 결정 인자를 결정하는 단계를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 선택된 향상된 소수성 CPP는 MTM, MTS, MTD10, MTD13, MTD47, MTD56, MTD73, MTD77, MTD84, MTD85, MTD86, MTD103, MTD132, MTD151, MTD173, MTD174 및 MTD181이다.
일 구현예에 따르면, 확인된 특징은 아미노산 길이, 분자량, pI 값, 굽힘 잠재성, 강성, 유연성, 구조적 특징, 소수성 지수, 잔기 구조, 아미노산 조성 및 이차 구조이다.
일 구현예에 따르면, 상기 결정된 6개의 결정 인자는 하기 특성으로 이루어진다:
a. 아미노산 길이: 9 - 13
b. 굽힘 잠재성: 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단에 위치한 프롤린(P)
c. 강성/유연성: 불안정성 지수(II): 40 - 60
d. 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 180 - 220
e. 소수성 지수: 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY): 2.1 - 2.6
f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임.
본 발명은 aMTD 서열을 개발하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법에 의해 얻은 6개의 결정 인자를 신중하게 결정한 후 하기 일반식을 갖는 aMTD의 디자인된 플랫폼을 제조하는 단계;
[일반식]
Figure pct00002
프롤린(P)을 서열의 말단(12')에 위치시키고 프롤린이 U 부위 중 어느 부위에 위치해야 하는지 결정하는 단계; X(들) 및 프롤린이 위치하지 않은 U(들)에 A, V, L 및/또는 I를 결정하고 위치시키는 단계; 및 상기 디자인된 아미노산 서열이 6개 결정 인자를 만족하는지 확인하는 단계를 포함한다.
일 구현예에 따르면, aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법에 의해 얻은 6개의 결정 인자는 하기 특성으로 이루어진다:
a. 아미노산 서열: 12
b. 굽힘 잠재성: 프롤린(P)이 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단(12')에 위치해야 함
c. 강성/유연성: 불안정성 지수(II): 41.3 - 57.3
d. 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 187.5 - 220
e. 소수성 지수: 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY): 2.2 - 2.6
f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 카고 단백질에 융합된 aMTD 서열의 발현 벡터를 개발하는 단계; 유도성 발현을 위한 적절한 박테리아 균주를 선택하는 단계; 다양한 생물학적 활성 재조합 단백질에 융합된 aMTD를 가용성 형태로 정제하고 제조하는 단계; 및 이들의 세포 투과성을 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 세포 투과성을 갖는 단리된 재조합 단백질을 추가로 제공한다. 상기 단리된 재조합 단백질은 서열번호: 1 내지 서열번호: 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열; 및 생물학적 활성 분자를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 생물학적 활성 분자는 성장 인자, 효소, 전사 인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
일 구현예에 따르면, 생물학적 활성 분자는 효소, 호르몬, 캐리어, 면역글로불린, 항체, 구조 단백질, 운동 기능 펩타이드, 수용체, 신호전달 펩타이드, 저장 펩타이드, 막 펩타이드, 막관통 펩타이드, 내부 펩타이드, 외부 펩타이드, 분비성 펩타이드, 바이러스 펩타이드, 천연(native) 펩타이드, 당화된 단백질, 단편화된 단백질, 디설파이드 결합 단백질, 재조합 단백질, 화학적으로 변형된 단백질 및 프리온으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이다.
일 구현예에 따르면, 생물학적 활성 분자는 핵산, 코딩 핵산 서열, mRNA, 안티센스 RNA 분자, 탄수화물, 지질 및 당지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이다.
일 구현예에 따르면, 생물학적 활성 분자는 바이오치료용 화학물질 및 독성 화학물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다.
본 발명은 생물학적 활성 분자를 세포 투과성을 갖도록 유전적으로 또는 후생유전적으로 조작 및/또는 변형하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 최적화되고 효과적인 조건 하에 aMTD를 생물학적 활성 분자에 융합시켜 세포 투과성일 수 있는 생물학적 활성 분자를 생성하는 것을 포함하며, 상기 aMTD는 서열번호: 1 내지 서열번호: 240으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어진다.
본 발명은 결정 인자(CF)로부터 인공적으로 제작된 aMTD 서열을 제공하며, 이는 시험 전에 제한된 다양성 및 예측불가능한 세포 투과성과 같은 선행 기술(MTM/MTS/MTD)의 한계를 극복하였다. aMTD 서열에 대한 무한한 가능한 디자인에서 세포 투과성을 보장하는 CF에 기초하여, 본 발명은 생물학적 활성 거대분자를 살아있는 세포 내로 전달하기 위해 이의 선행 기술과 비교하여 최대 109.9 상대적 배수로 향상된 능력을 갖는 이들 서열을 제시한다. 따라서, 이것은 분자 전달, 약물 전달, 단백질 요법, 세포내 단백질 요법, 단백질 대체 요법, 펩타이드 요법, 유전자 전달 등에서 이들의 실제적 효과적인 적용을 가능하게 할 것이다.
도 1. aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 구조. 히스-태그된 CRA 재조합 단백질의 개략도가 도시되어 있고 이는 본 발명에 따라 제작된다. 친화성 정제를 위한 히스-태그(흰색), aMTD 또는 r펩타이드(회색) 및 카고 A(CRA, 검정색)가 나타나 있다.
도 2a 내지 2c. aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질을 위한 발현 벡터의 제작. 이들 도면은 본 발명에 따라 pET28a(+) 벡터 내로 클로닝된 aMTD 또는 r펩타이드 융합된 CRA를 코딩하는 645bp 삽입에 있는 플라스미드 DNA 단편을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 분석을 나타낸다.
도 3a 내지 3d. aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 유도성 발현. 발현된 재조합 aMTD 또는 무작위 펩타이드 융합된 CRA 재조합 단백질을 E. coli BL21(DE3) 균주에서 형질전환하였다. IPTG로 유도하기 전(-)과 후(+)에 E. coli에서 재조합 단백질의 발현을 SDS-PAGE에 의해 모니터링하고, 쿠마시 블루로 염색하였다.
도 4a 및 4b. aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 정제. 발현된 재조합 단백질을 자연 조건 하에 Ni2+ 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 재조합 단백질의 정제를 SDS-PAGE 분석을 통해 표시하였다.
도 5a 내지 5u. aMTD 매개 세포 투과성의 결정. 음성 대조군(A: rP38) 및 레퍼런스 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85)의 세포 투과성이 나타나 있다. 각각의 aMTD 및/또는 r펩타이드의 세포 투과성을 카고 단백질 결여 펩타이드 서열(HCA)과 시각적으로 비교한다. 회색 음영 부분은 처리되지 않은 RAW 264.7 세포(비히클)를 나타내고; 얇은 옅은 회색선은 동등한 몰 농도의 FITC(FITC 단독)로 처리된 세포를 나타내며; 진한 두꺼운 선은 FITC 히스-태그된 CRA 단백질(HCA)로 처리된 세포를 나타내고; 음성 대조군(rP38), 레퍼런스 CPP(MTM12 또는 MTD85) 또는 새로운 소수성 CPP(aMTD)에 융합된 FITC 단백질(HMCA)로 처리된 세포는 옅은 두꺼운 선으로 나타나 있고 화살표로 표시되어 있다.
도 6a 내지 6c. r펩타이드 매개 세포 투과성의 결정. 각각의 aMTD 및/또는 r펩타이드의 세포 투과성을 카고 단백질 결여 펩타이드 서열(HCA)과 시각적으로 비교하였다. 회색 음영 부분은 처리되지 않은 RAW 264.7 세포(비히클)를 나타내고; 얇은 옅은 회색선은 동등한 몰 농도의 FITC(FITC 단독)로 처리된 세포를 나타내며; 진한 두꺼운 선은 FITC 히스-태그된 CRA 단백질(HCA)로 처리된 세포를 나타내고; r펩타이드에 융합된 FITC 단백질로 처리된 세포는 옅은 두꺼운 선으로 나타나 있고 화살표로 표시되어 있다.
도 7a 내지 7k. aMTD 융합된 재조합 단백질의 시각화된 세포 투과성. NIH3T3 세포를 37℃에서 1시간 동안 aMTD에 융합된 FITC 표지된 단백질(10 μM)로 처리하였다. 상기 단백질의 세포 투과성을 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사(LSM700 version)에 의해 시각화하였다.
도 8a 내지 8b. r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 시각화된 세포 투과성. r펩타이드 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사(LSM700 version)에 의해 시각화하였다.
도 9a 내지 9c. 음성 대조군(rP38) 대비 aMTD 융합된 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성. 상기 도면은 aMTD 및 음성 대조군(A: rP38)에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 10a 내지 10c. 레퍼런스 CPP(MTM12) 대비 aMTD 융합된 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성. 상기 도면은 aMTD 및 레퍼런스 CPP(MTM12)에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 11a 내지 11c. 레퍼런스 CPP(MTD85) 대비 aMTD 융합된 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성. 상기 도면은 aMTD 및 레퍼런스 CPP(MTD85)에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성을 비교하는 그래프를 나타낸다.
도 12. aMTD의 평균 세포 투과성 대비 r펩타이드 매개 재조합 단백질의 상대적 세포 투과성. 상기 도면은 r펩타이드에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성 및 aMTD에 융합된 재조합 단백질의 세포 투과성(평균 값: aMTD AVE)을 비교한 그래프를 나타낸다.
도 13a 및 13b. 세포 투과성과 aMTD 서열 내 아미노산 조성과의 연관성. 이들 그래프는 아미노산 조성(A, I, V 및 L)으로 영향을 받은 aMTD의 전달 잠재성(기하 평균)을 나타낸다.
도 14a 및 14b. 세포 투과성과 aMTD에서의 결정 인자와의 연관성. 이들 그래프는 세포 투과성과 결정 인자[굽힘 잠재성: 프롤린 위치(PP), 강성/유연성: 불안정성 지수(II), 구조적 특징: 지방족 지수(AI) 및 소수성 지수: 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)]와의 연관성을 나타낸다.
도 15a 및 15b. aMTD 매개 세포 투과성과 결정 인자와의 상대적 관련성. 전달 잠재성에서 10개의 높은 순위 및 10개의 낮은 순위의 aMTD의 세포 투과성을 결정 인자[굽힘 잠재성: 프롤린 위치(PP), 강성/유연성: 불안정성 지수(II), 구조적 특징: 지방족 지수(AI) 및 소수성 지수: 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)]와의 연관성에 대해 조사하였다.
도 16. r펩타이드 매개 세포 투과성과 소수성 지수 범위(GRAVY)와의 상대적 관련성. 이 그래프와 차트는 r펩타이드 매개 세포 투과성과 그의 소수성 지수 범위(GRAVY)의 상대적 관련성을 도시한다.
본 발명은 단백질, 펩타이드, 핵산, 화합물 등을 포함하는 생물학적 활성 거대분자가 세포 내 원형질 막을 횡단하는 것을 용이하게 하는, 의생물 과학, 전임상 및 임상 연구에 적용가능한 세포 투과성을 갖는, 제한되지 않은 수의 디자인으로 확장될 수 있는 기본 플랫폼인 신규 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열에 관한 것이다.
본 발명은 aMTD 서열의 세포 투과 능력을 촉진하는 이들 결정 인자를 분석, 확인, 및 결정한다. 이들 aMTD 서열은 종래 공개된 소수성 CPP의 심층 분석으로부터 결정된 결정 인자(CF)에 기초하여 인공적으로 조립된다.
본 발명의 또 다른 양태는 aMTD 서열을 생물학적 활성 카고 분자에 융합함으로써 세포 투과성을 갖는 생물학적 활성 분자를 유전적으로 조작하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 aMTD가 생물학적 활성 카고 분자에 부착된 세포 투과성 재조합 단백질을 포함하는 생물학적 활성 분자를 세포에 전달하기 위한 그의 치료 적용에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 생물학적 활성 거대분자에 융합된 aMTD 서열로 구성된 세포 투과성 재조합 단백질의 작제물로서 생물학적 활성 거대분자가 살아있는 세포 내로 들어갈 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 분자 전달, 약물 전달, 단백질 요법, 세포내 단백질 요법, 단백질 대체 요법, 펩타이드 요법, 유전자 전달 등을 위한 aMTD 서열의 효율적 사용에 관한 것이다.
본 발명의 aMTD 서열은 세포의 원형질 막을 통한 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 도메인, 또는 전장 단백질을 포함하는 생물학적 활성 거대분자의 전달을 매개할 수 있는 최초의 인공적으로 개발된 세포 투과성 폴리펩타이드이다.
1. 개선된 MTD 의 개발을 위한 '결정 인자'를 확인하기 위한 레퍼런스 소수성 CPP 의 분석
종래 보고된 MTD는 1,500개가 넘는 신호 펩타이드 서열의 선별(screen)로부터 선택되었다. 개발된 MTD는 공통 서열 또는 서열 모티프를 가지지 않았지만, 이들은 모두 소수성 및 알파-나선 형태를 채택하는 경향을 제외하고 공통 서열 또는 모티프가 결여된 신호 서열의 소수성(H) 영역(HRSS)으로부터 유래되었다. H-영역 서열의 광범위한 변이는 막 전좌 활성을 갖는 단백질에 대한 이전의 진화 및 SRP/Sec61 기계에 대한 후속 적응을 반영할 수 있으며, 상기 SRP/Sec61 기계는 매우 다양한 신호 펩타이드 서열을 수용하기 위해 SRP 내의 메티오닌-풍부 신호 펩타이드 결합 포켓을 이용한다.
종래 기술된 소수성 CPP(예컨대, MTS/MTM 및 MTD)는 분비된 단백질 및 세포 표면 단백질의 신호 펩타이드에 존재하는 소수성 영역으로부터 유래되었다. 선행 기술은 첫째로, H-영역 서열(MTS/MTM)의 임시 사용(ad hoc use), 및 둘째로, 1,500개 신호 서열의 선별로부터 선택된 가장 높은 CPP 활성을 갖는 H-영역 서열(변형이 있거나 없음)(MTM)로 이루어진다. 두 번째 선행 기술인 변형된 H-영역 유래의 소수성 CPP 서열은 섬유아세포 성장인자(FGF) 4로부터 유래된 MTS/MTM을 제외하고 다수의 이용가능한 서열을 갖는 다양성에 있어서 개선되었다. 그러나, 자연적으로 존재하는 분비된 단백질로부터 변형될 수 있는 MTD의 수는 다소 제한적이다. 이들의 세포 투과성을 결정하는데 규칙이 없기 때문에, 변형된 MTD 서열의 세포 투과성은 이들을 시험하기 전까지 예측할 수 없다.
상기 소수성 CPP는, 이들이 유래된 신호 펩타이드와 마찬가지로, 공통 서열을 따르지 않았고, 단백질 카고 내로 혼입될 때 단백질 용해도에 악영향을 미쳤다. 따라서, 본 발명자들은 단백질 용해도를 유지하면서 단백질을 포함하는 거대 분자 카고를 세포 및 조직 내로 전달하는 향상된 능력을 갖는 새로운 소수성 CPP를 디자인하기 위해, 최적 서열 및 구조적 결정인자, 즉 결정 인자(CF)를 확인하고자 하였다. 이러한 새롭게 개발된 CPP인 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD)은 상기 결정 인자에 기초하여 디자인되고 개발될 수 있는 거의 무한한 가능한 디자인을 가능하게 하였다. 또한, 이들의 세포 투과성은 어떤 시험관내 및/또는 생체내 실험을 수행하기 전에 이들의 특성 분석에 의해 예측될 수 있다. 하기의 이러한 결정 인자는 모든 공개된 레퍼런스 소수성 CPP를 분석함으로써 개발되었다.
1-1. 소수성 CPP 의 분석
1995년부터 2014년까지 공개된(표 2) 17개의 상이한 소수성 CPP(표 1)를 선택하였다. 선택된 소수성 CPP의 생리학적 및 화학적 특성을 분석한 후, 세포 투과성과 연관될 수 있는 11개의 상이한 특성을 추가 분석을 위해 선택하였다. 이러한 11개의 특성은 다음과 같다: 서열, 아미노산 길이, 분자량, pI 값, 굽힘 잠재성, 강성/유연성, 구조적 특징, 소수성 지수, 잔기 구조, 아미노산 조성 및 서열의 이차 구조(표 3).
하기 표 1은 선택된 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드의 요약을 나타낸다.
Figure pct00003
하기 표 2는 참조 정보를 요약한다.
Figure pct00004
하기 표 3은 분석된 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(A)의 특성을 나타낸다.
Figure pct00005
두 가지 펩타이드/단백질 분석 프로그램을 사용하여(ExPasy: SoSui: http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html) 펩타이드 서열의 다양한 지수 및 구조적 특징을 결정하고, 새로운 서열을 디자인하였다. 하기는 분석된 중요한 인자이다.
1-2. 분석된 펩타이드의 특성: 길이, 분자량 및 pl 값
분석된 펩타이드의 평균 길이, 분자량 및 pl 값은 각각 10.8±2.4, 1,011±189.6 및 5.6±0.1이었다(표 4)
하기 표 4는 분석된 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(A)의 결정 인자(CF)를 요약한다.
Figure pct00006
1-3. 분석된 펩타이드의 특성: 굽힘 잠재성 - 프롤린 위치(PP)
프롤린(P)이 존재하는지 및/또는 재조합 단백질에서 펩타이드에 굽힘 잠재성을 제공하는 아미노산(들)이 어디에 위치하는지에 관한 사실에 기초하여 굽힘 잠재성(굽힘 또는 비굽힘)을 결정하였다. 프롤린은 그의 측쇄가 알파-탄소 원자뿐만 아니라 백본 질소 원자에 결합된다는 점에서 다른 일반적인 아미노산과 상이하다. 생성된 사이클릭 구조는 폴딩된 펩타이드/단백질 사슬의 굽어진 곳(bend)에서 종종 발견되는 단백질 구조(architecture)에 현저한 영향을 미친다.
17개 중 11개가 '굽힘' 펩타이드로서 결정되었는데, 이는 프롤린이 펩타이드 굽힘을 위해 서열의 중간에 존재하고/하거나 단백질 굽힘을 위해 펩타이드의 말단에 위치한다는 것을 의미한다. 상기에 나타난 바와 같이, 펩타이드 서열은 "굽은" 형태로 원형질 막을 투과할 수 있다. 그러므로, 굽힘 또는 비굽힘 잠재성은 현 소수성 CPP의 향상을 위한 결정 인자 중 하나로서 간주된다.
1-4. 분석된 펩타이드의 특성: 강성/유연성 - 불안정성 지수(Instability Index; II)
임의의 펩타이드의 결정적인 구조적 특징 중 하나는 펩타이드 서열의 온전한 물리화학적 특성인 모티프가 강성인지 또는 유연한지에 관한 사실에 기초하므로, 상기 서열의 불안정성 지수(II)를 결정하였다. 펩타이드의 강성/유연성을 나타내는 지수 값은 매우 다양했지만(8.9 - 79.1), 평균 값은 40.1±21.9였고, 이는 상기 펩타이드가 다소 유연하지만 너무 강성이거나 유연하지 않다는 것을 시사하였다(표 3).
1-5. 분석된 펩타이드의 특성: 구조적 특징 - 구조적 특징(지방족 지수: AI) 및 소수성 지수(소수성 지수의 전체 평균: GRAVY)
알라닌(V), 발린(V), 류신(L) 및 이소류신(I)은 지방족 측쇄를 함유하고, 소수성, 즉 물에 대한 혐오감을 가지며 응집되는 것을 좋아한다. 소수성 및 지방족 잔기를 갖는 이러한 아미노산들은 상기 아미노산들이 꽉 채워져 구멍이 거의 없는 치밀한 구조를 형성하게 한다. 분석된 펩타이드 서열은 17개 중 하나(MTD10 - 표 3)에서만 글리신(G)을 제외하고 모든 구성 아미노산이 소수성(A, V, L 및 I)이었으며, 지방족(A, V, L, I, 및 P)이었음을 나타내었다. 이들의 소수성 지수(hydropathic index)(소수성 지수의 전체 평균: GRAVY) 및 지방족 지수(AI)는 각각 2.5±0.4 및 217.9±43.6이었다. 이들의 아미노산 조성이 또한 표 3에 나타나 있다.
1-6. 분석된 펩타이드의 특성: 이차 구조(나선도( Helicity ))
상기에 설명한 바와 같이, CPP 서열은 α-나선 형태를 갖는 소수성 서열을 갖는 "굽은" 배열로 막 내로 삽입된 후 곧바로 원형질 막을 투과하는 것으로 가정될 수 있다. 또한, 본 발명자들의 분석은 굽힘 잠재성이 막 투과에 매우 중요하다는 것을 강하게 나타내었다. 그러므로, 상기 서열이 나선을 형성하는지 여부를 결정하기 위해 상기 펩타이드의 구조 분석을 수행하였다. 9개의 펩타이드는 나선이었고, 8개는 그렇지 않았다(표 3). 나선 구조가 필요하지 않을 수 있다는 것을 시사하는 것으로 보인다.
1-7. 결정 인자(CF)의 결정
분석된 11개의 특성에서, 하기 6개, 즉 새로운 소수성 CPP인 개선된 MTD의 개발을 위한 "결정 인자"가 선택된다: 아미노산 길이, 굽힘 잠재성(프롤린 존재 및 위치), 강성/유연성(불안정성 지수: II), 구조적 특징(지방족 지수: AI), 소수성 지수(GRAVY) 및 아미노산 조성/잔기 구조(소수성 및 지방족 A/a)(표 3 및 표 4).
2. '결정 인자'를 최적화하기 위한 선택된 소수성 CPP 의 분석
지난 20년간 종래 개발된 17개의 상이한 소수성 CPP의 분석 데이터(분석 A, 표 3 및 4)가 높은 편차를 나타내어 공통 특징을 만들기 어려웠으므로, 향상된 CPP-aMTD의 더 나은 디자인을 위한 결정 인자를 최적화하기 위해 분석 B(표 5 및 6) 및 C(표 7 및 8)를 또한 수행하였다. 따라서, 17개의 소수성 CPP를 2개의 그룹으로 나누고, 상기 그룹을 세포 투과성 특성과 관련된 특성에 대해 분석하였다. 상기 그룹의 분석 데이터를 비교 및 대조하고 세포 투과 특성에 결정적일 수 있는 상동성 특징을 결정함으로써 결정 인자를 최적화하였다.
2-1. 생체내에서 생물학적 활성 카고 단백질에 사용된 펩타이드의 선택적 분석(B)
분석 B에서, 8개의 CPP를 생체내에서 각각의 생물학적 활성 카고와 함께 사용하였다. 길이는 11±3.2였지만, 8개 CPP 중 3개는 굽힘 잠재성이 거의 없었다. 강성/유연성은 41±15였지만, 상기 펩타이드 중 하나[MTD85: 강성임, 최소(II: 9.1)]를 제거하면 전체 불안정성 지수가 45.6±9.3으로 증가하였다. 이것은 더 높은 유연성(40 또는 이상 II)이 잠재적으로 더 좋다는 것을 시사하였다. 8개 CPP의 다른 모든 특성은 구조적 특징 및 소수성 지수를 포함하는 분석 A와 유사하였다(표 5 및 6)
하기 표 5는 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(B)의 특성을 나타낸다: 생체내에서 각각의 카고에 사용된 선택된 CPP.
Figure pct00007
하기 표 6은 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(B)의 요약된 결정 인자를 나타낸다.
Figure pct00008
2-2. 굽힘 잠재성 및 더 높은 유연성을 제공한 펩타이드의 선택적 분석(C)
분석 A, B 및 C에서 결정된 '결정 인자'가 소수성 CPP의 현재의 문제(MTS/MTM 또는 MTD에 융합된 재조합 단백질의 단백질 응집, 낮은 용해도/수율, 및 불량한 세포/조직 투과성, 및 상기 펩타이드의 비공통 서열 및 비상동 구조)를 향상시키는데 정확하였다는 것을 입증한 aMTD 및 무작위 펩타이드(rP 또는 r펩타이드)의 실제 디자인을 위해 '결정 인자의 공통 범위 및/또는 공통 특징'을 최적화하고자, 경험적으로 선택된 펩타이드를 대상으로 이들의 구조적 특징 및 물리화학적 인자 지수에 대해 분석하였다.
굽힘 잠재성이 없는 소수성 CPP, 강성이거나 너무 유연한 서열(너무 낮거나 너무 높은 불안정성 지수), 또는 너무 낮거나 너무 높은 소수성 CPP는 선택하지 않았고, 서열의 나선 구조가 필요하지 않았기 때문에 이차 구조는 고려하지 않았다.
분석 C에서, 굽힘 잠재성 및 더 높은 유연성을 제공할 수 있는 8개의 선택된 CPP 서열을 최종 분석하였다(표 7 및 8). 일반적인 아미노산 길이는 12개(11.6±3.0)이다. 프롤린은 서열의 중간 및/또는 말단에 존재해야 한다. 강성/유연성(II)은 45.5 - 57.3(평균: 50.1±3.6)이다. 펩타이드의 구조적 특징 및 소수성을 나타내는 AI 및 GRAVY는 각각 204.7±37.5 및 2.4±0.3이다. 모든 펩타이드는 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I, 및 P)으로 구성된다. 따라서, 분석 C를 새로운 소수성 CPP-aMTD의 새로운 디자인을 위한 표준으로서 선택하였다.
하기 표 7은 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(C)의 특성을 나타낸다: 굽힘 잠재성 및 더 높은 유연성을 제공한 선택된 CPP.
Figure pct00009
하기 표 8은 공개된 소수성 세포 투과성 펩타이드(C)의 요약된 결정 인자를 나타낸다.
Figure pct00010
3. 최적화된 결정 인자에 기초하여 향상된 소수성 CPP - aMTD 의 새로운 디자인
3-1. 공통 서열 및/또는 공통 상동 구조의 결정
전술한 바와 같이, 신호 서열(HRSS) 유래의 CPP(MTS/MTM 및 MTD)의 H-영역은 공통 서열, 서열 모티프, 및/또는 공통 구조적 상동성 특징을 갖지 않는다. 본 발명에서, 목적은 '공통 기능'을 갖도록, 즉 분석된 레퍼런스 CPP와 유사한 기전으로 막을 통과하는 단백질 전좌를 용이하게 하도록, 새롭게 결정된 '결정 인자'를 만족하는 공통 서열 및 구조적 모티프로 형식화된 향상된 소수성 CPP를 개발하는 것이다. 분석 A, B 및 C에 기초하여, 상동성 특징을 분석하여 세포 투과성에 영향을 미치는 결정 인자를 결정하였다. 각 결정 인자의 범위 값은 신규 aMTD를 디자인하는 분석 A, B 및 C로부터 제기된 각 결정 인자의 분석된 지수를 포함하는 것으로 결정되었다(표 9). 이러한 특징은 이들의 세포 투과성에서 새롭게 디자인된 aMTD를 이용하여 실험적으로 확인되었다.
하기 표 9는 분석된 CPP의 값과 신규 aMTD 서열의 새로운 디자인에 대해 결정된 값 사이의 각각의 결정 인자의 범위/특징의 비교를 나타낸다.
Figure pct00011
상기 표 9에, 보편적인 공통 특징 및 서열/구조적 모티프가 제공되어 있다. 길이는 9-13개 아미노산이며, 굽힘 잠재성은 펩타이드 굽힘을 위해 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8' 아미노산에) 및 재조합 단백질 굽힘을 위해 펩타이드의 말단에 프롤린의 존재로 제공되어 있고, II>40인 aMTD의 강성/유연성이 표 9에 기재되어 있다.
3-2. 개선된 MTD 의 개발을 위한 결정 인자
단백질을 포함하는 치료 활성 카고 분자를 살아있는 세포 내로 전달하는 소수성 CPP에 융합된 재조합 세포 투과성 단백질이 종래에 보고되었지만, 박테리아 시스템에서 발현된 융합 단백질은 낮은 용해도 및 수율 때문에 가용성 형태로 정제되기 어려웠다. 단백질 기반 바이오치료제로서 세포 투과성 단백질의 추가적인 임상 개발을 위해 상기 결정적인 약점을 해결하고자, 결정 인자 기반의 펩타이드 분석을 통해 개선된 MTD(aMTD)로 명명된 매우 향상된 형태의 소수성 CPP가 새롭게 개발되었다. aMTD의 현 발명을 위해 사용된 결정 인자가 본원에 제시되어 있다(표 9).
1. 아미노산 길이: 9 - 13
2. 굽힘 잠재성(프롤린 위치: PP)
: 서열의 중간(5' 내지 8' 아미노산) 및 말단에 프롤린 존재
3. 강성/유연성(불안정성 지수: II): 40 - 60
4. 구조적 특징(지방족 지수: AI): 180 - 220
5. 소수성 지수(소수성 지수의 전체 평균: GRAVY): 2.1 - 2.6
6. 아미노산 조성: 소수성 및 지방족 아미노산 - A, V, L, I 및 P
3-3. 모든 결정 인자가 고려되고 만족되는 잠재적인 최선의 aMTD 의 디자인
소수성 CPP의 독특한 특징의 분석으로부터 비롯된 6개의 결정 인자를 면밀히 고려한 후, 상기 분석으로부터 결정된 아미노산 길이(9 - 13)를 포함하는 결정 인자를 만족하는 공통적인 12개 아미노산 플랫폼에 기초하여 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD)을 디자인하고 개발하였다.
[일반식]
Figure pct00012
이들의 세포 투과성을 결정하기 위해 많은 실험을 필요로 하는 종래 공개된 소수성 CPP와 달리, 새롭게 개발된 aMTD 서열은 각 결정 인자의 결정된 범위 값/특징을 따르는 상기 언급된 플랫폼을 이용하여 하기와 같이 단지 몇 가지 단계를 수행함으로써 디자인될 수 있었다.
첫째, aMTD를 위한 12개 아미노산 서열 플랫폼을 준비한다. 둘째, 서열의 말단(12')에 프롤린(P)을 위치시키고 5', 6', 7', 및 8의 4개의 U 중 하나에 프롤린을 위치시킬 장소를 결정한다. 셋째, 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 X(들) 및/또는 U(들)에 위치시키고, 여기에 프롤린은 위치시키지 않는다. 마지막으로, 상기 플랫폼에 위치한 이 디자인된 아미노산 서열이 aMTD 서열의 세포 투과 특성을 보장하는 6개의 결정 인자의 값 또는 특징을 만족시키는지를 결정한다. 이러한 과정을 통해, 많은 신규 aMTD 서열이 제작되었다. 각 aMTD에 융합된 비기능적 카고 재조합 단백질을 제조하기 위해, 발현 벡터를 제작하였고 박테리아 세포에서 강제 발현시켰다. 이러한 aMTD 융합된 재조합 단백질을 가용성 형태로 정제하고 이들의 세포 투과성을 정량적으로 결정하였다. 표 10 - 15에 나타난 바와 같이, 1부터 240까지 번호가 매겨진 240개의 aMTD 서열이 새롭게 디자인되었다. 표 10 - 15에서, 서열번호는 참조용 서열 목록이고, aMTD 번호는 실험에서 실제 사용된 아미노산 목록 번호를 지칭한다. 추가 실험을 위해, aMTD 번호가 사용되었다. 또한, 상기 서열 목록에 나타난 폴리뉴클레오타이드 서열을 서열번호: 241부터 서열번호: 480까지 번호를 매겼다.
하기 표 10 내지 15는 모든 결정 인자를 만족하도록 개발된 240개의 새로운 소수성 aMTD 서열을 나타낸다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
3-4. 적어도 하나의 결정 인자를 만족하지 않은 펩타이드의 디자인
전술한 모든 결정 인자를 만족하는 새로운 소수성 CPP-aMTD의 본 발명이 정확하고 합리적으로 디자인된다는 것을 입증하기 위해, 적어도 하나의 결정 인자를 만족하지 않는 펩타이드를 또한 디자인하였다. 총 31개의 r펩타이드(rP)를 디자인하고, 개발하며, 하기와 같이 분류한다: 비굽힘(no bending) 펩타이드, 중간 뿐만 아니라 말단에 프롤린이 없고/없거나 중앙 프롤린이 없음; 강성인 펩타이드(II < 40); 너무 유연한 펩타이드; 방향족 펩타이드(방향족 고리 존재); 소수성이지만, 비방향족인 펩타이드; 친수성이지만 비지방족인 펩타이드.
3-4-1. 굽힘 잠재성을 만족하지 않는 펩타이드
표 16은 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단에 어떠한 프롤린도 갖지 않는 펩타이드를 나타낸다. 또한, 표 16은 서열의 중간에 프롤린을 갖지 않는 펩타이드를 기술한다. 이러한 모든 펩타이드는 굽힘 잠재성을 갖지 않는 것으로 가정된다.
Figure pct00019
3-4-2. 강성/유연성을 만족하지 않는 펩타이드
서열의 강성/유연성이 결정적인 결정 인자임을 입증하기 위해, 강성인 서열(Avg. II: 21.8±6.6) 및 너무 유연성이 높은 서열(Avg. II: 82.3±21.0)을 또한 디자인하였다. 불안정성 지수가 새로운 aMTD(II: 41.3 - 57.3, Avg. II: 53.3±5.7)보다 훨씬 더 낮은 강성인 펩타이드가 표 17에 나타나 있다. II가 새로운 aMTD보다 훨씬 더 높은, 굽어지지만 너무 유연성이 높은 펩타이드 또한 표 18에 제공되어 있다.
Figure pct00020
Figure pct00021
3-4-3. 구조적 특징을 만족하지 않는 펩타이드
새로운 소수성 CPP-aMTD는 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)만으로 구성되며, 지수의 평균 범위는 AI: 180 - 220이고 GRAVY: 2.1 - 2.6이다(표 9). 구조적 지수에 기초하여, 방향족 잔기(W, F 또는 Y)를 함유하는 펩타이드가 표 19에 나타나 있으며, 소수성이지만 방향족 잔기를 갖지 않는 비방향족인 서열인 펩타이드를 디자인한다(표 20). 최종적으로, 비지방족 아미노산으로 구성된 친수성 및/또는 굽힘 펩타이드가 표 21에 나타나 있다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
3-5. 새롭게 디자인된 펩타이드의 요약
총 457개의 서열이 결정 인자에 기초하여 디자인되었다. 결정 인자의 모든 범위/특징을 만족하는 디자인된 잠재적으로 최선인 aMTD(소수성, 유연성, 굽힘, 지방족 및 12-A/a 길이 펩타이드)는 316개이다. 결정 인자 중 적어도 하나를 만족하지 않는 디자인된 r펩타이드는 141개이며, 이 중에서 비굽힘 펩타이드 서열은 26개이고; 강성인 펩타이드(II<40) 서열은 23개이며; 너무 유연한 펩타이드는 24개이고; 방향족 펩타이드(방향족 고리 존재)는 27개이며; 소수성이지만 비방향족인 펩타이드는 23개이고; 친수성이지만 비지방족인 펩타이드는 18개이다.
4. aMTD 및 r 펩타이드에 융합된 재조합 리포트 단백질의 제조
aMTD 및 다른 것[r펩타이드, 레퍼런스 소수성 CPP 서열(MTM 및 MTD)]에 융합된 재조합 단백질을 박테리아 시스템에서 발현시키고, 단일 단계 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 생리학적 조건에서 가용성 단백질로서 제조하였다. 이러한 재조합 단백질을 유세포분석법 및 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사를 이용하여 세포 투과 능력에 대해 시험하였다.
4-1. 펩타이드 서열에 융합된 재조합 단백질에 대한 카고 단백질의 선택
임상/비임상 적용을 위해, aMTD 융합된 카고 물질은 생물학적 활성 분자일 것이며, 이는 하기 중 하나일 수 있다: 효소, 전사 인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체 및 항체 단편. 더욱이, 생물학적 활성 분자는 이러한 하기 거대분자 중 하나일 수 있다: 효소, 호르몬, 캐리어, 면역글로불린, 막 결합 단백질, 막관통 단백질, 내부 단백질, 외부 단백질, 분비된 단백질, 바이러스 단백질, 천연(native) 단백질, 당단백질, 단편화된 단백질, 디설파이드 결합 단백질, 재조합 단백질, 화학적으로 변형된 단백질 및 프리온. 또한, 이러한 생물학적 활성 분자는 하기 중 하나일 수 있다: 핵산, 코딩 핵산 서열, mRNA, 안티센스 RNA 분자, 탄수화물, 지질 및 당지질.
이러한 사전요구된 조건에 따르면, aMTD 매개 단백질 흡수를 평가하는 비기능성 카고가 선택되었고 카고 A(CRA)로 불리며, 이는 가용성이며 비기능적일 것이다. 상기 도메인(A/a 289 - 840; 184 A/a 길이)은 단백질 S(Genbank ID: CP000113.1)로부터 유래된다.
4-2. 발현 벡터의 제작 및 재조합 단백질의 제조
각각의 aMTD에 융합된 재조합 단백질에 대한 코딩 서열을 PCR 증폭된 DNA 절편으로부터 pET-28a(+)(Novagen, Darmstadt, Germany) 내의 Ndel(5') 및 SalI(3') 내로 클로닝한다. aMTD 및 r펩타이드에 융합된 재조합 단백질에 대한 PCR 프라이머 및 아미노산 서열이 각각 표 23 내지 38에 요약되어 있다. 재조합 단백질의 구조가 도 1에 나타나 있다.
상기 재조합 단백질을 0.6의 OD600까지 성장한 E. coli BL21(DE3) 세포에서 강제적으로 발현시키고 0.7 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 2시간 동안 유도하였다. 상기 단백질을 자연 조건에서 제조사(Qiagen, Hilden, Germany)에 의해 지시된 바와 같이 Ni2 + 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제 후, 정제된 단백질을 DMEM 배지와 같은 생리학적 버퍼에 용해시켰다.
Figure pct00025
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4-3. aMTD 또는 무작위 펩타이드 (rP) 융합된 재조합 단백질의 발현
본 발명은 또한 세포 투과성을 갖는 aMTD 서열의 개발 방법에 관한 것이다. 표준화된 6개의 결정 인자를 이용하여, 316개의 aMTD 서열이 디자인되었다. 또한, 이러한 결정 인자 중 하나가 결여된 141개의 r펩타이드를 또한 개발한다: 비굽힘 펩타이드: i) 서열의 중간 및 말단 모두에서의 프롤린의 부재 또는 ii) 서열의 중간 또는 말단에서의 프롤린의 부재, 강성인 펩타이드, 너무 유연한 펩타이드, 방향족 펩타이드(방향족 고리 존재), 소수성이지만 비방향족인 펩타이드, 및 친수성이지만 비지방족인 펩타이드(표 22).
이러한 r펩타이드는 펩타이드의 세포내 전달 잠재성에 관한 각 결정 인자의 구조/서열 활성 관계(SAR)를 분석하기 위해 aMTD와 비교 및 대조되도록 고안된다. 모든 펩타이드(aMTD 또는 r펩타이드) 함유 재조합 단백질은 발현될 재조합 단백질의 용해도를 향상시키기 위해 CRA에 융합되고, 정제되며, 제조되고, 분석되었다.
CRA에 융합된 이들 디자인된 316개의 aMTD 및 141개의 r펩타이드를 모두 클로닝하고(도 2) E. coli에서 유도성 발현에 대해 시험하였다(도 3). 이러한 펩타이드 중에서, 240개의 aMTD가 유도성으로 발현되었고, 정제되었으며, 가용성 형태로 제조되었다(도 4). 또한, 31개의 r펩타이드가 또한 가용성 형태로서 제조되었다(도 4).
r펩타이드에 융합된 단백질을 제조하기 위해, 60개의 단백질이 발현되었고, 26개 r펩타이드 중 10개는 비굽힘 펩타이드의 카테고리에 속하였고(표 16); 23개 중 15개는 강성인 펩타이드[불안정성 지수(II) < 40 ]의 카테고리에 속하였으며(표 17); 24개 중 19개는 너무 유연한 펩타이드의 카테고리에 속하였고(표 18); 27개 중 6개는 방향족 펩타이드의 카테고리에 속하였으며(표 19); 23개 중 8개는 소수성이지만 비방향족인 펩타이드의 카테고리에 속하였고(표 20); 18개 중 12개는 친수성이지만 비지방족인 펩타이드의 카테고리에 속하였다(표 21).
4-4. aMTD 융합된 재조합 단백질의 정량적 세포 투과성
aMTD 및 r펩타이드를 형광 표지하고 유세포분석법 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사를 이용하여 세포 투과성에 대한 결정 인자에 기초하여 비교하였다(도 5 내지 8). 펩타이드 융합된 비기능성 카고 재조합 단백질의 세포 흡수는 유세포분석법에서 정량적으로 평가될 수 있는 반면, 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사는 세포내 흡수가 시각적으로 평가될 수 있게 한다. 상기 분석은 aMTD(소수성 및 지방족 서열)와 반대 특성(친수성 및 방향족 서열: YYNQSTCGGQCY)을 갖는 음성 대조군[rP38]에 융합된 재조합 단백질을 포함하였다. 음성 대조군에 대한 aMTD의 상대적 세포 투과성(상대적 배수)을 또한 분석하였다(표 39 및 도 9).
하기 표 39는 음성 대조군(A: rP38)과 aMTD의 세포 투과성의 비교 분석을 나타낸다.
Figure pct00042
레퍼런스 CPP[B: MTM12(AAVLLPVLLAAP), C: MTD85(AVALLILAV)]에 대한 aMTD의 상대적 세포 투과성(상대적 배수)을 또한 분석하였다(표 40 및 41).
하기 표 40은 레퍼런스 CPP(B: MTM12)와 aMTD의 세포 투과성의 비교 분석을 나타낸다.
Figure pct00043
하기 표 41은 레퍼런스 CPP(C: MTD85)와 aMTD의 세포 투과성의 비교 분석을 나타낸다.
Figure pct00044
임의의 펩타이드(rP38 또는 aMTD)가 결여된 비융합(naked) 단백질(히스티딘-태그된 CRA 단백질)에 의해 차감된 음성 대조군(히스티딘-태그된 rP38 융합된 CRA 재조합 단백질)의 기하 평균을 상대적 배수 1로서 표준화하였다. 음성 대조군(A 유형)에 대한 240개 aMTD의 상대적 세포 투과성은 164배까지 유의하게 증가하였고, 평균 증가는 19.6±1.6이었다(표 42 - 47).
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
더욱이, 레퍼런스 CPP(B 유형: MTM12 및 C 유형: MTD85)와 비교하여, 신규 240개 aMTD는 각각 평균 13±1.1(최대 109.9) 및 6.6±0.5(최대 55.5)배 더 높은 세포 투과성이었다(표 42 - 47).
Figure pct00050
또한, 31개 r펩타이드의 세포 투과성을 240개 aMTD와 비교하였다(0.3±0.04; 표 48 및 49).
Figure pct00051
Figure pct00052
요약하면, aMTD의 상대적 세포 투과성은 각각 rP38, MTM12 및 MTD85보다 최대 164.0, 109.9 및 55.5배 더 높았다. 총 240개 aMTD 서열의 평균에서, 각각 19.6±1.6, 13.1±1.1 및 6.6±0.5배 더 높은 세포 투과성이 rP38, MTM12 및 MTD85에 대해 나타난다(표 42-47). 240개 aMTD에 대한 음성 대조군(rP38)의 상대적 세포 투과성은 단지 0.3±0.04배이다.
4-5. aMTD 융합된 재조합 단백질의 세포내 전달 및 국소화
aMTD에 융합된 재조합 단백질을 음성 대조군(rP38) 및 양성 대조군 참조로서 종래 공개된 CPP(MTM12 및 MTD85)를 이용한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사에 의해 시험하여 이들의 세포내 전달 및 국소화를 결정하였다. NIH3T3 세포를 37℃에서 1시간 동안 10 μM의 FITC 표지된 단백질에 노출시키고, 핵을 DAPI로 반대염색하였다. 그리고 나서, 세포를 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에 의해 조사하였다(도 7). aMTD에 융합된 재조합 단백질은 세포내 전달 및 세포질 국소화를 명확하게 나타내며(도 7), 이는 전형적으로 레퍼런스 CPP(MTM12 및 MTD85)보다 더 높다. rP38 융합된 재조합 단백질은 국소화된 형광 신호를 나타내지 않았다(도 7a). 또한, 도 8에서 나타난 바와 같이, r펩타이드(각 r펩타이드에 융합된 히스-태그된 CRA 재조합 단백질)는 더 낮은 세포 투과성 또는 비세포 투과성을 나타낸다.
4-6. 새롭게 개발된 aMTD 의 정량적 및 시각적 세포 투과성의 요약
히스티딘-태그된 aMTD 융합된 카고 재조합 단백질은 용해도 및 수율이 크게 향상되었다. 따라서, FITC 접합된 재조합 단백질을 또한 단백질의 세포내 국소화를 정량화하고 시각화하기 위해 시험하였고 레퍼런스 CPP 대비 더 높은 세포 투과성을 입증하였다.
소수성 신호 서열 유래의 CPP-MTS/MTM 또는 MTD를 이용한 종래 연구에서, 17개의 공개된 서열이 확인되었고 길이, 분자량, pI 값, 굽힘 잠재성, 강성, 유연성, 구조적 특징, 소수성 지수, 아미노산 잔기 및 조성, 및 펩타이드의 이차 구조와 같은 다양한 특성이 분석되었다. 상기 서열의 이러한 분석 데이터에 기초하여, 개선된 MTD(aMTD)로서 지정된 신규 인공 및 비천연 펩타이드 서열을 발명하였고, aMTD 융합된 재조합 단백질을 이용하여 세포내 전달 잠재성에서의 이들의 기능적 활성을 결정하였다.
aMTD 융합된 재조합 단백질은 r펩타이드 및/또는 레퍼런스 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85)를 함유하는 재조합 단백질과 비교하여 세포 내로의 단백질 전달 능력을 촉진하였다. 상기 결과에 따르면, 세포 투과성 펩타이드 서열의 결정 인자가 원형질 막 통과에 의한 펩타이드 매개 세포내 전달을 결정하는 주요 역할을 한다는 것이 입증되었다. 또한, 세포 투과성은 결정 인자를 모두 만족하는 근거를 따름으로써 상당히 향상될 수 있다.
5. 전달 잠재성에 대한 aMTD 의 구조/서열 활성 관계( SAR )
신규 aMTD의 세포 투과성을 결정한 후, 신규 aMTD의 선택된 일부 및 모두에서 각 결정 인자에 대해 구조/서열 활성 관계(SAR)를 분석하였다(도 13 내지 16 및 표 50).
Figure pct00053
5-1. 프롤린 위치: 굽힘 잠재성(프롤린 위치: PP)과 관련하여, 서열 내 7' 또는 8' 아미노산에 프롤린을 갖는 aMTD는 프롤린 위치가 5' 또는 6'인 서열과 비교하여 훨씬 더 높은 세포 투과성을 갖는다(도 14a 및 15a).
5-2. 소수성 지수: 또한, aMTD가 2.1 - 2.2 범위의 GRAVY(소수성 지수의 전체 평균)를 가질 때, 이들 서열은 상대적으로 더 낮은 세포 투과성을 나타내는 반면, 2.3 - 2.6 GRAVY를 갖는 aMTD는 유의하게 더 높은 세포 투과성을 나타낸다(도 14b 및 15b).
5-3. r펩타이드 SAR: aMTD의 SAR에 대해, r펩타이드는 그들의 프롤린 위치(PP) 및 소수성 지수(GRAVY)과 관련된 세포 투과성에서 유사한 SAR 상관관계를 나타내었다. 이러한 결과는 높은 GRAVY(2.4 ~ 2.6)를 갖는 r펩타이드가 더 우수한 세포 투과성을 갖는다는 것을 확인시켜준다(도 16).
5-4. 아미노산 조성의 분석: 프롤린 위치 및 소수성 지수 외에도, 아미노산 조성의 차이를 또한 분석한다. aMTD는 결정 인자에 기초하여 디자인되므로, 각각의 aMTD 융합된 재조합 단백질은 조성 내에 동일하게 2개의 프롤린 서열을 갖는다. 다른 소수성 및 지방족 아미노산인 알라닌, 이소류신, 류신 및 발린은 조합되어 aMTD 펩타이드 서열의 나머지를 형성한다.
알라닌: 아미노산의 조성에서, 상기 결과는 aMTD의 전달 잠재성 측면에서 알라닌의 수에 의해 유의한 차이를 나타내지 않는데, aMTD 모두가 3개 내지 5개의 알라닌을 가지기 때문이다. 그러나, 상기 서열에서, 4개의 알라닌 조성이 가장 효과적인 전달 잠재성(기하 평균)을 나타낸다(도 13a).
류신 및 이소류신 : 한편, aMTD 서열에서 이소류신 및 류신의 조성은 aMTD의 아미노산(I 및 L)의 수 및 전달 잠재성 사이에 역관계를 나타낸다. 서열에서 이소류신 및 류신의 수가 더 적을수록 더 높은 전달 잠재성(기하 평균)을 가지는 경향이 있다(도 13a 및 13b).
발린: 반대로, aMTD 서열의 발린의 조성은 이들의 세포 투과성과 양의 상관관계를 나타낸다. 서열에서 발린의 수가 적은 경우, aMTD의 전달 잠재성 역시 상대적으로 낮다(도 13b).
가장 높은 세포 투과성을 갖는 10개의 aMTD를 선택한다(평균 기하 평균: 2584±126). 서열에서 이들의 발린의 평균 수는 3.5이며; 상대적으로 낮은 세포 투과성(평균 기하 평균: 80±4)을 갖는 10개의 aMTD는 평균 1.9개의 발린 아미노산을 가지고 있었다. 서열에서 발린의 평균 수는 도 13b에 나타난 바와 같이 이들의 세포 투과성이 낮아짐에 따라 낮아진다. 더 높은 세포 투과성 aMTD 그룹과 비교하여, 더 낮은 서열은 그들의 발린 조성에서 평균 1.9를 가지고 있었다. 따라서, 높은 세포 투과성 서열을 얻기 위해, 평균 2-4개의 발린이 서열에 구성되어야 한다.
5-5. SAR 분석의 결론: 도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 240개의 모든 aMTD를 세포 투과성 및 결정 인자(굽힘 잠재성(PP), 강성/유연성(II), 구조 특징(AI), 및 소수성 지수(GRAVY), 아미노산 길이 및 조성)의 연관성에 대해 조사하였다. 이 분석을 통해, aMTD의 세포 투과성은 이들의 중심 프롤린 위치가 5' 또는 6'이고 GRAVY가 2.1 이하일 때 더 낮은 경향이 있다(도 15). 더욱이, 10개의 더 높은 세포 투과성 aMTD 및 10개의 더 낮은 세포 투과성 aMTD를 조사한 후, 이러한 경향은 세포 투과성의 중심 프롤린 위치 및 소수성 지수와의 연관성을 확인시켜 주는 것으로 명확히 나타난다.
6. 결정 인자의 지수 범위/특징의 실험적 확인
6개의 결정 인자 중 5개의 범위 및 특징은 또한 실험 및 SAR 분석을 수행하기 전에 처음에 제안된 결정 인자의 지수 범위 및 특징에 포함되는 것으로 경험적 및 실험적으로 결정되었다. 새롭게 개발된 240개의 aMTD의 결정 인자의 지수 범위 및 특징의 측면에서, 굽힘 잠재성(프롤린 위치: PP), 강성/유연성(불안정성 지수: II), 구조적 특징(지방족 지수: AI), 소수성 지수(GRAVY), 아미노산 길이 및 조성 모두는 레퍼런스 소수성 CPP의 분석으로부터 유래된 결정 인자의 특성에 속한다.
따라서, 개선된 MTD로서 새로운 소수성 CPP 서열을 디자인하고 개발하는 본 발명자들의 가설은 경험적 및 실험적으로 입증되고, 결정 인자 기반의 새로운 aMTD 합리적 디자인이 정확하다는 것을 입증하였다.
Figure pct00054
7. 본 발명의 요약
본 발명을 위해, 240개의 aMTD 서열이 결정 인자에 기초하여 디자인되고 개발되었다. 240개의 aMTD(소수성, 유연한, 굽힘, 지방족 및 12 a/a 길이 펩타이드)의 정량적 및 시각적 세포 투과성은 모두 실질적으로 결정된다.
aMTD의 세포 투과성을 결정하기 위해, r펩타이드를 또한 디자인하고 시험하였다. 도 13 내지 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 펩타이드의 세포 투과성 및 결정 인자는 분명한 연관성이 있다. 이들 결정 인자 중에서, 본 발명자들은 가장 효과적인 세포 투과성 aMTD가 12개의 아미노산 길이; A, V, L, I 및 P의 조성; 7' 또는 8' 중 어느 하나 및 말단(12')에 위치한 다수의 프롤린; 41.3 - 57.3 범위의 불안정성 지수; 187.5 - 220.0 범위의 지방족 지수; 및 2.2-2.6 범위의 소수성 지수(GRAVY)를 갖는 것으로 설정할 수 있다.
이러한 조사된 결정 인자는 본 발명자들이 결정 인자에 대해 설정한 범위에 속하며; 따라서, 본 발명자들은 이러한 결정 인자를 만족하는 aMTD가 지난 20년 동안 보고된 레퍼런스 소수성 CPP와 비교하여 상대적으로 높은 세포 투과성 및 훨씬 더 높은 세포내 전달 잠재성을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
8. 단백질 요법을 위해 aMTD 에 의해 가능하게 된 MITT를 이용한 단백질 기반의 새로운 바이오치료제의 발견 및 개발
많은 인간 질환이 기능 획득 또는 기능 손실과 같은 돌연변이를 유발하는 결핍 또는 과발현을 가진 단백질에 의해 유발된다는 것이 명확해졌다. 만약 생물학적 활성 단백질이 정량적 방식으로 비정상적인 단백질을 짧은 시간 내에, 아마도 1 또는 2시간 내에 대체하기 위해 전달될 수 있다면, 단백질이 필요한 때와 방법에 따라 복용량이 조절될 수 있다. 본 발명에서 신규 aMTD의 용해도 및 수율을 현저히 향상시킴으로써(표 47), 단백질, 펩타이드, 핵산, 및 다른 화학적 화합물과 같은 치료 거대분자를 살아있는 세포 뿐만 아니라 인간을 포함하는 살아있는 포유동물 내로 효과적으로 전달하는 제제로서 그의 실제적인 잠재성을 기대할 수 있다. 따라서, 신규 aMTD의 집단을 이용하는 새롭게 개발된 MITT(240)는 최적의 카고-aMTD 관계를 결정한 후 세포내 단백질을 이해하기 위해 단백질 기반의 바이오치료제의 발견 및 개발을 위한 플랫폼 기술로서 사용될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실시자를 돕기 위해, 본 발명에 대한 실험적 뒷받침을 제공하기 위해, 그리고 모델 프로토콜을 제공하기 위해 제시된다. 이들 실시예는 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
실시예 1. 신규 개선된 거대분자 전달 도메인( aMTD )의 개발
신호 서열의 H-영역(HRSP) 유래의 CPP(MTS/MTM 및 MTD)는 공통 서열, 서열 모티프, 및/또는 공통 구조적 상동성 특징을 갖지 않는다. 본 발명에서, 목적은 '공통 기능'을 갖도록, 분석된 CPP와 유사한 기전으로 원형질 막을 통과하는 단백질 전좌를 용이하도록, 새롭게 결정된 결정 인자'를 만족하는 공통 서열 및 구조적 모티프로 형식화된 향상된 소수성 CPP를 개발하는 것이다.
상기 구조적 모티프는 하기와 같다:
Figure pct00055
상기 식에서, X(들)는 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 지칭하고; 프롤린(P)이 U(들) 중 하나(5', 6', 7' 또는 8')에 위치할 수 있다. 나머지 U(들)는 A, V, L 또는 I로 구성되고, 12'에 있는 P는 프롤린이다.
표 9에서, 보편적인 공통 서열/구조적 모티프가 하기와 같이 제공되어 있다. 본 발명에서 펩타이드의 아미노산 길이는 9 내지 13개 아미노산, 주로 12개 아미노산의 범위이고, 이들의 굽힘 잠재성은 재조합 단백질의 굽힘을 위해 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8' 아미노산) 및 펩타이드의 말단(12')에서의 프롤린의 존재 및 위치에 의존적이다. aMTD의 강성/유연성에 대한 불안정성 지수(II)는 II<40이고, 소수성 지수에 대한 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY)은 약 2.2이며, 구조적 특징에 대한 지방족 지수(AI)는 약 200이다(표 9). 이러한 표준화된 결정 인자에 기초하여, 본 발명에서 새로운 소수성 펩타이드 서열, 즉 개선된 거대분자 전달 도메인 펩타이드(aMTD)가 개발되었고, 이는 표 10 내지 15에 요약되어 있다.
실시예 2. aMTD 에 융합된 재조합 단백질을 위한 발현 벡터의 제작
본 발명자들이 새롭게 개발한 기술은 세포 투과성 재조합 단백질의 제조방법을 확장시키는 것을 가능하게 하였다. aMTD 또는 r펩타이드에 융합된 히스티딘-태그된 CRA 단백질을 위한 발현 벡터를 디자인하였다. 재조합 단백질용 발현 벡터를 제작하기 위해, 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 각각 디자인된 CRA에 융합된 aMTD 또는 r펩타이드를 증폭하도록 고안되었다.
PCR 반응(100 ng 게놈 DNA, 10 pmol 각각의 프라이머, 각각의 0.2 mM dNTP 혼합물, 1X 반응 버퍼 및 2.5 U Pfu(+) DNA 중합효소(Doctor protein, Korea))을 각 30초 동안 변성(95℃), 어닐링(62℃), 및 연장(72℃)의 35 사이클을 수반하여, Nde I(5') 및 Sal I(3') 사이의 제한효소 부위 상에서 절단하였다. 마지막 연장 사이클 동안, PCR 반응을 72℃에서 5분간 유지시켰다. 그리고 나서, 이들을 pET-28a(+) 벡터(Novagen, Madison, WI, USA)의 부위 내로 클로닝하였다. DNA 라이게이션을 4℃에서 밤새 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 수행하였다. 이러한 플라스미드를 얼음 상에서 10분간 E. coli DH5-알파 균주의 컴피턴트 세포와 혼합하였다. 이 혼합물을 42℃에서 90초 동안 수조에서 열 충격을 가한 후 2분 동안 얼음에 두었다. 그리고 나서, LB 브로쓰 배지가 첨가된 상기 혼합물을 1시간 동안 37℃ 교반 배양기에서 회복시켰다. 형질전환체를 카나마이신(50 μg/mL)(Biopure, Johnson, TN)을 갖는 LB 브로쓰 아가 플레이트 상에 도말한 후, 37℃에서 밤새 배양하였다. 단일 콜로니로부터, 플라스미드 DNA를 추출하고, Nde I 및 Sal I 제한 효소의 절단 후, 절단된 DNA를 1.2% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 645 bp에서 확인하였다(도 2). aMTD 및 무작위 펩타이드(r펩타이드)에 융합된 CRA 재조합 단백질에 대한 PCR 프라이머가 표 23 내지 30에 요약되어 있다. aMTD 및 r펩타이드 프라이머의 아미노산 서열이 표 31 내지 38에 나타나 있다.
실시예 3. aMTDs 및 r 펩타이드에 융합된 재조합 단백질의 유도성 발현, 정제 및 제조
재조합 단백질을 발현하기 위해, 음성 대조군[r펩타이드 38(rP38)], 레퍼런스 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85) 및 aMTD에 융합된 CRA 단백질의 발현을 위한 pET-28a(+) 벡터를 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. 세포를 카나마이신(50 μg/ml)을 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 강하게 진탕하면서 성장시키고 37℃에서 2시간 동안 0.7 mM IPTG(Biopure)를 첨가하여 OD600=0.6로 유도하였다. 유도된 재조합 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 상에 로딩하고 쿠마시 브릴리언트 블루(InstantBlue, Expedeon, Novexin, UK)로 염색하였다(도 3).
E. coli 배양물을 10분 동안 5,000x rpm에서 원심분리에 의해 채취하고, 상층액을 버렸다. 펠렛을 용해 버퍼(50 mM NaH2PO4, 10 mM Imidazol, 300 mM NaCl, pH 8.0)에 재현탁하였다. 상기 세포 용해물을 탐침이 장착된 초음파분쇄기(Sonics and Materials, Inc., Newtowen, CT)를 이용하여 얼음 상에서 초음파분쇄하였다. 세포 용해물을 5,000 x rpm에서 10분간 원심분리하여 세포 잔해를 펠렛화한 후, 상층액을 개방 컬럼 시스템(Bio-rad, Hercules, CA)에 의해 부드럽게 용해 버퍼 평형화된 Ni-NTA 수지(Qiagen, Hilden, Germany)와 함께 배양하였다. 단백질 결합된 수지를 200 ml 세척 버퍼(50 mM NaH2PO4, 20 mM Imidazol, 300 mM NaCl, pH 8.0)로 세척한 후, 결합된 단백질을 용출 버퍼(50 mM NaH2PO4, 250 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, pH 8.0)로 용출시켰다.
자연 조건 하에 정제된 재조합 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하였다(도 4). 재조합 단백질 모두를 8시간 동안 그리고 세포 배양 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM, Hyclone, Logan, UT) 및 둘베코 인산 완충 염수(DPBS, Gibco, Grand Island, NY)의 혼합물에 대해 밤새 투석하였다. 클로닝된 316개의 aMTD 및 141개의 r펩타이드로부터, 240개의 aMTD 및 31개의 r펩타이드 융합된 재조합 단백질을 유도, 정제 및 제조하여 세포 투과성에 대해 분석하였다.
실시예 4. 재조합 단백질의 정량적 세포 투과성의 결정
정량적 세포 투과성을 위해, aMTD 또는 r펩타이드 융합된 재조합 단백질을 제조사(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 지침에 따라 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)에 접합시켰다. RAW 264.7 세포를 37℃에서 1시간 동안 10 μM FITC 표지된 재조합 단백질로 처리하고, 차가운 PBS로 3회 세척하고, 37℃에서 20분간 0.25% 트립신/EDTA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 처리하여 세포 표면 결합된 단백질을 제거하였다. 이들 재조합 단백질의 세포 투과성을 FlowJo 세포계측 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포분석법(Guava, Millipore, Darmstadt, Germany)에 의해 분석하였다(도 5 내지 6). aMTD의 상대적 세포 투과성을 측정하고 음성 대조군(rP38) 및 레퍼런스 소수성 CPP(MTM12 및 MTD85)와 비교하였다(표 47).
실시예 5. 재조합 단백질의 세포 투과성 및 세포내 국소화의 결정
세포 투과성의 시각적 참조를 위해, NIH3T3 세포를 24-웰 챔버 슬라이드에서 커버슬립 상에서 24시간 동안 배양하고, 37℃에서 1시간 동안 10 μM FITC 접합된 재조합 단백질로 처리하고, 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 처리된 세포를 실온에서 10분간 4% 파라포름알데하이드(PFA, Junsei, Tokyo, Japan)에서 고정하고, PBS로 3회 세척하고, VECTASHIELD 마운팅 배지(Vector laboratories, Burlingame, CA)로 올려놓고, DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)로 반대염색하였다. 형광 신호의 세포내 국소화를 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(LSM700, Zeiss, Germany; 도 7 및 8)에 의해 결정하였다.
<110> JO, Daewoong Cellivery Therapeutics, Inc. <120> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability, Polynucleotides Encoding the Same, Method to Identify the Unique Features of aMTDs Comprising the Same, Method to develop the aMTD sequences Comprising the Same <130> OPP-2015-0032-KR <150> US 62/038346 <151> 2014-08-17 <160> 480 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 1 Ala Ala Ala Leu Ala Pro Val Val Leu Ala Leu Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 2 Ala Ala Ala Val Pro Leu Leu Ala Val Val Val Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of 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Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 226 Ala Ile Ile Ile Val Val Pro Ala Ile Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 227 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 227 Ala Ile Leu Ile Val Val Ala Pro Ile Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 228 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 228 Ala Val Ile Val Pro Val Ala Ile Ile Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 229 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 229 Ala Val Val Ile Ala Leu Pro Ala Val Val Ala Pro 1 5 10 <210> 230 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 230 Ala Leu Val Ala Val Ile Ala Pro Val Val Ala Pro 1 5 10 <210> 231 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 231 Ala Leu Val Ala Val Leu Pro Ala Val Ala Val Pro 1 5 10 <210> 232 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 232 Ala Leu Val Ala Pro Leu Leu Ala Val Ala Val Pro 1 5 10 <210> 233 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 233 Ala Val Leu Ala Val Val Ala Pro Val Val Ala Pro 1 5 10 <210> 234 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 234 Ala Val Ile Ala Val Ala Pro Leu Val Val Ala Pro 1 5 10 <210> 235 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 235 Ala Val Ile Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro 1 5 10 <210> 236 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 236 Val Ala Ile Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro 1 5 10 <210> 237 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 237 Val Ala Leu Ala Leu Ala Pro Val Val Val Ala Pro 1 5 10 <210> 238 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 238 Val Ala Ala Leu Leu Pro Ala Val Val Val Ala Pro 1 5 10 <210> 239 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 239 Val Ala Leu Ala Leu Pro Ala Val Val Val Ala Pro 1 5 10 <210> 240 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) Sequences for Improvement of Cell-Permeability <400> 240 Val Ala Leu Leu Ala Pro Ala Val Val Val Ala Pro 1 5 10 <210> 241 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 241 gcggcggcgc tggcgccggt ggtgctggcg ctgccg 36 <210> 242 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 242 gcggcggcgg tgccgctgct ggcggtggtg gtgccg 36 <210> 243 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 243 gcggcgctgc tggtgccggc ggcggtgctg gcgccg 36 <210> 244 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 244 gcgctggcgc tgctgccggt ggcggcgctg gcgccg 36 <210> 245 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 245 gcggcggcgc tgctgccggt ggcgctggtg gcgccg 36 <210> 246 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 246 gtggtggcgc tggcgccggc gctggcggcg ctgccg 36 <210> 247 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 247 ctgctggcgg cggtgccggc ggtgctgctg gcgccg 36 <210> 248 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 248 gcggcggcgc tggtgccggt ggtggcgctg ctgccg 36 <210> 249 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 249 gcggtggcgc tgctgccggc gctgctggcg gtgccg 36 <210> 250 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 250 gcggtggtgc tggtgccggt gctggcggcg gcgccg 36 <210> 251 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 251 gtggtgctgg tgctgccggc ggcggcggcg gtgccg 36 <210> 252 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 252 attgcgctgg cggcgccggc gctgattgtg gcgccg 36 <210> 253 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 253 attgtggcgg tggcgccggc gctggtggcg ctgccg 36 <210> 254 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 254 gtggcggcgc tgccggtggt ggcggtggtg gcgccg 36 <210> 255 <211> 36 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gtgccg 36 <210> 259 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 259 gcggcgctgc tggtgccggc gctggtggcg gtgccg 36 <210> 260 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 260 gcgattgtgg cgctgccggt ggcggtgctg gcgccg 36 <210> 261 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 261 attgcgattg tggcgccggt ggtggcgctg gcgccg 36 <210> 262 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 262 gcggcgctgc tgccggcgct ggcggcgctg ctgccg 36 <210> 263 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 263 gcggtggtgc tggcgccggt ggcggcggtg ctgccg 36 <210> 264 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 264 ctggcggtgg cggcgccgct ggcgctggcg ctgccg 36 <210> 265 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 265 gcggcggtgg cggcgccgct gctgctggcg ctgccg 36 <210> 266 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 266 ctgctggtgc tgccggcggc ggcgctggcg gcgccg 36 <210> 267 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 267 ctggtggcgg tggcgccggt ggcggcggtg ctgccg 36 <210> 268 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 268 ctggcgctgg cgccggcggc gctggcgctg ctgccg 36 <210> 269 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 269 gcgctgattg cggcgccgat tctggcgctg gcgccg 36 <210> 270 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 270 gcggtggtgg cggcgccgct ggtgctggcg ctgccg 36 <210> 271 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 271 ctgctggcgc tggcgccggc ggcgctgctg gcgccg 36 <210> 272 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 272 gcgattgtgg cgctgccggc gctggcgctg gcgccg 36 <210> 273 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 273 gcggcgatta ttgtgccggc ggcgctgctg gcgccg 36 <210> 274 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 274 attgcggtgg cgctgccggc gctgattgcg gcgccg 36 <210> 275 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 275 gcggtgattg tgctgccggc gctggcggtg gcgccg 36 <210> 276 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 276 gcggtgctgg cggtgccggc ggtgctggtg gcgccg 36 <210> 277 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 277 gtgctggcga ttgtgccggc ggtggcgctg gcgccg 36 <210> 278 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 278 ctgctggcgg tggtgccggc ggtggcgctg gcgccg 36 <210> 279 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 279 gcggtgattg cgctgccggc gctgattgcg gcgccg 36 <210> 280 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 280 gcggtggtgg cgctgccggc ggcgctgatt gtgccg 36 <210> 281 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 281 ctggcgctgg tgctgccggc ggcgctggcg gcgccg 36 <210> 282 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 282 ctggcggcgg tgctgccggc gctgctggcg gcgccg 36 <210> 283 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 283 gcgctggcgg tgccggtggc gctggcgatt gtgccg 36 <210> 284 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 284 gcgctgattg cgccggtggt ggcgctggtg gcgccg 36 <210> 285 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 285 ctgctggcgg cgccggtggt gattgcgctg gcgccg 36 <210> 286 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 286 ctggcggcga ttgtgccggc gattattgcg gtgccg 36 <210> 287 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 287 gcggcgctgg tgctgccgct gattattgcg gcgccg 36 <210> 288 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 288 ctggcgctgg cggtgccggc gctggcggcg ctgccg 36 <210> 289 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 289 ctgattgcgg cgctgccggc ggtggcggcg ctgccg 36 <210> 290 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 290 gcgctggcgc tggtgccggc gattgcggcg ctgccg 36 <210> 291 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 291 gcggcgattc tggcgccgat tgtggcgctg gcgccg 36 <210> 292 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 292 gcgctgctga ttgcgccggc ggcggtgatt gcgccg 36 <210> 293 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 293 gcgattctgg cggtgccgat tgcggtggtg gcgccg 36 <210> 294 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 294 attctggcgg cggtgccgat tgcgctggcg gcgccg 36 <210> 295 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 295 gtggcggcgc tgctgccggc ggcggcggtg ctgccg 36 <210> 296 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 296 gcggcggcgg tggtgccggt gctgctggtg gcgccg 36 <210> 297 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 297 gcggcgctgc tggtgccggc gctggtggcg gcgccg 36 <210> 298 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 298 gcggcggtgc tgctgccggt ggcgctggcg gcgccg 36 <210> 299 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 299 gcggcggcgc tggcgccggt gctggcgctg gtgccg 36 <210> 300 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 300 ctggtgctgg tgccgctgct ggcggcggcg gcgccg 36 <210> 301 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 301 gcgctgattg cggtgccggc gattattgtg gcgccg 36 <210> 302 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 302 gcgctggcgg tgattccggc ggcggcgatt ctgccg 36 <210> 303 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 303 ctggcggcgg cgccggtggt gattgtgatt gcgccg 36 <210> 304 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 304 gtgctggcga ttgcgccgct gctggcggcg gtgccg 36 <210> 305 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 305 gcgctgattg tgctgccggc ggcggtggcg gtgccg 36 <210> 306 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 306 gtgctggcgg tggcgccggc gctgattgtg gcgccg 36 <210> 307 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 307 gcggcgctgc tggcgccggc gctgattgtg gcgccg 36 <210> 308 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 308 gcgctgattg cgccggcggt ggcgctgatt gtgccg 36 <210> 309 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 309 gcgattgtgc tgctgccggc ggcggtggtg gcgccg 36 <210> 310 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 310 gtgattgcgg cgccggtgct ggcggtgctg gcgccg 36 <210> 311 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 311 ctggcgctgg cgccggcgct ggcgctgctg gcgccg 36 <210> 312 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 312 gcgattattc tggcgccgat tgcggcgatt gcgccg 36 <210> 313 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 313 attgcgctgg cggcgccgat tctgctggcg gcgccg 36 <210> 314 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 314 attgtggcgg tggcgctgcc ggcgctggcg gtgccg 36 <210> 315 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 315 gtggtggcga ttgtgctgcc ggcgctggcg gcgccg 36 <210> 316 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 316 attgtggcgg tggcgctgcc ggtggcgctg gcgccg 36 <210> 317 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 317 attgtggcgg tggcgctgcc ggcggcgctg gtgccg 36 <210> 318 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 318 attgtggcgg tggcgctgcc ggcggtggcg ctgccg 36 <210> 319 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 319 attgtggcgg tggcgctgcc ggcggtgctg gcgccg 36 <210> 320 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 320 gtgattgtgg cgctggcgcc ggcggtgctg gcgccg 36 <210> 321 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 321 attgtggcgg tggcgctgcc ggcgctggtg gcgccg 36 <210> 322 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 322 gcgctgctga ttgtggcgcc ggtggcggtg gcgccg 36 <210> 323 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 323 gcggtggtga ttgtggcgcc ggcggtgatt gcgccg 36 <210> 324 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 324 gcggtgctgg cggtggcgcc ggcgctgatt gtgccg 36 <210> 325 <211> 36 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gcgccg 36 <210> 329 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 329 gtgattgtgg cgctggcgcc ggcgctgctg gcgccg 36 <210> 330 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 330 gtgattgtgg cgattgcgcc ggcgctgctg gcgccg 36 <210> 331 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 331 attgtggcga ttgcggtgcc ggcgctggtg gcgccg 36 <210> 332 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 332 gcggcgctgg cggtgattcc ggcggcgatt ctgccg 36 <210> 333 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 333 gcgctggcgg cggtgattcc ggcggcgatt ctgccg 36 <210> 334 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 334 gcggcggcgc tggtgattcc ggcggcgatt ctgccg 36 <210> 335 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 335 ctggcggcgg cggtgattcc ggcggcgatt ctgccg 36 <210> 336 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 336 ctggcggcgg cggtgattcc ggtggcgatt ctgccg 36 <210> 337 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 337 gcggcgattc tggcggcgcc gctgattgcg gtgccg 36 <210> 338 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 338 gtggtggcga ttctggcgcc gctgctggcg gcgccg 36 <210> 339 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 339 gcggtggtgg tggcggcgcc ggtgctggcg ctgccg 36 <210> 340 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 340 gcggtggtgg cgattgcgcc ggtgctggcg ctgccg 36 <210> 341 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 341 gcgctggcgg cgctggtgcc ggcggtgctg gtgccg 36 <210> 342 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 342 gcgctggcgg cgctggtgcc ggtggcgctg gtgccg 36 <210> 343 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 343 ctggcggcgg cgctggtgcc ggtggcgctg gtgccg 36 <210> 344 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 344 gcgctggcgg cgctggtgcc ggcgctggtg gtgccg 36 <210> 345 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 345 attgcggcgg tgattgtgcc ggcggtggcg ctgccg 36 <210> 346 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 346 attgcggcgg tgctggtgcc ggcggtggcg ctgccg 36 <210> 347 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 347 gcggtggcga ttctggtgcc gctgctggcg gcgccg 36 <210> 348 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 348 gcggtggtga ttctggtgcc gctggcggcg gcgccg 36 <210> 349 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 349 attgcggcgg tgattgtgcc ggtggcggcg ctgccg 36 <210> 350 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 350 gcgattgcga ttgcgattgt gccggtggcg ctgccg 36 <210> 351 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 351 attctggcgg tggcggcgat tccggtggcg gtgccg 36 <210> 352 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 352 attctggcgg cggcgattat tccggcggcg ctgccg 36 <210> 353 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 353 ctggcggtgg tgctggcggc gccggcgatt gtgccg 36 <210> 354 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 354 gcgattctgg cggcgattgt gccgctggcg gtgccg 36 <210> 355 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 355 gtgattgtgg cgctggcggt gccggcgctg gcgccg 36 <210> 356 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 356 gcgattgtgg cgctggcggt gccggtgctg gcgccg 36 <210> 357 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 357 gcggcgatta ttattgtgct gccggcggcg ctgccg 36 <210> 358 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 358 ctgattgtgg cgctggcggt gccggcgctg gcgccg 36 <210> 359 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 359 gcgattatta ttgtgattgc gccggcggcg gcgccg 36 <210> 360 <211> 36 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attgtggcgc tgattgtggc gccggcggcg gtgccg 36 <210> 368 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 368 gtggtgctgg tgctggcggc gccggcggcg gtgccg 36 <210> 369 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 369 gcggcggtgg cgattgtgct gccggcggtg gtgccg 36 <210> 370 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 370 gcgctgattg cggcgattgt gccggcgctg gtgccg 36 <210> 371 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 371 gcgctggcgg tgattgtggt gccggcgctg gcgccg 36 <210> 372 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 372 gtggcgattg cgctgattgt gccggcgctg gcgccg 36 <210> 373 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 373 gtggcgattg tgctggtggc gccggcggtg gcgccg 36 <210> 374 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 374 gtggcggtgg cgctgattgt gccggcgctg gcgccg 36 <210> 375 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 375 gcggtgattc tggcgctggc gccgattgtg gcgccg 36 <210> 376 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 376 gcgctgattg tggcgattgc gccggcgctg gtgccg 36 <210> 377 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 377 gcggcgattc tgattgcggt gccgattgcg gcgccg 36 <210> 378 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 378 gtgattgtgg cgctggcggc gccggtgctg gcgccg 36 <210> 379 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 379 gtgctggtgg cgctggcggc gccggtgatt gcgccg 36 <210> 380 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 380 gtggcgctga ttgcggtggc gccggcggtg gtgccg 36 <210> 381 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 381 gtgattgcgg cggtgctggc gccggtggcg gtgccg 36 <210> 382 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 382 gcgctgattg tgctggcggc gccggtggcg gtgccg 36 <210> 383 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 383 gtggcggcgg cgattgcgct gccggcgatt gtgccg 36 <210> 384 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 384 attctggcgg cggcggcggc gccgctgatt gtgccg 36 <210> 385 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 385 ctggcgctgg tgctggcggc gccggcgatt gtgccg 36 <210> 386 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 386 gcgctggcgg tggtggcgct gccggcgatt gtgccg 36 <210> 387 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 387 gcggcgattc tggcgccgat tgtggcggcg ctgccg 36 <210> 388 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 388 attctgattg cgattgcgat tccggcggcg gcgccg 36 <210> 389 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 389 ctggcgattg tgctggcggc gccggtggcg gtgccg 36 <210> 390 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 390 gcggcgattg cgattattgc gccggcgatt gtgccg 36 <210> 391 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 391 ctggcggtgg cgattgtggc gccggcgctg gtgccg 36 <210> 392 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 392 ctggcgattg tgctggcggc gccggcggtg ctgccg 36 <210> 393 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 393 gcggcgattg tgctggcgct gccggcggtg ctgccg 36 <210> 394 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 394 gcgctgctgg tggcggtgct gccggcggcg ctgccg 36 <210> 395 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 395 gcggcgctgg tggcggtgct gccggtggcg ctgccg 36 <210> 396 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 396 gcgattctgg cggtggcgct gccgctgctg gcgccg 36 <210> 397 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 397 attgtggcgg tggcgctggt gccggcgctg gcgccg 36 <210> 398 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 398 attgtggcgg tggcgctgct gccggcgctg gcgccg 36 <210> 399 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 399 attgtggcgg tggcgctgct gccggcggtg gcgccg 36 <210> 400 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 400 attgtggcgc tggcggtgct gccggcggtg gcgccg 36 <210> 401 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 401 gtggcggtgc tggcggtgct gccggcgctg gcgccg 36 <210> 402 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 402 attgcggtgc tggcggtggc gccggcggtg ctgccg 36 <210> 403 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 403 ctggcggtgg cgattattgc gccggcggtg gcgccg 36 <210> 404 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 404 gtggcgctgg cgattgcgct gccggcggtg ctgccg 36 <210> 405 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 405 gcgattgcga ttgcgctggt gccggtggcg ctgccg 36 <210> 406 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 406 gcggcggtgg tgattgtggc gccggtggcg ctgccg 36 <210> 407 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 407 gcggcgattc tggcgattgt ggcgccgctg gcgccg 36 <210> 408 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 408 gtggcgctgc tggcgattgc gccggcgctg gcgccg 36 <210> 409 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 409 gtggcggtgc tgattgcggt gccggcgctg gcgccg 36 <210> 410 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 410 gcggtggcgc tggcggtgct gccggcggtg gtgccg 36 <210> 411 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 411 gcggtggcgc tggcggtggt gccggcggtg ctgccg 36 <210> 412 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 412 attgtggtga ttgcggtggc gccggcggtg gcgccg 36 <210> 413 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 413 attgtggtgg cggcggtggt gccggcgctg gcgccg 36 <210> 414 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 414 attgtggcgc tggtgccggc ggtggcgatt gcgccg 36 <210> 415 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 415 gtggcggcgc tgccggcggt ggcgctggtg gtgccg 36 <210> 416 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 416 ctggtggcga ttgcgccgct ggcggtgctg gcgccg 36 <210> 417 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 417 gcggtggcgc tggtgccggt gattgtggcg gcgccg 36 <210> 418 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 418 gcgattgcgg tggcgattgc gccggtggcg ctgccg 36 <210> 419 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 419 gcgattgcgc tggcggtgcc ggtgctggcg ctgccg 36 <210> 420 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 420 ctggtgctga ttgcggcggc gccgattgcg ctgccg 36 <210> 421 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 421 ctggtggcgc tggcggtgcc ggcggcggtg ctgccg 36 <210> 422 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 422 gcggtggcgc tggcggtgcc ggcgctggtg ctgccg 36 <210> 423 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 423 ctggtggtgc tggcggcggc gccgctggcg gtgccg 36 <210> 424 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 424 ctgattgtgc tggcggcgcc ggcgctggcg gcgccg 36 <210> 425 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 425 gtgattgtgc tggcggcgcc ggcgctggcg gcgccg 36 <210> 426 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 426 gcggtggtgc tggcggtgcc ggcgctggcg gtgccg 36 <210> 427 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 427 ctgattattg tggcggcggc gccggcggtg gcgccg 36 <210> 428 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 428 attgtggcgg tgattgtggc gccggcggtg gcgccg 36 <210> 429 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 429 ctggtggcgc tggcggcgcc gattattgcg gtgccg 36 <210> 430 <211> 36 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gtgccg 36 <210> 434 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 434 attattgtgg cggtggcgcc ggcggcgatt gtgccg 36 <210> 435 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 435 gcggtggcgg cgattgtgcc ggtgattgtg gcgccg 36 <210> 436 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 436 gcggtgctgg tgctggtggc gccggcggcg gcgccg 36 <210> 437 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 437 gtggtggcgc tgctggcgcc gctgattgcg gcgccg 36 <210> 438 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 438 gcggcggtgg tgattgcgcc gctgctggcg gtgccg 36 <210> 439 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 439 attgcggtgg cggtggcggc gccgctgctg gtgccg 36 <210> 440 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 440 ctggtggcga ttgtggtgct gccggcggtg gcgccg 36 <210> 441 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 441 gcggtggcga ttgtggtgct gccggcggtg gcgccg 36 <210> 442 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 442 gcggtgattc tgctggcgcc gctgattgcg gcgccg 36 <210> 443 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 443 ctggtgattg cgctggcggc gccggtggcg ctgccg 36 <210> 444 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 444 gtgctggcgg tggtgctgcc ggcggtggcg ctgccg 36 <210> 445 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 445 gtgctggcgg tggcggcgcc ggcggtgctg ctgccg 36 <210> 446 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 446 gcggcggtgg tgctgctgcc gattattgcg gcgccg 36 <210> 447 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 447 gcgctgctgg tgattgcgcc ggcgattgcg gtgccg 36 <210> 448 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 448 gcggtgctgg tgattgcggt gccggcgatt gcgccg 36 <210> 449 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 449 gcgctgctgg tggtgattgc gccgctggcg gcgccg 36 <210> 450 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 450 gtgctggtgg cggcgattct gccggcggcg attccg 36 <210> 451 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 451 gtgctggtgg cggcggtgct gccgattgcg gcgccg 36 <210> 452 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 452 gtgctggcgg cggcggtgct gccgctggtg gtgccg 36 <210> 453 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 453 gcgattgcga ttgtggtgcc ggcggtggcg gtgccg 36 <210> 454 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 454 gtggcgatta ttgcggtgcc ggcggtggtg gcgccg 36 <210> 455 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 455 attgtggcgc tggtggcgcc ggcggcggtg gtgccg 36 <210> 456 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 456 gcggcgattg tgctgctgcc ggcggtggtg gtgccg 36 <210> 457 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 457 gcggcgctga ttgtggtgcc ggcggtggcg gtgccg 36 <210> 458 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 458 gcgattgcgc tggtggtgcc ggcggtggcg gtgccg 36 <210> 459 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 459 ctggcgattg tgccggcggc gattgcggcg ctgccg 36 <210> 460 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 460 ctggtggcga ttgcgccggc ggtggcggtg ctgccg 36 <210> 461 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 461 gtgctggcgg tggcgccggc ggtggcggtg ctgccg 36 <210> 462 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 462 attctggcgg tggtggcgat tccggcggcg gcgccg 36 <210> 463 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 463 attctggtgg cggcggcgcc gattgcggcg ctgccg 36 <210> 464 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 464 attctggcgg tggcggcgat tccggcggcg ctgccg 36 <210> 465 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 465 gtgattgcga ttccggcgat tctggcggcg gcgccg 36 <210> 466 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 466 gcgattatta ttgtggtgcc ggcgattgcg gcgccg 36 <210> 467 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 467 gcgattctga ttgtggtggc gccgattgcg gcgccg 36 <210> 468 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 468 gcggtgattg tgccggtggc gattattgcg gcgccg 36 <210> 469 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 469 gcggtggtga ttgcgctgcc ggcggtggtg gcgccg 36 <210> 470 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 470 gcgctggtgg cggtgattgc gccggtggtg gcgccg 36 <210> 471 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 471 gcgctggtgg cggtgctgcc ggcggtggcg gtgccg 36 <210> 472 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 472 gcgctggtgg cgccgctgct ggcggtggcg gtgccg 36 <210> 473 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 473 gcggtgctgg cggtggtggc gccggtggtg gcgccg 36 <210> 474 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 474 gcggtgattg cggtggcgcc gctggtggtg gcgccg 36 <210> 475 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 475 gcggtgattg cgctggcgcc ggtggtggtg gcgccg 36 <210> 476 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 476 gtggcgattg cgctggcgcc ggtggtggtg gcgccg 36 <210> 477 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 477 gtggcgctgg cgctggcgcc ggtggtggtg gcgccg 36 <210> 478 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 478 gtggcggcgc tgctgccggc ggtggtggtg gcgccg 36 <210> 479 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 479 gtggcgctgg cgctgccggc ggtggtggtg gcgccg 36 <210> 480 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The polynucleotide sequence that encodes advanced Macromolecule Transduction Domain (aMTD) peptide for Improvement of Cell-Permeability <400> 480 gtggcgctgc tggcgccggc ggtggtggtg gcgccg 36

Claims (18)

  1. 생물학적 활성 거대분자를 원형질 막 내로 전달하며, 하기 특성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는, 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열:
    a. 아미노산 길이: 9 - 13
    b. 굽힘 잠재성(Bending Potential): 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단에 위치한 프롤린(P)
    c. 강성(Rigidity)/유연성(Flexibility): 불안정성 지수(II): 40 - 60
    d. 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 180 - 220
    e. 소수성 지수(Hydropathy): 소수성 지수의 전체 평균(Grand Average of Hydropathy; GRAVY): 2.1 - 2.6
    f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 12개 아미노산 서열로 구성된 하기 일반식을 갖는 것인 aMTD 서열:
    [일반식]
    Figure pct00056

    상기 식에서, X(들)는 알라닌(A), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)을 지칭하고; 프롤린(P)이 U(들) 중 하나(5', 6', 7' 또는 8')에 위치할 수 있으며; 나머지 U(들)는 A, V, L 또는 I로 구성되고, 12'에 있는 P는 프롤린이다.
  3. 제2항에 있어서, 상기 일반식을 갖는 아미노산 서열이 서열번호: 1 내지 서열번호: 240으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 aMTD 서열.
  4. 제2항의 aMTD 서열을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호: 241 내지 서열번호: 480으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 폴리뉴클레오타이드.
  6. aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법으로서,
    종래 공개된 레퍼런스 소수성 CPP로부터 향상된 소수성 CPP를 선택하는 단계;
    선택된 소수성 CPP의 생리학적 및 화학적 특성을 분석하는 단계;
    이러한 생리학적 및 화학적 특성 중에서 특징을 확인하는 단계로서, 세포 투과성과 연관되어 있는 특징이 선택된 것인 단계;
    종래 공개된 레퍼런스 소수성 CPP를 적어도 2개의 그룹으로 분류하고, 이들의 세포 투과성 및 상대적 특성에 기초하여 그룹화된 이러한 CPP를 심층 분석하여 상동성 특징(homologous feature)을 결정하는 단계;
    결정된 상동성 특징의 분석을 통해 확인된 결정 인자(critical factor)를 구성하는 단계;
    실험적 연구를 통해 상기 결정 인자가 유효한지 확인하는 단계; 및
    확인된 실험적 연구에 기초하여 6개의 결정 인자를 결정하는 단계
    를 포함하는 확인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 선택된 향상된 소수성 CPP가 MTM, MTS, MTD10, MTD13, MTD47, MTD56, MTD73, MTD77, MTD84, MTD85, MTD86, MTD103, MTD132, MTD151, MTD173, MTD174 및 MTD181인 확인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 확인된 특징이 아미노산 길이, 분자량, pI 값, 굽힘 잠재성, 강성, 유연성, 구조적 특징, 소수성 지수, 잔기 구조, 아미노산 조성 및 이차 구조인 확인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 결정된 6개의 결정 인자가 하기 특성으로 이루어진 것인 확인 방법:
    a. 아미노산 길이: 9 - 13
    b. 굽힘 잠재성: 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단에 위치한 프롤린(P)
    c. 강성/유연성: 불안정성 지수(II): 40 - 60
    d. 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 180 - 220
    e. 소수성 지수: 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY): 2.1 - 2.6
    f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임.
  10. aMTD 서열을 개발하는 방법으로서,
    aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법에 의해 얻은 6개의 결정 인자를 신중하게 결정한 후 하기 일반식을 갖는 aMTD의 디자인된 플랫폼을 제조하는 단계;
    [일반식]
    Figure pct00057

    프롤린(P)을 서열의 말단(12')에 위치시키고 프롤린이 U 부위 중 어느 부위에 위치해야 하는지 결정하는 단계;
    X(들) 및 프롤린이 위치하지 않은 U(들)에 A, V, L 및/또는 I를 결정하고 위치시키는 단계; 및
    디자인된 아미노산 서열이 6개 결정 인자를 만족하는지 확인하는 단계
    를 포함하는 개발 방법.
  11. 제10항에 있어서, aMTD의 독특한 특징을 확인하는 방법에 의해 얻은 6개의 결정 인자가 하기 특성으로 이루어지는 것인 개발 방법:
    a. 아미노산 서열: 12
    b. 굽힘 잠재성: 프롤린(P)이 서열의 중간(5', 6', 7' 또는 8') 및 말단(12')에 위치해야 함
    c. 강성/유연성: 불안정성 지수(II): 41.3 - 57.3
    d. 구조적 특징: 지방족 지수(AI): 187.5 - 220
    e. 소수성 지수: 소수성 지수의 전체 평균(GRAVY): 2.2 - 2.6
    f. 아미노산 조성: 구성 아미노산 모두가 소수성 및 지방족 아미노산(A, V, L, I 및 P)임.
  12. 제10항에 있어서,
    카고(cargo) 단백질에 융합된 aMTD 서열의 발현 벡터를 개발하는 단계;
    유도성 발현을 위해 적합한 박테리아 균주를 선택하는 단계;
    다양한 생물학적 활성 재조합 단백질에 융합된 aMTD를 가용성 형태로 정제하고 제조하는 단계; 및
    이들의 세포 투과성을 확인하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 개발 방법.
  13. 서열번호: 1 내지 서열번호: 240으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 개선된 거대분자 전달 도메인(aMTD) 서열; 및
    생물학적 활성 분자
    를 포함하는, 세포 투과성을 갖는 단리된 재조합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자가 성장 인자, 효소, 전사 인자, 독소, 항원성 펩타이드, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 단리된 재조합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자가 효소, 호르몬, 캐리어, 면역글로불린, 항체, 구조 단백질, 운동 기능 펩타이드, 수용체, 신호전달 펩타이드, 저장 펩타이드, 막 펩타이드, 막관통 펩타이드, 내부 펩타이드, 외부 펩타이드, 분비성 펩타이드, 바이러스 펩타이드, 천연(native) 펩타이드, 당화 단백질, 단편화된 단백질, 디설파이드 결합 단백질, 재조합 단백질, 화학적으로 변형된 단백질 및 프리온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 단리된 재조합 단백질.
  16. 제13항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자가 핵산, 코딩 핵산 서열, mRNA, 안티센스 RNA 분자, 탄수화물, 지질 및 당지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 단리된 재조합 단백질.
  17. 제13항에 있어서, 상기 생물학적 활성 분자가 바이오치료용 화학물질 및 독성 화학물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 단리된 재조합 단백질.
  18. 세포 투과성을 가질 수 있는 생물학적 활성 분자를 생성하기 위한 최적화되고 효과적인 조건 하에 aMTD를 생물학적 활성 분자에 융합하는 것을 포함하는, 생물학적 활성 분자를 세포 투과성을 갖도록 유전적으로 또는 후생유전적으로 조작 및/또는 변형하는 방법으로서,
    상기 aMTD는 서열번호: 1 내지 서열번호: 240으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 어느 하나로 이루어지는 것인 방법.
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