CN101918556B - 可穿透细胞的nm23重组蛋白、编码其的多核苷酸以及包含其的抗转移组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了可穿透细胞的Nm23重组蛋白，其中大分子转导结构域(MTD)被融合至转移抑制因子Nm23。还公开了编码可穿透细胞的Nm23重组蛋白的多核苷酸、包含可穿透细胞的Nm23重组蛋白的表达载体、以及用于抑制转移的药物组合物，该药物组合物包含作为有效成分的可穿透细胞的Nm23重组蛋白。本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白可以通过有效地将转移抑制因子Nm23引入到细胞中而诱导KSR磷酸化和失活并且抑制Ras-介导的MAPK级联反应。因此，本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白可以有效地用作抗转移剂，其能够通过抑制癌细胞的增殖、分化和迁移而防止癌转移。

Description

可穿透细胞的NM23重组蛋白、编码其的多核苷酸以及包含其的抗转移组合物
技术领域
本发明涉及可穿透细胞的Nm23重组蛋白，其中转移抑制因子Nm23被融合至大分子转导结构域(MTD)，并涉及编码可穿透细胞的Nm23重组蛋白的多核苷酸、用于生产可穿透细胞的Nm23重组蛋白的表达载体以及包括可穿透细胞的Nm23重组蛋白作为用于抑制转移的有效成分的抗转移药物组合物。 
背景技术
已经报道了Nm23基因编码在正常组织的形成和分化中涉及的蛋白质，并且其表达在各种转移细胞中减少。Nm23蛋白质属于肿瘤转移抑制因子并且通常有150至180个氨基酸组成。Nm23蛋白质含有亮氨酸拉链基序并且表现出核苷二磷酸激酶(NDPK)活性。两个人Nm23类似物：Nm23-H1和Nm23-H2由152个氨基酸构成，其分子重量分别为17143和17294。尤其是，已经发现，Nm23-H1在肿瘤转移和其他各种细胞机制包括细胞增殖、胚胎发育、分化和肿瘤形成中起重要作用。 
Nm23影响肿瘤形成和转移的机制还没有被明确地研究出来。NDPK经由共价磷酸化酶中间产物在三磷酸核苷和二磷酸核苷之间转移磷酰基。对于这样的磷酸化，每个Nm23-H1和Nm23-H2的组氨酸118作为靶位点。除了NDPK介导的组氨酸磷酸化，在Nm23中观察到丝氨酸的自动磷酸化(MacDonald NJ et al.，J Biol.Chem. 268：25780-25789，1993)。当与对照细胞比较时，Nm23转染小鼠的黑色素瘤细胞在Nm23丝氨酸的体内磷酸化水平和肿瘤转移可能性的抑制之间存在直接关联。小鼠Nm23的丝氨酸磷酸化在体内通过cAMP抑制，而在体外通过福司柯林(forskolin)抑制，这表明磷酸化受信号转导途径的控制。 
最初，据报道Nm23表达与具有较弱转移可能性的小鼠黑色素瘤细胞系紧密相关。在Nm23的表达减少和肿瘤转移之间的关系被视为支持Nm23作为肿瘤转移抑制因子的事实的直接证据(Steeg，P.S.，Breast Dis.10：47-50，1998)。Nm23的可诱导过表达在高度转移性癌细胞系中表现出明显降低的转移能力。作为公认肿瘤转移抑制基因克隆的Nm23基因表现出丝氨酸/苏氨酸特异的磷酸转移酶和组氨酸蛋白激酶活性，以及NDPK活性。而且，Nm23的表达随着造血干细胞(HSC)分化而降低，这表明Nm23在这些细胞中是抗分化的重要因子(Gervasi，F.et al.，Cell Growth Differ.7：1689-95，1996)。已发现，在强迫可诱导基因表达和人肿瘤的体外转移模型系统中，在临时转染后，Nm23表现出对肿瘤转移的强抑制作用。(Hirayama，R.et al.，J.Natl.Cancer Inst.83：1249-50，1991；Nakayama，T.et al.，J.Natl.Cancer，Inst.84：1349-54，1992；Leone，A.et al.，Oncogene 8：2325-33，1993；Leone，A.et al.，Oncogene 8：855-65，1993)。相反，Nm23突变，导致NDPK活性丧失，对乳癌细胞中的Nm23的抑制功能没有影响(MacDonald，N.J.et al.，J.Biol.Chem.271：25107-16，1996)。 
当Nm23基因被转染到肿瘤细胞系中时，揭示了Nm23是转移抑制因子的事实最权威的证据。在转移的感受态细胞中，相比于对照转染子，给予高剂量Nm23表现出转移活性降低40-98％(Leone，A.et al.，Cell 65：25-35，1991；Leone，A.et al.，Oncogene 8：2325-33，1993)。 
最近，已有报道，Nm23与在果蝇(黑腹果蝇，Drosophilarmelanogaster)和线虫(漂亮新小杆线虫，caenorhabditis elegans)系统中发现的Ras(KSR)的激酶抑制剂相互作用(Morrison，D.K.，J.Cell Sci.114：1609-12，2001)。KSR是促细胞分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)级联的支架蛋白(Burack，W.R.and Shaw，A.S.，Curr.Opin，Cell Biol.12：211-6，2000；Pawson，T.and Scott，J.D.，Science 278：2075-80，1997)。这样的支架蛋白对于增强磷酸化速度是必需的并且有助于磷酸化途径的特异性和稳定化。一旦MAPK信号转导途径由活性Ras激活，则KSR被迫发生去磷酸化，然后用作MAPK级联反应激活的支架。在这个过程期间，Nm23磷酸化KSR丝氨酸392，其是KSR的另一种相关蛋白的结合位点。如果丝氨酸392发生突变，则Nm23磷酸化KSR丝氨酸434。Nm23的转移抑制活性已经通过如下事实明确证实，即转移能力在用Nm23基因转染的各种肿瘤细胞中被抑制(Yoshida，T.et al.，J.Gastroenterol.35：768-74，2000)。在通过MAPK级联的刺激激活的细胞中，在Nm23和KSR之间的相互作用经过组氨酸-依赖性途径以一种复杂方式诱导体外KSR磷酸化(Hartsough，M.T.et al.，J.Biol.Chem.277：32389-99，2002)。而且，KSR和Nm23的体内联合抑制激活MAPK级联的活性Ras的表型效应。 
因此，给予高剂量Nm23蛋白可以在体内使KSR磷酸化并失活，导致Ras介导的MAPK级联的抑制。因此，本发明的发明人认为由KSR的再磷酸化介导的MAPK信号转导途径的抑制可以抑制癌细胞的细胞增殖、分化和迁移，并且在各种人类癌症中表现出抗转移作用，并通过利用Nm23蛋白质而努力开发新型的抗转移剂。 
同时，来源于合成化合物或天然化合物的小分子可以被转运到细胞中，而大分子如蛋白、肽和核酸却不能。如被广泛理解的，大于500kDa的大分子不能穿过活细胞的细胞质膜，即脂质双层结构。 为了克服这个问题，开发了一种大分子细胞内转导技术(MITT)(Joet al.，Nat.Biotech.19：929-33，2001)，其允许将治疗有效的大分子递送到细胞中，使得利用肽、蛋白质和遗传物质来开发新的药物成为可能。根据这种方法，如果将靶大分子融合至疏水性大分子转导结构域(MTD)和其他细胞转运调节剂并以重组蛋白形式合成的、表达的和纯化的，则它能够穿过细胞的细胞质膜脂质双层，被准确地运送至靶位点，然后有效地表现出其治疗作用。这样的MTD有利于融合至肽、蛋白质、DNA、RNA、合成化合物等的许多不可穿透材料转运到细胞中。 
因此，本发明的发明人已经开发了一种介导转移性抑制因子Nm23转运到细胞中的方法，其中可穿透细胞的Nm23重组蛋白质通过将MTD融合至转移抑制因子Nm23而被改造。已发现，这样的可穿透细胞的Nm23重组蛋白有效地介导转移抑制因子Nm23在体内以及在体外转运到细胞中，并且在各种人类癌症中可以被用作抑制转移发生的抗转移剂。 
发明内容
技术问题
因此，本发明的目的是提供作为抗转移剂的可穿透细胞的Nm23重组蛋白，其通过抑制癌细胞增殖、分化和迁移而对防止各种类型的人类癌症中的转移是有效的。 
技术方案
本发明一方面涉及可穿透细胞的Nm23重组蛋白，其通过将具有可穿透细胞的的大分子转导结构域(MTD)融合至转移抑制蛋白而能够介导转移抑制因子Nm23转运到细胞中。 
本发明另一方面涉及编码上述可穿透细胞的Nm23重组蛋白的多核苷酸。 
本发明还涉及含有以上多核苷酸的表达载体，以及用以上表达载体转化的转化体。 
本发明另一方面涉及一种包括培养上述转化体的生产可穿透细胞的Nm23重组蛋白的方法。 
本发明另一方面涉及一种药物组合物，包括作为抑制转移的有效成分的上述可穿透细胞的Nm23重组蛋白。 
附图说明
图1是示意图，示出了根据本发明的被融合至kFGF4-来源的MTD、JO-76MTD和JO-77MTD之一并且以全长形式被构建的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的结构。 
图2a是琼脂糖凝胶电泳分析的照片，示出了根据本发明的编码可穿透细胞的Nm23重组蛋白被融合至kFGF4-来源的MTD并且以全长形式构建的PCR扩增的DNA片段。 
图2b是琼脂糖凝胶电泳分析的照片，示出了根据本发明的编码可穿透细胞的Nm23重组蛋白被融合至JO-76和JO-77MTD中的每一个并且以全长形式构建的PCR扩增的DNA片段。 
图3a是示意图，示出了根据本发明将编码可穿透细胞的Nm23重组蛋白的PCR产物亚克隆入pGEM-T Easy载体中。 
图3b和3c是琼脂糖凝胶电泳分析的照片，分别示出了根据本发明的亚克隆入pGEM-T Easy载体中的图2a和2b中的编码可穿透细胞的Nm23重组蛋白的PCR产物。 
图4a是示意图，示出了根据本发明将编码可穿透细胞的Nm23重组蛋白的重组DNA片段克隆入pET 28(+)载体中。 
图4b和4c是琼脂糖凝胶电泳分析的照片，示出了根据本发明被亚克隆入pET 28(+)载体中的编码可穿透细胞的Nm23重组蛋白的重组DNA片段。 
图5是SDS-PAGE分析的照片，示出了在各种类型的宿主细胞中根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的可诱导表达。 
图6是SDS-PAGE分析的照片，示出了由根据本发明的表达载体被转化到其中的转化体表达的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的纯化。 
图7a和7b是曲线图，示出了根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的可穿透细胞的的流式细胞仪分析的结果。 
图8a至8c是共聚焦激光扫描显微照片，可视化了在小鼠成纤维细胞中根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的细胞穿透性。 
图9a和9b是蛋白质印迹分析的照片，示出了根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白对MAPK信号转导的抑制作用。 
图10a和10b是侵入分析的照片，示出了根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白对转移的抑制作用。 
图11是伤口迁移测定的照片，示出了根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白对转移的抑制作用。 
图12a是照片，示出了在从给予根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的小鼠提取的小鼠肺组织中对转移的抑制作用。 
图12b是免疫组织化学染色的照片，示出了在从给予根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的小鼠提取的小鼠肺组织中，转移标记物波形蛋白(vimentin)的表达。 
图13是末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记(TUNEL)分析的照片，示出了在从给予根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的小鼠提取的小鼠肺组织中的细胞凋亡诱导作用。 
图14是微阵列分析的照片，示出了在从给予根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的小鼠提取的小鼠肺组织中的差异基因表达。 
具体实施方式
本发明提供可穿透细胞的Nm23重组蛋白(CP-Nm23)，其能够介导转移抑制因子Nm23转运到细胞中，其中转移抑制因子Nm23被融合至大分子转导结构域，由此赋予细胞穿透性；以及编码每一种所述可穿透细胞的Nm23重组蛋白的多核苷酸。 
本发明的特征在于一种转移抑制因子Nm23，(其是能够被引入到细胞中的大分子)被融合至特定大分子转导结构域(下文称为 “MTD”)肽以便提供细胞穿透性，因而能够被有效地转运到细胞中。该MTD肽可以融合至转移抑制因子Nm23的N-端、C-端或这两端。 
本发明涉及可穿透细胞的Nm23重组蛋白，其通过将转移抑制因子Nm23融合至能够介导大分子转运到细胞中的三种MTD结构域之一而被改造。 
如本文使用的，术语“可穿透细胞的Nm23重组蛋白”是指有MTD和转移抑制蛋白Nm23的共价结合复合体，其中它们通过遗传融合或化学偶联而功能性地连接。这里，术语“遗传融合”是指通过编码这些蛋白的多核苷酸分子的遗传表达，两个或更多个蛋白或其片段经由它们的个体肽主链的共线性、共价连接。 
Nm23是这样一种转移抑制蛋白质，其通过控制由KSR磷酸化介导的MAPK信号转导级联反应而抑制癌细胞的增殖、分化和迁移，并诱导细胞凋亡。Nm23具有SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列。Nm23在信号转导级联反应(包括KSR和Ras-介导的MAPK)中充当重要的靶蛋白。 
已有报道，Nm23是一种内源性蛋白并且表现出NDP(二磷酸核苷)-激酶酶活性(Biggs et al.，Cell 63，933-940，1990)。还发现Nm23是一种转录因子和细胞分化抑制剂(I因子)(Postel et al.，Science 261，478-480，1993；Okabe-kado et al.，Biochim.Biophys.Acta.1267，101-106，1995)。 
在人体中，至今已经鉴定了8个nm23亚型(nm23-H1，nm23-H2，DR-nm23，nm23-H4，nm23-H5，nm23-H6，nm23-H7和nm23-H8)，所有这些在调控转移中都涉及(Rosengard et al.， Nature 342，177-180，1989；Charpin C.et al.，Int.J.Cancer 74，416-420，1997)。在某些实施方式中，已经构建了Nm23-H1可穿透细胞的重组蛋白，但不限于此。 
对于能够被融合至转移抑制因子Nm23的MTD，可以使用具有选自由SEQ ID NO：4、6、8和37至227组成的组中的氨基酸序列的可穿透细胞的肽。具有选自由SEQ ID NO：4、6、8和37至227组成的组中的氨基酸序列之一的MTD是这样一种可穿透细胞的多肽，其能够介导生物学活性分子如多肽、蛋白质结构域或全长蛋白转运跨过细胞膜。对于本发明，合适的MTD包括，通过在由含有分泌的蛋白切割位点的N-端结构域、疏水性结构域和C-端结构域构成的信号肽处形成螺旋结构，而表现出细胞膜靶向活性的疏水区。这些MTD能够直接穿过细胞膜同时没有引起任何细胞损伤、将靶蛋白转运到细胞中，并由此允许该靶蛋白表现出其期望的功能。 
具有由SEQ ID NO：4、6、8和37至227代表的氨基酸序列且能够被融合至根据本发明的转移抑制因子Nm23的MTD概括在下表1a至11中。 
[表1a] 
Figure 2008801145975A00800101
[0047] 
[表1b] 
Figure 2008801145975A00800112
[0050] 
Figure 2008801145975A00800121
[表1c] 
Figure 2008801145975A00800122
[0053] 
Figure 2008801145975A00800131
[表1d] 
Figure 2008801145975A00800132
[0056] 
Figure 2008801145975A00800141
[表1e] 
Figure 2008801145975A00800142
[0059] 
Figure 2008801145975A00800151
[表1f] 
Figure 2008801145975A00800152
[0062] 
Figure 2008801145975A00800161
[0063] [表1g] 
Figure 2008801145975A00800171
[0065] 
Figure 2008801145975A00800181
[表1h] 
Figure 2008801145975A00800182
[0068] 
Figure 2008801145975A00800191
[表1i] 
Figure 2008801145975A00800192
[0071] 
Figure 2008801145975A00800201
[表1j] 
Figure 2008801145975A00800202
[0074] 
Figure 2008801145975A00800211
[表1k] 
[0077] 
[表1l] 
Figure 2008801145975A00800222
在一些实施方式中，本发明可以采用具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列和SEQ ID NO：4的氨基酸序列的卡波西式成纤维细胞生长因子4(kFGF4)-来源的MTD(下文称为“MTD1”)、具有SEQID NO：5的核苷酸序列和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的JO-76MTD(其是来源于环形泰勒虫(Theileria annulata)的假设蛋白) (下文称为“MTD2”)、以及具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列和SEQID NO：8的氨基酸序列的JO-77MTD(其属于人TMEM9结构域家族的成员B)(下文称为“MTD3”)，作为能够介导转移抑制因子Nm23转运到细胞中的MTD。 
根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白具有这样的结构，其中三种MTD(kFGF4来源的MTD：MTD1，JO-76：MTD2，JO-77：MTD3)中的一个融合至转移抑制蛋白Nm23的一个末端或两个末端，并且SV40大T抗原-来源的核定位序列(NLS)(SEQ ID NO：9的核苷酸序列，SEQ ID NO：10的氨基酸序列)和对于易于纯化的组氨酸标签(His-Tag)亲和性结构域融合至所得构建体的一个末端。 
在另一个实施方式中，本发明涉及通过利用kFGF4来源的MTD、JO-76MTD、JO-77MTD中的一个来构建可穿透细胞的Nm23重组蛋白的8个全长形式。 
如本文使用的，术语“全长形式”是指这样的构建体，其包括转移抑制蛋白Nm23的整个氨基酸序列，其不包括在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的任何缺失、添加、插入或取代。然而，对于本领域技术人员来说应当是显而易见的，在本发明中能够使用包括通过在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代的各种类型的改变(其是在不会导致Nm23抗转移作用退化的范围内作出的)的Nm23衍生物。 
参照图1，可穿透细胞的Nm23重组蛋白的全长形式如下： 
1)His-MTD1-Nm23(HM1N)，其中kFGF4-来源的MTD融合至全长Nm23的N-端， 
2)His-Nm23-MTD1(HNM1)，其中kFGF4-来源的MTD融合至全长Nm23的C-端， 
3)His-MTD1-Nm23-MTD1(HM1NM1)，其中kFGF4-来源的MTD融合至全长Nm23的两个末端， 
4)His-MTD2-Nm23(HM2N)，其中JO-76MTD融合至全长Nm23的N-端， 
5)His-Nm23-MTD2(HNM2)，其中JO-76MTD融合至全长Nm23的C-端， 
6)His-MTD3-Nm23(HM3N)，其中JO-77MTD融合至全长Nm23的N-端， 
7)His-Nm23-MTD3(HNM3)，其中JO-77MTD融合至全长Nm23的C-端， 
8)His-MTD3-Nm23-MTD3(HM3NM3)，其中JO-77MTD融合至全长Nm23的两个末端， 
其中来源于SV40大T抗原的His-标签和NLS共价偶联于以上构建体的N-末端。 
对于如上所述通过利用kFGF4-来源的MTD构建的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的全长形式，His-MTD1-Nm23(HM1N)具有SEQID NO：22表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ IDNO：21表示的核苷酸序列；His-Nm23-MTD1(HNM1)具有SEQ IDNO：24表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：23表示的核苷酸序列；而His-MTD1-Nm23-MTD1(HM1NM1)具有 SEQ ID NO：26表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQID NO：25表示的核苷酸序列。 
对于如上所述通过利用JO-76MTD构建的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的全长形式，His-MTD2-Nm23(HM2N)具有SEQ ID NO：28表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：27表示的核苷酸序列；而His-Nm23-MTD2(HNM2)具有SEQ ID NO：30表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：29表示的核苷酸序列。 
对于如上所述通过利用JO-77MTD构建的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的全长形式，His-MTD3-NM23(HM3N)具有SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：31表示的核苷酸序列；His-Nm23-MTD3(HNM3)具有SEQ ID NO：34表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：33表示的核苷酸序列；而His-MTD3-Nm23-MTD3(HM3NM3)具有SEQ IDNO：36表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：35表示的核苷酸序列。 
作为用于可穿透细胞的Nm23重组蛋白的对照，构建了His-Nm23(HN)，其中全长Nm23仅融合至来源于SV40大T抗原的NLS和组氨酸标签(His-Tag)而没有任何MTD。该对照蛋白具有SEQ ID NO：20表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：19表示的核苷酸序列。 
而且，本发明提供了一种含有编码上述每一种可穿透细胞的Nm23重组蛋白的多核苷酸的表达载体，以及一种能够高水平生产每一种可穿透细胞的Nm23重组蛋白的转化体，其可通过利用所述表达载体转化宿主细胞而获得。 
如本文使用的，术语“表达载体”是能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白或靶RNA的载体。本发明的核苷酸序列可以在这样的载体中，其中该核苷酸序列可操作地连接于能够提供用于通过合适宿主细胞表达所述核苷酸序列的调控序列。 
在表达载体的范围内，术语“可操作地连接”用来表示感兴趣的核苷酸序列以允许表达该核苷酸序列的方式连接至该调控序列。术语“调控序列”用于包括启动子、增强子、以及其他表达控制元件。这样的与表达载体的可操作连接可以通过本领域已知的常规基因重组技术实现，而位点定向DNA切割和连接通过利用本领域已知的常规酶来进行。 
适用于本发明的表达载体可以包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，但并不限于此。用于本发明的表达载体可以包含用于膜靶向或分泌的信号序列或引导序列，以及调控序列如启动子、操纵基因、起动密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号、增强子等。启动子可以是组成型或诱导型启动子。而且，表达载体可以包括一种或多种可选标记基因，用于选择含有该表达载体的宿主细胞，并且可以进一步包括能够使该载体在上述的宿主细胞中进行复制的核苷酸序列。 
根据本发明构建的表达载体可以通过pET28a(+)-HNM1进行举例说明，其中编码重组蛋白HNM1(其中kFGF4来源的MTD融合至全长Nm23的C-端)的多核苷酸插入到pET-28a(+)载体的多个克隆位点(MCS)中的NdeI限制酶的切割位点中。 
在另一个实施方式中，本发明的多核苷酸被克隆入带有His-标签序列的pET-28a(+)载体(Novagen，USA)，以便将六个组氨酸残基融合至可穿透细胞的Nm23重组蛋白的N-端，从而允许简单的纯化。 
因此，在上述表达载体中表达的可穿透细胞的Nm23重组蛋白具有这样的结构，其中kFGF4-来源的MTD、JO-76MTD和JO-77MTD中的一个融合至全长或截短的Nm23，并且His-标签和NLS连接至其N-端。 
本发明还提供了一种转化体，其能够高水平生产每一种可穿透细胞的Nm23重组蛋白，且可以通过利用所述表达载体转化宿主细胞而获得。适用于本发明的宿主细胞可以是真核细胞如大肠杆菌。在本发明的一个实施方式中，用作宿主细胞的大肠杆菌用表达载体例如含有编码可穿透细胞的重组蛋白HNM1(其中kFGF4-来源的MTD融合至根据本发明的全长Nm23的C-端)的pET28a(+)-HNM1加以转化，以便高水平生产可穿透细胞的Nm23重组蛋白。用于转化细菌细胞的方法在本领域是熟知的，并且包括但不限于生化手段如转化、转染、轭合(conjugation)、原生质体融合、磷酸钙沉淀，和应用多聚阳离子如二乙基氨基乙基(DEAE)葡聚糖，以及化学手段如电穿孔、直接微注射、微粒轰击、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、PEG-介导的融合和脂质体介导的方法。 
在一些实施方式中，通过分别用含有可穿透细胞的Nm23重组蛋白HM3N(其中JO-77MTD融合至全长Nm23的N-端)的表达载体、和含有可穿透细胞的Nm23重组蛋白HNM3(其中JO-77MTD融合至其C-端)的表达载体转化大肠杆菌DH5α获得的转化体，在韩国大田广域市305-333儒城区鱼隐洞52号(52，Oun-Dong，Yusong-Ku，Taejon 305-333，Republic of Korea)的韩国生命科学和生物技术研究所(KRIBB)典型培养物保藏中心(KCTC)分别以登录号KCTC-11380BP和KCTC-11381BP进行保藏。本文中提到的所有保藏是依据布达佩斯条约于2008年8月28日进行的，并且保藏人对关于保藏的生物材料对公众的可获得性施加的所有限制将在授予专利权后不可取消地去除。 
本发明提供了一种高水平生产可穿透细胞的Nm23重组蛋白的方法，其包括培养上述转化体的步骤。 
本发明的方法可以如下实施：通过在被引入转化体的表达载体中表达本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的合适条件下，在合适的培养基中培养所述转化体。通过培养转化体来表达重组蛋白的方法在本领域是熟知的，并且例如可以如下实施：通过在生长转化体的合适培养基中接种转化体，进行传代培养，将其转移到主培养基中，在合适条件下培养，例如补充有基因表达诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并由此诱导重组蛋白的表达。在培养完成之后，可以从培养溶液中回收“基本上纯的”重组蛋白。术语“基本上纯的”是指本发明的重组蛋白和编码其的多核苷酸在实践和适于它们的计划用途的程度上，基本上没有在自然或体内系统中与它们一起发现的其他物质。 
如上获得的本发明的重组蛋白可以分离自宿主细胞的内部或外部(例如培养基)，并纯化为基本上纯的同源性多肽。用于多肽分离和纯化的方法不限于任何特定方法。实际上，任何标准方法都可以使用。例如，可以适当地选择和组合色谱法、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳、透析和重结晶，以分离和纯化多肽。对于色谱法，例如亲和性色谱、离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、吸附性色谱等可以使用(Maniatis et al，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y，1982；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Deutscher，M.，Guide to Protein Purification Methods Enzymology vol.182.Academic Press.Inc.，San Diego，CA，1990)。 
同时，在根据本发明的转化体中表达的重组蛋白，根据蛋白纯化工艺方法的蛋白质特性可以分成可溶部分和不可溶部分。如果多数所表达的重组蛋白以可溶部分存在，则重组蛋白可以根据如上所述的方法进行分离和纯化。然而，当多数所表达的重组蛋白以不可溶部分存在，即作为包涵体，则重组蛋白首先通过利用多肽变性剂例如脲、盐酸胍，或去污剂进行溶解，然后通过实施一系列离心、透析、电泳和柱色谱进行纯化。由于多肽变性剂引起结构改变而存在丧失重组蛋白活性的危险，所以从不可溶部分纯化重组蛋白的工艺要求脱盐和再折叠步骤。即，脱盐和再折叠步骤通过用不包括多肽变性剂的溶液进行透析和稀释，或通过用过滤器进行离心而实施。而且，如果用于从可溶部分纯化重组蛋白的溶液的盐浓度相对较高，则可以实施这样的脱盐和再折叠步骤。 
在一些实施方式中，已经发现，本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白大多数作为包涵体以不可溶部分存在。为了从不可溶部分纯化重组蛋白，该不可溶部分可以溶解在含有非离子表面活性剂如Triton X-100的溶胞缓冲液中，进行超声处理，然后离心以分离沉淀物。分离的沉淀物可以溶解在补加有强变性剂如脲的缓冲液中，并离心以分离上清液。以上分离的上清液借助于组氨酸-标记的蛋白纯化试剂盒进行纯化，并进行超声处理，例如通过利用用于盐去除和蛋白质再折叠的超过滤器，从而获得本发明的纯化的重组蛋白。 
而且，本发明提供一种抗转移药物组合物，包括作为通过抑制癌细胞增殖、分化和迁移并诱导细胞凋亡而防止转移的有效成分的可穿透细胞的Nm23重组蛋白。 
转移抑制因子Nm23，其对于信号转导级联(包括KSR和Ras-介导的MAPK)是重要的靶蛋白，能够控制通过KSR磷酸化介导的MAPK信号转导级联，并由此抑制癌细胞的增殖、分化和迁移并 诱导凋亡。因此，本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白可以有效地被用作能够预防和/或治疗癌转移的抗转移剂。 
本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白，通过有效地将转移抑制蛋白Nm23引入细胞中，而可以激活在诱导响应于DNA损伤或致癌信号的细胞周期停滞和凋亡的ATM和p53激活中涉及的细胞信号机制。因此，本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白可以有效地用作治疗各种类型的人癌症的抗转移剂。 
包含本发明的重组蛋白作为有效成分的药物组合物可以进一步包括适于口服给药或非肠道给药的药用载体。如本文使用的，“药用载体”如本领域技术人员知晓的，包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂，抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘结剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、风味剂、染料、这类的材料以及它们的组合(Remington′s PharmaceuticalSciences，19th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1995)。用于口服给药的载体可以包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。在口服给药的情况下，本发明的重组蛋白可以以可咀嚼片剂、口含片剂、含锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片或其组合的形式，通过与载体混合而进行配制。而且，用于非肠道给药的载体可以包括水、合适的油、盐水、含水葡萄糖、乙二醇等，并且可以进一步包括稳定剂和防腐剂。适用于本发明的稳定剂可以包括抗氧化剂如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠和抗坏血酸。合适的防腐剂可以包括氯化苄烷铵、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯和氯丁醇。 
本发明的药物组合物可以配制成各种非肠道或口服给药形式。非肠道制剂的代表性实例包括设计为通过注射给药的那些。对于注射，本发明的重组蛋白可以配制成含水溶液，特别是在生理学相容性缓冲液或生理盐水缓冲液中。这些注射制剂可以使用一种或多种 分散剂、润湿剂和悬浮剂，通过常规方法进行配制。对于口服给药，蛋白质可以通过组合这些蛋白与本领域熟知的药用载体而易于配制。这样的载体使得本发明的蛋白质可以配制成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等，用于待治疗病人口服摄取。这样的口服固体制剂可以包括合适的赋形剂，如稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸)和润滑剂(例如胶体硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、和/或聚乙二醇)。片剂可以包括粘结剂，如硅酸铝、淀粉、明胶、树胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，以及崩解剂如交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、或海藻酸或它们的盐，如海藻酸钠。如果需要，可以加入吸附剂、着色剂、风味剂和/或甜味剂。这些制剂可以根据本领域熟知的常规方法通过混合、颗粒化或涂覆而制得。 
如果必要，本发明的药物组合物可以进一步包括药物添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、缓冲剂和/或用于调节渗透性的盐以及其他治疗有效物质，并且可以根据本领域已知的常规方法进行配制。 
另外，本发明的药物组合物可以经由口服途径或非肠道途径如静脉内、皮下、鼻内或腹膜内进行给药。口服给药可以包括舌下给药。非肠道给药可以包括点滴输入和注射如皮下注射、肌内注射、静脉内注射和瘤内注射。 
本发明的重组蛋白的总有效量可以以单剂量给予病人或可以通过分开的治疗方案给予，其中多个剂量在更长的时间内给予。尽管在本发明药物组合物中的重组蛋白或编码其的核酸的量可以根据疾病严重度变化，但是该蛋白或核酸通常可以以5～20mg的有效剂量每天给予多次。然而，本发明药物组合物中的重组蛋白的合适剂量可以取决于许多因素，如病人的年龄、体重、健康状况、性别、 疾病严重度、饮食和排泄，以及给药途径和要给予的治疗数量。鉴于以上因素，本领域的任何技术人员可以确定在各种人癌症中作为用于防止转移的抗转移剂的重组蛋白的有效剂量。含有重组蛋白的本发明的药物组合物对其配制、给药途径和/或给药模式没有特别限制，只要表现出本发明的效果即可。 
[实施例] 
提供以下实施例用来更详细地举例说明本发明的实施方式，但不以任何方式限制其范围。 
实施例1-可穿透细胞的Nm23重组蛋白(CP-Nm23)的构建 
8个全长形式的可穿透细胞的Nm23(CP-Nm23)重组蛋白通过利用kFGF4-来源的MTD(MTD1)、JO-76MTD(MTD2)和JO-77MTD(MTD3)作为大分子转导结构域进行构建。 
参照图1，CP-Nm23重组蛋白的全长形式如下： 
1)His-MTD1-Nm23(HM1N)，其中kFGF4-来源的MTD融合至全长Nm23的N-端， 
2)His-Nm23-MTD1(HNM1)，其中kFGF4-来源的MTD融合至全长Nm23的C-端， 
3)His-MTD1-Nm23-MTD1(HM1NM1)，其中kFGF4-来源的MTD融合至全长Nm23的两个末端， 
4)His-MTD2-Nm23(HM2N)，其中JO-76MTD融合至全长Nm23的N-端， 
5)His-Nm23-MTD2(HNM2)，其中JO-76MTD融合至全长Nm23的C-端， 
6)His-MTD3-Nm23(HM3N)，其中JO-77MTD融合至全长Nm23的N-端， 
7)His-Nm23-MTD3(HNM3)，其中JO-77MTD融合至全长Nm23的C-端， 
8)His-MTD3-Nm23-MTD3(HM3NM3)，其中JO-77MTD融合至全长Nm23的两个末端， 
其中来源于SV40大T抗原的His-标签和NLS共价偶联于以上构建体的N-末端。 
为了制备全长CP-Nm23重组构建体，通过利用在下表1中描述的寡核苷酸作为对于每一个重组构建体特异的引物对并将人Nm23cDNA(SEQ ID NO：1)作为模板，来实施聚合酶链反应(PCR)。用于扩增HM1N的正向和反向引物分别具有SEQ ID NO：13和12表示的核苷酸序列；用于扩增HNM1的正向和反向引物分别具有SEQ ID NO：11和14表示的核苷酸序列；用于扩增HM1NM1的正向和反向引物分别具有SEQ ID NO：13和14表示的核苷酸序列；用于扩增HM2N的正向和反向引物分别具有SEQ ID NO：15和12表示的核苷酸序列；用于扩增HNM2的正向和反向引物分别具有SEQ ID NO：11和16表示的核苷酸序列；用于扩增HM3N的正向和反向引物分别具有SEQ ID NO：17和12表示的核苷酸序列；用于扩增HNM3的正向和反向引物分别具有SEQ ID NO：11和18表示的核苷酸序列；用于扩增HM3NM3的正向和反向引物分别具有SEQID NO：17和18表示的核苷酸序列。 
作为对于每个重组蛋白特异的正向和反向引物组的寡核苷酸概括在下表2中。 
[表2] 
  引物   SEQ ID  NO   序列
  HN-5’(30nt)   11   CCG CAT ATG GCC AAC TGT GAG CGT ACC TTC
  HN-3’(33nt)   12   CCG CATATG TCATTC ATAGAT CCAGTT CTGAGC
  HM1N-5’(72nt)   13 CCG CAT ATG GCA GCC GTT CTT CTC CCT GTT CTT CTT GCC GCA CCC GCC AAC TGT GAG CGT ACC TTCATTGCG
  HNM1-3’(72nt)   14 CCG CAT ATG TCA GGG TGC GGC AAG AAG AAC AGG GAG AAG AAC GGC TGC TTC ATA GAT CCA GTT CTG AGC ACA
  HM2N-5’(60nt)   15 CCG CAT ATG GCG CTG GTG CTG CCG CTG GCG CCG GCC AAC TGT GAG CGT ACC TTC ATT GCG
  HNM2-3’(60nt)   16 CCG CAT ATG TCA CGG CGC CAG CGG CAG CAC CAG CGC TTCATAGAT CCAGTT CTGAGCACA
  HM3N-5’(63nt)   17 CCG CAT ATG GCG GTG GCG CTG CTG ATT CTG GCG GTG GCC AAC TGT GAG CGT ACC TTC ATT GCG
  HNM3-3’(63nt)   18 CCG CAT ATG TCA CAC CGC CAG AAT CAG CAG CGC CAC CGC TTC ATA GAT CCA GTT CTG AGC ACA
在50μl含有100ng作为模板的人Nm23cDNA、0.2mM dNTP混合物(dGTP，dATP，dTTP和dCTP，每一个为2mM)、0.6μM的每个引物、5μl的10x Taq缓冲液、1μl的Taq聚合酶(Takara，Japan)的反应混合物中实施PCR。在94℃2分钟的初始变性后，以94℃45秒、53℃45秒和72℃45秒实施PCR 25个循环，接着在72℃5分钟进行最后伸展。在完成PCR之后，扩增的PCR产物用限制酶NdeI消化并加载到1.0％琼脂糖凝胶上进行分离。如图2a和2b所示，确认了融合至kFGF4-来源的MTD、JO-76MTD和JO-77MTD中的一个的每一个重组构建体的预期片段被成功地扩增。 
预期大小的DNA带从凝胶切除，洗脱，并通过利用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，USA)纯化。洗脱的DNA用乙醇沉淀并在蒸馏水中再悬浮用于连接。如图3a所示，含有编码区的PCR扩增的DNA片段根据TA克隆方法，利用T4连接酶，亚克隆入pGEM-T Easy载体(Promega，Magison WI，USA)中，接着用该pGEM-T Easy载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。这些细胞铺放到补充50μg/ml氨苄西林的LB平板培养基上，并在37℃下培养过夜。在重组片段插入的pGEM-T Easy载体中，通过用限制酶NdeI在37℃处理1小时而被分离之后，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。 
如图3b所示，检测到大约0.5kb全长形式的DNA片段和大约3kb的载体片段，确认了CP-Nm23重组构建体的插入DNA适于被亚克隆入pGEM-T Easy载体中。 
带有组氨酸标签的pET-28(+)a载体(Novagen，Madison，WI)和T7启动子用限制酶NdeI(Enzynomics，Korea)消化。含有CP-Nm23重组片段和pET-28(+)a载体片段的pGEM-T Easy载体片段通过利用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。每一个pGEM-TEasy载体片段被克隆入在16℃利用T4连接酶预处理12小时的pET-28a(+)中，接着用所得pET28a(+)载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(图4a)。 
在克隆体用限制酶NdeI(Enzynomics，Korea)处理并经过0.8％琼脂糖凝胶电泳之后，证实检测到大约0.5kb全长形式的DNA片段和大约5kb的载体片段，确认了pET28a(+)载体中CP-Nm23重组构建体的插入DNA的克隆，如图4b所示。 
将用于表达可穿透细胞的Nm23重组蛋白的成功克隆的表达载体分别指定为pET28a(+)-HM1N、pET28a(+)-HNM1、pET28a(+)-HM1NM1、pET28a(+)-HM2N、pET28a(+)-HNM2、 pET28a(+)-HM3N、pET28a(+)-HNM3和pET28a(+)-HM3NM3。在它们之中，通过分别用表达载体pET28a(+)-HM3N和pET28a(+)-HNM3转化大肠杆菌DH5α获得的大肠杆菌转化体DH5α/HM3Nm23和DH5α/HNm23M3，依据布达佩斯条约于2008年8月28日，在韩国大田广域市305-333儒城区鱼隐洞52号(52，Oun-Dong，Yusong-Ku，Taejon 305-333，Republic of Korea)的韩国生命科学和生物技术研究所(KRIBB)典型培养物保藏中心(KCTC)分别以登录号KCTC-11380BP和KCTC-11381BP进行保藏。 
序列测定分析的结果如下： 
对于如上所述通过利用kFGF4-来源的MTD构建的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的全长形式，His-MTD1-Nm23(HM1N)具有SEQID NO：22表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ IDNO：21表示的核苷酸序列；His-Nm23-MTD1(HNM1)具有SEQ IDNO：24表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：23表示的核苷酸序列；而His-MTD1-Nm23-MTD1(HM1NM1)具有SEQ ID NO：26表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQID NO：25表示的核苷酸序列。 
对于如上所述通过利用JO-76MTD构建的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的全长形式，His-MTD2-NM23(HM2N)具有SEQ ID NO：28表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：27表示的核苷酸序列；而His-Nm23-MTD2(HNM2)具有SEQ ID NO：30表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：29表示的核苷酸序列。 
对于如上所述通过利用JO-77MTD构建的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的全长形式，His-MTD3-NM23(HM3N)具有SEQ ID NO：32表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：31表 示的核苷酸序列；His-Nm23-MTD3(HNM3)具有SEQ ID NO：34表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：33表示的核苷酸序列；而His-MTD3-Nm23-MTD3(HM3NM3)具有SEQ IDNO：36表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：35表示的核苷酸序列。 
作为用于可穿透细胞的Nm23重组蛋白的对照，构建了His-Nm23(HN)，其中全长Nm23仅融合至来源于SV40大T抗原的NLS和组氨酸标签(His-Tag)而没有任何MTD。该对照蛋白具有SEQ ID NO：20表示的氨基酸序列，而编码其的多核苷酸具有SEQ ID NO：19表示的核苷酸序列。 
实施例2-重组蛋白的表达 
<2-1>最佳菌株的选择 
为了选择对于以上实施例1中制得的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的表达的最佳菌株，以下实验在大肠杆菌BL21(DE3)、BL21-金(DE3)、BL21-密码子(BL21-Codonplus)(DE3)和BL21-金(DE3)pLysS菌株(Stratagene，USA)中实施，它们都含有LacI启动子。 
首先，根据热休克方法，将表达载体pET28a(+)-HM1N、pET28a(+)-HNM1、pET28a(+)-HM1NM1和pHN(对照)中的每一个分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)、BL21-金(DE3)、BL21-密码子(DE3)和BL21-金(DE3)pLysS菌株。而且，根据热休克方法，将表达载体pET28a(+)-HM2N、pET28a(+)-HNM2、pET28a(+)-HM3N、pET28a(+)-HNM3和pET28a(+)-HM3NM3中的每一个分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。在转化之后，细胞在含有50μg/ml氨苄西林的LB琼脂平板中进行培养。在该平板上形成的菌落，在1ml培养基中在37℃下生长过夜，培养基在剧烈摇晃下，在100ml的LB培 养基中在37℃下培养，直至光密度600(OD600)达到0.5。然后以终浓度0.7mM向其加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，以诱导CP-Nm23重组蛋白的表达。蛋白诱导在30℃下持续2小时。大肠杆菌培养溶液通过在4℃、7000xg下离心20分钟收集，在溶胞缓冲液(100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，8M脲，pH 8.0)中再悬浮，并利用装配有探针的近距离声波定位器在冰上进行超声处理。细胞溶胞产物以14000xg离心15分钟，以便分离不可溶部分与可溶部分。由此获得的在具有IPTG的大肠杆菌菌株中表达的CP-Nm23重组蛋白的可溶和不可溶部分加载到SDS-PAGE凝胶上。 
如图5所示，尽管一些细胞可溶性Nm23重组蛋白在BL21-金(DE3)中以较低水平表达，但是大多数可穿透细胞的Nm23重组蛋白在该菌株中表现出最高表达水平。根据这些结果，选择BL21-金(DE3)作为用于根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的表达的最佳菌株。 
<2-2>重组蛋白的表达 
将表达载体pET28a(+)-HM1N、pET28a(+)-HNM1、pET28a(+)-HM1NM1、pET28a(+)-HM2N、pET28a(+)-HNM2、pET28a(+)-HM3N、pET28a(+)-HNM3和pET28a(+)-HM3NM3中的每一个转化到大肠杆菌BL21(DE3)(在以上实施例2的部分<2-1>中选择作为最佳菌株)中，接着根据实施例2的部分<2-1>中描述的相同方法，通过加入0.7mM IPTG而诱导它们的表达。之后，将从其获得的CP-Nm23重组蛋白的可溶和不可溶部分加载到SDS-PAGE凝胶上。 
如图6所示，确认了在宿主细胞中表达的可穿透细胞的Nm23重组蛋白(19～20kDa)大多数作为包涵体包括在不可溶部分中，并且它们的表达在IPTG存在下显著增大。 
实施例3-重组蛋白的纯化和再折叠 
<3-1>重组蛋白的纯化 
可穿透细胞的Nm23重组蛋白在大肠杆菌系统中的可诱导表达导致形成不可溶聚集体，其被称为包涵体。为了彻底地溶解这些包涵体，以上所有表达的蛋白通过将它们溶解在用作强变性剂的8M脲中加以变性。 
首先，用表达载体pET28a(+)-HM1N、pET28a(+)-HNM1、pET28a(+)-HM1NM1、pET28a(+)-HM2N、pET28a(+)-HNM2、pET28a(+)-HM3N、pET28a(+)-HNM3和pET28a(+)-HM3NM3中的每一个转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株在1L如实施例2中描述的LB培养基中进行培养。每一个培养溶液通过离心进行收集，在没有形成气泡的情况下，温和地再悬浮在20ml溶胞缓冲液(HN和HNM1：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0；其他CP-Nm23：100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，8M脲，pH 8.0)中，并利用装配有微小尖端的近距离声波定位器在冰上进行超声处理。细胞间歇地声处理30秒，接着冷却10秒，同时将功率设置为25％的最大功率。总声处理时间为5分钟。细胞溶胞产物在4℃、4000xg下离心20分钟，以便分离上清液和细胞碎片沉淀物。上清液加载到Ni-NTA琼脂糖树脂上，其中次氮基三乙酸琼脂糖加载有镍(Ni)。Ni-NTA琼脂糖树脂用溶胞缓冲液平衡。通过在4℃温和摇晃(使用旋转摇床)8小时或更长，以允许上清液吸附到树脂上。吸附有包涵体(含有重组蛋白)的树脂在4℃、1000xg下离心5分钟，以去除树脂溶液并用清洗缓冲液(HN和HNM1：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 6.3；其他CP-Nm23：100mM NaH2PO4，10mMTris-HCl，8M脲，pH 6.3)清洗5次以去除非特异性吸附物质。在清洗之后，吸附至树脂的蛋白用洗脱缓冲液(HN和HNM1：50mMNaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 4.5；其他CP-Nm23：100 mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，8M脲，pH 4.5)在pH 4.5的酸性条件下，在搅拌下洗脱2小时或更长。洗脱的蛋白质用12％SDS-PAGE凝胶电泳进行分析，用考马斯亮蓝R通过温和摇晃进行染色，并用脱染色溶液加以脱染色。 
根据图6所示的结果，分别融合至kFGF4-来源的MTD、JO-76MTD和JO-77MTD的所有可穿透细胞的Nm23重组蛋白，作为对应于大约19～20kDa的单个带进行检测，这确认了本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白已从不可溶部分纯化出来。 
<3-2>重组蛋白的再折叠 
由于如在以上实施例3的部分<3-1>描述的，从不可溶部分纯化的本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白通过强变性剂如8M脲加以变性，所以变性的蛋白必须通过如下再折叠工艺变成活性形式。 
首先，纯化的重组蛋白通过在再折叠缓冲液(0.55M盐酸胍，0.88M L-精氨酸，50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，100mM NDSB，1mM谷胱甘肽氧化的，以及1mM谷胱甘肽还原的)中，在4℃下对它们进行透析24小时，由此去除变性剂。所有再折叠的重组蛋白通过利用透析袋(蛇皮皱褶物，PIERCE)在4℃针对细胞培养基DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)透析10小时，同时搅拌。培养基每3小时用新鲜DMEM进行取代。通过再折叠工艺转化成活性形式的本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白在以下实验中使用。 
实施例4-Nm23重组蛋白的穿透细胞性的定量分析 
为了定量确定根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的细胞穿透性，通过动物模型中的FACS(荧光活化细胞分选)来分析引入细胞中的蛋白，如下。 
在以上实施例3的部分<3-2>中再折叠成它们的活性形式的可穿透细胞的Nm23重组蛋白用FITC(荧光素-5-异硫氰酸酯，分子探针)进行标记。该重组蛋白(2～20mg)与1μl的浓度为333mg/ml的FITC混合，并于室温下温和搅拌在暗室中反应1小时。反应溶液在4℃对DMEM透析2天，直到未反应的FITC完全除去，由此获得FITC轭合的重组蛋白。由此获得的FITC轭合重组蛋白进行布拉德福德蛋白测定仪测量蛋白浓度。结果，测得每一种FITC轭合的重组蛋白具有大约0.7μg/μl的浓度。 
同时，将来源于小鼠巨噬细胞的RAW 264.7细胞保持在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素(500mg/ml)的DMEM中并在37℃下在5％CO2气体的潮湿环境中进行孵育。 
在孵育之后，细胞用10μM的上面制备的各种FITC轭合的重组蛋白(HM1N，HNM1，HM1NMi，HM3N，HNM3和HM3NM3)处理，接着进一步在37℃下将它们培养1小时。随后，细胞用胰蛋白酶/EDTA(T/E，Invitrogen)处理以去除细胞表面结合蛋白，用冷PBS(磷酸缓冲盐水)清洗三次，然后通过利用FACS(荧光活化的细胞分选)Calibursystem(B eckton-Dichinson)的CellQuest Pro软件程序进行流式细胞仪分析。每个样品的细胞浓度为1x104个细胞/μl，并且该分析进行两次或更多次。根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的细胞穿透性通过将其与没有融合至MTD的对照蛋白进行比较而确定。 
图7a和7b示出了流式细胞仪分析的结果，其中灰色填充曲线仅代表细胞，黑色曲线仅代表FITC，蓝色曲线代表没有融合至MTD (HN)的对照蛋白的细胞穿透性，红色曲线代表可穿透细胞的重组蛋白HM1N、HM3N、HNM3和HM3NM3的细胞穿透性，绿色曲线代表可穿透细胞的重组蛋白HNM1的细胞穿透性，而橙色曲线代表可穿透细胞的重组蛋白HM1NM1的细胞穿透性。参照图7a和7b中所示的结果，发现所有的可穿透细胞的Nm23重组蛋白表现出比对照蛋白显著更高的细胞穿透性。 
实施例5-Nm23重组蛋白的显微细胞穿透性分析 
为了将递送到细胞中的人Nm23蛋白的细胞内定位可视化，将NIH 3T3细胞(韩国细胞系库，韩国首尔)用FITC轭合的重组蛋白(HM1N，HNM1，HM1NM1，HM2N，HNM2，HM3N，HNM3和HM3NM3)处理并通过共聚焦激光扫描显微镜进行可视化。 
首先，将NIH 3T3细胞在8孔室载玻片(LabTek，Nalgen Nunc)中培养24小时。NIH3T3细胞保持在补充有10％胎牛血清和5％青霉素/链霉素(500mg/ml)的DMEM中并在37℃下在5％CO2气体的潮湿环境中进行孵育。在细胞用PBS清洗三次后，细胞分别用无血清DMEM、含有FITC的无血清DMEM和含10μM各种FITC-轭合的重组蛋白的DMEM在37℃下在5％CO2气体中进行处理。1小时之后，细胞在室温下用4％低聚甲醛固定20分钟。 
为了直接检测被内化的FITC轭合的重组蛋白，细胞用PBS清洗三次并用核荧光染色溶液(PI，Sigma-Aldrich)进行复染。细胞用浓度为1μg/ml的PI染色5分钟，接着用PBS清洗三次。为了保持重组蛋白的FITC荧光，在观察前将载玻片在10μl的含有DABCO(Fluca)的聚乙烯醇包埋剂中固定15分钟。荧光的细胞内分布利用诺马斯基过滤器在通过共聚焦激光扫描显微镜分析的单个细胞中部进行确定。共聚焦激光扫描显微镜用于观察细胞形态、FITC 荧光和PI荧光。FITC在488nm激发并在530nm处借助于带通滤波器(bandpass filter)进行检测。 
如图8a至8c所示，观察到相比于仅细胞、仅FITC和缺少MTD的对照蛋白，用FITC和PI染色的可穿透细胞的Nm23重组蛋白在细胞核中良好地大范围地分布。根据本发明融合至kFGF4-来源的MTD、JO-76MTD和JO-77MTD中的一个的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的细胞内定位与通过上述流式细胞仪确定的细胞穿透性一致。根据这些结果，确认本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白表现出高的细胞穿透性。 
实施例6-可穿透细胞的Nm23重组蛋白对MAPK信号转导的抑制作用 
为了确认根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的体内功能，通过蛋白质印迹研究了重组蛋白对三种类型的癌细胞系的生物化学功能。 
MDA-MB-435和MDA-MB-231细胞，在本实验中使用的高度转移性人乳癌细胞系，购自韩国细胞系库(韩国首尔)。将这些细胞系在37℃下在5％CO2气体的孵育器中保持在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素(500mg/ml)的RPMI 1640培养基(L-谷氨酸300mg/l，25mM HEPES和25mM NaHCO3)中。CCL-185细胞(一种人肺癌细胞系)获自ATCC并在37℃下在5％CO2气体的孵育器中保持在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素(500mg/ml)的HamF-12K培养基(2mM L-谷氨酸，1500mg/l碳酸氢钠)中。 
在将2ml补充FBS的RPMI 1640培养基加入到6孔板的每个孔之后，MDA-MB-435、MDA-MB-231和CCL-185细胞孵育至5x106个细胞/ml的浓度。孔板在37℃下孵育1天以便允许细胞生长同时 粘附至孔板。在取出培养基之后，粘附至孔板的细胞用冷PBS清洗。接着，细胞用500μl浓度为10μM的各种可穿透细胞的Nm23重组蛋白和缺少MTD的Nm23对照蛋白(HN)进行处理，并在37℃下在5％CO2气体的孵育器中反应1小时。MDA-MB-435细胞用HM1N、HNM1、HM1NM1、HM2N、HNM2、HM3N、HNM3和HM3NM3重组蛋白中的每一种进行处理，而MDA-MB-231和CCL-185细胞用HM3N、HNM3和HM3NM3重组蛋白中的每一种进行处理。在反应完成之后，细胞用PBS清洗两次，然后在上述相同条件下在有血清下分别培养2、4、6和8小时。 
在培养完成之后，将细胞悬浮在200μl的溶胞缓冲液(20mMHEPES，pH 7.2，1％Triton-X，10％甘油和蛋白酶抑制剂)中并在冰上进行超声处理30分钟，以由此获得细胞溶胞产物。细胞溶胞产物在4℃以12000rpm离心20分钟以分离上清液。由此获得的上清液进行布拉德福德蛋白测定仪定量地测量蛋白浓度。将重组蛋白以25μM的浓度再悬浮在SDS-PAGE加载缓冲液中以制备细胞溶解产物样品。由此制得的细胞溶胞产物样品在90℃加热5分钟，然后储存在-80℃至使用。 
对于蛋白质印迹分析，将p21(21kDa，Cell SignalingTechnology)、phospho-p53(Ser15，53kDa，Cell Singaling)、phospho-MEK(Ser217/221，45kDa，Cell Signaling)和phospho-Erk(Thr202/Tyr204，42/44kDa，Cell Signaling)用作第一抗体，并将羊抗-小鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)和羊抗-兔IgG-HRP(SantaCruz Biotechnology)用作第二抗体。细胞溶胞产物样品在100V施加至12％SDS-PAGE达2小时并在100V转移到聚偏二氟乙烯(PDVF)膜上达90分钟。为了防止印迹蛋白和不相关抗体之间的非特异性相互作用，PVDF膜在室温下用5％在TBS/T(10mM Tris-Cl，pH 8.0，150mM NaCl，0.05％Tween 20)中的无脂干奶粉封闭1小 时。在去除封闭缓冲液之后，PVDF膜用TBS/T清洗，接着在4℃用每一种第一抗体(用新制备的封闭缓冲液以1∶10000比率稀释的)孵育1小时。在去除第一抗体溶液之后，该膜TBS/T清洗5次，每次5分钟，并在室温下用第二抗体(用新制备的封闭缓冲液以1∶5000比率稀释)孵育1小时。在用TBS/T清洗5次之后，该膜利用增强化学发光(ECL)检测系统(GE Healthcare Amersham UK)染色以可视化抗原/抗体相互作用。 
如图9a和9b所示，在用可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的细胞中，相比于用对照蛋白处理的细胞，KSR丝氨酸392(其是MAPK级联的支架蛋白)的磷酸化被增强，而诱导肿瘤细胞周期活化的MEK的磷酸化(P-MEK)被减少。尤其是，其中JO-77MTD分别融合至N-端和C-端的HM3N和HNM3重组蛋白在所有三种类型的人癌细胞系中强烈地抑制ERK和MEK的磷酸化。 
实施例7-可穿透细胞的Nm23重组蛋白的体外抗转移作用 
<7-1>侵入实验 
为了考察肿瘤转移在用根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的癌细胞中是否通过阻碍癌细胞迁移而被抑制，侵入实验实施如下。 
首先，将人乳癌细胞系MDA-MB-435细胞在没有生长因子下在补充有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养过夜。第二天，将细胞用胰蛋白酶处理并收集，接着悬浮在相同的RPMI 1640培养基中。细胞用缺少MTD的Nm23对照蛋白(HN)、以及根据本发明的可穿透细胞的NM23重组蛋白(HM2N，HNM2，HM3N，HNM3和HM3NM3)中的每一种在37℃以10μM的浓度处理1小时。同时，将孔径为3μm的trans-well聚碳酸酯膜过滤器(BD Falcon)的上部 分用Matrigel(每孔40μl；BD Bioscience)涂覆。向小室的下部分，加入补充有10％FBS的DMEM培养基作为粘附基质。将用上述蛋白质处理的细胞悬浮在补充有0.1％FBS的DMEM培养基中以制备细胞悬液。由此制得的细胞悬液在trans-well膜过滤器上孵育(每孔1x105个细胞)，并在37℃下在5％CO2孵育器中培养20至24小时。过滤器用PBS清洗，并通过利用棉签去除在上部分的表面上残留的非侵入性细胞。通过基质胶(Matrigel)并移动到过滤器下部分的侵入性细胞用4％低聚甲醛固定5至10分钟，并用0.5％(w/v)hemacolor染色10至20分钟。迁移到该膜过滤器的基座表面的细胞数量(紫色)通过用光学显微镜观察进行计数。 
根据图10a和10b所示的结果，与对照蛋白(HN)相比，在用大多数可穿透细胞的Nm23重组蛋白HM2N、HM3N和HNM3处理的细胞的情况下，细胞的侵入显著减少。根据这些结果，发现根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白能够有效地抑制体内肿瘤细胞的转移能力。 
<7-2>伤口迁移测定 
为了考察根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白是否能够抑制具有高迁移活性的乳癌细胞系MDA-MB-435细胞的迁移，伤口迁移实验实施如下。MDA-MB-435细胞在60-mm培养皿中培养直至它们形成覆盖底部的汇合的单层。在孵育之后，细胞用缺少MTD的Nm23对照蛋白(HN)和根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白(HM2N，HNM2，HM3N，HNM3和HM3NM3)中的每一种在37℃以10μM的浓度处理1小时。在细胞用PBS清洗之后，它们被无菌黄色尖端形成伤口，由此形成将汇合区域与空白区域分开的参考线。细胞中加入补充有10％FBS的RPMI培养基(3mL)，接着在37℃下在5％CO2孵育器中培养24小时。细胞用PBS清洗，用甲醇固定1分钟，用Geimsa(Chameleon Chemical)染色5分钟， 然后，用蒸馏水清洗。利用40x放大的倒置光学显微镜(inverted lightmicroscope)，通过计数从伤口边缘迁移到空白区域中的细胞数对迁移进行定量。 
参考图11所示的结果，与对照蛋白相比，肿瘤细胞的迁移在用可穿透细胞的Nm23重组蛋白，尤其是HM2N、HM3N和HNM3处理的细胞中被显著抑制，这与来自上述侵入测定的结果一致。 
实施例8-可穿透细胞的Nm23重组蛋白的体内抗转移作用 
为了考察已在体外确认的可穿透细胞的Nm23重组蛋白对肿瘤转移的体内抑制作用，免疫组织化学分析实施如下。 
首先，将MDA-MB-435细胞(一种高转移性人乳癌细胞系)以1x106个细胞/ml的浓度悬浮在0.1ml PBS中并注射到5周龄MHC(主要组织相容性复合物)-缺陷型Balb/c nu/nu小鼠的外尾静脉。20只小鼠分成4组，每组5只小鼠。将融合JO-77MTD的可穿透细胞的Nm23重组蛋白(HM3N，300μg)、载体(PBS，300μg)和缺少MTD的Nm23对照蛋白(HN，300μg)、以及其中JO-77MTD融合至EGFP的N-端的EGFP重组蛋白(HM3E)中的每一种给予小鼠。这里，融合MTD的EGFP重组蛋白用作对照以考察融合至Nm23的JO-77MTD对Nm23表达是否有作用。在将MDA-MB-435细胞注射到小鼠之后5周，每天将这些蛋白经静脉内注射给予每组的小鼠达21天。在从每组选取三只小鼠并杀死之后，从其提取肺组织样品。每组中剩下的其他两只小鼠在给药结束后进一步观察14天，然后，从其提取肺组织样品。将肺组织样品用Bouin固定溶液固定过夜，用于检测转移性群落，用蒸馏水清洗，然后埋入石蜡中以制备石蜡块。由此制得的石蜡块用超薄切片机切割成具有4μm的厚度，其中切片固定在载玻片上并用二甲苯处理5分钟，处理三次 以去除石蜡。载玻片用波形蛋白作为转移标记物进行免疫组织化学染色。 
对于免疫组织化学染色，将抗-波形蛋白抗体(Abcam)用作第一抗体，而羊抗-小鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)用作第二抗体。为了防止印迹蛋白和不相关抗体之间的非特异性相互作用，载玻片在搅拌下在室温下用在TBS/T(10mM Tris-Cl，pH 8.0，150mM NaCl，0.05％Tween 20)中的无脂奶粉封闭1小时。在去除封闭缓冲液之后，载玻片用TBS/T清洗三次，接着在4℃用作为第一抗体的抗-波形蛋白抗体(用PBS以1∶200比率稀释的)孵育1小时。在去除第一抗体溶液之后，载玻片用TBS/T清洗5次，每次5分钟，并在室温下用作为第二抗体的羊抗-小鼠IgG-HRP(用PBS以1∶200比率稀释的)孵育1小时。在用TBS/T(0.025％Triton-X 100)清洗两次之后，载玻片用DAB基质染色以检测波形蛋白。 
图12a示出了在给予根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白达21天之后，光学观察从小鼠提取的肺组织的结果，并且也从可穿透细胞的Nm23重组蛋白在给予结束后14天的小鼠提取。如图12a所示，尽管用这些蛋白处理21天，在用赋形剂、对照蛋白(HN)和MTD融合的EGFP重组蛋白(HM3E)处理的小鼠的肺组织中，肿瘤生长显著增加。而且，肿瘤大小在随后的2周非处理期之后没有减小，并且新形成的肿瘤在其他周围组织中发现，表明发生转移。然而，在用根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白(HM3N)处理的小鼠的肺组织中，不仅在3周的蛋白质处理期间没有形成肿瘤，而且在随后的2周非处理期间也没有肿瘤形成，表明肿瘤形成和转移被该可穿透细胞的Nm23重组蛋白质有效地抑制。 
图12b示出了免疫组织化学染色的结果，示出了在从小鼠提取的肺组织中，在给予根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白达 21天(第21天)之后，以及从可穿透细胞的Nm23重组蛋白给予终止14天后(第35天)的小鼠提取的肺组织中，转移性标记物波形蛋白的表达。如图12b所示，在用赋形剂、对照蛋白(HN)和MTD融合的EGFP重组蛋白(HM3E)处理的小鼠的肺组织中，在第21天和第35天均检测到波形蛋白，而在用根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白(HM3N)处理的小鼠肺组织中在第21天和第35天均没有检测到波形蛋白。根据这些结果，确认了根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白在体内能够有效地抑制肿瘤转移。 
实施例9-在给予可穿透细胞的Nm23重组蛋白之后的体内细胞凋亡诱导作用 
为了考察在给予可穿透细胞的Nm23重组蛋白之后在肿瘤组织中诱导细胞凋亡的作用，通过利用如实施例8中描述的相同小鼠模型，实施TUNEL(末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dUTP切口末端标记)测定。TUNEL测定通过利用原位细胞死亡检测试剂盒(TMR red，Roche)实施。 
具体地，将可穿透细胞的Nm23重组蛋白(HM3N)、赋形剂和作为对照的HN、以及融合MTD的EGFP重组蛋白(HM3E)中的每一种，根据如实施例8中所述的相同方法，经静脉内注射每天给予分成4组的小鼠。在从每组选取三只小鼠并杀死之后，从其提取肺组织样品。每组中剩下的其他两只小鼠在给药结束后进一步观察14天，然后，从其提取肺组织样品。将肺组织样品埋入石蜡中以制备石蜡块。由此制得的石蜡块用超薄切片机切割成4μm的厚度，并固定到载玻片上。载玻片用二甲苯处理5分钟，处理三次以去除石蜡。然后按顺序用100％乙醇两次5分钟、和90％、80％及70％乙醇每个3分钟处理，以便使肺组织脱水，培养基在PBS中孵育5分钟。载玻片用溶解在0.1％柠檬酸钠溶液中的0.1％ X-100 处理8分钟，并用PBS清洗两次2分钟，在向载玻片加入一滴TUNEL反应缓冲液(50μl，Roche，USA)之后，载玻片在37℃的潮湿孵育器中孵育1小时，用PBS清洗三次，然后利用荧光显微镜进行观察。 
参考图13所示的结果，在用赋形剂、对照蛋白(HN)和MTD融合的EGFP重组蛋白处理的小鼠肺组织中没有显著的组织学变化，而在用可穿透细胞的Nm23重组蛋白(HM3N)处理的小鼠肺组织中，观察到染成红色的表示细胞凋亡特性的区域，确认根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的诱导细胞凋亡的作用。而且，还观察到在用根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的小鼠肺组织中，在给药结束后14天的仍在癌细胞中诱导细胞凋亡。 
实施例10-在给予可穿透细胞的Nm23重组蛋白之后蛋白表达谱的比较 
为了检测根据本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的肿瘤组织中的蛋白表达谱的变化，微阵列测定实施如下。 
具体地，根据如以上实施例9中描述的相同方法，将可穿透细胞的Nm23重组蛋白(HM3N)、赋形剂和HN(对照)中的每一种，经静脉内注射给予分成三组的小鼠达21天，然后在给药结束之后保留14天。在给药结束后的14天，从每组中提取肺组织样品并用液氮冷冻。根据制造商说明，通过利用TRIZOL试剂(Invitrogen)从肺组织分离总RNA，并用无RNA酶的DNA酶(Life Technologies，Inc.)处理，由此完全地去除残留基因组DNA。 
根据制造商说明，通过利用Low RNA Input Linear Amplification试剂盒(Agilent Technology)，由此分离的RNA进行靶cRNA探针的合成和杂交。简而言之，将1μg总RNA与T7启动子特异性 引物混合并在65℃下反应10分钟。通过混合第一链缓冲液(firststrand buffer)(5x)、0.1M DTT、10mM dNTP混合物、RNase-Out(RNA酶抑制剂)和MMLV-RT(反转录酶)制备cDNA主混合物(master mix)，并加入到反应混合物中。所得混合物在40℃反应2小时，接着在60℃反应15分钟，从而终止反转录和dsDNA合成。根据制造商说明，通过混合转录缓冲液(4x)、0.1M DTT、NTP混合物、50％PEG、RNase-Out、无机焦磷酸酶、T7-RNA聚合酶和酞菁(3/5-CTP)制备转录主混合物。由此制得的转录基本混合物加入到dsDNA反应混合物中并在40℃反应2小时以便实施dsDNA转录。根据制造商说明，由此扩增和标记的cRNA用cRNA收集模型(Cleanup Module)(Agilent Technology)纯化。标记的靶cRNA通过利用ND-1000分光光度计(NanoDropTechnologies，Inc.)进行定量。在检测了标记有效性之后，cRNA与封闭剂(10x)和片段化缓冲液(fragmentation buffer)(25x)混合，并在60℃反应30分钟以便实施cRND的片段化。分段的cRNA再悬浮在杂交缓冲液(2x)中并直接滴到全人基因组寡聚微阵列(Whole Human Genome Oligo Microarray)(44K)上。该微阵列在65℃在杂交炉(Agilent Technology)中杂交17小时，接着根据制造商说明进行清洗(Agilent Technology)。 
通过利用DNA微阵列扫描仪(Agilent Technology)读出杂交谱并通过利用特征提取软件(Feature Extraction Software)(AgilentTechnology)进行定量。折叠改变的基因的数据标准化和选择通过利用Gene Spring GX 7.3软件(Agilent Technology)实施。通过用标准化信号通道强度除以标准化对照通道强度来计算标准化比值的平均值。根据Gene OntologyTM Consortium(http://www.geneontology.org/index.shtml)，通过利用Gene SpringGX 7.3软件(Agilent Technology)执行对于基因的功能注释。 
微阵列分析的结果概括在图14和表3至表9中，其中表3示出了细胞凋亡相关基因的表达谱，表4示出了细胞粘附相关基因的表达谱，表5示出了细胞周期调控相关基因的表达谱，表6a和6b示出了细胞生长相关基因的表达谱，表7示出了细胞增殖相关基因的表达谱，表8a和8b示出了免疫应答相关基因的表达谱，而表9示出了转移相关基因的表达谱。 
[表3] 
Figure GPA00001127672000521
[表4] 
Figure GPA00001127672000531
[表5] 
Figure GPA00001127672000541
[表6a] 
Figure GPA00001127672000551
[表6b] 
  肿瘤坏死因子受体超家族，  成员17   NM_011608   0.65   4.42   6.81   0.083/0.00   9
  V-maf肌腱膜纤维肉瘤致癌  基因家族，蛋白B(鸟类)   NM_010658   0.83   2.03   2.45   0.203/0.02   3
  白介素7受体   NM_008372   0.82   2.36   2.86   0.195/0.01   7
  Fgfr1致癌基因伴侣   NM_201230   0.49   1.15   2.33   0.031/0.32   8
  血球巨(Tescalcin化因子   NM_021344   0.50   1.16   2.34   0.025/0.27   2
  Burkitt淋巴瘤受体1   NM_007551   0.42   1.93   4.60   0.031/0.03   1
  蛋白质磷酸酶1，  调节(抑制)亚单位14c   AK082372   0.18   0.40   2.22   0.019/0.18  4
  眼缺乏的4同源物   NM_010167   1.07   0.46   0.43   0.721/0.04   6
  sema结构域，跨膜结构域(TM)  和胞质结构域(semaphorin)6D   AK052232   1.12   0.48   0.43   0.367/0.02   2
  结直肠癌中突变的   AK086623   0.87   0.41   0.47   0.347/0.01   9
  Sema结构域，免疫球蛋白结构域  (Ig)，短碱性结构域，  分泌的，(semaphorin)3E   AK049580   0.95   0.38   0.40   0.713/0.18
  Sine眼相关同源框2同源物   NM_011380   4.18   1.60   0.38   0.022/0.09   4
  早期B细胞因子3   AK220542   4.49   1.70   0.38   0.008/0.04   9
  V-abl Abelson鼠类白血病病毒  致癌基因2(arg，Abelson-   相关基因)   NM_009595   3.90   1.35   0.35   0.021/0.20  1
  早期B细胞因子2   NM_010095   2.88   1.30   0.45   0.015/0.15   2
  HtrA丝氨酸肽酶3   NM_030127   3.50   1.41   0.40   0.011/0.08   9
  肌钙蛋白T2，心脏的   NM_011619   2.33   1.13   0.49   0.018/0.34
  发育多能性相关的5   NM_025274   2.30   0.85   0.37   0.027/0.41   4
  受体酪氨酸激酶样孤儿受体1   NM_013845   2.33   1.06   0.46   0.022/0.65   4
  磷脂酶C，γ1   AF027185   3.05   0.99   0.33   0.012/0.95   1
  肺癌和食管癌1中缺失的   AK045848   2.34   0.95   0.41   0.018/0.64   1
  上颚、肺和鼻上皮癌相关的   NM_011126   3.68   0.14   0.04   0.007/0/00   7
[0217] [表7] 
Figure GPA00001127672000571
[表8a] 
Figure DEST_PATH_GSB00000218799700011
[表8b] 
  CD3抗原，γ多肽   NM_009850   0.68   5.05   7.46   0.063/0.008
  CD96抗原   NM_032465   0.79   2.39   3.02   0.148/0.017
  组织相容性2，II类抗原A，α   NM_010378   0.72   2.75   3.82   0.12/0.014
  组织相容性2，  II类抗原A，O区α座位   NM_008206   0.65   2.81   4.31   0.053/0.013
  趋化因子(C-X-C基序)受体3   NM_009910   0.63   3.25   5.12   0.048/0.008
  CD8抗原，β链1   NM_009858   0.75   2.15   2.86   0.107/0.021
  CD86抗原   NM_019388   0.83   2.29   2.77   0.066/0.01
  CD3抗原，6多肽   NM_013487   0.56   3.42   6.16   0.031/0.011
  干扰素γ诱导性蛋白47   NM_008330   0.67   2.23   3.33   0.06/0.019
  免疫球蛋白λ链，变量1   AK008094   0.40   2.85   7.15   0.044/0.015
  CD180抗原   NM_008533   0.42   2.19   5.22   0.107/0.042
  含有85A的卷曲螺旋结构域   AK087049   1.00   0.44   0.44   0.984/0.019
  cathelicidin抗菌肽   NM_009921   1.19   0.37   0.31   0.243/0.016
  嗜中性颗粒蛋白   NM_008694   1.41   0.36   0.25   0.083/0.007
[表9] 
Figure GPA00001127672000591
如上表3所描述的，对于细胞凋亡相关基因，与用对照蛋白处理的小鼠组相比，在用可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的小鼠组中，半胱天冬酶14(Caspase 14)、细胞死亡诱导DFFA-样效应子c(Cidec)、细胞死亡诱导DNA片段化因子和α亚单位-样效应子A(Cidea)的表达分别被上调大约3.5，4.0，2.5和2.5倍。 
如上表4所描述的，对于细胞粘附-相关基因，与用对照蛋白治疗的小鼠组相比，在用可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的小鼠组中，钙粘蛋白-样26的表达被下调大约3.0倍。 
如上表5所描述的，对于细胞周期调控相关基因，与用对照蛋白处理的小鼠组相比，在用可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的小鼠组中，鸟类成红细胞增多症病毒E-26(v-ets)致癌基因的表达被下调大约4.0倍。 
如上表6a和6b所描述的，对于细胞生长相关基因，与用对照蛋白处理在小鼠组相比，在用可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的小鼠组中，在肿瘤坏死因子受体超家族的成员17的表达被上调大约6.8倍的同时，上颚、肺和鼻表皮癌瘤相关基因的表达被下调大约26.0倍。 
如上表7所描述的，对于细胞增殖相关基因，与用对照基因处理的小鼠组相比，在用可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的小鼠组中，转录本6的信号转导子和激活子的表达被上调大约5倍。 
如上表8a和8b所描述的，对于免疫应答相关基因，与对照蛋白处理的小鼠组相比，在用可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的小鼠组中，免疫球蛋白重链(J558家族)、免疫球蛋白重链复合体和免疫球蛋白结合链的表达被分别上调大约18、15和30倍 
如上表9所描述的，对于转移相关基因，与用对照蛋白处理的小鼠组相比，在用可穿透细胞的Nm23重组蛋白处理的小鼠组中，fascin同源物1(肌动蛋白成束蛋白)、前列腺素内过氧化物合成酶2和血管细胞粘附分子1的表达分别被上调大约2.5、2.5和2.0倍。 
尽管以举例说明的目的详细描述了本发明，但是应当理解，这样的详述仅用于举例说明的目的，在不背离通过所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员能够对本披露内容作出改变。 
工业应用
本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白通过有效地将转移抑制因子Nm23引入到细胞中，而能够诱导KSR的磷酸化和失活，并且抑制Ras-介导的MAPK级联反应。因此，本发明的可穿透细胞的Nm23重组蛋白通过抑制癌细胞的增殖、分化和迁移，而能够有效地被用作能够防止癌转移的抗转移剂。 
用于专利程序目的国际承认的关于微生物保藏布达佩斯条约国际形式 
原始保藏的接收 
根据条约第7.1条公布的 
寄到：JO，Daewoong residing at 1-1209， 
Samic Apt.869Dogok-dong，Gangnam-gu，Seoul 135-270 
Republic of Korea 
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Claims (14)

1.一种用于抑制或治疗癌症转移的可穿透细胞的Nm23重组蛋白，其在SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的人癌症转移抑制因子Nm23蛋白质的N-端、C-端或两端融合SEQ ID NO：6或8表示的氨基酸序列的大分子转导结构域(MTD)。
2.根据权利要求1所述的用于抑制或治疗癌症转移的可穿透细胞的Nm23重组蛋白，其中，所述MTD选自由SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的JO-76MTD和SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列的JO-77MTD组成的组。
3.根据权利要求1所述的用于抑制或治疗癌症转移的可穿透细胞的Nm23重组蛋白，进一步包含：
核定位序列(NLS)和组氨酸标签亲和性结构域，所述核定位序列和组氨酸标签亲和性结构域共价连接至所述重组蛋白的一个末端。
4.根据权利要求1所述的用于抑制或治疗癌症转移的可穿透细胞的Nm23重组蛋白，其中，所述重组蛋白选自由以下组成的组：
一种重组蛋白，其中SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的JO-76MTD融合至SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的全长Nm23的N-端；
一种重组蛋白，其中SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的JO-76MTD融合至SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的全长Nm23的C-端；
一种重组蛋白，其中SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列的JO-77MTD融合至SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的全长Nm23的N-端；
一种重组蛋白，其中SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列的JO-77MTD融合至SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的全长Nm23的C-端；以及
一种重组蛋白，其中SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列的JO-77MTD融合至SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的全长Nm23的两端。
5.根据权利要求1所述的用于抑制或治疗癌症转移的可穿透细胞的Nm23重组蛋白，其中，所述重组蛋白选自由SEQ ID NO：28、30、32、34和36的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列。
6.一种编码根据权利要求1所述的可穿透细胞的Nm23重组蛋白的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自由SEQ ID NO：27、29、31、33和35的碱基序列组成的组中的碱基序列。
8.一种包含根据权利要求6所述的多核苷酸的表达载体。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其中，所述表达载体选自由pET28a(+)-HM2N、pET28a(+)-HNM2、pET28a(+)-HM3N、pET28a(+)-HNM3和pET28a(+)-HM3NM3组成的组，
其中，所述pET28a(+)-HM2N是pET28a(+)载体内插入编码重组蛋白的多核苷酸的重组载体，所述重组蛋白是在SEQID NO：2表示的氨基酸序列的全长Nm23的N-端融合SEQ IDNO：6表示的氨基酸序列的JO-76MTD的重组蛋白；
所述pET28a(+)-HNM2是pET28a(+)载体内插入编码重组蛋白的多核苷酸的重组载体，所述重组蛋白是在SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的全长Nm23的C-端融合SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列的JO-76MTD的重组蛋白；
所述pET28a(+)-HM3N是pET28a(+)载体内插入编码重组蛋白的多核苷酸的重组载体，所述重组蛋白是在SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的全长Nm23的N-端融合SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列的JO-77MTD的重组蛋白；
所述pET28a(+)-HNM3是pET28a(+)载体内插入编码重组蛋白的多核苷酸的重组载体，所述重组蛋白是在SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的全长Nm23的C-端融合SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列的JO-77MTD的重组蛋白；以及
所述pET28a(+)-HM3NM3是pET28a(+)载体内插入编码重组蛋白的多核苷酸的重组载体，所述重组蛋白是在SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列的全长Nm23的两端融合SEQ ID NO：8表示的氨基酸序列的JO-77MTD的重组蛋白。
10.一种包含根据权利要求8所述的表达载体的转化体。
11.根据权利要求10所述的转化体，其中，所述转化体是保藏号为KCTC-11380BP的大肠杆菌DH5α/HM3Nm23。
12.根据权利要求10所述的转化体，其中，所述转化体是保藏号为KCTC-11381BP的大肠杆菌DH5α/HNm23M3。
13.一种生产可穿透细胞的Nm23重组蛋白的方法，包括培养根据权利要求10所述的转化体。
14.一种用于抑制或治疗癌症转移的药物组合物，包含作为有效成分的根据权利要求1所述的可穿透细胞的Nm23重组蛋白以及药用载体，其通过抑制癌细胞的增殖、分化或迁移以起到防止转移的作用。
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