CN102711773A - 生长激素和相关激素的抑制剂,和其使用方法 - Google Patents

生长激素和相关激素的抑制剂,和其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明包括生长激素和相关激素的新型抑制剂，包括促乳素，和胎盘催乳激素，和其它激素。本发明特别包括抗体，抗体片断，和其修饰物，以及多聚核苷酸，反义多聚核苷酸，干扰RNAs，小干扰RNAs，和使用这些物质抑制一种或多种上述激素的方法。特别方面，本发明包括制备这些抑制剂，包括一种或多种这些抑制剂的组合物的方法，以及使用一种或多种抑制剂抑制细胞，特别是肿瘤细胞的方法，例如，抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动性。本发明也包括使用一种或多种描述的组合物或抑制剂，进行诊断和监控的方法，特别是治疗肿瘤的方法。

Description

生长激素和相关激素的抑制剂,和其使用方法
相关申请
该非临时申请优先于2007年5月30日归档的U.S.S.N.60/940939，其通过在此引述全部合并于本文。
技术领域
本发明涉及新型生长激素和相关激素的抑制剂，特别是催乳素，和其它在此描述的激素。本发明特别涉及抗体，抗体片断，和其修饰物，以及多聚寡核苷酸，如反义多聚寡核苷酸，干扰RNAs，和小干扰RNAs，和使用这些抑制剂抑制生长激素和/或相关激素的方法。特别方面，本发明涉及制备这些抑制剂，包括一种或多种这些抑制剂的组合物的方法，以及使用一种或多种抑制剂抑制细胞，特别是肿瘤细胞的方法，例如，抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动性。本发明也包括使用一种或多种描述的组合物或抑制剂，进行诊断和监控的方法，特别是治疗肿瘤的方法。
背景技术
人类生长激素(hGH)是生长，发育和性成熟过程中的关键因子，并且自其1944年被发现以来一直进行了深入研究(C.H.Li，H.M.Evans，Isolation of pituitary growth hormone，Science 99(1944)183-184)。内分泌型hGH由垂体前叶分泌，并且直接作用于身体生长调节。通过与膜结合生长激素受体(GHR)的交互作用而达到调节效应(T.Zhu，E.L.Goh，R.Graichen，L.Ling，P.E.Lobie等综述，Signal transducton via the growth hormonereceptor，Cell Signal 13(2001)599-616；D.Le Roith，C.Bondy，S.Yakar，J.L.Liu，A.Butler，The somatomedin hypothesis：2001，Endocr，Rev.22(2001)53-74)。作为最初机制，hGH通过刺激肝IGF-1分泌而促进生长(D.Le Roith，C.Bondy，S.Yakar，J.L.Liu，A.Butler，The somatomedin hypothesis：2001，Endocr.Rev.22(2001)53-74)。然而，在生长过程中hGH也表现出许多非依赖于IGF-1的效应。
hGH的垂体前叶分泌是由生长激素释放激素(GHRH)和人生长激素释放多肽引发的，并由生长激素抑制素(SS)负调节。然而，在体内的一些推理位点也有hGH的合成。这样，hGH具有内分泌水平活性，但也具有重要的促分泌和旁分泌活性(见，例如，D.Le Roith，C.Bondy，S.Yakar，J.L.Liu，Butler，Thesomatomedin hypothesis：2001，Endocr.Rev.22(2001)53-74；N.Liu，H.C.Mertani，G.Norstedt，J.Tornell，P.E.Lobie，Mode ofthe autocrine/paracrine mechanism of growth hormone action，Exp.Cell.Res.237(1997)196-206；S.Harvey，K.L.Hull，Growthhormone.A paracrien growth factor Endocine(1997)267-279)。hGH的推理性分泌已经定位于多位点，包括中枢神经系统中的分离神经元群体，乳腺上皮细胞，血管纤维原内皮细胞，胸腺上皮细胞，免疫系统细胞，包括巨噬细胞，B-细胞，T-细胞，和自然杀伤细胞(见，例如，N.Liu，H.C.Mertani，G.Norstedt，J.Tornell，P.E.Lobie，Mode of the autocrine/paracrine mechanism of growthhormone action，Exp.Cell.Res.237(1997)196-206；S.Harvey，K.L.Hull，Growth hormone.A paracrine growth factor Endocrine(1997)267-279，和这里引述的文献)。
GH属于一种激素家族，其包括催乳素(PRL)和胎盘催乳素(PL)，和较少被认知的多育曲菌素和多育曲菌素相关蛋白，其可由内皮细胞或临近细胞分泌(AM Corbacho等，Journal ofEndocrinology，2002，173，219-238)。多肽激素家族的经典成员，GH，PRL，和PL，是由来源于共同基因的同源蛋白。所有脊椎动物的垂体前叶主要分泌PRL和GH，而PL仅在哺乳动物中存在，由胎盘分泌。这三种激素具有许多共同结构和生物特性。GH，PL，和PRL在mRNA和蛋白水平上的相似性已经被广泛研究(Nicoll CS，Mayer GL & Russell SM 1986 Structural features ofprolactins and growth hormones that can be related to theirbiological properties.Endocrine Reviews 7169-203，Goffin V，Shiverick KT，Kelly PA & Martial JA 1996 Sequence-functionrelationships within the expanding family of prolactin，growthhormone，placental lactogen and related proteins in mammlas.Endocrine Reviews 17385-410；Kelly PA 1990 Growth hormoneand prolactin.In Hormones from Molecules to Disease，pp 190-217.Eds E-E Baulieu & PA Kelly.Paris；Herman，Publishers inArts and Science.
由于更少的毒性和更高的耐受性，针对阻断肿瘤生长的特殊途径已经作为一种新型药物研发选择策略。例如，多种直接针对EGFR和HER2受体的化合物已经进入临床研发，并且目前已经进入临床试验。作为一个特别例子，
Figure GPA00001010977500031
已经作为一种人源化单克隆抗体以针对并阻断HER2的功能。此外，
Figure GPA00001010977500032
已经作为一种表皮生长因子受体(EGFR)和人类表皮生长因子受体2(HER-2)的双酪氨酸激酶抑制剂。新型抗-肿瘤药物仍具有持续需求。特别是，需要鉴定针对一种肿瘤细胞生长的特定基因和蛋白。本发明符合该需求和其它需求。
发明内容
本发明包括针对生长激素(GH)和相关激素的基因和对应基因产物的抑制药物，例如一种或多种人类生长激素基因簇成员，催乳素(PRL)基因，和/或多育曲菌素基因，和其对应基因产物(如多肽)。人类生长激素基因簇成员包括人类生长激素1(hGH1)基因，生长激素2(hHG2)基因，人类绒毛膜生长催乳激素1(CSH1)基因；以及人胎盘催乳激素(PL，例如，hPL-1，hPL-2，hPL-3))，人类绒毛膜生长催乳激素2(CSH2)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素2(CSL-2)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素3(CSL-3)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素4(CSL-4)基因，或其任何变体。人类生长激素基因簇成员的例子包括但不局限于下列描述的氨基酸序列，如GenBank Accession Nos.AAA72260，AAK69708，NP_001308，NP_002050，AAA98621，AAA39404，NP_851350，NP_072171，NP_066271，NP_072170，NP_001308，NP_072167，和NP_072166。催乳素基因包括但不局限于催乳素基因，催乳素相关蛋白基因，或任何其变体。编码催乳素的基因实施例包括但不局限于下列描述的氨基酸序列，如GenBank Accession Nos.CCA38264，NP_000939，CCA25214，CCA25108，AAH88370，CCA23829，和CCA38265。多育曲菌素基因包括但不局限于多育曲菌素基因，多育曲菌素相关蛋白基因，或其任何变体。编码多育曲菌素的基因实施例包括但不局限于下列描述的氨基酸序列，如GenBank Accession Nos.S48671。
人类生长激素基因簇的基因产物包括类生长激素1(hGH1)，生长激素2(hHG2)，人类绒毛膜生长催乳激素1(CSH1)；以及人胎盘催乳激素(PL，例如，hPL-1，hPL-2，hPL-3))，人类绒毛膜生长催乳激素2(CSH2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)，人类绒毛膜生长催乳相似激素2(CSL-2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素3(CSL-3)，人类绒毛膜生长催乳相似激素4(CSL-4)，或其任何变体。催乳素基因的基因产物包括但不局限于催乳素和催乳素相关蛋白。多育曲菌素基因产物包括但不局限于多育曲菌素和多育曲菌素相关蛋白。
本发明中的生长激素抑制剂包括抗体，和多聚核苷酸，包括反义多聚核苷酸，干扰RNAs(iRNAs)，和小干扰RNAs(siRNAs)。
一方面，本发明包括直接针对GH和/或其相关激素，或其变体的抗体，和抗体片断，和其修饰物。本发明的抗体的特征为其具有特异结合hGH，催乳素，或多育曲菌素多肽，和/或其变体的能力，例如，hGH1，hGH2，hPRL或hPL。本发明的抗体特异结合的hGH，hPRL，和/或hPL多肽包括一个或多个构象和/或序列表位。HGH多肽或其变体上的构象和序列表位包括但不局限于表2中显示的构象表位，和表3中显示的序列表位。hPRL多肽上的构象表位包括但不局限于表5中显示的构象表位。本发明的抗体可以包括一种生长激素多肽，如hGH，hPRL和/或hPL的抗原决定簇，表1和表4描述了这些抗原决定簇。
特定方面，本发明包括直接针对GH，和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL的多克隆或单克隆抗体，或抗体片断，和其修饰物。特定方面，抗体这届针对一种多肽，例如，SEQ ID Nos：1-26中的至少一种，合适地为SEQ ID Nos：1-26中的一种，或其修饰序列。多方面，抗体直接针对天然多肽，任何源于此多肽的肽，任何这些多肽或肽的修饰物(例如，其初级结构基于激素的序列)，或模拟激素3D结构的任何多肽或肽。
另一特定方面，本发明包括一种多克隆抗体，抗体片断，或其修饰物。
更特别的方面，本发明包括一种单克隆抗体，抗体片断，或其修饰物。
另一方面，本发明包括GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL的抑制多聚核苷酸，包括，例如，反义多聚核苷酸，iRNAs，和siRNAs。
特定方面中，抑制剂是适用于抑制GH和/或相关激素的多肽。特定方面中，多肽包括至少一种SEQ ID NO：27-96中的核苷酸序列，或其修饰序列。更特别地，试剂从下列组中选择：直接针对GH和/或其相关激素转录的反义核苷酸；适用于表达此类反义链的核苷酸；直接针对GH和/或其相关激素转录的iRNA；和适用于表达此类iRNA的核苷酸。
其它方面中，本发明包括一种直接针对GH和/或其相关激素转录的独立iRNA(例如，siRNA)，或适用于表达直接针对GH和/或其相关激素转录的iRNA的核酸。特定方面中，独立的iRNA包括任何一种从SEQ ID Nos：33-60或97-98中选择的序列，或其修饰序列。一些方面中，独立iRNA可以包括一条正义链和一条反义链，并形成双链形式。这些反义多聚核苷酸和iRNAs，特别是siRNAs，可以抑制GH和/或相关激素核酸和/或多肽产物的表达，例如，SEQ ID NO；27-32，或其修饰序列。
其它方面，本发明包括制备这些反义多聚核苷酸或iRNAs的表达载体，以及宿主细胞。本发明也以一种宿主细胞为特点，例如，一种包括至少一种表达载体的微生物宿主细胞。
另一方面中，本发明包括抑制GH和/或相关激素基因和相关基因产物(例如，多肽)的方法，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL，方法包括：根据本发明，将GH和/或其相关激素与抗体，或抗体片断，或其修饰物反应。特定方面中，本方法用于减少GH和/或相关激素的活性或其表达水平。
进一步的方面中，本发明包括抑制GH和/或相关激素基因和相关基因产物(例如，多肽)的方法，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL，方法包括：根据本发明，将GH和/或相关激素多聚核苷酸与多聚核苷酸移植物反应，如反义链，iRNA，或siRNA。特定方面中，本方法用于减少GH和/或相关激素的活性或其表达水平。
更进一步方面中，本发明包括抑制GH和/或相关激素的交互反应的方法，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL，方法包括：根据本发明，将所述的受体与抗体，或抗体片断，或其修饰物反应。
额外方面中，本发明包括抑制细胞，特别是肿瘤细胞(例如，来源于乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，和/或子宫内膜异位的上皮肿瘤细胞)的增殖，存活和/或运动的方法。特别地，本方法包括使用至少一种GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL的抑制剂，如此所述，包括将细胞与抑制剂接触。特定方面中，抑制剂是一种抗体，多抗体片断，或其修饰物。另一方面中，抑制剂是一种多聚核苷酸抑制剂，或其片断，或修饰物，如反义链，iRNA，或siRNA。
相关方面中，本发明包括在需要的主体中治疗或预防一种失调，例如癌症(包括但不局限于乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌)，细胞增殖失调(包括但不局限于子宫内膜异位)和/或细胞存活失调的方法。方法包括：将所述的细胞与人类生长激素和/或相关激素，或其变体的抑制剂反应。hGH抑制剂可以单独给药，或与第二种治疗化合物联合给药(同时或连续)，如化学治疗或抗-肿瘤药物。例如，对所述的主体使用有效剂量的一种或多种抑制剂，包括但不局限于抗体，抗体片断，或其修饰物，使得所述的细胞与所述的抑制剂接触。
另一相关方面中，本发明包括在需要的主体中治疗或预防一种失调，例如癌症(包括但不局限于乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌)，细胞增殖失调(包括但不局限于子宫内膜异位)和/或细胞存活失调的方法。方法包括：将所述的细胞与hGH和/或相关激素，或其变体的抑制剂反应。hGH抑制剂可以单独给药，或与第二种治疗化合物联合给药(同时或连续)，如化学治疗或抗-肿瘤药物。例如，对所述的主体使用有效剂量的一种或多种抑制剂，包括但不局限于多聚核苷酸抑制剂，例如反义链，iRNA，或siRNA。
另一方面中，本发明包括检测样本中GH和/或相关激素存在或水平的方法，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL，方法包括：将所述样本与一种多种抗体，抗体片断，或其修饰物接触。特定方面中，样本为生物体液或组织。
另一方面中，本发明包括检测样本中GH和/或相关激素存在或水平的方法，特别是hGH和/或其变体，hPRL或hPL，方法包括：将所述样本与一种多种多聚核苷酸，片断，或其修饰物接触。特定方面中，样本为生物体液或组织。
额外的方面中，本发明包括诊断或监控主体(例如人类)中的失调的方法，如癌症(包括但不局限于上皮细胞肿瘤，如乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌)，细胞增殖失调(包括但不局限于子宫内膜异位)和/或细胞存活失调的方法，方法包括：将所述主体的样本与生长激素(GH)和相关激素激素和对应多肽产物抑制剂接触，特别是所述的人类生长激素(hGH)和其变体，并测定相对于对照样本，抗体结合所述样本的水平。与对照样本相比，抗体与所述样本结合水平的升高表明存在肿瘤，细胞增殖失调和/或细胞存活失调。特定方面中，主体的样本为生物体液或组织。
特别方面中，本发明包括诊断或监控主体(例如人类)中的失调的方法，如癌症(包括但不局限于上皮细胞肿瘤，如乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，和/或子宫内膜癌)，细胞增殖失调(包括但不局限于子宫内膜异位)和/或细胞存活失调的方法，方法包括：将所述的至少一种抗体与主体中样本接触；并测定相对于对照样本，抗体结合所述样本的水平。与对照样本相比，抗体与所述样本结合水平的升高表明存在肿瘤，细胞增殖失调和/或细胞存活失调。
另一特定方面中，本发明包括诊断或监控主体(例如人类)中的失调的方法，如癌症(包括但不局限于上皮细胞肿瘤，如乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，和/或子宫内膜癌)，细胞增殖失调(包括但不局限于子宫内膜异位)和/或细胞存活失调的方法，方法包括：将所述的至少一种抗体与主体中样本接触；并测定相对于对照样本，抗体结合所述样本的水平。与对照样本相比，抗体与所述样本结合水平的升高表明存在肿瘤，细胞增殖失调和/或细胞存活失调。
特定方面中，诊断或监控的方法包括比较测定样本中GH和/或相关激素相对于标准或基础的水平，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。特定方面中，本发明的方法使用ELISA。可选的，或附加的，本方法使用一种或多种RIA，免疫沉淀，Westernblotting，免疫组化染色，亲和色谱，竞争结合试验，和凝集试验。
另一方面中，本发明包括一种组合物，例如，一种药物组合物，其包括至少一种在此描述的抗体，或抗体片断，或其修饰物。特定方面中，组合物可以包括一种或多种药物可接受稀释物，载体，和/或赋形剂。
另一方面中，本发明包括一种组合物，例如，一种药物组合物，其包括至少一种在此描述的多聚核苷酸，或片断，或其修饰物。特定方面中，组合物可以包括一种或多种药物可接受稀释物，载体，和/或赋形剂。
进一步的方面中，本发明包括在药物生产中使用一种或多种在此描述的抗体，或抗体片断，或其修饰物，治疗一种主体失调，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调。
进一步的方面中，本发明包括在药物生产中使用一种或多种在此描述的多聚核苷酸，或抗体片断，或其修饰物，治疗一种主体失调，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调。
另一方面中，本发明包括在药物生产中使用一种或多种在此描述的抗体，或抗体片断，或其修饰物，用于分离或纯化GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。
另一方面中，本发明包括在药物生产中使用一种或多种在此描述的多聚核苷酸，或片断，或其修饰物，用于鉴定GH和/或相关激素多聚核苷酸(例如，基因或转录产物)，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。
进一步的方面中，本发明包括一种在主体中诊断，监控，或治疗一种失调的试剂盒，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调。本试剂盒包括至少一种在此描述的抗体，或抗体片断，或其修饰物。
进一步的方面中，本发明包括一种在主体中诊断，监控，或治疗一种失调的试剂盒，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调。本试剂盒包括至少一种在此描述的多聚核苷酸，或抗体片断，或其修饰物。
特定方面中，试剂盒包括：a)至少一种针对GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL的抑制剂(例如，多聚核苷酸或抗体)；和b)合适的，使用方法。
另一特定方面中，本发明的方法可以进一步包括一种多多种对照样本，其包括已知水平的GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，或其片断，或修饰物。另一方面中，试剂盒可以进一步包括从人类中分离的可溶性激素。
另一方面中，根据在此描述的方法，试剂盒包括用于诊断，监控，或治疗一种失调，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调的本发明的组合物。
相关方面中，本发明也提供了使用GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，或其片断，或修饰物，以制备试剂盒，用于诊断，监控，或治疗一种失调，特别是癌症，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，细胞增殖失调。
多种方面中，本发明的方法使用体内或体外表达系统。另一方面中，本方法使用由重组，合成，或半-合成方法制备的多聚核苷酸或抗体，或由内源性方法(例如，自然产生成分)制备的多聚核苷酸或抗体。
该应用说明中涉及或指示的部分，单元和特征，与任何或所有其它两种或多种所述的部分，单元和特征，可以单独的或联合的，广义地包含本发明，这里说明的特定总变量数具有本发明涉及领域中的等同物，通过单独的说明，该同等物在此合并。
以下描述了本发明的其它方面。
附图说明
被认为包括所有情况的本发明的这些和其它方面，将从以下描述，结合随附的图表，仅以示范例的方法获得显性说明
图1A-1D：显示了RL95-2子宫内膜癌细胞系中自分泌-hGH的表达能力和其对细胞发育能力的效应。使用pcDNA3载体对RL95-2细胞稳定转染hGH cDNA。(图1A)hGH mRNA和hGH受体的水平通过RT-PCR测定。(图1B)以ELISA测定载体分泌至培养基中的hGH和转染RL95-2细胞中的hGH cDNA。以MTT方法评估hGH表达能力对RL95-2细胞发育的效应，图1C表示10％FBS培养基，图1D表示血清减量培养基(0.2％)条件。*p值＜0.001，**p值＜0.05。
图2A-2D：RL95-2人类子宫内膜癌细胞产生的自分泌-hGH增强了细胞增殖和细胞存活。(图2A)10％FBS培养基中RL95-2-载体和RL95-2-hGH细胞的生长曲线。(图2B)以BrdU核苷酸插入显示的自分泌-hGH对细胞周期的效应，和(图2C)TUNEL方法的细胞凋亡效应，血清去除48小时后介导的细胞凋亡。(图2D)实时PCR显示的自分泌-hGH的表达对多种细胞周期调节物，抗-凋亡，促-凋亡，和致癌基因表达的效应。*p值＜0.001，**p值＜0.05。
图3A-3D：RL95-2人类子宫内膜癌细胞产生的自分泌-hGH增强不依赖支持物生长，集落形成，腔体空间填充，和腺泡形态干扰的结果。(图3A)悬浮培养基中RL95-2-载体和RL95-2-hGH-稳定细胞生长曲线，10％FBS培养基中悬浮培养群落的形态。(图3B)10％FBS培养基中RL95-2-载体和RL95-2-hGH-稳定细胞的软琼脂集落形成，150×放大率下群落形态。(图3C)RL95-2-载体和RL95-2-hGH-稳定细胞的基质胶集落，干扰腺泡形态的全部集落数量的图示。以400×放大率拍摄集落照片。(图3D)10％FBS培养基中RL95-2-载体和RL95-2-hGH-稳定细胞的集落形成。*p值＜0.001，**p值＜0.05。
图4A-4D：RL95-2人类子宫内膜癌细胞产生的自分泌-hGH刺激间叶细胞显形并增强细胞运动性和导致蔓延性表型。(图4A)以明视场400×放大率显微镜测定塑料培养板上10％FBS培养基培养的RL95-2-载体和RL95-2-hGH-稳定细胞形态。(图4B)伤口愈合试验，以100×放大率测定伤口面积。以Transwell chamber方法测定RL95-2-载体和RL95-2-hGH-稳定细胞的运动性(图4C)和侵染(图4D)。*p值＜0.001，**p值＜0.05。
图5A-5C：显示AN3细胞系中自分泌-hGH的表达能力和其功能特征。(图5A)以RT-PCR测定hGH mRNA水平。(图5B)10％FBS培养基中AN3-载体和AN3-hGH-稳定细胞的生长曲线。(图5C)10％FBS培养基中AN3-载体和AN3-hGH-稳定细胞的软琼脂集落形成，150×放大率下的集落形态。*p值＜0.001，**p值＜0.05。
图6A-6D：兔抗hGH血清对RL95-2细胞的效应。以MTT试验评估hGH-抗血清处理后的RL95-2细胞的生存能力。(图6A)10FBS培养基；和(图6B)血清-缺乏(0.2％)培养基；NRC＝正常兔血清；48小时间隔内用抗体处理细胞两次，4天内进行测定。(图6C)以非-特异兔IgG hGH-抗血清处理后的细胞周期和凋亡基因标记物的表达情况。(图6D)以CASPASE-GLOTM 3/7检测试剂盒(Promege)进行3/7半胱氨酸蛋白酶活性评估中获得的hGH抗体浓度增加效应。
图7：不同细胞系中的hGH基因表达模式。以实时PCR评估不同细胞中的hGH基因表达特征。柱状表示hGH基因相对于MCF7(ATCC)细胞系的表达情况。关键：r2＝0.984；SF＝无血清；HP＝高传代次数；vec＝载体。
图8A-8D：GH和相关激素的序列信息。(图8A)hPRL，GH1，GH2，CSH1，CSH2，hCSL hCSL-2，hCSL-3，hCSL-4的CLUSTALW氨基酸序列。下划线表示信号肽序列。(图8B)hPRL，GH1，GH2，CSH1，CSH2，hCSL，hCSL-2，hCSL-3，hCSL-4的氨基酸序列。(图8C)GH1，GH2，CSHL，CSH2，CSH1，hPRL的CLUSTALW核酸序列。(图8D)GH1，GH2，CSHL，CSH2，CSH1，hPRL的核酸序列。
图9A-9C：siRNA造成的hGH mRNA的衰减可促使子宫内膜癌细胞的凋亡：两种siRNA结构(sihGH5和sihGH6(SEQ IDNO：97和SEQ ID NO：98))促进了RL95-2细胞的凋亡活性(以半胱氨酸蛋白酶3/7活性评估的凋亡)(图9A和9B)；实时PCR定量分析显示sihGH5和sihGH6的使用可减少RL95-2细胞中的hGH基因的表达(图9C)。
具体实施方式
以下是本发明的描述，包括其带有常规术语的优选的实施方案。以下的”实施例”部分提供了支持本发明和特定实施例的试验数据，对本发明进了了进一步的说明。
定义
术语”抗体”(例如，”GH抗体”或类似术语)应当以最广泛的可能意义理解，并包括完整的单克隆抗体和多克隆抗体。并包括其片断和其它修饰物，只要其显示了期望的生物学活性。抗体包括免疫蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，例如，包括一种特异结合(免疫结合)抗原的抗原结合位点的分子。其包括，但不局限于，多克隆，单克隆，人工的，单链，Fc，Fab，Fab’，和Fab2片断，及Fab表达文库。与任何IgG，IgM，IgA，IgE，和IgD几何相关的抗体，其分子重链相互不同。其包括子集，如IgG1，IgG2，和其它。轻链可以是kappa链或lambda链。这里所指的抗体包括所有集合，子集，和类型。也包括人工抗体，例如，特异针对超过一种来源的单克隆抗体或其片断，例如，一种鼠类或人类序列。进一步包括camelid抗体或nanobodies。应当理解每个”抗体”或任何类似术语的的引述，包括完整抗体，以及任何片断，和其任何修饰物。
术语”抗原结合位点”或”抗原结合部位”指免疫球蛋白分子上的部分，或片断，或其修饰物，其参与抗原相互作用。抗原结合位点通常由重链(”H”)和轻链(”L”)的N-末端可变区域(”V”)氨基酸残基构成。重链和轻链V区中的三个高度分歧结构，称为”超变量区域”，插入至称为”侧翼区域”的更为保守的侧翼结构中。这样，术语”侧翼区域”或”FR”指自然发现于，或接近于免疫球蛋白超变区域中的氨基酸序列。任何抗体分子中，轻链中的三种超变量区域和重链区域的三种超变量区域在3维空间上相互作用形成抗原结合表面。抗原结合表面通常与被结合的抗原的三维表面互补，每个重链和轻链的三个超变区域称为”互补-决定区域”，或”CDRs”。根据可接受的定义指定每个区域中的氨基酸(见，例如，Kabat Sequence of Proteins of Immunological Interest，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991；及Chthia & Lesk J.Mol.Biol.196：901-917，1987，Chothia等。Nature 342：878-883，1989)。
这里使用的”选择性”多聚核苷酸，包括带有删除，插入，或替换不同核苷的多聚核苷酸，其具有相同编码或功能相等。编码的多肽和抗体也可以是”选择性”的，并包括删除，插入，或替换的氨基酸，产生沉默改变并形成功能相等的序列。根据残基的极性，电荷，可溶性，疏水性，亲水性和/或两性特征，可以进行氨基酸的设定替换，只要至少保留一种生物活性(例如，细胞增殖，细胞存活，或细胞运动的刺激性)或免疫原性或免疫学活性。例如，阴离子氨基酸可以包括天门冬氨酸和谷氨酸；阳离子氨基酸可以包括赖氨酸和精氨酸；带有非离子极性基团并具有相似的亲水性的氨基酸包括亮氨酸，异亮氨酸，和缬氨酸，甘氨酸和丙胺酸。如图示，通过相关序列的阵列，可以获得关于替换和/或删除或添加的指南。
术语”癌”和”癌的”指哺乳动物中以异常的或不受控制的细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动为典型特征的生理性状况。癌症病理学可以与以下状况相关，例如，转移，干扰临近细胞的正常功能，以非正常水平释放细胞因子或其它分泌物，抑制或恶化炎症或免疫应答，肿瘤形成，癌前病变，恶性肿瘤，侵染远距离器官或组织，如淋巴结。特别是乳腺癌，其可以包括上皮细胞肿瘤，非上皮肿瘤，癌，例如，原位癌，以及入侵性乳腺癌。也包括直肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，和子宫内膜异位，和其它情况。
这里使用的术语”互补的”或”互补”，指在可行的盐浓度和温度条件下，多聚核苷酸通过碱基配对自然结合。对于序列A-G-T，互补序列为T-C-A，反向互补为A-C-T，反向序列为T-G-A。两条单链分子间的互补可以是部分的，其中仅有部分核苷酸结合，或其可以为两条单链分子间的完全互补。核酸链之间互补的程度对于核酸链杂交的效果和强度具有重要效应。对于扩增反应尤其重要，其依赖于核酸链间的结合以及iRNAs和PNAs的设计和使用。
这里使用的术语”衍生”，指多聚核苷酸，或其多聚核苷酸互补物的化学修饰物。一些化学修饰包括，例如，以烷基，酰基，或氨基基团替换氢。优选的方面，多聚核苷酸衍生物编码的多肽或抗体保留自然分子的生物或免疫功能。衍生多肽或抗体通过糖基化、聚乙二醇化，或任何相似的过程，保留原始序列的一种或多种生物学功能(例如，对于细胞增殖，细胞存活，或细胞运动的效应)或免疫学功能。当特指抗体时，术语”衍生物”包括，例如，杂交和重组抗体。抗体的杂交和重组形态包括，例如，人源化抗体，微型双功能抗体，三功能抗体，和单链抗体。
这里使用的术语”表位”包括任何具有结合免疫球蛋白或相关分子能力的多肽或多肽决定簇，例如，一种scFv，或一种T细胞受体。表位决定簇通常包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸和/或唐链分子，并且通常具有特定的三维决定结构特征，以及特定的离子特征。表位包括两种主要类型，顺序表位(SEs)，其中抗体与以肽链连接的氨基酸残基连续片断相结合，以及构象表位(CEs)，其中抗体与非连续残基的折叠多肽链结合。构象表位也指自然表位。由抗原-抗体复合物的结晶结构分析可以获知，如果将被抗体识别，则残基必须在相互作用中易于接近，因此其应存在于抗原表面。一种可商业获得的计算方法可以预测SE和CE。当抗体的解离常数≤1μM；合适地≤100nM，更合适地≤10nM时，其可以特异结合抗原。
术语”表达”包括多聚核苷酸和多肽的产生，特别是，来源于一种基因或基因片段的RNA产物(例如，mRNA)，并且包括一种RNA或基因或基因片段编码的氨基酸序列产物，以及表达相关的可检测物质的出现。例如，多肽-多肽相互作用，多肽-核酸相互作用，或类似物的复合物的形成，也包括于术语”表达”的范围内。另一实施例为结合配基的结合，例如针对一种基因或其它多聚核苷酸或寡核苷酸的杂交探针或抗体，一种多肽或一种蛋白片断，和结合配基的显色。这样，微阵列点光密度的增加，Northern斑点的杂交，或Western斑点的免疫杂交，或珠阵列，或PCR分析，也包括于术语”表达”的范围内。
这里使用的术语”生长激素和相关激素”，指具有相似序列和/或功能的激素，包括，但不局限于生长激素(GH)；催乳素(PRL)和催乳素-相关蛋白；人类生长激素基因簇，包括生长激素1(hGH1)，生长激素2(hHG2)基因，绒毛膜生长激素1(CSH1；也称为胎盘催乳素(PL，PL-1，PL-2，PL-3))；绒毛膜生长激素2(CHS2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)，人类绒毛膜生长催乳相似激素2(CSL-2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素3(CSL-3)，人类绒毛膜生长催乳相似激素4(CSL-4)基因，和多育曲菌素和多育曲菌素-相关蛋白。人类激素特定地包括于该定义中。本发明的激素包括多重序列代号，例如，GH1也指GH，GHN，和GH-N(正常生长激素)；GH2也指GHL，GHV和GH-V(生长激素变体)；CSL也指CSHL1，CS-5，CSHP1，和hCS-L；CSH1也指PL，hCS-A，和CSMT；GH2也指GHL，GHV，GH-V(生长激素变体)；CSH2也指CSB，CS-2，和hCS-B。这里使用的术语绒毛膜生长素和盘催乳素，和其相应的序列符号，可以交互使用。应当理解，每个激素的引用(例如，hGH，hPRL，或hPL)，或类似术语，将包括全场序列以及任何片断，或其修饰物(包括变体)。
“抑制剂”，和GH和/或相关激素的”抑制”或”抑制”，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，指抑制或减少GH和/或相关激素的基因和相关基因产物的生物学活性和/或表达水平的方面。当期望完全抑制激素的活性时，该需求是必须的。许多”抑制”发生在激素的表达和生产水平上(例如，转录或翻译水平)或通过针对激素的功能。对GH和/或相关激素的”抑制”或”抑制”，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，指某种减少，例如，在DNA水平(例如，减少DNA合成，增加更替，和/或减少稳定性)，RNA水平(例如，降低转录，增加更替，和/或减少稳定性)，或多肽水平(例如，减少翻译，增加更替，和/或减少稳定性)，或激活，或翻译后修饰。抑制剂也可以减少或抑制激素途径中的下游或上游产物的活性或表达水平。特定方面，抑制剂可以与这里所述的激素特定结合或反应。对于一种抗体，”特定结合”或”特定免疫反应”指抗体与期望抗原的一个或多个抗原决定簇反应，而不与其它多肽反应(例如，结合)，或与其它多肽以非常低的亲和力结合(例如，Kd＞10-6)。
特定实施方案，本发明的抑制剂可用于抑制细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动，特别是针对这里所述的肿瘤细胞。特别地，该试剂可用于一种或多种：减少细胞增殖(例如，通过减少细胞分化)，增加细胞死亡(例如，通过增加细胞凋亡或坏死)，或减少细胞入侵和/或转移(例如，通过减少细胞骨架活性，细胞马达)。某些情况下，本发明通常直接抑制GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hRPL，或hPR，其具有维持或减少激素水平的有益方面。根据已知的方法，显示的多聚核苷酸和多肽也可以用于某些目的。
这里使用的术语”修饰物”指序列改变产物和序列片段，变体，和衍生物。该术语包括多肽，多聚核苷酸，抗体，和这里描述的相似物。
这里使用的术语”单克隆抗体”，”MAb”，或”单克隆抗体合成物”，指具有抗体分子特征的抗体分子群，其包括唯一的轻链基因产物和唯一的重链基因产物。特别地，单克隆抗体的互补决定区(CDRs)是唯一的。MAbs包括可以与抗原特定表位产生免疫反应的抗原结合位点，并以唯一亲和力为特征。
术语”寡核苷酸”指一种多聚核苷酸，典型的为一种探针或引物，包括，但不局限于，单链DNAs，单链或双链RNAs，RNA:DNA杂交，和双链DNAs。寡核苷酸，如单链DNA引物寡核苷酸，通常以化学方法合成，例如，使用可商业提供的自动寡核苷酸合成仪，或通过多种其它方法，包括体外表达系统，重组技术，及细胞和机体表达。
“纯化抗体”指占自然相关蛋白质和自然产生有机分子的重量百分比至少为60％的抗体。合适地，抗体，例如GPR30特异抗体的重量百分比至少为75％，更合适地为90％，最合适地至少为99％。使用重组制备的蛋白质或保守模体多肽和标准技术，通过亲和色谱法可以获得纯化抗体。
“纯化的”或”分离的”指一种核酸，多肽，或其它分子，其已经从自然伴随的成分中分离出。典型地，一种充分纯化的多肽占自然相关蛋白质和自然产生有机分子的重量百分比至少为60％，70％，80％，90％95％，或99％。例如，充分纯化的多肽可以通过从自然材料中提取获得，或通过细胞中的重组核酸表达，或通过化学合成获得。
分离核酸不含某些基因或序列，其为有机体自然产生的基因组。例如，”分离的DNA或RNA”包括，例如，cDNA，克隆基因组DNA，合成DNA，和siRNA结构。
“有效剂量”指单独或联合使用一种组合物，产生期望的临床治疗效果所需的有效数量。例如，对于癌症治疗，这只描述的抑制剂的有效剂量可减少或防止哺乳动物中肿瘤的生长或侵染。活性化合物的有效剂量根据治疗途径，年龄，体重，和主体的健康情况而变化。最终，医生或兽医将决定合适的剂量和给药方案。
术语”病人”或”主体”包括人类和非-人类的动物。非人来的动物包括，但不局限于，鸟类和哺乳动物，特别是小鼠，大鼠，兔子，猫，狗，猪，绵羊，山羊，牛，和马。
这里使用的术语”药物可接受稀释剂，载体和/或分散剂”包括用于制备药物组合物的物质，并且根据本发明，可以与药物共同给药，并且保持其相同的期望效果。其通常为安全的，非-毒性的，并且不具有非期望的生物学或其它特征。药物可接受稀释剂，载体，和/或分散剂的实施例包括溶液，溶剂，分散介质，缓释剂，乳化剂，和类似物。稀释剂，载体，和/或分散剂可以包括少量的添加物，如增强等渗性和化学稳定性的物质。
以单数或复数形式使用的”多聚核苷酸”(例如，”GH”，”hGH”，”hPRL”，或”hPL”，其可以用于论述一种多聚核苷酸)，通常指任何核酸序列，例如，任何多具核糖核酸或多具脱氧核糖核酸，其可以为非修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。非限制性地，其包括单链和双链DNA，包括单链和双链区域的DNA，单链和双链RNA，和包括单链和双链区域的RNA，单链或双链或包括单链和双链区域的DNA和RNA杂交分子。也包括含有RNA或DNA或兼含RNA和DNA的三链区域。特别包括mRNAs，cDNAs，和基因组DNAs，和任何片断，和其修饰物。术语包括含有一种或多种修饰碱基的DNAs和RNAs，如氚化碱基，或非常规碱基，如次黄嘌呤核苷。本发明的多聚核苷酸可以包括编码或非编码序列，或正义或反义序列，或iRNAs如siRNAs。应当理解每个”多聚核苷酸”或类似术语的的引述将包括全场序列以及任何片断，或其修饰物。
这里使用的”多肽”(例如，”GH”，”hGH”，”hPRL”，或”hPL”其可以用于描述一种多肽)，指一种寡肽，肽，或蛋白质，或其片断，以及自然产生的，重组，合成或半合成分子。这里叙述的”多肽”指自然产生的蛋白质分子的氨基酸序列，”多肽”和类似术语，并不限定于全长分子的完全的，自然氨基酸序列。应当理解”多肽”或类似术语的每次引述，将包括全长序列，以及任何片断或其修饰物。
“序列号”可以指每种单独序列的标示符，或任何联合的，或所有这些序列的标示符。
术语”充分纯化的”或”分离的”指从细胞，重组，合成，或半合成环境中分离的核酸或氨基酸序列，其相对于环境相关的其它成分的纯度至少为60％，合适地为75％，最合适地为90％或至少99％。”分离的”多聚核苷酸和抗体已经从其自然环境相关的污染分子中被鉴定和分离出。相应的，应当理解分离的多聚核苷酸和抗体的形式与其自然形式不同。更合适地，”分离”并不充分反映纯化序列的精确的范围(例如，特定的百分数)。
“治疗”和类似术语指预防，治疗，或改善医学失调(例如，医学疾病，状况，或综合症)，或减少这些失调的至少一种综合症的方法和组合物。特别地，包括预防或延缓医疗疾病的发生的方法和组合物；治愈，改良，减少，延缓，或改善疾病的物理或发展效应；及/或预防，终止，或改善疾病导致的疼痛或痛苦。术语”治疗”将以其最广泛的范畴被理解。该术语并不意指主体经治疗而完全康复。相应的，这里广泛使用的”治疗”包括抑制，减少或预防细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动；改善细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动导致的症状或强度；或在示范性的癌症中，特别是乳腺癌，直肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，子宫内膜异位中，预防或减少发生细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动的危险性。
这里使用的多肽”变体”，指一个或多个氨基酸发生改变的氨基酸序列。相似的，变体抗体中一个或多个氨基酸发生改变。变体多聚核苷酸中一个或多个核苷酸发生改变。变体可能发生”保守的”改变，其中替换的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如，将亮氨酸替换为异亮氨酸。更少见的，变体可以造成”非保守”改变，例如，将甘氨酸替换为色氨酸。类似的微笑改变也可以包括氨基酸删除或插入，或兼包括。可以使用领域中已知的计算机程序获得指导，例如，LASERGENE软件(DNASTAR)以决定哪个氨基酸残基可被替换，插入，或删除而不影响生物学或免疫活性。
本发明也包括至少保留一种生物学活性(例如，对细胞增殖，细胞存活，或细胞运动的效应)或免疫学功能的变体。变体的序列与所描述的序列间的一致性至少为80％，更合适地至少为90％。更合适地，变体的序列与所描述的序列间的一致性至少为95％，至少为97％，至少为98％，至少为99％。如下所述，通过将两种序列进行阵列比较，测定阵列部分一致残基的数量，除以发明(比较)序列中残基的总数，并乘以100，获得百分比一致性。有用的阵列程序为AlignX(Vector NTI)。
除非另有说明，在本发明的实践中将使用常规分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，和生物化学技术，其包含于本领域的技术中。这些技术在文献中详细描述，例如，分子克隆：实验室手册，第2版，Sambrook等，1989；以及分子克隆：实验室手册，第3版，Sambrook等，2000；寡核苷酸合成，MY Gait，ed.，1984；动物细胞培养，R.I.Freshney，ed.，1987；酶学方法，学院出版社，Inc.；实验免疫学手册，第4版，D.M.Weir和CC.Blackwell，eds.，Blackwell Science Inc.，19887；哺乳动物细胞基因转移载体，JAM.Miller和MAP.Calos，eds1987；目前的分子生物学方法，FEM.Ausubel等，eds.，1987；和PCR：聚合酶链反应，Mullis等，eds.，1994。
生长激素和相关激素
人类中，hGH基因是包括5种结构和功能相关基因的基因簇中的一部分。垂体特异hGH-N基因和四种结构和功能相关基因(仅在胎盘中表达的hGH-V，hCS-A，hCS-B，和hCS-L)。其以5’至3’方向：hGH-N；N＝正常(也称为hGH1)，hCS-L；L为类似(也称为hPL-1)，hCS-A(也称为hPL-2)，hGH-V；V＝变体(也称为hGH2)和hCS-B(也称为hPL-3)。5个hGH-hCS基因成簇定位于人类17号染色体q22-24带长臂约50kb的DNA片段上。这些基因被6-13kb的基因间区域分离，其含有29个散布的Alu型中等重复序列元素。基因簇由祖先基因进化而来，该过程开始于3.5×108年前。制备本发明的位点形式将包括重复，插入假定的对照因子，及至少一种基因替换过程。人类中，5种基因在其编码和侧翼区域间超过92％的核苷序列具有一致性。其分子结构也一致；四个小基因内区在一致的区域将转录单元进行划分，使所有开放阅读框的密码子共线性更优化。
通过最初转录产物的不同拼接产生两种hGH-N亚型(22kDa和20kDa hGH)的信使RNAs。22kDa hGH-N是主要形式，包括了90％hGH-N垂体mRNA。20kDa hGH-N除了删除了32-46位氨基酸残基外，与22kDahGH相一致。胎盘表达的hGH-V基因中也可产生22kDa hGH-V异构物。未测定到20kDa hGH-V异构物，但具有一种mRNA，其保留第4基因内区内并延伸20密码子至第5基因外区，并可以翻译为26kDa膜结合hGH-V异构体。已经描述了多种其它物种的GH核苷和氨基酸序列。人类GH与hPL的序列一致性(87％)高于猪GH(73％)，牛GH，绵羊GH，马GH和大鼠GH(每种约为65％)，或PRL家族(大约为27％)。只有灵长类GHs与hGH受体结合。特定条件下hGH也可以结合并激活PRL受体。
hGH作为一种激素原被合成，其在氨基末端具有信号肽，在细胞分泌时将被去除hGH-N的成熟的22kDa异构体为一种191氨基酸多肽，在血清中是最丰富的hGH异构体。人类hGH的半衰期大约为25分钟。已经测定了哺乳动物GH的三维结构。其含有4个alpha螺旋，每个长度为21-30氨基酸。螺旋以左手方向环绕，并具有一种非常规的上-上-下-下拓扑结构。对于GH唯一拓扑方向，其在两组平行螺旋组间具有长连接环结构，并在螺旋2和螺旋3之间具有短环状区域。hGH在Cys35-Cys165和Cys182-Cys189上具有两个二硫键。Cys残基是环状结构中的成分。GH分子的中心区域包括约20个疏水性氨基酸，更小氨基酸的疏水簇将保持4螺旋串的稳定。
hGH-N基因的0.5kb近端启动子包括许多调节DNA元素，其与转录和hGH-N的组织特异表达相关。TATA盒之外，近端hGH-N基因启动子包括两个假定的垂体-特异转录因子结合位点，表达hGH所需的Pit-1(也称为GHF-1)。然而，hGH-N转录促使位点下游15kb的序列对于hGH-N基因的有效表达也是必需的。近端hGH-N基因启动子也包括cis-活性元素，调节激素信号应答的转录。
GH受体(GHR)包括两个区域(氨基酸1-123和氨基酸128-238)，其以多肽链上的四个残基(124-127)相连。每个区域含有7个beta-链，形成两个反向平行的beta-片层三明治结构。GH受体在Cys38-Cys48，Cys83-94，Cys108-122间也包括三个二硫键。Arg43和Glu169间的氢键及Arg39和Asp123间的盐桥也可以稳定受体。从氨基酸序列推断的GH分子量为70kDa。糖基化和泛素化等翻译后修饰可以使受体分子量达到100-130kDa。GH受体含有5个N-交联的糖基化位点，每一个使受体的分子量增加约10kDa。GH受体具有19个潜在的泛素化位点，在多个赖氨酸残基上进行多泛素化。通过配基结合增加受体的泛素化，而其是GH受体内源化所必需的。
在许多有机系统中均观察到GH受体的表达，包括胃肠道，雄性和雌性生殖系统，骨骼肌系统，心肺系统，造血系统和免疫系统，中枢神经系统，珠被，肾和泌尿系统，和内分泌系统。这些系统中GH受体在分化和非-分化细胞中均表达。GH受体在来源于胚胎发育的外胚层，中胚层，和内胚层的细胞中均表达。人类中的GHBP是由膜结合GH受体经金属蛋白酶家族成员的限制性蛋白水解产生的。高至60％循环GH与GHBP结合。GHBP通过降低清楚速度和随后的降解，增加GH在血清中的半衰期。在大鼠，小鼠，和猴子中，GHBP由GH受体前体mRNA的选择性拼接产生。在人类中描述了一些GH受体的小型膜-结合异构体。
一种hGH分子与两个受体的细胞外区域相互作用，导致受体的同型二聚体化。hGH具有两个受体结合位点；一个高亲和位点”位点1”和一个低亲和位点”位点2”，其先后与两个分离的受体分子上的结合”袋”相互作用。位点2与hGH的接触，以及受体的两个细胞外区域间约
Figure GPA00001010977500271
的二聚作用，增加第二个受体与复合物的结合稳定性。GH受体中，双-配基结合位点主要由相同的氨基酸残基构成，并包括相似的形状和结构。形成GHBP位点1和2的氨基酸残基位于残基43和218之间的6个成串区域。受体二聚化的结果可能提供了生产生物学应答的信号。为研制有效的GH受体拮抗剂，已经制备了hGH位点2突变体。
PRL是一种包括199个氨基酸，具有四个反-平行alpha螺旋和三个二硫环的23-kDa蛋白质。环的位置是保守的，但其初始结构在不同物种中是不同的。翻译后修饰，如糖基化，磷酸化，切割和聚合，将生成分子异构体(Sinha，Y.N.(1995)Structuralvariants of prolaction：occurrence and physiological significance，Endocr.Rev.16，354-369)。人类RPL(hPRL)在Asp31具有N-糖基化，具有不同比例的糖基化和非糖基化形式。糖基化PRL具有更低的PRL受体结合亲和力，并减少一些生物学活性，而磷酸化PRL与受体良好结合，但可能作为一种拮抗剂(Xu，X.等(2001)A molecular mimic of phosphorylated prolactin markedlyreduced tumor incidence and size when DU145 human prostatecancer cells were grown in nude mice.Cancer Res.61，6098-6104)。
PRL的裂解形式(16K PRL)具有抗-血管生成特性(Struman，I.等.(1999)Opposing actions of intact and N-terminalfragments of the human prolatin/growth hormone family memberson angiogenesis：an efficient mechanism for the regulation ofangiogenesis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96，1246-1251)。与IgG的共聚和结合可以形成大分子量物质；高泌乳素血症病人血清中存在”big”PRL(50-60kDa)和macro-PRL(150-170kDa)。其他物种中，hRPL，而非PRL或生长激素(GH)，将与肝素结合(Khurana，S.等.(1999)Heparin binding property of humanprolatin：a novel aspect of prolactin biology.Endocrinology 140，1026-1029)。
PRL在多种垂体外位置合成，包括蜕膜，肌层，乳腺，前列腺，脑和免疫细胞(Ben-Jonathan，N.等(1996)Extrapituitaryprolactin：distribution，regulation，functions and clinical aspects.Endocr.Rev.17，639-669)。可在循环中被摄取和保留是PRL的另一重要特征。摄取可以传送PRL至液体环境，如脑髓液和乳汁中(Ollivier-Bousquet，M.等(1993)Prolactin transit throughmammary epithelial cells and appearance in milk.Endocr.Regul.27.115-124)，而PRL在细胞外基质中的保留可以增加临近的应答细胞的浓度。PRL也位于目标细胞的内部(Rycyzyn，M.A.等.(2000)Role of cyclophilin B in prolactin signal transduction andnuclear retrotranslocation.Mol.Endocrinol.14，1175-1186)，虽然细胞内PRL的实际功能或其循环和再生的潜力仍未知。
对于结构同源性，hGH和hPL多肽间的序列一致性为85％，而hPRL与其他两个激素的相似度约为25％(AM Corbacho等，Journal of Enocrinology，2002，173，219-238)。虽然，hPL显示了相对较低的GHR亲和力(Lowman等，1991)，所有三种人类激素以高亲和力与PRL受体结合(Nicoll等，1986，supra，Goffin等，1996b，supra)。此外，所有三种激素包括190-200氨基酸，而突变蛋白分子量为22-23kDa。通过内部二硫键稳定三维结构，通常由四个反-平行alpha-螺旋构成(参阅Goffin等，1996b，supra，Bole-Feysot C，Goffin V，Edery M，Binart N & Kelly PA1998 Prolactin(PRL)and its receptor.actions，signal transductionpathways and phenotypes observed in PRLreceptor hnockout mice.Endocrine Reviews 19255-268)。此外，PRL和GH受体在结构和功能上与细胞因子受体超家族类型I成员相关(Bazan F 1989A novel family of growth factor receptors：a common bindingdomain in the growth hormone，prolactin，erythropoietin and IL-6receptors，and the p75IL-2 receptor beta-chain.Biochemical andBiophysical Research Communications 164 788-795，Kelly PA，Djiane J，Postel-Vinay MC & Edery M 1991 The prolactin/growthhormone receptor family.Endocrine Reviews 12 235-251，Cosman D 1993 The hematopoietin receptor superfamily.Cytokine595-106)。
这些激素受体是跨膜蛋白，其在细胞外和细胞内区域具有高度保守的序列(AM Corbacho et al.，Journal of Endocrinology，2002，173，219-238；see，also，Murakami M，Narazaki M，Hibi M，Yawata H，Yasukawa K，Hamaguchi M，Taga T & Kishimoto T1991 Critical cytoplasmic region of the interleukin 6 signaltransducer gpl30 is conserved in the cytokine receptor family.PNAS88 11349-11353 1991，Cosman 1993，supra，O′Neal KD & Yu-Lee L-Y 1993 The proline-rich motif(PRM)：a novel featureof the cytokine/hematopoietin  receptor superfamily.Lymphokineand Cytokine Research 12 309-312，Bole-Feysot et al.1998，supra，Waters MJ，Shang CA，Behncken SN，Tarn S-P，Li H，ShenB & Lobie PE 1999 Growth hormone as a cytokine.Clinical andExperimental Pharmacology and Physiology 26760-764)，在配基结合产生的受体二聚体之后，其均可激活JAK/STAT(Janus激酶/信号感受器和转炉激活物)信号转换途径(IhIe JN & Kerr IM1995 Jaks and Stats in signaling by the cytokine receptorsuperfamily.Trends in Genetics 11 69-74，Yu-Lee L-Y 1997Molecular actions of prolactin in the immune system.Proceedingsof the Society for Experimental Biology and Medicine 215 35-52.，Bole-Feysot et al.1998，supra，Waters et al.1999，supra)。
生长激素和癌症
最近，许多出版物已经叙述了人类和动物模型中生长激素与癌症的相关性。虽然转基因小鼠模型清楚地支持GH在癌症中的作用，在人类肿瘤形成中很难获得相应的临床证据，并且富有争议。已知增加循环hGH可以增加IGF-1的表达，而其在多项研究中与恶化危险性相关(C.Laban，S.A.Bustin，PJ.Jenkins，TheGH-IGF-I axis and breast cancer，Trends Endocrinol.Metab.14(2003)28-34；H.M.Khandwala，I.E.McCutcheon，A.Flyvbjerg，K.E.Friend，892 The effects of insulin-like growthfactors on tumourigenesis and neoplastic growth，Endocr.Rev.21(2000)215-244.894)。然而，在绝经前妇女乳腺癌的研究中未发现hGH血清水平的改变(R.R.Love，D.R.Rose，T.S.Surawicz，P.A.Newcomb，Prolactin and growth hormone levels inpremenopausal women with breast cancer and healthy women with astrong family history of breast cancer，Cancer 68(1991)1401-1405)。
此外，最近的研究中，hGH的血清浓度与前列腺癌症的危险性负相关(B.Fuhrman，M.Barba，H.J.Schunemann，T.Hurd，T.Quattrin，R.Cartagena，et al.，Basal growth hormone concentrationsin blood and the risk for prostate cancer：a case-control study，Prostate 64(2005)109-115)。肿瘤产生的IGF-1导致的hGH分泌阴性反馈回路可能致使该负相关(S.Yakar，D.Leroith，P.Brodt，The role of the growth hormone/insulin-like growthfactor axis in tumor growth and progression：lessons from animalmodels，Cytokine Growth Factor Rev.16(2005)407-420；R.R.Love，D.R.Rose，T.S.Surawicz，P.A.Newcomb，Prolactin andgrowth hormone levels in premenopausal women with breast cancerand healthy women with a strong family history of breast cancer，Cancer 68(1991)1401-1405)。
人类PRL功能的全谱和其在肿瘤发生中的作用均未完全了解。在乳腺癌中，施用PRL增加了自发和病毒-诱发的乳腺癌的发生，大小和数量，并且在啮齿类中维持致癌物诱发的肿瘤生长(Nandi，S.et al.(1995)Hormones and mammarycarcinogenesis in mice，rats，and humans：a unifying hypothesis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92，3650-3657)。此外，过量表达编码PRL的基因的转基因小鼠中发生了乳腺癌(Wennbo，H.et al.(1997)Activation of the prolactin receptor but not the growthhormone receptor is important for induction of mammary tumours intransgenic mice.J.Clin.Invest.100，2744-2751)。然而，人类中PRL循环水平和乳腺癌的相关性仍未清楚。
PRL和子宫内膜肿瘤间的关系仍未清楚。子宫内膜异位妇女人群中具有升高水平的血清PRL，但在子宫内膜肿瘤病人中未发现变化(Gregoriou，G.et al.(1999)Evaluation of serum prolactinlevels in patients with endometriosis and infertility.Gynecol.Obstet.Invest.48，48-51)。然而，一种永生人类子宫内膜基质细胞系，N5，表达PRL并且与雌激素和孕酮相关(Brar，A.K.et al.(1999)N5 endometrial stromal cell line：a model system to study decidualprolactin gene expression.In Vitro Cell.Dev.Biol.Anim.35，150-154)。
关于前列腺癌，PRL受体在胎儿，青春期前，和成人前列腺上皮细胞中均表达(Leav，I.et al.(1999)Prolactin receptorexpression in the developing human prostate and in hyperplastic，dysplastic，and neoplastic lesions.Am.J.Pathol.154，863-870)。其在良性前列腺增生中可以被检测到，并且其表达高于发育不良的情况，但低于高度癌扩散情况。在肿瘤细胞系中，PRL受体在LNCaP细胞和PC-3细胞中表达(Peirce，S.K.et al.(2001)Quantification of prolactin receptor mRNA in multiple humantissues and cancer cell lines by real time RT-PCR.J.Endocrinol.171，R1-R443 Leav，I.et al.(1999)Prolactin receptor expressionin the developing human prostate and in hyperplastic，dysplastic，and neoplastic lesions.Am.J.Pathol.154，863-870)。然而，PRL刺激DU145和PC3细胞的增殖，但在LNCaP细胞中无效应(Janssen，T.et al.(1996)In vitro characterization of prolactin-induced effects on proliferation in the neoplastic LNCaP，DU145，and PC3 models of the human prostate.Cancer 77，144-149)。这样，目前需要生长激素和其在人类肿瘤中的作用的相关性的数据和试剂。
与这里描述的发现一致，hGH在多种肿瘤细胞系中高度或适度表达，包括子宫内膜肿瘤细胞系(见实施例)。此外，以全部细胞数量显示，过量表达hGH的子宫内膜肿瘤细胞的生长快于稳定转染空载体的对照细胞。BrdU结合试验显示全部细胞数量的增加是细胞增殖增速的结果。细胞凋亡测定显示自分泌hGH也可以通过正确细胞存活而增加全部细胞数量。此外，细胞增殖和存活的增加可以通过使用针对hGH的抗-hGH抗体有效地逆转。这些抗体抑制自分泌hGH的功能，减少生长速度并抑制细胞增殖和细胞存活(见实施例)。
常规的用于治疗癌症病人的治疗方法包括手术，放射治疗，化疗，和性激素治疗。然而，这些传统治疗对许多癌症病人的情况并无效应。由于不受控制的细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动是癌症的特点，数十年间，肿瘤治疗中最直接和有效的方法已经为通过抑制细胞分化而试图阻止肿瘤细胞的生长。传统化疗药物对于健康细胞和肿瘤细胞均有毒害。此外，肿瘤细胞内在的基因不稳定性导致长期暴露于化疗后出现抗药性克隆。
本发明的抑制剂提供了新型组合物和方法，通过针对细胞生长和增殖相关的特异基因，预防，和/或抑制肿瘤生长。特别的，本发明的抑制剂提供了新型组合物和方法，通过针对人类生长激素，和相关激素，治疗，预防，和/或抑制肿瘤生长。本发明的抗体预计将避免具有影响其他抑制抑制剂的效果，包括减少特异性，缺少长期有效期，及有害的免疫应答。抗体也预计将极大改善化疗药物。特别的，抗体将具有加强的比较稳定，例如，针对多肽药物。此外，hGH抗体与hGH结合，而非受体，因此不能提供刺激信号(例如，激动剂或部分激动剂活性)。发明者已经观测到抗体对自分泌hGH的抑制效应，如针对内分泌hGH。因此，所描述的抑制剂(例如，抗体和多聚核苷酸)可有效治疗分泌自身hGH的肿瘤。由于其并非必须穿刺入肿瘤内部或与细胞表面的受体结合，但可以通过结合肿瘤环境中的可溶性hGH而起作用，因此这些抑制剂更适用于治疗固体肿瘤。抑制剂可以用于其他生产或与GH和相关激素相关的肿瘤，例如，乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，和子宫内膜异位。相似地，siRNA也可以用于减少这些癌症的激素表达，因此也可提供治疗。
因此，这里显示的数据表明hGH促进子宫内膜癌细胞的增殖和存活，通过抗体结合抑制自分泌hGH的功能，可以有效地抑制该增殖和存活。GH和相关激素，特别是hGH和其遍体，hPRL，和hPL，显示了理想的癌症治疗和诊断的新型目标，特别是针对子宫内膜癌或子宫内膜异位，或乳腺癌，结肠癌，肺癌，或前列腺癌。任何抑制这些激素的生物学活性(例如，自分泌活性)的药物均可以用于抑制肿瘤细胞的增殖，存活，和/或运动。这些药物可以包括，例如，化合物(例如，小分子)，拮抗剂，抗体，和iRNAs。相似地，诊断药物(例如，多聚核苷酸和抗体)可用于测定GH和/或相关激素的存在或水平，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，并测定癌变条件，例如，肿瘤发生，发展，或复发。
分离的GH和相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL，可以发现具有不同用途。例如，激素可以用作这里描述的诊断方法或试剂盒的对照。可选的，激素也可以用于制备更多的用于治疗或诊断的抗体。激素也可以用作研究细胞增殖，细胞存活，和细胞运动，和其他细胞机制的对象。
多聚核苷酸和多肽
发明包括针对GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的多肽的使用，包括了SEQ ID NO：1-26中的至少一种，和其片段，和其修饰物。本发明也包括使用这些多肽，以诊断癌症，特别是子宫内膜癌或子宫内膜异位，或乳腺癌，结肠癌，肺癌，或前列腺癌。本发明进一步包括使用多肽以制备抗体，抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动。
这里使用的多肽包括从以下组中选择的一种序列：(a)包括至少一种从SEQ ID NO：1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽；(b)多肽的功能区域包括至少一种从SEQ ID NO：1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物；和(c)多肽包括的特定数量的连续残基来源于SEQ ID NO：1-26或其修饰物。一个特别实施方案，本发明包括一种分离的GH多肽或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL，其包括的氨基酸序列至少为SEQ ID NO：1-26中的一种。所有这里包括的这些序列为本发明使用的多肽。
多肽可以在不同方法中表达和使用，以测定或检测多肽的活性和/或水平。多肽可用于高-通量合成和分离方法，例如，用于商业生产。这些多肽可用于提升抗体，分离相应氨基酸序列，和定量测定氨基酸序列的水平。
本发明包括使用针对GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的多聚核苷酸，包括SEQ ID NO：27-96中的序列，片段，和其修饰物。本发明也包括使用这些多聚核苷酸诊断癌症，特别是乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌或子宫内膜异位。本发明进一步包括使用这些多聚核苷酸抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动。相应的，本发明包括使用这些多聚核苷酸制备表达载体和宿主细胞，并制备翻译多聚核苷酸和iRNAs。
这里使用的多聚核苷酸包括至少一种从以下组中选择的序列：(a)包括的编码序列中至少一条氨基酸序列为SEQ ID NO：1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽；(b)一条编码序列的互补，反向序列，和反向互补序列，其中编码序列中至少一个氨基酸序列为SEQ ID NO：1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽；(c)编码序列中的开放阅读框中至少一条氨基酸序列为SEQ ID NO：1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽(d)一条编码序列的功能区域，其中至少一条氨基酸序列为SEQ ID NO：1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽；(e)包括至少特定数量编码序列连续残基的序列，其中至少一条氨基酸序列为SEQ ID NO：1-26中选择的序列，或片段，或其修饰物的多肽；和(f)包括至少特定数量的SEQ IDNO；27-96中连续核酸的序列，或其修饰物。特别实施方案中，本发明包括一种分离的多聚核苷酸，其包括的编码序列中至少一条氨基酸序列是从SEQ ID NO：1-26组成的组中选择的。另一特别实施方案中，本发明使用一种分离多聚核苷酸，其包括的序列是从从SEQ ID NO：27-96组成的组中选择的。也可以使用多聚核苷酸探针和引物和其修饰物。所有这些多聚核苷酸和寡核苷酸探针和引物在此被包括，作为本发明的多聚核苷酸使用。
分离的多聚核苷酸也可以用于基因组作图，物理作图，克隆相关性更高或更低的物种基因。利用本领域中已知的技术，如狭缝杂交技术或微阵列分析，使用多聚核苷酸设计的探针可以用于测定在其细胞中具有充分同源DNA和RNA序列的任何器官中的基因的存在，并测定其表达模式。使用多聚核苷酸设计的引物可以用于测序和PCR扩增。多聚核苷酸也可以用作为组合物，例如，药物组合物。多聚核苷酸也可以用于提供健康益处。对于这些益处，多聚核苷酸可以作为表达载体或包括表达载体的宿主细胞而存在。
本领域中的技术人员可知，由于遗传密码子的退化，可以制备多种核酸序列，其编码本发明的多肽，具有任何已知和自然发生基因的核酸序列的最小同源性。这样，本发明关注于个可以通过基于可能的编码选择，以选择性重组获得的每一个可能的变体。这些重组产物根据自然发生的氨基酸序列，依据标准三联遗传密码制备，这些变体将被特别叙述。
编码多肽，或其片段，或修饰物的核酸序列，可以在合适的选择条件下与自然发生序列中的核酸序列杂交。然而，适合于制备编码一条多肽，或其片段，或修饰物的核酸序列，其具有充分不同的编码情况。根据宿主中使用的特定密码子的频率，选择密码子以增加多肽在特定原核或真核宿主中多肽表达的速度。其他充分改变核酸序列而不改变编码的氨基酸序列的原因包括制备具有更多期望特征的RNA转录产物，如与自然发生序列制备的转录产物相比，更长的半衰期。
本发明也包括完全通过化学合成，制备多肽，或片段，或其修饰物。制备后，使用领域中已知的试剂，合成序列可以插入任何可用的表达载体和细胞系统。此外，化学合成可以用于在编码多肽的序列中，或任何片段，或其修饰物中引入突变。如Wahl，G.M.and S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152：399-407)和Kimmel，A.R.(1987；Methods Enzymol.152：507-511)所述，在不同条件下，本发明也包括可与权利要求中的核酸序列杂交的多聚核苷酸序列，特别是SEQ ID NO：27-96中显示的序列。
领域中已知和常规运用的DNA测序方法可以用于本发明的任何实施方案实践中。方法中可以使用酶，如DNA聚合酶I Klenow片段，SEQUENASE(U.S.Biochemical Corp，Cleveland，OH)，Taq polymerase(Perkin Elmer)，耐热T7聚合酶(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，或ELONGASE Amplification系统中发现的聚合酶和校正核酸外切酶组合物(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)。合适地，该过程通过机器自动运行，如Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)，Peltier Thermal Cycler(PTC200；MJ Research，Watertown，MA)，ABI Catalyst和373及377DNA测序仪(Perking Elmer)，或Genome Sequencer 20TM(Roche Diagnostics)。
可以使用特别核酸序列并使用多种领域中已知的方法，延伸编码多肽的核酸序列，以测定下游序列如启动子和调节元素。例如，可以运用的一种方法，”限制-位点”PCR，使用广泛的引物在已知位点附近寻找未知的序列(Sarkar，G.(1993)PCR MethodsApplic.2：318-322)。特别的，当存在交联序列引物和已知区域特异引物时，首先扩增基因组DNA。用相同的交联引物和第一种引物内部的其他特异引物对扩增的序列进行第二轮PCR。使用合适的RNA聚合酶对每轮PCR产物转录，并使用反向转录酶测序。
可商业获得的毛细管电泳系统可用于分析测序或PCR产物的大小或验证其核酸序列。特别的，毛细管测序可以使用流行性聚合酶进行电泳分离，四种不同荧光燃料(每种对应一种核苷)，其可被激光激活，并通过电荷耦合器件摄像机测定发射波长。使用合适的软件(例如，GENOTYPER和Sequence NAVIGATOR，Perkin Elmer)可以将输出/光密度转化为电子信号，从上样至计算机分析和电子数据显示的全过程受计算机控制。毛细管电泳特别适合于在特定样品中以有限数量存在的小片DNA。
另一实施方案，编码本发明的多肽的多聚核苷酸或其片段可以用于重组DNA分子，在合适的宿主细胞中直接表达多肽，或片段，或其修饰物。由于遗传密码固有的简并性，其他编码相同或功能相等的氨基酸序列的DNA序列也可以被制备，并且这些序列可以用于克隆和表达该多肽。出于多种原因，本发明的核酸序列可以使用领域中已知的方法改变氨基酸编码序列，包括但不局限于，调整基因产物克隆，加工处理，和/或表达的改变。随机序列重构的DNA，和基因片段重新组装的PCR，和合成寡核苷酸，可以用于构建核酸序列。例如，可以使用定点突变插入新的限制性位点，改变糖基化模式，改变编码优选模式，引入突变，和其他改变。
本发明的另一实施方案中，编码多肽的自然，修饰，或重组核酸序列可以与异种序列连接以编码融合蛋白。例如，可以用此方法编码可被商业获得抗体是别的嵌合序列。构建的融合蛋白在本发明的多肽和异种蛋白序列之间也可以含有裂解位点，从而多肽可以从异种配基上裂解并纯化。
另一实施方案中，使用领域中已知的化学方法，可以合成全部或不分的编码多肽的序列(see Caruthers，M.H.et al.(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223，Horn，T.et al.(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232)。可选的，使用化学方法可以合成氨基酸序列，或其片段。例如，可以使用多种固相技术合成多肽(Roberge，J.Y.et al.(1995)Science 269：202-204；Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)，也可以使用自动合成仪，例如，ABI431A多肽合成仪(PerkinElmer)。可以分别通过化学合成不同的多肽片段并使用化学方法连接以制备全长分子。
全长合成多肽可以通过高效液相分离(e.g.，Creighton，T.(1983)Proteins Structures and Molecular Principles，WHFreeman and Co.，New York，NY)。合成多肽组合物可以通过氨基酸分析或测序验证(例如，Edman降解方法；Creighton，supra)。此外，多肽，或其任何部分的氨基酸序列，可以通过直接合成而改变，并且/或使用化学方法，由其他蛋白，或其任何片段进行合并，以制备修饰分子。
为表达具有生物学活性的多肽，编码多肽或其功能相似物的核酸序列，可以插入至合适的表达载体，例如，含有插入编码序列所需的转录和翻译元件的载体。本领域中的技术人员已知的方法可以用于构建表达载体，其包括编码多肽的序列和合适的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术，和体内遗传重组。这些技术描述见Sambrook，J.et al.(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，NY；also，Sambrook，J.et al.(2000)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，NY；and Ausubel，F.M.et al.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，NY。
多种表达载体/宿主系统可以用于包含和表达编码本发明多肽的序列。包括，但不局限于，微生物，如重组噬菌体，质粒，或粘粒DNA表达载体转染的细菌；酵母表达载体转染的酵母；病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。对于细菌，有用的质粒包括Invitrogen的pET，pRSET，pTreHis2，和pBAD质粒，Novagen的pET和pCDF质粒，和Sigma-Aldrich的DirectorTM质粒。特别的，E.coli可以与表达载体pET一起使用。本发明不受使用的表达载体或宿主细胞的限制。
“控制元件”或”调节序列”是与宿主细胞蛋白相互反应以实现转录和翻译的非-翻译区域(例如，增强子，启动子，5’和3’非翻译区域)。这些元件在其能力和特异性方面具有多样性。依据使用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括构成性的和诱导性的启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导性的启动子，如BLUESCRIPT噬菌体的杂交lacZ启动子(Stratagene，LaJolla，CA)或pSPORT1质粒(LifeTechnologies)和其类似物。杆状病毒多角体蛋白启动子可以用于昆虫细胞。来源于植物细胞(例如，热休克，RUBISCO，和储存蛋白基因)或植物病毒(例如，病毒启动子或引导序列)的启动子或增强子也可以克隆入载体。
在细菌系统中，根据多肽的使用目的可以选择多种表达载体。例如，当需要大量多肽时，可以使用高通量表达融合蛋白并易于纯化的载体。这些载体包括，但不局限于，多功能E.coli克隆和表达载体，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码多肽的序列可以与氨基末端甲硫氨酸和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基序列联合并结合入载体中，以制备一种杂交蛋白；pIN载体(Van Heeke，G.和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264：5503-5509)；和类似物。
pGEX载体(Promega，Madison，WI)也可以用于表达带有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的多肽融合蛋白。通常，这些融合蛋白是可溶的，并可以通过谷胱甘肽-琼脂糖珠吸附，并以谷胱甘肽洗脱，从裂解细胞中纯化。以这些系统制备的蛋白可以设计成包括肝素，凝血酶，或Xa因子蛋白酶裂解位点，从而克隆的多肽可以从GST配基中分离。酵母中，Saccharomyces cerevisias，也可以使用一种包括结构的或诱导启动子，如alpha因子，醇氧化酶，和PGH的载体。参阅Ausubel等(supra)和Grant等(1987)Methods Enzymol。153：516-544。
特定的初始信号也可以用于获得更有效的编码本发明多肽序列的翻译。这些信号包括ATG初始密码子和临近序列。在编码多肽的序列中，其初始密码，和上游序列被插入至合适的表达载体中，而不需要额外的转录或翻译控制喜好。然而，当仅插入编码序列，或其片段时，需要外源性翻译控制信号，包括ATG初始密码子。此外，初始密码子应当在正确的阅读框内，以保证全部插入序列的翻译。外源性翻译元件和初始密码子可以是自然和合成等多种来源的。表达的效率可以通过含有增强子而增强，其适合于使用的特定细胞系统，如文献(Scharf，D.等(1994)Results Probl.Cell Differ.20：125-162)中描述。
此外，可以根据宿主细胞调节插入序列表达或以期望的模式处理表达多肽的能力，对宿主细胞进行选择。序列的修饰包括，但不局限于，乙酰化作用，羧化作用，糖基化，磷酸化，脂化，和酰化。对多肽”前体”形式裂解的翻译后过程也可以用于促进正确的插入，折叠，和/或融合。具有特定细胞机制和翻译后活性特征机制的不同宿主细胞可以从美国菌种保藏中心(ATCC；Bethesda，MD)获得，并选择以保证序列的正确修饰和处理。特定的宿主细胞包括，但不局限于，Rhodotorula，Aureobasidium，Saccharomyces，Sporobolomyces，Pseudomonas，Erwinia andFlavobacterium；或其他生物如Escherichia，Lactobacillus，Bacillus，Streptomyces，和类似物。特别的宿主细胞包括Escherichia coli，其特别适合于本发明的应用，Saccharomyces cerevisiae，Bacillusthuringiensis，Bacillus subtilis，Streptomyces lividans，和类似物。
多种技术可以诱导核酸序列进入体外培养的真核细胞。包括化学方法(Feigner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84：74137417(1987)；Bothwell et al.，Methods for Cloning and Analysisof Eukaryotic Genes，Eds.，Jones and Bartlett Publishers Inc.，Boston，Mass.(1990)，Ausubel et al.，Short Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，New York，NY(1992)；和Farhood，Annal.NY Acad.Sci.，716：2334(1994))，use of protoplasts(Bothwell，supra)or electrical pulses(Vatteroni et al.，Mutn.Res.，291：163169(1993)；Sabelnikov，Prog.Biophys.MoI.Biol.，62：119 152(1994)；Bothwell et al.，supra；和Ausubel et al.，supra)，use of attenuated viruses(Davis et al.，J.Virol.1996，70(6)，3781 3787；Brinster et al.J.Gen.Virol.2002，83(Pt 2)，369381；Moss，Dev.Biol.Stan.，82：5563(1994)；和Bothwell etal.，supra)，as well as physical methods(Fynan et al.，supra；Johnston et al.，Meth.Cell Biol.，43(Pt A)：353 365(1994)；Bothwell et al.，supra；和Ausubel et al.，supra)。
通过阳离子脂质体可以成功地将核酸输送入动物组织中(Watanabe等，Mol.Reprod.Dev.38：268274(1994))，直接注射裸露DNA或RNA入动物肌肉组织(Robinson等，Vacc.，11：957 960(1993)Hoffman et al.，Vacc.12：1529 1533；(1994)；Xiang et al.，Virol.，199：132 140(1994)；Webster et al.，Vacc，12：1495 1498(1994)；Davis et al.，Vacc，12：1503 1509(1994)；Davis et al.，Hum.Molec Gen.，2：1847 1851(1993)；Dalemans et al.Ann NY Acad.Sci.1995，772，255 256.Conry，et al.Cancer Res.1995，55(7)，1397-1400)，及胚胎(Naito et al.，MoI.Reprod.Dev.，39：153 161(1994)；和Burdon et al.，MoI.Reprod.Dev.，33：436442(1992))，肌肉内注射自我重复RNA疫苗(Daviset al.，J.Virol.1996，70(6)，3781 3787；Balasuriya et al.Vaccine2002，20(11 12)，1609 1617)或使用”基因枪”技术皮内注射DNA(Johnston等，supra)。
使用特异针对蛋白的多克隆或单克隆抗体，对本发明的多肽表达进行测定和检测的多种方法在本领域中是已知的。示范例包括免疫吸收方法(ELISA)，放射免疫(RIA)，和荧光激活细胞分选(FACS)。可以以单克隆抗体与多肽上的两个非-干扰表位反应，使用双-位点，基于单克隆的免疫方法，也可以使用竞争结合方法。其他方面描述了另外的方法，如Hampton，R等(1990；Serological Mehods，a laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN)和Maddox，D.E.等(1983；J.Exp.Med.158：1211-1216)。
本领域中的技术人员已知多种标记和结合技术，并可以在不同核酸和氨基酸分析中使用。制备标记的杂交物或PCR探针，以测定多肽相关序列的方法包括寡核苷酸标记，缺口平移，末端-标记或使用标记核苷进行PCR扩增。可选的，编码多肽，或任何片段，或其修饰物的序列，可以克隆入载体以制备mRNA探针。这些在本领域中已知的载体可通过商业获得，并可以通过合适的RNA聚合酶，如T7，T3，或SP6，或标记的核苷，在体外合成RNA探针。这些过程可以通过使用多种商业获得的试剂盒而完成，如Amersham Pharmacia Biotech，Promega，和USBiochemical。可用于测定的合适的报告分子或标记物，包括放射性核素，酶，荧光，化学发光，或显色剂及底物，辅酶，抑制物，磁粉，和类似物。
表达载体或转化了表达载体的宿主细胞可以在适合于表达和从培养基中回收多肽的条件中培养。培养基可以包括体外或体内表达成分。体外表达成分包括兔网织红细胞裂解物，E.coli裂解物，小麦胚提取物，例如，Invitrogen的ExpresswayTM或RiPs系统，iNtRON Biotechnology的GenelatorTM系统，Novagen的EcoProTM或STP3TM系统，Promega的
Figure GPA00001010977500441
Coupled系统，和QIAGEN的EasyXpress系统。根据序列和/或使用的载体，培养基中的多肽可以是分泌的或细胞内的。特定方面，编码噬菌体多肽的表达载体可以设计成包括信号序列，其可分泌多肽至原核或真核细胞膜外。
其他结构可以包括一种可以促进多肽纯化的氨基酸区域。这些区域包括，但不局限于，金属螯合多肽，如组氨酸-色氨酸(例如，6×HIS)模块，其可以通过固定金属纯化，可通过固定免疫球蛋白纯化的蛋白A区域，和在FLAGR延伸/亲和纯化系统中使用的区域(Immunex Corp，Seattle，WA)。可使用的表位标签包括3X-
Figure GPA00001010977500442
，HA，VSV-G，V5，HSV，GST，GFP，MBP，GAL4，和β-牛乳糖。可使用的质粒中包括生物素标记(例如，Promega的PinPointTM质粒)，钙调蛋白结合蛋白(例如，Stratagene的pCAL质粒)，链霉素结合多肽(例如，Stratagene的InterPlayTM质粒)，c-myc或
Figure GPA00001010977500451
标签(例如，Sigma-Aldrich的免疫沉淀质粒)，或组氨酸标签(例如，QIAGEN的QIAExpress质粒)。
表达载体可包括Factor Xa或肠激酶特异的可裂解的连接序列(Invitrogen，San Diego，CA)，以促进纯化。例如，载体在纯化区域和多肽间可以包括一个或多个连接。这些表达载体表达的融合蛋白包括本发明的多肽和带有硫氧还蛋白或肠激酶切割位点的编码6个组氨酸残基的核酸。组氨酸残基促进IMAC纯化(固定金属例子亲和色谱，如Porath，J.等描述(1992)Prot.Exp.Purif.3：263-281)，而肠激酶切割位点提供了从融合蛋白中纯化多肽的方法。Kroll，D.J等描述了含有融合蛋白的载体(1993；DNACell Biol.12：441-453)。
抑制GH和/或相关激素的多聚核苷酸
如此所述，根据本发明的一个实施方案中，多聚核苷酸可以用于抑制GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。这些多聚核苷酸可以是DNA，RNA，单链，或双链。这里所指的本发明使用的多聚核苷酸为”分离”的多聚核苷酸。分离的多聚核苷酸可以通过本领域中已知的技术获得。例如，可以使用Sambrook，J.等描述的重组DNA技术(1989)分子克隆：实验室手册(第2版)，冷泉港实验室出版社，Plainview，NY andSambrook and Russell(2000)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(3rd Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Planinview，NY.相似地，可以使用化学合成，如磷酰胺和固相化学。多聚核苷酸可以根据描述的核酸序列数据，已知的核苷碱基的相互交互关系，已知的同源物序列，和使用的特定的核酸技术进行设计，以下将进行例证。
一个实施方案，干扰RNAs(iRNAs或siRNAs)可以用于抑制GH和/或相关激素的表达，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。iRNA技术中使用的多聚核苷酸与其目标100％互补。然而，可喜的是，该需要对于iRNA保留目标特异性和抑制翻译的能力并非必须。示范性的iRNA分子可以为带有3’二核苷酸悬臂的18至21bp双链RNAs，而更短或更长的分子也可以使用。当iRNA以合适的核酸载体通过体外制备时，其典型地为具有茎-环结构的RNA分子，例如，19个核苷茎部和9核苷环状，并在3’末端具有2-3Us。Cenix提供了设计siRNA的适用算法(Dresden，Germany，via Ambion，TX)。
示范性的siRNA分子可以包括以下序列：
一方面，iRNA包括了以下组中选择的核酸序列：
5′-GAGGGCAGTGCCTTCCCAA-3′(SEQ ID NO：33)
5′-GCCTATATCCCAAAGGAAC-3′(SEQ ID NO：34)
5′-CCTGGTGTACGGCGCCTCT-3′(SEQ ID NO：35)
5′-CTGACAGCAACGTCTATGA-3′(SEQ ID NO：36)
5′-GTATTCATTCCTGCAGAAC-3′(SEQ ID NO：37)
5′-CAGCCTGGTGTACGGCGCC-3′(SEQ ID NO：38)
5′-CGATGACGCACTACTCAAG-3′(SEQ ID NO：39)
合适的方面，iRNA包括以下组中选择的序列：
5′-GAGGGCAGTGCCTTCCCAATTCAAGAGATTGGGAAGGCACTGCCCTC-3′(SEQ ID NO：40)
    |---    正义链  ---|--Loop--|-     反义链     -|
5′-GCCTATATCCCAAAGGAACTTCAAGAGAGTTCCTTTGGGATATAGGC-3′(SEQ ID NO：41)
    |---    正义链  ---|--Loop--|-     反义链     -|
5′-CCTGGTGTACGGCGCCTCTTTCAAGAGAAGAGGCGCCGTACACCAG-3′(SEQ ID NO：42)
    |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
5′-CTGACAGCAACGTCTATGATTCAAGAGATCATAGACGTTGCTGTCAG-3′(SEQ ID NO：43)
    |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
5′-GTATTCATTCCTGCAGAACTTCAAGAGAGTTCTGCAGGAATGAATAC-3′(SEQ ID NO：44)
    |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
5′-CAGCCTGGTGTACGGCGCCTTCAAGAGAGGCGCCGTACACCAGGCTG-3′(SEQ ID NO：45)
    |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
5′-CGATGACGCACTACTCAAGTTCAAGAGACTTGAGTAGTGCGTCATCG-3′(SEQ ID NO：46)
    |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
另一合适的方面，iRNA包括以下组中选择的核酸序列：
5′-XXXXGAGGGCAGTGCCTTCCCAATTCAAGAGATTGGGAAGGCACTGCCCTCXXXX-3′
        |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
    (SEQ ID NO：47)
5′-XXXXGCCTATATCCCAAAGGAACTTCAAGAGAGTTCCTTTGGGATATAGGCXXXX-3′
         |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
(SEQ ID NO：48)
5′-XXXXGCCTGGTGTACGGCGCCTCTTTCAAGAGAAGAGGCGCCGTACACCAGXXXX-3′
        |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
(SEQ ID NO：49)
5′-XXXXGCTGACAGCAACGTCTATGATTCAAGAGATCATAGACGTTGCTGTCAGXXXX-3′
        |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
(SEQ ID NO：50)
5′-XXXXGTATTCATTCCTGCAGAACTTCAAGAGAGTTCTGCAGGAATGAATACXXXX-3′
         |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
(SEQ ID NO：51)
5′-XXXXGCAGCCTGGTGTACGGCGCCTTCAAGAGAGGCGCCGTACACCAGGCTGXXXX-3′
        |---   正义链   ---|--Loop--|-     反义链     -|
(SEQ ID NO：52)
5′-XXXXGCGATGACGCACTACTCAAGTTCAAGAGACTTGAGTAGTGCGTCATCGXXXX-3′
        |---   正义链    ---|--Loop--|-     反义链     -|
(SEQ ID NO：53)
“X”表示任何数量的额外核苷，其存在于有利于克隆和表达iRNA的终止信号和限制性位点。
非-限制性实施例，以下核酸可以用于在设定的载体中克隆和表达本发明使用的iRNAs：
    BamHI                                                         Hind III
5′-ggatccGAGGGCAGTGCCTTCCCAATTCAAGAGATTGGGAAGGCACTGCCCTCTTTTTGGAAaagtcc-3′
          |    正义链        |Loop|          反义链      |  终止子
(SEQ ID NO：54)
    BamHI                                                         Hind III
5′-ggatccGCCTATATCCCAAAGGAACTTCAAGAGAGTTCCTTTGGGATATAGGCTTTTTGGAAaagtcc-3′
          |    正义链        |Loop|          反义链      |  终止子
(SEQ ID NO：55)
    BamHI                                                         Hind III
5′-ggatccGCCTGGTGTACGGCGCCTCTTTCAAGAGAAGAGGCGCCGTACACCAGGCTTTTTTGGAAaagtcc-3′
          |    正义链        |Loop|          反义链      |  终止子
(SEQ ID NO：56)
    BamHI                                                        Hind III
5′-ggatccGCTGACAGCAACGTCTATGATTCAAGAGATCATAGACGTTGCTGTCAGAGTTTTTTGGAAaagtcc-3′
          |    正义链        |Loop|          反义链      |  终止子
(SEQ ID NO：57)
    BamHI                                                        Hind III
5′-ggatccGTATTCATTCCTGCAGAACTTCAGAGAGTTCTGCAGGAATGAATACTTTTTTGGAAaagtcc-3′
          |    正义链        |Loop|          反义链      |  终止子
(SEQ ID NO：58)
    BamHI                                                        Hind III
5′-ggatccGCAGCCTGGTGTACGGCGCCTTCAAGAGAGGCGCCGTACACCAGGCTGTTTTTTGGAAaagtcc-3′
          |    正义链        |Loop|          反义链      |  终止子
(SEQ ID NO：59)
    BamHI                                                        Hind III
5′-ggatccGCGATGACGCACTACTCAAGTTCAAGAGACTTGAGTAGTGCGTCATCGTTTTTTGGAAaagtcc-3′
          |    正义链        |Loop|          反义链      |  终止子
(SEQ ID NO：60)
根据这里的”实施例”章节中描述的技术可以制备iRNA分子。关于怎样制备和设计此类分子的额外信息可见，例如，McManus MT and Sharp PA(2002)Gene silencing in mammals bysmall interfering RNAs.Nature Rev.Genet.3：737747；Dillin A(2003)The specifics of small interfering RNA specificity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(11)：6289-6291；and Tuschl T(2002)Expanding small RNA interference.Nature Biotechnol.20：446-448。
本领域中的技术人员将理解siRNA为短/小干扰RNA，其包括双链RNA，典型地包括21至23碱基对，其可以通过化学合成。比较而言，shRNA指小发卡RNA，也称为基于载体的siRNA，其包括单链RNA，其通过体外或体内表达。典型地，shRNA包括与目标mRNA(正义链)同源的序列，一段”环状”区域和与目标序列互补的序列(反义序列)。ShRNA形成发卡二级结构，该结构通过酶切割，去除发卡，转变为siRNA。这样，这里描述的序列可以用于制备shRNAs，并转变为期望的siRNAs。
本发明的另一实施方案中，使用反义分子。这里使用的术语”反义”将被广泛应用。其指任何可以结合激素转录物的核酸(合适地为RNA，也包括单链DNA)。典型地，反义分子或多聚核苷酸包括15至25核苷，其可以与目标mRNA完全互补。然而，也可以使用更长的反义多聚核苷酸，包括全长序列。同时，保留了目标特异性和抑制表达能力的与目标非完全互补的反义分子也可以被使用。
本发明相关领域的普通技术人员可以根据这里描述的，及提供的序列数据，使用反义分子。关于反义技术的额外信息可见，例如：Kandimalla ER，Manning A，Lathan C，Byrn RA，Agrawal S.Design，biochemical，biophysical and biological properties ofcooperative antisense oligonucleotides；Nucleic Acids Res.1995Sep 11；23(17)：3578-84；Tseng BY，Brown KD.Antisenseoligonucleotide technology in the development of cancertherapeutics；Cancer Gene Ther.1994 Mar；1(1)：65-71；BryschW，Schlingensiepen KH.Design and application of antisenseoligonucleotides in cell culture，in vivo，and as therapeutic agents；Cell MoI Neurobiol.1994 Oct；14(5)：557-68；Han J，Zhu Z，Hsu C，Finley WH.Selection of antisense oligonucleotides on thebasis of genomic frequency of the target sequence；Antisense ResDev.1994 Spring；4(1)：53-65。
根据本发明，DNA酶，单链DNA，核酶，和三链DNA也可以抑制激素。本领域的普通技术人员可以根据这里所描述的，提供的序列数据和目前的方法学，容易地获得核酶，DNA酶，三链，和单链DNA。然而，这些技术的示范性方法学见JosephSambrook和David W.Russell.Molecular Cloning：A LaboratoryManual(third Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.
本发明使用的多聚核苷酸，包括反义链，iRNA，核酶和DNA酶可以通过化学修饰以增加稳定性或防止降解。例如，核酸分子可以包括非自然碱基类似物，修饰糖基，特别是在核糖的2’位点，或改变的磷酸骨架。本发明使用的多聚核苷酸也可以包括定位降解任何与其结合的转录产物的序列。例如，可以包括Rnase H特异性序列。另一实施例是外源引导序列(EGSs)，其可以募集核酶(Rnase P)以降解反义分子结合的转录产物。
通过在转录物，活性基因的完全互补物，mRNAs，或特定细胞的转录物中筛选同源的候选序列，以确保反义多聚核苷酸，iRNAs，核酶，DNA酶，和cDNAs的类似物的特异性。技术人员可以选择合适的算法设计和保证这些多聚核苷酸的特异性。
本发明使用的多聚核苷酸可以为体外制备的核酸分子形式，如，单链DNA，iRNA，反义RNA，或DNA酶。可选的，其可以作为适合于产生合适的核酸的载体形式被使用，例如，反义链分子，iRNA，或核酶。本发明将使用任何领域中已知的载体。例如，使用带有CMV启动子的裸露质粒。病毒载体也是合适的，例如腺-相关病毒(AAV)和慢病毒。以下提供了合适的启动子和病毒载体的合适例子。使用这些病毒载体的优点之一是相对于对组织或肿瘤的定点给药，其可以通过系统性给药。
本发明使用的载体或结构可以包括合适的基因元件，例如领域中已知的启动子，增强子，复制起点，包括诱导性的，构建性的，或组织特异的启动子。特定实施方案中，载体包括的诱导性启动子与编码本发明的核酸的区域连接(例如，反义链或合适的siRNA)，从而通过控制转录诱导物的存在或缺失，对核酸的表达进行控制。另一实施方案中，本发明的核酸分子的侧翼具有在基因组期望位点促进同源重组的区域，从而达到期望核酸的染色体内整合(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342：435-438)。当然，载体也可以位于染色体外。
本发明的另一实施方案中，将使用PNAs。PNAs是多肽-核酸杂交产物，其中磷酸骨架已经被N-(2-乙基)-甘氨酸单元构成的非手性中性骨架替换(见，例如，Eurekah BioscienceCollection.PNA和Oligonulcotide Inhibitors of HumanTelomerase.G.Gavory和S.Balasubramanian，Landes Bioscinece，2003)。碱基A，G，T，C通过亚甲基羰基连接与氨基氮结合(P.E.Nielsen等，Science 1991，254：1497-1500；M.Egholm等，Nature1993.365：566-568)。PNAs高度特异结合互补序列，相对于类似的DNA或RNA具有更高的亲和力(M.Egholm等，supra)。相对于对应的DNA/DNA或DNA/RNA复合物，PNA/DNA或PNA/RNA杂交物也显示了更高的热稳定性(M.Egholm等，supra)。由于非自然性氨基骨架不被核酸酶或蛋白酶识别，PNAs也具有高度化学和生物学稳定性(V.Demidov等，BiochemPharmacol 1994，48：1310-1313)。典型地，PNAs至少为5个碱基长度，并包括末端赖氨酸。PNAs也可以聚乙二醇化以进一步增加其有效期(Nielsen，P.E.等(1993)Anticancer Drug Des.8：53-63)。非限制性例子中，反基因PNAs可以与基因编码DNA链中唯一序列相互补，并设计成可抑制mRNA的合成。
抑制GH和/或相关激素的抗体
本发明包括GH和/或相关激素的抗体，特别是hGH或人类生长激素基因簇编码的激素，多育曲菌素产物或催乳素基因产物，例如，hPRL，或hPL。例如，与激素或其修饰序列的至少一部分结合的抗体。本发明的特定方面，抗体可以用于抑制一种或多种此类激素。应当理解，抗体的片段或修饰物不需要完全与抗体相同。即，片段或修饰产物不需要募集免疫系统细胞至结合激素的体内位点。产生综合抗体是非必需的。本发明涉及领域的普通技术人员知道制备抗体片段的方法。本发明的抗体片段可以包括完整抗体的一部分，通常为抗体的抗原结合或可变区域。作为常规示范例，可以通过将完整抗体蛋白水解制备片段，或通过重组核酸技术直接制备片段。本发明相信这里描述的抗体，抗体片段，或其修饰物，可应用于激素-介导功能的调控。特别的，发明已经显示抗体可以用于抑制激素水平和/或活性，从而可以应用于治疗主体中的多种失调。
应当理解基本的抗体结构单元包括一个四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个”轻”链(约25kDa)和一个”重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括100至110或更多氨基酸构成的可变区域，对应于抗原识别。每条链的碳末端为一个恒定区域，对应于效应功能。人类轻链分类为kappa和lambda轻链。重链分类为mu，delta，gamma，alpha，或epsilon，并且抗体类型为IgM，IgD，IgA，和IgE。轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12或更多氨基酸的”J”区域连接，重链中也包括一个约为10多个氨基酸的”D”区域。参阅，Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W，ea，2nd ed.Raven Press，N..Y.(1989))。每条轻链/重链对的可变区域形成抗体结合位点。
可以根据类型和表位图谱，某些情况下，根据其抑制激素与其受体结合的能力，对本发明的抗体进行特征化。本发明已经定义了可用于制备抑制抗体的激素范围。抑制激素结合或活性的药物已经在方法中应用于治疗这里描述的多种失调。识别GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，但不能抑制受体结合的抗体，也是所期望的。如之后描述，这些抗体可用于测定和纯化这些激素，以及诊断和监控主体中失调的发展情况。这些抗体也可以用于分析激素的翻译后修饰产物，或其他修饰的序列。
抗体的人源化可以用于减少在其他动物中制备的抗体的免疫原性。可以使用领域中已知的激素获得人源化抗体或抗体的人源化。将啮齿类单克隆抗体进行人源化的最常规方法是CDR移植(Reichmann，L.，M.Clark，H.Waldman，and G Winter.1998.Reshaping human antibodies for therapy.Nature 332L323-327；Jones PT，Dear PH，Foote J，Neuberger MS，Winter G 1986.Replacing the complementarity determining regions in a humanantibody with those from a mouse.Nature 321：522-25)和表面重构(Pedersen，J.T.，A.H.Henry，S.J.Searle，B.C.Guild，M.Roguska，and A.R.Rees.1994.Comparison of surface accessibleresidues in human and murine immunoglobulin Fv domains.Implication for humanization of murine antibodies.J.MoI.Biol.235：959-973)。也可以通过表位-指导选择获得人源化抗体(Wang et al，J.Immunological Methods 241：171-184，2000)。Maynard，J，和georgioud的方法，Antibody engineering.Annu RevBiomed Eng 2：339-375。提供了进一步的示范例。
可以根据合理的设计方法和重复优化制备人源化抗体，例如，通过计算机模型化的定点突变框架残基。可以使用噬菌体显示的其他可选的人源化方法。见，例如，Baca，M.，L.G.Presta，S.J.O′Connor，and J.A.Wells.1997.Antibody humanization usingmonovalent phage display.J.Biol.Chem.272：10678-10684；Hoogenboom，H.R.，A.P.de Bruine，S.E.Hufton，R.M.Hoet，J.W.Arends，and R.C.Roovers.1998.Antibody phage displaytechnology and its applications.Immunotechnology.4：1-20；Jespers，L.S.，A.Roberts，S.M.Mahler，G.Winter，and H.R.Hoogenboom.1994.Guiding the selection of human antibodies fromphage display repertoires to a single epitope of an antigen.Biotechnology(NY)12：899-903；Rader，C.and C.F.Barbas，III.1997.Phage display of combinatorial antibody libraries.Curr.Opin.Biotechnol.8：503-508；Rader，C，D.A.Cheresh，and C.F.Barbas，III.1998.A phage display approach for rapid antibodyhumanization：designed combinatorial V gene libraries.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95：8910-8915；Rosok，M.J.，D.E.Yelton，L.J.Harris，J.Bajorath，K.E.Hellstrom，I.Hellstrom，G.A.Cruz，K.Kristensson，H.Lin，W.D.Huse，and S.M.Glaser.1996.Acombinatorial library strategy for the rapid humanization ofanticarcinoma BR96 Fab.J.Biol.Chem.271：22611-22618.
其他方面，可以使用以人类免疫球蛋白位点重构的转基因动物制备人类抗体，例如，XenoMouse品种。这些品种使得可以在动物中制备完全的人类抗体(Mendez，M.J.，L.L.et al.1997.Functional transplant of megabase human immunoglobulin locirecapitulates human antibody response in mice.Nat.Gen.15：146-156)。XenoMouse动物，包括了含有66个人类重链和23Kppa轻链免疫球蛋白基因的酵母人工染色体(YACs)，其中内源性重链和kappa位点通过目标性删除在功能上失活(Mendez等，supra)。小鼠表达人类mu，delta，gamma2，和kappa链和小鼠lambda链，其中人类kappa-小鼠lambda比率为75∶1(Mendez等，supra)。XenoMouse动物已经显示可以产生针对抗原的人类抗体(Green，L.L.，et al.1994.Antigen-specific humanmonoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavyand light chain YACs.Nat.Gen.7：13-21；Mendez et al.，supra)，并可以对T-依赖的抗原如多糖产生应答。一个实施例中，两种或多种具遗传差异的XenoMouse动物组可以用于制备抗体，例如，Xm2a-3品种，以含有重链和轻链基因的双YAC重新构建；及Xm2a-5品种，以两个YAC重构，其中一个含重链而另一个含轻链基(Jakobovits，A.1995.Production of fullyhuman antibodies by transgenic mice.Curr.Opin.Biotechnol.6：561-566；see，also，Russell ND et al.，Production of protectivehuman antipneumococcal antibodies by transgenic mice with humanimmunoglobulin loci.Infect Immun.2000 Apr；68(4)：1820-6)。
本发明相关领域的技术人员将理解术语”双功能抗体”和”三功能抗体”。这些分析以短肽连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，该短肽过于短小以至于无法在同一条链上的两个区域配对。其促进了与一条或多条其他链的互补区域的配对，并促进了带有两种或多种功能性抗原结合位点的二聚或三聚分子的形成。这些抗体分子可以是单特异性或多特异性的(例如，双功能抗体的双特异性)。这些抗体分子可以通过使用本发明相关领域中的标准方法由两种或多种抗体制备。见，例如，Todorovska etal.Design and application of diabodies，triabodies and tetrabodiesfor cancer targeting.J.Immunol.Methods.2001 Feb 1；248(1-2)：47-66；Holliger P，Prospero T，and Winter G，Diabodies：smallbivalent and bispecific antibody fragments，Proc Natl Acad Sci USA，90，6444-6448，1993；and Tomlinson I and Holliger P，Methodsfor generating multivalent and bispecific antibody fragments，Methods Enzymol，326，461-479，2000。
抗体的制备将根据领域中的标准方法进行。例如，可使用Bean描述的多克隆抗体的制备方法(Eric S.Bean(2001)Polyclonal Antibodies.In：Basic Methods in Antibody Productionand Characterization antibodies.Howard，G，and Bethel D.(ed.)，CRC Press，5：21-50，2000)。根据Stewart的方法(Sandy J.Stewart(2001)Monoclonal Antibody Production.In：BasicMethods in Antibody Production and Characterization antibodies.Howard，G.and Bethel D.(ed.)，CRC Press，6：51-68，2000)，或根据单克隆抗体制备技术和应用，Lawrence B Schook eds，Marcel Dekker Inc，New York，1987，可以制备单克隆抗体和对应的杂交瘤。杂交瘤可以使用领域中的标准方法进行亚克隆，生长和维持。例如，其可以在体内培养基中生长和维持，例如DMEM或RPMI-1640。可选的，也可以在选取的动物中以腹水瘤形式进行体内培养。
本发明的抗体可以根据发明相关领域中已知的标准方法从培养上清，腹水，或血清中分离。以下提供了这些技术的一个示范例。然而，在其他示范例中，分离或纯化可以通过一种或多种方法进行，如亲和色谱，例子交换色谱，作用色谱，凝胶亲和色谱，嗜硫凝胶色谱，色谱聚焦，A-蛋白或G-蛋白琼脂糖柱，羟磷灰石柱，洗涤剂提取，电泳，渗压震扰处理，包涵体纯化，硫酸铵沉淀，液体聚合物离心，过滤，和透析。可以使用领域中多种标准技术从转化细胞，或培养基，或转基因动物中获得本发明中的重组抗体。本发明抗体的氨基酸序列可以使用标准方法测定，例如，使用Edman降解和HPLC，或质谱分析(M.W.Hunkapiller，R.M.Hewick，WJ.Dreyer，and L.E.Hood.1983.High-Sequencing with a Gas-Phase Sequenator.MethodsEnzymol.91：399)。
标准方法可以用于鉴定对抗体制备有用的氨基酸序列。可以预测多肽的抗原决定簇片段，例如，通过Abie Pro 3.0：PeptideAntibody Design(hypertext transfer protocol：//world wide web.changbioscience.com/abie/abie.html)。更特别的，抗原决定簇片段可以根据Hopp-Woods scale(Hopp TP，Woods KR.Predictionof protein antigenic determinants from amino acid sequences.ProcNatl Acad Sci USA.1981 Jun；78(6)：3824-8.)和/或Kyte和Doolittle scale(Kyte J，Doolittle RF.A simple method fordisplaying the hydropathic character of a protein.J MoI Biol.1982May 5；157(1)：105-32.)进行预测。特别的计算机算法包括MAPAG(Aguilar RC，Retegui LA，Roguin LP Int J BiomedComput.1994 Nov-Dec；37(3)：225-35)；PEOPLE(Alix AJ：Vaccine.1999 Sep；18(3-4)：311-4)；和HYDRPHIL(E A Mesri等，J Clin Microbiol.1990 June；28(6)：1219-1224)。
这些表位可以是构象特异性的，其可以包括非连续残基，并可以由预测的抗原决定簇序列不同部分构成(例如，以下SEQ IDNO：10-20中的任何部分)，或一个或多个预测抗原决定簇序列的联合(例如，SEQ ID NO：10-20中的一个或多个联合)，或一个或多个全长序列(例如，SEQ ID NO：10-20中的一个或多个)。自然多肽中具有的抗原决定簇序列，其可能包括任何氨基酸或其派生物的组合，并可形成类似3-D结构(例如，表面残基)。
下表1显示了hGH的预测抗原决定簇区域(ADs)。表2显示了hGH的预测构象表位。表3显示了hGH的预测序列表位。表4显示了hPRL的预测抗原决定簇。表5显示了hPRL的预测构象表位。这些表中，小写字母表示该氨基酸与多肽3D结构的形成较少关联(例如，作为抗原决定簇的可能性较小)，而大写字母表示该氨基酸与多肽3D结构的形成关联较大(例如，更有可能作为抗原决定簇)。
表1
  AD No.   预测AD SEQ ID NO：
  1   X_2：PTIPLSRLfQN：12 10
  2   X_33：EAY：35 11
  3   X_40：QKYSFIQAPQASL：52 12
  4   X_56：ESiPTpSNREQaQQKSNIQ：74 13
  5   X_91：GFLRSVfANSLVYGASDSDVYD：112 14
  6   X_126：GRLEDGSPRTGqAFKQTYAkFDaNSHNDD：154 15
  7   X_182：CRSVEGSCG：190 16
表2
Figure GPA00001010977500581
Figure GPA00001010977500582
表3
Figure GPA00001010977500591
应注意hGH NMR coordingats数据库(pdb file id：1HGU)已经忽略氨基酸37，38和39的信息。这些氨基酸位于中心螺旋外，在两个SE之间，其可以包括抗原决定簇X_37：PKE：39，(SEQ ID NO：17)或可以为两个SE中的部分，X_33：EAYIPKE：39(SEQ ID NO：18)和X_37：PKEQKYSFIQAPQASL：52(SEQID NO：19)，或可以与其他两个SE形成一个更大的SE，例如，X_33：EAYIPKEQKYSFIQAPQASL：52(SEQ ID NO：20)(见，下表中，3)。
表4
  AD   预测AD  SEQ IDNO：
  1_A   A_1-LPICPGGaArCQV-13  21
  2_A   A_44-YtHGRgFiTkAiNScHtSSLATPEDKEQ-71  22
  3_A   A_74-QMNQ-77  23
  AD   预测AD   SEQ IDNO：
  4_A   A_103-RGmQeAPEAiLS-114   24
  5_A   A_135-SQvHpETKENEiYPVWSGLPSIQmADEEsR-164   25
  6_A   A 187-KlLKcRIIhNNNC-199   26
表5
Figure GPA00001010977500601
本发明使用的抗体也可以通过标准重组技术制备，见，例如，Siegel(2002)Siegel DL，Recombinant monoclonal antibodytechnology，Transfus Clin Biol，9(l)：15-222002；Welschof，M.，C.Christ，I.Hermes，A.Keller，C.Kleist，and M.Braunagel.2003.Generation and screening of a modular human scFv expressionlibrary from multiple donors.Methods MoI.Biol.207：103-121。发明者认为重组技术是以工业规模制备抗体的优选方法。编码抗体的多聚核苷酸可以依据抗体的氨基酸序列，遗传密码，和其中的简并性，容易地鉴定编码抗体的多聚核苷酸。例如，编码抗体的多聚核苷酸可以从杂交瘤细胞中分离，并使用领域中标准的方法进行特征分析。根据抗体中部分氨基酸序列可以设计一段核酸探针，并用于分离编码抗体重链和；或轻链的基因。可选的，可以通过标准化学合成方法制备多聚核苷酸，例如，使用磷酰胺和固相化学。
应当理解由于本发明也包括这里特指的抗体片段，以及其修饰物，因此编码抗体的核酸也可以适当被修饰。例如，重链和轻链恒定区域的编码区可以由同源的人类区域替换。可选的，CDR(互补决定区域或抗原结合位点)区域也可以被同源的人类beta-片层框架替换。该方法中，抗体的修饰，如人源化抗体可以通过标准重组方法制备。相应的，本发明也包括编码抗体，抗体片段，或其修饰物的多聚核苷酸，相同的结构，以及包括所述结构的宿主细胞。如此所述，根据本发明的多聚核苷酸可以是DNA，RNA，或cDNA，例如，双链或单链，正义链或反义链序列。
应当理解，根据本发明的抗体，或抗体片段，或其修饰物，可以用于常规测定和纯化激素的目的。激素可以是自然或人工来源，如细胞培养物。合适地，激素来源于人类。此外，特定应用中，抗体可以带有化合物标记修饰，以提供检测信号。例如，可以使用酶，荧光试剂，和放射同位素。本发明涉及领域中的普通技术人员可以容易地鉴定这些合适的标记系统。这样，在直接针对激素的抗体治疗应用之外，抗体也可以用于纯化或诊断应用。例如，固定于固相的抗体可以纯化和/或定量样品中的激素水平。这些发明领域涉及的普通技术人员将理解这些所应用的技术。然而，通过举例的方式，亲和色谱使用的抗体，抗体片段，或修饰物可以固定于色谱支持物上。诊断和纯化方法中，抗体的抑制活性是非必需的。
应当理解，ELISA或相似方法可以为直接或间接测定方法，并且本发明的抗体，或抗体片段，或其修饰物，可以作为捕获物或检测抗体使用。应当理解，单一方法中可以包括本发明的一种或多种抗体。例如，当两种抗体不识别激素上的相同抗原决定簇时，一种抗体可以用于捕获抗体，而另一抗体可以作为检测抗体。可选的，本发明的抗体可以与之前鉴定的激素抗体联合使用。本领域中的普通技术人员应当理解，这里所述的ELISA中使用的测定抗体可以与检测标签结合。
将样品中的激素水平与标准品中的检测基线水平进行直接比较，可以获得主体中的诊断或常规监控情况信息。例如，可以测定正常主体(例如，已知不存在如此所述的医学失调的主体)中GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的血清平均水平。这些浓度可以作为基础水平，而超过该水平则显示具有医学失调。合适地，显示失调的水平应当比正常范围具有统计学意义的显著升高。然而，即使未显示统计学意义的显著升高，获得的结果仍可提供主体情况的有价值信息。应当理解激素的正常水平在不同体液和组织中具有差异。相似地，组织中激素的正常水平可能在血清正常水平之外。
应当理解，可以通过将测定的样品中激素水平与其他主体中获得的数据结果进行比较，对主体情况进行诊断和常规测定。与使用多位正常主体获得的标准或基础激素浓度不同，该基础浓度水平可以在单个主体未显示医学失调阶段，或活性医学失调阶段进行测定。当需要对主体情况进行连续监控时，可以应用于发展性和/或间歇性疾病或失调情况。例如，可以在未有失调的阶段测定基础水平，并在评估情况的不同时间阶段进行诊断。这将提供失调发展固有的有价值信息，或有助于评估失调的治疗是否成功。
如此所述，根据本发明制备的抗体可以作为特别的治疗药物使用，例如，预防，减少，或抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动。在一个广泛的实施方案中，本发明提供抑制至少一种激素与一种或多种激素受体相互作用的方法，更广泛的，抑制一种激素与一种结合试剂的相互作用，本剧发明，该方法包括使用抗体，抗体片段，或其修饰物。该方法可以在体内或体外进行。本领域中的普通技术人员将容易地理解测定抗体在预防，减少，或抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动的效果的方法。然而，通过举例方法，也可以使用这里之外描述的方法学，包括”实施例”章节中的一种或多种方法。此外，本发明的抗体可以作为载体使用，例如转运毒素，放射性核素，同位素，基因，或其他治疗分子至细胞或组织，以协助治疗。
抑制GH和/或相关激素的组合物
用于抑制GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL的药物，可以单独使用，或与一种或多种药物可接受稀释剂，载体，和/或赋形剂以组合物形式使用。本发明涉及相关领域的技术人员将容易地了解可在本发明的组合物中使用的多种药物可接受稀释剂，载体，和/或赋形剂。应当理解，这些稀释剂，载体，和/或赋形剂的选择将根据使用药物的自然性，组合物期望的剂量形式，和给药形式而指定。通过举例方法，当以多聚核苷酸给药时，因选择适合于表达反义或iRNA的载体，合适的载体包括等渗溶液，水，水盐溶液，葡萄糖水溶液，和类似物。
标准稀释剂，载体，和/或赋形剂之外，本发明的药物组合物也可以由额外物质制备，或某种模式，只要可以增强药物的活性或有助于保护药物的完整性。例如，组合物可以进一步包括佐剂或组分，在主体治疗中提供降解保护性，或减少药物抗原性。可选的，药物经修饰以针对特定细胞，组织，或肿瘤。
药物可以制备成持续-释放系统。组合物可以包括以有形材料形式存在的半-渗透基质，例如，膜，或微囊。持续-释放基质包括聚交酯(U.S.P.No.3773919；EP 58481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸盐共聚(Sidman等，1983，Biopolymers：22：547-56)，聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)(Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res：15：267)，乙烯醋酸乙烯酯(Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res：15：267)，或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133988)。
本发明的药物也可以制备成脂质体。包括化合物的脂质体可以使用本发明相关领域的已知技术制备。通过举例的方法，见DE3218121，EP52322，EP36676，EP88046，EP143949，EP142641，Japanese Pat.Appln.83-118008，U.S.Pat.Nos.4485045和4544545和EP102324。通常，脂质体为微小(约200至800埃)片状，其中脂脂质mol百分比含量大于30，选择的部分适合于最有效的治疗。本发明使用的药物也可以聚乙二醇化以增加效期。
此外，根据本发明，可以由其他成分制备组合物，其对特定情况下的主体有利。例如，其可以利于组合一种或多种抗-肿瘤药物。这些药物的例子包括：烷基化药物，例如，苯丁酸氮芥(例如，LeukeranTM)，环磷酰胺(例如，EndoxanTM，CycloblastinTM，NeosarTM，环磷酰胺TM)，异环磷酰胺(例如，HoloxanTM，IfexTM，MesnexTM)，三胺硫磷(例如，ThioplexTM，ThiotepaTM)；和抗代谢药物/S-相抑制物，例如，甲氨蝶呤钠(例如，FolexTM，AbitrexateTM，EdertrexateTM)，5-氟尿嘧啶(例如，EfudixTM，EfudexTM)，羟基脲(例如，DroxiaTM，Hydroxyurea，HydreaTM)，安吖啶，吉西他滨(例如，GemzarTM)，dacarbazine，thioguanine(例如，LanvisTM)。
也包括抗代谢/有丝分裂药物，例如，依托泊甙(EtopophosTM，Etoposide，ToposarTM)，长春碱(VelbeTM，VelbanTM)，vindestine(EldesineTM)，长春瑞滨(NavelbineTM)，紫杉醇(TaxolTM)；抗生素-型药物，例如，阿霉素(RubexTM)，博来霉素(BlenoxaneTM)，dactinomycin(CosmegenTM)，柔红霉素(CerubidinTM)，丝裂霉素(MutmycinTM)；激素药物，例如，氨格鲁米特(CytadrenTM)，阿那曲唑(ArimidexTM)，雌二醇氮芥(EstracytTM，EmcytTM)，戈舍瑞林(ZoladexTM)，六甲基三聚氰胺(HexametTM)，来曲唑(FemaraTM)，阿那曲唑(ArimidexTM)，和他莫昔芬(tamoxifen)，(EstroxynTM，GenoxTM，NovaldexTM，SoltamoxTM，TamofenTM)。
进一步包括任何两种或多种抗-肿瘤药物的组合物(例如，阿霉素/5-氟代脲嘧啶/环磷酰胺(FAC)；和环磷酰胺/氨甲蝶呤/50氟代脲嘧啶(CMF))。包括以下至少两种多种多药物的组合物是特别有用的，例如环磷酰胺(CYTOXAN)，甲氨蝶呤(RHEUMATREX)，5-氟代脲嘧啶(ADRUCIL)，多柔比星(ADRIAMYCIN)，环磷酰胺(CYTOXAN)。有助于转移性疾病的药物如卡培他滨(XELODA)，多柔比星(ADRIAMYCIN)，包括其脂质体形式，吉西他滨(GEMZAR)，taxanes，包括太平洋紫杉醇(TAXOL)和多西他赛(TAXOTERE)，长春瑞滨(navelbine)，赫赛汀(HERCEPTIN)。本发明相关领域的普通技术人员将容易地理解其他有利的药物例子。除非另有特别说明，根据可接受药物试验，本发明的药物也可以与其他化合物和药物制备。
应当理解，施用多聚核苷酸时，其可以装载入病毒输送系统，其中病毒系统可以制备成组合物。本发明相关领域的普通技术人员可以理解根据这里描述的发明的自然性，可以具有多种合适的病毒载体。然而，通过举例方法，可以使用逆转录病毒载体，腺病毒载体，和腺相关病毒载体(AAV)。本发明相关领域的普通技术人员可以了解本发明中应用这些载体的方法。然而，通过举例方法，使用逆转录病毒载体间Miller等，1993。Meth.Enzymol.217：581-599，和Boesen等，1994，biotherapy 6：291-302；腺病毒载体的使用间Kozarsky和Wilson，1993，Current Opinionin Genetics and Development 3：499-503；Rosenfeld等，1991，Science 252：431-434；Rosenfeld等，1992，Cell 68：143-155；Mastrangeli等，1993，J.Clin.Invest.91：225-234；PCT PublicationWO 94/12649；和Wang等，1995，Gene Therapy2：775-783；AAV的应用见Walsh等，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300；U.S.Pantent No.5436146。
根据使用的给药形式，和合适的药物赋形剂，稀释剂和/或载体，本发明的组合物可以制备成常规剂量形式，如溶液，口服液，注射剂，药片，糖衣片，胶囊，药丸，颗粒，栓剂，透皮贴剂，分散剂，乳化剂，持续释放剂型，凝胶，气雾剂，脂质体，粉末和免疫脂质体。剂型的选择将反映期望使用的给药方法，治疗的失调，和药物的自然性。特别合适的剂型包括口服药片，凝胶，药丸，胶囊，半固体，粉末，持续释放形式，悬浮剂，西也剂，气雾剂，药膏，或局部给药溶液，和注射剂。技术人员将容易地识别合适的剂型和制备方法。通常，通过将特定药物和成分相互接触混合制备组合物。随后，如有需要，制备物被制备成期望形状。通过举例方法，特定的制备组合物的方法见Gennaro AR：Remington：The Scinece and Practice of pharmacy，20th ed，Lippincott，Williams&，Wilkins，2000.
根据组合物的类型，单位剂量大小，载体类型，稀释剂和/或赋形剂，和其他领域中普通技术人员已知的因素，本发明组合物中的药物数量可以在较大范围内变动。通常，最终组合物中活性成分的重量可以为0.0001％至100％，合适地为0.001％w至10％w，而剩余成分为任何其他的活性药物和/或载体，稀释剂和/或赋形剂。
治疗方法
本发明的主要研究包括子宫内膜癌细胞，GH和相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，和hPL，并预测也可以应用于小肠，脾，肝脏，胚肝和肾，以及心脏，前列腺，子宫，结肠，胃，皮肤，肺，气管，大脑，小脑，胚脑，脊髓，胎盘，肾上腺，脂肪，软骨，造血和免疫系统，胰腺，和骨骼肌，胸腺，唾腺，甲状腺，脐带，和卵巢。特别的，激素将预期作用于乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，子宫内膜癌，和子宫内膜异位。相应的，发明者希望抑制一种或多种激素，以治疗多种以改变细胞增殖，细胞存活，或细胞运动为特征的失调。
一个实施方案中，本发明涉及通过抑制GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL，预防，减少，或抑制细胞增殖，细胞存活，或细胞运动的方法。合适地，方法用于治疗以主体中异常细胞为特征的失调。该异常细胞增殖，细胞存活，或细胞运动可以在主体中的一种或多种细胞类型中发生，并可以包括转移性失调。特定的失调包括，例如，癌症(例如乳腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，或子宫内膜癌)和子宫内膜异位。失调的例子包括癌症，如腺癌，白血病，淋巴癌，黑色素瘤，骨髓瘤，肉瘤，畸胎癌，和肾上腺，膀胱，骨骼，大脑，乳腺，宫颈，胆囊，神经中枢，胃肠道，心脏，肾脏，肝脏，肺，骨髓，肌肉，卵巢，胰腺，副甲状腺，阴茎，前列腺，唾腺，皮肤，脾，睾丸，胸腺，甲状腺，和子宫肿瘤。多种实施方案中，失调是乳腺，结肠，肺，前列腺，胰腺，胃，子宫内膜，或卵巢的上皮肿瘤，或鳞状细胞癌，或黑色素瘤，或肾癌或肿瘤。
关于乳腺癌，其可以包括上皮肿瘤(例如，来源于细胞衬管或小叶)或非上皮性肿瘤(例如，来源于支持基质)，如血管肉瘤，初级间质肉瘤，和叶状肿瘤。乳腺癌也可以包括癌，例如，原位癌，以及侵袭性癌。原位癌中的癌细胞只在管道和小叶中增殖，而不侵染间质组织。原位小叶癌(LCIS)包括非触及病变，其可以显示增高的在任一乳腺中发生随后的侵染性癌症的危险性。乳腺癌中，侵染性通常包括腺癌，主要包括渗透导管型癌，其余包括渗透小叶型癌。乳腺癌的较少形式包括脊髓，粘液，和管癌。乳腺癌失调也包括乳头Paget’s疾病，和转移性乳腺癌。
结肠癌中，通常包括结肠，直肠，和/或肛门癌症，特别是腺癌，和癌(例如，鳞状肛原癌)，黑色素瘤，淋巴瘤，和肉瘤。表皮(非角化型鳞状细胞或基底细胞癌)癌。结肠癌可以与特定类型的息肉或其他损害相关，例如，管状腺瘤，管状腺瘤(例如，管状息肉)，绒毛(例如，乳头状)腺瘤(带有或不带有腺癌)，增生性息肉，错构瘤，幼年性息肉，息肉样癌，pseudopolyps，脂肪瘤，或平滑肌瘤。癌症可以与家族性平滑肌瘤相关，并涉及Gardner综合症或Peutz-Jeghers综合症等症状相关。癌症可以涉及，例如，慢性瘘，辐射肛门皮肤，白斑，性病淋巴肉芽肿，Bowen疾病(上皮癌)，尖锐湿疣，或人类乳头瘤病毒。其他方面，癌症可以涉及基底细胞瘤，乳房外Paget疾病，cloacogeniccarcinoma，或恶性黑色素瘤。
关于子宫内膜癌，其可以包括腺癌和浆液性乳头状，透明细胞，鳞状，和粘液性癌。也可以包括癌前情况如子宫内膜增生。子宫内膜癌可以与一种或多种肥大，多囊卵巢综合征，nulliparity，绝经后期，雌激素产生肿瘤，无排卵(排卵功能障碍)，和无孕酮和遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)症的雌激素疗法。
本发明涉及的领域中的普通技术人员可以容易地理解，本发明应用的失调类型，与这里提供的激素相关。此外，本发明涉及的领域中的普通技术人员可以容易地理解，考虑到这里报告的发明和结果的自然性，本发明应用于多种不同主体。相应的，诊断和治疗可以应用于任何期望的主体，特别的，本发明应用于哺乳动物，更特别的为人类。
本发明涉及的领域中的普通技术人员可以容易地理解多种抑制GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL的方法和药物。以示范的方法，包括iRNA，反义链，和三螺旋DNA等核酸技术可以用于抑制表达。可选的，直接针对激素的抗体或这些抗体的功能修饰物可以使用。以下详细描述了示范性药物。这些发明中使用的药物将合适地抑制一种或多种以下特征：1)防止，减少或抑制细胞增殖的能力；2)防止，减少或抑制细胞存活的能力；3)防止，减少或抑制细胞运动的能力；3)防止，减少或抑制激素表达或激活的能力；4)防止，减少或控制肿瘤转移的能力。优选地，合适的药物将抑制一种或多种这些特征。
如此所述，GH为一种在特定肿瘤细胞，也在至少一种亚型的正常成年细胞中表达的细胞因子。因此，GH和相关激素，特别是hGH和其变体，hPRL，和hPL，可以被认为是肿瘤相关抗原。根据正常和肿瘤细胞中的不同表达和通路，一些方法已经用于定位这些激素(参阅Paul，Fundamental Immunology，1999，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，PA，Chapter 37)。肿瘤细胞倾向于高水平表达这些激素，正常细胞和肿瘤细胞间的表达差异可以具有治疗性应用(见Brown JP，等，Quantitativeanalysis of melanoma-associated antigen p97 in normal andneoplastic tissues.Proc Natl Acad Sci USA 1981；78：539-543)。由于相对于正常细胞，肿瘤细胞是更易接近的激素-特异效应细胞，从而对其进行定位。例如，肿瘤细胞表达的抗原由于非完全性的糖基化，更易于结合(例如，上皮粘蛋白中的情况)。对于肿瘤细胞，增强表达的MHC分子可以使肿瘤细胞称为T细胞的直接标靶(见，例如，Uyttenhove C，et al.The expression of mousegene PlA in testis does not prevent safe induction of cytolytic Tcells against a Pl A-encoded tumor antigen.Int J Cancer 1997；70：349-356)。
包括先天性或获得性免疫的多种免疫治疗策略可以用于控制GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL相关的癌症，包括(a)或细菌疫苗的定位使用，例如，BCG；(b)使用细胞因子；(c)针对一种或多种激素的激活免疫；(d)针对一种或多种激素的抗体的被动治疗；和(e)效应细胞的继转移(例如，T细胞)。针对至少一种激素的激活免疫可以用于诱导免疫应答或，以针对GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的鼠单克隆抗体引发的被动免疫。常规参考见，例如，Riethmuller G，et al.，Monoclonal antibody therapy forresected Dukes′C colorectal cancer：seven-year outcome of amulticenter randomized trial.J Clin Oncol 1998；16：1788-1794；
Figure GPA00001010977500701
G，et al.，Randomized trial of monoclonalantibody for adjuvant therapy of resected Dukes′C colorectalcarcinoma.Germ an Cancer Aid 17-1A Study Group.Lancet 1994；343：1177-1183；Herlyn DM，et al.，Inhibition of growth ofcolorectal carcinoma in nude mice by monoclonal antibody.CancerRes 1980；40：717-721。
在免疫反应中，纯化的抗原通常对于诱导需要的(例如，抗原特异的)免疫应答是无效的，除非使用特定佐剂刺激自然免疫。因此，在疫苗接种时设计了多种方法使用化学和/或细菌药物以刺激自然免疫。疫苗中使用的合成多肽可以设计为特定的MHC单模标本(见Toes RE et al.Peptide vaccination can lead to enhancedtumor growth through specific T-cell tolerance induction.ProcNatl Acad Sci USA 1996；93：7855-7860)。抗原性多肽可以定位于热休克蛋白上(或重组的类病毒颗粒)以增加免疫效果。通常，免疫应答的有效诱导需要抗原在提供合适帮助和第二信号的环境下表达。
一些试验设计使用树突状细胞和病毒特异或肿瘤相关多肽以诱导肿瘤相关T细胞，并阻止转移的肿瘤细胞。树突状细胞可以加载合成抗原多肽或重组蛋白。树突状细胞也可以加载一种或多种：从肿瘤细胞表面剥离的自然多肽；肿瘤来源的，多肽装载的热休克蛋白；肿瘤来源的mRNA；或融合肿瘤细胞(见ShurinMR.Dendritic cells presenting tumor antgen.Cancer Immunity1996：43：158-164)。这些策略的一个优点为(唯一)单一的特定肿瘤抗原，以及肿瘤相关抗原可以诱导强大的免疫应答。
进一步的研究，可以使用被动抗体治疗或肿瘤-特异T细胞移植。例如，针对GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的抗体的被动免疫可以防护肿瘤细胞的侵袭并可在肿瘤细胞侵染后作为治疗(见，G，et al.Monoclonalantibody therapy for resected Dukes′C colorectal cancer：seven-year outcome of a multicenter randomized trial.J Clin Oncol 1998；16：1788-1794；G，et al.Randomized trial ofmonoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes′Ccolorectal carcinoma.German Cancer Aid 17-1A Study Group.Lancet 1994；343：1177-1183；Herlyn DM，et al.Inhibition ofgrowth of colorectal carcinoma in nude mice by monoclonalantibody.Cancer Res 1980；40：717-721)。
可选的方法中，抗独特型抗体治疗可以用于诱导肿瘤细胞进入长期休眠状态(见，Miller RA，Maloney DG，Warnke R，Levy R.Treatment of B-cell lymphoma with monoclonal anti-idiotypeantibody.N Engl J Med 1982；306：517-522)。此外，肿瘤细胞抗体也可以用于细胞因子或细胞毒素药物的载体，如放射化学或自然毒素(见，Ghetie V，Vitetta E.Immunotoxins in the therapy ofcancer：from bench to clinic.Pharmacol Ther 1994；63：209-234；Reisfeld RA，Gillies SD.Recombinant antibody fusion proteins forcancer immunotherapy.Curr Top Microbiol Immunol 1996；213：27-53)。重组抗体-细胞因子或抗体-毒素融合蛋白可以用于在肿瘤细胞周围基质中浓缩这些药物。可选的，可以制备双特异性单克隆抗体，结合效应细胞以及肿瘤细胞上的肿瘤抗原。单克隆抗体也可以经人源化以减少病人中中和性抗-鼠类抗体的刺激。进一步的方案中，长期肿瘤中可以使用T细胞移植。病人中分离的T细胞可以用IL-2在体外增殖，并移植入接受IL-2的病人中(见，Smith CA，et al.Adoptive immunotherapy for Epstein-Barr virus-related lymphoma.Leuk Lymphoma 1996；23：213-220)。
药物抑制GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的效果，可以根据本发明的描述和已知方法测定。例如，药物的效果可以通过观测其预防，减少，或抑制激素表达，或激素的一种或多种功能的效果而进行测定。以特别举例的方式，可以研究药物对一种或多种细胞入侵，细胞移植，基因转录水平和激素-应答基因的效应。这些研究可以在体外或体内进行。
这里描述“实施例”之后的的方法可以用于测定药物的适合性。特别的，RT-PCR和Northern blot分析可用于测定mRNA水平的GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL的表达，而Western blotting和直接或间接免疫染色可以用于测定蛋白水平的表达。可以用关于细胞增殖，细胞存活，或细胞运动的基于细胞分析测定激素活性。
可以使用体内方法检测激素抑制转移的效果，例如，参阅Fidler，I.J.(1973)Nat.New Biol.242，148-149；和Price J.E.The biology of cancer metastasis.Prog.Clin.Biol.Res.，354A：237-255，1990，或者Kerbel R.S.What is the optimal rodentmodel for anti-tumor drug testing？Cancer Metastasis Rev.，17：301-304，1998；Killion J.J.，Radinsky R.，Fidler I.J.Orthotopicmodels are necessary to predict therapy of transplantable tumours inmice.Cancer Metastasis Rev.，17：279-284，1998；和Price J.E.Analyzing the metastatic phenotype.J.Cell.Biochem.，56：16-22，1994。
治疗途径/方法
本发明为通过任何可以输送期望的活性物(例如GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL的抑制剂)至主体身体中的目标位置的方法，以本发明的任何抑制药物或组合物进行的治疗。这些药物和组合物可以用于抑制目标位置的细胞增殖，细胞存活，和/或细胞运动。目标位置可以是身体中的任何位置，其具有或易于遭受一种失调，或可以包括一种或多种细胞的，组织的或特定肿瘤。例如，治疗可以包括注射给药途径，系统给药途径，口服和局部给药。可以通过注射，皮下，眶内，眼内，脊柱内，脑池，局部，灌输(使用缓释输送或微型真空泵，如渗透泵或皮肤贴片)，移植，气溶胶，吸入，scarification，腹膜内，心脏内，肌肉内，癌内，鼻内，口服，口腔，透皮，肺部，直肠或阴道输送给药。应当理解，选择的给药途径可以依赖于主体身体中的目标位置，以及使用的药物或组合物的自然性。
特别实施方案中，多聚核苷酸可以通过缺陷或减毒逆转录病毒或其他病毒载体感染而给药(见，U.S.Patent No.4980286)，或通过直接注射裸露DNA，或使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，DuPont)；或以脂质或细胞表面受体或转染药物包裹；脂质体，微粒，或微囊包埋；与已知可以进入细胞核的肽相连；或通过与配基连接诱使受体-介导的胞吞给药(见，例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)，其可以用于定位特异表达受体和类似物的细胞类型。此外，可以制备核酸-配基复合物，其中配基包括一个膜融合病毒多肽以破坏内涵体，使核酸分子免受溶酶体降解。
另一实施方案中，多聚核苷酸可以通过定位特异受体，在体内定位细胞特异摄取和表达，如WO 92/06180 dated April 16，1992(Wu et al.)；WO 92/22635 dated December 23，1992(Wilson et al.)；WO 92/20316 dated November 26，1992(Findeis et al.)；WO 93/14188 dated July 22，1993(Clarke etal.)；和，WO 93/20221 dated October 14，1993(Young)。可选的，多聚核苷酸可以通过同源重组介导入细胞内并整合入宿主细胞DNA而进行表达，如Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8935；Zijlstra等，1989，Nature 342：435-438.根据本发明的目的，可以诱导多聚核苷酸进入的细胞可以包括任何期望的，可行的细胞类型。合适的细胞类型将依赖于治疗的失调的自然性。然而，通过举例的方法，多聚核苷酸可以介导入肿瘤细胞。
应当理解，施用的药物或组合物的剂量，给药时间，和通常的给药方法可以依赖于治疗情况的自然性，主体症状的严重性，治疗的肿瘤大小，治疗的目标位点，选择给药的模式，和年龄，性别和/或主体健康情况而不同。本发明设计领域中的普通技术人员可以根据这些因素容易地理解或可以决定合适的给药方法。应当理解给药可以包括单日剂量或多次不连续剂量给药。本发明也设计联合不同给药模式或途径的给药方法。例如，肿瘤内注射和系统给药结合。
应当理解本发明的方法可以包括额外步骤，例如施用额外的有助于主体情况治疗的药物或组合物。例如，可以使用其他治疗增殖失调的药物(如上述的抗-肿瘤药物)。应当理解这些额外的药物和组合物可以与本发明的药物或组合物同时给药，或以顺序方式给药。例如，额外的药物或组合物可以在本发明的药物和组合物给药之前或之后给药。应当理解在顺序输送药物或组合物时，一施用种药物或组合物后不需要立即进行随后的给药，虽然这将是更合适的。药物或组合物的输送之间可以有时间间隔。时间的间隔将依赖于治疗的治疗的情况和输送和组合物和药物的自然性。然而，以举例的方法，发明者期望的间隔为数小时至数天或数月。
诊断方法和组合物
一个实施方案中，本发明涉及在诊断细胞增殖，细胞存活，或细胞运动相关失调的方法中使用本发明的一种或多种药物。合适的，方法用于诊断以主体中异常的细胞增殖，细胞存活，或细胞运动为特征的失调。异常的细胞增殖，细胞存活，或细胞运动可以发生在主体的一种或多种细胞类型中，并可以包括转移性失调。特异失调包括，例如，肿瘤(乳腺癌，肺癌，结肠癌，前列腺癌，或子宫内膜癌)和子宫内膜异位。失调的实施例包括癌症，如腺癌，白血病，淋巴癌，黑色素瘤，骨髓瘤，肉瘤，畸胎癌，和肾上腺，膀胱，骨骼，大脑，乳腺，子宫颈，胆囊，胃肠道，心脏，肾脏，肝脏，肺，骨髓，肌肉，卵巢，胰腺，副甲状腺，阴茎，前列腺，唾腺，皮肤，脾脏，睾丸，胸腺，甲状腺，和子宫肿瘤。多种实施方案中，失调是乳腺，肺，前列腺，结肠，胰腺，子宫内膜，胃，或卵巢上皮肿瘤，或鳞状细胞癌，或黑色素瘤，或肾癌或肿瘤。这里详细描述了特异的乳腺，结肠，和子宫内膜肿瘤。
根据本发明，特异结合GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL的抗体，可以用于诊断以一种或多种激素表达为特征的情况或失调，或用于监控以激素抑制剂治疗的主体的方法。用于诊断目的的抗体可以用上述治疗学描述的相同方法制备。诊断一种或多种激素的方法包括使用抗体和标签检测人类体液或细胞或组织提取液中的GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL。抗体可以经或不经修饰使用，并可以通过共价或非共价结合一种报告分子进行标记。领域中已知的多种报告分子均可以使用，其中一些在上文描述。
多种方法，包括ELIS，RIA，和FACS，是本领域中已知的，并提供了诊断GH和/或相关激素，特别是hGH和/或其变体，hPRL，或hPL的改变或异常表达的基础。将由正常哺乳动物主体，合适的为人类中提取的体液或细胞提取物，与针对一种或多种激素的抗体在适合于形成复合物的条件下结合，建立正常或标准的激素表达水平。标准复合物形成的数量可通过多种方式定量，但优选光度测定法。对主体，对照，和疾病中的激素表达进行测定，将活检组织样本与标准值比较。以标准和主体值之间的差异建立诊断失调的参数。
本发明的另一实施方案，编码激素的多聚核苷酸可以用于诊断。可使用的多聚核苷酸包括寡核苷酸序列，互补RNA和DNA分子，和PNAs。多聚核苷酸可用于检测和定量活检组织中基因的表达，其中一种或多种激素的表达可以与失调相关。诊断方法可以用于区分至少一种激素的缺失，存在，和过量表达，并监控治疗间隙的激素调节水平。
一方面，可以检测多聚核苷酸序列，包括基因组序列，编码GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的PCR探针杂交，可以用于检定编码激素的核酸序列。探针的特异性为其由高度特异的区域制备，例如，5’调整区域的10个唯一核苷酸，或较少特异区域，例如，3’编码区域，和杂交或扩增压力区(最大，高度，中都，或低度)将决定是否探针只鉴定编码激素，等位基因，或相关序列的自然发生序列。
探针也可以用于测定相关序列，合适地至少包括50％的内源性序列核苷酸。本发明的杂交探针可以是DNA或RNA，来源于SEQ ID NO：27-96的核苷序列，或包括SEQ ID NO：27-96的核苷序列的片段，或来源于自然发生激素基因组序列，包括启动子，增强子元件，和内含子。
制备针对编码GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的DNA的特异杂交贪生的方法，包括将编码激素或修饰序列的核酸序列克隆入载体制备mRNA探针。这些载体是本领域中已知的，可商业获得的，并可通过加入合适的RNA聚合酶和合适的标记核苷酸用于体外合成RNA探针。杂交探针可以用多种报告基团标记，例如，放射标记，入32P或35S，或酶标记，如通过抗生物素蛋白/生物素偶联系统，和类似物，将碱性磷酸酶与探针偶联。
编码激素的多聚核苷酸序列可以用于诊断与激素表达增加或减少相关的失调。编码激素的多聚核苷酸序列可以用于Southern或northern分析；点杂交或其他膜-基础的技术；PCR技术；或试纸，针，ELISA分析；或利用病人活检体液或组织的微阵列分析测定改变的激素表达。这些定性或定量方法在本领域中已知。
特定方面，编码GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的核酸序列可以在测定多种，特别是上述提及的癌症活性或发生方法中使用。编码激素的核酸序列可以通过标准方法标记，并和适合于形成杂交复合物的条件下加入至主体体液或组织样品中。孵育合适的时间后，样本经洗涤，定量信号并与标准值比较。如果活检或提取样本的信号强度明显区别于比较对照样品，核酸序列已经与样本中的核酸序列结合，而样本中编码激素的核酸序列表达水平的改变显示相关失调的存在。这些方法也可以用于评估动物试验，临床试验中特别治疗方法的效果，或监控病人个体的治疗。
为提供诊断与GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL相关的失调的基础，建立了正常或标准表达模式。可以通过将来源于正常主体，动物，或人类的体液或细胞提取物，与编码GH的序列或其片段，在合适于杂交或扩增的条件下结合而完成。正常样品获得的标准值可以与具有失调症状的病人样品值比较。标准和病人值间的差异将用于建立失调的存在。
一旦失调经诊断并开始治疗后，可以重复进行杂交方法以评估病人中的表达水平是否开始接近于正常病人中获得的值。连续方法获得的结果也可以用于显示数天或数月期间的治疗效果。在肿瘤中，个体活检组织中相对高水平的转录可以表明具有发生失调的倾向，或可以提供在实际临床症状出现前测定失调的方法。该类型的确定诊断可以使健康专家更早使用预防措施或积极治疗，从而预防癌症的发生和进一步发展。
由编码GH的序列设计的寡核苷酸的额外诊断应用包括PCR的使用。这些寡聚体可以是化学合成的，酶切制备，或体外制备的。寡聚体合适地包括两种核苷酸序列，一个为正方向(5’至3’)，另一个为反义链(3’至5’)，在鉴定特定基因或情况的优化条件下使用。相同的两个寡聚体，寡聚体的嵌套组，或寡聚体的衰退集合，也可以在检测和/定量密切相关DNA或RNA序列的次严格条件下使用。
用于定量GH和/或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的方法，包括放射标记或生物素标记核苷，对照核酸共扩增，和计算试验结果的标准曲线(Melby，P.C.等(1993)J.Immunol.Methods，159：235-244；Duplaa，C.等(1993)Anal.Biochem.229-236)。ELISA方法可以加速定量测定多样品的速度，其中期望高度寡聚体经多重稀释，吸光度或显色反应可以进行快速定量。
进一步实施方案中，寡核苷酸或来源于任何这里描述的寡核苷酸序列的更长片段可以用于微阵列分析中的目标。微阵列分析可以用于同时监控大量基因的表达水平(以产生转录形式)，并鉴定基因变体，突变和多态现象。该信息可用于测定基因功能，了解失调的基因基础，诊断失调，并研发和监控治疗药物的活性。一个实施方案中，微阵列是根据本领域中的已知方法建立和使用的，如PCT申请WO95/11995(Chee et al.)，Lockhart，D.J.etal.(1996；Nat.Biotech.14：1675-1680)and Schena，M.etal.(1996；Proc.Natl.Acad.Sci.93：10614-10619)。
微阵列合适地由大量唯一的，单链核酸序列组成，通常为合成反义寡核苷酸或cDNA的片段，并固定于固相支持物上。寡核苷酸合适地为6至60核苷酸长度，更合适地为15至30核苷酸长度，最合适地为20至25核苷酸长度。对于特定类型的微阵列，合适地使用7至10核苷酸长度的寡核苷酸。微阵列包括的核苷可以含有已知的5’至3’序列，或可以包括跨越全长序列的序列寡核苷酸；或从序列长度的特定区域选择的唯一的寡核苷酸。
用于微阵列的多聚核苷酸可以为期望基因特异的寡核苷酸，其中序列的至少一个片段是已知的，或其是特定细胞或组织中，或正常，发展，或疾病阶段常见的一种或多种未鉴定的cDNA特异的。特定情况下，应当理解在微阵列中使用寡核苷酸对。配对是经鉴定的，除非一种核苷优先定位于序列中心。配对中的第二个寡核苷酸(与一个错配)将作为对照。寡核苷酸对的数量范围可以为1至1000000。
为制备微阵列中已知序列的寡核苷酸，使用计算机算法从核酸序列的5’开始，更合适地从3’末端开始检测期望的基因。该算法鉴定基因中唯一的指定长度的低聚体，其在合适于杂交的范围内具有GC含量，并缺少可能干扰杂交的预测的二级结构。一方面，使用light-directed化学方法，在设定的基底区域合成低聚体。基底可以是纸，尼龙或任何其他类型的膜，过滤器，芯片，玻璃片，或其他任何合适的固相支持物。
一方面，通过使用化学偶联方法和喷墨装置在基底表面合成寡核苷酸，如PCT应用WO95/251116(Baldeschweiler等)中描述。另一方面，使用抽真空系统，热，UV，机械或化学结合方法，以网格阵列进行点或狭缝杂交(HYBRIDOT装置，LifeTechnologies)可以用于排列和交联cDNA片段或寡核苷酸至基底表面。另一方面，可以通过手工或使用适用的装置，材料和机械制备阵列(包括多通道吸移管管理器或机器装置；Brinkmann，Westbury，NY)，并可以包括3，24，96，384，1536或6144寡核苷酸，或任何其他2至1000000的倍数，可有效用于商业提供的装置。
从生物样本中提取多聚核苷酸，使用微阵列分析样本。生物样本可以从任何体液(例如，血液，尿液，唾液，粘液，胃液等)，培养细胞，活组织，或其他组织中获得。使用从样本中提取的多聚核苷酸制备与微阵列中寡核苷酸互补的核酸序列，以生产探针。如果微阵列由cDNA组成，则反义RNA为合适的探针。因此，一方面，mRNA被用于制备cDNA，存在荧光核苷时，被用于制备片段或寡核苷酸反义RNA探针。这些因表机关的探针与微阵列孵育，使探针序列与微阵列中的cDNA寡核苷酸杂交。另一方面，用于探针的核酸序列可以包括使用限制性酶，PCR技术，和oligolabeling Kit(Amersham Pharmacia Biotech)制备的多聚核苷酸，片段，和互补或反义序列，其在杂交技术领域中是已知的。
调整孵育条件从而使杂交以精确互补模式或不同程度的降低互补模式进行。去除非-杂交探针后，使用扫描器测定荧光的水平和模式。检测扫描图像以测定互补的程度和微阵列上每个寡核苷酸序列的相对丰富度。检测系统可以同时测量所有不同序列的杂交存在缺失和数量情况。该数据可用于高通量相关研究或对样本的序列，突变，变体，或多态性进行功能分析(Heller，R.A.等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：2150-55)。
本发明的另一实施方案中，编码激素的核酸序列可以用于制备杂交探针，其可以用于绘制自然发生的基因组序列。序列可以定位于特定的染色体，染色体的特定区域，或人工染色体结构，如人工染色体(HACs)，酵母人工染色体(YACs)，细菌人工染色体(BACs)，细菌P1结构或单一染色体cDNA文库(cf Price，C.M.(1993)Blood Rev.7：127-134；Trask，B.J.(1991)TrendsGenet.7：149-154)。
原位杂交荧光(Verma等描述的FISH，(1988)HumanChromosomes：A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York，NY)也可以与其他物理的染色体作图技术和基因组作图数据结合。基因组作图数据可以在多种科学杂志或在线Mendelian Inheritance in Man(OMIM)上获得。编码激素的基因在染色体作图上的物理位点，与特定失调或特定失调易患病体质间的相关性，可以有助于划定与该失调相关的DNA区域。本发明的核酸序列可用于测定正常，携带，和患病个体间的基因序列差异。
染色体制备和物理绘图技术的原位杂交，使用建立的染色体标记的链接分析，可以用于扩增基因组绘图。通常另一种不如动物，如小鼠中染色体上的基因位置，可以显示相关性标记，即使特定人类染色体的序号或臂仍未知。通过物理作图，新序列可以用于设计染色体臂，或其部分。这提供了研究者使用定位克隆或其他基因研究技术研究疾病基因的有用信息。一旦通过基因组交联将失调粗略定位与特定基因组区域，例如AT至11q22-23(Gatti，R.A.等(1988)Nature 336：577-580)，任何定位于该区域的序列将被认为是相关或调节基因而被进一步研究。本发明的核酸序列可以用于在正常，携带，患病个体中测定由于迁移，倒置等倒置的染色体定位差异。
本发明的另一实施方案中，GH或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL，或其功能或免疫原性片段或其寡肽，可以在任何药物筛选技术中用于筛选化合物文库。筛选中使用的片段可以游离于溶液中，与固相支持物结合，融合在细胞表面，或位于细胞内。技术和被检测的药物间复合物结合的形成可以被检测。进一步的实施方案中，可以使用竞争药物筛选方法，其中中和抗体与测试的化合物特异竞争与激素的结合。相同的模式，本发明的抗体可以用于检测任何与抗体共享一个或多个抗原结合位点的任何氨基酸序列的存在。
另一个应用的药物筛选技术提供了高通量筛选具有与期望蛋白的合适亲和力的化合物，如WO 84/03564描述。该方法中，其应用于一种或多种技术，在固相基底，如塑料片或其他表面上合成大量不同的试验化合物。检测的化合物与激素，或其片段反应，并洗涤。以领域中已知方法检测结合的GH。纯化的激素也可以直接包埋于板上以用于之后叙述的药物筛选技术。可选的，非-中和抗体可以用于捕获多肽并将其固定于固相支持物上。
额外的实施方案中，编码GH或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的核酸序列，也可以用于任何分子生物学技术，只要新技术依赖于目前已知的核酸序列的特征，包括，但不局限于，三联遗传密码和特定碱基对相互作用。
治疗或诊断试剂盒
本发明的药物和组合物可用于控制或抑制GH或相关激素，特别是hGH或其变体，hPRL，或hPL的试剂盒，以治疗这里定义的失调。另一方面，药物和组合物可用于诊断试剂盒。试剂盒可以包括至少一种装入合适的容器的本发明的药物。药物可以制备成适合于直接适用于主体的形式，如药物或药物组合物。可选的，试剂盒中一个容器内可以包括一种或多种药物，另一容器中可以包括药物稀释剂，载体和/或分散剂；每个容器中的内容物在施用前相互混合。试剂盒也可以在额外的容器中包括额外的药物和组合物，以应特别应用需要。任何适合于储存和/施用药物或组合物的容器均可以在本发明的试剂盒中使用。本领域中的技术人员将理解合适的容器。通过举例方式，这些容器包括小瓶和注射器。这些容器经合适的灭菌和密封。此外，本发明的试剂盒可以包括使用和施用试剂盒中的组合物的装置。以下实施例对本发明进行进一步阐述。
实施例
这里描述的实施例是出于阐述本发明的实施方案的目的。其他实施方案，方法，和分析类型也被分子诊断领域中的普通技术人员了解，不需在此详述。领域范围内的其他实施方案被认为属于本发明的一部分。
实施例1：材料和方法
细胞株和细胞转染
人类子宫内膜癌细胞株，RL95-2和AN3，由American TypeCulture Collection(ATCC)提供。以Dulbecco’s调整的Eagle’s培养基和Ham’s F12培养基(1∶1)，及10mM HEPES和2.0g/L碳酸氢钠，10％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺和0.005mg/ml胰岛素培养RL95-2细胞。以含2mM L-谷氨酰胺的最小必需培养基(Eagle)，和含有1.5g/L碳酸氢钠，10％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.1非必须氨基酸和1.0mM丙酮酸钠的Earle’s BBS培养AN3细胞。两种细胞置于37℃，5％CO2培养箱培养。
通过将含有完整hGH基因的来源于pMT-hGH载体(Palmiter RD，Norstedt G，Gelinas RE，Hammer RE，Brinster RL(1983).Metallothionein-human GH fusion genes stimulategrowth of mice.Science 222：809-14)BamHI片段，克隆入pcDNA3构建pcDNA3-hGH质粒。为制备稳定的细胞系，使用6(Roche Applied Science，USA)，以pcDNA3或pcDNA3-hGH质粒稳定转染RL95-2和AN3细胞。根据之前叙述以800μg/ml G418孵育14天进行合适的转染(Moller C，Hansson A，Enberg B，Lobie PE，Norstedt G(1992).Growth hormone(GH)induction of tyrosine phosphorylation and activation of mitogen-activated protein kinases in cells transfected with rat GH receptorcDNA.J Biol Chem 267：23403-8)。稳定转染pMT-hGH的RL95-2和AN3细胞称为RL95-2-hGH和AN3-hGH，其中转染pcDNA3的田胞为RL95-2-VECTOR和AN3-VECTOR。
通过克隆制备siRNA结构sihGH5和sihGH6。SihGH5结构包括以下目标序列：AAGTATTCATTCCTGCAGAAC(SEQ INNO：97)，直接针对人类生长激素1和人类生长激素2。SihGH6结构包括以下目标序列：AACAGCCTGGTGTACGGCGCC(SEQIN NO：98)，直接针对人类生长激素1。RL95-2细胞使用
Figure GPA00001010977500851
6(Roche Applied Science，USA)稳定转染质粒sihGH5，sihGH6，制备稳定细胞系。根据之前叙述以800μg/ml G418孵育14天进行合适的转染。稳定转染sihGH5的RL95-2细胞称为RL95-2-sihGH5，稳定转染sihGH6的细胞称为RL95-2-sihGH6，仅转染质粒的细胞称为RL95-2-sivector。
细胞总数分析
分别以含有10％FBS或缺少血清(0.2％FBS)培养基，在6孔板上以每孔5*104细胞的密度，三份重复培养细胞。以37℃，5％CO2维持细胞生长。规定天数后，细胞以0.5％胰酶处理，使用流式细胞仪测定细胞数量(Zhu Z，Mukhina S，Zhu T，MertaniHC，Lee KO，Lobie PE  (2005).p44/42MAP kinase-dependentregulation of catalase by autocrine human growth hormone protectshuman mammary carcinoma cells from oxidative stress-inducedapoptosis.Oncogene 24：3774-85)。试验重复三次，每次试验进行至少2次。
5’-溴代-2’-脱氧脲嘧啶整合试验
在DNA合成期间通过测定5’-溴代-2’-脱氧脲嘧啶(BrdU)的整合直接分析有丝分裂(Sawa T，Sasaoka T，Hirai H，Ishihara H，Ishiki M，Wada T等(1999)。Intracellular signallingpathways of okadaic acid leading to mitogenesis in Ratl fibroblastoverexpressing insulin receptors：okadaic acid regulates Shephosphorylation by mechanisms independent of insulin.Cell Signal11：797-803)。稳定细胞经PBS洗涤2次，胰酶消化后以含10％FBS或血清缺失培养基(0.2％FBS)在6孔板中传代培养，以整合5’-溴代-2’-脱氧脲嘧啶(BrdU)。RL95-2和AN3细胞以20μM BrdU脉冲标记45分钟，PBS冲洗2次，以冷4％多聚甲醛固定30分钟。使用BrdU染色试剂盒(VECTASTAINElite ABC Kit，Invitro Tech，NZ)按照制造商说明测定BrdU。随机选取数个细胞总数＞5000的显微区域进行分析，测定BrdU标记指示(合成DNA的细胞百分数)。重复进行3次试验，每次试验平行测定2次。
细胞凋亡检测
通过末端脱氧核酸转移酶生物素-dUTP nick末端标记(TUNEL)试验测定细胞凋亡。6孔板中的亚融合稳定细胞以无血清培养基培养。无血清培养基培养48小时后，细胞以0.5％胰酶处理并以1*PBS冲洗2次。使用试剂盒(APO-BrdUTMTUNEL Assay，Invitrogen，NZ)根据制造商的说明测定TUNEL。以流是细胞仪测定TUNEL阳性细胞数量，并以占细胞总数百分比表示。重复进行3次试验，每次试验平行测定2次。使用Promega试剂盒根据制造商说明进行测定，3/7活性的凋亡指示出现细胞凋亡。
Matrigel中的细胞行为和形态分析
加入稳定细胞系之前，培养板以Matrigel(BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ)于37℃包被30分钟。分析细胞系的行为并用倒置光学显微镜(Olympus IX2-ILL100，Japan)进行24小时数码纪录。
贴壁-非依赖的生长试验
如前所述进行贴壁-非依赖的生长试验，包括悬浮培养(Zhang X，Zhu T，Chen Y，Mertani HC，Lee KO，Lobie PE(2003).Human growth hormone-regulated HOXAl is a humanmammary epithelial oncogene.J Biol Chem 278：7580-90)。合适的细胞(5x105)以单层在75cm2培养瓶中以野生型培养基培养。72小时后，细胞以0.5％胰酶处理，使用流式细胞仪计算细胞数量。对于悬浮培养，细胞(5*103)在覆盖6孔板的Poly-HEMA(Sigma)中生长。特定时间收集细胞并以流式细胞仪计数。对于软琼脂克隆形成，稳定细胞在覆盖琼脂层6孔板中培养(含0.5％琼脂的无血清培养基)。中间层为10％培养基和0.35％琼脂糖，含有5*103细胞。含血清的培养基加入至上层以防止琼脂糖凝胶干燥。板经培养18小时，随后培养物经观察并拍照。对于灶形成，细胞(5*103)以单层在6孔板中以10％FBS培养基培养。细胞培养20天后培养物经观察并拍照。
体外细胞迁移和侵染试验
以BD BioCoat Matrigel invasion chamber，根据制造商说明进行试验，以未覆盖的多孔滤膜(8μm孔径)评估细胞迁移，并以Matrigel覆盖的滤膜测定细胞侵染。对于侵染试验，滤膜以500μl生长因子-还原Matrigel覆盖(1∶5，Matrigel和无血清DMEM-Fμl 12培养基)。试验之前，去除细胞血清至24小时。50ul无血清DMEM-F12中的细胞(5*104)加入至每个滤膜，并在低层加入含有10％FBS的DMEM-F12作为化学引诱.孵育48小时后，滤膜以4％多聚甲醛固定，并以结晶紫染色.以棉签去除滤膜上层细胞。每张滤膜上随机选取8个区域，显微计数侵染至滤膜低层的细胞数(10*放大倍数)。以每张滤膜每个显微区域细胞数的三次平均值表示细胞迁移或侵染值。试验重复三次以鉴定该结果。对于创伤迁移试验，汇合单层的稳定转染细胞系以移液器吸头破碎后，PBS冲洗，于10％FBS培养基培养6天。
ELISA
稳定细胞系在6孔板中生长至汇合。细胞以pH7.4磷酸-缓冲盐(PBS)冲洗，培养基替换为无血清培养基至24小时。评估24小时内每ml无血清培养基中产生和分泌的hGH数量。使用hGH包被ELISA试剂盒(Diagnostic Systems Laboratories Inc.，USA)，根据制造商说明对hGH进行ELISA定量分析。
细胞生存能力
使用前述MTT方法测定测定细胞生存能(van de LoosdrechtAA，Beelen RH，Ossenkoppele GJ，Broekhoven MG，LangenhuijsenMM(1994).A tetrazolium-based colorimetric MTT assay toquantitate human monocyte mediated cytotoxicity against leukemiccells from cell lines and patients with acute myeloid leukemia.JImmunol Methods 174：311-20)。简要的，细胞(1*104)加入至96-微孔板至终体积为200μl，培养基为含10％FBS或血清缺少培养基(0.2％FBS)。细胞于37℃，5％CO2培养一段时间，期间每孔加入20μl MTT试剂(5mg/ml于PBS中)，培养板于37℃额外培养4小时。每孔加入100μl裂解剂(含12N HCL的10％SDS)，测定595nm吸光度。每个试验重复三次，每次至少2个平行重复以保证结果。
hGH-抗血清处理
由National Hormone&Peptide Program(California，USA)购买hGH-抗血清。这些hGH-抗血清为兔源。细胞以不同数量的hGH-抗血清处理。加入相等浓度的正常兔血清(NRS)作为对照。
新产生的hGH多克隆抗体
免疫：以重组人生长激素(～0.5mg/鸡)和Freund’s完全佐剂免疫鸡，免疫程序为第0天初免，第9，29，39天加强(～0.17mg/鸡)。收集免疫之前和之后的鸡蛋。
从卵黄中提取IgY：收集鸡蛋，分离收集卵黄。以4℃进行分离。卵黄经稀释和离心。IgY从上清中沉淀。分离沉淀并以PBS溶解。免疫前和免疫后的鸡IgY经无菌过滤，终浓度为～5mg/ml，纯度等于或大于90％，于4℃储存。
亲和株制备：Affigel-15(Bio-Rad 153-6052)珠是一种琥珀酰亚胺交联基质，含有只有羧基基团，可结合蛋白质中氨基酸的初级氨基。凝珠以冷水冲洗，重悬于结合缓冲液(10mMMOPS，pH7.5)。人类生长激素(抗原)以水溶解并在结合缓冲液中透析过夜。抗原和Affigel-15珠轻柔混合4小时。之后加入pH8.0的1M乙醇胺以促进蛋白结合并搅动1小时。抗原结合珠转移至EconoColumn(Bio-Rad)，并进行系列冲洗。首先，使用结合缓冲液冲洗凝珠，随后用PBS，之后用甘氨酸-HCl pH2.4/150mMNaCl，最后用PBS冲洗。
抗-hGH-IgY纯化：IgY用于制备hGH亲和柱。柱子以PBS冲洗，使用100mM甘氨酸-HCl pH2.4/150mM NaCl洗脱抗-hGH-IgY。洗脱部分立即用pH8.0的1M Tris-HCl中和。抗-hGH-IgY以pH7.4的PBS于4℃透析48小时，并浓缩至等于或高于4mg/ml。
实时PCR和反转录-PCR
根据前述进行总RNA提取和RT-PCR试验(Mertani HC，Zhu T，Goh EL，Lee KO，Morel G，Lobie PE(2001)。Autocrinehuman growth hormone(hGH)regulation of human mammarycarcinoma cell gene expression.Identification of CHOP as amediator of hGH-stimulated human mammary carcinoma cellsurvival.J Biol Chem 276：21464-75)。用于RT-PCR的寡核苷酸引物对序列为：hGH：5′-CCG-ACA-CCC-TCC-AAC-AGG-GA-S′(SEQ ID NO：61)和5′-CCT-TGT-CCA-TGT-CCT-TCC-TG-S′(SEQ ID NO：62)；hGHR：5′-CTC-AAC-TGG-ACT-TTA-CTG-AAC-G-3′(SEQ ID NO：63)和5′-AAT-CTT-TGG-AAC-TGG-AAC-TGG-G-3′(SEQ ID NO：64)；β-Actin：5′-ATG ATA TCG CCG CGC TCG-3′(SEQ ID NO：65)和5′-CGC TCG GTGAGG ATC TTC A-3′(SEQ ID NO：66)。
对于实时PCR，使用qRT-PCR的SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen，CA)，根据制造商说明，将总RNA反转录为cDNA。使用ABI实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)进行分析。使用ABI PRISM(Invitrogen，CA)的SYBRR GreenERTM qPCR SuperMix对基因组中分布的多种基因标记和三个管家基因进行实时PCR分析。表6显示了所有引物的序列信息。
表6：实时PCR引物对
Figure GPA00001010977500911
  基因   引物序列   扩增大小 SEQ IDNO：
  GH1   正向：   CAGGGAGGAAACACAACAGAAA   155bp 81
  反向：   TTAGGAGGTCATAGACGTTGCT 82
  GH受体   正向：   GCTAACTAGCAATGGTGGTACAG   103bp 83
  反向：   GACGTTCAGTAAAGTCCAGTTGA 84
  HOX-A1同源盒   正向：   CGTGAGAAGGAGGGTCTCTTG   147bp 85
  反向：   GTGGGAGGTAGTCAGAGTGTC 86
  CCND1(细胞同期素D1)   正向：反向：   ACGAAGGTCTGGCGCGTGTTCCGCTGGCCATGAACTACCT   323bp 8788
  TP53   正向：   TGCAGCTGTGGGTTGATTCC   396bp 89
  反向：   AAACACGCACCTCAAAGCTGTTC 90
  BCL2   正向：   TCCGCATCAGGAAGGCTAGA   113bp 91
  反向：   AGGACCAGGCCTCCAAGCT 92
  BAD   正向：   CCCAGAGTTTGAGCCGAGTG   249bp 93
  反向：   CCCATCCCTTCGTCGTCCT 94
  BAK1   正向：   GAACAGGAGGCTGAAGGGGT   307bp 95
  反向：   TCAGGCCATGCTGGTAGACG 96
加入5ng总cDNA的试验基因和内源性对照基因至20μl ABIGreenERTM qPCR SuperMix，200nM引物的混合物中。使用384孔板对每个标记进行三次重复试验，使用两步法扩增程序，初始变性为95℃10min，随后以95℃20秒和60℃30秒循环40次。扩增末进行熔解曲线分析，以95℃还原1分钟，55℃重新退火1分钟。每个试验板中使用5倍系列稀释的未处理cDNA制备标准曲线。
使用ABI软件计算每次反应的Ct值。根据等式E＝10(-1/斜率)计算扩增效应(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，Williams PM(1996).Real time quantitative PCR.Genome Res 6：986-94)，所有基因标记在90-104％范围内；熔解曲线分析确诊所有反应中未观察到非特异性扩增或引物二聚体。基于效应(E)计算相对表达，通过一组管家基因，β-肌动蛋白，HPRT，和GAPDH的规范化，以及样品相对于对照的Ct差异值(Δ)(ΔCt目标-对照)，补偿标记间E的潜在差异。相对表达＝2-(Ct，目标-Ct，HKG) -(Ct，对照-Ct，HKG)；相对表达＝2-ddCt
统计
所有数据以三次重复平均值±SD表示。所有试验至少重复2次。使用双尾t检验或ANOVA分析数据。
实施例2：结果
子宫内膜细胞中hGH的过表达增加了细胞总数
前述的hGH的自分泌显示其可影响细胞功能并在乳腺癌细胞模型中增加致癌性(Kaulsay KK，Zhu T，Bennett W，Lee KO，Lobie PE(2001).The effects of autocrine human growth hormone(hGH)on human mammary carcinoma cell behaviour aremediated via the hGH receptor.Endocrinology 142：767-77，Mukhina S，Mertani HC，Guo K，Lee KO，Gluckman PD，Lobie PE(2004).Phenotypic conversion of human mammary carcinomacells by autocrine human growth hormone.Proc Natl Acad Sci USA101：15166-71，Zhu T，Starling-Emerald B，Zhang X，Lee KO，Gluckman PD，Mertani HC et al(2005).Oncogenic transformationof human mammary epithelial cells by autocrine human growthhormone.Cancer Res 65：317-24)。为测定自分泌hGH在子宫内膜肿瘤模型中是否影响细胞功能，将RL95-2细胞稳定转染编码hGH基因的表达质粒(RL95-2-hGH)。作为对照，平行建立稳定转染载体(RL95-2-载体)的第2个细胞系。使用汇总的稳定转化物以使任何潜在的克隆选择效应最小化。
RT-PCR显示RL95-2-hGH稳定细胞合成hGH mRNA(图1a)，ELISA分析显示其分泌hGH蛋白进入细胞外培养基中(图l b)。该分析也显示RL95-2细胞低水平表达内源性hGH转录产物和hGH蛋白(图1a和b)。实时PCR也可以相对定量分析测定稳定转染细胞系中hGH和hGH受体的水平。分析显示RL95-2-hGH细胞系相对于RL95-2细胞，具有3*102倍增加的自分泌-hGH，而hGH-受体转录无改变。
RT-PCR也显示了稳定转染细胞系中hGH-受体mRNA的连续表达(图1a)。表达hGH的稳定细胞(RL95-2-hGH)与对照细胞系(RL95-2-载体)比较，未显示受体表达的差异。实时PCR显示RL95-2-载体和RL95-2-hGH细胞间均未测定到IGF-1mRNA，表明自分泌hGH-介导的效应并非由于IGF-1的细胞功能。然而，相对于RL95-2-载体细胞系，实时PCR显示RL95-2-hGH细胞中IGF-2mRNA的表达升高。
为测定自分泌hGH对于RL95-2细胞功能的影响，将评估稳定转染RL95-2细胞系在血清和血清缺乏培养基中的增殖。MTT试验评估细胞生存能力和生长，显示血清和血清缺失培养基中均显示RL95-2-hGH细胞中自分泌hGH的表达增强其生存能力(图1c和d)。10％血清培养基中进行的细胞总数分析显示，以相同的培养密度经6天培养后，RL95-2-hGH细胞数的增加速度显著高于RL95-2-载体细胞(图2a)。细胞生长的升高可能由于增强的增殖净效应和/或细胞凋亡的减少。血清和无血清条件下BrdU在RL95-2-hGH细胞中的整合显示hGH的自分泌表达显著增加细胞循环(图2b)。此外，相对于对照细胞系RL95-2-载体，无血清时自分泌hGH减少了凋亡性细胞死亡。
细胞循环和细胞存活所需的基因转录调控与癌基因转化细胞中信号通道的激活直接相关(Evan G，Littlewood T(1998).Amatter of life and cell death.Science 281：1317-22，Nagasawa H，Noguchi Y，Mori T，Niki K，Namiki H(1985).Suppression ofnormal and preneoplastic mammary growth and uterineadenomyosis with reduced growth hormone level in SHN micegiven monosodium glutamate neonatally.Eur J Cancer Clin Oncol21：1547-51)。自分泌hGH在MCF-7细胞中显示不同的基因表达调节(Xu XQ，Emerald BS，Goh EL，Kannan N，Miller LD，Gluckman PD et al(2005).Gene expression profiling to identifyoncogenic determinants of autocrine human growth hormone inhuman mammary carcinoma.J Biol Chem 280：23987-4003)。使用实时PCR测定细胞增殖和细胞凋亡中的几种关键基因的mRNA水平。过表达hGH的RL95-2细胞上调了细胞周期所需的DDND1(Cyclin D1)和Cyclin E1，和细胞存活所需的抗-凋亡基因Bcl-2的mRNA水平。编码预-凋亡蛋白p53(TP53)，BAD，和BAK1的mRNA的水平经测定出现下调。此外，一种自分泌hGH-介导的肿瘤中包含的潜在的癌基因HOXA1的mRNA水平，在过表达自分泌hGH中具有6倍升高(图2d)。
子宫内膜癌细胞中的自分泌-hGH表达增强了不依赖贴壁的生长
癌基因转化细胞的一个特征是不依赖贴壁的生长(Evan G，Littlewood T(1998).A matter of life and cell death.Science 281：1317-22；Zhu Z，Mukhina S，Zhu T，Mertani HC，Lee KO，LobiePE(2005).p44/42MAP kinase-dependent regulation of catalaseby autocrine human growth hormone protects human mammarycarcinoma cells from oxidative stress-induced apoptosis.Oncogene 24：3774-85；Hanahan D，Weinberg RA(2000).Thehallmarks of cancer.Cell 100：57-70)。软琼脂克隆形成(图3a)和在悬浮培养基中的生长(图3b)显示，RL95-2-hGH细胞中的自分泌hGH表达增强了不依赖贴壁的生长。此外，自分泌-hGH显著增加了软琼脂中的单独克隆大小(图3a)。相对于RL95-2-载体对照细胞系，RL95-2-hGH稳定细胞中高表达的自分泌-hGH增加了集落形成(图3d)。
Matrigel中生长的癌基因转化上皮细胞可形成无腔的巨大的，非-分化的，无差别克隆(Petersen OW，Ronnov-Jessen L，Howlett AR，Bissell MJ(1992).Interaction with basementmembrane serves to rapidly distinguish“growth and differentiationpattern of normal and malignant human breast epithelial cells.ProcNatl Acad Sci USA 89：9064-8)。体外模型用于测定自分泌hGH在Matrigel腔结构中的效应(Muthuswamy SK，Li D，Lelievre S，Bissell MJ，Brugge JS(2001).ErbB2，but not ErbBl，reinitiatesproliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini.Nat Cell Biol 3：785-92)。RL95-2-载体细胞和RL95-2-hGH细胞在含有和不含有生长因子的Matrigel中培养。RL95-2-载体细胞生成通常的三维结构。相反，RL95-2-hGH细胞形成不规则形态的组织破坏结构(图3c)。此外，生长因子-减少的Matrigel中的RL95-2-hGH细胞更具侵染性，并显示破坏性的细胞分化(图3c)。
稳定细胞中的自分泌hGH表达促进间质细胞型
肿瘤发展的去分化和加剧恶性阶段，细胞失去其上皮细胞特征并获得间质细胞型，并伴随基因表达的改变(Sommers CL，Byers SW，Thompson EW，Torri JA，Gelmann EP(1994).Differentiation state and invasiveness of human breast cancer celllines.Breast Cancer Res Treat 31：325-35；Thiery JP(2002).Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.NatRev Cancer 2：442-54。这些表型转变涉及上皮细胞-间叶细胞的转变。人类乳腺癌细胞中的自分泌hGH已经显示可改变细胞形态并显示产生侵染型的效果((Mukhina S，Mertani HC，GuoK，Lee KO，Gluckman PD，Lobie PE(2004).Phenotypicconversion of human mammary carcinoma cells by autocrine humangrowth hormone.Proc Natl Acad Sci U S A 101：15166-71)。相似的，具发现RL95-2-hGH细胞中的自分泌-hGH与细胞形态改变相关。与对照细胞相比，RL95-2-hGH细胞也显示了间叶细胞型(图4a)。随着自分泌-hGH的过表达，细胞外基质蛋白纤维连接蛋白(FN1)，和alpha-环，beta-环，和delta-环，(特定家族)的表达也具有上调。
自分泌-hGH表达细胞的间叶细胞型显示增加迁移和侵染的潜在性。使用伤口愈合法测定细胞迁移时，相对于载体转化细胞，自分泌hGH细胞的确刺激了细胞迁移，使创伤更快愈合(图4b)。使用transwell试验，与对照细胞RL95-2亲本细胞系比较，也可以验证自分泌hGH表达细胞的迁移增强(图4c)。RL95-2细胞的自分泌hGH在标准侵染试验中也显示了通过matrigel的增强能力。
AN3细胞系中的自分泌hGH表达效应
为表明自分泌hGH对RL95-2细胞的效应是非细胞类型特异性的，将测定hGH的自分泌表达在另一子宫内膜癌细胞系(AN3)中的效应。如RL95-2细胞中描述，通过稳定转化AN3-hH和AN3-载体制备过表达hGH，和对应的对照AN3细胞系。RT-PCR和ELISA分析显示相对于对照细胞系，AN3-hGH细胞具有升高水平的hGH mRNA和蛋白表达，而二个细胞系中具有相对水平的hGH-受体转录水平(图5a)。以10％血清培养基评估两种稳定细胞系的细胞生长。初始细胞密度相同，14天后AN3-hGH的细胞总数显著高于对照细胞(图5b)。稳定细胞中hGH的自分泌表达也增强了不依赖贴壁的细胞生长，并且软琼脂克隆显示克隆大小具有显著增加(图5c)。
hGH-抗血清减少了内源性表达的自分泌-hGH的效应
野生型RL95-2细胞产生少量的hGH蛋白。因此，研究hGH抗体对RL95-2细胞功能的效果。使用兔源的hGH-抗体。MTT试验显示，10％血清和血清缺失培养基中，经4天培养，不同数量hGH-抗体处理的RL95-2细胞减少了细胞存活(图6a&b)。针对hGH的多克隆鸡IgY也获得相似的结果。细胞循环和细胞凋亡中多种基因标记的表达分析也表明hGH抗体的处理显示与细胞凋亡一致的表达特征(图6c)。增加hGH抗体的浓度增强了凋亡3/7活性，进一步验证hGH抗体的凋亡作用(图6d)。
子宫内膜癌细胞增加凋亡时hGH mRNA的损耗
使用siRNA检测hGH mRNA损害对于RL95-2细胞功能的效应。以3/7凋亡活性测定，稳定表达的两个siRNA结构(sihGH5(SEQ ID NO：97)和sihGH6(SEQ ID NO：98)增加了RL95-2细胞的凋亡(图9A和9B)。sihGH5和sihGH6对RL-95细胞中hGH mRNA的减少可由q-PCR验证(图9c)。
本发明通过引述特定的实施方案在此描述，以帮助读者实施本发明，避免不合适的实验。然而，领域中的普通激素人员可以容易地理解许多组合物和参数可以在一定范围内变化和修正，而不脱离本发明的范围。此外，题目，抬头，或类似物是增强读者对文件的理解，不应作为本发明的范围限制。
所有以上和以下完整描述的专利应用，专利，和出版，通过在此引述全部整合入本文。
本说明中，任何以下的权利要求，除非文中另有要求，文字”包括”，”包括”和类似物，将以包含意义，而非唯一意义而理解，即，意指”包括但不局限于”。
序列表
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<120>生长激素和相关激素的抑制剂，和其使用方法
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Met Ala Ala Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Ala Leu Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Ala Gly Ala Val Gln Thr Val Pro Leu
            20                  25                  30
Ser Arg Leu Phe Lys Glu Ala Met Leu Gln Ala His Arg Ala His Gln
        35                  40                  45
Leu Ala Ile Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Ile Ser Ser Trp Gly Met Asp
    50                  55                  60
Ser Ile Pro Thr Ser Ser Asn Met Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Leu His Ile Ser Leu Leu Leu Ile Glu Ser Arg Leu Glu
                85                  90                  95
Pro Val Arg Phe Leu Arg Ser Thr Phe Thr Asn Asn Leu Val Tyr Asp
            100                 105                 110
Thr Ser Asp Ser Asp Asp Tyr His Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly
        115                 120                 125
Ile Gln Met Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser His Leu Thr Gly
    130                 135                 140
Gln Thr Leu Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn
145                 150                 155                 160
His Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu His Cys Phe Arg Lys
                165                 170                 175
Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Met Val Gln Cys Arg Ser
            180                 185                 190
Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
        195
<210>8
<211>128
<212>PRT
<213>现代人
<400>8
Met Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu His Ile Ser
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Ile Glu Ser Arg Leu Glu Pro Val Arg Phe Leu Arg Ser
            20                  25                  30
Thr Phe Thr Asn Asn Leu Val Tyr Asp Thr Ser Asp Ser Asp Asp Tyr
        35                  40                  45
His Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Met Leu Met Gly Arg
    50                  55                  60
Leu Glu Asp Gly Ser His Leu Thr Gly Gln Thr Leu Lys Gln Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn His Asp Ala Leu Leu Lys Asn
                85                  90                  95
Tyr Gly Leu Leu His Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
            100                 105                 110
Phe Leu Arg Met Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
        115                 120                 125
<210>9
<211>139
<212>PRT
<213>现代人
<400>9
Met Ala Ala Asp Ser Ile Pro Thr Ser Ser Asn Met Glu Glu Thr Gln
1               5                   10                  15
Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu His Ile Ser Leu Leu Leu Ile Glu
            20                  25                  30
Ser Arg Leu Glu Pro Val Arg Phe Leu Arg Ser Thr Phe Thr Asn Asn
        35                  40                  45
Leu Val Tyr Asp Thr Ser Asp Ser Asp Asp Tyr His Leu Leu Lys Asp
    50                  55                  60
Leu Glu Glu Gly Ile Gln Met Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser
65                  70                  75                  80
His Leu Thr Gly Gln Thr Leu Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr
                85                  90                  95
Asn Ser His Asn His Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu His
            100                 105                 110
Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Met Val
        115                 120                 125
Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
    130                 135
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH抗原决定簇
<400>10
Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Gln Asn
1               5                   10
<210>11
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH抗原决定簇
<400>11
Glu Ala Tyr
1
<210>12
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH抗原决定簇
<400>12
Gln Lys Tyr Ser Phe Ile Gln Ala Pro Gln Ala Ser Leu
1               5                   10
<210>13
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH抗原决定簇
<400>13
Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Gln Ala Gln Gln Lys Ser
1               5                   10                  15
Asn Ile Gln
<210>14
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH抗原决定簇
<400>14
Gly Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
Asp Ser Asp Val Tyr Asp
            20
<210>15
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH抗原决定簇
<400>15
Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ala Phe Lys Gln
1               5                   10                  15
Thr Tyr Ala Lys Phe Asp Ala Asn Ser His Asn Asp Asp
            20                  25
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH抗原决定簇
<400>16
Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly
1               5
<210>17
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH构象表位
<400>17
Pro Lys Glu
1
<210>18
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH序列表位
<400>18
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu
1               5
<210>19
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH序列表位
<400>19
Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Ile Gln Ala Pro Gln Ala Ser Leu
1               5                   10                  15
<210>20
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hGH序列表位
<400>20
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Ile Gln Ala Pro
1               5                   10                  15
Gln Ala Ser Leu
            20
<210>21
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hPRL抗原决定簇
<400>21
Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val
1               5                   10
<210>22
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hPRL抗原决定簇
<400>22
Tyr Thr His Gly Arg Gly Phe Ile Thr Lys Ala Ile Asn Ser Cys His
1               5                   10                  15
Thr Ser Ser Leu Ala Thr Pro Glu Asp Lys Glu Gln
            20                  25
<210>23
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hPRL抗原决定簇
<400>23
Gln Met Asn Gln
1
<210>24
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hPRL抗原决定簇
<400>24
Arg Gly Met Gln Glu Ala Pro Glu Ala Ile Leu Ser
1               5                   10
<210>25
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hPRL抗原决定簇
<400>25
Ser Gln Val His Pro Glu Thr Lys Glu Asn Glu Ile Tyr Pro Val Trp
1               5                   10                  15
Ser Gly Leu Pro Ser Ile Gln Met Ala Asp Glu Glu Ser Arg
            20                  25                  30
<210>26
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的hPRL抗原决定簇
<400>26
Lys Leu Leu Lys Cys Arg Ile Ile His Asn Asn Asn Cys
1               5                   10
<210>27
<211>822
<212>DNA
<213>homon sapiens
<400>27
aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg    60
caatggctac aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc tgcctgccct    120
ggcttcaaga gggcagtgcc ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta    180
tgctccgcgc ccatcgtctg caccagctgg cctttgacac ctaccaggag tttgaagaag    240
cctatatccc aaaggaacag aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgtt    300
tctcagagtc tattccgaca ccctccaaca gggaggaaac acaacagaaa tccaacctag    360
agctgctccg catctccctg ctgctcatcc agtcgtggct ggagcccgtg cagttcctca    420
ggagtgtctt cgccaacagc ctggtgtacg gcgcctctga cagcaacgtc tatgacctcc    480
taaaggacct agaggaaggc atccaaacgc tgatggggag gctggaagat ggcagccccc    540
ggactgggca gatcttcaag cagacctaca gcaagttcga cacaaactca cacaacgatg    600
acgcactact caagaactac gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg    660
agacattcct gcgcatcgtg cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctagctgc    720
ccgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc    780
cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat ca                       822
<210>28
<211>821
<212>DNA
<213>现代人
<400>28
aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagcgg    60
caatggctgc aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc tgcctgtcct    120
ggcttcaaga gggcagtgcc ttcccaacca ttcccttatc caggcttttt gacaacgcta    180
tgctccgcgc ccgtcgcctg taccagctgg catatgacac ctatcaggag tttgaagaag    240
cctatatcct gaaggagcag aagtattcat tcctgcagaa cccccagacc tccctctgct    300
tctcagagtc tattccaaca ccttccaaca gggtgaaaac gcagcagaaa tctaacctag    360
agctgctccg catctccctg ctgctcatcc agtcatggct ggagcccgtg cagctcctca    420
ggagcgtctt cgccaacagc ctggtgtatg gcgcctcgga cagcaacgtc tatcgccacc    480
tgaaggacct agaggaaggc atccaaacgc tgatgtggag gctggaagat ggcagccccc    540
ggactgggca gatcttcaat cagtcctaca gcaagtttga cacaaaatcg cacaacgatg    600
acgcactgct caagaactac gggctgctct actgcttcag gaaggacatg gacaaggtcg    660
agacattcct gcgcatcgtg cagtgccgct ctgtggaggg cagctgtggc ttctagctgc    720
ccgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggtcgtggaa ggtgctactc    780
cag5gcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat c                        821
<210>29
<211>837
<212>DNA
<213>现代人
<400>29
agcatcccaa ggcccgactc cccgcaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagcgg    60
caatggctgc aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tgccctgctc tgcctgccct    120
ggcttcaaga ggctggtgcc gtccaaaccg ttcccttatc caggcttttt aaagaggcta    180
tgctccaagc ccatcgcgca caccagctgg ccattgacac ctaccaggag tttataagct    240
cttggggaat ggaagcctat atcacaaagg aacagaagta ttcattcctg catgactccc    300
agacctcctt ctgcttctca gactctattc cgacatcctc caacatggag gaaacgcagc    360
agaaatccaa cttagagctg ctccacatct ccctgctgct catcgagtcg cggctggagc    420
ccgtgcggtt cctcaggagt accttcacca acaacctggt gtatgacacc tcggacagcg    480
atgactatca cctcctaaag gacctagagg aaggcatcca aatgctgatg gggaggctgg    540
aagacggcag ccacctgact gggcagaccc tcaagcagac ctacagcaag tttgacacaa    600
actcgcacaa ccatgacgca ctgctcaaga actacgggct gctccactgc ttcaggaagg    660
acatggacaa ggtcgagaca ttcctgcgca tggtgcagtg ccgctctgtg gagggcagct    720
gtggcttcta ggggcccgcg tggcatcctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct    780
gaaggtgcca ctccagtgcc caccagcctt gtcttaataa aattaagttg tattgtt       837
<210>30
<211>883
<212>DNA
<213>现代人
<400>30
cagggagaga gaactggcca gggtataaaa agggcccaca agagaccggc tctaggatcc    60
caaggcccaa ctccccgaac cactcagggt cctgtggaca gctcacctag cggcaatggc    120
tgcaggctcc cggacgtccc tgctcctggc ttttgccctg ctctgcctgc cctggcttca    180
agaggctggt gccgtccaaa ccgttccgtt atccaggctt tttgaccacg ctatgctcca    240
agcccatcgc gcgcaccagc tggccattga cacctaccag gagtttgaag aaacctatat    3D0
cccaaaggac cagaagtatt cattcctgca tgactcccag acctccttct gcttctcaga    360
ctctattccg acaccctcca acatggagga aacgcaacag aaatccaatc tagagctgct    420
ccgcatctcc ctgctgctca tcgagtcgtg gctggagccc gtgcggttcc tcaggagtat    480
gttcgccaac aacctggtgt atgacacctc ggacagcgat gactatcacc tcctaaagga    540
cctagaggaa ggcatccaaa cgctgatggg gaggctggaa gacggcagcc gccggactgg    600
gcagatcctc aagcagacct acagcaagtt tgacacaaac tcacacaacc atgacgcact    660
gctcaagaac tacgggctgc tctactgctt caggaaggac atggacaagg tcgagacatt    720
cctgcgcatg gtgcagtgcc gctctgtaga gggtagctgt ggcttctagg tgcccgcgtg    780
gcatcctgtg accgacccct ccccagtgcc tctcctggcc ctggaaggtg ccactccagt    840
gcccatcagc cttgtcctaa taaaattaag ttgtatcatt tca                      883
<210>31
<211>879
<212>DNA
<213>现代人
<400>31
gcagggagag agaactggcc agggtataaa aagggcccac aagagaccgg ctctaggatc    60
ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac agctcaccta gtggcaatgg    120
ctccaggctc ccggacgtcc ctgctcctgg cttttgccct gctctgcctg ccctggcttc    180
aagaggctgg tgccgtccaa accgttccgt tatccaggct ttttgaccac gctatgctcc    240
aagcccatcg cgcgcaccag ctggccattg acacctacca ggagtttgaa gaaacctata    300
tcccaaagga ccagaagtat tcattcctgc atgactccca gacctccttc tgcttctcag    360
actctattcc gacaccctcc aacatggagg aaacgcaaca gaaatccaat ctagagctgc    420
tccgcatctc cctgctgctc atcgagtcgt ggctggagcc cgtgcggttc ctcaggagta    480
tgttcgccaa caacctggtg tatgacacct cggacagcga tgactatcac ctcctaaagg    540
acctagagga aggcatccaa acgctgatgg ggaggctgga agacggcagc cgccggactg    600
ggcagatcct caagcagacc tacagcaagt ttgacacaaa ctcgcacaac catgacgcac    660
tgctcaagaa ctacgggctg ctctactgct tcaggaagga catggacaag gtcgagacat    720
tcctgcgcat ggtgcagtgc cgctctgtgg agggcagctg tggcttctag gtgcccgagt    780
agcatcctgt gacccctccc cagtgcctct cctggccctg aaggtgccac tccagtgccc    840
accagccttg tcctaataaa attaagttgt atcatttca                           879
<210>32
<211>1384
<212>DNA
<213>现代人
<400>32
atccttattc tatatctctt ggtatttagt gtaaaaattt taaaatcttt acctagcaat    60
cttgaggaag aaacttgata actgataata catgagattg ttacctaagt gaaatataat    120
cctatatatt caacaaactt tagagaaata agataaattt taaagtaaat gacttctgta    180
gttttataga tcctccaaac caatctagtc tcagatctca ccttcatcat ttctctcatt    240
tccttttggc ctaattaatc aaaatccttc ctagaatgtt catttctggc cagtatgtct    300
tcctgaatat gaataagaaa taaaatacca tttgatgttt gaaattatgg gggtaatctc    360
aatgacggaa atagatgacc aggaaaaggg aaacgaatgc ctgattcatt atattcatga    420
agatatcaaa ggtttataaa gccaatatct gggaaagaga aaaccgtgag acttccagat    480
cttctctggt gaagtgtgtt tcctgcaacg atcacgaaca tgaacatcaa aggatcgcca    540
tggaaagggt ccctcctgct gctgctggtg tcaaacctgc tcctgtgcca gagcgtggcc    600
cccttgccca tctgtcccgg cggggctgcc cgatgccagg tgacccttcg agacctgttt    660
gaccgcgccg tcgtcctgtc ccactacatc cataacctct cctcagaaat gttcagcgaa    720
ttcgataaac ggtataccca tggccggggg ttcattacca aggccatcaa cagctgccac    780
acttcttccc ttgccacccc cgaagacaag gagcaagccc aacagatgaa tcaaaaagac    840
tttctgagcc tgatagtcag catattgcga tcctggaatg agcctctgta tcatctggtc    900
acggaagtac gtggtatgca agaagccccg gaggctatcc tatccaaagc tgtagagatt    960
gaggagcaaa ccaaacggct tctagagggc atggagctga tagtcagcca ggttcatcct    1020
gaaaccaaag aaaatgagat ctaccctgtc tggtcgggac ttccatccct gcagatggct    1080
gatgaagagt ctcgcctttc tgcttattat aacctgctcc actgcctacg cagggattca    1140
cataaaatcg acaattatct caagctcctg aagtgccgaa tcatccacaa caacaactgc    1200
taagcccaca tccatttcat ctatttctga gaaggtcctt aatgatccgt tccattgcaa    1260
gcttctttta gttgtatctc ttttgaatcc atgcttgggt gtaacaggtc tcctcttaaa    1320
aaataaaaac tgactcctta gagacatcaa aatccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1380
aaaa                                                                 1384
<210>33
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>33
gagggcagtg ccttcccaa    19
<210>34
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>34
gcctatatcc caaaggaac    19
<210>35
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>35
cctggtgtac ggcgcctct    19
<210>36
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>36
ctgacagcaa cgtctatga    19
<210>37
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>37
gtattcattc ctgcagaac    19
<210>38
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>38
cagcctggtg tacggcgcc                                                             19
<210>39
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>39
cgatgacgca ctactcaag                                                             19
<210>40
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>40
gagggcagtg ccttcccaat tcaagagatt gggaaggcac tgccctc                              47
<210>41
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>41
gcctatatcc caaaggaact tcaagagagt tcctttggga tataggc                              47
<210>42
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>42
cctggtgtac ggcgcctctt tcaagagaag aggcgccgta caccag                               46
<210>43
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>43
ctgacagcaa cgtctatgat tcaagagatc atagacgttg ctgtcag                              47
<210>44
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>44
gtattcattc ctgcagaact tcaagagagt tctgcaggaa tgaatac                              47
<210>45
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>45
cagcctggtg tacggcgcct tcaagagagg cgccgtacac caggctg                              47
<210>46
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>46
cgatgacgca ctactcaagt tcaagagact tgagtagtgc gtcatcg                              47
<210>47
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(4)
<223>其中，n可以是任意核苷，a，t，g，或c
<220>
<221>其他特征
<222>(52)..(55)
<223>其中，n可以是任意核苷，a，t，g，或c
<400>47
nnnngagggc agtgccttcc caattcaaga gattgggaag gcactgccct cnnnn                     55
<210>48
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(4)
<223>其中n是任意核苷a，t，g或c.
<220>
<221>其他特征
<222>(52)..(55)
<223>其中n是任意核苷a，t，g或c.
<400>48
nnnngcctat atcccaaagg aacttcaaga gagttccttt gggatatagg cnnnn                     55
<210>49
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(4)
<223>其中n是任意核苷a，t，g或c
<220>
<221>其他特征
<222>(52)..(55)
<223>其中n是任意核苷a，t，g或c
<400>49
nnnngcctgg tgtacggcgc ctctttcaag agaagaggcg ccgtacacca gnnnn                     55
<210>50
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(4)
<223>其中n是任意核苷a，t，g，或c
<220>
<221>其他特征
<222>(53)..(56)
<223>其中n是任意核苷a，t，g，或c
<400>50
nnnngctgac agcaacgtct atgattcaag agatcataga cgttgctgtc agnnnn                    56
<210>51
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(4)
<223>其中n是任意核苷a，t，g，或c
<220>
<221>其他特征
<222>(52)..(55)
<223>其中n是任意核苷a，t，g，或c
<400>51
nnnngtattc attcctgcag aacttcaaga gagttctgca ggaatgaata cnnnn                     55
<210>52
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(4)
<223>其中n是任意核苷a，t，g或c
<220>
<221>其他特征
<222>(53)..(56)
<223>其中n是任意核苷a，t，g或c
<400>52
nnnngcagcc tggtgtacgg cgccttcaag agaggcgccg tacaccaggc tgnnnn                    56
<210>53
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<220>
<221>其他特征
<222>(1)..(4)
<223>其中n是任意核苷a，t，g，或c
<220>
<221>其他特征
<222>(53)..(56)
<223>其中n是任意核苷a，t，g，或c
<400>53
nnnngcgatg acgcactact caagttcaag agacttgagt agtgcgtcat cgnnnn                    56
<210>54
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>54
ggatccgagg gcagtgcctt cccaattcaa gagattggga aggcactgcc ctcttttttg                60
gaaaagtcc                                                                        69
<210>55
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>55
ggatccgcct atatcccaaa ggaacttcaa gagagttcct ttgggatata ggcttttttg                60
gaaaagtcc                                                                        69
<210>56
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>56
ggatccgcct ggtgtacggc gcctctttca agagaagagg cgccgtacac caggcttttt    60
tggaaaagtc c                                                         71
<210>57
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>57
ggatccgctg acagcaacgt ctatgattca agagatcata gacgttgctg tcagagtttt    60
ttggaaaagt cc                                                        72
<210>58
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>58
ggatccgtat tcattcctgc agaacttcaa gagagttctg caggaatgaa tacttttttg    60
gaaaagtcc                                                            69
<210>59
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>59
ggatccgcag cctggtgtac ggcgccttca agagaggcgc cgtacaccag gctgtttttt    60
ggaaaagtcc                                                           70
<210>60
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>60
ggatccgcga tgacgcacta ctcaagttca agagacttga gtagtgcgtc atcgtttttt    60
ggaaaagtcc                                                           70
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>61
ccgacaccct ccaacaggga       20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>62
ccttgtccat gtccttcctg       20
<210>63
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>63
ctcaactgga ctttactgaa cg    22
<210>64
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>64
aatctttgga actggaactg gg    22
<210>65
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>65
atgatatcgc cgcgctcg         18
<210>66
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>66
cgctcggtga ggatcttca                                                             19
<210>67
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>67
ttcctgggca tggagtc                                                               17
<210>68
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>68
caggtctttg cggatgtc                                                              18
<210>69
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>69
tgacactggc aaaacaatgc a                                                          21
<210>70
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>70
ggtccttttc accagcaagct                                                           21
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>71
tgcaccacca actgcttagc                                                            20
<210>72
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>72
ggcatggact gtggtcatga g                                                          21
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>73
cccatcagca ggaacacctt                                                            20
<210>74
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>74
ggctcactgc aaagactttg aa                                                         22
<210>75
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>75
ccatgcaggc aacataaact tc                                                         22
<210>76
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>76
agggttgtaa cctgtgtaac aag                                                        23
<210>77
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>77
cctatgcagg ggtggtcaac                                                            20
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>78
cgacctggaa aacgccatca                                                            20
<210>79
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>79
cccaccacgt acaagggt c                                                            19
<210>80
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>80
ctggggtatt gggggcatc                                                             19
<210>81
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>81
cagggaggaa acacaacaga aa                                                         22
<210>82
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>82
ttaggaggtc atagacgttg ct                                                         22
<210>83
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>83
gctaactagc aatggtggta cag                                                        23
<210>84
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>84
gacgttcagt aaagtccagt tga                                                        23
<210>85
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>85
cgtgagaagg agggtctctt g                                                          21
<210>86
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>86
gtgggaggta gtcagagtgt c                                                          21
<210>87
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>87
acgaaggtct gcgcgtgtt                                                             19
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>88
ccgctggcca tgaactacct                                                            20
<210>89
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>89
tgcagctgtg ggttgattcc                                                            20
<210>90
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>90
aaacacgcac ctcaaagctg ttc                                                        23
<210>91
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>91
tccgcatcag gaaggctaga                                                            20
<210>92
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>92
aggaccaggc ctccaagct                                                             19
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>合成的引物
<400>93
cccagagttt gagccgagtg                                                            20
<210>94
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>94
cccatccctt cgtcgtcct                                                             19
<210>95
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>95
gaacaggagg ctgaaggggt                                                            20
<210>96
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的引物
<400>96
tcaggccatg ctggtagacg                                                            20
<210>97
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>97
aagtattcat tcctgcagaa c                                                          21
<210>98
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的siRNA
<400>98
aacagcctgg tgtacggcgc c                                                          21

Claims (37)

1.一种抑制肿瘤细胞增殖或存活的方法，包括将以下抑制药物接触所述的细胞：
a)人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素或催乳素基因；或
b)人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素或催乳素基因的多肽产物。
2.一种在需要的主体中治疗或预防癌症，细胞增殖失调或细胞存活失调的方法，包括包括将以下抑制药物处理所述的细胞：
a)人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素或催乳素基因；或
b)人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素或催乳素基因的多肽产物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中人类生长激素基因簇基因成员是从以下组中选择的，人类生长激素1(hGH1)基因，人类生长激素2(hHG2)基因，绒毛膜生长激素1(CSH1)基因，绒毛膜生长激素2(CHS2)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素2(CSL-2)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素3(CSL-3)基因，人类绒毛膜生长催乳相似激素4(CSL-4)基因。
4.根据权利要求1或2的方法，其中多育曲菌素基因是多育曲菌素或多育曲菌素相关蛋白基因。
5.根据权利要求1或2的方法，其中催乳素基因是催乳素或催乳素相关蛋白基因。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述的抑制药物是一种可以抑制人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素基因或催乳素基因的多肽产物表达的分离的siRNA。
7.根据权利要求1或2的方法，其中所述的抑制药物是一种可以抑制人类生长激素基因簇基因成员多肽产物表达的分离的siRNA。
8.根据权利要求1，2，6，7中任意一项的方法，其中人类生长激素基因簇基因成员的多肽产物是从以下组中选择的，催乳素(PRL)，催乳素-相关蛋白，生长激素1(hGH1)，生长激素2(hHG2)，绒毛膜生长激素1(CSH1)，绒毛膜生长激素2(CHS2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)，人类绒毛膜生长催乳相似激素2(CSL-2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素3(CSL-3)，人类绒毛膜生长催乳相似激素4(CSL-4)，多育曲菌素和多育曲菌素-相关蛋白。
9.根据权利要求1，2，6，7中任意一项的方法，其中所述的多育曲菌素基因的多肽产物是多育曲菌素或多育曲菌素-相关蛋白。
10.根据权利要求1，2，6，7中任意一项的方法，其中所述的催乳素基因的多肽产物是催乳素或催乳素-相关蛋白。
11.根据权利要求7的方法，其中所述的分离siRNA包括从SEQID NOs：33-60和97-98组成的组中选择的核酸序列。
12.根据权利要求7的方法，其中所述的抑制药物是一种与人类生长激素基因簇基因成员，多育曲菌素基因或催乳素基因肽产物的线性或构象表位结合的抗体。
13.根据权利要求12的方法，其中所述的抑制药物是一种结合人类生长激素多肽或人类催乳素多肽的抗体。
14.根据权利要求13的方法，其中所述的人类生长激素多肽是从包括SEQ IN NOs：10-20的组中选择的。
15.根据权利要求13的方法，其中所述的人类催乳素多肽是从包括SEQ IN NOs：21-26的组中选择的。
16.根据权利要求1的方法，其中所述的肿瘤细胞是上皮肿瘤细胞。
17.根据权利要求16的方法，其中所述的上皮肿瘤细胞是从肺癌，结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，子宫内膜癌中选择的。
18.根据权利要求2的方法，其中所述的细胞增殖失调是子宫内膜异位。
19.根据权利要求1-18中任意一项的方法，进一步包括第二种化合物的治疗，其中所述的第二种化合物是一种化学治疗或抗-肿瘤药物。
20.一种特异结合人类生长激素多肽的抗体，其中所述的抗体结合所述的人类生长激素多肽上的构象表位。
21.根据权利要求20的抗体，其中所述的构象表位是从表2中显示的构象表位中选择的。
22.一种特异结合人类生长激素多肽的抗体，其中所述的抗体结合所述的人类生长激素多肽上的序列表位。
23.根据权利要求22的抗体，其中所述的序列表位是从表3中显示的序列表位中选择的。
24.一种特异结合人类生长激素多肽的抗体，其中所述的抗体包括从表1显示的抗原决定簇中选取的抗原决定簇。
25.一种特异结合人类催乳素多肽的抗体，其中所述的抗体结合所述的人类催乳素多肽上的构象表位。
26.根据权利要求25的抗体，其中所述的构象表位是从表5中显示的构象表位中选择的。
27.一种特异结合人类催乳素多肽的抗体，其中所述的抗体包括从表4显示的抗原决定簇中选取的抗原决定簇。
28.一种包括根据权利要求20-27的任何之一的抗体的组合物，其中所述的组合物进一步包括一种药物可接受载体。
29.一种包括从包括SEQ ID NO：33-39和97-98的组中选择的核酸序列的siRNA，其中所述的分离siRNA可以抑制人类生长激素多肽的表达。
30.一种包括一条正义RNA链和一条反义RNA链的分离的siRNA，其中正义和反义RNA链形成一个RNA复合物，其中所述的分离siRNA包括从SEQ ID NOs：40-60组成的组中选择的核酸序列，并所述的siRNA可以抑制人类生长激素多肽的表达。
31.根据权利要求29或30的siRNA，其中人类生长激素多肽是从以下组中选择的，催乳素(PRL)，催乳素-相关蛋白，生长激素1(hGH1)，生长激素2(hHG2)，绒毛膜生长激素1(CSH1)，绒毛膜生长激素2(CHS2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素(CSL)，人类绒毛膜生长催乳相似激素2(CSL-2)，人类绒毛膜生长催乳相似激素3(CSL-3)，人类绒毛膜生长催乳相似激素4(CSL-4)，多育曲菌素和多育曲菌素-相关蛋白。
32.一种包括根据权利要求29-31任何之一的siRNA的组合物，其中所述的组合物进一步包括一种药物可接受载体。
33.一种在主体中诊断癌症，细胞增殖失调或细胞存活失调的方法，包括将所述主体的实验样本与根据权利要求20-27任何之一的抗体接触，并测定结合所述样品的抗体的水平，其中相对于结合对照样品的水平，结合所述样品的抗体的升高水平显示存在癌症，细胞增殖失调或细胞存活失调。
34.根据权利要求33的方法，其中所述的癌症是上皮癌。
35.根据权利要求34的方法，其中所述的上皮癌是从肺癌，结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，子宫内膜癌中选择的。
36.根据权利要求33的方法，其中所述的细胞增殖失调是子宫内膜异位。
37.根据权利要求1-19或33-36中任意一项的方法，其中所述的主体是人类。
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