CN104560996A - 一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，其特征在于：所述shRNA包括分别与GH？mRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340、544位点的GH-mus-544、616位点的GH-mus-616和627位点的GH-mus-627；所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板包括siRNA正义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号的核苷酸序列。本发明能有效抑制小鼠GH基因表达，且4个GH？shRNA过表达载体均具有很高的表达效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用。
背景技术
Small interfering RNA siRNA是一种小RNA分子，它的核苷酸序列长度为～21-25，由Dicer，RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。RNA干涉RNAinterference，RNAi是指内源性或外源性双链RNA，dsRNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。
小鼠生长激素mouse growth hormone,mGH是小鼠垂体前叶分泌的一个单链多肽类激素，它能加速蛋白质的合成和脂类的代谢，因而具有较高的商业价值和科研价值，我们发现不同内含子对生长激素基因的表达有很大的差异。shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环loop序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在细胞或活体组织中输送“短干涉RNA”siRNA的一种办法是将siRNA序列作为“短发夹”克隆进真核表达载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”shRNA，并被RNAi通道处理。
目前，缺乏一种有效抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种有效抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明提供了一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，所述shRNA包括分别与GH mRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340、544位点的GH-mus-544、616位点的GH-mus-616和627位点的GH-mus-627；
所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板包括siRNA正义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号的核苷酸序列。
进一步地，所述GH-mus-340的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述GH-mus-340的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
所述GH-mus-544的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述GH-mus-544的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
所述GH-mus-616的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述GH-mus-616的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
所述GH-mus-627的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述GH-mus-627的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
进一步地，所述正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；当siRNA的第一个碱基不是G时，在CACC后补加一个G。
更进一步地，所述loop环的核苷酸序列是TTCAAGAGA；终止信号的核苷酸序列是TTTTTT。
本发明所述的抑制小鼠GH基因表达的小干扰RNA质粒，所述所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板，经单链退火形成双链的shRNA分子后，分别插入到pGPU6/GFP/Neo载体中，构建4个干扰RNA质粒，分别为pGPU6/GFP/Neo-GH340、pGPU6/GFP/Neo-GH544、pGPU6/GFP/Neo-GH616及pGPU6/GFP/Neo-GH627。
本发明所述的shRNA在抑制小鼠GH基因表达的药物中的应用。
本发明所述的抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体在制备降低小鼠GH基因表达的试剂中的应用。
有益效果：本发明能有效抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用。本发明设计的4条GH shRNA序列均有很好的抑制GH基因表达的活性，且4个GH shRNA过表达载体均具有很高的表达效率。涉及4个过表达小鼠GH shRNA载体的构建及4条专用GH shRNA片段。本发明通过荧光PCR及western blot分别从mRNA及蛋白水平分析各对shRNA的干扰效率。
附图说明
图1为重组载体酶切鉴定图
图2为本发明实施例重组载体的示意图；
图3为QRT-PCR检测shRNA干扰后的GH表达图；
图4为GH蛋白表达检测图；
图5为GH蛋白表达灰度分析图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
如图1至图5所示，本发明提供了一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，所述shRNA包括分别与GH mRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340、544位点的GH-mus-544、616位点的GH-mus-616和627位点的GH-mus-627；
所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板包括siRNA正义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号的核苷酸序列。
所述GH-mus-340的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述GH-mus-340的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
所述GH-mus-544的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述GH-mus-544的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
所述GH-mus-616的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述GH-mus-616的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
所述GH-mus-627的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述GH-mus-627的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
所述正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；当siRNA的第一个碱基不是G时，在CACC后补加一个G。
所述loop环的核苷酸序列是TTCAAGAGA；终止信号的核苷酸序列是TTTTTT。
本发明所述的抑制小鼠GH基因表达的小干扰RNA质粒，所述所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板，经单链退火形成双链的shRNA分子后，分别插入到pGPU6/GFP/Neo载体中，所述载体包括pGPU6、GFP和Neo。构建4个干扰RNA质粒，分别为pGPU6/GFP/Neo-GH340、pGPU6/GFP/Neo-GH544、pGPU6/GFP/Neo-GH616及pGPU6/GFP/Neo-GH627。
本发明所述的shRNA在抑制小鼠GH基因表达的药物中的应用。
本发明所述的抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体在制备降低小鼠GH基因表达的试剂中的应用。
实施例1
GH shRNA的设计及合成
(1)寡核苷酸的合成
根据小鼠GH mRNA的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。针对不同位点设计4条shRNA和对照shRNA，模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加一个G，序列名称分别为GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627，另外设计阴性对照shRNA，所述阴性对照正义链的核苷酸序列是SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，所述阴性对照反义链的核苷酸序列是SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。
(2)shRNA模板的退火
将DNA oligo分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100 uM。取相应的正义链和反义链oligo溶液，按照如下配比配置退火反应体系。
在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃ 5min；85℃ 5min；75℃ 5min；70℃ 5min；4℃保存。退火处理后得到浓度为10μM的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍，终浓度为20 nM，用于连接反应。
(3)pGPU6/GFP/Neo载体的线性化
取2 ug pGPU6/GFP/Neo载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，按照如下体系进行酶切处理：
37℃酶切1小时，琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(TaKaRa)回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50ng/ul。
(4)pGPU6/GFP/Neo-GH shRNA载体的构建
4.1按照如下体系进行载体的连接反应：
22℃ 1hr,转染JM 109感受态大肠杆菌.
4.2每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50 ug/ml Kanamycin的LB培养集中。
4.3使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用BamH I,Pst I分别酶切鉴定。阳性重组载体应该可以被BamH I切开，而不能被Pst I切开。鉴定结果如图1所示，图1中M为lamda/Eco130I DNA mark；最左上侧1-5为GH-mus-340(1-5)Pst I酶切结果，其右侧1-5为GH-mus-544(1-5)Pst I酶切结果；其右侧1-5为GH-mus-340(1-5)BamH I酶切结果，最右侧1-5为GH-mus-544(1-5)BamH I酶切结果；最左下侧1-5为GH-mus-616(1-5)PstI酶切结果，其右侧1-5为GH-mus-627(1-5)Pst I酶切结果；其右侧1-5为GH-mus-616(1-5)BamH I酶切结果，最右侧1-5为Gh-mus-627(1-5)BamH I酶切结果。
酶切结果表明，所有质粒均为阳性重组载体,重组载体pGPU6/GFP/Neo-GH shRNA载体结构图见图2，每组选择两个克隆进行测序鉴定。测序正确的菌株采用高纯度质粒中量抽提试剂盒(Axygen)抽提，所得质粒可以用于常规的分子生物学实验和细胞学实验。请重新转化至大肠杆菌DH5α中，然后用OMEGA公司去内毒素试剂盒制备质粒，用于细胞转染。
(5)细胞培养及转染
5.1冻存细胞的复苏与培养
将上述质粒用ScaI大量酶切线性化后，QIAGEN纯化试剂盒胶回收线性化片段，产物终浓度为500ng/ul用于细胞转染。从液氮中取出装有小鼠垂体瘤细胞系AtT-20细胞(购自中国科学院细胞库)的冻存小管，立即投入37-40℃的温水中快速晃动，直至冻存液完全融解；在1-2min内完成复温；将细胞悬液移入无菌的离心管，加入5mL培养液，轻轻吹匀；将细胞悬液800-1000r/min离心5min，弃上清；向含有细胞沉淀的离心管加入1mL DMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号：12100-046)，轻轻吹匀，将细胞悬液转入细胞培养瓶，加入适量的完全培养基进行培养。
5.2细胞转染
将小鼠垂体瘤细胞系AtT-20细胞分为6组分别是正常饲养组、转阴性对照组(pGPU6/GFP/Neo)及4组实验组pGPU6/GFP/Neo-GH340、pGPU6/GFP/Neo-GH544、pGPU6/GFP/Neo-GH616、pGPU6/GFP/Neo-GH627,每组3个重复。
转染前1天，向每孔含10％胎牛血清(购自GIBCO公司，货号：21640-079)的500μLDMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号：12100-046)的24孔板中分别接种0.5-2×105个猪PK15细胞，使细胞在转染前达到90-95％的汇合；用50μL的不加血清的DMEM高糖培养基(购自GIBCO公司，货号：12100-046)分别稀释0.8μg步骤1中的待转染各组DNA，并温和的混匀；使用前将脂质体温和摇匀，将2μL lipefectaminTM-2000加入50μL的无血清、无抗生素的DMEM培养基，所述DMEM培养基购自GIBCO公司，货号：12100-046。并轻轻混匀，于室温孵育5min；5min后，分别将50μL的各组DNA稀释液加入50μL的脂质体稀释液，轻轻混匀并于室温放置20min；将100μL的DNA脂质体混合物加入到准备好的孔内，轻轻来回晃动培养板，将其置于37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱中培养，于4-6h后用含10％血清的DMEM高糖培养基继续培养，所述血清购自GIBCO公司，货号：21640-079。各组细胞转染后36h观察荧光确定转染效率，并提取总RNA的提取用于后续试验。
5.3各转染细胞组GH表达水平的测定
5.3.1细胞总RNA提取及cDNA的制备
按照试剂盒，所述试剂盒购自北京天跟公司，货号：DP430的操作说明，提取上述各组细胞总RNA；凝胶电泳鉴定总RNA质量后，按照TOYOBO反转录试剂盒，所述TOYOBO反转录试剂盒购自TOYOBO公司，货号：FSK-100，将提取的总RNA反转录成cDNA。
5.3.2荧光定量PCR检测
以(1)中制备的cDNA为模板，梯度稀释模板验证选定最佳模板浓度，以小鼠GAPDH基因为内参。引物为表1中mGAPDH-L1和mGAPDH-R1，进行实时荧光定量PCR测定GH，GH引物为表1所示的mGH-RTL1和mGH-RTR1表达量，上样体系按照ABI定量试剂说明书上样，反应体系为20μl，10μL 2×Mixturer(TAKARA，货号DRR041A)、1μL 20μM上游引物、1μL 20μM下游引物、1微升cDNA，加超纯水至20μL。PCR扩增程序：95℃5min；94℃20s，退火温度56℃，72℃1m，循环40次，最后72℃延伸5min。
如图3所示为QRT-PCR检测shRNA干扰后的GH表达的荧光定量检测结果，图中NC代表阴性对照，即转染pGPU6/GFP/Neo线性化片段细胞组，GH340代表转染pGPU6/GFP/Neo-GH340细胞组，GH544代表转染pGPU6/GFP/Neo-GH544细胞组，GH616代表转染pGPU6/GFP/Neo-GH616细胞组，GH627代表转染pGPU6/GFP/Neo-GH627细胞组。各测定组中，以阴性对照NC为基准值1，转染GH-mus-340组、转染GH-mus-544组、转染GH-mus-616组及转染GH-mus-627shRNA组GH表达效率分别是0.151、0.447、0.338及0.351倍，其中GH-mus-340 shRNA干扰效率最为明显。
实施例2
shRNA干扰后GH表达蛋白检测
将制备的分别含不同GH shRNA的过表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA转染小鼠垂体瘤细胞系AtT-20细胞，G418筛选12天富集整合有外源基因的细胞，提取细胞总蛋白，检测各组细胞中GH蛋白表达量。
如图4和图5所示，图中NC代表阴性对照，即转染pGPU6/GFP/Neo线性化片段细胞组，GH340代表转染pGPU6/GFP/Neo-GH340细胞组，GH544代表转染pGPU6/GFP/Neo-GH544细胞组，GH616代表转染pGPU6/GFP/Neo-GH616细胞组，GH627代表转染pGPU6/GFP/Neo-GH627细胞组。检测结果表明，阴性对照NC相对灰度值为94，转染GH-mus-340组、转染GH-mus-544组、转染GH-mus-616组及转染GH-mus-627 shRNA组GH相对灰度值分别是12、22、31及20，各合成GH shRNA均能有效抑制GH表达，其中GH 340 shRNA干扰效率最好。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，其特征在于：所述shRNA包括分别与GHmRNA序列特异性结合在340位点的GH-mus-340、544位点的GH-mus-544、616位点的GH-mus-616和627位点的GH-mus-627；
所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板包括siRNA正义链模板的核苷酸序列，loop环的核苷酸序列，siRNA反义链模板的核苷酸序列和终止信号的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，其特征在于：
所述GH-mus-340的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述GH-mus-340的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
所述GH-mus-544的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述GH-mus-544的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；
所述GH-mus-616的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述GH-mus-616的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
所述GH-mus-627的正义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述GH-mus-627的反义链模板的核苷酸序列是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，其特征在于：所述正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；当siRNA的第一个碱基不是G时，在CACC后补加一个G。
4.根据权利要求1至3任一项所述的抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体，其特征在于：所述loop环的核苷酸序列是TTCAAGAGA；终止信号的核苷酸序列是TTTTTT。
5.权利要求1或2所述的抑制小鼠GH基因表达的小干扰RNA质粒，其特征在于：所述所述GH-mus-340、GH-mus-544、GH-mus-616、GH-mus-627的DNA模板，经单链退火形成双链的shRNA分子后，分别插入到pGPU6/GFP/Neo载体中，构建4个干扰RNA质粒，分别为pGPU6/GFP/Neo-GH340、pGPU6/GFP/Neo-GH544、pGPU6/GFP/Neo-GH616及pGPU6/GFP/Neo-GH627。
6.权利要求1所述的shRNA在抑制小鼠GH基因表达的药物中的应用。
7.权利要求1所述的抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体在制备降低小鼠GH基因表达的试剂中的应用。
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