JP2006500017A - RNA発現のためのアデノウイルスのVA1PolIII発現システム - Google Patents
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Abstract
RNAi発現のためのアデノウイルスのVA1 PolIII発現系を提供する。
Description
[0001]本出願は、同時係属中の米国仮出願シリアル番号第60/399,397号、2002年7月31日に出願の優先権を主張する。
政府の権利の言及
[0002]本発明は、米国政府保険社会福祉省の国立衛生研究所からシティー・オブ・コープへの助成金番号A129329のもとで、連邦政府の援助を受けて行った。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
政府の権利の言及
[0002]本発明は、米国政府保険社会福祉省の国立衛生研究所からシティー・オブ・コープへの助成金番号A129329のもとで、連邦政府の援助を受けて行った。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
発明の分野
[0003]本発明は、RNA干渉(RNAi)に関し、より具体的には、哺乳動物における小干渉RNA分子(siRNA)及びsiRNA前駆体を含む干渉RNA分子を生産するための発現システムに関する。
[0003]本発明は、RNA干渉(RNAi)に関し、より具体的には、哺乳動物における小干渉RNA分子(siRNA)及びsiRNA前駆体を含む干渉RNA分子を生産するための発現システムに関する。
発明の背景
[0004]遺伝子治療は、免疫療法、プロテアーゼ阻害剤、及びワクチンのようね既存の抗ウイルス剤の制限された効果のため、AIDSの有望な治療として残されている。いくつかのタイプのRNA遺伝子治療が開発され、哺乳動物の培養においてHIV−1複製を阻害することを示している;これらはアンチセンスRNA、触媒RNA(リボザイム)、及び高アフィニティーRNAリガンド(アパマー(apamer)又はデコイ(decoy))を含む。しかし、それらの効率は非常に変化しやすく、多くの場合、効果的でないようである。
[0004]遺伝子治療は、免疫療法、プロテアーゼ阻害剤、及びワクチンのようね既存の抗ウイルス剤の制限された効果のため、AIDSの有望な治療として残されている。いくつかのタイプのRNA遺伝子治療が開発され、哺乳動物の培養においてHIV−1複製を阻害することを示している;これらはアンチセンスRNA、触媒RNA(リボザイム)、及び高アフィニティーRNAリガンド(アパマー(apamer)又はデコイ(decoy))を含む。しかし、それらの効率は非常に変化しやすく、多くの場合、効果的でないようである。
[0005]RNA干渉(RNAi)は、動物や植物において、配列においてサイレンス遺伝子に相同的である二重鎖RNAによって開始される配列特異的な転写後の遺伝子のサイレンシングのプロセスである(Sharp,P.A.,2001)。この強力な遺伝子工学的技術は、最近、哺乳動物において有用であることが示されている(Elbashir,S.M.,et al.,2001; Novina,C.D.,et al.,2002; Brummelkamp,T.R.,et al.,2002; Paddison,P.I.,et al.,2002; Lee,N.S.,et al.,2002)。二重鎖RNAの一形体は、小干渉RNA(siRNA)として知られるが、HIV−1遺伝子の発現を標的とし、阻害することが示されている(Lee,N.S.,et al.,2002)。
[0006]30bp以上のdsRNAは、誘導性dsRNAに本質的に配列非特異的である、哺乳動物におけるインターフェロン応答を引き起こし得ることが知られている(Elabashir,S.M.,et al.,2001)。突き出している3’末端を有する21ヌクレオチドの二重鎖は、培養の哺乳動物細胞において配列特異的な方法でRNAiを仲介することができる(Elbashir,S.M.,et al.,2001)。
[0007]哺乳動物の系において、配列特異的なRNAiの効果は、siRNAを標的細胞にトランスフェクションによって直接的に導入すること(Elbashir,S.M.,et al.,2001及びNovina,C.D.,et al.,2002)、又はsiRNA若しくは短いヘアピンsiRNA(shRNA)の内因性の発現によって間接的に導入すること(Brummelkamp,T.R.,et al.,2002; Paddison,P.I.,et al.,2002;及びLee,N.S.,et al.,2002)によって観察することができる。shRNAのステム−ループ部分は、小さな一時的(small temporal)RNA(stRNA)又はミクロRNA(miRNA)を生じるためのダイサー(Dicer)によって処理される自然発生のステムループ構造に匹敵する。したがって、HIV−1配列に対応するshRNA又はmiRNAの前駆体の発現は、ヒトのダイサーによって作用され、HIV−特異的siRNAを生じ得た。最近、哺乳動物細胞におけるDNA鋳型から異なるステム−ループ構造を有するいくつかのshRNAの発現が、いくつかの標的を合成のsiRNAと同様に効果的にサイレントした。
[0008]合成のsiRNA又はプラスミドDNAから発現したsiRNAを用いるHIV−1複製の阻害は、siRNA技術が宿主細胞におけるHIV−1複製及び感染を阻害するための治療的戦略として有用であり得る(Novina,C.D.,et al.,2002; Paddison,P.I.,et al.,2002;及びJacque,J.−M.,et al.,2002)。これらのデータは、抗HIV−1剤としてsiRNAの治療用途を調査するための根拠を提供する。本目的としては、HIV−1感染に対する免疫性を与え、ウイスル複製を妨げるために、siRNAを細胞に発現させる。
[0009]細胞にsiRNAを発現させるための1つのアプローチは、siRNA遺伝子をウイルスベクターに挿入し、初代細胞に形質導入することを含む。ウイルス性遺伝子及び/又は細胞の遺伝子の組み合わせを標的とするベクターを基礎とした戦略は、RNAを基礎とした抗ウイルス治療に対する改良を提供する。CCR5、HIV−1コレセプターは、魅力的な標的候補を提供するが、CCR5におけるホモ接合体欠損が、ヒトの免疫機能におけるいかなる重い有害な効果なしにHIV−1からの保護を与える。ヒト細胞におけるHIV−1 revをサイレントするためのベクターを基礎とする戦略は、U6プロモータ系を用いて示されている(Paddison,P.I.,et al.,2002)。
[00010]VA1ベクターの基本的な設計は、Cagnon及びRossi,Antisense and Nucleic Acid Drug Development 10:251−261,2000に記載され、本明細書に参照として援用される。リボザイム発現のためのアデノウイルスnのVA1プロモータの使用は、米国特許第6,100,087(Rossiら)に記載され、本明細書に参照として援用される。
[00011]初代細胞におけるベクターを基礎とするsiRNA指向性遺伝子サイレンシングは、細胞株において見られるものよりも低く、これは、恐らくは初代細胞においてsiRNAの発現が低いか、又はサイレンシングの仕組みの効率がより低いためである。
[00012]初代細胞におけるサイレンシングRNAの発現及び効率を改良する戦略が必要とされる。戦略には、初代細胞において干渉RNA分子、及び部分的なsiRNAを発現するための代替的プロモータシステムが含まれる。本発明は、この必要性を追求する。
発明の概要
[00014]一側面において、本発明は、細胞、好ましくは哺乳動物細胞において、siRNA分子及びsiRNA前駆体分子を含む干渉RNA(RNAi)分子を発現するためのVA1 PolIIIプロモータシステム、及び好ましくはアデノウイルスのVA1プロモータシステムを提供する。このプロモータシステムの1つの利点は、VA1転写物が、RNAi関連酵素のダイサーが局在する細胞質に輸送されるものである。
[00014]一側面において、本発明は、細胞、好ましくは哺乳動物細胞において、siRNA分子及びsiRNA前駆体分子を含む干渉RNA(RNAi)分子を発現するためのVA1 PolIIIプロモータシステム、及び好ましくはアデノウイルスのVA1プロモータシステムを提供する。このプロモータシステムの1つの利点は、VA1転写物が、RNAi関連酵素のダイサーが局在する細胞質に輸送されるものである。
[00015]好ましい態様において、RNAi分子をコードする構築物は、VA1プロモータ遺伝子の非必須のステム領域に埋め込まれる。RNAi分子は、二本鎖RNAとして発現し、酵素ダイサーの基質として供給し得るshRNA又は他のsiRNA前駆体を含むことができ、該酵素ダイサーは、siRNAとして機能することができる約21−23のヌクレオチド二重鎖に該RNAを消化する。
[00016]別の好ましい態様において、VA1遺伝子は、初代細胞においてより高い発現レベル又は効率を提供することができる前駆体ミクロRNA(miRNA)をコードする構築物を含む。miRNA前駆体は、同様に、酵素ダイサーによって約21−24のヌクレオチドのsiRNAに処理される。より好ましい態様において、ヒトのmir−30及びlet−7a−3miRNAは、ヒト細胞におけるそれらのRNAi効果のために利用することができる。
[00017]別の側面では、本発明は、上述のアデノウイルスのVA1 PolIIIプロモータシステムを用いて哺乳動物細胞におけるRNAi分子を発現するための方法を提供する。この方法は、遺伝子発現及び/又は複製を阻害するために有用である。
[00018]さらなる側面では、本発明は、干渉RNA分子をコードする構築物を含有するVA1プロモータシステムを導入している哺乳動物細胞、好ましくは初代細胞を提供する。該構築物及びVA1プロモータ遺伝子は、好ましくは、操作的に連結される。
発明の詳細な説明
[00027]本発明において、RNAポリメラーゼIII(PolIII)を基礎としたアデノウイルスのVA1プロモータ遺伝子(例えば、図1A)は、哺乳動物細胞及び好ましくは初代細胞においてsiRNA及びsiRNA前駆体を含む干渉RNAの発現を調節するために使用される。
[00027]本発明において、RNAポリメラーゼIII(PolIII)を基礎としたアデノウイルスのVA1プロモータ遺伝子(例えば、図1A)は、哺乳動物細胞及び好ましくは初代細胞においてsiRNA及びsiRNA前駆体を含む干渉RNAの発現を調節するために使用される。
[00028]VA1 PolIIIプロモータは、2つのプロモータ調節要素を分離する配列における可変性を寛容することができる。サイレンシングRNAをコードする配列は、VA1遺伝子のコード領域、好ましくはステム−ループIV内に挿入され、サイレンシングRNAを効率的に転写し、天然のRNAの二次構造及び三次構造によって安定化させることができる。VA1転写物はまたサイレンシング複合体(RISC)やダイサーのような本質的なsiRNA機構成分が局在する細胞質に主に局在する。VA1 RNAとsiRNA機構成分の細胞質の同時局在は、siRNAを介したRNAiの効率を改善するものかもしれない。
[00029]好ましい態様において、miRNA前駆体は、VA1 RNAにクローニングするための適切なサイレンシングRNAであり、これは、該RNAが同様に約21−24のヌクレオチドsiRNAにダイサーによって処理されるためである(図2B)。多くのヒトのmiRNAのうち、自然の及び設計されたmir−30 miRNAがヒト細胞において標的mRNAの発現を阻害することができる(Zeng,Y.et al.,2002)。ヒトのmir−30及びlet−7a−3miRNA(mir−30に類似の構造を有する)は、ヒト細胞におけるそれらのRNAi効果のために、本目的に有用である。miRNA前駆体をコードする構築物は、rev又はCCR5 mRNAの二重鎖配列を含み、DNAフォワード及びリバースオリゴマーを用いるPCRによって設計され生産することができる。
[00030]VA1ベクターにクローニングする前に、設計したmir−30若しくはlet7のrev若しくはCCR5 miRNA前駆体構築物は、ダイサーに対する感受性を試験するために、DNAオリゴマーの鋳型及びT7メガショートスクリプトキット(Ambion)を用いてin vitroで転写することができる。5’末端でT7プロモーター配列を含む転写の鋳型を設計する。その後、T7転写したmiRNAは、ヒトのダイサーとともにインキュベートし、生産物をPAGEゲルで視覚化する。
[00031]ダイサーがiv vivoにおいてRNAiに関わるを決定するために、ダイサーの活性は、ダイサーsiRNAを用いてトランスフェクトした細胞から消耗させることができる。
[00032]好ましい態様において、rev及び/又はCCR5 mRNAに対して標的とされるsiRNAであるmiRNAは、BstEII部位を用いてVA1ベクターにクローニングされる(図2A)。構築物並びに対照の構築物は、pIND−rev−EGFP又はpIND−CCR−EGFP標的構築物を用いて293/EcR細胞に同時にトランスフェクトされる。阻害効率は、FACS及び蛍光顕微鏡イメージングを含むアッセイを用いてモニターされる。
[00033]miRNA−VA1構築物の細胞内局在は、in situハイブリダイゼーションを用いて調べることができる(Lee,N.S.,et al.,1999)。VA1カセット中の挿入物に相補的な修飾したCy3標識DNAプローブ、及び標的に相補的なFITC標識DNAプローブをこの目的のために使用することができる。細胞内配列に相補的な適切な対照(核小体に対するU3、核に対するU6、及び細胞質に対するtRNA lys)はまた、細胞内コンパートメントを確かめるために第三の蛍光色素と共に使用することができる。効果的なshRNA構築物の予備的な同定に続いて、該構築物は、ヒトCD34+細胞及びHIV−1でチャレンジしたT細胞に発現する。
[00034]siRNAに対する耐性は、HIV−1感染個体において起こり得るし、そして起こるであろう。この問題を回避するためには、ウイルスの異なる部位を標的とした複数のsiRNAを、好ましくは細胞のコレセプターCCR5に対して標的とされるsiRNAとともに、同時に発現するベクターを生産することが可能である。
[00035]遺伝子治療前に、抗HIV−1候補構築物を効率的に初代細胞又は休止期の幹細胞に形質導入する。候補構築物は、同時係属中の米国出願シリアル番号第10/365,643、2003年2月13日出願に記載される具体例のベクターにサブクローニングすることができ、本明細書に参考として援用される。候補構築物は、好ましくはレンチウイルスベクター、より好ましくはHIV7レンチウイルスベクターにサブクローニングされる。HIV7レンチウイルスベクターは、集積を増大させるためのHIV−1のポリプリントラクト、及びRNAの安定性を増大するためのウッドチャックの肝炎の翻訳後の制御因子(WCRE)を含む。5’LTRは、ウイルスRNAのリバース転写にその後に除去されるCMVプロモーターでベクターを置換される。最終の構築物において、PolIIIカセットは、ポリプリントラクトとRev応答要素(RRE)の下流であり、pHIV−7のCMVの上流に挿入される。EGFP遺伝子はまた選択マーカーを提供するためにベクターに挿入することが可能である。
[00036]好ましい態様において、VA1 miRNAを宿すベクターは、それらを、VSV Gタンパク質を発現するpCMV−G、HIV−1 Gag及びPolタンパク質を発現するpCHGP−2、及びpCMV−Revと一緒に同時にトランスフェクトすることによってパッケージ化される。CEM細胞は、初代細胞における構築物の発現前にそれらの発現レベルをプレスクリーニングするために使用される。トランスフェクトした293T細胞からの上清を用いて、CEM細胞をトランスフェクトし、VA1 miRNAを宿すレンチウイルスベクターの発現レベルをノーザンゲル解析を用いて解析する。
[00037]その後、形質導入物は、M−トロピックJRFL及びBaL、及びT−トロピックIIIB及びNL4−3のようなHIV−1のlab菌株で感染させる。ウイルスの複製物の懸濁液は、RT及びp24レベル、シンシチウム(syncytia)形成、及び生存率をモニターすることによって測定することができる。一度、構築物を適当に機能することを決定すれば、その後、例えば、Bauerら(Bauer,G.et al.,1997)のプロコルを用いて、初代CD34+細胞及びTリンパ球にそれらを形質導入される。形質導入した細胞は、その後、siRNA発現及び抗HIV1活性について評価される。
[00038]本発明は、さらに、下記の実施例を詳述し、例証の方法によって添付され、いかなる手法においても発明を制限することを意図しない。
実施例1
[00039]VA1−miRNA及びVA1−siRNAは、1)21−ntセンス、2)siRNA又はmiRNA(mir−30又はlet−7a−3)に対する4、8、又は9塩基ループ、3)HIV−1 rev標的(全体で約50−nt)に相補的な21−ntのアンチセンス鎖を含有することができる。不活性化の突然変異のmi−又はsi−RNA改変体を作製するために、ステム配列の中間の4−ntを標的に対して非相補的になるように変異させた。mi−又はsi−RNA配列を含むBstEII制限断片を合成オリゴヌクレオチドから調製し、それらの3’末端の相補配列の12塩基を共有する。これらをアニールし、Taqポリメラーゼ及びPCRの数ラウンドを用いてプライマー末端を伸長した。wt及びmt mi−又はsi−RNA配列をpVA1のBstEIIにクローニングした(図1A)。ループの配列は、4塩基ループ:TTAA[配列番号4]、8塩基ループ:GAAGCTTG[配列番号5](下線:HindIII部位)、及び9塩基ループ:TTCAAGAGA(配列番号6)である。
[00039]VA1−miRNA及びVA1−siRNAは、1)21−ntセンス、2)siRNA又はmiRNA(mir−30又はlet−7a−3)に対する4、8、又は9塩基ループ、3)HIV−1 rev標的(全体で約50−nt)に相補的な21−ntのアンチセンス鎖を含有することができる。不活性化の突然変異のmi−又はsi−RNA改変体を作製するために、ステム配列の中間の4−ntを標的に対して非相補的になるように変異させた。mi−又はsi−RNA配列を含むBstEII制限断片を合成オリゴヌクレオチドから調製し、それらの3’末端の相補配列の12塩基を共有する。これらをアニールし、Taqポリメラーゼ及びPCRの数ラウンドを用いてプライマー末端を伸長した。wt及びmt mi−又はsi−RNA配列をpVA1のBstEIIにクローニングした(図1A)。ループの配列は、4塩基ループ:TTAA[配列番号4]、8塩基ループ:GAAGCTTG[配列番号5](下線:HindIII部位)、及び9塩基ループ:TTCAAGAGA(配列番号6)である。
実施例2
[00040]rev部位IIを標的とするVA1−siRNA発現構築物は、rev−EGFP融合構築物で同時にトランスフェクトした(図3)。様々なVA1 shRNAキメラ構築物又はU6プロモータsiRNA発現構築物は、カチオン脂質を用いてヒト293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、RNAを細胞から単離し、6%の変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。RNAをナイロン膜に電気ブロットし、shRNA又はsiRNAのアンチセンス配列に相補的な32P標識した合成DNAオリゴヌクレオチドでハイブリダイズした。
[00040]rev部位IIを標的とするVA1−siRNA発現構築物は、rev−EGFP融合構築物で同時にトランスフェクトした(図3)。様々なVA1 shRNAキメラ構築物又はU6プロモータsiRNA発現構築物は、カチオン脂質を用いてヒト293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、RNAを細胞から単離し、6%の変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。RNAをナイロン膜に電気ブロットし、shRNA又はsiRNAのアンチセンス配列に相補的な32P標識した合成DNAオリゴヌクレオチドでハイブリダイズした。
実施例3
[00041]センス及びアンチセンス鎖のいくつか異なるループサイズ及び相対的な配向をヒト293細胞内にVA1−siRNA構築物とpNL4−3とを同時にトランスフェクトすることによって試験した。多様な構築物をコードするプラスミドをヒト293細胞にHIV−1のプロウイルスDNAで同時にトランスフェクトし、HIV−1 p24アッセイを指定した時間に採取したサンプルについて実行した。結果(図4)は、8塩基のループが中でも、機能性siRNAを生じることにおいて最も効果的であり、センス及びアンチセンス(#1及び#2)の相対的な配向がsiRNAの効率に影響を与えないようであることを示す。
[00041]センス及びアンチセンス鎖のいくつか異なるループサイズ及び相対的な配向をヒト293細胞内にVA1−siRNA構築物とpNL4−3とを同時にトランスフェクトすることによって試験した。多様な構築物をコードするプラスミドをヒト293細胞にHIV−1のプロウイルスDNAで同時にトランスフェクトし、HIV−1 p24アッセイを指定した時間に採取したサンプルについて実行した。結果(図4)は、8塩基のループが中でも、機能性siRNAを生じることにおいて最も効果的であり、センス及びアンチセンス(#1及び#2)の相対的な配向がsiRNAの効率に影響を与えないようであることを示す。
[00042]本発明の背景を明らかにし、本発明の実施に関する追加の詳細を提供するための本明細書で使用される刊行物やその他の材料は、各々が参照により本明細書により個別に援用されるかのように、本明細書に参照により援用される。
[00043]本発明が、その好ましい態様の詳細に言及することによって本特許出願に開示されてはいるが、本発明の意図及び添付の請求の範囲内において、変更が当業者に容易に生じるであろうことを予期されるため、その開示は限定的な意味というよりはむしろ例証される意味に意図されると理解されるべきである。
参考文献リスト
Claims (12)
- アデノウイルスのVA1プロモーター及び干渉RNA(RNAi)分子をコードする構築物を含有する発現カセット。
- RNAiをコードする構築物がプロモーターの非必須ステム領域内に含有される、請求項1に記載の発現カセット。
- 非必須ステム領域がBstEII部位を含有する、請求項2に記載の発現カセット。
- RNAiをコードする構築物がヘアピンsiRNA(shRNA)又はミクロRNA(miRNA)をコードする構築物である、請求項1に記載の発現カセット。
- RNAiをコードする構築物が約4ないし約9塩基を含有するループを含む、請求項1に記載の発現カセット。
- ループが約8塩基を含有する、請求項5に記載の発現カセット。
- 哺乳動物細胞において干渉RNA分子を発現する方法であって、アデノウイルスのVA1プロモーター配列に操作的に連結した干渉RNA分子をコードする構築物を前記哺乳動物細胞に導入することを含み、前記配列が該細胞において該構築物の発現を指向する、前記方法。
- 干渉RNA分子をコードする構築物が、ヘアピンsiRNA(shRNA)又はミクロRNA(miRNA)をコードする構築物である、請求項7に記載の方法。
- RNAiをコードする構築物が約4ないし約9塩基を含有するループを含む、請求項7に記載の方法。
- ループが約8塩基を含有する、請求項9に記載の方法。
- アデノウイルスのVA1プロモーターに操作的に連結した干渉RNA分子をコードする構築物が導入されている哺乳動物細胞。
- 哺乳動物細胞が初代細胞である、請求項11に記載の哺乳動物細胞。
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