CN115119509A - 用于抑制细胞因子风暴或炎症性疾病的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽及其用途 - Google Patents

Abstract

提供一种用于抑制细胞因子风暴或炎症性疾病的改善的细胞渗透性核转运抑制剂(iCP‑NI)，并且，由于细胞渗透性核转运抑制剂(CP‑NI，cSN50.1肽)中引入了基于治疗分子全身递送技术(TSDT)的改善的高级大分子转导域(aMTD)，从而改善了溶解性及稳定性。根据本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽基于显著的细胞渗透性，能更有效地阻断包括核因子κB(NF‑κB)在内的应激反应转录因子(SRTFs)介导的信号转导，从而可用作对细胞因子风暴或炎症性疾病优异的预防剂或治疗剂。

Description

用于抑制细胞因子风暴或炎症性疾病的改善的细胞渗透性核 转运抑制剂合成肽及其用途

技术领域

本发明涉及一种用于抑制细胞因子风暴(cytokine storm)或炎症性疾病(inflammatory disease)的改善的细胞渗透性核转运抑制剂(improved cell-permeablenuclear import inhibitor)(iCP-NI)合成肽，并且，由于细胞渗透性核输入抑制剂(CP-NI，cSN50.1肽)中引入基于治疗分子全身递送技术(therapeuticmolecule systemicdelivery technology，TSDT)的高级大分子转导域(advanced macromoleculetransduction domain，aMTD)，从而提高了溶解性和稳定性。根据本发明的改善的细胞渗透性核输入抑制剂合成肽基于显著的细胞渗透性更有效地阻断包括核因子κB(NF-κB)在内的应激反应转录因子(stress-responsive transcription factors)(SRTFs)介导的信号转导，从而可用作对细胞因子风暴或炎症性疾病优异的预防剂或治疗剂。

背景技术

炎症反应是指保护生物体免受微生物感染或外部损伤的防御机制。炎症的目的是早期抑制细胞损伤，从伤口中清除受损的组织和坏死细胞，同时启动组织再生。炎症本身并不是一种疾病，而是一种生命体所必需的自我防御体系(self-defense system)。然而，当身体的防御系统变得过度活跃时，因不受控制的免疫反应而产生一种被称为“细胞因子风暴”的现象。细胞因子风暴会在全身引起严重的炎症反应，结果导致血管扩张、发烧、肝脏释放急性期蛋白(acute phase proteins)、使白细胞募集到炎症灶(foci)，且在严重的情况下，可由于有低血压和器官衰竭(organ failure)而导致患者死亡。并且，已知过度的炎症和细胞因子风暴也是导致多种炎症性疾病的原因。

作为炎症性疾病之一的败血症(sepsis)是由细菌或病毒感染、严重的外伤等引起的症状，诸如来源于入侵身体的病原体的病原相关的分子模式(pathogen-associatedmolecule pattern)(PAMP)或来源于受损组织的损伤相关分子模式(damage-associatedmolecule pattern)(DAMP)之类的病因物质会诱发自我防御系统的过度激活，例如巨噬细胞及细胞因子风暴。这种过度的全身炎症反应诱发循环系统异常，因毛细血管渗漏引起的血管渗透性增加导致血压降低，并最终因全身各器官供血不足而诱发多器官功能衰竭(multiple organ failure)(MOF)。败血症是一种致死率约为30％的代表性的难治性疾病，全世界每年有2700万名患者。败血症是仅次于癌症和心脏病的世界第三大死因。因此，治疗败血症的目标应为通过抑制机体和细胞的炎症反应来阻断细胞因子风暴。

并且，2019年12月首次报告了作为冠状病毒疾病的致病病原体的重症急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)(SARS-CoV-2)。

2019年12月报告了COVID-19的病例后(Huang，C.等人，中国武汉市2019年新型冠状病毒感染患者的临床特征，柳叶刀，95，497-506(2020)(Huang，C.et al.Clinicalfeatures of patients infected with 2019novel coronavirus in Wuhan，China.Lancet 395，497-506(2020)))，随着使医疗系统不堪重负并需要侵入性外部通气(invasive external ventilation)的严重病例数量持续增加，SARS-CoV-2已成为一种全球大流行病(世界卫生组织冠状病毒病(COVID-2019)情况报告(World HealthOrganization.Coronavirus disease(COVID-2019)situation reports.See websitemade up of"https：//www."before"who.int/emergencies/disease/novel-coronavirus-2019/situation-reports")。尽管尚不清楚COVID-19患者会出现从无症状到严重疾病的各种临床结果的原因，但COVID-19病因及死亡率的显著特征是弥漫的炎症和造成急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的细胞因子释放综合征(CRS)(Mehta，P.et al.COVID-19：considercytokine storm syndromes and immunosuppression.Lancet 395，1033-1034(2020)；Qin，C.et al.Dysregulation of immune response in patients with COVID-19inWuhan，China.Clin.Infect.Dis.(2020))。事实表明，过度的免疫细胞浸润(immune cellinfiltration)肺部、细胞因子风暴及ARDS已被定义为密切相关的β-冠状病毒SARS-CoV感染的人类的重症疾病的特征。

另一方面，促炎信号的扩增依赖于有限数量的转录因子(包括核因子κB(NF-κB)、激活蛋白1(AP-1)、信号转导与转录激活因子(STAT))(在此被定义为应激反应转录因子，即SRTF)和活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells)(NFAT)，其中，所述活化T细胞核因子通过对基于模式识别受体(PRR)及促炎细胞因子受体而起始的信号进行响应来调节细胞因子及其他炎症性基因的表达。为了快速响应于炎症，先天免疫系统(innateimmune system)的细胞在非活性状态维持隔离在细胞质中的SRTFs的池(pool)。应激反应转录因子通过暴露核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)的磷酸化依赖性变化所激活，可以使蛋白质移至核中。核因子κB通过抑制蛋白质(IkB)的磷酸化而被激活；AP-1及STAT1/3通过磷酸化被激活，而活化NFAT1通过去磷酸化而被激活。

以往的研究测试了通过将SRTF核转运作为靶标来抑制炎症反应的可能性。基于每个转录因子的核定位序列被相同的转运衔接蛋白质输入蛋白-5α(Importin-5α)识别的事实，可简化操作。细胞渗透性肽(cSN50.1)是通过将足够数量的核定位序列传递到细胞中来合成，以竞争性地抑制所有四种应激反应转录因子的核输入并阻断脂多糖(LPS)依赖性的细胞因子基因表达的激活。进而，cSN50.1能够保护受到致死量的LPS及其他促炎作用剂攻击的小鼠。

发明内容

发明要解决的问题

本发明人为克服现有的细胞渗透性核转运抑制剂(CP-NI，cSN50.1肽)的局限性做出了巨大努力，其结果发现，细胞渗透性核转运抑制剂中引入基于治疗分子全身递送技术(therapeuticmolecule systemic delivery technology，TSDT)的高级大分子转导域(advanced macromolecule transduction domain，aMTD)时可提高溶解性及稳定性，从而完成了本发明。

用于解决问题的手段

本发明的目的在于，提供一种用于抑制细胞因子风暴或炎症性疾病的改善的细胞渗透性核转运抑制剂(iCP-NI)合成肽，iCP-NI合成肽包括NF-κB核定位序列及高级大分子转导域，上述NF-κB核定位序列包括SEQ ID NO.1的氨基酸序列，上述高级大分子转导域包括选自由SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.6组成的组中的氨基酸序列。根据本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽与输入蛋白α(impotinα)结合，抑制包括NF-κB的应激反应转录因子(stress-responsive transcription factor，SRTF)的核内移动，从而可以提前防止细胞因子风暴的发生。

本发明的另一目的在于，提供一种包含改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽的用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物。

本发明另一目的在于，提供一种细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法，包括将包含NF-κB核定位序列及高级大分子转导域的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽给药(施用)于对象体的步骤。

发明的效果

根据本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂(iCP-NI)合成肽基于优异的细胞渗透性，能更有效地阻断包括NF-κB的应激反应转录因子介导的信号转导，因此，iCP-NI合成肽可用作对细胞因子风暴或炎症性疾病的优异的预防剂或治疗剂。

附图说明

图1为示出aMTDs-NLSs肽对于脂多糖/D-半乳糖胺(LPS/D-Gal)急性肝损伤模型的存活率的效果。

图2为示出线状(lNLS)或环状(cNLS)形态的单独的核定位序列对于脂多糖/D-半乳糖胺急性肝损伤模型的存活率的影响。

图3为示出aMTD827-cNLS对于脂多糖/D-半乳糖胺急性肝损伤模型的存活率的静脉内(IV)或腹腔内(IP)给药效果。

图4为示出cSN50.1肽对于脂多糖/D-半乳糖胺急性肝损伤模型的存活率的效果。

图5为示出iCP-NI对于脂多糖/D-半乳糖胺急性肝损伤模型的存活率的治疗效果。

图6为示出iCP-NI在25℃温度具有3个月以上的稳定性。

图7为通过表面等离子共振(surface plasmon resonance)评估所示的Improtin-a5对于iCP-NI的结合的能力。

图8示出了在培养的RAW264.7细胞中的与异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)结合的iCP-NI的流式细胞术分析结果。

图9为示出FITC-iCP-NI在肺、脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏中的分布。

图10为示出FITC-iCP-NI在肺组织中的药代动力学(pharmacokinetic)。

图11为通过核和细胞质级分的蛋白质印迹分析(Western Blot analysis)示出iCP-NI对NF-κB、AP-1及STAT3的核内迁移的影响。

图12为通过免疫染色示出iCP-NI对NF-κB、AP-1及STAT3的核内迁移抑制效果。

图13为通过核及细胞质级分的蛋白质印迹分析示出iCP-NI对NF-κB、STAT1/3、AP-1及NFAT的核内迁移抑制效果。

图14为通过免疫染色示出iCP-NI对NF-κB、STAT1/3、AP-1及NFAT的核内迁移抑制效果。

图15为示出iCP-NI对于脂多糖/D-半乳糖胺急性肝损伤模型的存活率的效果。

图16为示出iCP-NI对于肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及白细胞介素-10(IL-10)的表达的效果。

图17为示出iCP-NI对于肝损伤及大规模肝细胞凋亡(apoptosis)的效果。

图18为示出iCP-NI对于脂多糖/聚肌胞苷酸(LPS/Poly I：C)诱导肺炎模型的存活率的影响。

图19为示出iCP-NI对于脂多糖/聚肌胞苷酸诱导肺炎模型的肺组织学的效果。

图20为示出iCP-NI对于肺泡损伤程度的效果。

图21为示出iCP-NI对于盲肠结扎穿孔(CLP)诱导腹膜炎模型的存活率的影响。

图22为示出iCP-NI对于盲肠浆料(CS)诱导腹膜炎模型的存活率的影响。

图23为示出iCP-NI对于脂多糖吸入诱导急性肺炎模型的肺组织学的效果。

图24为示出iCP-NI对于聚肌胞苷酸吸入诱导急性肺炎模型的肺组织学的效果。

图25为示出iCP-NI对于脂多糖吸入诱导急性肺炎模型的支气管肺泡灌洗液(BALF)的细胞数量的效果。

图26为示出iCP-NI对于聚肌胞苷酸吸入诱导急性肺炎模型的肺组织中的促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokines)(白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1))的抑制效果。

图27为示出iCP-NI对于被脂多糖/聚肌胞苷酸刺激的RAW264.7细胞中的促炎细胞因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β)抑制效果。

图28为示出iCP-NI对于聚肌胞苷酸/链球菌肠毒素B(Poly I：C/SEB)全身炎症模型的肝脏和脾脏的嗜中性粒细胞浸润(infiltration)及嗜中性粒细胞数量的效果。

图29为示出iCP-NI对于聚肌胞苷酸/链球菌肠毒素B全身炎症模型的肺的肺泡体积的效果。

图30为示出iCP-NI对细胞凋亡脾细胞(apoptotic splenocyte)的效果。

图31为通过微计算机断层扫描(CT)示出iCP-NI对肺纤维症小鼠博来霉素(BLM)诱导模型的效果。

图32为示出iCP-NI对于肺纤维症小鼠博来霉素(BLM)诱导模型的效果。

图33为示出iCP-NI对于被SARS-CoV-2感染的猴子模型的O₂饱和度、呼吸率、心率及体温的效果。

图34为示出iCP-NI对于血浆的干扰素-γ(IFN-γ)及支气管肺泡灌洗液(Balf)的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的水平的效果。

图35为示出iCP-NI对于被SARS-CoV-2感染的猴子模型的病毒滴度(viraltilter)的效果。

图36为示出iCP-NI对于被SARS-CoV-2感染的猴子模型的肺中的免疫细胞浸润、增殖、出血及纤维症的效果。

具体实施方式

以下，将详细说明根据本发明具体实施例的用于抑制细胞因子风暴或炎症性疾病的改善的细胞渗透性核输入抑制剂合成肽、包含NF-κB核定位序列及aMTD的改善的细胞渗透性核输入抑制剂合成肽、用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物、包含改善的细胞渗透性核输入抑制剂(improved cell-permeable nuclear importinhibitor)合成肽的药学组合物及细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法。但是，这些只用于示例实施例，本发明的范围并不限于此。对于本领域技术人员而言，在本发明的范围内可以对各种实施例进行修改是显而易见的。

除非在本说明书中另有说明，否则术语“包含(include)”或“包括(comprise)”是指包括结构(或要素)，不能解释为排出其他结构(或要素)的添加。

本发明中使用的术语“氨基酸”作为最宽泛的含义包括天然存在的L-α-氨基酸或其残基以及D-氨基酸及化学修饰的氨基酸。例如，氨基酸可包括前述的氨基酸的模仿物及类似物。在本公开中，模仿物及类似物可包括功能性等效物。

本发明中使用的术语“炎症”通常是身体组织对异物或有害刺激物侵入宿主的局部保护反应的结果。这种炎症的原因可包括：细菌、病毒、寄生虫等感染原因；烧伤或辐射等物理原因；毒素、药物或工业试剂等化学物质；或过敏及自身免疫反应等免疫反应；或与氧化应激相关的异常状态。

本发明中使用的术语“预防”是指通过施用根据本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽(cell-permeable nuclear import inhibitor syntehtic peptide)来抑制或延迟细胞因子风暴或炎症性疾病的发生的所有作用，并且，“治疗”是指通过施用根据本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽来使细胞因子风暴或炎症性疾病的症状好转或使向好方向改变的所有作用。

本发明中使用的“给药”是指以任何合适的方式向对象体提供本发明的预定的药学组合物。

本发明中使用的术语“对象体”是指已经发生或可能发生细胞因子风暴或炎症性疾病的包括人在内的所有动物。动物不仅包括人类，而且还可包括牛、马、羊、猪、山羊、骆驼、羚羊、狗或猫，但不限于此。

根据第一实施例，本发明提供一种用于抑制细胞因子风暴或炎症性疾病的改善的细胞渗透性核转运抑制剂(iCP-NI)合成肽，所述改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽包含NF-κB核定位序列(NLS)及aMTD。

针对于本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽，NF-κB核定位序列可以是线状NF-κB核定位序列及具有2个额外半胱氨酸的环状核定位序列。针对于本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽，环状NF-κB核定位序列可包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列。

就本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽而言，aMTD可包含选自由SEQID NO.2至SEQ ID NO.6组成的组中的氨基酸序列。

针对于本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽，改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽可抑制应激反应转录因子(SRTFs)的核转运。

例如，应激反应转录因子可以是核因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)、活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)、激活蛋白1(activatorprotein 1，AP1)、信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator oftranscription 1，STAT1)或核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-relatedfactor 2，Nrf2)。

与本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽相关地，细胞因子风暴可诱发自身免疫疾病(autoimmune disease)、移植排斥(graft rejection)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、胰腺炎(pancreatitis)、急性支气管炎(acute bronchitis)、慢性支气管炎(chronic bronchitis)、急性细支气管炎(acute bronchiolitis)、慢性细支气管炎(chronic bronchiolitis)、败血症(sepsis)、败血性休克(septic shock)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome)、多器官功能衰竭(multiple organfailure)或慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease)。例如，自身免疫性疾病可包括类风湿关节炎(rheumatoid arthritis)、牛皮癣(psoriasis)、特异反应性皮炎(atopic dermatitis)、克罗恩病(crohn’s disease)、炎症性肠病(inflammatory boweldisease)、舍格林氏综合征(Sjorgen’s syndrome)、视神经炎(optic neuritis)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease)、哮喘(asthma)、I型糖尿病(type Idiabetes)、视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)、肌无力症(Myasthenia Gavis)、葡萄膜炎(uveitis)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、牛皮癣性关节炎(psoriatic arthritis)、格雷夫斯氏病(Gaves’disease)及过敏(allergy)，但不限于此。

根据第二实施例，本发明提供一种包含改善的细胞渗透性核转运抑制剂(iCP-NI)合成肽的用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物，其中，所述改善的细胞渗透性核转运抑制剂(iCP-NI)合成肽包含NF-κB核定位序列及aMTD。

就用于预防或治疗根据本发明的细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物而言，NF-κB核定位序列可以是线状NF-κB核定位序列及具有2个额外半胱氨酸的环状核定位序列。

就根据本发明的用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物而言，环状NF-κB核定位序列可包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列。

就根据本发明的用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物而言，aMTD可包含选自由SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.6组成的组中的氨基酸序列。

就根据本发明的用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物而言，改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽可以抑制应激反应转录因子(SRTF)的核转运。例如，应激反应转录因子可以是核因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)、活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)、激活蛋白1(activator protein 1，AP1)、信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription1，STAT1)或核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)。

与根据本发明的用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物相关地，细胞因子风暴或炎症性疾病可以是由病毒、细菌，霉菌或寄生虫引起的炎症性感染诱发所致。炎症性感染可以是由病毒、细菌、真菌或寄生虫诱发所致。例如，病毒可包括冠状病毒(coronavirus)、流感病毒(influenza virus)、汉坦病毒(Hantavirus)、黄病毒(flavivirus)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、人体免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)，逆转录病毒(retrovirus)或天花病毒(variola virus)，但不限于此。冠状病毒可以是重症急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。细菌感染可包括菌血症(bacteremia)、细菌性败血症(bacterial sepsis)、肺炎(pneumonia)、蜂窝织炎(cellulitis)、脑膜炎(meningitis)、丹毒(erysipelas)、感染性心内膜炎(infective endocarditis)、坏死性筋膜炎(necrotizing fasciitis)、前列腺炎(prostatitis)、假膜性结肠炎(pseudomembranous colitis)、肾盂肾炎(pyelonephritis)或败血性关节炎(septic arthritis)，但不限于此。细菌感染可以是由土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、链球菌(Streptococcus spp.)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、梭状菌(Clostridium spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、分枝杆菌(Mycobacterium spp.)或嗜血杆菌(Haemophilus spp.)引起，但不限于此。上述真菌可包括曲霉(Aspergillis)、白假丝酵母(Candida albicans)或新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)，但不限于此。上述寄生虫可包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)等疟疾寄生虫，但不限于此。

就根据本发明的用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物而言，上述细胞因子风暴或炎症性疾病可以是由外伤、伤害、烧伤、毒素或致癌物质诱发所致。毒素包括脂多糖诱导毒素(lipopolysaccharide-induced toxins)、超抗原诱导毒素(superantigen-induced toxins)(如：由葡萄球菌肠毒素A或B(Staphylococcalenterotoxin A or B)、链球菌致热毒素(streptococcal pyrogenic toxin)及M蛋白质(Mprotein)、或细菌生成的所有超抗原)、植物毒素(plant toxins)(如：毒藤(poison ivy))、镍(nickel)、乳胶(latex)、环境毒素(environmental toxins)(如：毒物(poisons))或过敏，但不限于此。

就根据本发明的用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物而言，细胞因子风暴可诱发炎症性疾病，例如，自身免疫性疾病、移植排斥、多发性硬化症、胰腺炎、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性细支气管炎、慢性细支气管炎、败血症、败血性休克、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭或慢性阻塞性肺病等。例如，自身免疫性疾病可包括类风湿关节炎、牛皮癣、特异反应性皮炎、克罗恩病、炎症性肠病、舍格林氏综合征、视神经炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、I型糖尿病、视神经脊髓炎、肌无力症、葡萄膜炎、格林-巴利综合征、牛皮癣性关节炎、格雷夫斯氏病及过敏，但不限于此。就根据本发明的用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物而言，药学组合物还可包含抗生素(antibiotic)、抗病毒剂(anti-viral agent)(例如，瑞德西韦(remdesivir))、抗HIV剂(anti-HIV agent)、抗寄生虫剂(anti-parasite agent)、抗原虫剂(anti-protozoalagent)、甾体类制剂(steroidal agent)、甾体类抗炎剂或非甾体类抗炎剂(steroidal ornon-steroidal anti-inflammatory agent)、抗组胺剂(antihistamine)(例如，苯海拉明(diphenhydramine))、免疫抑制剂(immunosuppressant agent)或其组合。例如，抗生素包括头孢菌素类(cephalosporin series)、β-内酰胺类(beta-lactam series)、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂类(beta-lactam/beta-lactamase inhibitor series)、喹诺酮类(quinolone series)、糖肽类(glycopeptide series)、碳青霉烯类(carbapenem series)、氨基糖苷类(aminoglycoside series)、大环内酯类(macrolide series)、磺胺类(sulfadrug series)、氨曲南(aztreonam)、克林霉素(clindamycin)、替加环素(tigecycline)、多粘菌素E甲磺酸钠(colistin sodium methanesulfonate)、甲硝唑(metronidazole)、螺旋霉素(spiramycin)或其组合，但不限于此。头孢菌素类抗生素可包括头孢唑啉(cefazolin)、头孢卡品酯(cefcapene pivoxil)、头孢泊肟酯(cefpodoxime proxetil)、头孢拉定(cephradine)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢米诺(cefminox)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢匹罗(cefpirome)、头孢克肟(cefixime)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢地尼(cefdinir)、头孢沙定(cefroxadine)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢他美酯(cefetamet pivoxil)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢孟多酯钠(cefamandole nafate)、头孢西酮(cefazedone)、头孢特仑酯(cefteram pivoxil)、头孢替唑(ceftezole)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢替坦(cefotetan)、头孢甲肟(cefmenoxime)、头孢托仑匹酯(cefditoren pivoxil)、头孢曲嗪丙二醇(cefatrizine proplyeneglycol)、头孢替安(cefotiam)、盐酸头孢替安酯(cefotiam hexetil HCl)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢克洛(cefaclor)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢地嗪(cefodizime)、头孢尼西(cefonicid)、头孢美唑(cefmetazole)或头孢吡肟(cefepime)。β-内酰胺类抗生素可包括乙氧萘青霉素(nafcillin)、氧哌嗪青霉素(piperacillin)或氨苄青霉素(ampicillin)。β-内酰胺酶抑制剂类抗生素可包括舒巴坦(sulbactam)、他唑巴坦(tazobactam)、托西酸舒他西林(sultamicillintosylate)、阿莫西林(amoxicillin)、克拉维酸钾(potassiumclavulanate)、替卡西林(ticarcillin)或舒巴坦匹酯(pivoxil sulbactam)。喹诺酮类抗生素可包括环丙沙星(ciprofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)或洛美沙星(lomefloxacin)。糖肽类抗生素可包括万古霉素(vancomycin)、利奈唑胺(linezolid)或替考拉宁(teicoplanin)。碳青霉烯类抗生素可包括美罗培南(meropenem)、多利培南一水合物(doripenem monohydrate)、西司他丁(cilastatin)或亚胺培南一水合物(imipenem monohydrate)。氨基糖苷类抗生素可包括阿米卡星(amikacin)、妥布霉素(tobramycin)、奈替米星(netilmicin)、西索米星(sisomicin)、异帕米星(isepamicin)、磷霉素(Fosfomycin)或庆大霉素(gentamicin)。大环内酯类抗生素可包括克拉霉素(clarithromycin)、罗红霉素(roxithromycin)或阿奇霉素(azithromycin)。磺胺类抗生素可包括磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)或甲氧苄啶(trimethoprim)。

本发明的药学组合物还可包括常用的合适的载体、赋形剂(excipient)或稀释剂(diluent)。可包括在本发明的药学组合物中的载体、赋形剂或稀释剂可包括乳糖(lactose)、葡萄糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨糖醇(sorbitol)、甘露糖醇(mannitol)、木糖醇(xylitol)、赤藓糖醇(erythritol)、麦芽糖醇(maltitol)、淀粉(starch)、阿拉伯胶(acacia rubber)、海藻酸盐(alginate)、明胶(gelatin)、磷酸钙(calcium phosphate)、硅酸钙(calcium silicate)、纤维素(cellulose)、甲基纤维素(methyl cellulose)、微晶纤维素(microcrystalline cellulose)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、水、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石(talc)、硬脂酸镁(magnesium stearate)或矿物油(mineral oil)，但不限于此。

本发明的药学组合物可以根据常规方法以口服或非经胃肠道剂型来进行给药，当剂型化时可使用常用的稀释剂或赋形剂，如填充剂(fillers)、增量剂(extenders)、结合剂(binders)、润湿剂(wetting agents)、崩解剂(disintegrants)、表面活性剂(surfactants)等。用于口服给药的固体制剂具有片剂(tablets)、丸剂(pills)、散剂(powders)、颗粒剂(granules)、胶囊剂(capsules)等，这些固体制剂通过在组合物中混合至少一种赋形剂来制备，例如，淀粉(starch)、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖、乳糖、明胶等。除了简单的赋形剂以外，还可使用硬脂酸镁(magnesium stearate)及滑石等润滑剂。用于口服给药的液剂包括悬浮液(suspensions)、内服液剂(liquid solutions forinternal use)、乳剂(emulsions)、糖浆(syrups)等。除了常用的作为简单稀释剂的水及液体石蜡(liquid paraffin)以外，还可包括各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂(sweeteningagents)、香料(fragrances)、防腐剂(preservatives)等。用于非经胃肠道给药的制剂包括灭菌水溶液(sterile aqueous solutions)、非水溶剂(non-aqueous solvents)、悬浮液、乳剂、冷冻干燥制剂(lyophilized formulations)及栓剂(suppositories)。非水溶剂及悬浮液可使用植物油(vegetable oil)(如丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、橄榄油(olive oil))、可注射的酯(injectable ester)(油酸乙酯(ethyl oleate))等。作为栓剂的基质可使用半合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇(macrogol)、吐温61(tween 61)、可可脂(cacao butter)、月桂酸甘油酯(laurin butter)、甘油明胶(glycerogelatin)等，但不限于此。

本发明的药学组合物的优选的给药量可根据个人的状态及体重、疾病的严重程度、药物的种类、给药途径及时间而不同，本领域技术人员可以适当地进行选择。为了获得优选的效果，本发明的药学组合物可以以每天0.001mg/kg至1000mg/kg的用量进行给药。给药可以每天进行一次，也可以分几次进行给药。上述给药量在任何方面都不限制本公开内容的范围。

根据第三实现例，本发明提供一种细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法，包括将包含NF-κB核定位序列(NLS)及aMTD的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽给药于对象体的步骤。

就根据本发明的细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法而言，NF-κB核定位序列可以是线状NF-κB核定位序列及具有2个额外半胱氨酸的环状核定位序列。

就根据本发明的细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法而言，环状NF-κB核定位序列可包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列。

就根据本发明的细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法而言，aMTD可包含选自由SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.6组成的组中的氨基酸序列。

就根据本发明的细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法而言，改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽可抑制应激反应转录因子(SRTF)的核转运。应激反应转录因子可以是核因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB)、活化T细胞核因子(nuclear factor ofactivated T cells，NFAT)、激活蛋白1(activator protein1，AP1)、信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)或核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)。

就根据本发明的细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法而言，改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽可以与抗生物质(antibiotic)、抗病毒剂(anti-viral agent)(如：瑞德西韦(remdesivir))、抗HIV剂(anti-HIV agent)、驱虫药(anti-parasiteagent)、抗原虫剂(anti-protozoal agent)、甾体类制剂(steroidal agent)、甾体类或非甾体类消炎药(steroidal or non-steroidal anti-inflammatory agent)、抗组胺剂(antihistamine)(如：苯海拉明(diphenhydramine))、免疫抑制剂(immunosuppressantagent)或其组合进行联合给药(co-administed)。例如，抗生素可包括头孢菌素类(cephalosporin series)、β-内酰胺类(beta-lactam series)、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂类(beta-lactam/beta-lactamase inhibitor series)、喹诺酮类(quinolone series)、糖肽类(glycopeptide series)、碳青霉烯类(carbapenem series)、氨基糖苷类(aminoglycoside series)、大环内酯类(macrolide series)、磺胺类(sulfa drugseries)、氨曲南(aztreonam)、克林霉素(clindamycin)、替加环素(tigecycline)、多粘菌素E甲磺酸钠(colistin sodiummethanesulfonate)、甲硝唑(metronidazole)、螺旋霉素(spiramycin)或其组合，但不限于此。

就根据本发明的细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法而言，给药可包括静脉内(intravenous)、非经胃肠道(parenteral)、经皮(transdermal)、皮下(subcutaneous)、肌肉内(intramuscular)、颅内(intracranial)、眼眶内(intraorbital)、眼内(intraocular)、脑室内(intraventricular)、被膜内(intracapsular)、鞘内(intrathecal)、脑池内(intracisternal)、腹腔内(intraperitoneal)、鼻腔内(intranasal)、直肠内(intrarectal)、阴道内(intravaginal)、喷雾(spraying)或口服(oral)给药。

就根据本发明的细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法而言，细胞因子风暴可以是由病毒、细菌、真菌或寄生虫引起的炎症感染诱发所致。

就根据本发明的细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法而言，细胞因子风暴或炎症性疾病可以是由外伤、受伤、烧伤、毒素或致癌物质诱发所致。

就根据本发明的细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法而言，炎症性疾病可包括自身免疫性疾病、移植排斥、多发性硬化症、胰腺炎、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性细支气管炎、慢性细支气管炎、败血症、败血性休克、急性呼吸系统障碍综合征、多器官功能衰竭或慢性阻塞性肺疾病。例如，自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、牛皮癣、特异反应性皮炎、克罗恩病、炎症性肠病、舍格林氏综合征、视神经炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、I型糖尿病、视神经脊髓炎、肌无力症、葡萄膜炎、格林-巴利综合征、牛皮癣性关节炎、格雷夫斯氏病及过敏，但不限于此。

具体实施例

以下，通过实施例及实验例进一步详细说明本发明。但是，下述实施例及实验例用于示例本发明，本发明的内容不限于下述实施例及实验例。

<实施例>

1.利用反相高效液相色谱(reversed-phase high-pressure liquidchromatography，RP-HPLC)验证稳定性

使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)验证了iCP-NI的稳定性。测量并比较了在两种不同条件下保管的iCP-NI的吸光度：1)以冷冻干燥粉末形式在25℃温度保管3个月；2)以冷冻干燥粉末在-20℃温度保管。将各条件下的1mg的iCP-NI冷冻干燥粉末溶解于1mL的高效液相色谱(HPLC)级水中，并将溶液通过0.2μm的微孔针头式过滤器(pore syringe filter)(东洋(ADVANTEC)，型号：13HP020AN)过滤。将50μL的iCP-NI注入到反相柱(reversed-phase-column)(25cm×4.6mm，HRC-ODS；岛津(SHIMADZU)，型号：228-23463-92)。条件如下：缓冲液A；蒸馏水及缓冲液B中的0.05％的三氟乙酸(TFA)；乙腈中的0.05％的三氟乙酸(TFA)。针对于色谱，在35℃温度以1mL/分钟的流速并适用0～100％缓冲液B的梯度进行了60分钟。通过在230nm处测量吸光度来监测峰。使用安捷伦OpenLAB控制面板软件(AgilentOpen LAB Control Panel Software)导出并分析色谱图。

2.利用表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)测量结合亲和力

为了确认iCP-NI与输入蛋白-5α(Importin-5α)之间的直接相互作用，进行了表面等离子共振(SPR)。思拓凡(Cytiva)的Biacore T200装置用于运输(carry)表面等离子共振(SPR)。在所有实验中，温度固定在25℃。运行缓冲液(Running buffer)以如下所示的方式通过双蒸馏水(double-distilled water)(DW)准备：25mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、100mM的NaCl、0.05％的表面活性剂P20、pH 7.5。流动系统(flow system)在开始实验前被填充(priming)了3次。所有实验使用了CM5传感器芯片(思拓凡(Cytiva)，BR100530，10285242)。在使用α5固定之前，注入三次运行缓冲液来冲洗了CM5传感器芯片表面。在CM5传感器芯片中注入输入蛋白-5α(Importin-5α)来实现了1900RU的Rmax值。将稀释的浓度(介于10μM、25μM、50μM、75μM及100μM之间)的iCP-NI以30μL/分钟的速度注入至CM5传感器芯片，共注入180秒种。CM5传感器芯片表面再生(regeneration)使用100mM的NaOH(60秒钟，以30μL/分钟)来执行。比较每个实验前后的基准反应值，对表面再生效果进行了评估。在将iCP-NI与输入蛋白-5α(Importin-5α)之间的亲和力测量完成后，使用Biacore T200评估软件3.1(Biacore T200 Evaluation Software 3.1)计算了解离常数(KD)。

3.iCP-NI的药代动力学分析及分布

为了评估iCP-NI在肺中的药代动力学，对6～8周龄的C57BL/6小鼠静脉内施用100mg/kg的与异硫氰酸荧光素(FITC)结合的iCP-NI。然后，在不同的时间点处死小鼠并获得肺组织，用于药代动力学分析。并且，收集不同的组织(大脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、小肠/大肠和胰腺)用于iCP-NI分析。代表性的肺组织标本施用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)(PFA；生物世界(BIOSESANG)，型号：PC2031-100-00)灌注固定，并在4℃温度于30％的蔗糖溶液中过夜培养。然后，将标本包埋在最佳切割温度(OCT)化合物(徕卡病理系统(Leica Biosystems)，型号：3801480)，并在显微镜下以10μm的厚度冷冻切片至载玻片上。冷冻切片样品用磷酸盐缓冲液(PBS)彻底洗涤，并与氯化铵(NH₄Cl，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，型号：A9434)溶液在室温(room temperature)(RT)一起孵育20分钟。将样品封固在含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)封固溶液(英杰(Invitrogen)，型号：00-4959-52)，并在荧光显微镜下使用共聚焦激光扫描显微镜系统(徕卡SP8(Leica SP8))进行可视化，并使用徕卡LAS×(Leica LAS X)软件处理图像。

4.细胞培养体系

鼠(murine)巨噬细胞细胞株(RAW264.7)、鼠树突状细胞株(DC2.4)、人单核细胞株(THP-1)及人肺泡上皮细胞株(A549)购自韩国细胞株银行(KCLB)，人T淋巴细胞(Jurkat Tcell，E6-1)购自美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection，ATCC)。将RAW264.7细胞维持在含10％的胎牛血清及1％的青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)(海克隆(Hyclone)，型号：SV30010)的达尔伯克(Dulbecco)的改良伊格尔(Eagle)培养基(DMEM)。DC2.4、THP-1、Jurkat T及A549细胞培养于含10％的胎牛血清及1％的青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基(海克隆，型号：SH30255.01)。所有细胞均维持在37℃、5％的CO₂的加湿环境下的培养箱中。

5.小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的分离

小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)分离自8周龄的C57BL/6J小鼠的骨髓(BM)。BM细胞取自小鼠的大腿骨及胫骨，并使用无血清DMEM培养基冲洗。然后，单细胞悬浮液通过尼龙细胞过滤网(nylon cell strainer)(70-μm的尼龙网(Nylon mesh))过滤并用汉克斯平衡盐溶液(HBSS)培养基洗涤两次。对细胞进行离心(200×g，5分钟)并吸出上清液。将细胞在室温下使用红细胞裂解缓冲液(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，型号(Cat NO)：R7757)裂解3分钟，并使用含血清的DMEM培养基稀释裂解缓冲液来阻断反应。对细胞进行离心(200×g，5分钟)并弃去上清液。细胞在完全的BMDM培养基[含有10％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素的DMEM，其中，青霉素-链霉素中补充有50ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(派普泰克(Peprotech)，型号：315-02)]中于12-孔组织培养板(1×10⁶细胞/孔)中培养，并保持在37℃及5％的CO₂的湿润的培养箱中。在第一天和第三天，更换培养基，第五天分化的BMDM发生附着，将其用于实验。

6.细胞刺激、激活及转染

所有细胞使用脂多糖(西格玛奥德里奇，型号：L3012)、人干扰素-γ(安迪系统(R&D Systems))，型号：285-IF)、小鼠干扰素-γ(安迪系统，型号：485-MI-100)、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol myristate acetate)(PMA；西格玛奥德里奇，型号：P1585)、离子霉素(ionomycin)(西格玛奥德里奇，型号：I0634)及聚肌胞苷酸(Poly I：C)(西格玛奥德里奇，型号：P1530)进行刺激。每个实验的激活方案和激活时间点示于各个附图。为了聚肌胞苷酸(Poly I：C)的细胞内递送，根据制造商的指南使用脂质体3000(lipofectamine3000)(赛默飞世尔(Thermo Scientific)，型号：L3000-015)并用聚肌胞苷酸转染RAW264.7细胞。

7.动物系统

雄性C57BL/6小鼠(6～8周龄)购自Nara-Biotech及Samtako，所有动物实验均按照国家指南中的对于机构的建议事项来进行实验动物的管理和使用。所有方案均获得Cellivery实验室动物资源研究所的机构动物管理和使用委员会(IACUC；核准编号(Approval No.)：CV-2019-32)的批准。

8.脂多糖/D-半乳糖胺诱发急性肝损伤模型

脂多糖及D-半乳糖胺(D-galactosamine)(西格玛奥德里奇，型号：G0500)用于急性肝损伤小鼠模型。对雄性C57BL/6(6周龄)小鼠通过静脉注射给药磷酸盐缓冲液(PBS)(100μL/小鼠)或iCP-NI(50mg/kg，100μL/小鼠)。1小时后，对个别小鼠腹腔内注射脂多糖(200μL中50μg/kg)及D-半乳糖胺(200μL中400mg/kg)。对脂多糖/D-半乳糖胺诱发小鼠在每个时间点静脉注射(I.V.)磷酸盐缓冲液(100μL/小鼠)或iCP-NI(100μL/小鼠)。个别图例中示出的特定方案。监测所有动物，并在脂多糖/D-半乳糖胺诱发后16小时处死小鼠。

9.毒素吸入诱发急性肺炎模型

对雄性C57BL/6(6～8周龄)小鼠通过静脉注射给药磷酸盐缓冲溶液(100μL/小鼠)或iCP-NI(50mg/kg，100μL/小鼠)。使用喷雾器(欧姆龙(Omron)，型号：NE-U22)通过吸入方式对注射磷酸盐缓冲溶液或iCP-NI的小鼠给药脂多糖或聚肌胞苷酸。所有小鼠都以吸入脂多糖(0.5mg/mL，7mL)或聚肌胞苷酸(1mg/mL，5mL)的方式在定制的亚克力笼中放置30分钟。然后，如个别图例中所示，在完成吸入后通过尾静脉注射给药iCP-NI。

10.IT脂多糖/聚肌胞苷酸小鼠模型

雄性C57BL/6小鼠(6～8周龄)使用异氟醚(isoflurane)麻醉，将脂多糖和聚肌胞苷酸均通过气管内给药的方式进行给药。对正常动物仅提供50μL的磷酸盐缓冲溶液。将脂多糖溶解于磷酸盐缓冲溶液，并以10mg/kg的量施用脂多糖(50μL/小鼠)。4小时后，用异氟醚麻醉脂多糖致敏小鼠(LPS-sensitized mice)，气管内注射50mg/kg的聚肌胞苷酸(100μL/小鼠)。脂多糖/聚肌胞苷酸-诱发的小鼠被随机分配到两个不同的组。处理组具体如下：(1)I.T脂多糖/聚肌胞苷酸，磷酸盐缓冲溶液，38只动物；(2)I.T脂多糖/聚肌胞苷酸，iCP-NI，25只。注入聚肌胞苷酸后，给小鼠在4小时、16小时、28小时及52小时通过静脉注入磷酸盐缓冲溶液(100μL/小鼠)或iCP-NI(30mg/kg，100μL/小鼠)进行给药处理。

11.盲肠浆料诱导腹膜炎模型(Cecal slurry-induced peritonitis model)

使用盲肠浆料(CS)诱发的腹膜炎模型(1-3)研究了复数菌败血症(Polymicrobialsepsis)。8周龄的雄性C57BL/6小鼠以安乐死方式被处死，解剖每只小鼠以分离整个盲肠。收集整个盲肠内容物并与4mL的磷酸盐缓冲溶液混合以制备1g/mL浓度的盲肠浆料。该盲肠浆料通过灭菌的70μm的过滤器(strainers)过滤，并与等体积的溶于磷酸盐缓冲溶液中的30％的甘油混合以生成15％的甘油的最终储备液(final stock solution)(1×CS)。之后，分取最终溶液并保管在-80℃。为了诱导小鼠败血症，在37℃解冻冻结的盲肠浆料储备液(1.5mg/kg)，并使用1mL注射器腹膜注射到小鼠模型中。在注入盲肠浆料2小时后首次施用25mg/kg美罗培南(西格玛奥德里奇，型号：1392454)，之后，则每隔24小时定期施用。在施用盲肠浆料2小时后首次施用iCP-NI(50mg/kg)，之后，以2小时的间隔给药4次。美罗培南和iCP-NI均采用静脉注射。

12.盲肠结扎穿孔(Cecal-ligation and puncture，CLP)诱导腹膜炎模型

盲肠结扎穿孔-诱发腹膜炎模型具有能导致类似于发生在人类的败血症的倾向，因此被认为最适合于研究目的，其能够诱发全身性菌血症、器官功能障碍和最终的全身性炎症(4-6)。雄性C57BL/6小鼠(8周龄)通过肌内注射阿法辛(alfaxan)(Jurox，型号：470760)和龙朋(rompun)(拜耳(Bayer))的混合物(7：3)被麻醉并以仰卧姿势放置。剃毛并进行无菌处理后，通过腹壁的中线切开1～2cm。盲肠利用6-0丝线被部分结扎。利用19号针头穿刺盲肠壁，盲肠内容物缓缓渗漏。切开部利用6-0丝线自动缝合器(autoclip)进行缝合。将聚维酮碘(povidone-iodine)涂布于缝合部位以避免手术部位感染。

13.肺炎诱发全身炎症模型(聚肌胞苷酸/链球菌肠毒素B(Poly I：C/SEB))

聚肌胞苷酸及链球菌肠毒素B(SEB；西格玛奥德里奇，型号：BT202)用于肺炎诱发全身炎症模型。对雄性C57BL/6(6周龄)小鼠通过静脉注射施用磷酸盐缓冲溶液(100μL/小鼠)或iCP-NI(50mg/kg，100μL/小鼠)。注射磷酸盐缓冲溶液或iCP-NI的小鼠使用喷雾器吸入聚肌胞苷酸(1mg/mL，5mL)30分钟。然后，通过肌肉内注射阿法辛和龙朋的混合物(7：3)来麻醉小鼠，并且，通过鼻腔途径施用链球菌肠毒素B(0.25mg/kg，20μL/小鼠)。对聚肌胞苷酸/链球菌肠毒素B-诱导小鼠在每个时间点通过静脉注射方式施用磷酸盐缓冲溶液(100μL/小鼠)或iCP-NI(50mg/kg，100μL/小鼠)。个别图例中示出特定方案。所有动物经聚肌胞苷酸/链球菌肠毒素B诱导后，在0.5小时、1小时、2小时、4小时或6小时时被处死。

14.博来霉素诱发肺纤维症模型

博来霉素用于开发有关肺纤维症的实验模型(7，8)。将硫酸博来霉素(Bleomycinsulphate)(BLM；西格玛奥德里奇，型号：B2434)溶解于灭菌磷酸盐缓冲溶液并用于实验。用异氟醚(isoflurane)麻醉8周龄的雄性C57BL/6小鼠，并在第0天(Day 0)通过支气管内给药方式施用磷酸盐缓冲溶液或博来霉素。通过博来霉素(3mg/kg于50μL的磷酸盐缓冲溶液中)的单次支气管内(I.T)注射对动物(n＝41)小鼠进行给药。正常动物(n＝10)仅施用50μL的磷酸盐缓冲溶液。施用博来霉素的小鼠被随机分配到两个不同的组。治疗组具体如下：(1)I.T注射博来霉素，磷酸盐缓冲溶液，21只；(2)I.T注射博来霉素，iCP-NI，20只。通过静脉内(I.V)注射方式给小鼠施用磷酸盐缓冲溶液(100μL/小鼠)或iCP-NI(50mg/kg，一天两次，100μL/小鼠)，共处理7天。为了进行微计算机断层扫描(CT)，使用异氟醚麻醉小鼠，使用体内X线射线摄影微计算机断层扫描(Micro-CT)系统(In Vivo X-ray Radiography Micro-CT System)拍摄了小鼠肺影像。之后，处死小鼠并收集肺组织用于组织病理学分析。

15.SARS-CoV-2感染非人类灵长类(NHP)研究

15-1.SARS-CoV-2感染非人类灵长类(NHP)模型

该研究用于评估iCP-NI对恒河猴(rhesus macaques)(RM)和非洲绿猴(Africangreen monkeys，AGM)中SARS-CoV-2的治疗功效而设计的。在研究期间，动物被收容在南方研究院(Southern Research’s，SR)A/BSL-3设施中。病毒菌株(2019-nCoV/USA-WA1/2020)来源于疾病预防控制中心(CDC)，由德州大学医学部加尔维斯顿(UTMB Galveston)提供。麻醉动物并将供给管插入气管。当管的端部到达气管中间点时，动物保持坐姿，通过接种管注射接种物(1.0mL或4.0mL)后，注入足量的冲洗物质(无Mg²⁺/Ca²⁺的灭菌杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS))，从而确保完全传递诱发物质。在第0天(Day 0)以4.0×10⁶TCID 50/mL使用诱发病毒。解冻SARS-CoV-2的小瓶(Vials)并在准备诱发之前涡旋(vortexed)10秒钟，并以单位给药用量储存在冰上。为了接种，动物用氯胺酮(ketamine)和赛拉嗪(xylazine)麻醉。诱发后在约24小时后，为指定的动物通过静脉内(IV)注射的方式以200mg/kg/动物的用量单次静脉注入iCP-NI，注入时间为30分钟。施用物质通过注入泵实现给药，并对使用的血管进行记入。用量以每分钟1mL的速率递送约30mL的体积。对所有动物的临床征兆、体温、葡萄糖水平、O₂饱和度、心率(BPM)、呼吸率及体重进行监测。在第5天和第8天，进行尸检并收集组织用于组织病理学。

15-2.血液收集、处理及细胞因子分析

收集血液用于评估所有动物的细胞因子和葡萄糖水平。从麻醉动物收集了大约6mL，其中，2mL用于处理乙二胺四乙酸(EDTA)管中血浆(细胞因子分析)，4mL用于在第-3天、第2天、第4天、第5天、第6天及第8天(Days-3、2、4、5、6、8)的肝素钠管(sodium heparintubes)中的外周血单个核细胞(PBMC)。通过手指或脚趾收集的血液来监测葡萄糖水平。从所有可接近的静脉采集血样。在安乐死之前，从处于临死状态的动物中收集血液。针对于在含有乙二胺四乙酸及肝素钠抗凝剂的管中收集的血液，收集后立即轻轻倒置。使用路明克斯(Luminex)测量细胞因子水平(白细胞介素-6、白细胞介素-10、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-2、白细胞介素-4及白细胞介素-17α)。

15-3.尸检及组织病理学

所有动物都接受了有限的肺、肝、肾和脾的尸检。组织样品通过10％中性缓冲福尔马林(neutral buffered formalin)进行固定。从所有尸检动物收集肺、肝、肾和脾组织，称重并用10％的中性缓冲福尔马林中固定，以用于组织病理学。对收集的组织在载玻片上进行处理，并用苏木精(hematoxylin)、伊红(eosin)(对应所有组织)及三色(trichrome)(仅对应肺)进行染色。

16.流式细胞微球阵列(CBA)&酶联免疫吸附分析(ELISA)

16-1.在小鼠血浆及组织中细胞因子测量

在血浆样品、支气管肺泡灌洗液(BALF)或肺组织中，肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-12、白细胞介素-10及干扰素-γ的浓度通过使用细胞计数珠阵列(BD生物科学(BD Biosciences)，型号：552364)并根据制造商的方案进行测量。从脂多糖/D-半乳糖胺诱发急性肝损伤小鼠(LPS/D-Galactosamine-induced acute liver injury mice)，脂多糖或聚肌胞苷酸吸入诱发肺炎小鼠(LPS or Poly I：C inhalation-inducedpneumonitis mice)收集血浆。从脂多糖或聚肌胞苷酸吸入诱发肺炎小鼠收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。从脂多糖/聚肌胞苷酸诱发肺炎小鼠收集肺组织匀浆。通过LSRII流式细胞分析仪(LSRII flow cytometer)(BD生物科学)收集数据并使用FCAP分析软件(FCAP Arraysoftware)(BD生物科学)进行分析。

16-2.酶联免疫吸附检查

使用市售的用于小鼠肿瘤坏死因子-α(英杰，型号：88-7324-88)、小鼠白细胞介素-6(英杰，型号：88-7064-88)及小鼠白细胞介素-1β(英杰，型号：88-7013-88)用的ELISA试剂盒，对包含在细胞培养液的上清液中的细胞因子的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β含量进行双重分析。

17.细胞质/核提取物的准备

根据制造商的指南，使用NE-PER核细胞质提取试剂盒(赛默飞世尔，型号：78835)准备细胞质及核提取，以用于分析免疫细胞中应激反应转录因子(SRTF)的核内迁移抑制。简而言之，将被刺激的细胞用冰冷的磷酸盐缓冲溶液(ice-cold PBS)洗涤两次，并以500×g离心3分钟。小心除去上层液，通过涡旋使细胞团块(cell pellet)悬浮于补充有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的细胞质提取试剂I(CER I)中。将悬浮液在冰上孵育10分钟后，添加细胞质提取试剂II(CER II)，并涡旋5秒钟，在冰上孵育1分钟，然后以16000×g离心5分钟。将上层液(细胞质提取物)转移到预冷管。对于含有核的不溶性团块级分(insoluble pelletfraction)，每10分钟涡旋15秒钟以重悬于核提取试剂(NER)，在冰上孵育40分钟后，以16000×g离心10分钟。组成核提取物的上层液用于后续实验。

18.蛋白质印迹分析(Western blot analysis)

实验中使用了总细胞裂解物及细胞质/核蛋白质。将总细胞团块在补充有蛋白酶/磷酸酶抑制剂(Cell Signaling，#5872S)的RIPA缓冲液(Biosesang，型号：RC2002-050-00)中裂解，并收集裂解物。使用布拉德福(Bradford)分析(伯乐(Bio-Rad))对蛋白质样品进行定量化。将含30μg的蛋白质的样品与SDS-样品缓冲液混合并煮沸5分钟。使用10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride)(PVDF；默克(Merck Millipore)，型号：IPVH00010)膜(membrane)。在室温下，将印迹膜在含0.1％的吐温-20的Tris-缓冲食盐水(科里(Biopure)，型号：TWN508-500)中的5％的牛血清白蛋白(BSA；BIOSESANG，型号：A1025)中封闭1小时后，在4℃温度条件下与一抗一起孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶联的二抗在室温条件下孵育1小时。使用化学发光试剂(Super Signal^TM West Dura Extended Duration Substrate；赛默飞世尔，Cat No.34075)并通过ChemiDoc成像系统(伯乐)对该蛋白质带(protein bands)进行可视化，并使用Image J软件进行定量化。使用的抗体如下：抗磷酸化-核因子-κBp65Ser536抗体(anti-phospho-NF-κB p65 Ser536)(Cell Signaling，#3033)、抗-核因子-κB p65抗体(anti-NF-κB p65)(圣克鲁斯(Santa Cruz)，sc-8008)、抗NFATc1抗体(anti-NFATc1)(圣克鲁斯，sc-7294)、抗磷酸-c-Jun Ser63抗体(anti-phospho-c-Jun Ser63)(Cell Signaling，#91952)、抗-c-Jun抗体(anti-c-Jun)(圣克鲁斯，sc-74543)、抗磷酸化-STAT3 Tyr705抗体(anti-phospho-STAT3Tyr705)(Cell Signaling，#9145)、抗-STAT3抗体(anti-STAT3)(Cell Signaling，#9139)、抗磷酸化-STAT1 Tyr701抗体(anti-phospho-STAT1 Tyr701)(Cell Signaling，#9167)、抗-STAT1抗体(anti-STAT1)(圣克鲁斯，sc-464)、抗-白细胞介素-1β抗体(anti-IL-1β)(R&D Systems，AF-401-NA)、抗-snail抗体(anti-snail)(Cell Signaling，#3879)、抗-slug抗体(anti-slug)(Cell Signaling，#9585)、抗-twist抗体(anti-twist)(圣克鲁斯，sc-81417)、β-肌动蛋白抗体(β-Actin)(西格玛奥德里奇，型号：A3854)、抗核纤层蛋白B1抗体(anti-LaminB1)(圣克鲁斯，sc-374015)、抗-3-磷酸甘油醛脱氢酶抗体(anti-GAPDH)(Bioworld，型号：MB001H)、辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗兔IgG抗体(horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbitIgG antibody)(Cell Signaling，#7074)及辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠IgG抗体(horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-mouse IgG)(Cell Signaling，#7076)。

19.核糖核酸(RNA)提取及定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

使用TRIzol试剂(赛默飞世尔，型号：15596018)从细胞或组织分离总核糖核酸(total RNA)，并根据制造商的指南使用iScript cDNA合成试剂盒(伯乐，型号：1708897)由共1μg的RNA合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。根据以下步骤，通过伯乐CFX96实时聚合酶链式反应(Real-Time PCR)检测系统(伯乐(Bio-Rad))并使用iQ

Green Supermix(Bio-Rad，型号：1708880)进行了实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)：(1)聚合酶及DNA变性，在95℃温度进行5分钟；(2)变性，在95℃进行10秒钟；(3)在60℃温度进行退火及延长30秒钟，共进行35个循环；(4)熔解曲线分析(melt curve anylysis)，60-95℃增量(increment)，5秒钟/步骤。信使核糖核酸(mRNA)的相对量(2^ΔΔCt)通过β-肌动蛋白基因的水平归一化(normalizing)而获得。

20.用于分析细胞渗透性的流式细胞分析

将RAW264.7细胞(5×10⁵细胞/孔)接种于12-孔并孵育24小时。细胞使用磷酸盐缓冲溶液洗涤2次，并在无胎牛血清(FBS-free)培养基中，使用FITC-偶联iCP-NI、FITC-偶联-cNLS或FITC肽对照组在37℃或4条件处理1小时。然后，去除细胞上层液，收集细胞团块，使用冰冷的磷酸盐缓冲液(ice-cold PBS)洗涤3次。然后，使用70％的EtOH在4℃条件下对细胞进行固定30分钟，并用冰冷的磷酸盐缓冲液洗涤3次。使用LSRII流式细胞分析系统(LSRII flow cytometry system)(BD)分析细胞的内在化的肽。

为了评估肽的细胞吸收，使用细胞内机制相关的各种类型的制剂对RAW264.7细胞进行处理。分析使用了ATP(西格玛奥德里奇，型号：A2383)-消耗剂(depleting agent)(抗霉素(Antimycin)；西格玛奥德里奇，型号：A8674)、蛋白酶K(proteinase K)(Cosmogenetech，型号：CMB-022)、微管抑制剂(microtubule inhibitor)(紫杉醇(Taxol)；西格玛奥德里奇，型号：T7402)、网格蛋白介导的内吞阻滞剂(clathrin-mediatedendocytosis blocker)(氯丙嗪(chlorpromazine)；西格玛奥德里奇，型号：C8138)、脂筏介导的内吞阻滞剂(lipid raft-mediated endocytosis blocker)(甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin)；西格玛奥德里奇，型号：C4555)或巨胞饮阻滞剂(macropinocytosisblocker)(amiloride；西格玛奥德里奇，型号：A7410)。具体步骤如下：针对于RAW264.7细胞，(1)于1mM的ATP存在或不存在条件下使用10μM的抗霉素预处理2小时，(2)使用10μg/ml蛋白酶K预处理10分钟，(3)用紫杉醇20μM预处理，(4)使用3μM的氯丙嗪预处理30分钟，(5)使用5mM的甲基-β-环糊精预处理30分钟，(6)在无血清培养基中于1mM的ATP的存在或不存在条件下使用10μM的抗霉素预处理2小时。然后，使用FITC-偶联-iCP-NI、FITC-偶联-cNLS或FITC肽对照组对细胞进行后处理。细胞固定及分析如上所述。

21.免疫细胞化学(ICC)

室温下，通过4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)对细胞固定15分钟，并在-20℃温度使用甲醇进行渗透化。然后，将细胞在封闭溶液(含3％的牛血清白蛋白(BSA)及0.3％的Triton X-100的磷酸盐缓冲溶液)中进行孵育后，在室温下与一抗一起孵育60分钟。在4℃条件下加入一抗过夜，并用磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞。并且，在室温下加入二抗1小时。然后，细胞用磷酸盐缓冲溶液洗涤，并通过带有4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(英杰，型号：E132139)的抗荧光淬灭封片剂(luoromount-GTM)F置于载玻片。使用配有数字成像系统(Leica TCS SP8-STED)的共聚焦显微镜观察并拍摄获得的制剂。使用Leica LAS X软件来处理和记录图像。使用的抗体如下：抗磷酸化-核因子-κB p65Ser536抗体(anti-phospho-NF-κB p65 Ser536)(Cell Signaling，#3033)、抗磷酸-c-Jun Ser63抗体(anti-phospho-c-Jun Ser63)(Cell Signaling，#91952)、抗磷酸化-STAT1 Tyr701抗体(anti-phospho-STAT1 Tyr701)(Cell Signaling，#9167)、抗磷酸化-STAT3 Tyr705抗体(anti-phospho-STAT3 Tyr705)(Cell Signaling，#9145)、活化T细胞核因子抗体(NFAT)(艾博抗(Abcam)，ab2722)、波形蛋白抗体(vimentin)(艾博抗，ab8978)、抗E-钙粘蛋白抗体(anti-E-cadherin)(艾博抗，ab40772)、山羊抗-兔IgG Alexa Fluor 488抗体(Goat anti-RabbitIgG Alexa Fluor 488)(英杰，型号：A11034)、山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488抗体(Goatanti-rabbit IgG Alexa Fluor 488)(英杰，型号：A11001)、山羊抗兔IgG Alexa Fluor647抗体(Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647)(Invitrogen，型号：A21245)、山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 647抗体(Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor647)(英杰，型号：A21235)、抗小鼠CD3 PE偶联抗体(anti-mouse CD3 PE-conjugated Antibody)(R&DSystems，型号：FAB4841P)、抗小鼠CD45R PE偶联抗体(anti-mouse CD45R PE-conjugatedAntibody)(eBioscience，型号：12-0452-82)、抗小鼠CD11b-PE偶联抗体(anti-mouseCD11b-PE-conjugated Antibody(eBioscience，型号：12-4801-82)。

22.免疫组织化学(IHC)

对所有组织均用10％的缓冲福尔马林(buffered formalin)固定24小时后，包埋在石蜡(paraffin)中。将石蜡包埋的组织以4μm厚度切片。为了脱蜡，将样品在65℃温度孵育30分钟后，在新鲜的二甲苯(xylene)分别培养3次，每次20分钟。样品复水(rehydration)分别在100％、90％及70％的EtOH中执行5分钟。然后，将样品在煮沸的pH 6柠檬酸钠溶液中孵育30分钟以修复(retrieve)抗原，并转移到NH₄Cl溶液中孵育20分钟。使用磷酸盐缓冲溶液洗涤后，将样品在封闭溶液(blocking solution)(含3％的牛血清白蛋白(BSA)及0.3％的Triton X-100的磷酸盐缓冲溶液)中孵育，且在室温下孵育1小时。将识别中性粒细胞的PE偶联Ly6G鼠单克隆一抗(赛默飞世尔，型号：12-9668-82)在封闭溶液中稀释，并在4℃条件下与样品一起孵育过夜。使用磷酸盐缓冲溶液冲洗后，将样品通过含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)封固溶液(mounting solution)进行封固。使用共聚焦激光扫描显微镜系统(Leica TCS SP8)通过荧光显微镜使所有样品可视化，并使用Leica LAS X软件处理图像

23.用于组织病理学分析的组织染色

所有组织均在10％的缓冲福尔马林中固定48小时并包埋在石蜡。使用苏木精(hematoxylin)及伊红(eosin)(H&E；艾博抗，型号：ab245880)、马森三色(Masson'strichrome)(艾博抗，型号：ab150686)、天狼星红(sirius red)(艾博抗，型号：ab150681)对4-μm切片进行染色，分别评估炎症、胶原沉积及纤维。并且，利用Apoptag过氧化物酶(Peroxidase)染色试剂盒(默克，#S7101)进行了TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记)染色。使用配备数字成像系统(Nikon DS-Ri2)的显微镜对整个标本进行观察和拍照。所有实验均根据制造商的方案(protocol)进行。

24.统计分析

使用GraphPad Prism软件5(GraphPad Prism software 5)及Microsoft Excel软件(Microsoft Excel software)进行统计分析。所有结果均执行了两个生物学(biological replicates)重复和至少三个独立实验(three-independent experiments)。所有实验数据均用平均值±标准偏差(SD)表示，并使用学生t检验(Student's t test)来比较组间差异。*<0.05，<0.01或<0.001的P值被认为具有统计学上的显著性差异。

<实验例>

1.改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽(iCP-NI)的开发

我们使用对细胞内蛋白质递送优化的序列、特定改善的高级大分子转导域(designated advanced macromolecule transduction domains)或高级大分子转导域(aMTD)开发了一种改善的细胞渗透性核转运抑制剂(iCP-NI)。高级大分子转导域(aMTD)整合了6个重要特征(氨基酸长度(12个氨基酸)、弯曲可能性(bending potential)、刚性/柔韧性(rigidity/flexibility)、结构特征(structural feature)、疏水性(hydropathy)及氨基酸组成(国际专利(worldwide patent)WO2016028036A1)，并且，其显著优于用于递送大蛋白质货物(protein cargo)(如改善的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)、Parkin蛋白及细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of Cytokine Signaling 3)(SOCS3)等)的前几代非优化序列。

本研究中使用的肽如表1所示。线状核定位序列(lNLS)由侧面有2个胱氨酸的NF-κB1(p50)的线状核定位序列组成。环状核定位序列(cNLS)具有由二硫键环化的相同序列。六种肽含有环化的核定位序列和用于促进细胞内蛋白质递送的其他序列：非优化的FGF-4序列(unoptimized FGF-4 sequence)(cSN50.1)及5个高级大分子转导域(aMTD385-cNLS、aMTD666-cNLS、aMTD891-cNLS、aMTD831-cNLS及aMTD827-cNLS)。除了核定位序列未被环化以外，额外的肽(aMTD827-1NLS)与aMTD827-cNLS相同。

[表1]

2.最佳iCP-NI的筛选

2-1.表1的肽的抗炎活性

加入细菌性脂多糖和作为致敏剂(sensitizing agent)的D-半乳糖胺(D-Gal)后，在90％以上的小鼠经受(succumbed)致命性炎症反应的鼠急性肝损伤模型中，对每种肽的抗炎症活性进行了评估。用五种含有高级大分子转导域的肽处理保护了20-100％的测试动物。环状(aMTD827-cNLS)及线状(aMTD827-lNLS)表现出同等的效果(图1)。由于单独处理线状(lNLS)或环状(cNLS)形态的核定位序列也没有提高生存率，因此aMTD827-cNLS的抗炎症活性严格要求aMTD827序列(图2)。aMTD827-cNLS在静脉(IV)给药时比腹腔内(IP)注射时更有效(分别保护100％及75％，图3)。无论给药途径如何，cSN50.1肽的效果都低于aMTD827-cNLS(图4)。基于这些观察结果，aMTD827-cNLS被选为候选抗炎性COVID-19治疗剂。

2-2.改善的细胞渗透性核转运抑制剂的治疗方案(therapeutic protocol)

我们在急性肝损伤模型中测试了几种治疗方案，通过以50mg/Kg给药4次治疗或以25mg/Kg给药6次的治疗实现了100％的保护。以25mg/Kg给药4次或以25mg/Kg给药3次的治疗方案效果较差，在统计学上差异不显著。在以5mg/Kg或10mg/Kg 40给药4次的方案中观察到更高的死亡率(分别有25％及38％存活)。并且，我们建立了急性肝损伤模型的治疗方案，观察到在该模型中以50mg/kg给药6次的小鼠表现出60％的治疗效果(图5)。

2-3.改善的细胞渗透性核转运抑制剂(iCP-NI)的稳定性及对于输入蛋白-5α的结合力

改善的细胞渗透性核转运抑制剂由于其优异的溶解性，以冷冻干燥粉末的状态在25℃条件下实现了3个月以上的稳定(图6)，并且根据表面等离子共振(Surface PlasmonResonance)评估，保持了对于输入蛋白-5α的结合能力(图7)。

2-4.改善的细胞渗透性核转运抑制剂的细胞内递送

为了分析细胞内递送，用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记改善的细胞渗透性核转运抑制剂，并通过流式细胞分析检测培养的RAW264.7细胞的吸收。改善的细胞渗透性核转运抑制剂的细胞渗透性比没有aMTD827的核定位序列高1000倍(图8)。静脉给药(IV)后，FITC-iCP-NI广泛分布于肺、脑、心、肝、脾、肾等主要器官(图9)。在肺组织中就，高水平的改善的细胞渗透性核转运抑制剂至少维持8小时，并以时间依赖性方式下降(图10)。

3.iCP-NI对应激反应转录因子(SRTF)的核内迁移的功效

应激反应转录因子(SRTF)激活细胞因子和趋化因子基因表达程序以响应促炎刺激(proinflammatory stimuli)。就大多数应激反应转录因子而言，如同可通过脂多糖和聚肌胞苷酸或脂多糖和干扰素-γ(IFN-γ)处理的RAW264.7细胞的核中的核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)、信号转导与转录激活因子1及信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator oftranscription 1 and 3)及活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells，NFAT)的积累能够解释，其在核内迁移水平上受到调节。就改善的细胞渗透性核转运抑制剂而言，如同对核及细胞质级分的蛋白质印迹分析(图11)及免疫染色(图12)评估，抑制了NF-κB(磷酸化及非磷酸化p65)与激活蛋白1及AP-1(磷酸化c-Jun)及信号转导与转录激活因子3(STAT3)的核内迁移。就改善的细胞渗透性核转运抑制剂而言，仍如同对蛋白印迹(Western Blot)分析(图13)和免疫染色(图14)评估，通过对脂多糖/IFN-γ的响应来阻断了NF-κB(磷酸化和非磷酸化p65)、STAT1及STAT3(磷酸化蛋白，p-STAT1及p-STAT3)、AP-1(磷酸化c-Jun)及NFAT的核积累。

4.iCP-NI对急性炎症模型的功效

就iCP-NI对SRTF核内迁移的抑制而言，其与如下模型一致，即由iCP-NI转运的核定位序列(NLS)与应激反应转录因子竞争来与输入蛋白-5α结合，从而抑制应激反应转录因子核转运的模型一致。结果，iCP-NI的全身递送有望抑制SRFT以及其调节表达的细胞因子(cytokines)及趋化因子(chemokines)在病理学中起重要作用的炎症性障碍。该预测在急性炎症的几种末端小鼠模型中得到了验证：脂多糖/D-半乳糖胺诱发肝炎、脂多糖/聚肌胞苷酸诱发肺炎、及通过盲肠结扎和穿刺(cecal ligation and puncture，CLP)及盲肠浆料(cecal slurry，CS)诱发的腹膜炎。

4-1.脂多糖/D-半乳糖胺诱发肝炎

正如100％的存活(n＝163)结果所证明，静脉内给药的iCP-NI可对由脂多糖/D-半乳糖胺诱发致命性的(n＝120)肝炎(图15)的小鼠起到保护作用。iCP-NI处理抑制炎性细胞因子(TNF-α及IL-6)的表达并诱导作为抗炎性细胞因子的IL-10表达(图16)，并保护其发生肝损伤及大规模肝细胞凋亡(图17)。脂多糖/D-半乳糖胺肝炎模型中预防性iCP-NI的显著优点说明应激反应转录因子激活的急性后果和伴随肝脏稳态的炎症反应。

4-2.LPS/聚肌胞苷酸(Poly I:C)诱发肺炎

先施用脂多糖后，4小时后给药聚肌胞苷酸。对C57BL/6小鼠均通过支气管内给药。单独处理并不致命(未示出数据)，但联合处理在79％的动物中表现出了致命性。对小鼠施用聚肌胞苷酸后的120小时内，表现出与ARDS相似的症状，包括呼吸困难并伴有杂音(noise)、活动大大减少，甚至死亡。相比之下，在给药聚肌胞苷酸4小时后开始用iCP-NI处理时，生存率增加至84％(70.6％的治疗功效)(图18)。就以上皮增殖、单核细胞浸润及肺泡结构丧失为特征的肺组织学，也通过iCP-NI治疗得到显著改善(图19)，肺泡损伤程度也是如此(图20)。

4-3.由盲肠结扎和穿刺及盲肠浆料(cecal slurry，CS)诱发的腹膜炎

iCP-NI也被证明有益于治疗由盲肠结扎和穿刺(图21)及盲肠浆料(图22)方案诱发的重症败血症的治疗。与仅使用抗生素美罗培南(Meropenem)时相比，iCP-NI在两种模型的均提高了生存率。

5.iCP-NI在亚急性肺部炎症模型中的功效

COVID-19表现出多种疾病严重程度和进展。这被认为是由于病毒感染的近端(呼吸器官及肺)组织和远端组织之间的复杂相互作用、宿主炎症反应的全身效果以及如合并症、遗传学及疗法(例如，呼吸机诱发肺损伤(VILI))等患者的变量所导致的结果。人COVID-19的复杂性使动物模型的开发变得复杂，从而使iCP-NI作为COVID-19治疗剂的临床前评估(preclinical evaluation)变得复杂。因此，我们采用了广泛的接近方法并使用了几种非致命性肺炎模型来评估了iCP-NI多种种病理终点的影响：肺组织学，LPS吸入后BALF细胞数量及细胞因子表达；肺组织学，聚肌胞苷酸吸入后BALF细胞数量及细胞因子表达；肺组织学，聚肌胞苷酸吸入及葡萄球菌肠毒素B(SEB)的鼻腔给药后嗜中性粒细胞浸润及肝脏和脾脏全身效果；以及博来霉素-诱发的肺纤维症。并且，我们通过A549人肺泡上皮细胞检测了iCP-NI对于TGF-b诱发的上皮细胞(epithelial)至间叶细胞(mesenchymal)转化的效果。

吸入脂多糖或聚肌胞苷酸诱导肺组织学的暂时变化，其特征是上皮增殖、单核细胞浸润和肺泡结构丧失。与正常对照组相比，在脂多糖或聚肌胞苷酸之前启动的iCP-NI处理，可阻断大部分这些反应并保留了肺泡结构(图23及图24)，从BALF中回收的细胞数量增加了5～6倍(图25)。iCP-NI的抗炎效果伴随着IL-12、TNF-α、IL-6及MCP-1表达的降低(图26)。此外，RAW264.7细胞中观察到了与通过脂多糖的细胞因子的表达类似的激活。在iCP-NI处理的细胞中，TNF-α、IL-6及IL-1β的水平以iCP-NI的浓度依赖性的方式降低(图27)。

聚肌胞苷酸吸入后葡萄球菌肠毒素B(SEB)的鼻腔(IN)给药诱导了因iCP-NI的处理受到抑制的细胞性质(cellularity)、嗜中性粒细胞浸润(Ly-6G阳性细胞)及嗜中性粒细胞数量的增加。iCP-NI降低了嗜中性粒细胞浸润及肝内数值(图28)及肺的肺泡体积(图29)。iCP-NI治疗也显著改善了全身效果，包括凋亡细胞数量的减少，其可能是在脾脏中观察到的潜在激活结果-依赖性细胞凋亡(图28及30)。

ARDS及中度至重度SARS-CoV-2感染与间质纤维症有关。我们为了测试iCP-NI的抗纤维症的效果，使用了肺纤维症的博来霉素(BLM)诱发小鼠模型。BLM诱发15小时后，BLM处理的小鼠的肺显示出广泛的肺泡损伤，正如微计算机断层扫描(图31)所成像，其特征是肺泡结构丧失、炎性细胞浸润、玻璃样化(hyalinization)和胶原沉积(图32)。静脉内iCN-NI治疗在很大程度上阻止了这种纤维化变化。

同时，这些结果表明肺部炎症对在促炎刺激之前开始的iCP-NI静脉内给药的响应良好。可限制趋化因子MCP-1的产生会抑制免疫细胞的趋化性，尤其是在中度至重度COVID-19疾病中观察到的作为细胞因子风暴的主要原因的中性粒细胞的趋化性。因此，iCP-NI可作为具有抑制趋化因子/细胞因子表达、保留肺泡结构和抑制可导致微血管损伤和多器官衰竭的全身炎症的能力的有效的COVID-19治疗方法。

6.iCP-NI对感染SARS-CoV-2的非人类灵长类的细胞因子/趋化因子分泌和肺部炎症的功效

在非人类灵长类((非洲绿猴：AGM，恒河猴：RM))感染SARS-CoV-2后，注入iCP-NI并观察了临床征兆(O₂饱和度、呼吸率、心率、血糖水平、体温)的改善。

跟踪所有动物的细胞因子/趋化因子血浆水平和BALF。处死所有动物并进行组织病理学分析。不幸的是，感染了SARS-CoV-2的猴子仅表现出轻微的症状，并且BAL液和促炎细胞因子/趋化因子的血浆水平较低。

尽管感染了SARS-CoV-2的猴子症状轻微且细胞因子/趋化因子分泌较低，但iCP-NI处理动物的临床症状有所改善，且细胞因子(IFN-γ)/趋化因子(MCP-1)的分泌减少。在1dpi至5dpi(感染后1天)，O₂饱和度下降到86％，呼吸率增加到每分钟32次，心率增加到163bpm，血糖增加到286mg/dL，但施用iCP-NI的猴子维持正常状态(氧饱和度为98％，呼吸率为20次，心率为113次，血糖数值为103mg/dL)(图33)。血浆中IFN-γ的分泌水平增加至12.91pg/mL，在iCP-NI给药后下降50.5％，即为6.39pg/mL。作为直接感染和炎症部位BALF中，MCP-1在感染后5天增加至2010.9pg/mL，但在iCP-NI处理动物中显示为下降99.9％，即为24.87pg/mL(图34)。SARS-CoV-2的病毒滴度与临床症状水平无关，但通过iCP-NI处理时其消灭率(rate of extinction)保持为高水平。与iCP-NI给药的第一天(治疗前)相比，稀释动物的病毒滴度仅降低了70％，而iCP-NI处理动物在完全建立的SARS-CoV-2猴子模型中显示91％的降低率。类似地，部分(partially)和未建立(non-established)组中的稀释动物显示病毒滴度的倍数增加(分别为641％、426％)，而iCP-NI处理的动物分别显示37％及98％的降低率(图35)。在未用iCP-NI处理的动物肺中观察到免疫细胞浸润、增殖、出血和纤维症，但在用iCP-NI处理的动物中未观察到这些病理结果(36)。

已参考示例性实施例描述了本发明。本发明所属领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以以修改的形式实施本发明。因此，在本说明书中公开的实施例被认为是示例性的，而不是限制性的。本发明的范围应以权利要求书为准，而不应以上述说明为准，凡在等同范围内的差异均应理解为包含在本发明中。

工业实用性

根据本发明的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽基于优异的细胞渗透性，更有效地阻断包括NF-κB在内的应激反应转录因子(stress-responsive transcriptionfactor，SRTF)介导的信号转导，从而可用作对细胞因子风暴或炎症性疾病优异的预防剂或治疗剂。

[参考文献]

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<110> CELLIVERY THERAPEUTICS, INC.

<120> 用于抑制细胞因子风暴或炎症性疾病的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽及其用途

<130> FP200015PCT

<150> US 62/977,832

<151> 2020-02-18

<160> 8

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> circular or linear NLS

<400> 1

Cys Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met Pro Cys

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aMTD385

<400> 2

Ile Val Ala Ile Ala Val Pro Ala Leu Val Ala Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aMTD666

<400> 3

Ala Ala Ile Ala Ile Ile Ala Pro Ala Ile Val Pro

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aMTD827

<400> 4

Ile Ala Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Leu Val Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aMTD831

<400> 5

Ile Ile Val Ala Val Ala Pro Ala Ala Ile Val Pro

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> aMTD891

<400> 6

Ile Leu Ala Val Ala Ala Ile Pro Ala Ala Leu Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP of cSN50.1

<400> 7

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

1 5 10 15

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NLS

<400> 8

Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met Pro

1 5 10

Claims (23)

1.一种改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽，其特征在于，

所述改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽用于抑制细胞因子风暴或炎症性疾病，

所述改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽包含核因子κB核定位序列及高级大分子转导域，

所述核因子κB核定位序列包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列，

所述高级大分子转导域包含选自由SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.6组成的组中的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽，其特征在于，

所述核因子κB核定位序列为线状核因子κB核定位序列或具有2个额外半胱氨酸的环状核定位序列。

3.根据权利要求1所述的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽，其特征在于，

所述改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽用于抑制应激反应转录因子的核转运。

4.根据权利要求3所述的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽，其特征在于，

所述应激反应转录因子为核因子κB、活化T细胞核因子、激活蛋白1、信号转导与转录激活因子1或核因子E2相关因子2。

5.根据权利要求1所述的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽，其特征在于，

所述炎症性疾病包括自身免疫性疾病、移植排斥、多发性硬化症、胰腺炎、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性细支气管炎、慢性细支气管炎、败血症、败血性休克、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭或慢性阻塞性肺病。

6.根据权利要求5所述的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽，其特征在于，

所述自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、牛皮癣、特应性皮炎、克罗恩病、炎症性肠病、舍格林氏综合征、视神经炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、I型糖尿病、视神经脊髓炎、肌无力症、葡萄膜炎、格林-巴利综合征、牛皮癣性关节炎、格雷夫斯氏病或过敏。

7.一种用于预防或治疗细胞因子风暴或炎症性疾病的药学组合物，其特征在于，

包含根据权利要求1至6中任一项所述的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽。

8.根据权利要求7所述的药学组合物，其特征在于，

所述细胞因子风暴或炎症性疾病是由病毒、细菌、真菌或寄生虫引起的炎症感染所致。

9.根据权利要求8所述的药学组合物，其特征在于，

所述病毒包括冠状病毒、流感病毒、汉坦病毒、黄病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人体免疫缺陷病毒、埃博拉病毒、逆转录病毒或天花病毒。

10.根据权利要求8所述的药学组合物，其特征在于，

所述细菌感染包括菌血症、细菌性败血症、肺炎、蜂窝织炎、脑膜炎、丹毒、感染性心内膜炎、坏死性筋膜炎、前列腺炎、假膜性结肠炎、肾盂肾炎或败血性关节炎。

11.根据权利要求8所述的药学组合物，其特征在于，

所述真菌为曲霉、白假丝酵母或新型隐球酵母。

12.根据权利要求8所述的药学组合物，其特征在于，

所述寄生虫包括恶性疟原虫。

13.根据权利要求7所述的药学组合物，其特征在于，

还包括：抗生素、抗病毒剂、抗HIV剂、抗寄生虫剂、抗原虫剂、甾体类制剂、甾体类抗炎剂或非甾体类抗炎剂、抗组胺剂、免疫抑制剂或其组合。

14.根据权利要求13所述的药学组合物，其特征在于，

所述抗生素包括头孢菌素类、β-内酰胺类、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂类、喹诺酮类、糖肽类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、大环内酯类、磺胺类、氨曲南、克林霉素、替加环素、多粘菌素E甲磺酸钠、甲硝唑、螺旋霉素或其组合。

15.根据权利要求7所述的药学组合物，其特征在于，

所述炎症性疾病包括自身免疫性疾病、移植排斥、多发性硬化症、胰腺炎、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性细支气管炎、慢性细支气管炎、败血症、败血性休克、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭或慢性阻塞性肺病。

16.根据权利要求15所述的药学组合物，其特征在于，

所述自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、牛皮癣、特应性皮炎、克罗恩病、炎症性肠病、舍格林氏综合征、视神经炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、I型糖尿病、视神经脊髓炎、肌无力症、葡萄膜炎、格林-巴利综合征、牛皮癣性关节炎、格雷夫斯氏病或过敏。

17.一种细胞因子风暴或炎症性疾病的预防或治疗方法，其特征在于，

包括：将根据权利要求1至6中任一项所述的改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽给药于对象体的步骤。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，

将所述改善的细胞渗透性核转运抑制剂合成肽与抗生素、抗病毒剂、抗HIV剂、抗寄生虫剂、抗原虫剂、甾体类制剂、甾体类抗炎剂或非甾体类抗炎剂、抗组胺剂、免疫抑制剂或与其组合进行联合给药。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，

所述抗生素包括头孢菌素类、β-内酰胺类、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂类、喹诺酮类、糖肽类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、大环内酯类、磺胺类、氨曲南、克林霉素、替加环素、多粘菌素E甲磺酸钠、甲硝唑、螺旋霉素或其组合。

20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，

所述给药包括：静脉内给药、非经胃肠道给药、经皮给药、皮下给药、肌肉内给药、颅内给药、眼眶内给药、眼内给药、脑室内给药、被膜内给药、鞘内给药、脑池内给药、腹腔内给药、鼻腔内给药、直肠内给药、阴道内给药、喷雾给药或口服给药。

21.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，

所述细胞因子风暴或炎症性疾病是由病毒、细菌、真菌或寄生虫引起的炎性感染诱发所致。

22.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，

所述细胞因子风暴或炎症性疾病是由外伤、受伤、烧伤、毒素或致癌物质诱发所致。

23.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，

所述炎症性疾病包括自身免疫性疾病、移植排斥、多发性硬化症、胰腺炎、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性细支气管炎、慢性细支气管炎、败血症、败血性休克、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭或慢性阻塞性肺病。

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