ES2281278B1

ES2281278B1 - Empleo de un polipeptido que comprende el dominio c-terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica en el tratamiento del parkinsonismo.

Info

Publication number: ES2281278B1
Application number: ES200600132A
Authority: ES
Inventors: Jose Aguilera Avila
Original assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Current assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2006-01-20
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2026-01-20
Also published as: ES2281278A1; WO2007082973A1

Abstract

Se describe el uso de un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento del parkinsonismo, en particular, en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson .

Description

Empleo de un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica en el tratamiento del parkinsonismo.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona, en general, con el uso de un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento del parkinsonismo, en particular, en el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson.

Antecedentes de la invención

El parkinsonismo, también llamado síndrome Parkinson o parkinson atípico, consiste en un grupo de trastornos del sistema motor que se producen normalmente como consecuencia de otro trastorno neurológico primario, por ejemplo, tumores en el encéfalo, traumatismos repetidos en la cabeza, parkinsonismo inducido por medicamentos o por agentes tóxicos, parkinsonismo post-encefalítico, degeneración estriatonígrica, o parkinsonismo que acompaña a otras condiciones neurológicas tales como el síndrome de Shy-Drager (atrofia multisistémica), la parálisis supranuclear progresiva, la enfermedad de Wilson, la corea de Huntington, el síndrome de Hallervorden-Spatz, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la atrofia olivopontocerebelosa y la encefalopatía postraumática.

El parkinsonismo se define por la concurrencia de varias alteraciones motoras tales como rigidez muscular, temblor en reposo, o inestabilidad postural, y siempre se asocia con pérdida de neuronas dopaminérgicas, principalmente las neuronas localizadas en la pars compacta (PC) de la sustancia negra del mesencéfalo. La sustancia negra es un núcleo pigmentado, debido a su contenido en melanina, situado en el mesencéfalo. Dentro de la sustancia negra se diferencian dos zonas, la pars compacta y la pars reticulata.

Enfermedad de Parkinson (EP)

La Enfermedad de Parkinson (EP), es la forma más frecuente de parkinsonismo. Es una enfermedad muy frecuente que afecta entre 1 y 5 casos cada 1.000 personas, se desarrolla más a partir de los 50 años, y afecta ligeramente más a hombres (55-60%) que a mujeres. La pérdida de neuronas dopaminérgicas en la pars compacta de la sustancia negra del mesencéfalo junto a una disminución del contenido de dopamina cerebral (neurotransmisor que transmite los impulsos de unas células a otras), representan las alteraciones histológicas y neuroquímicas más importantes de la EP y son las responsables de la mayoría de las alteraciones motoras que presentan los pacientes. El déficit de dopamina es la causa de los síntomas principales de la EP, temblor, rigidez muscular y acinesia. Sin embargo, desde el punto de vista neuroquímico no se puede hablar de un déficit dopaminérgico aislado. La presencia de cuerpos de Lewy, unas inclusiones eosinofilicas en el citoplasma en las neuronas, y la consiguiente degeneración neuronal, es responsable de un déficit en otros transmisores químicos como noradrenalina, acetilcolina y serotonina. Algunos pacientes muestran también destrucción del estriado o del pálido, pero invariablemente siempre coexiste daño nigral. Clínicamente, la EP se caracteriza por una reducción en los movimientos espontáneos, rigidez muscular, dificultades para andar, temblor y alteraciones en la coordinación de movimientos. Para que se produzcan manifestaciones clínicas se requiere una pérdida de al menos el 80% de las células de la PC. La degeneración de otros sistemas ascendentes (noradrenérgicos, colinérgicos y serotoninérgicos) puede estar especialmente implicada en la aparición de estados depresivos y del deterioro mental.

La EP se trata mediante administración sistémica de un agente terapéutico. Este tipo de administración es, sin embargo, a veces poco eficiente debido a la imposibilidad de algunos fármacos de atravesar la barrera hematoencefálica y, si son capaces de penetrar en la barrera hematoencefálica, a veces provocan efectos secundarios en el sistema nervioso central (SNC). Actualmente, el aminoácido levodopa constituye el tratamiento base de la EP. Dicha sustancia, sin embargo, puede favorecer la aparición de radicales libres, disminuir la sensibilidad de los receptores dopaminérgicos y cambiar el patrón de respuesta de éstos. Otros fármacos, como la seleginila, un inhibidor de la monoaminooxidasa B (MAOB) que atraviesa bien la barrera hematoencefálica, disminuye la metabolización de la levodopa mejorando su biodisponibilidad. Además, presenta un efecto inhibidor de la producción de metabolitos tóxicos y antioxidante ayudando a prevenir el deterioro neuronal. Sin embargo, en algunos pacientes, la seleginila pierde eficacia terapéutica con el paso del tiempo.

Para reducir la dosis de levodopa se administra un inhibidor periférico de la dopa-descarboxilasa (e.g., carbidopa), el cual no atraviesa la barrera hematoencefálica por lo que permite que no se degrade periféricamente la levodopa y pueda transformase en dopamina principalmente en el núcleo estriado.

En los últimos años ha resurgido el tratamiento quirúrgico de la EP en diversas modalidades. Este tratamiento puede llevarse a cabo mediante estimulación talámica, o mediante la implantación de electrodos conectados a estimuladores. Asimismo, el tratamiento quirúrgico de la EP puede llevarse a cabo mediante el transplante de células dopaminérgicas en el núcleo estriado, provenientes de sustancia negra fetal. Sin embargo, esta técnica aparece poco eficaz puesto que las causas de deterioro celular persisten y por lo tanto las células implantadas acaban por degenerar.

En la mayoría de los casos, la cirugía es la alternativa última a considerar. Por tanto, la estrategia terapéutica actual consiste en encontrar fármacos o sustancias que específicamente modulen el componente principal de estas enfermedades, la degeneración de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo.

Ahora se ha encontrado que el dominio carboxilo terminal (C-terminal), no tóxico, de la cadena pesada de la toxina tetánica puede ser utilizado en el tratamiento del parkinsonismo y, en particular, de la EP.

Toxina tetánica (TeTx)

Las toxinas clostridiales, las neurotoxinas botulínicas y la toxina tetánica (TeTx) son proteínas sintetizadas por diferentes especies del género Clostridium, cuyo objetivo concreto es producir la muerte de animales superiores con sistema nervioso desarrollado para utilizarlos como incubadores anaerobios para el crecimiento y desarrollo de la especie bacteriana. Para conseguir su objetivo, las especies clostridiales han desarrollado evolutivamente unas proteínas altamente sofisticadas que desarrollan diferentes funciones: reconocer específicamente las terminaciones neuromusculares y neurosensitivas (unión específica), internalizarse en las células del sistema nervioso (internalización por endocitosis), translocarse a través de las membranas de las vesículas endocíticas, y producir en el citosol de las terminaciones nerviosas la hidrólisis de proteínas específicas del sistema de neurosecreción a través de su actividad metaloproteasa contenida en la cadena ligera de la toxina clostridial. Esta última actividad es la causante de la neurotoxicidad y muer-
te del organismo por la intoxicación tetánica, muerte debida a la falta de comunicación entre las neuronas afectadas.

La toxina tetánica (TeTx) es una proteína de 150 kDa de peso molecular formada por dos subunidades, la cadena ligera (L), de peso molecular 50 kDa, y la cadena pesada (H), de peso molecular 100 kDa, unidas entre sí por un puente disulfuro. La cadena ligera (L) es la parte neurotóxica de la toxina tetánica ya que tiene capacidad metaloproteásica mientras que la cadena pesada (H) es la parte inocua y posee las funciones ya señaladas de unión, internalización, transiocación, transporte retro-axonal y salto trans-sináptico. Esta última, la cadena pesada (H), puede dividirse a su vez en dos fragmentos por acción de la papaína (proteasa), la parte N-terminal (HN) y la parte C-terminal (H_{C}) de 50 kDa cada uno de ellos. Dicha parte C-terminal (H_{C}), que comprende el domino C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, contiene los 451 aminoácidos finales de la secuencia de aminoácidos de la toxina tetánica nativa (NCBI n° de acceso P04958).

Se ha descrito recientemente que el dominio C-terminal de la toxina tetánica es el responsable de la unión de dicha toxina tetánica a la membrana celular. Una vez que la toxina tetánica se une a las terminaciones nerviosas de las neuronas motoras, se transporta retro-axonalmente al SNC y allí bloquea la secreción de neurotransmisores inhibidores (e.g., ácido gamma-aminobutírico y glicina). Asimismo, es bien conocido que la unión de la toxina tetánica a las neuronas requiere de la parte C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica.

Por tanto, el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica produce gran parte de las acciones positivas de dichos factores neurotróficos pero con ventajas sobre ellos ya que dicho dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica posee mayor versatilidad (puesto que actúa imitando a varios factores tróficos, por lo que puede actuar sobre diferentes receptores en diferentes células nerviosas), viaja retroaxonalmente y con mayor eficacia que la mayoría de los factores tróficos, y, finalmente, tiene una vida media superior.

Se ha descrito el papel del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como inhibidor del transporte de serotonina, por lo que puede ser utilizado en el tratamiento de trastornos del comportamiento. Por otra parte, estudios recientes han mostrado que el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica parece proteger las neuronas granulares de cerebelo de la muerte apoptótica inducida por la falta de potasio en el medio [Chaïb-Oukadour et al., 2004. The C-terminal domain of the heavy chain of tetanus toxin rescues cerebellar granule neurones from apoptotic death: involvement of phosphatidylinositol 3-kinase and mitogen-activated protein kinase pathways. J. Neurochemistry, 10.1111. p1227-1236]. Sin embargo, nada en dicho documento sugiere que dicho dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica pueda ser utilizado en el tratamiento del parkinsonismo.

Compendio de la invención

Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que el dominio C-terminal, no tóxico, de la cadena pesada de la toxina tetánica, ejerce un efecto protector contra la muerte celular por apoptosis inducida por agentes neurotóxicos en neuronas dopaminérgicas por lo que puede ser utilizado en el tratamiento del parkinsonismo y, en particular, en el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson.

Esta nueva aplicación del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica se basa en las investigaciones llevadas a cabo por los inventores sobre modelos in vitro con neuronas granulares de cerebelo e in vivo en animales a los que se les administró el agente neurotóxico MPP^{+} (1-metil-4-fenilpiridinio), observándose una mayor viabilidad celular en los cultivos y animales tratados con un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento del parkinsonismo. En una realización particular, dicho parkinsonismo es la Enfermedad de Parkinson.

El empleo de un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo en el tratamiento de parkinsonismos, en particular, de la Enfermedad de Parkinson, supone una forma eficaz de evitar los problemas planteados por las estrategias de los tratamientos actuales, tales como los efectos secundarios de los fármacos utilizados en el tratamiento de este tipo de enfermedades.

Breve descripción de las figuras

En la Figura 1 se muestra una gráfica en la que se observa el desplazamiento de la mortalidad (% de viabilidad con MTT) provocada por un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica (H_{C}-TeTx) aplicado de manera simultánea a varias dosis del agente neurotóxico MPP^{+} (1-metil-4-fenilpiridinio) en cultivos de primarios de CGN.

En la Figura 2, se muestra una fotografía de microscopía de fluorescencia en la que se observa una mayor aparición de células pre-apoptóticas y apoptóticas en las placas de cultivos tratadas con MPP^{+} (b) frente a las placas controles (a) y las tratadas con un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica (H_{C}-TeTx) y MPP^{+} (c). En el panel inferior derecho se representa en un gráfico de barras el porcentaje de células pre-apoptóticas y apoptóticas que aparecen en cada uno de los casos.

En la Figura 3 se representan en un gráfico de barras los niveles de dopamina del núcleo estriado ipsilateral. Los valores son las medias más los errores estándar de la media de tres experimentos con un "n" de 2 a 4 animales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona, en general, con el uso de un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento del parkinsonismo.

En una realización particular, la invención contempla el uso de un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica.

Tal como aquí se utiliza, el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica comprende los 451 aminoácidos finales de la secuencia de aminoácidos de dicha toxina tetánica y mantiene las funciones de unión, internalización, translocación, transporte retro-axonal y salto trans-sináptico de la toxina tetánica nativa, que le confieren una capacidad neuroprotectora. La capacidad neuroprotectora del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica ha sido puesta de manifiesto en ensayos realizados con cultivos de neuronas granulares de cerebelo tratadas con MPP^{+}, un agente neurotóxico inductor de la apoptosis celular (Ejemplo 1) o con ratas tratadas con MPP^{+} (Ejemplo 2).

En una realización concreta, dicho dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica comprende la secuencia de 451 aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, que corresponde a la secuencia de aminoácidos comprendida entre la lisina en posición 865 (Lys865) y el ácido aspártico en posición 1315 (Asp1315) de la secuencia de aminoácidos de la toxina tetánica (NCBI n° de acceso P04958).

En una realización particular, el polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica es un polipéptido que está constituido por, la secuencia de 451 aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

En otra realización particular, el polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica es un polipéptido que comprende la cadena pesada de la toxina tetánica nativa.

En otra realización particular, el polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica es un polipéptido que comprende, o está constituido por, una forma mutante de la toxina tetánica nativa caracterizada porque tiene capacidad neuroprotectora y carece de actividad neurotóxica propia de la toxina tetánica nativa, por ejemplo, porque ha perdido su capacidad hidrólítica y/o de translocarse a través de la membrana de la vesícula endocítica. La capacidad neuroprotectora de este polipéptido que comprende, o está constituido por, dicha forma mutante de la toxina tetánica nativa puede evaluarse mediante ensayos tales como los descritos en los Ejemplos 1 y 2.

En otra realización particular, la invención contempla el uso de un polipéptido que comprende un fragmento funcional del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica.

Tal como aquí se utiliza, un fragmento funcional del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica es un péptido que comprende una porción de dicho dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica con capacidad neuroprotectora; en una realización particular, dicho fragmento funcional del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica mantiene las funciones de unión, internalización, translocación, transporte retro-axonal y salto trans-sináptico de la toxina tetánica nativa. La capacidad neuroprotectora de este fragmento funcional del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica puede evaluarse mediante ensayos tales como los descritos en los Ejemplos 1 y 2. Asimismo, la evaluación de si un fragmento del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica mantiene las funciones de unión, internalización, translocación, transporte retro-axonal y salto trans-sináptico de la toxina tetánica nativa puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. El tamaño de dicho fragmento funcional del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica no es crítico siempre y cuando tenga capacidad neuroprotectora.

En otra realización particular, la invención contempla el uso de un polipéptido que comprende una variante del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica.

Tal como aquí se utiliza, el término "variante" se refiere a un péptido sustancialmente homólogo y funcionalmente equivalente al dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica. Tal como aquí se utiliza, un péptido es "sustancialmente homólogo" a dicho dominio cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos de dicho dominio de, al menos, un 60%, ventajosamente de, al menos un 70%, preferentemente de, al menos, un 85%, y, más preferentemente de, al menos, un 95%. En una realización particular, dicho dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 y dicha variante es un péptido cuya secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: I de, al menos, un 60%, ventajosamente de, al menos un 70%, preferentemente de, al menos, un 85%, y, más preferentemente de, al menos, un 95%. La expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que el péptido en cuestión tiene capacidad neuroprotectora; en una realización particular, dicha variante mantiene las funciones de unión, internalización, translocación, transporte retro-axonal y salto trans-sináptico de la toxina tetánica nativa. La capacidad neuroprotectora de esta variante del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica puede evaluarse mediante ensayos tales como los descritos en los Ejemplos 1 y 2.

En otra realización particular, el polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, puede ser parte de una proteína de fusión. Dicha proteína de fusión posee capacidad neuroprotectora; en una realización particular mantiene las funciones de unión, internalización, translocación, transporte retro-axonal y salto trans-sináptico de la toxina tetánica nativa. La capacidad neuroprotectora de esta proteína de fusión puede evaluarse mediante ensayos tales como los descritos en los Ejemplos 1 y 2.

A modo ilustrativo, no limitativo, dicha proteína de fusión comprende una región A, que contiene el polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, unida a una región B, que contiene un segundo polipéptido; dicho segundo polipéptido puede contener cualquier polipéptido de interés, por ejemplo, un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento del mismo o una variante del mismo, un polipéptido diferente con capacidad neuroprotectora, etc. Dicha región B puede estar unida bien al extremo amino-terminal de dicha región A, o bien, alternativamente, dicha región B puede estar unida al extremo carboxilo-terminal de dicha región A. La región A de dicha proteína de fusión puede estar unida directamente a dicha región B. Alternativamente, dicha región A no está unida directamente a dicha región B sino que está unida a través de un polipéptido espaciador (linker) entre dichas regiones A y B. Por tanto, si se desea, la proteína de fusión de la invención puede contener, además, un polipéptido espaciador situado entre dichas regiones A y B. En una realización particular, dicha proteína de fusión incluye unas dianas de corte proteolítico entre las regiones que componen la proteína de fusión. Estos sitios permitirán la separación de ambas secuencias proteicas.

El dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica (TeTx) puede obtenerse por digestión de la cadena pesada de la toxina tetánica con papaína por métodos convencionales. Alternativamente, dicho dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica puede obtenerse por métodos convencionales, conocidos por los expertos en la materia, basados en la tecnología del ADN recombinante, mediante la expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica para dicho dominio en células hospedadoras apropiadas. Los fragmentos de dicho dominio también pueden obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante digestión del dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica nativa con las proteasas adecuadas, o, ventajosamente, mediante la expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica para dicho fragmento en células hospedadoras apropiadas. Las variantes de dicho dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica pueden obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante mutagénesis y expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha variante en células hospedadoras apropiadas.

Análogamente, el polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, puede obtenerse por métodos bien conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mediante la expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica para dicho polipéptido en células hospedadoras apropiadas. Dichas células hospedadoras apropiadas son células que contienen la secuencia de nucleótidos que codifica para dicho polipéptido. Por ejemplo, dichas células contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho polipéptido o han sido transformadas con dicho ácido nucleico. Similarmente, dichas células pueden ser células transformadas, transfectadas o infectadas con un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho polipéptido. A modo ilustrativo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ácido nucleico puede ser un plásmido que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3]. En una realización particular, dicho polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, puede obtenerse a partir de la expresión en células hospedadoras de un vector de expresión que contiene el ADNc que codifica para dicho polipéptido mediante un procedimiento como el descrito por Gil et al. [Gil et al., 2003. C-terminal fragment of the tetanus toxin heavy chain activates Akt and MEK/ERK signalling pathways in a Trk receptor-dependent manner in cultured cortical neurons. Biochem. J. 373, 613-620].

Asimismo, dicha proteína de fusión que contiene un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, puede obtenerse mediante la expresión génica de la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión en células hospedadoras apropiadas. Dichas células hospedadoras apropiadas son células que contienen la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión, por ejemplo, células que han sido transformadas con dicho ácido nucleico, o células transformadas, transfectadas o infectadas con un vector recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha proteína de fusión tal y como se ha explicado anteriormente.

Tal y como se describe en los ejemplos, ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que el pretratamiento de neuronas granulares de cerebelo (Ejemplo 1) y de ratas (Ejemplo 2) con un polipéptido que comprende el dominio C-terminal, no tóxico, de la cadena pesada de la toxina tetánica atenúa la muerte celular inducida por MPP^{+}. Del mismo modo, la administración de dicho polipéptido que comprende el dominio C-terminal, no tóxico, de la cadena pesada de la toxina tetánica al cultivo celular, antes del tratamiento con MPP^{+}, reduce los efectos apoptóticos bioquímicos desencadenados por este último (Ejemplo 1). Estos resultados ponen de manifiesto la capacidad neuroprotectora de dicho polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, por lo que puede ser utilizado en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento del parkinsonismo.

Tal como aquí se utiliza, el término "parkinsonismo", también llamado síndrome Parkinson o parkinson atípico, incluye un grupo de trastornos del sistema motor que se producen normalmente como consecuencia de otro trastorno neurológico primario. Entre dichos trastornos primarios que pueden producir parkinsonismo se incluyen los tumores en el encéfalo, los traumatismos repetidos en la cabeza, el parkinsonismo inducido por medicamentos (e.g., mediante uso prolongado de tranquilizantes, tales como las fenotiacinas, las butiroferonas, la reserpina, la metoclopramida, etc.), el parkinsonismo inducido por tóxicos (e.g., envenenamiento por manganeso, monóxido de carbono, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), cianuro, etc.), el parkinsonismo post-encefalítico (encefalitis letárgica) (e.g., infección viral que causa la llamada "enfermedad del sueño"), la degeneración estriatonígrica; el parkinsonismo que acompaña a otras condiciones neurológicas (e.g., el síndrome de Shy-Drager (atrofia multisistémica), la parálisis supranuclear progresiva, la enfermedad de Wilson, la corea de Huntington, el síndrome de Hallervorden-Spatz, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la atrofia olivopontocerebelosa, la encefalopatía post- traumática, etc.). Ejemplos ilustrativos, no limitativos de parkinsonismo incluyen el parkinsonismo idiopático (primario), la Enfermedad de Parkinson, un parkinsonismo sintomático (secundario) y el parkinsonismo "plus" (e.g., atrofia sistémica múltiple, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticodentatodonígrica, síndromes asociados a demencia con cuerpos de Lewy, etc.).

En una realización particular, la invención contempla el uso de dicho polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una patología seleccionada entre el parkinsonismo idiopático, la Enfermedad de Parkinson, un parkinsonismo sintomático y el parkinsonismo "plus" (e.g., atrofia sistémica múltiple, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticodentatodonígrica, síndromes asociados a demencia con cuerpos de Lewy, etc.). En una realización particular y preferida, dicho medicamento se usa para el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson.

En general, para el tratamiento de parkinsonismos, el polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, se formulará en una composición farmacéutica apropiada, en la cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables, para su administración a un sujeto en necesidad de tratamiento.

Tal como se utiliza en esta descripción, el término "sujeto" se refiere a cualquier mamífero, e incluye, aunque no se limita a, animales domésticos, roedores, primates y humanos. Preferentemente, dicho individuo es un ser humano, macho o hembra, de cualquier edad o raza.

De forma más concreta, para su administración a un sujeto, dicho polipéptido se formulará en una forma farmacéutica adecuada para su administración, por la vía de administración elegida, a un sujeto. Para ello, dicha composición farmacéutica incluirá los vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la elaboración de la forma farmacéutica de administración elegida. Información sobre excipientes o vehículos que pueden ser utilizados en la elaboración de dicha composición farmacéutica, así como sobre formas farmacéuticas de administración de principios activos, en general, puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 1ª Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.

Dicha composición farmacéutica comprende, al menos, un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, en una cantidad terapéuticamente efectiva. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de dicho polipéptido calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las caracteristicas propias del polipéptido y el efecto terapéutico a conseguir, las características del individuo que vaya a ser tratado, la severidad de la enfermedad que padezca dicho individuo, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben ser consideradas tan solo como guías para el experto en la materia, y éste debe ajustar las dosis en función de las variables citadas anteriormente. Típicamente, dicho polipéptido se administrará en una dosis apropiada, típicamente comprendida entre 0,01 y 50 \mug/kg peso corporal, preferiblemente entre 0,1 y 10 \mug/kg, más preferentemente entre 0,1 y 1 \mug/kg peso corporal. El polipéptido se puede administrar diariamente. Sin embargo, debido a su acción neurotrófica sobre mecanismos amplificadores de la respuesta, su elevado tropismo y su elevada vida media, este fármaco se puede espaciar a dosis de días alternos, semanas o meses dependiendo de la gravedad del síndrome presente.

La composición farmacéutica comprende, al menos, un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, nasal (mucosa), etc., típicamente, por vía parenteral, ventajosamente, mediante su administración intramuscular o subcutánea. Asimismo, dicha composición farmacéutica puede presentarse en cualquier forma de presentación apropiada para su administración, por ejemplo, en forma de presentación sólida (e.g., comprimidos, cápsulas, gránulos, etc.), líquida (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.), etc., para su administración por la vía de administración elegida. En una realización particular, dicha composición farmacéutica se formula en forma de una forma farmacéutica de dosificación unitaria apropiada.

En una realización particular, dichas composiciones farmacéuticas pueden estar en una forma farmacéutica de administración por vía oral, bien en forma sólida o líquida. Ejemplos ilustrativos de formas farmacéuticas de administración por vía oral incluyen comprimidos, cápsulas, granulados, soluciones, suspensiones, etc., y pueden contener los excipientes convencionales, tales como aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubrificantes, humectantes, etc., y pueden ser preparadas por métodos convencionales. En otra realización particular, las composiciones farmacéuticas también pueden ser adaptadas para su administración parenteral, en forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o productos liofilizados, estériles, en la forma de dosificación apropiada; en este caso, dichas composiciones farmacéuticas incluirán los excipientes adecuados, tales como tampones, tensioactivos, etc. En cualquier caso, los excipientes se elegirán en función de la forma farmacéutica de administración seleccionada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones, citado supra.

La composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, puede usarse con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos otros fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición o facilitarse como una composición farmacéutica separada para su administración al mismo tiempo (administración simultánea) que dicha composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido o en momentos diferentes (administración secuencial). Así, en una realización particular, el polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, y las composiciones farmacéuticas que lo contienen pueden utilizarse junto con otros fármacos adicionales útiles en el tratamiento del parkinsonsimo, por ejemplo, corticoesteroides, inmunosupresores, inmunomoduladores, etc., para proporcionar una terapia de combinación. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos fármacos adicionales incluyen: levodopa, ascarbidopa, amantadina, antihistamínicos, antidepresivos, bromocriptina, inhibidores de la monoaminooxidasa (IMAO), etc. Dichos fármacos adicionales pueden entonces formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo.

En una realización particular, dicha composición farmacéutica que contiene un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, es administrada en combinación con otro fármaco adicional útil en el tratamiento del parkinsonismo, tal como se ha mencionados previamente.

En otra realización particular, dicho fármaco adicional útil en el tratamiento del parkinsonismo se administra en forma de una composición farmacéutica separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende el polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo o una variante del mismo.

El siguiente ejemplo ilustra la invención y no debe ser considerado limitativo del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Protección de las neuronas granulares de cerebelo de muerte celular por apoptosis inducida por MPP^{+} mediante un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica

En las últimas dos décadas se han desarrollado varios modelos para la enfermedad de Parkinson (EP). El veneno mitocondrial 1-metil-4-fenil-1,2,3,6- tetrahidropiridina (MPTP) induce una forma de parkinsonismo que es clínicamente indistinguible y que por ello se ha empleado habitualmente con propósitos experimentales. Cultivos celulares maduros de neuronas granulares de cerebelo (NGCs) son susceptibles a los efectos neurotóxicos del metabolito derivado de la monoamina oxidasa B (MAOB), 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP^{+}). MPP^{+} induce apoptosis y muerte celular de las NGCs en cultivo, presumiblemente seguido a la activación de un programa de muerte celular intrinseco. MPP^{+} bloquea la reoxidación de la deshidrogenasa NADH por la coenzima Q de la oxidación mitocondrial, lo que resulta en el cese de la fosforilación oxidativa. Las células agotan el ATP, el potencial de membrana mitocondrial colapsa y como resultado se produce la muerte celular. Estudios recientes sugieren que el estrés oxidativo juega un papel importante en el proceso neurodegenerativo de la EP. La generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) de fuentes mitocondriales y/o no mitocondriales contribuye aparentemente al estrés oxidativo inducido por MPP^{+}.

Materiales y Métodos 1.1 Materiales

Ratas Sprague-Dawley (OFA) se obtuvieron del Servei d'Estabulari de la Universitat Autónoma de Barcelona (Barcelona; España). El medio base Eagle's (BME), el suero fetal de ternero, las placas de cultivo, la penicilina y la estreptomicina son de Pan Biotechnology GmbH, Fontlab (Barcelona; España). El 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP^{+}), la citosina arabinósido, el 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-bromuro de difeniltetrazolium (MTT), la poli D-lisina, los inhibidores de proteasa y la wortmanina se obtuvieron de Sigma (St Louis, MO, Estados Unidos). El 4',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) es de Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA; Estados Unidos). Las células Pansorbin y PD98059 son de Calbiochem (San Diego, CA, Estados Unidos). El polipéptido utilizado (denominado H_{C}-TeTx) está constituido por el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, comprende la secuencia de 451 aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, y ha sido obtenido siguiendo el protocolo descrito por Gil et al. (Gil et al., 2003. C-terminal fragment of the tetanus toxin heavy chain activates Akt and MEKIERK signalling pathways in a Trk receptor-dependent manner in cultured cortical neurons. Biochem. J. 373, 613-620).

1.2 Cultivo de neuronas granulares de cerebelo (CGNs)

Se obtuvieron cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo (CGNs) a partir de ratas Sprague-Dawley de 7 a 8 días de edad. Para ello, se diseccionaron los cerebelos, se cortaron en pequeños trozos y se digirieron con tripsina (0,025%, 10 minutos a 37°C) en una solución tampón bicarbonato Krebs-Ringer (NaCl 125 mM, KCl 3 mM, MgSO_{4} 1,2 mM, CaCl 1,2 mM, NaHCO_{3} 22 mM, NaH_{2}PO_{4} 1 mM y glucosa 10 mM) (pH = 7,4) que contiene albúmina de suero bovino (0,3%). Tras añadir inhibidor de tripsina de soja (0,5 mg/mL) y DNAsa (30 Ul/mL), el tejido se disgregó pasándolo a través de una punta fina de plástico de pipeta. La suspensión celular resultante se filtró a través de un filtro de nylon de 100 \mum de tamaño de poro, se centrifugó y resuspendió en BME suplementado con 10% de suero de ternero fetal, KCl 20 mM, glucosa 5 mM, glutamina 2 mM, penicilina (50 UI/ml) y estreptomicina (50 \mug/mL). A continuación, las células se sembraron a una densidad de 1,3 x 10^{6} células/mL, en placas de 24 pocillos o en placas de 6 pocillos pretratadas con poli-L-lisina e incubadas en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} a 37°C. 24 horas después de la siembra, se añadió citosina arabinósido (10 \muM) para detener el crecimiento de células no neuronales, mayoritariamente de astrocitos y células de microglía. Todos los experimentos se llevaron a cabo a los 7 días de cultivo en BME sin suero fetal de ternera y suplementado con KCl 20 mM, glutamina 2 mM, 5 U/mL de penicilina y 50 \mug/mL de estreptomicina.

1.3 Ensayo de reducción MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2, 5-bromuro de difeniltetrazolium)

La actividad mitocondrial se estimó mediante ensayo de reducción de MTT 24 horas después de mantener las células en KCl 5 mM (K5) ó 25 mM (K25). Se añadió la sal de tetrazolium (MTT, a 0,2 mg/mL) a las células y después de 45 minutos a 37°C se retiró el medio y se añadió dimetilsulfóxido (DMSO) al 100% a las placas. Después de una incubación de 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente, se cuantificó por espectrofotometría la cantidad de azul formazan formado medido a 560 nm de longitud de onda de excitación después de la reducción del MTT usando un lector de microplacas Multiskan RC (Labsystems; Helsinki, Finlandia). La absorbancia de un pocillo en el que no había células se usó como fondo y se substrajo dicho valor. Existe una muy buena correlación entre la capacidad de los cultivos para formar azul formazan, el contenido en proteína y DNA, y la proporción de neuronas que aparecen intactas en el microscopio de contraste de fase.

Los resultados que se obtuvieron usando el ensayo MTT fueron confirmados usando el método de rojo neutral que mide la viabilidad celular [D. Okada, Neutral red as a hydrophobic probe for monitoring neuronal activity, J. Neurosc. Meth. 110, 85-92, 2000]. Los datos se presentan como media\pmDE (desviación estándar). El análisis estadístico se llevó a cabo usando el ANOVA y el test de Studen-Neuman-Keuls.

1.4 Tinción de DNA y medida de fluorescencia

Para la visualización por microscopía de fluorescencia de la condensación de la cromatina y la degradación nuclear, se utilizó la tinción 4',6-diaminodifenil-2-fenilindol (DAPI). Después de diferentes tratamientos, las células se lavaron rápidamente con TBS (Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH = 7,4) y se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 minutos. Después de la fijación, las neuronas se lavaron dos veces con TBS frío, y después se realizó la tinción con DAPI (10 \mug/mL). Las preparaciones se excitaron a una longitud de onda de 360 nm y la absorbancia se midió a 460 nm. Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron usando un microscopio de fluorescencia (Leica DMRB) equipado con un programa de software Q500MC QuantiMed. Los datos mostrados se obtuvieron a partir de dos placas por tratamiento de dos o tres preparaciones celulares por separado.

Resultados 2.1 Efectos protectores del Hc-TeTx contra la muerte celular por apoptosis en CGNs inducida por MPP^{+}

Resultados previos han demostrado el efecto protector del dominio C-terminal de la toxina tetánica en una situación de estrés celular, tal como la de privación de potasio [Chaib-Oukadour et al., 2004. The C-terminal domain of the heavy chain of tetanus toxin rescues cerebellar granule neurones form apoptotic death: involvement of phosphatidylinositol 3-kinase and mitogen-activated protein kinase pathways. J. Neurochemistry]. Los inventores han investigado los efectos de dicho dominio C-terminal de la toxina tetánica en la viabilidad de CGNs tratadas con el agente neurotóxico 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP^{+}). Las células en cultivo se expusieron a concentraciones crecientes de MPP^{+} (10 \muM - 100 \muM) con y sin H_{C}-TeTx durante 24 horas y se examinó su viabilidad celular. Los resultados muestran que la neurotoxicidad inducida por MPP^{+} se atenúa en la presencia de H_{C}-TeTx (Figura 1). Los resultados obtenidos usando los ensayos MTT se confirmaron usando el método de rojo neutral para la cuantificación de la viabilidad celular [D. Okada, Neutral red as a hydrophobic probe for monitoring neuronal activity, J. Neurosc. Meth. 110, 85-92, 2000].

La atenuación de la neurotoxicidad inducida por MPP^{+} por adición de H_{C}-TeTx es dependiente de concentración con un máximo en 10 nM a 100 nM. Se obtuvieron otras evidencias con respecto a los cambios en viabilidad celular y el fenómeno de rescate observado en los cultivos de células tratadas con H_{C}-TeTx mediante marcaje nuclear con DAPI y medida de fluorescencia. Como se muestra en el gráfico de la Figura 2, el 20,5\pm3,2% de las células tratadas con MPP^{+} mostraron, tras 24 horas, fragmentación nuclear, un fenómeno típicamente asociado con la muerte celular por apoptosis. Por el contrario, en presencia de H_{C}-TeTx, sólo un 10\pm2,7% de las células mostraron signos de apoptosis. La condensación nuclear en las células pretratadas con H_{C}-TeTx no se alteró con respecto a las células control.

Ejemplo 2 Recuperación de los niveles de dopamina en ratas tratadas con MPP^{+} tras administración de un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica H_{C}-TeTx Materiales y Métodos 1.1 Tratamiento farmacológico de los animales

Los animales utilizados fueron ratas machos de la cepa Spargue-Dawley (OFA) de 200 a 250 gramos de peso corporal obtenidas del Servei d'Estabulari de la Universitat Autónoma de Barcelona (Barcelona; España). La operación quirúrgica se realizó bajo condiciones asépticas. Los animales fueron pretratados con un inhibidor del transporte de noradrenalina, desipramina (25 mg/kg) vía intraperitoneal (i.p.) 15 minutos antes de la operación quirúrgica para limitar la entrada de MPP^{+} (ioduro de 1-metil-4-fenilperidina) a través del transportador de noradrenalina. Los animales se anestesiaron con isoflurano (50 mg/kg) y se inmovilizaron en un aparato estereotáxico (KOPF Instruments). Las coordenadas estereotáxicas fueron determinadas de acuerdo al atlas de Paxinos y Watson (George Paxinos and Charles Watson. 1986. The rata brain in stereotaxic oordinates (2nd Ed) Academic Press, Inc. San Diego). Se abrió un pequeño orificio en el cráneo hacia el núcleo estriado derecho (0,7 mm anteroposterior, 2,8 mm lateral). Para aplicar los fármacos se introdujo una aguja de 30-gauge (5,0 mm dorsoventral). El MPP^{+} (Sigma, St Louis, MO, USA) en tampón salino (10 \mug) fue perfundido a razón de 0,124 y 0,5 \muL/min durante 5 minutos. Los volúmenes totales inyectados para las dosis indicadas fueron entre 1,0 \muL (aproximadamente 33,7 \muM) y 2,5 \muL (aproximadamente 13,5 \muM). Para determinar si el diseño de la inyección tiene efecto en los niveles de catecolaminas, los animales Control fueron perfundidos con el vehículo, y parte de los animales Control y Tratados con MPP^{+} fueron perfundidos con H_{C}-TeTx (10 ng) (Ejemplo 1). Para cada caso estudiado (Control, MPP^{+}, H_{C}-TeTx y MPP^{+}/H_{C}-TeTx) fueron utilizadas de tres a seis ratas. Las ratas fueron sacrificadas 5 días después de la inyección de MPP^{+} y los niveles de dopamina y sus metabolitos fueron determinados tanto en el núcleo estriado ipsilateral y como el contralateral. En un protocolo similar el fragmento H_{C}-TeTx fué inyectado por vía intraperitoneal (10 \mug por animal, i.p.) 5 días antes de la aplicación estereotáxica de MPP^{+}. Las ratas fueron sacrificadas por decapitación bajo anestesia, y diseccionadas las áreas seleccionadas para su determinación.

1.2 Preparación de las muestras

El tejido obtenido se introduce en un tubo adecuado de propileno de 5 ó 10 mL según el volumen, previamente pesado. Las muestras se pesan rápidamente y se congelan a -80°C en el caso de no procesarlas de inmediato. Se añade tampón de desproteinización y homogeneización (ácido perclórico 250 mM, EDTA 250 \muM, metabisulfito sódico 100 \muM) en una relación 1/10 (w/v) y, posteriormente, se homogeniza mediante sonicación. Todo el proceso se lleva a cabo manteniendo tanto las muestras como las soluciones en un baño de hielo/agua. Una vez homogeneizado, se mantiene un mínimo de 24 h a -80°C. Para convertir los datos obtenidos a valores de concentración se utilizan estándares externos acordes a las concentraciones esperadas. Se descongelan muestras y estándares y se centrifugan a 16.000 g durante 10 minutos en una microcentrifuga Eppendorf.

1.3 Determinación de dopamina y sus metabolitos por cromatografia líquida de alta resolución y detección electroquímica (HPLC ECD)

Las determinaciones de los niveles de catecolaminas se realizaron por HPLC y los niveles de dopamina (DA), de ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC), de 3-metoxitiramina (3-MT) y de ácido homovalinico (HVA) se determinaron tanto en el núcleo estriado ipsilateral como en el contralateral. Los datos del núcleo estriado ipsilateral se compararon con los del respectivo núcleo estriado contralateral, usando el test t-student por parejas (*p \leq 0.05). Las muestras de tejido congeladas a -80°C se utilizaron para determinar el nivel endógeno de catecolamina y sus metabolitos con un sistema de HPLC ECD según el método que se describe a continuación: 20 \muL de sobrenadante de cada muestra se inyectaron (Inyector Kontron Autosampler 560; Kontron Instruments, Zurich, Switzerland) directamente en el sistema de HPLC. Los análisis se realizaron a temperatura controlada (30 \pm 0,5°C). La fase móvil consiste en ácido cítrico 0,1 M, EDTA 50 \muM, octanosulfonato de sodio 1,2 mM. El pH = 2,3 se ajusta con trietilamina (TEA). Se añadió 1-1,5% de acetonitrilo y se filtró al vacío con una membrana de nylon 0,22 pm. El flujo de elución fue de 1 mL/min. Se utilizó un detector electroquímico (Coulochem II, coulométrico con un "dual-electrode analitical cell" Modelo 5011 (ESA, Chelmsford, MA, Estados Unidos). El potencial de los electrodos 1 y 2 se programó a +0,05 V y +0,4 V respectivamente. El tratamiento de los resultados obtenidos se realizó con el programa de Kontron "PC Integration Pack".

Resultados

Los resultados de la medida de los metabolitos 3-MT, DOPAC y HVA dieron un patrón igualmente significativo de recuperación de los animales doblemente tratados con MPP^{+} y H_{C}-TeTx frente a los tratados con MPP^{+}. Los animales a los que se les inyectó el neuroprotector H_{C}-TeTx periféricamente y la neurotoxina MPP^{+} intracranealmente también recuperaron los niveles de dopamina respecto al grupo tratado únicamente con MPP^{+} (Figura 3). En tratamiento con dosis únicas de H_{C}-TeTx, tanto por vía intraestriatal como por vía intraperitoneal, no mostraron cambios significativos respecto al grupo Control.

<110> UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA

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<120> EMPLEO DE UN POLIPÉPTIDO QUE COMPRENDE EL DOMINIO C-TERMINAL DE LA CADENA PESADA DE LA TOXINA TETÁNICA EN EL TRATAMIENTO DEL

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PARKINSONISMO

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<160> 1

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 451

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica

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4

5

Claims

1. Uso de un polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento del parkinsonismo.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo.

3. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido es un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho parkinsonismo es una patología seleccionada entre el parkinsonismo idiopático, la Enfermedad de Parkinson, un parkinsonismo sintomático y un parkinsonismo "plus".

5. Uso según la reivindicación 4, en el que dicho parkinsonismo es una patología seleccionada entre la Enfermedad de Parkinson, la atrofia sistémica múltiple, la parálisis supranuclear progresiva, la degeneración corticodentatodonígrica y los síndromes asociados a demencia con cuerpos de Lewy.

6. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es una composición farmacéutica destinada a su administración por vía oral, parenteral o nasal.

7. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición farmacéutica es administrada en combinación con otro fármaco adicional útil en el tratamiento del parkinsonismo.

8. Uso según la reivindicación 7, en donde dicho fármaco adicional útil en el tratamiento del parkinsonismo se administra en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende el polipéptido que comprende el dominio C-terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica, o un fragmento funcional del mismo, o una variante del mismo.