ES2332628B1 - Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica como medicamento. - Google Patents
Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica como medicamento. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de la secuencia codificante del dominio
carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como
medicamento.
Uso de la secuencia codificante del dominio del
extremo carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica
como medicamento, preferentemente en el tratamiento de la Esclerosis
Lateral Amiotrófica (ELA), así como el polipéptido codificado por
dicha secuencia para el tratamiento de la mencionada enfermedad.
Description
Uso de la secuencia codificante del dominio
carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como
medicamento.
La presente invención se refiere al uso de la
secuencia codificante del domino del extremo carboxilo terminal de
la cadena pesada de la toxina tetánica como medicamento,
preferentemente en el tratamiento de la Esclerosis Lateral
Amiotrófica (ELA), así como el polipéptido codificado por dicha
secuencia para el tratamiento de la mencionada enfermedad.
La Esclerosis Lateral Amiotrófica (enfermedad de
Lou Gehrig's o de Charcot) es una enfermedad progresiva, incurable
y mortal que cursa con la degeneración de motoneuronas a nivel
medular, bulbar y de cortex motor. En el caso de España, la
enfermedad presenta una incidencia de 2/100.000 y una prevalencia
de 1/10.000, lo que indica que aproximadamente 40.000 españoles
desarrollarán la enfermedad a lo largo de su vida (fuente:
Asociación Española de Esclerosis Lateral Amiotrófica -ADELA-).
A pesar de ser una enfermedad declarada como tal
desde hace largo tiempo, aún no se conocen con exactitud las causas
que la originan y, aunque existen formas genéticas de la misma,
también son conocidos casos en los que no parece tener un origen
hereditario. Así, se estima que el 10% de los casos son de origen
genético, las formas familiares, de los cuales un
15-20% se corresponden con mutaciones a nivel de la
enzima Superóxido Dismutasa (SOD-1.) e incluso
también se han observado mutaciones en esta enzima en formas
esporádicas de la enfermedad (Brown. R.H. Jr. (1997). Arch. Neurol.
54(10) 1246-1250). Mutaciones en NFH, gen
que codifica para la cadena pesada de los neurofilamentos, también
han sido encontradas de forma excepcional en algún enfermo de
esclerosis lateral
amiotrófica. Consecuentemente, la investigación de la herencia genética de esta enfermedad presenta gran interés.
amiotrófica. Consecuentemente, la investigación de la herencia genética de esta enfermedad presenta gran interés.
En los últimos años, la creación de modelos
animales de la enfermedad ha sido una de las herramientas más
relevantes en los estudios de tratamiento experimental, que han
servido para aclarar algunas dudas sobre sus causas, aunque todavía
éstas son desconocidas en gran medida. Ni los ratones knockout para
la enzima SOD-1, ni los animales transgénicos para
la diferentes mutaciones en la enzima SOD-1 humana
han conseguido reproducir un cuadro clínico similar a la enfermedad
en humanos. El animal que más se aproxima al desarrollo de la
enfermedad es un transgénico que presenta varias copias de la
Superóxido dismutasa mutada en su posición 93, es el llamado
SOD1G93A (Tu, P.H., et al. (1996.) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 93(7): 3155-3160.) que es suministrado
por The Jackson Laboratory.
A pesar de los numerosos estudios realizados
tanto para conocer su causa como su mecanismo por el momento no
existen tratamientos clásicos efectivos. Actualmente, se encuentran
en desarrollo tres líneas de investigación basadas en la aplicación
de antagonistas del glutamato, factores neurotróficos y
antioxidantes, aunque hasta la fecha ninguna de ellas a desembocado
en un tratamiento eficaz.
Desde hace unos años se conoce la capacidad de
los factores neurotróficos para rescatar a la motoneuronas de la
degeneración. De gran interés han resultado las experiencias de
terapia génica realizadas en modelos animales, utilizando vectores
adenovirales que expresan diversos factores neurotróficos (GDNF,
CNTF, NI-4, IGF-1), que han ofrecido
resultados esperanzadores. Sin embargo, las inyecciones
adenovirales presentan el inconveniente de tener que aplicarse en
animales neonatos debido a la gran respuesta inmunitaria que
ocasionan. Por tanto, aunque sus resultados sean esperanzadores
resulta imprescindible el desarrollo de nuevos vectores menos
inmunogénicos que posibiliten un tratamiento efectivo de la
ELA.
En relación a los ensayos clínicos que han sido
llevados a cabo hasta la fecha, los iniciados en el año 1996 por el
Dr. Schuelp no obtuvieron resultados satisfactorios
(http://www.wiley.co.uk/genetherapy), barajándose como las posibles
causas del fracaso: la naturaleza del factor neurotrófico utilizado
en los ensayos (CNTF) y/o su falta de accesibilidad al Sistema
Nervioso Central. En 1999, el grupo del Dr. Axel Kahn comprobó en
modelos animales que efectivamente la vía de administración de dicho
factor neurotrófico resulta un factor importante para su efecto
terapéutico (Haase et al. (1999) Ann. Neurol. 45(3)
296-304). Esta falta de especificidad también ha
sido propuesta como causa probable del fracaso en la administración
de BDNF en humanos de forma subcutánea.
Por otra parte, cuando los factores
neurotróficos son administrados de forma sistémica presentan
problemas de toxicidad al actuar sobre otros tejidos. A pesar de
todos estos inconvenientes las posibilidades terapéuticas de los
factores neurotróficos no han dejado de investigarse debido a sus
prometedores resultados en fase preclínica. Concretamente, el
último ensayo clínico que está teniendo lugar en el Medical Center
in Rochester (Minnesota) se basa de nuevo en la administración de
un factor neurotrófico, IGF-1.
Los autores de la presente invención han
descubierto que el dominio carboxilo terminal, no tóxico, de la
cadena pesada de la toxina tetánica (HcTeTx), que hasta la fecha
únicamente había sido utilizado en el tratamiento de ELA como
vehículo de diversos factores neurotróficos, así como de la enzima
SOD-1, mediante la creación de proteínas de fusión,
es capaz por si solo de prolongar la supervivencia de modelos
animales de la enfermedad.
Muy interesantes han sido los resultados
"in vivo" arrojados por la inyección de la secuencia
codificante de HcTeTx desnuda, que ha conseguido prolongar la
supervivencia de los animales modelo tratados de 23 días, respecto
al tratamiento con HcTeTx. Este hecho presenta a la secuencia
codificante de HcTeTx como una alternativa con una eficacia dos
veces superior a la propia terapia con proteína recombinante
HcTeTx.
Así, un primer aspecto de la invención se
relaciona con el uso de un polinucleótido que comprende la
secuencia codificante de HcTeTx aislada, sus variantes alélicas o
fragmentos funcionales de las mismas para la elaboración de un
medicamento, preferentemente para el tratamiento de ELA. En una
realización preferida de la invención la secuencia codificante de
HcTeTx abarca desde el triplete codificante del aminoácido V
(Valina) del extremo amino terminal de HcTeTx hasta el triplete que
codifica para el aminoácido D (Aspartato), preferentemente del
aminoácido V(854) a D (1315) de la secuencia con número de
acceso (NCBI.: PO4958). En una realización todavía más preferida de
este aspecto de la invención la secuencia codificante de HcTeTx es
la SEQ ID NO:1 y el fragmento de HcTeTx es la SEQ ID NO:5. En
adelante este polinucleótido será denominado como
"polinucleótido de la invención".
En otra realización preferida, el polinucleótido
de la invención puede encontrarse mutado (delección, inserción,
inversión, mutación puntual, etc.) donde dichas mutaciones no
afectan a su capacidad para actuar como medicamento, concretamente
para el tratamiento de ELA. El mantenimiento del efecto terapéutico
del polinucleótido de la invención mutado puede ser comprobado
mediante la reproducción de cualquiera de los ejemplos I y II. A lo
largo de la descripción estos polinucleótidos mutados serán
considerados también como variantes alélicas.
En una realización también preferida el
polinucleótido de la invención puede comprender además secuencias
promotoras, terminadoras, silenciadoras, secuencias que faciliten
su integración en cromosomas o cualquier tipo de estructura
organizativa del material genético, etc.
Un segundo aspecto de la invención, está
referido al uso de un vector que comprende al polinucleótido de la
invención para la elaboración de un medicamento, preferentemente
para el tratamiento de ELA, donde dicho vector es seleccionado del
grupo que comprende, sin ningún tipo de limitación, plásmidos,
fagos, cósmidos, fagémidos, cromosomas artificiales de levaduras
(YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas
humanos artificiales (HAC), vectores virales, tales como
adenovirus, retrovirus o cualquier otro tipo de molécula de DNA o
ARN con capacidad para replicarse en el interior de una célula,
procariota o eucariota. En adelante este vector será denominado
como "vector de la invención".
Un tercer aspecto de la invención está referido
al uso de una célula transgénica para la elaboración de un
medicamento, preferentemente para el tratamiento de ELA, donde
dicha célula comprende al polinucleótido de la invención o al
vector de la invención.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al
uso de un polipéptido aislado que comprende la secuencia de HcTeTx,
sus variantes alélicas o sus fragmentos funcionales de las mismas
para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de ELA.
En una realización preferida de la invención la secuencia de HcTeTx
abarca desde el aminoácido V(854) a D(1315) de la
secuencia con número de acceso (NCBI.: PO4958). En una realización
todavía más preferida de este aspecto de la invención, la secuencia
de HcTeTx es la SEQ ID NO:2 y el fragmento de HcTeTx es la SEQ ID
NO:6. En adelante este polinucleótido será denominado como
"polipéptido de la invención".
En otra realización preferida, el polipéptido de
la invención está mutado (deleccíón, inserción, inversión,
sustituciones puntuales de aminoácidos, etc.), aunque dichas
mutaciones no afectan a su capacidad para actuar como medicamento en
el tratamiento de ELA. El mantenimiento del efecto terapéutico del
polipéptido de la invención mutado puede ser comprobado mediante la
reproducción de los ejemplos 1-2.
Para la administración del medicamento o la
composición farmacéutica el polinucleótido, los vectores, las
células transgénicas o polipéptido de la invención se formularán en
una forma farmacéutica adecuada para su administración, por la vía
de administración elegida. Para ello, dicha composición
farmacéutica incluirá los vehículos y excipientes farmacéuticamente
aceptables necesarios para la elaboración de la forma farmacéutica
de administración elegida. Información sobre excipientes o
vehículos que pueden ser utilizados en la elaboración de dicha
composición farmacéutica, así como sobre formas farmacéuticas de
administración de principios activos, en general, puede encontrarse
en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i
Trillo, 1ª Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
Dicha composición farmacéutica comprende, al
menos, cualquiera de los elementos del grupo que comprende: el
polinucleótido, los vectores, las células transgénicas o el
polipéptido de la invención deben encontrarse en una cantidad
terapéuticamente efectiva. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva"
se refiere a la cantidad del elemento seleccionado calculada para
producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre
otras causas, por las características propias del propio elemento
polipéptido y el efecto terapéutico a conseguir, las
características del individuo que vaya a ser tratado, la severidad
de la enfermedad que padezca dicho individuo, etc. En adelante esta
composición farmacéutica será conocida como "composición
farmacéutica o medicamento de la invención".
La composición farmacéutica de la invención
puede ser administrada por cualquier vía de administración
apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, nasal (mucosa),
etc., típicamente, por vía parenteral, ventajosamente, mediante su
administración intramuscular o subcutánea. Asimismo, dicha
composición farmacéutica puede presentarse en cualquier forma de
presentación apropiada para su administración, por ejemplo, en forma
de presentación sólida (comprimidos, cápsulas, gránulos, etc.),
líquida (soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.), etc., para su
administración por la vía de administración elegida. En una
realización preferida, dicha composición farmacéutica se formula en
forma de una forma farmacéutica de dosificación unitaria
apropiada.
En una realización preferida, la composición
farmacéutica puede estar en una forma farmacéutica de
administración por vía oral, bien en forma sólida, preferentemente
líquida, más preferentemente lista para su administración vía
intramuscular. Ejemplos ilustrativos de formas farmacéuticas de
administración por vía oral incluyen comprimidos, cápsulas,
granulados, soluciones, suspensiones, etc., y pueden contener los
excipientes convencionales, tales como aglutinantes, diluyentes,
desintegrantes, lubrificantes, humectantes, etc., y pueden ser
preparadas por métodos convencionales. En otra realización
preferida, las composiciones farmacéuticas también pueden ser
adaptadas para su administración parenteral, en forma de, por
ejemplo, soluciones, suspensiones o productos liofilizados,
estériles, en la forma de dosificación apropiada; en este caso,
dichas composiciones farmacéuticas incluirán los excipientes
adecuados, tales como tampones, tensioactivos, etc. En cualquier
caso, los excipientes se elegirán en función de la forma
farmacéutica de administración seleccionada. Una revisión de las
distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de
su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia
Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A.
de Ediciones, citado supra. Además, la composición
farmacéutica puede comprender otros polipéptidos, policleótidos,
vectores, o células que aporten una mayor eficacia y a la
composición.
El término "polinucleótido", tal y como se
utiliza en esta memoria, se refiere a una forma polimérica de
nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos. Este término se refiere exclusivamente a la
estructura primaria de la molécula. Así, este término incluye DNA
bi- y mono-catenario, así como RNA bi- y
mono-catenario.
El término "aislado" a lo largo de la
descripción cuando se emplea en asociación con HcTeTx o su
secuencia codificante, no únicamente está referido a que éstos se
encuentran aislados del cuerpo humano, sino que además no se están
formando parte de proteínas o enzimas de fusión que vayan a ejercer
una función terapéutica.
La expresión "fragmento funcional de HcTeTx,
variantes alélicas de la misma o las secuencias que las
codifican" está referida a lo largo de la descripción a un
péptido o un polinucleótido que comprende una porción de HcTeTx,
sus variantes alélicas o sus secuencias codificantes, que mantienen
su capacidad para actuar como medicamento, más concretamente para
el tratamiento de ELA, donde el mantenimiento de su capacidad
terapéutica puede ser comprobado mediante la reproducción de los
ejemplos 1-3.
El término "variante alélica" se refiere a
lo largo de la descripción a un polipéptido sustancialmente
homólogo y funcionalmente equivalente al dominio
C-terminal de la cadena pesada de la toxina
tetánica. Tal como aquí se utiliza, un péptido es
"sustancialmente homólogo" a dicho dominio cuando su secuencia
de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia
de aminoácidos de dicho dominio de, al menos, un 60%, 70%, 85% y,
más preferentemente de, al menos, un 95%. Preferentemente la
secuencia aminoacídica del mencionado dominio es la SEQ ID NO:2.
Este término también está referido en la descripción a un
polinucleótido capaz de codificar un polipéptido sustancialmente
homólogo y funcionalmente equivalente a HcTeTx. De este modo, el
polinucleótido podrá tener una homología de al menos un 40%, 50%,
60%, 70%, 85% ó 95% con el polinucleótido codificante de HcTeTx,
cuya secuencia nucleotídica es preferentemente la SEQ ID NO:1.
La expresión "funcionalmente equivalente",
tal y como se emplea a lo largo de la descripción, significa que el
polipéptido o el polipéptido mantiene su capacidad para actuar como
medicamento, más concretamente para el tratamiento de ELA, donde el
mantenimiento de su capacidad terapéutica puede ser comprobado
mediante la reproducción del ejemplo I o II.
Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se
pretende que sean limitativos de la presente invención.
Figura 1. Amplificación por PCR para la
detección de la expresión de HcTeTx. Diez días tras la inyección
intramuscular del plásmido pCMV-HcTeTx (n=2, calles
1 y 2) y del plásmido vacío pCMV (n=2, calles 3 y 4) se extrajo el
RNA del músculo y se procedió a la retrotranscripción. El cDNA
obtenido se amplificó por PCR para el gen HcTeTx. La calle 5 muestra
el control positivo (plásmido pCMV-HcTeTx) y en la
calle 6 se cargó el blanco de la reacción. En la calle M se
encuentra el marcador de talla de 100 pb.
Figura 2. Efectos del tratamiento con DNA
desnudo codificante para HcTeTx sobre el comienzo de los síntomas
en ratones modelo para la enfermedad de ELA SOD1 G93A. La
manifestación de los síntomas se retrasó significativamente en el
grupo tratado con HcTeTx (n=5) con respecto al grupo control
(n=10). Las probabilidades acumuladas se calcularon mediante el
análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (SPSS
13.0).
Figura 3. Efectos del tratamiento con DNA
desnudo codificante para HcTeTx sobre la supervivencia en ratones
modelo para la enfermedad de ELA SOD1 G93A. La supervivencia
aumentó notablemente en el grupo tratado con HcTeTx (n=5) con
respecto al grupo control (n=10). Las probabilidades acumuladas se
calcularon mediante el análisis de supervivencia de
Kaplan-Meier (SPSS 13.0).
Figura 4. Efectos del tratamiento con DNA
desnudo codificante para HcTeTx sobre La actividad motora se
determinó mediante el rotarod a una velocidad constante de 14 rpm,
con un tiempo máximo de desarrollo de 180 s. Se observa una mejor
actividad motora en el grupo tratado con HcTeTx (n=5) respecto al
control (n=10 control).
Figura 5. Western blot de las muestras de médula
espinal de ratones wild type y ratones SOD1 G93A. A) Detección de
Akt fosforilado en ratones control (inyectados con pcDNA3.1) e
inyectados con HcTeTx. Se midió la expresión de GAPDH para la
normalización de las medidas de intensidad de banda obtenidas a
partir de Akt fosforilado. B) Representación gráfica de los niveles
de Akt fosforilado en función de la intensidad de banda para los
distintos grupos de muestras (controles, inyectados con HcTeTx). Los
test ANOVA y t-Student revelaron que los niveles de
Akt fosforilado en los ratones inyectados con HcTeTx era
significativamente superior que la observada en los controles.
Figura 6. Los niveles de mRNA de
caspasa-3, caspasa-1,
NCS-1 y Rrad se cuantificaron en médula espinal de
ratones sintomáticos SOD1G93A a los 110 días de edad. La figura
presenta la disminución de la expresión de los genes
caspasa-3, caspasa-1 y Rrad en los
animales tratados con HcTeTx con respecto al grupo control,
mientras que la expresión del gen NCS-1 se
encuentra incrementada en el grupo tratado. Los niveles de expresión
génica se normalizaron con la media geométrica de los genes
endógenos GAPDH, 18s rRNA y \beta-actina y se
tabularon como ratio de SOD1 G93A y wild type. (** P<0,01, * P
<0,05; n=4 por punto).
Figura 7. Efectos del tratamiento
intraperitoneal con el polipeptido que contiene el dominio C
terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica (HcTeTx) sobre
la supervivencia en ratones modelo para la enfermedad de ELA
SOD1G93A. La supervivencia aumentó notablemente en el grupo tratado
con HcTeTx (n= 3, línea punteada) con respecto al grupo control
(n=3, línea continua). Las probabilidades acumuladas se calcularon
mediante el análisis de supervivencia de
Kaplan-Meier (SPSS 13.0).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante los ensayos realizados por los inventores, que ponen de
manifiesto la eficacia de HcTeTx, así como de su secuencia
codificante, para su uso como medicamento, y más preferentemente
para el tratamiento de ELA.
\vskip1.000000\baselineskip
La generación de animales transgénicos que
sobreexpresan el gen para la superóxido dismutasa-1
(SOD-1) humana con distintas mutaciones ha
proporcionado modelos animales para el estudio de la enfermedad de
ELA. Estos animales presentan características clínicas y
patológicas propias de los enfermos de ELA. Uno de los modelos más
estudiados y caracterizados es el ratón transgénico SOD1 G93A, que
presenta una mutación por sustitución del aminoácido glicina por
alanina en posición 93 en el gen para la enzima
SOD-1. En este modelo animal se han probado con
éxito diversos compuestos terapéuticos. Sin embargo no se ha
traducido en una terapia efectiva en ensayos clínicos humanos, ya
sea por una inadecuada ruta de administración y/o por la escasa
biodisponibilidad de las moléculas terapéuticas para alcanzar las
células diana. Algunas estrategias de terapia génica incluyen el
uso del virus adenoasociado (AAV), que es transportado
retrógradamente a motoneuronas tras inyección intramuscular. Sin
embargo existe la posibilidad de que el uso de vectores virales
pueda causar daños añadidos en los enfermos tratados. La
utilización del DNA desnudo se presenta como una estrategia
alternativa más segura y apropiada para hacer llegar a los enfermos
un gen terapéutico específico.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen codificante para HcTeTx (dominio
C-terminal de la cadena pesada de la toxina
tetánica -SEQ ID NO:2 de 462 aminoácidos-) fue clonado en el
plásmido de expresión eucariota pcDNA3.1 (Invitrogen), bajo control
del promotor del citomegalovirus (CMV). Los vectores se produjeron
en bacterias Escherichia coli (DH5\alpha) químicamente
competentes y se purificaron utilizando el kit GenElute maxiprep de
Sigma-Aldrich.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones transgénicos que sobreexpresan SOD1
humana con la mutación G93A
(B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur)
se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se
utilizaron mutantes hemizigóticos en todos los experimentos (un
macho mutante apareado con una hembra no transgénica). Los ratones
transgénicos se identificaron por amplificación por PCR del DNA
extraído de la cola, como se describe en Gumey et al.
(Gurney et al., 1994. Motor neuron degeneration in mice that
express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science, 264
(5166): 1772-5). Los animales se conservaron en la
Unidad Mixta de Investigación de la Universidad de Zaragoza. Se les
proporcionó agua y comida ad libitum. Todos los experimentos
y cuidados en los animales fueron desarrollados de acuerdo con las
normas de la Universidad de Zaragoza y la guía internacional para
el uso de animales de laboratorio.
\vskip1.000000\baselineskip
A la edad de 8 semanas se inyectaron
intramuscularmente ratones transgénicos SOD1 G93A con 300 \mug de
pCMV-HcTeTx en los músculos cuádriceps (dos
inyecciones de 50 \mug por músculo) y en los músculos tríceps
(una inyección única de 50 \mug por músculo). El grupo de ratones
control fue inyectado con las mismas cantidades de plásmido
vacío.
Diez días después de las inyecciones
intramusculares de los plásmidos, se extrajeron los músculos
inoculados que fueron precongelados en nitrógeno líquido y
posteriormente almacenados a -70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tejidos se congelaron en nitrógeno líquido y
seguidamente fueron pulverizados en un mortero frío. El RNA total
de los músculos fue extraído de acuerdo con el protocolo de TRIzol
Reagent (Invitrogen). Para la síntesis de cDNA se empleó el kit
SuperScriptTM First-Strand Synthesis System
(Invitrogen), partiendo de 1 \mug de RNA en un volumen final de
20 \muL. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen
final de 20 \muL, con 150nM de cada cebador, 150 \muM de dNTPs,
2 mM de MgCl_{2}, IX de buffer, 0,2U Taq pol y 2 \muL por
reacción de cDNA diluído 10 veces para la amplificación de un
fragmento del gen HcTeTx. Todas las reacciones de PCR se realizaron
en GeneAmp® Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems, Foster City,
CA, USA). Los parámetros de ciclos termales fueron los siguientes:
incubación a 94ºC durante 3 min y 35 ciclos de 94ºC durante 30 s,
61ºC durante 30 s y 72ºC durante 30 s. La presencia de la
amplificación del gen HcTeTx se observó en un gel de agarosa al 2%
teñido con bromuro de etidio. Las secuencias de los cebadores
directo y reverso empleadas fueron las SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO:4,
respectivamente. La talla del amplicón corresponde a 355 pb.
\vskip1.000000\baselineskip
La prueba de la rejilla se utilizó para
determinar la fuerza muscular y el comienzo de los síntomas de ELA.
Los animales realizaron este test una vez por semana desde la edad
de 8 semanas. Cada ratón fue colocado sobre una rejilla que sirve
de tapa para las jaulas convencionales. La rejilla fue después
girada 180º y mantenida a una distancia de aproximadamente 60 cm de
una superficie blanda para evitar lesiones. Se cronometró la
latencia de cada ratón a caer. Cada uno de los ratones tuvo hasta
tres tentativas para sujetarse en la rejilla invertida durante un
máximo de 180 s y se registró el período de tiempo más largo.
El test de rotarod fue empleado para evaluar la
coordinación motora, la fuerza y el equilibrio. Los animales fueron
colocados sobre la barra giratoria del aparato
(ROTA-ROD/RS, LE8200, LSI-LETICA
Scientific Insturments). Se registró el tiempo durante el cual un
animal podía mantenerse en dicha barra a una velocidad constante de
14 rpm. Cada ratón tuvo tres oportunidades y se registró el período
de tiempo más largo sin que los animales cayeran de la barra,
tomando arbitrariamente un tiempo límite de 180 s.
El punto final en la vida de los ratones se
considero cuando el animal colocado de cubito supino no fue capaz
de volverse sobre si mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Inicialmente se confirmó la capacidad del vector
pCMV-HcTeTx construido de expresar el gen
codificante en las células musculares de los ratones transgénicos
SOD1G93A. Debido a que no existe expresión endógena del gen HcTeTx
en estos ratones, se aplicó a los músculos inyectados la
amplificación por PCR de un fragmento de este gen para la detección
de la expresión del mRNA de dicha molécula. Como muestra la Figura
1., no se observa expresión del gen HcTeTx en el grupo control
inyectado con plásmido vacío. Sin embargo la PCR revela la
presencia de la amplificación del gen HcTeTx en el músculo
inoculado con el vector codificante para el mismo, indicando que el
vector alcanza con éxito las células musculares y que se realiza el
proceso de transcripción de dicho gen.
\vskip1.000000\baselineskip
El tratamiento intramuscular con DNA desnudo
codificante para HcTeTx produce un retraso en el comienzo de los
síntomas, mejora la actividad motora y pospone el punto final de la
enfermedad en el ratón modelo para ELA, que contiene la mutación
G93A en el gen SOD1 humano. La manifestación de los síntomas se
registró como el primer día en el que los ratones no pudieron
mantenerse sujetos en la rejilla invertida durante tres minutos. El
comienzo de los síntomas se redujo muy significativamente en
aproximadamente 17 días en el grupo de animales inyectados con
HcTeTx, con respecto al grupo control (Figura 2. y Tabla 1.). Como
se observa en la Figura 3 y en la Tabla 1, la máxima supervivencia
se detectó en los ratones del grupo tratado con HcTeTx, que
alcanzaron una media de 139 días; 27 días más que el grupo control,
que representa una prolongación de la supervivencia de
aproximadamente un 16%. Entre las semanas 12 y 13 se observa un
descenso notable en el desarrollo de la actividad sobre el rotarod
del grupo control, mientras que en el grupo de animales tratados no
se observan esas deficiencias hasta la semana 16 (Figura 4).
El gen codificante para HcTeTx (dominio
C-terminal de la cadena pesada de la toxina
tetánica, SEQ ID NO:1) fue clonado en el plásmido de expresión
eucariota pcDNA3.1 (Invitrogen), bajo control del promotor del
citomegalovirus (CMV). Los vectores se produjeron en bacterias
Escherichia coli (DH5\alpha) químicamente competentes y se
purificaron utilizando el kit Genelute maxiprep de
Sigma-Aldrich.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones transgénicos que sobreexpresan SOD1
humana con la mutación G93A
(B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur)
se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se
utilizaron mutantes hemizigóticos en todos los experimentos (un
macho mutante apareado con una hembra no transgénica). Los ratones
transgénicos se identificaron por amplificación por PCR del DNA
extraído de la cola, como se describe en Gurney et al.
(Gurney et al., 1994. Motor neuron degeneration in mice that
express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science, 264
(5166): 1772-5). Los animales se conservaron en la
Unidad Mixta de Investigación de la Universidad de Zaragoza. Se les
proporcionó agua y comida ad libitum. Todos los experimentos
y cuidados animales fueron desarrollados de acuerdo con las normas
de la Universidad de Zaragoza y la guía internacional para el uso
de animales de laboratorio. Se emplearon un total de 12 animales:
wild-type (n=4), ratones SOD1G93A inyectados con
pcDNA3.1 (controles, n=4) y ratones SOD1G93A tratados con HcTeTx
(n=4).
\vskip1.000000\baselineskip
A la edad de 8 semanas se inyectaron
intramuscularmente ratones transgénicos SOD1G93A con 300 \mug de
pCMV-HcTeTx en los músculos cuádriceps (dos
inyecciones de 50 \mug por músculo) y en los músculos tríceps
(una inyección única de 50 \mug por músculo). El grupo de ratones
control fue inyectado con las mismas cantidades de plásmido
vacío.
Las médulas espinales se extrajeron 110 días
después de las inyecciones intramusculares de los plásmidos, que
fueron precongelados en nitrógeno líquido y posteriormente
almacenados a -70ºC. Los tejidos se congelaron en nitrógeno líquido
y seguidamente fueron pulverizados en un mortero frío. La mitad de
la muestra se empleó para la extracción de RNA y la otra mitad se
utilizó para la extracción proteica.
\vskip1.000000\baselineskip
El RNA total de las médulas espinales fue
extraído de acuerdo con el protocolo de RNeasy® Lipid Tissue Mini
Kit (Qiagen). Para la síntesis de cDNA se empleó el kit
SuperScriptTM First-Strand Synthesis System
(Invitrogen), partiendo de 2 \mug de RNA en un volumen final de 20
\muL.
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron
a cabo en un volumen final de 10 \muL, con 1X de TagMan®
Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG (Applied Biosystems), 1X
de la mezcla de cebadores no marcados y sondas TagMan® MGB (Applied
Biosystems) para cada gen a estudio y 1 \muL por reacción de
cDNA diluído 10 veces. Para la normalización se emplearon 3 genes
endógenos (18s rRNA, GAPDH y \beta-actina). Las
referencias de la mezcla de cebadores y sondas empleadas para
amplificar cada uno de los genes a estudio fueron las siguientes:
caspasa-3 (Mm00438023_m1), caspasa-1
(Mm00438023_m1), NCS-1 (Mm00490552_m1), Rrad
(Mm00451053_m1), 18s rRNA (Hs99999901), GAPDH (4352932E) y
\beta-actina (4352933E). Todas las reacciones de
PCR se realizaron en un termociclador ABI Prism 7000 Sequence
Detection System (Applied Biosystems). Los parámetros de ciclos
termales fueron los siguientes: incubación a 95ºC durante 10 min y
40 ciclos de 95ºC durante 15 s y 60ºC durante 1 min. La expresión
relativa de caspasa-3, caspasa-1,
NCS-1 y Rrad fue normalizada aplicando la media
geométrica de los tres genes endógenos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de médula espinal de ratones wild
type y ratones SOD1G93A tratados con HcTeTx se homogeneizaron en
nitrógeno líquido con el buffer de extracción de composición 150 mM
NaCl, 50 mM Tris-HCl pH=7,5, 1% desoxicolato, 0,1%
SDS, 1% Tritón X-100, 1 mM NaOVa, 1 mM PMSF, 10
\mug/mL leupeptina y aprotinina y 1 \mug/mL pepstatina. Se
centrifugó a 4ºC, durante 10 minutos a 3000 g. Una vez cuantificada
la concentración de proteína del sobrenadante de cada muestra
mediante el método de BCA (9643 Sigma), se cargaron 25 \mug de
proteína en un gel al 10% de acrilamida. Se utilizaron membranas de
PVDF para el proceso de transferencia, las cuales se bloquearon con
solución TTBS al 5% de leche desnatada (20 mM Tris base, 0,15M
NaCl, pH=7,5, 0,1% Tween) durante una hora. Más tarde se incubaron
con el anticuerpo primario toda la noche a 4ºC
(anti-p-Akt
(sc-7985R, Sta. Cruz)). Se utilizó GAPDH
(Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa) para normalizar la medida
obtenida con Akt (anti-GAPDH
(sc-25778, Sta. Cruz)). Tras incubar con el
anticuerpo primario, las membranas se lavaron con TTBS y se
incubaron con el anticuerpo secundario 1 hora a temperatura
ambiente. Finalmente, se procedió a revelar mediante
quimioluminiscencia (Western Blotting Luminol Reagent,
sc-2048 Sta. Cruz). Las películas se escanearon y se
analizaron mediante el software AlphaEase FC (Bonsai Technologies).
El análisis estadístico se llevó a cabo usando el test de ANOVA y
el test de Student-Neuman-Keuls.
\vskip1.000000\baselineskip
En este estudio se presentan los resultados de
la aplicación de HcTeTx sobre ratones SOD1G93A modelo para la
enfermedad de ELA, donde existe una degeneración de las
motoneuronas. El estudio transcripcional (Figura 6) a nivel de
médula espinal de estos ratones, en edad sintomática, revela una
disminución de la expresión génica de caspasa-3
(p<0,01) y caspasa-1 (p<0,05) en aquellos
ratones tratados con HcTeTx con respecto a los inyectados con
plásmido vacío. Esto indica una reducción de la apoptosis en médula
espinal debida al tratamiento. Además, el gen NCS-1
se encuentra significativamente aumentado (p<0,05) en el grupo de
animales tratados, indicando un aumento de la supervivencia celular
en la médula de los mismos. Por otro lado, la expresión del gen
Rrad (Ras related associated with diabetes), descrito como una
proteína de unión al calcio, también se encuentra aumentado en
médula espinal de estos animales con respecto al wild type. Tras el
tratamiento con HcTeTx se observa que el efecto es revertido
llegando a niveles más próximos a los de los animales no
transgénicos (Figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla se expresa la media y la desviación
estándar de los valores de densidad de banda medidos en cada grupo
de muestras. Los subíndices a, b y c, que representan al grupo de
los individuos salvajes (wild type; WT), de los inyectados con
pcDNA3.1 (G93A, control) y de los inyectados con HcTeTx
respectivamente, difieren entre sí con una significación p <
0,05.
Los resultados obtenidos mediante Western blot
mostraron que la presencia de Akt fosforilado en ratones inyectados
con HcTeTx es mayor que la obtenida en los controles. El test de
ANOVA y de Student-Neuman-Keuls
indicó la existencia de diferencias significativas (p<0,05) entre
el grupo de los controles y el grupo de los ratones inyectados con
HcTeTx, confirmando que la activación de la vía de supervivencia de
Akt en ratones inyectados con HcTeTx puede favorecer la inhibición
de la apoptosis y, por tanto, la supervivencia neuronal, con
respecto a los controles (Figura 5).
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El polipéptido utilizado (denominado HcTeTx)
utilizado corresponde al dominio C-terminal de la
cadena pesada de la toxina tetánica y comprende la secuencia de 451
aminoácidos (SEO ID NO:1) de la SEQ ID Nº 2, y ha sido obtenido
siguiendo el protocolo descrito por Gil et al.(Gil et
al., 2003. Biochem. J. 373,613-620).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones transgénicos que sobreexpresan SOD1
humana con la mutación G93A
(B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur)
se obtuvieron de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se
utilizaron mutantes hemizigóticos en todos los experimentos (un
macho mutante apareado con una hembra no transgénica). Los ratones
transgénicos se identificaron por amplificación por PCR del DNA
extraído de la cola, como se describe en Gurney et al.
(Gurney et al., 1994. Science, 264 (5166):
1772-5). Los animales se conservaron en la Unidad
Mixta de Investigación de la Universidad de Zaragoza. Se les
proporcionó agua y comida ad libitum. Todos los experimentos
y cuidados animales fueron desarrollados de acuerdo con las normas
de la Universidad de Zaragoza y la guía internacional para el uso
de animales de laboratorio.
\vskip1.000000\baselineskip
A la edad de 12 semanas se inyectaron
intraperitonealmente los ratones transgénicos SOD1G93A con 250
\mul a una concentración de 0.5 \muM del polipéptido que
comprende el dominio C terminal de la toxina tetánica (HcTeTx). La
inyección fue repetida semanalmente durante toda la vida.
\vskip1.000000\baselineskip
El punto final en la vida de los ratones se
considero cuando el animal colocado de cubito supino no fue capaz
de volverse sobre si mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se observa en la Figura 7 y en la Tabla 2,
la máxima supervivencia se detectó en los ratones del grupo tratado
con HcTeTx, que alcanzaron una media de 135 días; 9 días más que el
grupo control.
\vskip1.000000\baselineskip
<110> UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
\hskip1cm UNIVERSIDAD DE AUTONOMA DE
BARCELONA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USO DE LA SECUENCIA CODIFICANTE DEL
DOMINIO CARBOXILO TERMINAL LA CADENA PESADA DE LA TOXINA TETÁNICA
COMO MEDICAMENTO.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1510.16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium tetani
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 462
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium tetani
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm5
\hskip1cm6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial (cebador)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 451
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium tetani
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(451)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de la SEQ ID NO:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm9
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium tetani
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm11
Claims (10)
1. Uso de un polinucleótido aislado que
comprende la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal
de la subunidad pesada de la toxina tetánica (HcTeTx), sus
variantes alélicas o fragmentos funcionales de las mismas para la
elaboración un medicamento.
2. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde el HcTeTx es codificado por la SEQ ID NO: 1.
3. Uso según la reivindicación 1 donde el
fragmento de la secuencia codificante del dominio carboxilo
terminal de la subunidad pesada de la toxina tetánica tiene la SEQ
ID NO: 6.
4. Uso de un vector que comprende cualquiera de
los polinucleótidos de las reivindicaciones anteriores para la
elaboración de un medicamento.
5. Uso de una célula transgénica que comprende
cualquiera de los polinucleótidos de las reivindicaciones
1-3 para la elaboración de un medicamento.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde el medicamento es para el tratamiento de la
esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
7. Uso de un polipéptido aislado que comprende
el dominio carboxilo terminal de la subunidad pesada de la toxina
tetánica (HcTeTx), sus variantes alélicas o fragmentos funcionales
de los mismos para la elaboración un medicamento para el
tratamiento de ELA.
8. Uso según la reivindicación anterior donde
HcTeTx tiene la SEQ ID NO: 2.
9. Uso según la reivindicación 7 donde el
fragmento funcional de HcTeTx tiene la SEQ ID NO: 5.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores donde el medicamento está destinado a su administración
vía oral, parenteral, intramuscular o nasal.
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