RU2495676C2 - Применение последовательности, кодирующей с-концевой домен тяжелой цепи токсина столбняка, в качестве лекарственного средства - Google Patents
Применение последовательности, кодирующей с-концевой домен тяжелой цепи токсина столбняка, в качестве лекарственного средства Download PDFInfo
- Publication number
- RU2495676C2 RU2495676C2 RU2010115135/15A RU2010115135A RU2495676C2 RU 2495676 C2 RU2495676 C2 RU 2495676C2 RU 2010115135/15 A RU2010115135/15 A RU 2010115135/15A RU 2010115135 A RU2010115135 A RU 2010115135A RU 2495676 C2 RU2495676 C2 RU 2495676C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hctetx
- polypeptide
- polynucleotide
- mice
- sequence
- Prior art date
Links
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 title claims abstract 8
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 title claims abstract 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 20
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 26
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 25
- 238000011831 SOD1-G93A transgenic mouse Methods 0.000 description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 19
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 19
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 15
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 15
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101800003755 Tetanus toxin heavy chain Proteins 0.000 description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 9
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 8
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 7
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 101150105133 RRAD gene Proteins 0.000 description 6
- 108700013394 SOD1 G93A Proteins 0.000 description 6
- 108010021188 Superoxide Dismutase-1 Proteins 0.000 description 6
- 102000008221 Superoxide Dismutase-1 Human genes 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 102100032077 Neuronal calcium sensor 1 Human genes 0.000 description 5
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 5
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 5
- 102000055102 bcl-2-Associated X Human genes 0.000 description 5
- 108700000707 bcl-2-Associated X Proteins 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 4
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 4
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 4
- 102220020162 rs397508045 Human genes 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150100916 Casp3 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101000637977 Homo sapiens Neuronal calcium sensor 1 Proteins 0.000 description 3
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 3
- 101001083117 Microbacterium liquefaciens Hydantoin permease Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 206010056677 Nerve degeneration Diseases 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 108700041737 bcl-2 Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101100149812 Homo sapiens SOD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- -1 N1-4 Proteins 0.000 description 2
- 101150074759 NCS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710133725 Neuronal calcium sensor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010090931 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000013535 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004094 calcium homeostasis Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 101150062190 sod1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006487 Aciphylla squarrosa Species 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 101150017888 Bcl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101150091777 CASP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101100256850 Drosophila melanogaster EndoA gene Proteins 0.000 description 1
- 206010053172 Fatal outcomes Diseases 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 229940122459 Glutamate antagonist Drugs 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000664887 Homo sapiens Superoxide dismutase [Cu-Zn] Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000003194 amino acid receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000002332 glycine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000001767 medulla oblongata Anatomy 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10071—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/00041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/00043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/00071—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и касается применения полинуклеотида, который содержит последовательность, кодирующую C-концевой домен тяжелой субъединицы токсина столбняка (HcTeTx), для лечения бокового амиотрофического склероза (ALS), а также применения полипептида, который содержит C-конец тяжелой субъединицы токсина столбняка (HcTeTx), для лечения указанного заболевания. Группа изобретений обеспечивает облегчение симптоматики ALS при введении изолированного нетоксичного фрагмента токсина столбняка (HcTeTx или его варианта) или полинуклеотида, кодирующего указанный фрагмент. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 4 пр., 11 ил., 2 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к применению последовательности, кодирующей С-концевой домен тяжелой цепи токсина столбняка в качестве лекарственного средства, предпочтительно для лечения бокового амиотрофического склероза (болезни Шарко), а также полипептида, кодируемого указанной последовательностью, для лечения указанного заболевания.
Уровень техники
Боковой амиотрофический склероз (болезнь Луи Герига или Шарко) представляет собой прогрессирующее, неизлечимое, смертельное заболевание, которое приводит к дегенерации двигательных нейронов на медуллярном уровне, уровне продолговатого мозга и двигательной области коры головного мозга. В Испании данное заболевание обнаруживается у 2/100000 человек, а уровень распространения составляет 1/10000, что означает, что данное заболевание в течение жизни разовьется приблизительно у 40000 испанцев (источник: Ассоциация Бокового Амиотрофического Склероза Испании - ADELA-).
Несмотря на то, что указанное заболевание было описано значительное время назад, до сих пор точно не известны причины возникновения этого заболевания, и хотя существуют генетические формы данного заболевания, известны также случаи, когда болезнь не имеет наследственного происхождения. Таким образом, предполагается, что 10% случаев имеют генетическое происхождение и представляют собой семейные формы заболевания, из которых 15-20% соответствуют мутации фермента супероксид дисмутазы (SOD-1), при этом мутацию этого фермента наблюдали при спорадических формах данного заболевания (Brown, R.H. Jr. (1997). Arch. Neurol. 54(10) 1246-1250). Мутация гена NFH, который кодирует тяжелую цепь нейрофиламента, также в виде исключения была обнаружена у пациентов, страдающих Бокового амиотрофического склероза.
Таким образом, большой интерес представляет исследование путей генетического наследования данного заболевания.
В последние годы создание моделей указанного заболевания на животных стало одним из самых важных инструментов экспериментальных исследований, направленных на поиск возможных способов лечения; что помогло прояснить некоторые вопросы, относящиеся к причинам данного заболевания, хотя его причины до сих пор в значительной степени не ясны. Ни мыши с нокаутом фермента SOD-1, ни трансгенные животные, несущие различные мутации фермента SOD-1 человека не позволили получить клиническую картину заболевания, характерную для человека. Развитие болезни наиболее схожее с заболеванием человека наблюдали у животных, которые являются трансгенными, и несут несколько копий супероксид дисмутазы с мутацией в 93 положении, так называемой SOD1 G93A (Tu, P.H., et al. (1996.) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93(7): 3155-3160.), который можно получить от Jackson Laboratory.
Несмотря на многочисленные исследования, проведенные для того, чтобы понять причины заболевания, также его механизм, для данной болезни не существует классического, эффективного способа лечения. В настоящее время ведутся исследования по трем направлениям, основанным на применении антагонистов глутамата, нейротрофических факторов и антиоксидантов, хотя на сегодняшний день ни одно из направлений не привело к созданию эффективного способа лечения.
В течение уже нескольких лет известно, что нейротрофические факторы могут спасать моторные нейроны от дегенерации. Большой интерес был вызван опытом применения генной терапии на животных моделях с применением аденовирусных векторов, которые экспрессировали различные нейротрофические факторы (GDNF, CNTF, N1-4, IGF-1); что показало обнадеживающие результаты. Тем не менее, большой иммунный ответ, который вызывает аденовирусные вектора, представляет собой значительный недостаток данного способа, что приводит к необходимости применения их только на новорожденных животных. Таким образом, хотя результаты были обнадеживающими, остается потребность в создании менее иммуногенных векторов, которые являются необходимыми для создания эффективных средств лечения ALS.
Что касается клинических испытаний, исследования проведенные в начале 1996 года группой Dr.Schuelp, не дали удовлетворительных результатов (http://www.wiley.co.uk/genetherapy). Возможными причинами этой неудачи являются природа нейротрофического фактора, использованного в тестировании (CNTF), и/или в отсутствии способности проникать в центральную нервную систему для данных факторов. В 1999 году группа доктора Axel Kahn доказала, что способ введения вышеупомянутого нейротрофического фактора в животных моделях является важной составляющей положительного терапевтического эффекта (Haase et al. (1999) Ann. Neurol. 45(3) 296-304). Отсутствие специфичности также было предложено в качестве возможной причины неудачи при введении BDNF людям при подкожной инъекции.
Кроме того, нейротрофические факторы, которые вводят системным образом применяли к существующим проблемам, хотя они могут являться создают проблемы токсичности в отношении других тканей. Несмотря на все указанные недостатки, продолжаются исследования терапевтических возможностей нейротрофических факторов в связи с их многообещающими результатами на доклинической стадии исследований. В частности, последние клинические испытания, проведенные в Рочестер Медикал Центр (Миннесота), вновь основаны на введении нейротрофического фактора - IGF-1.
Описание изобретения
Авторы данного изобретения показали, что нетоксичный С-конец тяжелой цепи токсина столбняка (НсТеТх) (который посредством создания рекомбинантных белков до сих пор использовали при лечении ALS только в качестве носителя для различных нейротрофических факторов, так же как и фермент SOD-1), сам по себе способен продлевать жизнь зараженных животных.
Таким образом, в первом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению полинуклеотида, который содержит последовательность, кодирующую изолированный НсТеТх, его аллельный вариант или функциональный фрагмент для создания лекарственного препарата, предпочтительного для лечения ALS. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения последовательность, кодирующая НсТеТх охватывает триплет кодирующий аминокислоту V (валин) в последовательности М-конца НсТеТх и триплет, кодирующий аминокислоту D (аспарат), желательно с аминокислоты V (854) по аминокислоту D (1315) в последовательности с номером доступа (NCBI.: P04958). В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения последовательность, кодирующая НсТеТх представляет собой SEQ ID NO: 1, а фрагмент НсТеТх соответствует последовательности SEQ ID NO: 5. Далее по тексту этот полинуклеотид обозначают, как «полинуклеотид согласно настоящему изобретению».
В другом предпочтительном варианте реализации полинуклеотид согласно настоящему изобретению может быть получен мутацией (удаление, вставка, инверсия, точечная мутация и т.д.), причем вышеупомянутая мутация не влияет на его способность действовать, как лекарственное средство, в частности, для лечения ALS. Сохранение терапевтического эффекта мутировавшего полинуклеотида согласно настоящему изобретению может быть проверено путем воспроизведения любого из примеров I или II. На протяжении всего описания такой мутированный полинуклеотид должен рассматриваться, как аллельный вариант.
В предпочтительном варианте реализации полинуклеотид согласно настоящему изобретению также может включать промоторную, терминаторную последовательность или последовательность сайленсера, последовательность, которая способствуют интеграции в хромосому или в любой тип структуры, организующей генетический материал и т.д.
Второй аспект изобретения относится к применению вектора, который содержит полинуклеотид согласно настоящему изобретению для создания лекарственного препарата, предпочтительно для лечения ALS, причем указанный вектор выбран из группы, включающей (без любого ограничения) плазмиды, фаги, искусственные хромосомы дрожжей (YAC), искусственные хромосомы бактерий (ВАС), искусственные хромосомы человека (НАС), вирусные вектора такие, как аденовирусы, ретровирусы или любой другой тип молекул ДНК или РНК, способный к репликации в прокариотической или эукариотической клетке. В дальнейшем указанный вектор называют «вектор согласно настоящему изобретению».
Третий аспект настоящего изобретения относится к применению трансгенной клетки для создания лекарственного препарата, предназначенного для лечения ALS, согласно которому указанная клетка содержит полинуклеотид согласно настоящему изобретению или вектор согласно настоящему изобретению.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к применению изолированного нуклеотида, который содержит последовательность, кодирующую изолированный НсТеТх, его аллельный вариант или его функциональный фрагмент для создания лекарственного препарата для лечения ALS. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, последовательность НсТеТх содержит аминокислоты от кислоты V(854) до D(13151) последовательности с номером доступа (NCBI.: P04958). В еще более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения последовательность НсТеТх представляет собой SEQ ID NO: 2 и фрагмент НсТеТх представляет собой SEQ ID NO: 6. Далее по тексту указанный полинуклеотид обозначают как «полинуклеотид согласно настоящему изобретению».
В другом предпочтительном варианте реализации полипептид согласно настоящему изобретению содержит мутацию (удаление, вставку, инверсию, точечное замещение аминокислоты и т.д.), но данная мутация не влияет на его способность действовать в качестве лекарственно средства для лечения ALS. Сохранение терапевтического эффекта мутированного полинуклеотида согласно настоящему изобретению можно проверить путем воспроизведения примеров 1 и 2.
Для введения препарата или фармацевтического состава полинуклеотида, вектора, трансгенной клетки или полипептида согласно настоящему изобретению будут получены в фармацевтической форме, пригодной для их введения с помощью выбранного пути введения. Для этого указанная фармацевтическая смесь должна содержать в себя носитель и вспомогательные вещества, которые фармацевтически приемлемы и необходимы для осуществления введения препарата. Информация о вспомогательных веществах и носителе, которые можно использовать для создания указанного лекарственного препарата, а также о фармацевтических формах для введения активных составляющих в обобщенном виде представлена в книге "Treatise of the Galenic Pharmacy", by C. Fauli i Trillo, 1st Edition, 1993, Luzan 5, SA de Ediciones.
Указанная фармацевтическая композиция содержит в достаточном для достижения терапевтического эффекта количестве по меньшей мере один элемент из группы, включающей: полинуклеотид, вектор, трансгенную клетку или полипептид согласно настоящему изобретению. Выражение «терапевтически эффективное количество», используемое в данном описании, означает, что количество выбранного элемента рассчитано для достижения заданного эффекта и в целом зависит от характеристик самого полипептида, помимо всего прочего, терапевтического действия, которое надо получить, от расположенности к лечению каждого отдельного пациента, от тяжести заболевания и т.д. В дальнейшем, указанную фармацевтическую композицию обозначают, как «фармацевтическая композиция или лекарственный препарат согласно настоящему изобретению».
Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить в организм любым подходящим способом, например, пероральным, парентеральным, назальным (через слизистую оболочку) и т.д., типичным образом, парентерально, преимущественно внутримышечно или подкожно. Кроме того, данная фармацевтическая композиция в любой форме, пригодной для ее введения, например, в твердой форме (в виде таблетки, капсулы, гранул и т.д.), в жидкой форме (раствора, суспензии, эмульсии) и т.д., в зависимости от выбранного пути введения указанной композиции. В предпочтительном варианте реализации, указанную фармацевтическую композицию получают в фармацевтической форме для единичного дозирования.
В предпочтительном варианте реализации фармацевтическая композиция может быть представлена в лекарственной форме, для перорального введения в твердом виде, более предпочтительно в жидком виде, наиболее предпочтительно для внутримышечного введения. Примеры фармацевтических форм для введения препарата перорально представляют собой таблетки, капсулы, гранулы, растворы, суспензии и т.д., и могут содержать традиционные наполнители, такие как агглютинаты, разбавители, разрыхляющие вещества, лубриканты, увлажнители и т.д., и могут быть изготовлены обычными способами. В другом предпочтительном варианте реализации фармацевтическая композиция может быть адаптирована для парентерального введения, в виде, например, раствора, суспензии или лиофилизированного, стерильного продукта, в соответствующих лекарственных дозах; в данном случае фармацевтическая композиция будет включать в себя вспомогательные вещества, такие как буферные растворы, поверхностно-активные вещества и т.д. В любом случае, вспомогательные вещества должны быть выбраны, исходя из выбранной формы введения препарата. Обзор различных форм введения лекарств и их подготовка могут быть найдены в книге «Tretise the Galenic Pharmacy", by С.Faull i Trillo, 10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones, приведенная ранее. Кроме того, лекарственная композиция может содержать и другие полипептиды, полинуклеотиды, векторы и клетки, которые будут способствовать более высокой эффективности лекарственного средства.
Определения
Термин «полинуклеотид», при использовании в данном документе, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины и может представлять как ДНК, так и РНК. Этот термин относится исключительно к первичной структуре молекулы. Таким образом, данный термин охватывает как одно- и двуцепочную ДНК, так и одно- и двуцепочную структуру РНК.
Термин «изолированный», встречающийся в описании, при использовании его в сочетании с НсТеТх или с его кодирующей последовательностью, относится не только к тому факту, что вещества выделены из человеческого тела, но также обозначает, что они не являются частью рекомбинантных белков или ферментов, который выполняют терапевтическую функцию.
Под выражением «функциональный фрагмент НсТеТх, его аллельный вариант или кодирующая последовательность» понимается описание пептида или полинуклеотида, которые включают часть НсТеТх, его аллельный вариант и кодирующую его последовательность, которые сохраняют способность действовать в качестве лекарственного средства, в особенности для лечения ALS, а их терапевтический потенциал может быть проверен путем воспроизведения примеров 1-3.
В данном описании термин «аллельный вариант» относится к полипептиду, гомологичному и функционально эквивалентному С-концу тяжелой цепи токсина столбняка. Пептид гомологичен вышеупомянутой области токсина, когда его последовательность аминокислот соответствует последовательности токсина, по меньшей мере, на 60%, 70%, 85%, предпочтительно, на 95%. Предпочтительно, чтобы последовательность кислот указанного окончания токсина представляла собой SEQ ID NO: 2. Этот термин также употребляется в данном описании в отношении полинуклеотида, который кодирует гомологичный полипептид, функционально эквивалентный НсТеТх. В этом случае полинуклеотид может быть гомологичен НсТеТх, по меньшей мере, на 40%, 50%, 60%, 70%, 85% или 90%, последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 1.
Выражение «функционально-эквивалентный» означает, что полипептид или полинуклеотид сохраняет свою функцию лекарственного средства, в частности для лечения ALS, а его терапевтический потенциал можно проверить посредством воспроизведения примеров 1 или 2.
Для специалистов в данной области, преимущества и характеристики изобретения будут ясны из совокупности описания изобретения и практического осуществления настоящего изобретения. Следующие примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения и они не должны рассматриваться, как ограничивающие данное изобретения.
Краткое описание фигур
Фигура 1. ПЦР-амплификация для выявления экспрессии НсТеТх. Через 10 дней после внутримышечной инъекции плазмиды pCMV-HcTeTx (n=2, дорожки 1 и 2) и пустой плазмиды pCMV (n=2, дорожки 3 и 4) из мышцы выделили РНК, и провели обратную-транскрипцию. Полученную кДНК амплифицировали с помощью ПЦР для гена НсТеТх. Дорожка 5 показала положительный контроль (плазмиды pCMV-HcTeTx), на дорожку 6 загрузили продукт реакции, на дорожке М нанесен маркер размером 100 pb.
Фигура 2. Эффект курса лечения незащищенной (чистой) ДНК, кодирующей НсТеТх, при возникновении симптомов заболевания ALS SOD1 G93A у испытуемых мышей. Проявление симптомов заболевания существенно задерживалось у группы, получившей НсТеТх (n=10), по сравнения с контрольной группой (n=10). Суммарная вероятность была рассчитана с применением процедуры Kaplan-Meier Survival Analysis (SPSS 13.0).
Фигура 3. Эффект курса лечения незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх, в отношении выживаемости мышей в модели заболевания ALS SOD1 G93A. Выживаемость значительно увеличилась в группе, проходившей лечение с помощью НсТеТх (n=10), по сравнению с контрольной группой (n=10). Суммарная вероятность была рассчитана с применением процедуры Kaplan-Meier Survival Analysis (SPSS 13.0).
Фигура 4. Эффект курса лечения незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх. Двигательную активность определили при помощи ротатора, вращающегося с постоянной скоростью 14 об/мин, с максимальным временем прохождения препятствия 180 с. Большая двигательная активность наблюдалась в группе, проходившей лечение с помощью НсТеТх (n=10), по сравнению с контрольной группой (n=10).
Фигура 5. Влияние внутримышечных инъекций незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх, на SOD1 G93A мышей. Сила мышц и моторная функция были протестированы с применением подвешенной проволоки. В каждой группе было по 10 мышей (n=10)
Фигура 6. Влияние внутримышечных инъекций незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх, на SOD1 G93A мышей. Изменение веса трансгенных мышей, проходивших лечение с помощью НсТеТх. В каждой группе было по 10 мышей (n=10).
Фигура 7. Анализ экспрессии генов, участвующих в сигнальных путях апоптоза спинного мозга мышей с симптомами SOD1 G93A, возраст которых составлял 110 дней. Приведено среднее содержание информационной РНК для генов Casp1, Casp3, Вах и Bcl2 у контрольной (цель) группы и у группы мышей, проходивших лечение с применением НсТеТх, (серые). Предыдущая группа мышей была сопоставлена с дикими мышами (черные), (n=5 мышей в группе).
Фигура 8. Анализ белков, участвующих в сигнальных путях апоптоза спинного мозга мышей с симптомами SOD1 G93A, возраст которых составлял 110 дней. Western-Blot анализ белков pro-Casp3, активной Casp3, Вах и Bcl2, присутствующих в спинном мозге мышей, проходивших лечение с помощью НсТеТх (серые линии), и контрольной группы мышей (черные линии) в сравнении с дикими мышами (черные) (n=5 мышей в каждой группе).
Фигура 9. Western-Blot анализ фосфолирования в белках Akt и Erk 1/2. Были проанализированы образцы от 5 мышей в каждой группе. IDV (Значение плотности интенсивности). Величины, полученные при Western-Blot анализе, выражены в виде отношения к количеству р-тубулина относительно значений, характерных для мышей дикого типа. (*Р<0.05, **Р<0.01; погрешность отображает SEM). Полосы отражают те же группы, что и в предыдущем примере.
Фигура 10. Влияние внутрибрюшного лечения полипептидом, содержащим С-конец тяжелой цепи токсина столбняка (НсТеТх), на выживаемость мышей ALS SOD1 G93A. Выживаемость значительно увеличилась в группе, проходящей лечение НсТхТе (n=3), по сравнению с контрольной группой (n=3, сплошная линия). Суммарная вероятность была рассчитана с применением процедуры Kaplan-Meier Survival Analysis (SPSS 13.0).
Фигура 11. Внутримышечное лечение мышей, инъецированием НсТеТх, влияет на экспрессию генов, связанную с гомеостазом кальция в спинном мозге трансгенных мышей SOD1 G93A. Были определены уровни экспрессии генов Ncs1 и Rrad у трансгенных мышей с НсТеТх (серый) или с пустой плазмидой (белый). Изменения в уровне информационной РНК у мышей обеих указанных групп были сопоставлены с группой мышей дикого типа (черный). (*Р<0.05, **Р<0.01; погрешность отображает SEM, n=5 мышей в каждой группе).
Подробное описание вариантов реализации настоящего изобретения
Ниже настоящее изобретения иллюстрируется посредством тестов, проведенных авторами, которые демонстрируют эффективность НсТеТх, а так же кодирующей его последовательности в качестве лекарственного средства, в особенности для лечения ALS.
Пример 1
Введение НсТеТх в виде внутримышечной инъекции незащищенной ДНК замедляет проявление симптомов и продлевает продолжительность жизни SOD1 G93A мышей.
Получение трансгенных животных с внедренным человеческим геном супероксиддисмутазы-1 (SOD-1), который содержит различные мутации, послужило моделью для изучения заболевания ALS. У данных животных наблюдают клинические и патологические характеристики аналогичные мышам, которые больны ALS. Лучше всего изучены и охарактеризованы трансгенные мыши SOD1 G93A, которые содержат мутацию фермента SOD-1 в виде замены глицина на аланин в положении 93. Данная животная модель была успешно протестирована с применением различных терапевтических средств. Однако при клинических испытаниях на людях эффективность указанных средств не подтвердилась или по причине неподходящего пути введения препарата и/или ограниченной биодоступности терапевтических молекул к целевым клеткам. Некоторые методики генной терапии включают применение аденоассоциированного вируса (AAV), который ретроградным способом транспортируется к моторным нейронам при помощи внутримышечной инъекции. Однако существует вероятность, что применение вирусов-переносчиков может привести к еще большему ущербу для здоровья у пациентов. Применение незащищенной ДНК является более безопасной и подходящей методикой для осуществления генной терапии у пациентов.
Материалы и методы
1.1. Незащищенная ДНК, кодирующая НсТеТх
Ген, кодирующий НсТеТх (С-конец тяжелой цепи токсина столбняка - SEQ ID NO: 2 из 462 аминокислот), был клонирован в эукариотическую экспрессионную плазмиду pcDNA3.1 (Invitrogen) под контролем промотора цитомегаловируса (ЦМВ). Вектора получали в химически компетентных бактериях Escherichia coli (DH5a) и очищали с применением набора Sigma-Aldrich maxi prep GenElute.
1.2. Трансгенные мыши
Трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют ген SOD1 человека с мутацией G93A (B6SJL-TgN(SOD1-93AJ1 Gur), были получены в Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Гемизиготные мутанты были использованы во всех экспериментах (мутированную мужскую особь скрещивали с не трансгенной женской особью). Трансгенных мышей идентифицировали с помощью ПЦР-амплификации ДНК, извлеченной из хвоста, по методике, описанной в Gurney et al. (Gurney et al., 1994 «Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation», Science, 264 (5166): 1772-5). Животных содержали в Mixed Research Unit университета Сарагоса. Пищу и воду предоставляли без ограничений. Все проведенные эксперименты и процесс ухода за животными были разработаны в соответствии со стандартами университета Сарагоса и международного руководства по использованию лабораторных животных.
1.3. Внутримышечная инъекция незащищенной ДНК и извлечение мышцы
В возрасте 8 недель трансгенным мышам SOD1 G93A внутримышечной инъекцией вводили 300 мг pCMV-HcTeTx в четырехглавые мышцы (2 инъекции по 50 мг в каждую мышцу) и трехглавые мышцы (1 инъекция по 50 мг в каждую мышцу). Контрольной группе ввели аналогичное количество пустой плазмиды. Через 10 дней после инъекций привитые мышцы были извлечены, заморожены жидким азотом, а затем хранились при -70°С.
1.4. Экстракция РНК, синтез кДНК и ПЦР-амплификация
Ткани были заморожены в жидком азоте, а затем растерты в порошок в холодной ступке. Тотальную РНК мышц экстрагировали в соответствии с протоколом TRIzol Reagent (Invitrogen). Для синтеза кДНК был использован комплект SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen), начиная с 1 мг РНК в конечном объеме в 20 мкл. ПЦР-реакции были проведены в окончательном объеме в 20 мкл с 150 мкМ каждого инициатора, 150 нМ dNTPs, 2 мМ de MgCl2, 1X буфера, 0.2U Taq pol и 2 мкл для каждой кДНК, разбавленным в 10 раз для амплификации фрагмента гена НсТеТх. Все ПЦР-реакции проводили в приборе GeneAmp@ Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Тепловые параметры цикла были следующие: инкубация при 94°С в течение 3 минут и 35 циклов при 94°С в течение 30 секунд, 30 секунд при 61°С и 30 секунд при 72°С. Факт амплификации гена НсТеТх наблюдали на агарозном геле, окрашенном 2% бромистым этидием. В качестве прямой и обратной последовательности инициатора были использованы SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно. Ампликон имел размер 355 пн.
1.5. Ротатор-тест, тест с решеткой и тест на выживание.
Тест с решеткой был использован для определения мышечной силы и начала проявления симптомов ALS. Животные проходили этот тест один раз в неделю, начиная с 8-недельного возраста. Каждую мышь помещали на решетку, которая использовалась в качестве крышки для обычной клетки. Затем решетку поворачивали на 180° и поддерживалась на расстоянии 60 см от мягкой поверхности во избежание травм. У каждой мыши было три попытки удержаться на перевернутой решетке в течение максимум 180 секунд, лучшее время было записано.
Ротатор тест был использован для оценки координации движений, силы и возможности удерживать равновесие. Животные были помешены на вращающийся стержень прибора (ROTA-ROD/RS, LE8200, LSI-LETICA Scientific Instruments). Было записано время, в течение которого животное может удерживаться на стержне при постоянной скорости вращения 14 об/мин. У каждой маши было три попытки, и лучше время, в течение которого животное оставалось на стержне, было записано, лимит времени был произвольным образом выбран в 180 секунд.
Окончательным этапом в жизни мыши считали ее неспособность перевернуться со спины, когда ее помещали в это положение.
Результаты
2.1 Обнаружение экспрессии плазмиды в мышцах
Первоначально, подтвердили способность сконструированного pCMV-HcTeTx экспрессировать кодирующий ген в мышечных клетках трансгенных мышей SOD1 G93A. Поскольку эндогенная экспрессия гена НсТеТх у этих мышей отсутствует, проводили ПЦР-амплификацию фрагмента гена, который был введен в мышцы посредствам инъекции с целью обнаружения экспрессии мРНК данной молекулы. Как показано на фигуре 1, экспрессию гена НсТеТх не наблюдали в контрольной группе с пустыми плазмидами. ПЦР анализ показал наличие амплификации гена НсТеТх в мышцах, инокулированным кодирующим его вектором, это означает, что вектор успешно достиг мышечных клеток, произошел процесс транскрипции данного гена.
2.2 НсТеТх задерживает появление симптомов, повышает моторную активность и увеличивает выживаемость трансгенных SOD1 G93A мышей.
Внутримышечное лечение незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх, приводило к задержке проявления симптомов, улучшало двигательную активность и отсрочивало гибель мышей, с мутацией G93A гена SOD1 человека, которые служили моделью для ALS. Проявление симптомов диагностировали в первый день, когда мыши не могли удержаться на перевернутой решетке в течение трех минут. Время проявление симптомов значительно увеличилось, примерно до 8 дней, у группы, инъецированной НсТеТх, по сравнению с контрольной группой (фигура 2, таблица 1). Как видно из фигуры 3 и таблицы 1, максимум выживания наблюдали у мышей группы, инъецированной НсТеТх, и в среднем достигал 136 дней, на 16 дней больше, чем у контрольной группы. В период 12-13 недели у контрольной группы было замечено значительное снижение активности на вращающемся стержне, а у проходившей лечении группы снижение активности не наблюдали до 16-той недели.
Control (контрольная группа) (n=10) | НсТеТх (трансгенные особи) (n=10) | P Value | |
Начало проявления симптомов (дни) | 102.4±2.4 | 110.9±2.0 | 0.0295 |
Летальный исход (дни) | 120.5±3.9 | 136.0±3 | 0.0093 |
Ухудшение моторной функции (дни) | 18.1 | 25.1 |
Таблица 1. В таблице приведены данные, касающиеся начала проявления симптомов заболевания, выживаемости животных, как для контрольной группы мышей, так и для проходившей лечение группы, а также Р-значение (Log Rank, Mantel-Cox).
Эффективность лечения также проверили на мышах, начиная с 8-недельного возраста, при помощи теста «подвешенного шнура» (фигура 5). На 14-той неделе SOD1G93A мыши показали первые признаки слабости, а группа мышей с НсТеТх оказалась сильнее на 14-16 неделях. Кроме того, контрольная группа мышей начала терять вес на 14-той неделе, что было связано с развитием заболевания. При этом, лечение НсТеТх препятствовало потере веса, данная группа мышей показала максимальный вес на 15 неделе (фигура 6).
Пример 2.
Ингибирование апоптоза в спинном мозге мышей SOD1 G93A при помощи инъекции незащищенной ДНК, кодирующей НсТеТх. Материалы и методы
1.1 Незащищенная ДНК, кодирующая НсТеТх
Ген, кодирующий НсТеТх (С-конец тяжелой цепи токсина столбняка - SEQ ID NO: 1), был клонирован в эукариотическую экспрессионную плазмиду pcDNA3.1 (Invitrogen) под контролем промотора цитомегаловируса (ЦМВ). Вектора получали в химически компетентных бактериях Escherichia coli (DH5a) и очищали с применением набора Sigma-Aldrich maxi prep GenElute.
1.2 Трансгенные мыши
Трансгенные мыши, которые сверх экспрессировали ген SOD1 с мутацией G93A (B6SJL-TgN(SOD1-93AJ1 Gur), были получены от Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Во всех экспериментах использовали гемизиготные мутанты (мужскую мутированную особь скрещивали с нетрансгенной женской особью). Трансгенных мышей определяли с помощью ПЦР-амплификации ДНК, извлеченной из хвоста, по методике, описанной в Gurney et al. (Gurney et al., 1994 «Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation», Science, 264 (5166): 1772-5). Животных содержали в Mixed Research Unit университета Сарагоса. Пищу и воду давали без ограничений. Все проведенные эксперименты и процесс ухода за животными были разработаны в соответствии со стандартами университета Сарагоса и международного руководства по использованию лабораторных животных. В общей сложности было использовано 12 животных: дикие мыши (n=5), мыши SOD1G93Ac pcDNA3.1 (n=5), и мыши SOD1G93A мыши, проходящие лечение с применением НсТеТх.
1.3 Внутримышечная инъекция незащищенной ДНК и извлечение спинного мозга
В возрасте 8 недель трансгенным мышам SOD1 G93A внутримышечной инъекцией ввели 300 мг pCMV-HcTeTx в четырехглавые мышцы (2 инъекции по 50 мг в каждую мышцу) и трехглавые мышцы (1 инъекция по 50 мг в каждую мышцу). Контрольной группе ввели аналогичное количество пустых плазмид.
Через 110 дней после инъекций привитые извлекали спинной мозг замораживали жидким азотом, а затем хранили при -70°С. Ткани были заморожены в жидком азоте, а затем растерты в порошок в холодной посуде. Половину образцов использовали для извлечения РНК, а другую половину для экстракции белка.
1.4 Экстракция РНК из спинного мозга и синтез кДНК.
Суммарную РНК из спинного мозга экстрагировали в соответствие с протоколом RNeasy@ Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen). Для синтеза кДНК был использован SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen) комплект, начиная с 1 мг РНК в конечный объем 20 мл.
1.5 ПЦР в режиме реального времени
ПЦР-реакции в режиме реального времени были проведены в окончательном объеме 10 мкл при помощи 1Х of TaqMan@ Universal PCR Master Mix, No AmpErase@ UNG (Applied Biosystems), 1Х смесь не маркированного инициатора и TaqMan@ MGB (Applied Biosystems) зондов для каждого гена и 1 мкл на одну кДНК реакцию, разбавленную в 10 раз. Для стандартизации использовали 3 эндогенных гена (18s rRNA, GAPDH and .-actin). Обозначения для используемых смесей инициатора и зондов, предназначенных для амплификации каждого изучаемого гена, был следующими: caspasa-3 (Mm00438023_m1), caspasa-1 (Mm00438023_m1), NCS-1 (Mm00490552_m1), Rrad (Mm00451 053_m1), 18s rRNA (Hs99999901), GAPDH (4352932E) and (S-actin (4352933E). Все ПЦР-реакции проводили по тепловому циклу ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Тепловые параметры цикла следующие: инкубация при 94°С в течение 10 минут, 40 циклов при 94°С в течение 15 секунд и при 60°С по 1 секунде. Экспрессию нормировали по отношению к caspase-3, caspase-1, NCS-1 и Rrad путем применения среднего геометрического трех эндогенных генов.
1.6 Экстракция белка из спинного мозги и Western Blot анализ.
Образцы спинного мозга мышей дикого типа и мышей SOD1 G93A, проходивших лечение при помощи НсТеТх, были гомогенизированы в жидком азоте с экстрактивным буферным раствором следующего состава: 150 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl pH=7,5, 1% дезоксиколата, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1 мМ NaOVa, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 10 г/мл леупептина и апротинина и 1 мг/мл пепстатина. Смесь центрифугировали при 4°С в течение 10 минут при 3000 д. Далее определяли количество белка, сконцентрированного из супернатанта каждой пробы, при помощи способа ВСА (9643 Sigma). 25 мг белка было загружено в 10% акриламидный гель. Для процесса переноса использовали поливинилиденфторидные мембраны, которые блокировали с помощью TTBS раствора с 5% обезжиренного молока (20 мМ Tris base, 0.15М NaCl, pH=7.5, 0.1% Tween) в течение часа. Позже мембраны инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4°С (antip-Akt (sc-7985R, Santa Cruz)). После инкубационного периода первичные антитела и мембраны промывали TTBS и инкубировали вместе с вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре. На последнем этапе белки были визуализированы при помощи химической люминесценции (Western Blotting Luminol Reagent, sc-2048 Santa Cruz). Пленки были отсканированы и проанализированы с помощью программного обеспечения AlphaEase FC (Bonsai Technologies). Статистический анализ был проведен с применением ANOVA теста и Student-Neuman-Keuls теста.
Результаты
В данной работе представлены результаты применения НсТеТх для мышей SOD1 G93A, служащих моделью для ALS, у которых наблюдают дегенерацию двигательных нейронов. Результаты исследования транскрипции в спинном мозге мышей в симптоматической стадии представлены на фигуре 7. Сравнение транскрипционной регуляции генов caspase-1, caspase-3, Bax and Bcl2, вовлеченных в апоптоз клеток спинного мозга в конце симптоматической стадии (в возрасте 110 дней), диких мышей и у мышей SOD1 G93A показало значительную индукцию генов caspase-1 (Р<0.05), caspase-3 (Р<0.05) и Bcl2 (Р<0.01), но не было никакого существенного различия в профиле гена контрольной группы мышей SOD1 G93A по сравнению с группой мышей дикого типа (фигура 7). В группе мышей, получившей лечение НсТеТх, уровень экспрессии генов caspase-1 and caspase-3 был равен уровню мышей дикого типа, а существенные различия были отмечены только при сравнении с группой, не проходившей лечение (Р<0.05 and P<0.01, соответственно). Однако лечение net не повлияло на экспрессию генов Bax и Bcl2 (Р>0.05) в спинном мозге трансгенных мышей (Фигура 7).
Для оценки действия НсТеТх на механизмы, которые обращает процесс апоптоз, вызывающий смерть клеток спинного мозга мышей SOD1 G93A провели исследование белка. Данные показали, что активация гена caspase-3 (P<0.05) заметно уменьшалась у мышей, которым вводили НсТеТх, по сравнению с контрольной группой, достигнув уровня мышей дикого типа, в то время как уровень белка pro-caspase-3 у трансгенных мышей не изменялись. В отличие от результатов анализа экспрессии согласно способом Western-Blot, было отмечено, что количество белков Вах и Bcl2 было ниже у мышей, инъецированных НсТеТх (фигура 8).
Один из способов действия НсТеТх - это фосфорилирование Akt (Gil et al., 2003. Biochem J. 373:613-620), протеинкиназы, которая активизируется различными факторами роста, участвующими в блокировке путей, опосредуемых фосфатидилинозитол-3-киназой. Денситометрический количественный анализ показал, что у животных, получивших НсТеТх, уровень Akt фосфорилированной по Ser473 был более чем в два раза выше, чем у инъецированной пустым переносчиком группы (Р<0.05), при исследовании способом Western-Blot, при котором использовали фосфор-специфичные антитела (фигура 9). Эквимолярная нагрузка белков была подтверждена при использовании антител против тубулина. Фосфорилирование ERK1/2 по НсТеТх было показано ранее в культивируемых нейронах коры мозга (Gil et al., 2003. Biochem J. 373:613-620). Для подтверждения участия НсТеТх в пути MAP киназы был проведен анализ Western-Blot экстракта спинного мозга SOD1 G93A мышей, как подвергавшихся лечению, так и не подвергавшихся, в возрасте 110 дней. Результат показал растущую активацию ERK 1/2 у контрольной группы мышей по сравнению с группой, получавшей НсТеТх, при этом уровень экспрессии соответствовал уровню у мышей дикого типа.
Пример 3
Выживаемость SOD1 G93A мышей увеличилась после внутрибрюшного введения полипептида, включающего С-конец тяжелой цепи токсина столбняка (НсТеТх).
Материалы и методы
1.1 Экстракция полипептида, включающего С-конец тяжелой цепи токсина столбняка (НсТеТх).
Используемый полипептид (НсТеТх) соответствует С-концу тяжелой цепи токсина столбняка и содержит 451 аминокислоту (SEQ ID NO: 1) последовательности SEQ ID NO: 2, полипептид был получен согласно протоколу, описанному в Gil et al (Gil et al., 2003. Biochem. J. 373,613-620).
1.2 Трансгенные мыши
Трансгенные мыши, которые сверхэкспрессировали ген SOD1 с мутацией G93A (B6SJL-TgN(SOD1-93AJ1 Gur), были получены от Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Во всех экспериментах использовали гемизиготные мутантные особи (мужскую мутантную особь скрещивали с не трансгенной женской особью). Трансгенные мыши были выявлены посредством ПЦР-амплификации ДНК, полученной из хвоста, по методике, описанной в Gurney et al. (Gurney et al., 1994 «Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation», Science, 264 (5166): 1772-5). Животных содержали в Mixed Research Unit университета Сарагоса. Пищу и воду давали без ограничений. Все проведенные эксперименты и процесс ухода за животными были разработаны в соответствии со стандартами университета Сарагоса и международного руководства по использованию лабораторных животных.
1.3 Внутрибрюшная инъекция полипептида животным
В возрасте 12 недель трансгенным мышам SOD1 G93A во внутрибрюшную область вводили 250 мл полипептида с концентрацией 0.5 мМ, содержащего С-конец тяжелой цепи токсина столбняка (НсТеТх). Инъекции повторяли раз в неделю на протяжении всей жизни мышей.
1.4 Измерение выживаемости у животных
Финальной точкой жизни животного принято было считать момент, когда оно было не способно перевернуться со спины после переворачивания.
Результаты
1.1 Инъекция НсТеТх увеличила продолжительность жизни SOD1 G93A трансгенных мышей
Как видно из фигуры 10 и таблицы 2 максимальную продолжительность жизни, которая в среднем достигала 135 дней, показали мыши из группы, инъецированной НсТеТх, что на 9 дней дольше, чем у контрольной группы.
Контрольная группа (n=3) | НсТеТх (n=3) | Р Value | |
Летальный исход | 126±4 | 135±2 | 0.021 |
Таблица 2. Показатель выживаемости в контрольной группе, группе, инъецированной НсТеТх, а также Р Value
Пример 4
Ведение НсТеТх вызывает экспрессию генов, связанных кальций, в спинном мозге SOD1G93A мышей.
Существует свидетельство ненормального внутриклеточного кальциевого гомеостаза, связанного с Боковым амиотрофическим склерозом (ALS). Было показано, что белок нейронов NCS1 регулирует секреторную функцию нервной системы кальций-зависимым образом (McFerran et al., 1998. J. Biol. Chem. 273: 22768-22772), а также связан с модуляцией кальций/кальмодулин зависимых ферментов, участвующих в передаче нейронного сигнала (Schaad et al., 1996. PNAS. 93: 9253-9258). Экспрессия NCS1 в спинном мозге мышей SOD1 G93A была протестирована 50 раз после лечения с помощью НсТеТх. R-PCR эксперименты показали, что экспрессия гена NCS1 была подавленной (Р<0.05) у трансгеннх мышей с поздним наступлением симптоматики заболевания относительно мышей дикого типа того же возраста. Кроме того, у мышей, внутримышечно инъецированных НсТеТх, уровень NCS1 (Р<0.05) оказался выше и соответствовал уровню, характерному для мышей дикого типа. У тех же образцов был проанализирован уровень информационных РНК гена, связанного с Ras и гена, ассоциированного с диабетом (Rrad). В этом примере уровень экспрессии Rrad увеличился почти в два раза в спинном мозге у контрольных трансгенных мышей, по сравнению с мышами дикого типа того же возраста. Однако, по сравнению с контрольной группой курс лечения НсТеТх у трансгенных мышей SOD1 G93A значительно снизил экспрессию Rrad (Р<0.05), которая достигла уровня у мышей дикого типа (фигура 11).
Claims (17)
1. Способ лечения бокового амиотрофического склероза (ALS) у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающий введение в указанное млекопитающее эффективного количества изолированного полинуклеотида, который содержит последовательность, кодирующую C-концевой домен тяжелой субъединицы токсина столбняка (HcTeTx), фрагмент указанной кодирующей последовательности, или вариант указанной полинуклеотидной последовательности, в котором осуществлена замена или делеция по меньшей мере одного нуклеотида, при этом:
(а) полипептид, кодируемый указанным изолированным полинуклеотидом или вариантом полинуклеотида, оказывает лечебное действие в отношении ALS;
(б) полипептид, кодируемый указанным изолированным полинуклеотидом, не является частью гибридного белка или конъюгата; и
(в) полипептид, кодируемый указанным изолированным полинуклеотидом, не является нацеливающим агентом.
(а) полипептид, кодируемый указанным изолированным полинуклеотидом или вариантом полинуклеотида, оказывает лечебное действие в отношении ALS;
(б) полипептид, кодируемый указанным изолированным полинуклеотидом, не является частью гибридного белка или конъюгата; и
(в) полипептид, кодируемый указанным изолированным полинуклеотидом, не является нацеливающим агентом.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанной последовательностью, кодирующей указанный C-концевой домен тяжелой субъединицы токсина столбняка (HcTeTx), является последовательность SEQ ID NO:1.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанной кодирующей последовательностью является последовательность SEQ ID NO:6.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид вводят в виде чистой ДНК.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид вводят орально, парентерально, внутримышечно или назально.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид вводят внутримышечно.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид экспрессируется in vivo в указанной мышце.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид введен в вектор экспрессии.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный вектор обладает способностью к экспрессии in vivo.
10. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанным вектором является вектор экспрессии pcDNA3.1.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный вектор содержит промотор, способный вызывать экспрессию указанного изолированного полинуклеотида, введенного в указанный вектор.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанным промотором является промотор pCMV.
13. Способ лечения бокового амиотрофического склероза (ALS) у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающий введение в указанное млекопитающее эффективного количества изолированного полипептида, который содержит C-конец тяжелой субъединицы токсина столбняка (HcTeTx), фрагмент НсТеТх или вариант указанной полипептидной последовательности, в котором осуществлена замена или деления по меньшей мере одной аминокислоты, при этом:
(a) фрагмент HcTeTx или вариант указанного полипептида оказывает лечебное действие в отношении ALS;
(б) указанный полипептид не является частью гибридного белка или конъюгата; и
(в) указанный полипептид не является нацеливающим агентом.
(a) фрагмент HcTeTx или вариант указанного полипептида оказывает лечебное действие в отношении ALS;
(б) указанный полипептид не является частью гибридного белка или конъюгата; и
(в) указанный полипептид не является нацеливающим агентом.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанным изолированным полипептидом, который содержит C-конец тяжелой субъединицы токсина столбняка (HcTeTx), является полипептид с последовательностью SEQ ID NO:2.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанным изолированным полипептидом является полипептид с последовательностью SEQ ID NO:5.
16. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный полипептид вводят орально, парентерально, внутримышечно и назально.
17. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный полипептид вводят внутрибрюшинно.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200702621A ES2332628B1 (es) | 2007-10-05 | 2007-10-05 | Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica como medicamento. |
ESP200702621 | 2007-10-05 | ||
PCT/ES2008/070186 WO2009043963A1 (es) | 2007-10-05 | 2008-10-03 | Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetánica como medicamento |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2010115135A RU2010115135A (ru) | 2011-11-10 |
RU2495676C2 true RU2495676C2 (ru) | 2013-10-20 |
Family
ID=40525852
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010115135/15A RU2495676C2 (ru) | 2007-10-05 | 2008-10-03 | Применение последовательности, кодирующей с-концевой домен тяжелой цепи токсина столбняка, в качестве лекарственного средства |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8945586B2 (ru) |
EP (1) | EP2210611B1 (ru) |
JP (1) | JP5325224B2 (ru) |
CN (1) | CN101873865B (ru) |
BR (1) | BRPI0817792A2 (ru) |
CA (1) | CA2701521C (ru) |
ES (2) | ES2332628B1 (ru) |
MX (1) | MX2010003695A (ru) |
RU (1) | RU2495676C2 (ru) |
WO (1) | WO2009043963A1 (ru) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2332628B1 (es) | 2007-10-05 | 2011-01-24 | Universidad De Zaragoza | Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica como medicamento. |
EP3164149A1 (en) | 2014-07-02 | 2017-05-10 | Spherium Biomed S.L. | Methods of increasing muscle mass using non-toxic tetanus toxin c fragment (ttc) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999009057A2 (en) * | 1997-08-14 | 1999-02-25 | Institut Pasteur | Hybrid tetanus toxoid proteins that migrate retrogradely and transynaptically into the cns |
US20040248188A1 (en) * | 2000-06-28 | 2004-12-09 | Ira Sanders | Methods for using tetanus toxin for benificial purposes in animals (mammals) |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2498192A2 (fr) * | 1981-01-22 | 1982-07-23 | Pasteur Institut | Nouveau compose polypeptidique thiole provenant d'un fragment de la toxine tetanique, son procede d'obtention et ses applications |
US7923216B2 (en) * | 1997-08-14 | 2011-04-12 | Institut Pasteur | In vivo modulation of neuronal transport |
WO2004021992A2 (en) * | 2002-09-06 | 2004-03-18 | The General Hospital Corporation | Delivery of therapeutics to the brain and spinal cord |
ES2281278B1 (es) * | 2006-01-20 | 2008-10-16 | Universidad Autonoma De Barcelona | Empleo de un polipeptido que comprende el dominio c-terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica en el tratamiento del parkinsonismo. |
WO2008094583A2 (en) * | 2007-01-30 | 2008-08-07 | The General Hospital Corporation | Methods and devices for mri-based measurement of axonal transport in vivo and delivery of therapeutic substances to the cns |
ES2332628B1 (es) | 2007-10-05 | 2011-01-24 | Universidad De Zaragoza | Uso de la secuencia codificante del dominio carboxilo terminal de la cadena pesada de la toxina tetanica como medicamento. |
-
2007
- 2007-10-05 ES ES200702621A patent/ES2332628B1/es active Active
-
2008
- 2008-10-03 RU RU2010115135/15A patent/RU2495676C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-10-03 CN CN2008801173975A patent/CN101873865B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-03 WO PCT/ES2008/070186 patent/WO2009043963A1/es active Application Filing
- 2008-10-03 MX MX2010003695A patent/MX2010003695A/es active IP Right Grant
- 2008-10-03 JP JP2010527478A patent/JP5325224B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-03 EP EP08836703.2A patent/EP2210611B1/en active Active
- 2008-10-03 ES ES08836703.2T patent/ES2463770T3/es active Active
- 2008-10-03 BR BRPI0817792 patent/BRPI0817792A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-10-03 CA CA2701521A patent/CA2701521C/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-04-05 US US12/754,552 patent/US8945586B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-12-15 US US14/570,976 patent/US20160017008A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999009057A2 (en) * | 1997-08-14 | 1999-02-25 | Institut Pasteur | Hybrid tetanus toxoid proteins that migrate retrogradely and transynaptically into the cns |
US20040248188A1 (en) * | 2000-06-28 | 2004-12-09 | Ira Sanders | Methods for using tetanus toxin for benificial purposes in animals (mammals) |
Non-Patent Citations (3)
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2010115135A (ru) | 2011-11-10 |
MX2010003695A (es) | 2010-09-14 |
US8945586B2 (en) | 2015-02-03 |
ES2332628B1 (es) | 2011-01-24 |
ES2463770T3 (es) | 2014-05-29 |
EP2210611A4 (en) | 2010-12-15 |
CN101873865A (zh) | 2010-10-27 |
EP2210611B1 (en) | 2014-02-26 |
WO2009043963A1 (es) | 2009-04-09 |
CA2701521A1 (en) | 2009-04-09 |
EP2210611A1 (en) | 2010-07-28 |
ES2332628A1 (es) | 2010-02-09 |
CN101873865B (zh) | 2013-06-05 |
CA2701521C (en) | 2015-12-01 |
JP5325224B2 (ja) | 2013-10-23 |
US20160017008A1 (en) | 2016-01-21 |
US20100261656A1 (en) | 2010-10-14 |
BRPI0817792A2 (pt) | 2015-03-24 |
JP2010540599A (ja) | 2010-12-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5123226B2 (ja) | 自己免疫疾患を予防し治療するための物質 | |
JP6625071B2 (ja) | 慢性疼痛用のナトリウムチャネルを標的とする非麻薬性crmp2ペプチド | |
ES2819866T3 (es) | Polipéptido ANGPTL8 y su uso para el tratamiento de condiciones asociadas con triglicéridos elevados | |
ES2420510T3 (es) | Composiciones y métodos para el tratamiento de lesiones del SNC | |
BR112020015511A2 (pt) | composições de vírus adeno-associado para transferência de genes da pah e métodos de uso das mesmas | |
US20210268126A1 (en) | Treating spinal cord injury (sci) and brain injury using gsx1 | |
JP2022520232A (ja) | ダノン病の治療のための遺伝子療法ベクター | |
Cui et al. | NF1, neurofibromin and gene therapy: prospects of next-generation therapy | |
ES2433915T3 (es) | Vacunas de ADN que codifican proteínas de choque térmico | |
RU2495676C2 (ru) | Применение последовательности, кодирующей с-концевой домен тяжелой цепи токсина столбняка, в качестве лекарственного средства | |
US11510999B2 (en) | Treatment of neuropathy with DNA constructs expressing IGF-1 isoforms | |
HU227985B1 (en) | Methods and compositions useful for modulation of angiogenesis using tyrosine kinase src | |
JP4422330B2 (ja) | 新規な免疫異常性疾患予防・治療用剤 | |
US20050209148A1 (en) | Methods of treating obesity or diabetes using NT-4/5 | |
KR20020032553A (ko) | 단백질 키나제 Raf 및 Ras를 사용한 혈관형성조절에 유용한 방법 및 조성물 | |
US20020082204A1 (en) | Treatment of inflammation with p20 | |
HU230294B1 (hu) | IL-18-inhibitorok alkalmazása központi idegrendszeri sérülések kezelésére vagy megelőzésére | |
US20220033450A1 (en) | Virally expressed inhibitors of pdz domains, such as pick1 and uses thereof | |
US20050043258A1 (en) | Methods of treating xerostomia and xerophthalmia | |
JP2012512183A (ja) | 改変された孔形成性タンパク質プロアエロリシンを用いた前立腺炎の処置のための方法 | |
US20050123977A1 (en) | Assay and treatment | |
KR102315736B1 (ko) | Apoe4 rna 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 | |
TW202408594A (zh) | 用於膀胱過動之長期基因療法 | |
WO2020097150A1 (en) | Treatment of traumatic brain injury | |
JP2023522050A (ja) | 血管炎の処置のための住血吸虫由来の28kda gstタンパク質 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161004 |