JP2022520232A - ダノン病の治療のための遺伝子療法ベクター - Google Patents
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本開示は、ＬＡＭＰ－２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子療法ベクター、その使用方法、医薬組成物、およびその他を提供する。特に本開示は、例えばダノン病における治療剤として使用するための、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、またはＬＡＭＰ－２Ｃを発現するＡＡＶｒｈ７４血清型を有する組換えＡＡＶベクターを提供する。【選択図】図１
Description
関連出願
本出願は、２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，９２８号、および２０１９年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８０４，５２１号に対する優先権を主張し、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，９２８号、および２０１９年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８０４，５２１号に対する優先権を主張し、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子出願されており、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルには、２０２０年２月１１日に作成され、約６１キロバイトのサイズを有する“ＲＯＰＡ＿０１３＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”という名称の配列表が含まれる。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子出願されており、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルには、２０２０年２月１１日に作成され、約６１キロバイトのサイズを有する“ＲＯＰＡ＿０１３＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”という名称の配列表が含まれる。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、概して、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２、ＣＤ１０７ｂとしても知られる）の変異に関連する疾患のための遺伝子療法に関する。
本発明は、概して、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２、ＣＤ１０７ｂとしても知られる）の変異に関連する疾患のための遺伝子療法に関する。
背景
リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２、ＣＤ１０７ｂとしても知られる）は、リソソーム関連膜糖タンパク質をコードする遺伝子である。遺伝子の選択的スプライシングは、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、およびＬＡＭＰ－２Ｃの三つのアイソフォームを生成する。ＬＡＭＰ－２における機能喪失型変異は、オートファジー障害に関連する家族性心筋症であるダノン病を含むヒト疾患と関連している。ダノン病は、稀であるが重篤な心臓および骨格筋症であり、不整脈および心筋症により、かなりの罹患率および早期死亡をもたらす。Ｘ連鎖性遺伝形式が、男性と女性の間の表現型重症度における報告された差の原因である。Ｂｏｕｃｅｋら Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３：５６３－５６８（２０１１）（非特許文献１）。この疾患は、シャペロン媒介性オートファジー中のリソソーム膜受容体として機能するリソソーム関連膜タンパク質－２（ＬＡＭＰ－２）の原発性欠乏症によって引き起こされることが理解されている。ＮｉｓｈｉｎｏらＮａｔｕｒｅ ４０６：９０６－９１０（２０００）（非特許文献２）。
リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２、ＣＤ１０７ｂとしても知られる）は、リソソーム関連膜糖タンパク質をコードする遺伝子である。遺伝子の選択的スプライシングは、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、およびＬＡＭＰ－２Ｃの三つのアイソフォームを生成する。ＬＡＭＰ－２における機能喪失型変異は、オートファジー障害に関連する家族性心筋症であるダノン病を含むヒト疾患と関連している。ダノン病は、稀であるが重篤な心臓および骨格筋症であり、不整脈および心筋症により、かなりの罹患率および早期死亡をもたらす。Ｘ連鎖性遺伝形式が、男性と女性の間の表現型重症度における報告された差の原因である。Ｂｏｕｃｅｋら Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３：５６３－５６８（２０１１）（非特許文献１）。この疾患は、シャペロン媒介性オートファジー中のリソソーム膜受容体として機能するリソソーム関連膜タンパク質－２（ＬＡＭＰ－２）の原発性欠乏症によって引き起こされることが理解されている。ＮｉｓｈｉｎｏらＮａｔｕｒｅ ４０６：９０６－９１０（２０００）（非特許文献２）。
Ｂｏｕｃｅｋら Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３：５６３－５６８（２０１１）
ＮｉｓｈｉｎｏらＮａｔｕｒｅ ４０６：９０６－９１０（２０００）
本開示は、ＬＡＭＰ２に関連するかかる遺伝子療法ベクター、その使用方法、医薬組成物、およびその他を提供する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの臨床使用は知られているが、遺伝子療法のためのＡＡＶの好ましい血清型の選択は依然として困難かつ予測不可能である。
本開示は、ＬＡＭＰ－２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、その使用方法、医薬組成物、およびその他を含む、改善された遺伝子療法ベクターを提供する。特に本開示は、例えばダノン病における治療剤として使用するための、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、またはＬＡＭＰ－２Ｃを発現するＡＡＶｒｈ７４血清型を有する組換えＡＡＶベクターを提供する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、それらによって包含される。
発明の詳細な説明
本開示は、最適化された発現カセットを用いて、ＣＤ１０７ｂとしても知られるリソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）タンパク質のうちの一つをコードするポリヌクレオチドを送達するＡＡＶｒｈ７４ベースの遺伝子療法ベクターを提供する。概して、ＬＡＭＰ２はヒトＬＡＭＰ２であるが、任意の哺乳類ＬＡＭＰ－２の発現が想定される。天然ＬＡＭＰ２遺伝子は、選択的スプライシングによって、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、およびＬＡＭＰ－２Ｃの三つのバリアントをコードする。ＬＡＭＰ－２Ｂはダノン病に関連している。本開示は主にダノン病に関するものであるが、ＬＡＭＰ２は癌を含む様々な他の疾患に関係している。開示されるベクターは、これらの疾患のいずれかを治療するために使用され得る。
本開示は、最適化された発現カセットを用いて、ＣＤ１０７ｂとしても知られるリソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）タンパク質のうちの一つをコードするポリヌクレオチドを送達するＡＡＶｒｈ７４ベースの遺伝子療法ベクターを提供する。概して、ＬＡＭＰ２はヒトＬＡＭＰ２であるが、任意の哺乳類ＬＡＭＰ－２の発現が想定される。天然ＬＡＭＰ２遺伝子は、選択的スプライシングによって、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、およびＬＡＭＰ－２Ｃの三つのバリアントをコードする。ＬＡＭＰ－２Ｂはダノン病に関連している。本開示は主にダノン病に関するものであるが、ＬＡＭＰ２は癌を含む様々な他の疾患に関係している。開示されるベクターは、これらの疾患のいずれかを治療するために使用され得る。
本開示はさらに、ＡＡＶｒｈ７４キャプシドまたはＡＡＶｒｈ７４キャプシドと実質的な相同性を有し、ＡＡＶｒｈ７４キャプシドの機能を保持するキャプシドに関する。本開示は、表１に列挙された配列を提供する。表１はさらに、様々な実施形態で使用されるポリヌクレオチド配列を提供する。配列は、異なるプロモーター、エンハンサー、または他の遺伝要素によるこれらの配列の置換または改変が考慮されるため、本発明を限定することを意図していない。
（表１）配列
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）遺伝子療法ベクターを提供する。本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター」は、核酸およびキャプシドタンパク質を含むタンパク質成分を含む完全なウイルスを指す。いくつかの実施形態では、キャプシドタンパク質は、トランスファープラスミドにトランスでプラスミド上に供給されるポリヌクレオチドによって、コードされる。野生型ＡＡＶｒｈ７４キャップのポリヌクレオチド配列は以下の通りである。
ＡＡＶｒｈ７４キャプシドコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＡＡＶｒｈ７４キャプシドコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
本開示はさらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～４、および相同体またはその機能的バリアントを含むＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のタンパク質配列を提供する。
ＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
特定の事例では、ＡＡＶｒｈ７４キャプシドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されるＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ１のアミノ酸配列と、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より一般的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一な配列を含む、または本質的にそれからなる、またはさらにそれからなるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されるＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ２のアミノ酸配列と、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より一般的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一な配列を含む、または本質的にそれからなる、またはさらにそれからなるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されるＡＡＶｒｈ７４ ＶＰ３のアミノ酸配列と、例えば少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より一般的には９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一な配列を含む、または本質的にそれからなる、またはさらにそれからなるポリペプチドを含む。
ＬＡＭＰ－２Ｂの野生型ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）およびＬＡＭＰ－２Ｂの野生型ポリヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）はそれぞれ、
である。
一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のポリヌクレオチド配列と少なくとも９９％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のポリヌクレオチド配列を含む。実施形態では、当該導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な同一性を共有する。
一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列と、少なくとも９９％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子によってコードされるポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む。実施形態では、導入遺伝子によりコードされるポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な同一性を共有する。
本明細書は、コドン最適化、ＣｐＧ枯渇、クリプティックスプライス部位の除去、および代替のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の減少を含む、ＬＡＭＰ－２Ｂの遺伝子配列に対する修飾が開示される。実施形態では、本開示は、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）またはその機能的バリアントのアイソフォームをコードする導入遺伝子を提供する。実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９から選択される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な同一性を共有する。本開示は、ＬＡＭＰ－２Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９）の少なくとも三つのバリアント遺伝子配列を提供する：
である。
一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９から選択される配列と少なくとも９９％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９から選択される配列を含む。実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な同一性を共有する。実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な同一性を共有する。実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または完全な同一性を共有する。
いくつかの事例では、導入遺伝子は、参照配列のポリヌクレオチド配列、例えば、「天然型」または「野生型」ＬＡＭＰ－２Ｂ配列と異なるポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、参照配列と最大で７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、参照配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と７８．５％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５または７～９のいずれか一つのサブ配列と類似または同一である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５または７～９のいずれか一つのサブ配列を含む。様々な実施形態において、サブ配列は、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約１５０ｎｔ、少なくとも約２５０ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ、少なくとも約４５０ｎｔ、少なくとも約４００ｎｔ、少なくとも約４５０ｎｔ、少なくとも約５５０ｎｔ、少なくとも約６００ｎｔ、少なくとも約６５０ｎｔ、少なくとも約６００ｎｔ、少なくとも約６５０ｎｔ、少なくとも約７００ｎｔ、少なくとも約７５０ｎｔ、少なくとも約８００ｎｔ、少なくとも約８５０ｎｔ、少なくとも約９００ｎｔ、少なくとも約９５０ｎｔ、少なくとも約１０００ｎｔ、少なくとも約１０５０ｎｔ、少なくとも約１１００ｎｔ、少なくとも約１１５０ｎｔ、または少なくとも約１２００ｎｔの長さを有する連続したヌクレオチド（ｎｔ）の任意のセットを、完全配列中に含むことができる。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６または１６～１８のいずれか一つのサブ配列と類似または同一のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６または１６～１８のいずれか一つのサブ配列を含むポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、サブ配列は、少なくとも約２０ａａ、少なくとも約３０ａａ、少なくとも約５０ａａ、少なくとも約７０ａａ、少なくとも約８０ａａ、少なくとも約１００ａａ、少なくとも約１２０ａａ、少なくとも約１３０ａａ、少なくとも約１５０ａａ、少なくとも約１７０ａａ、少なくとも約１８０ａａ、少なくとも約２００ａａ、少なくとも約２２０ａａ、少なくとも約２３０ａａ、少なくとも約２５０ａａ、少なくとも約２７０ａａ、少なくとも約２８０ａａ、少なくとも約３００ａａ、少なくとも約３２０ａａ、少なくとも約３３０ａａ、少なくとも約３５０ａａ、少なくとも約３７０ａａ、少なくとも約３８０ａａ、または少なくとも約４００ａａの長さを有する連続したアミノ酸（ａａ）の任意のセットを、完全配列中に含むことができる。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、１～１０アミノ酸（ａａ）、１～２０ａａ、１～３０ａａ、１～４０ａａ、もしくは１～５０ａａのＮ末端切断、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４８、５０ａａ以上のＮ末端切断、および／または１～１０アミノ酸（ａａ）、１～２０ａａ、１～３０ａａ、１～４０ａａ、もしくは１～５０ａａのＣ末端切断、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４８、５０ａａ以上のＣ末端切断を含むＬＡＭＰ－２ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ２ポリペプチドのサブ配列は、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、またはＬＡＭＰ－２Ｃの機能的バリアントを含む。本明細書で使用される場合、「機能的バリアント」とは、参照ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、またはＬＡＭＰ－２Ｃに配列類似性を共有し、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、またはＬＡＭＰ－２Ｃの少なくとも一つの生物学的特性を有するポリペプチドを指す。生物学的特性は、一つまたは複数の結合パートナーと特異的に相互作用する能力、抗－ＬＡＭＰ２抗体に結合する能力、および／または細胞、組織、および／または生物におけるＬＡＭＰ２活性の欠損を補足する能力を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ２ポリペプチドのサブ配列は、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、またはＬＡＭＰ－２Ｃの機能的断片を含む。本明細書で使用される場合、「機能的断片」とは、参照ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、またはＬＡＭＰ－２Ｃのサブ配列に配列類似性を共有し、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、またはＬＡＭＰ－２Ｃの少なくとも一つの生物学的特性を有するポリペプチドを指す。生物学的特性は、一つまたは複数の結合パートナーと特異的に相互作用する能力、抗－ＬＡＭＰ２抗体に結合する能力、および／または細胞、組織、および／または生物におけるＬＡＭＰ２活性の欠損を補足する能力を含み得る。
一実施形態では、導入遺伝子は、ヒト宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。一実施形態では、導入遺伝子コード配列は、稀に表されるコドンをより頻繁に表されるコドンで置換することによって発現を増強するように改変されるか、または「コドン最適化」される。コード配列は、翻訳のためにアミノ酸をコードするｍＲＮＡ配列の部分である。翻訳中、６１個のトリヌクレオチドコドンの各々が、２０個のアミノ酸のうちの一つに翻訳され、遺伝コードにおいて縮重性または冗長性をもたらす。しかしながら、異なる細胞タイプ、および異なる動物種は、異なる頻度で同じアミノ酸をコードするｔＲＮＡ（各々、アンチコドンを有する）を利用する。遺伝子配列が、対応するｔＲＮＡによって稀に表されるコドンを含有する場合、リボソーム翻訳機構は速度を緩め、効率的な翻訳を妨げる場合がある。特定の種について「コドン最適化」を介して、発現を改善することができ、ここで、コード配列は、同じタンパク質配列をコードするが、高度に表されるおよび／または高度に発現されるヒトタンパク質によって利用されるコドンを利用するように、改変される（Ｃｉｄ－Ａｒｒｅｇｕｉら、２００３；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４９２８）。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子のコード配列は、哺乳類または霊長類において稀に発現されるコドンを、霊長類において頻繁に発現されるコドンで置換するように改変される。例えば、いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、参照ポリペプチド（例えば、野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）と少なくとも８５％の配列同一性、例えば、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードし、コード配列の少なくとも一つのコドンは、上記または本明細書に開示される配列において、対応するコドンよりも高いヒトにおけるｔＲＮＡ頻度を有する。
一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６よりも少ない代替のオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、導入遺伝子は、所望の導入遺伝子をコードしないオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の終了または除去によって発現を増強するように改変される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンに続く核酸配列であり、終止コドンを含有しない。ＯＲＦは、順方向または逆方向であってもよく、対象となる遺伝子と比較して、「インフレーム」または「アウトオブフレーム」であってもよい。こうしたオープンリーディングフレームは、対象となる遺伝子と共に発現カセットに発現される可能性を有し、望ましくない有害作用をもたらす可能性がある。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、コドン使用をさらに変更することによってオープンリーディングフレームを除去するために改変されている。これは、一つまたは複数の開始コドン（ＡＴＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ）を除去すること、および／または一つまたは複数の停止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、またはＴＧＡ）を所望のＯＲＦに対して逆方向またはアウトオブフレームに導入することによって行われるが、一方で、対象となる遺伝子においてコードされたアミノ酸配列を保持し、任意で、高度に利用されるコドンを維持する（すなわち、頻度＜２０％を有するコドンを回避する）。
本開示の変形では、導入遺伝子コード配列は、コドン最適化および非導入遺伝子ＯＲＦの除去のいずれかによって、または両方の技術を使用して最適化されてもよい。いくつかの事例では、コドン最適化中に導入されたＯＲＦを除去するために、コドン最適化後に非導入遺伝子ＯＲＦを除去または最小化する。
一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６よりも少ないＣｐＧ部位を含有する。理論に拘束されるものではないが、ポリヌクレオチド配列中のＣｐＧ部位の存在は、ポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターに対する宿主の望ましくない免疫反応と関連すると考えられる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＣｐＧ部位の数を減少させるよう設計される。例示的な方法は、米国特許出願公開第ＵＳ２００２００６５２３６Ａ１号に提供されている。
一実施形態では、導入遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６よりも少ないクリプティックスプライス部位を含有する。最適化のために、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ソフトウェアを使用して、例えば、ＧＣ含量を増加させ、および／または転写サイレンシングを回避し、したがって導入遺伝子の発現を増加させるために、クリプティックスプライス部位を除去してもよい。あるいは、当技術分野で周知の任意の最適化方法を使用してもよい。クリプティックスプライス部位の除去は、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００４０１５１０６Ａ１に記載されている。
また、本明細書では、ＬＡＭＰ－２Ｂ、例えば、本明細書に開示されるコドン最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ配列をコードする発現カセットおよび遺伝子療法ベクターも開示されており、この配列は、コンセンサス最適コザック配列、全長ポリアデニル化（ポリＡ）配列（または切断されたポリＡについての全長ポリＡの置換）、および最小または上流のない（すなわち、５’）開始コドン（すなわち、ＡＴＧ部位）を含む。
いくつかの事例では、発現カセットは、第１の末端逆位配列、エンハンサー／プロモーター領域、コンセンサス最適コザック配列、導入遺伝子（例えば、本明細書に開示されるＬＡＭＰ－２Ｂをコードする導入遺伝子）、全長ポリＡ配列を含む３’非翻訳領域、および第２の末端逆位配列のうちの二つ以上を含有する。
一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子に動作可能に連結されたコザック配列を含む。一実施形態では、コザック配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含むか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０からなるコンセンサス最適コザック配列である。
GCCGCCACCATGG（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
GCCGCCACCATGG（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
様々な実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子に動作可能に連結された代替のコザック配列を含む。一実施形態では、コザック配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２５のいずれか一つを含むまたはそれからなる代替のコザック配列である。
(gcc)gccRccAUGG （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
AGNNAUGN（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
ANNAUGG（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
ACCAUGG（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
GACACCAUGG（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
(gcc)gccRccAUGG （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
AGNNAUGN（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
ANNAUGG（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
ACCAUGG（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
GACACCAUGG（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１では、小文字は、塩基がなおも変化し得る位置の最も一般的な塩基を示し、大文字は、高度に保存された塩基を示す。「Ｒ」はアデニンまたはグアニンを示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１では、括弧内の配列（ｇｃｃ）は任意である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２～２３では、「Ｎ」は任意の塩基を示す。
様々な配列を、このコンセンサス最適コザック配列の代わりに、翻訳開始部位として使用することができるが、他の配列を特定し、試験することは、当業者の範囲内である。Ｋｏｚａｋ Ｍ．Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｉｎｔｉｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１５（４）：８８７－９０３（１９９１）を参照されたい。
一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子に動作可能に連結された全長ポリＡ配列を含む。一実施形態では、全長ポリＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６を含む。
限定されるものではないが、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）、ＳＶ４０初期／後期ポリアデニル化シグナル（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）、およびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を含む様々な代替のポリＡ配列を、本開示の発現カセットに使用してもよい。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、ポリＡ配列の活性断片を含む。特定の実施形態では、ポリＡ配列の活性断片は、例えば、本明細書に開示されるポリＡ配列のいずれかの２０塩基対（ｂｐ）未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、または１５０ｂｐ未満を含む、またはそれからなる。
いくつかの事例では、発現カセットが競合するＯＲＦを含有しないことを保証することによって、導入遺伝子の発現が増加する。一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンの５’の２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、または３００塩基対以内に開始コドンを含まない。一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンの５’に開始コドンを含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、代替の転写物を含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、例えば３００塩基対以下の小さな転写物を除いて、代替の転写物を含まない。
一実施形態では、発現カセットは、５’から３’方向に、動作可能に連結された第１の末端逆位配列、エンハンサー／プロモーター領域、イントロン、コンセンサス最適コザック配列、導入遺伝子、全長ポリＡ配列を含む３’非翻訳領域、および第２の末端逆位配列を含み、発現カセットは導入遺伝子の開始コドンに対して５’に開始コドンを含まない。
一実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、５’から３’方向に、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーおよびニワトリベータ－アクチンプロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、ＣＡＧプロモーターを含む。本明細書で使用される場合、「ＣＡＧプロモーター」は、ＣＭＶ初期エンハンサー要素、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含むポリヌクレオチド配列を指す。
一実施形態では、発現カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態では、発現カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２から選択される配列に完全な同一性を共有するか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２から選択される配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を共有する。特定の実施形態では、発現カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２から選択される配列と比較して、一つまたは複数の修飾を含む。特定の実施形態では、一つまたは複数の修飾は、一つまたは複数（例えば、全て）の上流ＡＴＧ配列の除去、本明細書に開示するもののいずれかを含むがこれに限定されない最適化されたコンセンサスコザック配列もしくは別のコザック配列によるコザック配列の置換、および／または本明細書に開示するもののいずれかを含むがこれに限定されない全長ポリアデニル化配列または別のポリアデニル化配列によるポリアデニル化配列の置換のうちの一つまたは複数を含む。これらの例示的な発現カセット内の遺伝要素の例示的な構成を図１に記載する。
である。
一実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一実施形態では、発現カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３および１４から選択されるＩＴＲ配列を含む。
関連の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法ベクターを提供する。概して、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）の一つまたは複数のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含み、ＬＡＭＰ－２を発現して、欠乏したＬＡＭＰ－２タンパク質発現レベルおよび／またはオートファジーフラックスの部分的または完全な調整をそれを必要とする対象（例えば、ダノン病またはＬＡＭＰ－２発現の欠乏に少なくとも部分的に起因するオートファジーフラックスの欠陥を特徴とする別の障害を有する対象）に行うことを可能にする。
ＬＡＭＰ－２Ａタンパク質配列
ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質配列
ＬＡＭＰ－２Ｃタンパク質配列
特定の実施形態では、発現カセットは、本明細書に開示されるＬＡＭＰ－２をコードするポリヌクレオチド配列、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１７のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。遺伝子療法ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってもよい。例示的な非ウイルスベクターとして、例えば、ネイキッドＤＮＡ、カチオン性リポソーム複合体、カチオン性ポリマー複合体、カチオン性リポソームポリマー複合体、およびエクソソームが挙げられる。ウイルスベクターの例として、限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１７のうちの一つ以上、二つ以上、または三つ全てをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ－２遺伝子の天然イントロンを含むポリヌクレオチド配列は、一つのベクターを使用して同じ細胞において複数のアイソフォームの発現を可能にする。いくつかの実施形態では、人工イントロン、スプライスアクセプター、および／またはスプライスドナーは、ポリヌクレオチドの長さを最適化するために、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１７の二つ以上、または三つ全てをコードするポリヌクレオチドによって発現されるアイソフォームの比率を最適化するために、使用されている。
いくつかの実施形態では、発現カセット、ＡＡＶキャプシド遺伝子、および／またはヘルパー遺伝子は、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、および当技術分野で周知の任意の他の方法を使用して細胞に送達される。いくつかの実施形態では、発現カセット、ＡＡＶキャプシド遺伝子、および／またはヘルパー遺伝子は、リポソームまたは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に送達される。発現カセット、ＡＡＶキャプシド遺伝子、および／またはヘルパー遺伝子は、例えば、一つまたは複数のプラスミド、バクミド、または他のＤＮＡ分子上でＤＮＡとして提供されてもよい。いくつかの実施形態では、発現カセット、ＡＡＶキャプシド遺伝子、および／またはヘルパー遺伝子は、ＲＮＡ分子として送達される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、一つまたは複数のｍＲＮＡ分子、例えば、一つまたは複数のインビトロに転写されたｍＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、修飾ｍＲＮＡ分子である。例示的な修飾としては、ロック核酸、ホスホチオレート結合、および修飾ヌクレオシド（例えば、プソイドウリジン、５－メチルシトシン、または５－メチルシチジン）が挙げられる。いくつかの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、キャップ、例えば、ＡＲＣＡキャップを含む。発現カセット、ＡＡＶキャプシド遺伝子、および／またはヘルパー遺伝子は、インビトロまたはインビボで送達されてもよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシド遺伝子は、ＡＡＶ９キャプシド遺伝子およびＡＡＶｒｈ７４キャプシド遺伝子のうちの一つまたは複数を含む。
本発明の実施に有用な遺伝子送達ウイルスベクターは、分子生物学の技術分野で周知の方法論を利用して構築され得る。典型的には、導入遺伝子を担持するウイルスベクターは、導入遺伝子、適切な調節因子、およびウイルスタンパク質の産生に必要な要素をコードするポリヌクレオチドから構築され、これは細胞形質導入を媒介する。かかる組換えウイルスは、当技術分野で周知の技術によって、例えば、パッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスによる一過性トランスフェクションによって生成され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ９細胞（任意にバキュロウイルスヘルパーベクターを有する）、２９３細胞などが含まれるが、これらに限定されない。ＵＳ２０１７０２１８３９５Ａ１に記載されるように、ヘルペスウイルス系システムを使用してＡＡＶベクターを産生することができる。かかる複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えば、Ｗ０９５／１４７８５、Ｗ０９６／２２３７８、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号およびＷ０９４／１９４７８に見つけることができ、それぞれの完全な内容は参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＡＶは４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＡＡＶは非病原性であり、既知の疾患との病因的関連がないため、ＡＡＶに基づく組換えベクターは優れた臨床安全性を伴う。さらに、ＡＡＶは、多数の組織において、非常に効率的な遺伝子送達および持続的導入遺伝子発現の能力を提供する。「ＡＡＶベクター」とは、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味し、限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ７４等を含む。ＡＡＶベクターは、全体的にまたは部分的に削除された一つまたは複数のＡＡＶ野生型遺伝子、例えば、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子を有することができるが、機能的に隣接している末端逆位配列（ＩＴＲ）配列を保持することができる。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの救出、複製およびパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージング（例えば、機能性ＩＴＲ）のためにシスで必要とされる少なくともそれらの配列を含むように本明細書に定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的救出、複製およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって、改変され得る。ＡＡＶベクターは、限定されるものではないが、一つまたは複数の改変キャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）を含む、他の改変を含み得る。例えば、キャプシドタンパク質は、指向性を変化させ、および／または免疫原性を減少させるように改変されてもよい。ＡＡＶ発現ベクターは、周知の技術を使用して構築されて、転写の方向に動作可能に連結された構成要素として、転写開始領域、対象のＤＮＡ（すなわち、ＬＡＭＰ－２遺伝子）および転写終結領域を含む制御要素を少なくとも提供する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶゲノムは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、ポジティブセンスまたはネガティブセンスのいずれかで構築され、長さは約４．７キロ塩基である。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に末端逆位配列（ＩＴＲ）、ならびに二つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐおよびｃａｐを含む。第１のｒｅｐは、ＡＡＶライフサイクルに必要なＲｅｐタンパク質をコードする四つの重複遺伝子から構成され、第２のｃａｐは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の三つのキャプシドタンパク質をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶのｐ４０プロモーターからのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として発現される。ｍＲＮＡは２．３ｋｂおよび２．６ｋｂの転写物に選択的スプライシングされ、２．３ｋｂの転写物のほうがより豊富である。ＶＰ１は２．６ｋｂの転写物からのみ発現され、ＶＰ１タンパク質は分子量で８７キロダルトン（ｋＤａ）である。ＶＰ２は、翻訳開始のための最適なコザック配列の存在により、基準のＡＵＧコドンよりも、ＡＣＧコドンから始まるオープンリーディングフレームから発現される。ＶＰ２は７２ｋＤａである。わずか６２ｋＤａのＶＰ３は、２．３ｋｂの転写物、ならびに２．６ｋｂの転写物に存在するＡＴＧ配列から発現される。ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の相対存在量は１：１：１０である。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は相互作用して、二十面体対称性のキャプシドを形成する。
野生型ＡＡＶは非病原性であり、既知の疾患との病因的関連がないため、ＡＡＶに基づく組換えベクターは優れた臨床安全性を伴う。さらに、ＡＡＶは、多数の組織において、非常に効率的な遺伝子送達および持続的導入遺伝子発現の能力を提供する。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ７４等を含むＡＡＶの様々な血清型が知られている。ＡＡＶベクターは、全体的にまたは部分的に削除された一つまたは複数のＡＡＶ野生型遺伝子、例えば、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子を有することができるが、機能的に隣接している末端逆位配列（ＩＴＲ）配列を保持している。組換えＡＡＶベクターの血清型は、そのキャプシドによって決定される。国際特許公開ＷＯ２００３０４２３９７Ａ２は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ１０を含む様々なキャプシド配列を開示している。国際特許公開ＷＯ２０１３０７８３１６Ａ１は、ＡＡＶｒｈ７４由来のＶＰ１のポリペプチド配列を開示している。数多くの多様な天然由来のまたは遺伝子改変されたＡＡＶキャプシド配列が当技術分野で知られている。
本開示はまた、本明細書に開示される発現カセットまたはベクター（例えば、遺伝子療法ベクター）、および一つまたは複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される発現カセットを含むＡＡＶベクターを含み、例えば、発現カセットは、ＬＡＭＰ－２Ｂをコードするコドン最適化された導入遺伝子、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９のいずれかを含む。オートファジーフラックスの欠陥を特徴とする障害（例えば、ダノン病）の予防または治療に使用するために、ＬＡＭＰ－２の一つまたは複数のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含む治療有効量のベクターを含む医薬組成物を提供する。
発現カセットまたはベクターを含有する医薬組成物は、例えば、脳室内、心筋内、冠動脈内、静脈内、動脈内、腎内、尿道内、硬膜外、または筋肉内投与のための選択された投与モードに好適な任意の形態であってもよい。一つまたは複数のＬＡＭＰ－２アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターは、動物およびヒトに、唯一の活性剤として、または他の活性剤と組み合わせて、単位投与形態で、従来の医薬支持体との混合物として、投与することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本開示の遺伝子療法ベクターのいずれかを用いてｅｘ ｖｉｖｏで形質導入された細胞を含む。
様々な実施形態において、医薬組成物は、注射され得る製剤に薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体、希釈剤、および賦形剤）を含有する。これらは、特に、等張性、滅菌、生理食塩水溶液（一ナトリウムまたはリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたは塩化マグネシウム等、またはそのような塩の混合物）であり得る。注射用に好適な例示的な薬学的形態として、例えば、滅菌水溶液または分散剤；ゴマ油、落花生油、または水性プロピレングリコールを含む配合物；および滅菌注射剤または分散剤の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において、ダノン病または別のオートファジー障害の一つまたは複数の症状を予防、軽減、改善、低減、抑制、除去、および／または逆転させる方法を提供し、本開示の遺伝子療法ベクターを対象に投与することを含む。用語「ダノン病」は、多系統の臨床症状を伴うＸ連鎖優性骨格および心筋障害を指す。ダノン病変異は、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）タンパク質発現の非存在をもたらす。主な臨床的特徴には、骨格および心臓ミオパチー、心臓伝導異常、認知障害、および網膜疾患が含まれる。男性は通常、女性よりも早期に、より重度に罹患する。
一実施形態では、ベクターは、非経口、静脈内、動脈内、心臓内、冠動脈内、心筋内、腎内、尿道内、硬膜外、および筋肉内からなる群から選択される経路を介して投与される。一実施形態では、ベクターは複数回投与される。一実施形態では、ベクターは、ベクターの筋肉内注射によって投与される。一実施形態では、ベクターは、ベクターの骨格筋への注射によって投与される。一実施形態では、発現カセットは、筋肉特異的プロモーター、任意に筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、またはＴａｋｅｓｈｉｔａら Ｍｕｓｃｌｅ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ／ＳＶ４０ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｍｕｓｃｌｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００７ Ｆｅｂ；１９（２）：３０９－１５に記載されるＭＣＫ／ＳＶ４０ハイブリッドプロモーターを含む。一実施形態では、ベクターは心臓内注射によって投与される。
一実施形態では、本開示は、疾患または障害、任意にダノン病を治療する方法をそれを必要とする対象に提供し、本開示に従って細胞を遺伝子療法ベクターと接触させ、該細胞を対象に投与することを含む。一実施形態では、細胞は幹細胞であり、任意に多能性幹細胞である。一実施形態では、幹細胞は心臓組織に分化することができる。一実施形態では、幹細胞は、筋組織、例えば、心筋組織および／または骨格筋組織に分化することができる。一実施形態では、幹細胞は自家性である。一実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
一実施形態では、オートファジー障害は、末期心不全、心筋梗塞、薬物毒性、糖尿病、末期腎不全、および加齢からなる群から選択される。一実施形態では、対象は哺乳類、例えばヒトである。一実施形態では、対象は、ダノン病または別のオートファジー障害の症状を呈している。一実施形態では、対象は、減少または検出することができないＬＡＭＰ－２発現を有するとして特定されている。一実施形態では、対象は、変異型ＬＡＭＰ－２遺伝子を有すると特定されている。
本明細書に記載される方法を使用した治療を施すことができる対象／患者には、不十分なオートファジーフラックス、例えば、ダノン病ならびに限定されるものではないが、収縮期および拡張期心不全、心筋梗塞、薬物毒性（例えば、アントラサイクリン、クロロキン、およびその誘導体）、糖尿病、末期腎疾患および加齢）を特徴とする疾患または障害のリスクがあるが症状が現れない個体、ならびに現在症状を呈している個体が含まれる。かかる対象は、変異型ＬＡＭＰ－２遺伝子を有するか、またはＬＡＭＰ－２発現のレベルが低下しているもしくは検出不能であるとして特定することができる。
いくつかの実施形態では、対象は、不十分なオートファジーフラックス（例えば、ダノン病、ならびに収縮期および拡張期心不全、心筋梗塞、薬物毒性、糖尿病、末期腎疾患、および加齢を含むがこれに限定されない、他の既知のオートファジー障害）を特徴とする疾患または障害の症状を呈する。症状は、活動的に顕在化してもよく、または（例えば、薬剤によって）抑制もしくは制御されてもよく、または寛解していてもよい。対象は、例えば、資格を有する医師によって、障害と診断されても、診断されていなくてもよい。
定義
「リソソーム関連膜タンパク質２」および「ＬＡＭＰ－２」という用語は、核酸およびポリペプチド多型バリアント、対立遺伝子、変異体、および種間相同体を互換的に指し、（１）ＬＡＭＰ－２核酸によってコードされるアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００２２９４．２（アイソフォームＡ）．ＮＭ＿０１３９９５．２（アイソフォームＢ）、ＮＭ＿００１１２２６０６．１（アイソフォームＣ）を参照されたい）と、またはＬＡＭＰ－２ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００２２８５．１（アイソフォームＡ）、ＮＰ＿０５４７０１．１（アイソフォームＢ）、ＮＰ＿００１１１６０７８．１（アイソフォームＣ）を参照されたい）と、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、または全長にわたり、約９０％を超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、（２）ＬＡＭＰ－２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるＬＡＭＰ－２ポリペプチド）のアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生される抗体、例えばポリクローナル抗体、またはＬＡＭＰ－２核酸（例えば、本明細書に記載されるＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）によってコードされるアミノ酸配列、およびその保存的に修飾されたバリアントに結合し、（３）厳格なハイブリダイゼーション条件下で、ＬＡＭＰ－２タンパク質をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖、およびその保存的に修飾されたバリアントに特異的にハイブリダイズし、（４）ＬＡＭＰ－２核酸（例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド、および本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ポリペプチドをコードするＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）と、好ましくは、少なくとも約２５個、５０個、１００個、２００個、５００個、１０００個、２０００個またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、または全長にわたり、約９０％超、好ましくは約９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する。
「リソソーム関連膜タンパク質２」および「ＬＡＭＰ－２」という用語は、核酸およびポリペプチド多型バリアント、対立遺伝子、変異体、および種間相同体を互換的に指し、（１）ＬＡＭＰ－２核酸によってコードされるアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００２２９４．２（アイソフォームＡ）．ＮＭ＿０１３９９５．２（アイソフォームＢ）、ＮＭ＿００１１２２６０６．１（アイソフォームＣ）を参照されたい）と、またはＬＡＭＰ－２ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００２２８５．１（アイソフォームＡ）、ＮＰ＿０５４７０１．１（アイソフォームＢ）、ＮＰ＿００１１１６０７８．１（アイソフォームＣ）を参照されたい）と、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、または全長にわたり、約９０％を超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、（２）ＬＡＭＰ－２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるＬＡＭＰ－２ポリペプチド）のアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生される抗体、例えばポリクローナル抗体、またはＬＡＭＰ－２核酸（例えば、本明細書に記載されるＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）によってコードされるアミノ酸配列、およびその保存的に修飾されたバリアントに結合し、（３）厳格なハイブリダイゼーション条件下で、ＬＡＭＰ－２タンパク質をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖、およびその保存的に修飾されたバリアントに特異的にハイブリダイズし、（４）ＬＡＭＰ－２核酸（例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド、および本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ポリペプチドをコードするＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）と、好ましくは、少なくとも約２５個、５０個、１００個、２００個、５００個、１０００個、２０００個またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、または全長にわたり、約９０％超、好ましくは約９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する。
「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、以下の配列比較アルゴリズムを使用して、または手動の配列比較および目視検査を使用して測定される比較ウィンドウまたは指定された領域で最大相関性（ｍａｘｉｍｕｍ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）について比較および配列比較を行う場合に、二つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、同じである、または同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定の割合を有する（すなわち参照配列、例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と、特定の領域にわたり、少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する）二つ以上の配列またはサブ配列を指す。かかる配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の補完を指す。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域、例えば、５０、１００、２００、３００、４００アミノ酸長またはヌクレオチド長の領域、または参照配列の全長にわたって存在する。
配列比較については、典型的には、一つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータを使用する、または代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一性の割合を計算する。ＬＡＭＰ－２核酸およびタンパク質に対する核酸およびタンパク質の配列比較のためには、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムおよびデフォルトパラメータが使用される。
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、２０～６００、通常では約５０～約２００、より通常では約１００～約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか一つのセグメントへの参照を含み、配列は、二つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続位置の基準配列と比較されてもよい。比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）によって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）によって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎの類似法の検索、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｌにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動配列比較および目視検査による（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照のこと）によって実施することができる。配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）にそれぞれ記述がある。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブ、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開されている。
二つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に交差反応性である。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、保存的置換によってのみ二つのペプチドが異なる場合に、第２のポリペプチドに対し実質的に同一である。二つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、二つの分子またはその相補体が、厳しい条件下で互いにハイブリダイズすることである。さらに、二つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅することができることである。
本明細書で使用される場合、「投与」は、局所投与および全身投与を指し、例えば、経腸投与、非経口投与、肺投与、および局所／経皮投与を含む。本明細書に記載の方法における使用を見出す化合物（例えば、一つ以上のＬＡＭＰ－２アイソフォームをコードするポリヌクレオチド）の投与経路として、対象に対しての例えば、経口（ｏｓ（Ｐ．Ｏ．）当たり）投与、経鼻または吸入投与、坐薬としての投与、局所接触、経皮的送達（例えば、経皮パッチを介して）、くも膜下腔内（ＩＴ）投与、静脈内（「ｉｖ」）投与、腹腔内（「ｉｐ」）投与、筋肉内（「ｉｍ」）投与、病巣内投与、または皮下（「ｓｃ」）投与、または徐放装置、例えば、ミニ浸透圧ポンプの埋め込み、デポ製剤の投与等が挙げられる。投与は、非経口および経粘膜的（例えば、経口、鼻腔、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路によってもよい。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腎内、尿道内、心臓内、冠動脈内、心筋内、皮内、硬膜外、皮下、腹腔内、脳室内、イオン交換、および頭蓋内が含まれる。他の送達様式としては、限定されるものではないが、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が挙げられる。いくつかの実施形態では、投与されるｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの用量は、約１Ｅ＋１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ～約１Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約１Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ～約２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ～約３Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約３Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ～約３Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ、または約３Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ～約３Ｅ＋１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、投与されるｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの用量は、約３Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ～約３Ｅ＋１４ｖｇ／ｋｇである。
用語「全身投与」および「全身投与される」は、化合物または組成物が循環系を介して、薬学的作用の標的部位を含む体内の部位に送達されるように、化合物または組成物を哺乳動物に投与する方法を指す。全身投与には、限定されないが、経口、鼻腔内、直腸および非経口（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮、および皮下などの消化管以外の）投与が含まれる。
用語「共投与」または「同時投与」は、例えば、化合物（例えば、ＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）および／またはその類似体ならびに別の活性剤に関して使用される場合、両方が生理学的効果を同時に達成できるような、化合物および／または類似体および活性剤の投与を指す。しかしながら、二つの薬剤は一緒に投与される必要はない。特定の実施形態では、一つの薬剤の投与は、他方の投与に先行することができる。同時生理学的効果は、必ずしも循環中の両方の薬剤の存在を同時に必要としない。しかしながら、特定の実施形態では、共投与は、典型的には、両方の薬剤が、任意の所与の用量についてそれらの最大血清濃度の有意な画分（例えば、２０％以上、例えば、３０％もしくは４０％以上、例えば、５０％もしくは６０％以上、例えば、７０％もしくは８０％もしくは９０％以上）で、体内（例えば、血漿中）に同時に存在する結果となる。
用語「有効量」または「医薬有効量」は、所望の結果をもたらすために必要な一つまたは複数の化合物（例えば、遺伝子療法ベクター）の量および／または投与量、および／または投与レジメン、例えば、障害またはオートファジーの欠陥によって特徴付けられる疾患（例えば、ダノン病）の最終的な重症度を減少させるのに十分な量の一つまたは複数のＬＡＭＰ－２アイソフォームの発現の増加を指す。いくつかの実施形態では、有効量は、約１Ｅ＋１１ｖｇ／ｋｇ～約１Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約１Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ～約２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ～約３Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、約３Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ～約３Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ、または約３Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ～約３Ｅ＋１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターである。いくつかの実施形態では、有効量は、約３Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ～約３Ｅ＋１４ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターである。
「投与させる」という語句は、医療従事者（例えば、医師）、または対象の医療を制御する者が、問題となる薬剤（複数可）／化合物（複数可）の対象への投与を制御および／または許可する行為を指す。投与させることには、適切な治療または予防レジメンの診断および／または決定、ならびに／または対象に対する特定の薬剤（複数可）／化合物の処方を伴い得る。こうした処方には、例えば、処方書の草案作成、医療記録の注釈付けなどが含まれ得る。
本明細書で使用される場合、用語「治療する」および「治療」は、当該用語が適用される疾患もしくは病態、または当該疾患もしくは病態の一つまたは複数の症状のいずれかの発症を遅らせること、進行を遅らせることもしくは逆転させること、重症度を減少させること、または軽減もしくは予防することを指す。用語「治療する」および「治療」はまた、疾患または病態の一つまたは複数の症状を予防、軽減、改善、低減、阻害、除去、および／または逆転させることを含む。
用語「軽減」は、その病理または疾患の一つまたは複数の症状の低減または除去、および／またはその病理または疾患の一つまたは複数の症状の発症率の減少または発症の遅延、または重症度の低減、および／またはその病理または疾患の予防を指す。特定の実施形態では、病理または疾患の一つまたは複数の症状の低減または除去は、例えば、ＬＡＭＰ－２の一つまたは複数のアイソフォームの発現レベルの測定可能かつ持続的な増加を含み得る。
本明細書で使用される場合、「本質的にそれからなる」という語句は、方法または組成物に列挙された活性薬学的剤の属または種を指し、さらに、それ自体は、列挙された表示または目的に対して実質的な活性を有しない他の薬剤を含み得る。
用語「対象」、「個体」、および「患者」は、哺乳類、好ましくはヒトまたは非ヒト霊長類であるが、家畜化された哺乳類（例えば、イヌまたはネコ）、実験哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）、および農業哺乳類（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ウシ）を互換的に指す。様々な実施形態において、対象は、ヒト（例えば、成人男性、成人女性、青年男性、青年女性、男性子供、女性子供）であってもよい。
用語「遺伝子導入」または「遺伝子送達」は、外来ＤＮＡを宿主細胞に確実に挿入するための方法またはシステムを指す。こうした方法は、非統合的に導入されたＤＮＡの一過性の発現、染色体外複製および導入されたレプリコン（例えばエピソーム）の発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡへの導入された遺伝物質の組み込みをもたらし得る。
用語「ベクター」は、本明細書において、別の核酸分子を伝達または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。導入された核酸は、概してベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは、細胞内の自律的複製または逆転写を方向付ける配列を含んでもよく、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。「ベクター」は遺伝子療法ベクターを含む。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子療法ベクター」は、遺伝子療法の実施、例えば、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を対象に送達する際に使用できるベクターを指す。遺伝子療法ベクターは、治療的に活性なポリペプチド、例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂ、または対象に導入された場合に置換遺伝子療法に有用な他の遺伝子をコードする核酸分子（「導入遺伝子」）を含み得る。有用なベクターには、ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「発現カセット」は、該発現カセットに組み込まれる治療的に活性なポリペプチド（例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂ）をコードするポリヌクレオチド（導入遺伝子）の発現を駆動する適切な設定において能力を有するＤＮＡセグメントを指す。宿主細胞に導入されると、発現カセットは特に、導入遺伝子をＲＮＡに転写するように細胞の機構に指示することができ、その後、通常さらに治療され、最終的に治療活性ポリペプチドに翻訳される。発現カセットは、遺伝子療法ベクター内に含まれてもよい。概して、発現カセットという用語は、ポリヌクレオチド配列５’～５’ＩＴＲおよび３’～３’ＩＴＲを除外する。
本明細書において参照および識別される全ての特許、特許刊行物、およびその他の刊行物は、参照によりその全体が全ての目的に対して個別におよび明示的に本明細書に組み込まれる。
実施例１：ＡＡＶｒｈ７４－ＬＡＭＰ－２Ｂの前臨床評価および臨床評価
図１に図示される遺伝子発現カセットを含むプラスミドベクターが生成される。導入遺伝子は、ＬＡＭ２Ｂ－ＨＡ－ＦＬＡＧをコードするように改変され、その結果、タンパク質は、抗ＨＡ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体のいずれかを使用して検出され得る。ＡＡＶｒｈ７４－ＬＡＭＰ２Ｂウイルスベクターは、ヒトＬＡＭＰ－２Ｂ発現カセットに隣接するＡＡＶ２ＩＴＲを有する血清型ｒｈ７４キャプシドタンパク質およびウイルスゲノムを含有する組換えＡＡＶ粒子を生成するために、３プラスミドヘルパーウイルスフリーシステムを使用して生成される。ウイルスベクターは、非ヒト霊長類で試験される。
図１に図示される遺伝子発現カセットを含むプラスミドベクターが生成される。導入遺伝子は、ＬＡＭ２Ｂ－ＨＡ－ＦＬＡＧをコードするように改変され、その結果、タンパク質は、抗ＨＡ抗体または抗ＦＬＡＧ抗体のいずれかを使用して検出され得る。ＡＡＶｒｈ７４－ＬＡＭＰ２Ｂウイルスベクターは、ヒトＬＡＭＰ－２Ｂ発現カセットに隣接するＡＡＶ２ＩＴＲを有する血清型ｒｈ７４キャプシドタンパク質およびウイルスゲノムを含有する組換えＡＡＶ粒子を生成するために、３プラスミドヘルパーウイルスフリーシステムを使用して生成される。ウイルスベクターは、非ヒト霊長類で試験される。
薬理試験および毒性試験は、ＬＡＭＰ－２Ｂ－／－マウスおよび野生型マウスで実施される。マウスおよび非ヒト霊長類試験で観察された前臨床安全性および有効性データに基づき、ダノン病患者における臨床試験を実施する。
実施例２：１×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２ＢおよびＡＡＶｒｈ７４．ＬＡＭＰ２Ｂの静脈内投与後の非ヒト霊長類におけるＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の発現
ＡＡＶ９対ＡＡＶｒｈ７４ベクターの非ヒト霊長類研究を、対となる雄と雌のアフリカミドリサル（ＡＧＭ）で行った。対象は、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ－ＨＡ－ＦｌａｇまたはＡＡＶｒｈ７４．ＬＡＭＰ２Ｂ－ＨＡ－Ｆｌａｇのいずれかを投与された。「ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ－ＨＡ－Ｆｌａｇ」は、ＨＡ－ＦｌａｇタグにＣ末端融合されたＬＡＭＰ２ＢをコードするＡＡＶ９血清型アデノ随伴ウイルスベクターである。「ＡＡＶｒｈ７４．ＬＡＭＰ２Ｂ－ＨＡ－Ｆｌａｇ」は、ＨＡ－ＦｌａｇタグにＣ末端融合されたＬＡＭＰ２ＢをコードするＡＡＶｒｈ７４血清型アデノ随伴ウイルスベクターである。１頭の対象にビヒクル対照を与えた。ＷＰＲＥ配列を含有するプラスミドを使用して定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により決定された１．８５×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの２ｍＬの静脈内注射によりベクターを投与し、参照曲線を作成した。この注射は、ベクターの標的用量、すなわち約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇを達成した。雌対象は体重が少ないため、それぞれのベクター約１．２×１０１３ｖｇ／ｋｇを投与された。この実験を表２に要約する。
ＡＡＶ９対ＡＡＶｒｈ７４ベクターの非ヒト霊長類研究を、対となる雄と雌のアフリカミドリサル（ＡＧＭ）で行った。対象は、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ－ＨＡ－ＦｌａｇまたはＡＡＶｒｈ７４．ＬＡＭＰ２Ｂ－ＨＡ－Ｆｌａｇのいずれかを投与された。「ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ－ＨＡ－Ｆｌａｇ」は、ＨＡ－ＦｌａｇタグにＣ末端融合されたＬＡＭＰ２ＢをコードするＡＡＶ９血清型アデノ随伴ウイルスベクターである。「ＡＡＶｒｈ７４．ＬＡＭＰ２Ｂ－ＨＡ－Ｆｌａｇ」は、ＨＡ－ＦｌａｇタグにＣ末端融合されたＬＡＭＰ２ＢをコードするＡＡＶｒｈ７４血清型アデノ随伴ウイルスベクターである。１頭の対象にビヒクル対照を与えた。ＷＰＲＥ配列を含有するプラスミドを使用して定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により決定された１．８５×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの２ｍＬの静脈内注射によりベクターを投与し、参照曲線を作成した。この注射は、ベクターの標的用量、すなわち約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇを達成した。雌対象は体重が少ないため、それぞれのベクター約１．２×１０１３ｖｇ／ｋｇを投与された。この実験を表２に要約する。
（表２）
対象は、注射の２か月後に人道的に屠殺され、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質分析のために組織が収集された。以下の組織を検査した：心臓（左心房、右心房、左心室、および右心室）；骨格筋（四頭筋および腓腹筋）；肝臓（左葉、右葉、中葉、および四頭筋葉）；脳（前頭葉、頭頂葉、側頭葉、後頭葉、皮質、海馬、髄質、および小脳）；性腺。
ベクターＤＮＡ－定量的ＰＣＲ
ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キットを使用して凍結組織から抽出された。ＤＮＡ純度（Ａ２６０／Ａ２８０）および濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ社）上で評価した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、リアルタイムＰＣＲシステム（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５、Ｔｈｅｒｍｏ社）上でＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社、４４４００３８）を使用し、以下のプライマー／プローブを使用して、２０ｎｇのＤＮＡに実施した。
ＷＰＲＥ（カセット）：
ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キットを使用して凍結組織から抽出された。ＤＮＡ純度（Ａ２６０／Ａ２８０）および濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ社）上で評価した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、リアルタイムＰＣＲシステム（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５、Ｔｈｅｒｍｏ社）上でＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社、４４４００３８）を使用し、以下のプライマー／プローブを使用して、２０ｎｇのＤＮＡに実施した。
ＷＰＲＥ（カセット）：
ＲＮａｓｅＰ（ハウスキーピング遺伝子、Ｔｈｅｒｍｏ社）
ＷＰＲＥ配列を含有するプラスミドＤＮＡを使用して、標準曲線を生成した。図２は、ｑＰＣＲによる、ダノン病の影響を最も受けた臓器におけるベクターＤＮＡ定量の棒グラフを示す。
ＷＰＲＥ配列を含有するプラスミドＤＮＡを使用して、標準曲線を生成した。図２は、ｑＰＣＲによる、ダノン病の影響を最も受けた臓器におけるベクターＤＮＡ定量の棒グラフを示す。
ＬＡＭＰ２Ｂ ｍＲＮＡ－定量的ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して心臓および筋肉組織から、ならびにＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して肝臓および脳から抽出された。純度（Ａ２６０／Ａ２８０）および濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ分光光度計上で決定した。ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用してｃＤＮＡに変換した。ｑＰＣＲを、リアルタイムＰＣＲシステム（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５、Ｔｈｅｒｍｏ社）上でＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）において、、以下のプライマー／プローブを使用して、１０ｎｇのＲＮＡに実施した。
ＷＰＲＥ（カセット）：
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して心臓および筋肉組織から、ならびにＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して肝臓および脳から抽出された。純度（Ａ２６０／Ａ２８０）および濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ分光光度計上で決定した。ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用してｃＤＮＡに変換した。ｑＰＣＲを、リアルタイムＰＣＲシステム（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５、Ｔｈｅｒｍｏ社）上でＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ社）において、、以下のプライマー／プローブを使用して、１０ｎｇのＲＮＡに実施した。
ＷＰＲＥ（カセット）：
ＨＰＲＴ－１（ハウスキーピング遺伝子、Ｔｈｅｒｍｏ社）
ＷＰＲＥ配列を含有するプラスミドＤＮＡを使用して、標準曲線を生成した。図３Ａは、ｑＰＣＲによる、心臓の領域におけるベクターＤＮＡ定量の棒グラフを示す。図３Ｂは、ｑＰＣＲによる、筋肉におけるベクターＤＮＡ定量の棒グラフを示す。図４は、ＲＴ－ｑＰＣＲによる、ダノン病で最も影響を受けた臓器におけるｍＲＮＡ定量の棒グラフを示す。図５Ａは、ＲＴ－ｑＰＣＲによる、心臓の領域におけるｍＲＮＡ定量の棒グラフを示す。図５Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲによる、筋肉におけるｍＲＮＡ定量の棒グラフを示す。
ＷＰＲＥ配列を含有するプラスミドＤＮＡを使用して、標準曲線を生成した。図３Ａは、ｑＰＣＲによる、心臓の領域におけるベクターＤＮＡ定量の棒グラフを示す。図３Ｂは、ｑＰＣＲによる、筋肉におけるベクターＤＮＡ定量の棒グラフを示す。図４は、ＲＴ－ｑＰＣＲによる、ダノン病で最も影響を受けた臓器におけるｍＲＮＡ定量の棒グラフを示す。図５Ａは、ＲＴ－ｑＰＣＲによる、心臓の領域におけるｍＲＮＡ定量の棒グラフを示す。図５Ｂは、ＲＴ－ｑＰＣＲによる、筋肉におけるｍＲＮＡ定量の棒グラフを示す。
ＬＡＭＰ２Ｂ ｍＲＮＡ－ＲＮＡｓｃｏｐｅ
５ｍｍの組織立方体を１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、切片化した。導入遺伝子ｍＲＮＡは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＬＳ ＲＥＤでＷＰＲＥ－Ｏ３ ＺＺプローブ（ＡＣＤ）を使用して検出した。陽性とみなされる細胞当たり≧１ドットの細胞を用いて、各組織からの一つの切片の半定量的視覚的評価を実施した。陽性細胞の割合は、０％、１～２５％、２６～５０％、５１～７５％、または１００％の５つのカテゴリーに分けられた。
５ｍｍの組織立方体を１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、切片化した。導入遺伝子ｍＲＮＡは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＬＳ ＲＥＤでＷＰＲＥ－Ｏ３ ＺＺプローブ（ＡＣＤ）を使用して検出した。陽性とみなされる細胞当たり≧１ドットの細胞を用いて、各組織からの一つの切片の半定量的視覚的評価を実施した。陽性細胞の割合は、０％、１～２５％、２６～５０％、５１～７５％、または１００％の５つのカテゴリーに分けられた。
図６Ａは、未治療の左心室におけるＲＮＡｓｃｏｐｅによる半定量的ｍＲＮＡ分析の顕微鏡写真を示す。図６Ｂは、未治療の左心室におけるＲＮＡｓｃｏｐｅによる半定量的ｍＲＮＡ分析の顕微鏡写真を示す。図７Ａは、未治療の四頭筋におけるＲＮＡｓｃｏｐｅによる半定量的ｍＲＮＡ分析の顕微鏡写真を示す。図７Ｂは、未治療の四頭筋におけるＲＮＡｓｃｏｐｅによる半定量的ｍＲＮＡ分析の顕微鏡写真を示す。図８は、未治療の腓腹筋におけるＲＮＡｓｃｏｐｅによる半定量的ｍＲＮＡ分析の顕微鏡写真を示す。結果を、ビヒクル対照（表３Ａ）、ＡＡＶ９（表３Ａ）、およびＡＡＶｒｈ７４（表３Ｃ）について要約する。
（表３Ａ）
（表３Ｂ）
（表３Ｃ）
ＬＡＭＰ２Ｂタンパク質－ＥＬＩＳＡ
約１２５ｍｇの組織を、０．９～２．００ｍｍのステンレス鋼ビーズ（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ社）およびＮｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ ２４を使用して、５００μＬの溶解緩衝液中で均質化した。溶解緩衝液は、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのトリスｐＨ８．０、２％のＮＰ－４０、および０．２％のＳＤＳと、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤およびＰｈｏｓＳＴＯＰ（商標）ホスファターゼ阻害剤を含有する。総タンパク質をＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ社）により評価した。ウェル当たり総タンパク質１００ｍｇを装填した。精製ヒトＬＡＭＰ２タンパク質（Ｏｒｉｇｅｎｅ社）を使用して標準曲線を構築した。ＥＬＩＳＡは、捕捉抗体としてマウスモノクローナル抗体Ｈ４Ｂ４ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）、検出抗体としてヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、二次抗体としてＨＲＰ結合抗体：ロバ抗ヤギ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて行った。プレートをＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いて開発し、分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｃ）上で定量した。
約１２５ｍｇの組織を、０．９～２．００ｍｍのステンレス鋼ビーズ（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ社）およびＮｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ ２４を使用して、５００μＬの溶解緩衝液中で均質化した。溶解緩衝液は、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのトリスｐＨ８．０、２％のＮＰ－４０、および０．２％のＳＤＳと、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤およびＰｈｏｓＳＴＯＰ（商標）ホスファターゼ阻害剤を含有する。総タンパク質をＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ社）により評価した。ウェル当たり総タンパク質１００ｍｇを装填した。精製ヒトＬＡＭＰ２タンパク質（Ｏｒｉｇｅｎｅ社）を使用して標準曲線を構築した。ＥＬＩＳＡは、捕捉抗体としてマウスモノクローナル抗体Ｈ４Ｂ４ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）、検出抗体としてヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、二次抗体としてＨＲＰ結合抗体：ロバ抗ヤギ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて行った。プレートをＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いて開発し、分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５ｃ）上で定量した。
図９は、ＥＬＩＳＡによる、ダノン病で最も影響を受けた組織におけるタンパク質定量の棒グラフを示す。図１０Ａは、ＥＬＩＳＡによる、心臓の領域におけるタンパク質定量の棒グラフを示す。図１０Ｂは、ＥＬＩＳＡによる、筋肉におけるタンパク質定量の棒グラフを示す。
臨床病理学
ベクターの病理学的効果を評価した。図１１Ａ～１１Ｄは、試験の過程におけるＮＨＰ血清中の臨床病理測定の線グラフを示す。臨床病理レベルは、研究期間中の、（図１１Ａ）アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ；（図１１Ｂ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＡＳＴ；（図１１Ｃ）白血球細胞、ＷＢＣ；および（図１１Ｄ）好中球の変化として評価された。Ｂ０５９はビヒクル対照である。Ａ９９１およびＡ６０２はＡＡＶ９治療された動物である。Ａ７１０およびＡ９８１はＡＡＶｒｈ７４治療された動物である。
ベクターの病理学的効果を評価した。図１１Ａ～１１Ｄは、試験の過程におけるＮＨＰ血清中の臨床病理測定の線グラフを示す。臨床病理レベルは、研究期間中の、（図１１Ａ）アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ；（図１１Ｂ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＡＳＴ；（図１１Ｃ）白血球細胞、ＷＢＣ；および（図１１Ｄ）好中球の変化として評価された。Ｂ０５９はビヒクル対照である。Ａ９９１およびＡ６０２はＡＡＶ９治療された動物である。Ａ７１０およびＡ９８１はＡＡＶｒｈ７４治療された動物である。
結論
ＬＡＭＰ２Ｂ導入遺伝子を使用したＡＡＶベースの遺伝子療法は、ベクター用量１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇで非ヒト霊長類において忍容性が良好であった。いくつかの他の導入遺伝子についてのＡＡＶ遺伝子治療を用いた実験は１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下の用量で病理学的効果を示したため、この結果は重要であり予想外の結果である。さらに、ＡＡＶ９とＡＡＶｒｈ７４は両方とも忍容性が良好であった。２１日目にＡ６０２およびＡ７１０動物において特定のマーカーの上昇レベルが観察されたが、これらの外れ値は実験誤差または自己解決性の病理に起因する可能性がある。
ＬＡＭＰ２Ｂ導入遺伝子を使用したＡＡＶベースの遺伝子療法は、ベクター用量１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇで非ヒト霊長類において忍容性が良好であった。いくつかの他の導入遺伝子についてのＡＡＶ遺伝子治療を用いた実験は１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下の用量で病理学的効果を示したため、この結果は重要であり予想外の結果である。さらに、ＡＡＶ９とＡＡＶｒｈ７４は両方とも忍容性が良好であった。２１日目にＡ６０２およびＡ７１０動物において特定のマーカーの上昇レベルが観察されたが、これらの外れ値は実験誤差または自己解決性の病理に起因する可能性がある。
両方のベクターは、ダノン病の治療の標的組織（心臓および筋肉）に局在化され、形質導入するが、脳または性腺ではそれほどではない。性腺における発現は、安全上の理由から望ましくない。予想通り、相当量のベクターが肝臓に蓄積するが、これは肝臓がダノン病に罹患した組織であるため望ましい。ベクターは、心臓の各四分円内、および四頭筋と腓腹筋の両方に存在する。これはダノン病の治療に望ましい結果である。
ＡＡＶベクターの血清型（例えば、ＡＡＶ９）の局在化は、他のベクター（例えば、ＡＡＶｒｈ７４）の局在化を予測するものではない。この実験は、ＡＡＶｒｈ７４がダノン病、または心臓と筋肉の組織に関連する病因を有する他の疾患の治療に望ましい局在化を達成することを実証している。ＬＡＭＰ２Ｂの導入遺伝子ｍＲＮＡとタンパク質は両方とも、ＡＡＶ９とＡＡＶｒｈ７４の両群において同じ一式の組織で発現される。発現は、ベクター血清型間で同等である。研究中の動物の数が少なすぎて、ＡＡＶ９とＡＡＶｒｈ７４の発現レベルの統計的に有意な傾向を識別することができない。ＲＮＡｓｃｏｐｅは、ＡＡＶ９群とＡＡＶｒｈ７４群で、心臓、筋肉、肝臓の組織において同様の量の細胞が感染していることを示唆する。
これらのデータは、ＡＡＶｒｈ７４が、ダノン病の治療に関連する組織にＬＡＭＰ２Ｂを送達するためのベクターとして使用され得ることを実証している。これらの実験では、ＡＡＶｒｈ７４はＡＡＶ９に対して非劣性だった。
Claims (66)
- ５’ＩＴＲ、発現カセット、および３’ＩＴＲを含むポリヌクレオチド；ならびにキャプシドタンパク質を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）遺伝子療法ベクターであって、
前記発現カセットが、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）またはその機能的バリアントをコードする導入遺伝子を含み、
前記発現カセットが、前記５’ＩＴＲおよび前記３’ＩＴＲに隣接し、
前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶｒｈ．７４キャプシドタンパク質またはその機能的バリアントを含む、
ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。 - 前記ＬＡＭＰ－２が、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、およびＬＡＭＰ－２Ｃから選択される、請求項１に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記キャプシドタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記キャプシドタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも９５％の配列同一性を共有する、請求項３に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記キャプシドタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも９７％の配列同一性を共有する、請求項４に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記キャプシドタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも９９％の配列同一性を共有する、請求項５に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記キャプシドタンパク質がＡＡＶｒｈ．７４キャプシドタンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記５’ＩＴＲおよび前記３’ＩＴＲが、それぞれ、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲおよびＡＡＶ２の３’ＩＴＲ、またはそのバリアントである、請求項１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記５’ＩＴＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３と少なくとも９８％の同一性を共有し、前記３’ＩＴＲがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４と少なくとも９８％の同一性を共有する、請求項８に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記導入遺伝子が、ヒト宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記発現カセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６よりも少ないＣｐＧ部位を含有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記発現カセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６よりも少ないクリプティックスプライス部位を含有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記発現カセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６よりも少ない代替のオープンリーディングフレームをコードする、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記導入遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記導入遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９から選択される配列と少なくとも９９％の同一性を共有する、請求項１４に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記導入遺伝子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～９から選択される配列を含む、請求項１５に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記発現カセットが、前記導入遺伝子に動作可能に連結されたコンセンサス最適コザック配列を含み、前記コンセンサス最適コザック配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記発現カセットが、前記導入遺伝子に動作可能に連結された全長ポリＡ配列を含み、前記全長ポリＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記発現カセットが、前記導入遺伝子の開始コドンに対して５’に開始コドンを含まない、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記発現カセットが、前記５’から３’方向に、動作可能に連結された第１の末端逆位配列、エンハンサー／プロモーター領域、イントロン、コンセンサス最適コザック配列、前記導入遺伝子、全長ポリＡ配列を含む３’非翻訳領域、および第２の末端逆位配列を含み、前記発現カセットは前記導入遺伝子の開始コドンに対して５’に開始コドンを含まない、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記エンハンサー／プロモーター領域が、前記５’から３’の方向に、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーおよびニワトリベータ－アクチンプロモーターを含み、任意に、前記エンハンサー／プロモーター領域が、ニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターをさらに含む、請求項２０に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記エンハンサー／プロモーター領域が、肝臓組織と比較して、心臓組織および／または骨格筋組織において増加した発現を媒介することができる組織特異的プロモーターを含む、請求項２０に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記発現カセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２から選択される配列と少なくとも９５％の同一性を共有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 前記発現カセットが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０～１２から選択される配列を含む、請求項２３に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
- 請求項１～２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターを含む医薬組成物。
- それを必要とする対象においてダノン病または別のオートファジー障害を治療または予防する方法であって、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターまたは請求項２５に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターまたは医薬組成物が、静脈内、動脈内、心臓内、冠動脈内、心筋内、腎内、尿道内、硬膜外、および筋肉内からなる群から選択される経路を介して投与される、請求項２６に記載の方法。
- 前記オートファジー障害は、末期心不全、心筋梗塞、薬物毒性、糖尿病、末期腎不全、および加齢からなる群から選択される、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、ダノン病または別のオートファジー障害の症状を呈している、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、内因性ＬＡＭＰ－２の発現が減少しているまたは検出不能であると特定された、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、変異ＬＡＭＰ－２遺伝子を有すると特定された、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターが、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約３×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターが、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．２×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターが、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの用量が投与された場合、任意に約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与された場合、臨床病理を引き起こさない、請求項２６～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、心臓、筋肉、および肝臓のうちの一つまたは複数を形質導入する、請求項２６～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、心臓、筋肉、および肝臓のうちの一つまたは複数においてＬＡＭＰ２Ｂ ｍＲＮＡ発現を引き起こす、請求項２６～３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、心臓、筋肉、および肝臓のうちの一つまたは複数においてＬＡＭＰ２Ｂタンパク質発現を引き起こす、請求項２６～３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、心臓、筋肉、および肝臓のうちの一つまたは複数の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％における前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターによる感染を引き起こす、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、二倍体ゲノム当たり０．１未満のベクターゲノム（ｖｇ）で、性腺において前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの形質導入を引き起こす、請求項２６～４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、全ＲＮＡのμｇ当たり、２×１０４未満のｍＲＮＡコピーで、性腺においてＬＡＭＰ２Ｂ ｍＲＮＡ発現を引き起こす、請求項２６～４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、脳および／または性腺においてＬＡＭＰ２Ｂタンパク質発現を引き起こさない、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、同じ発現カセットを有するＡＡＶ９遺伝子療法ベクターとほぼ同じレベルで、形質導入する、および／または導入遺伝子発現を引き起こす、請求項２６～４３のいずれか一項に記載の方法。
- ＬＡＭＰ－２タンパク質をコードするＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチドを細胞に送達する方法であって、前記細胞を、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターまたは請求項２５に記載の医薬組成物と接触させることを含み、前記細胞が、任意に、心臓細胞、肺細胞、および／または筋細胞から選択される、方法。
- 細胞を形質導入する方法であって、前記細胞を、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターまたは請求項２５に記載の医薬組成物と接触させることを含み、前記細胞が、任意に、心臓細胞、肺細胞、および／または筋細胞から選択される、方法。
- ＬＡＭＰ－２タンパク質をコードするＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチドを組織に送達し、および／または組織においてＬＡＭＰ－２タンパク質を発現する方法であって、前記組織を、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターまたは請求項２５に記載の医薬組成物と接触させることを含み、前記組織が、任意に心臓組織、肺組織、および／または筋組織から選択される、方法。
- ＬＡＭＰ－２タンパク質をコードするＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチドを対象に送達し、および／または対象においてＬＡＭＰ－２タンパク質を発現する方法であって、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターまたは請求項２５に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターまたは医薬組成物が、静脈内、動脈内、心臓内、冠動脈内、心筋内、腎内、尿道内、硬膜外、および筋肉内からなる群から選択される経路を介して投与される、請求項４８に記載の方法。
- 前記対象がダノン病、末期心不全、心筋梗塞、薬物毒性、糖尿病、末期腎不全、および加齢からなる群から選択されるオートファジー障害を罹患しているまたはリスクがある、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、前記オートファジー障害の症状を呈している、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、内因性ＬＡＭＰ－２の発現が減少しているまたは検出不能であると特定された、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、変異ＬＡＭＰ－２遺伝子を有すると特定された、請求項４８～５３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターが、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約３×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４８～５４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターが、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ～約１．２×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４８～５５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターが、約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４８～５６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの用量が投与された場合、任意に約１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与された場合、臨床病理を引き起こさない、請求項４８～５７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、心臓、筋肉、および肝臓のうちの一つまたは複数を形質導入する、請求項４８～５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、心臓、筋肉、および肝臓のうちの一つまたは複数においてＬＡＭＰ２Ｂ ｍＲＮＡ発現を引き起こす、請求項４８～５９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、心臓、筋肉、および肝臓のうちの一つまたは複数においてＬＡＭＰ２Ｂタンパク質発現を引き起こす、請求項４８～６０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、心臓、筋肉、および肝臓のうちの一つまたは複数の細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％における前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターによる感染を引き起こす、請求項４８～６１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、二倍体ゲノム当たり０．１未満のベクターゲノム（ｖｇ）で、性腺において前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの形質導入を引き起こす、請求項４８～６２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、全ＲＮＡのμｇ当たり、２×１０４未満のｍＲＮＡコピーで、性腺においてＬＡＭＰ２Ｂ ｍＲＮＡ発現を引き起こす、請求項４８～６３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、脳および／または性腺においてＬＡＭＰ２Ｂタンパク質発現を引き起こさない、請求項４８～６４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与が、同じ発現カセットを有するＡＡＶ９遺伝子療法ベクターとほぼ同じレベルで、形質導入する、および／または導入遺伝子発現を引き起こす、請求項４８～６５のいずれか一項に記載の方法。
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