EA011284B1

EA011284B1 - Конъюгаты инсулиноподобного фактора роста i (ифр-i) и полиэтиленгликоля

Info

Publication number: EA011284B1
Application number: EA200701234A
Authority: EA
Inventors: Беат Амрайн; Штефан Фозер; Курт Ланг; Фридрих Метцгер; Йёрг Регула; Андреас Шаубмар; Фридерике Хессе; Клаус-Петер Кюнкеле; Мартин Ланцендёрфер
Original assignee: Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2009-02-27
Also published as: US9724425B2; AU2005318387B2; US20150099699A1; CA2592006C; KR20070088809A; ZA200705146B; WO2006066891A2; TW200914041A; BRPI0515857A; AR052842A1; KR20090010138A; TW200635604A; TNSN07237A1; AU2005318387A1; NO20073103L; NZ555840A; US20110009317A1; KR101106860B1; EP1674113A1; JP4954896B2

Abstract

В изобретении описан конъюгат, состоящий из варианта инсулиноподобного фактора роста I (ИФР-I) и одной или двух полиэтиленгликолевых групп, отличающийся тем, что указанный вариант ИФР-I имеет до трех аминокислотных замен в положениях 27, 37, 65, 68 в последовательности исходного ИФР-I, из которых одна или две из указанных аминокислот являются лизином, а аминокислота в положении 27 является полярной аминокислотой, но не лизином, и конъюгирован по первичной аминогруппе (аминогруппам) указанного лизина (лизинов), причем средняя молекулярная масса группы (групп) указанного полиэтиленгликоля равна 20-100 кДа. Этот конъюгат применим для лечения нейродегенеративных расстройств, например болезни Альцгеймера.

Description

Настоящее изобретение относится к конъюгатам инсулиноподобного фактора роста I (ИФР-Ι) с полиэтиленгликолем (ПЭГ), фармацевтическим композициям, содержащим эти конъюгаты, способам получения и способам применения этих конъюгатов.

Предпосылки создания изобретения

Болезнь Альцгеймера (БА) становится все более превалирующей формой нейродегенерации, которая составляет примерно 50-60% всех случаев слабоумия у людей старше 65 лет. По современным оценкам это заболевание встречается у 15 млн чел. в мире, и в связи с тем, что происходит относительное увеличение доли пожилых людей в сообществе, вероятно, в последующие 20-30 лет количество больных возрастет. БА является прогрессирующим заболеванием, средняя продолжительность которого составляет 8,5 лет от начала появления клинических симптомов до смерти.

Гибель пирамидальных нейронов и нейрональных синапсов в областях мозга, связанных с высшими психическими функциями, приводит к появлению типичных симптомов, проявляющихся в обширном и прогрессирующем ухудшении когнитивной функции (Ртапаз Р.Т. и др. 1. №иго1. №игозигд. РзусЫайу 66, 1999, с. 137-147). БА - наиболее распространенная форма старческого и предстарческого слабоумия в мире и распознается клинически в качестве беспрестанно прогрессирующего слабоумия, которое характеризуется возрастающей потерей памяти, интеллекта, а также расстройством речи (Метлй в кн.: «А Тех!Ьоок οί №ито1о§у», Ьеа& РеЫдет, 1979, 6-е изд. Филадельфия, с. 484-489). По данным нейропатологии основным отличительным признаком БА является наличие двух характерных повреждений: амилоидных сенильных бляшек и нейрофибриллярных сплетений (НФС). Хотя бляшка расположена экстранейронально, сплетение наблюдается в мозге интранейронально, что следует из результатов посмертного вскрытия. Одним из основных компонентов оболочки амилоидных бляшек являются патологические отложения низкомолекулярных амилоидных бета-пептидов (Ав), которые образуются в результате расщепления секретазами амилоидного белка-предшественника (АБП) (8е1кое Ό.Ι. Рйузю1. Ксу. 81, 2001, с. 741-766, Нагбу 1. и 8е1кое Ό.Ι. 8с1еисе 297, 2002, с. 353-356, Визй Α.Ι. и Та№ К.Е. Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И8А 99, 2002, с. 7317-7319). Ав является самоагрегирующимся пептидом, состоящим из 39-43 остатков аминокислот (молекулярная масса ~ 4 кДа) и синтезируется в качестве части более крупного АБП (110120 кДа). АБП является интегрированным в мембрану гликопротеином I типа с крупным Ν-концевым внеклеточным доменом, одним трансмембранным доменом и коротким цитоплазматическим хвостом. Область Ав перекрывает части внеклеточного и трансмембранного доменов АБП. Наиболее признанной гипотезой участия АБП в гибели нейрональных клеток при БА является амилоидная гипотеза. Эта гипотеза постулирует, что отложение амилоидных бляшек или частично агрегированный растворимый Ав запускают нейротоксичный каскад, тем самым вызывая нейродегенеративные изменения, напоминающие патологические изменения при БА (8е1кое, Ό.Ι. РЬ.у8ю1. К.еу. 81, 2001, с. 741-766; Нагбу, 1. и 8е1кое, Ό.Ι. 8с1епсе 297, 2002, с. 353-356).

Инсулиноподобный фактор роста I (ИФР-Ι) является циркулирующим гормоном, близким по структуре инсулину. ИФР-Ι всегда рассматривался в качестве основного медиатора действия гормона роста на периферические ткани. ИФР-Ι, также называемый соматомедином С и 8\\'1ззРго1 №. Р01343, состоит из 70 аминокислот. Применение, действие и образование описаны, например, в работах 1е Войс Υ. и др. РЕВ8 Ье!!. 196, 1986, с. 108-112, бе Рад!е^-Нοййи^ζеη Р. и др. РЕВ8 Ье!!. 195, 1986, с. 179-184, ЗапбЬетд №гбс.|\зз1 А.С. и др. Вташ Кез. Мо1. Вташ Кез. 12, 1992, с. 275-277, 8!еепЬетдй Р.Н. и др. Вюсйет. Вюрйуз. Кез. Соттип. 175, 1991, с. 507-514, Таппег ГМ. и др. Ас!а Епбосппо1. (Сорепй.) 84, 1977, с. 681-696, Шйпе К. и др. 1. Сйп. Епбосппо1. Ме!аЬ. 39, 1974, с. 548-554, ЕР 0123228, ЕР 0128733, И8 5861373, И8 5714460, ЕР 0597033, АО 02/32449, АО 93/02695.

Регуляция действия ИФР-Ι весьма сложна. При циркуляции только 0,2% ИФР-Ι существует в свободной форме, а большая часть связана с ИФР-связывающими белками (ИФРСБ), которые обладают чрезвычайно высоким сродством с инсулиноподобными факторами роста и модулируют функцию ИФР-Ι. Этот фактор может высвобождаться локально с помощью механизмов высвобождения ИФР-Ι, например, протеолиза ИФРСБ протеазами.

ИФР-Ι выполняет паракринную роль в развитии и созревании мозга (Аеййет О.А. и др. Мо1. Епбосппо1. 4, 1990, с. 773-778). Исследования ш уйго показали, что ИФР-Ι является мощным неселективным трофическим агентом для нескольких типов нейронов в ЦНС (Кпизе1 В. и др. 1. №игозс1. 10, 1990, с. 558570, δντζκ Ό. и 8сйиЬей, Ό. Вюсйет. Вюрйуз. Кез. Соттип. 172, 1990, с. 54-60), включая дофаминергические нейроны (Кпизе1 В. и др. 1. №игозск 10, 1990, с. 558-570) и олигодендроциты (МсМотз, Р.А. и 0иЬо1з-0а1сс.|. М.1. №итозс1. Кез. 21, 1988, с. 199-209, МсМотз Р.А. и др. Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 83, 1986, с. 822-826, Мοζе11, К.Ь. и МсМотз Р.А. 1. №игозс1. Кез. 30, 1991, с. 382-390). В патенте υδ 5093317 указано, что выживание холинергических нейрональных клеток повышается в результате введения ИФР-Ι. Также было установлено, что ИФР-Ι стимулирует регенерацию периферических нервов (Кафе М. и др. Вташ Кез. 486, 1989, с. 396-398) и повышает активность орнитиндекарбоксилазы (И8 5093317). В ϋδ 5861373 и АО 93/02695 описан способ лечения повреждений и заболеваний центральной нервной системы, которые преимущественно воздействуют на невроглию и/или нехолинергические нейрональные клетки путем повышения действующих концентраций ИФР-Ι и/или его аналогов в центральной

- 1 011284 нервной системе пациента. В №0 0232449 описаны способы понижения или предупреждения ишемических повреждений в центральной нервной системе млекопитающего путем введения в носовую полость млекопитающего фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество ИФР-1 или его биологически активных вариантов. ИФР-Ι или его варианты адсорбируются по всей носовой полости и транспортируются в центральную нервную систему млекопитающего в количестве, эффективном для уменьшения или предупреждения ишемического повреждения, связанного с развитием ишемии. В ЕР 0874641 заявлено применение ИФР-Ι или ИФР-ΙΙ для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения нейронального повреждения в центральной нервной системе из-за связанного со СПИДом слабоумия, БА, болезни Паркинсона, болезни Пика, болезни Гантингтона, печеночной энцефалопатии, кортикально-базальных ганглиозных синдромов, прогрессирующего слабоумия, семейного слабоумия со спастическим парапарезом, прогрессирующего надъядерного паралича, рассеянного склероза, церебрального склероза Шильдера или острого некротизирующего геморрагического энцефаломиелита, в котором лекарственное средство предусмотрено в форме для парентерального введения эффективного количества указанного ИФР за пределами гематоэнцефалического барьера или барьера кровь-спинной мозг.

Снижение уровней содержания несвязанного ИФР-Ι в сыворотке и в мозге связано с патогенезом спорадических и семейных форм БА. Кроме того, ИФР-Ι защищает нейроны от Ав-индуцированной нейротоксичности (Никита Т. и др. 1. №игокск 21, 2001, с. 1902-1910, Эоге 8. и др. Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8с1. И8А, 94, 1997, с. 4772-4777, Эоге 8. и др. Апп. ΝΥ Асаб. 8с1. 890, 1999, с. 356-364). Ранее было установлено, что периферическое введение ИФР-Ι способно понизить уровни содержания Ав в мозге у крыс и мышей (Сагго Е. и др. Ναι. Меб. 8, 2002, с. 1390-1397). Кроме того, установлено, что у трансгенных модельных мышей с БА пролонгированное лечение ИФР-Ι приводит к значительному снижению нагрузки амилоидных бляшек в мозге. Эти результаты убедительно подтверждают предположение о том, что ИФР-Ι может понизить уровни содержания Ав и проявление связанного с отложением бляшек слабоумия путем очищения мозга от Ав.

Было доказано, что ковалентные модификации белков с полиэтиленгликолем (ПЭГ) пригодны для продления полупериода циркуляции белков в организме (НегкЫ1е1б М.8. и др. Ν. Епд1. 1. Меб. 316, 1987, с. 589-596, Меуегк ЕЭ. и др. Сйп. Рйагтасо1. Т1ег. 49, 1991, с. 307-313, Эе1дабо С. и др. Сгб. Веу. Т1ег. Эгид Сатег 8ук!. 9, 1992, с. 249-304, Кайе, Абуапсеб Эгид Эейуегу 8ук!етк 10, 1993, с. 91, ЕР-А 0400472, МопГагбйи С. и др. Вюсопщда1е Сйеш. 6, 1995, с. 62-69, 8а1аке-[51ика\\'а В. и др. Се11 81гис1. Гипс!. 17, 1992, с. 157-160, Кайе Ν.ν. и др. Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 84, 1987, с 1487-1491, ТкШкшш Υ. и др. 1рп. 1. Сапсег Век. 85, 1994, с. 9-12, Июне Н. и др. 1. Ьай. Сйп. Меб. 124, 1994, с. 529-536, С11ато\у 8.М. и др. Вюсопщда1е С1ет. 5, 1994, с. 133-140).

Другие преимущества пэгилирования заключаются в увеличении растворимости и в понижении иммуногенности белков (Кайе Ν.ν. 1. Iттипο1. 144, 1990, с. 209-213). Обычный способ пэгилирования белков заключается в применении полиэтиленгликоля, активированного аминореактивными реагентами, например, Ν-гидроксисукцинимидом (ЙГС). С помощью таких реагентов полиэтиленгликоль присоединяется к белкам по свободным первичным аминогруппам, например Ν-концевой α-аминогруппе и ε-аминогрупп остатков лизина. Однако серьезный недостаток такого подхода заключается в том, что белки обычно содержат большое количество остатков лизина, поэтому группы полиэтиленгликоля присоединяются к белку неспецифически по всем свободным ε-аминогруппам, образуя смесь гетерогенных продуктов, а именно случайным образом пэгилированных белков. Следовательно, многие ИГС-пэгилированные белки не пригодны для коммерческого применения из-за низкой специфической активности. Инактивирование происходит из-за ковалентной модификации одного или нескольких остатков лизина или Ν-концевой аминогруппы, требуемых для биологической активности, или от ковалентного присоединения остатков полиэтиленгликоля по активному сайту белка или около него. Например, было обнаружено, что модификация гормона роста человека при использовании ИГС-пэгилирующих реагентов снижает биологическую активность белка более чем в 10 раз (С1агк В. и др. 1. Вю1. С1ет. 271, 1996, с. 21969-21977). В составе гормона роста человека содержится 9 лизинов помимо Ν-концевой аминокислоты. Некоторые из этих лизинов расположены в областях белка, о которых известно, что они являются принципиально важными для связывания рецептора (Сипишдйат В.С. и др. 8с1епсе 254, 1991, с. 821-825). Кроме того, модификация эритропоэтина в результате применения аминореактивных полиэтиленгликолевых реагентов также приводит почти к полной потере биологической активности (\№о)с1ю\укк| Э.М. и др. ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 910, 1987, с. 224-232). Ковалентная модификация а2-интерферона аминореактивными реагентами для пэгилирования приводит к потере на 40-75% биологической активности (И8 5382657). Сходная модификация приводит к потере биологической активности гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) более чем на 60% (Тапака Н. и др. Сапсег Век. 51, 1991, с. 3710-3714), а интерлейкина-2 - более чем на 90% (Сообкоп ВЭ. Кайе Ν.ν. ВюТесйпо1оду 8, 1990, с. 343-346).

В №0 94/12219 и №0 95/32003 описаны конъюгаты полиэтиленгликоля, включающие ПЭГ и ИФР или ИФР с мутацией по цистеину, в которых ПЭГ присоединен к указанному мутеину по свободному

- 2 011284 цистеину в Ν-концевой области мутеина. В νθ 2004/60300 описан Ν-концевой пэгилированный ИФР-1.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении описан вариант ИФР-Ι, у которого аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности ИФР-Ι природного типа заменами аминокислот в положениях 27, 37, 65 и/или 68 таким образом, что одна или несколько аминокислот в положениях 37, 65, 68 являются лизином (К), а аминокислота в положении 27 является полярной аминокислотой, но не лизином.

Предпочтительно аминокислотой в положении 27 является аргинин.

Такие варианты ИФР-Ι применяют в качестве промежуточных соединений (ИФР-1-промежуточных соединений) для получения лизин-пэгилированного ИФР-Ι.

Неожиданно было обнаружено, что лизин-пэгилированный ИФР-1-вариант (аминоактивированный пэгилированный ИФР-Ι вариант), предпочтительно массой 20-100 кДа пэгилированный ИФР-Ι вариант и особенно предпочтительно монопэгилированный ИФР-Ι вариант, обладает описанными выше свойствами, касающимися терапевтического применения.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является композиция лизинпэгилированного ИФР-Ι варианта по настоящему изобретению и варианта ИФР-Ι, пэгилированного с Ν-конца. Предпочтительно молекулярное соотношение находится в диапазоне от 9:1 до 1:9. Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является композиция, в которой молярное соотношение составляет по меньшей мере 1:1 (по меньшей мере одна часть лизинпэгилированного ИФР-Ι варианта на одну часть варианта ИФР-Ι, пэгилированного с Ν-конца), предпочтительно по меньшей мере 6:4 (по меньшей мере 6 частей лизин-пэгилированного варианта ИФР-Ι на четыре части варианта ИФР-Ι, пэгилированного с Ν-конца). Предпочтительно оба варианта, и лизинпэгилированный вариант ИФР-Ι, и вариант ИФР-Ι, пэгилированный с Ν-конца, являются монопэгилированными. Предпочтительно в такой композиции вариант идентичен одновременно и лизинпэгилированному варианту ИФР-Ι, и пэгилированному с Ν-конца варианту ИФР-Ι. Вариант предпочтительно выбран из группы, включающей КККК, КККК, КККК, КККК. ПЭГ предпочтительно имеет молекулярную массу 30-45 кДа, особенно 30 кДа или 40 кДа. Лизин-пэгилированный вариант ИФР-Ι и пэгилированный с Ν-конца вариант ИФР-Ι имеют сопоставимое сродство с ИФР-связывающими белками (например, СБ4 и СБ5), но разную активность в отношении фосфорилирования ИФР-ΙΚ.

Настоящее изобретение предусматривает конъюгат, состоящий из варианта ИФР-Ι (ИФР-Ι конъюгата или конъюгата) и полиэтиленгликольной группы (групп), отличающийся тем, что указанный вариант ИФР-Ι имеет такую аминокислотную замену(ы) в положениях 27, 37, 65 и/или 68 аминокислотной последовательности природного ИФР-Ι, что одна или несколько аминокислот в положениях 37, 65, 68 являются лизином (К), аминокислота в положении 27 является полярной аминокислотой, но не лизином, а указанный ПЭГ конъюгирован с указанным вариантом ИФР-Ι через первичную аминогруппу(ы), предпочтительно через первичную аминогруппу(ы) лизина(ов).

Предпочтительно средняя молекулярная масса полиэтиленгликолевых групп(ы) составляет по меньшей мере 20 кДа, более предпочтительно 20-100 кДа и особенно предпочтительно 20-80 кДа.

Группы(а) полиэтиленгликоля сопряжены с вариантом ИФР-Ι по первичным аминогруппам(е) лизина одной или нескольких аминокислот в положениях 37, 65, 68 (аминореактивное пэгилирование) и необязательно пэгилированы по Ν-концевой аминокислоте. Конъюгат предпочтительно моно- или дипэгилирован по остатку (остаткам) лизина по одной или нескольким аминокислотам в положении (положениях) 37, 65, 68 и необязательно пэгилирован по Ν-концевой аминокислоте. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат является монопэгилированным по К65, К68 или К37 или дипэгилированным по К65 и К68 и необязательно пэгилированным по Νконцевой аминокислоте. Предпочтительно не более 20% пэгилированного варианта ИФР-Ι дополнительно пэгилировано с Ν-конца.

Варианты ИФР-Ι обозначены следующим образом: К65 означает, что аминокислотой в положении 65 является лизин, К27 означает, что аминокислотой в положении 27 является аргинин и т.д. Вариант ИФР-Ι, несущий аминокислоты К27, К37, К65, К68, обозначается аббревиатурой КККК. Исходный вариант ИФР-Ι обозначается аббревиатурой КККК.

Особенно предпочтительными вариантами ИФР-Ι и вариантами в составе конъюгатов являются КККК, КККК, КККК, КККК.

Также предпочтительным является пэгилированный вариант ИФР-Ι, у которого согласно настоящему изобретению процессированно до трех аминокислот (предпочтительно все три) с Ν-конца. Соответствующий мутант природного типа, называемый Пек(1-3)-ИФР-[, лишен остатков аминокислот д1у, рго и д1и с Ν-конца (Кишшег А. и др. Ιηΐ. 1. Ехр. Э/аЬекйу Кек. 4, 2003, с. 45-57).

Полиэтиленгликолевые группы(а) являются линейными или разветвленными.

Настоящее изобретение также предусматривает способы приготовления конъюгата по настоящему изобретению с использованием в качестве промежуточных соединений ИФР-Ι. Способ заключается в приготовлении конъюгата, содержащего вариант ИФР-Ι и одну или две полиэтиленгликолевые группы, причем указанные ПЭГ группы(а), имеющие предпочтительно молекулярную массу по меньшей мере

- 3 011284 равную 20 кДа, более предпочтительно примерно 20-100 кДа и особенно предпочтительно 20-80 кДа, путем химической реакции промежуточного соединения ИФР-Ι с активированным полиэтиленгликолем в условиях, при которых указанный полиэтиленгликоль становится химически связанным с указанным промежуточным соединением ИФР-Ι по первичной аминогруппе(ам) варианта ИФР-Ι.

Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтические композиции, содержащие конъюгат согласно настоящему изобретению, предпочтительно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Настоящее изобретение также предусматривает способы получения фармацевтических композиций, содержащих конъюгат согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также предусматривает применение конъюгата согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения БА.

Настоящее изобретение также предусматривает способы лечения БА, отличающиеся тем, что фармацевтически эффективное количество аминореактивного пэгилированного варианта ИФР-Ι вводят в организм пациента, нуждающегося в таком лечении, предпочтительно один или два раза в неделю.

Подробное описание изобретения

Понятия «пэгилированный вариант ИФР-Ι» или «аминореактивное пэгилирование» в контексте настоящего изобретения означают, что вариант ИФР-Ι ковалентно связан с одной или двумя полиэтиленгликолевыми группами путем аминореактивного соединения с одним или двумя лизинами в молекуле варианта ИФР-Ι. Группы(а) ПЭГ присоединены по сайтам молекулы варианта ИФР-Ι, являющимися первичными ε-аминогруппами боковых цепей лизина. Возможно также дополнительное наличие пэгилирования по Ν-концевой α-аминогруппе. Из-за применяемого способа синтеза и используемого варианта пэгилированный вариант ИФР-Ι может состоять из смеси вариантов ИФР-Ι, пэгилированных по аминокислотам К65, К68 и/или К37, пэгилированных или не пэгилированных по Ν-концу, в соответствии с чем сайты пэгилирования могут быть разными у разных молекул или могут быть в основном однородными в зависимости от количества полиэтиленгликолевых боковых цепей, приходящихся на одну молекулу, и/или сайт пэгилирования в молекуле. Предпочтительно варианты ИФР-Ι являются моно- и/или дипэгилированными и специально очищенными от пэгилированных по Ν-концу вариантов ИФР-Ι.

Аминореактивное пэгилирование в контексте настоящего изобретения означает способ случайного присоединения цепей полиэтиленгликоля к первичным аминогруппам(е) лизина в варианте ИФР-Ι путем использования реактивного (активированного) полиэтиленгликоля, предпочтительно путем использования Ν-гидроксисукцинимидильного сложного эфира, предпочтительно метоксиполиэтиленгликоля. В результате реакции сочетания происходит присоединение полиэтиленгликоля к реактивным первичным ε-аминогруппам остатков лизина и необязательно к α-аминогруппе Ν-концевой аминокислоты ИФР-Ι. Такое сопряжение ПЭГ к белкам хорошо известно в данной области. Например, обзор таких методов приведен в работе Усгопс^с Р.М. Вюта1епак 22, 2001, с. 405-417. Согласно Усгопс^с сопряжение ПЭГ с первичными аминогруппами белков может быть выполнено путем использования активированных молекул ПЭГ, которые производят алкилирование указанных первичных аминогрупп. Для такой реакции могут применяться активированные алкилирующие полиэтиленгликоли, например, ПЭГ-альдегид, ПЭГ-тресилхлорид или ПЭГ-эпоксид. Пригодными реагентами также являются ацилированные полиэтиленгликоли, например, гидроксисукцинимидильные сложные эфиры карбоксилированных полиэтиленгликолей или полиэтиленгликоли, в которых концевая гидроксильная группа активирована хлорформиатами или карбонилимидазолом. Пригодными полиэтиленгликолевыми реагентами также являются полиэтиленгликоли с аминокислотными цепями. К таким реагентам могут относиться так называемые разветвленные полиэтиленгликоли, в соответствии с чем по меньшей мере две идентичные или различные молекулы ПЭГ связываются друг с другом пептидным спейсером (предпочтительно лизином) и, например, связываются с вариантом ИФР-Ι в качестве активированного карбоксилата лизинового спейсера. Моно-Ы-концевое сопряжение также описано КшкИег О. и др. в Α6ν. Эгид Эсйу. Рем 54, 2002, с. 477485.

В контексте настоящего изобретения понятие «ПЭГ или полиэтиленгликоль» означает водорастворимый полимер, который коммерчески доступен или может быть приготовлен способом полимеризации этиленгликоля с раскрытием цикла, хорошо известным в данной области (Кобега Υ. и др. Ргодгекк ίη Ро1утег 8с1епсе 23, 1998, с. 1233-1271, Егапск С.Е. и др. Ιηΐ. 1. НетаЮ1. 68, 1998, с. 1-18). Термин «ПЭГ» широко используется и распространяется на любую молекулу полиэтиленгликоля, в которой число звеньев этиленгликоля составляет по меньшей мере 460, предпочтительно 460-2300, особенно предпочтительно 460-1840 (молекулярная масса 230 звеньев ПЭГ примерно равна 10 кДа). Максимальное число звеньев ПЭГ ограничено только растворимостью конъюгата. Обычно не используются полиэтиленгликоли, содержащие более 2300 звеньев. Предпочтительно ПЭГ, применяемый в настоящем изобретении, заканчивается по одному концу гидрокси- или метоксигруппой (метоксиПЭГ, мПЭГ), а с другого конца ковалентно присоединен к линкерной части молекулы оксиэфирной связью. Полимер является прямым или разветвленным. Разветвленные полиэтиленгликоли, например, описаны Уегопеке Е.М. и др. в 1оита1 о£ ВюасЩ'е апб СотраНЫе Ро1утег§ 12, 1997, с. 196-207. Пригодными в качестве регентов, например,

- 4 011284 являются полиэтиленгликоли фирмы Ыек1аг Тйегареийск (\\л\л\'.пск1аг.сот).

Могут применяться ПЭГ разной молекулярной массы, например примерно 20-100 кДа (п=460-2300). Число повторяющихся звеньев η в ПЭГ приближено к молекулярной массе, выраженной в дальтонах. Например, если две молекулы ПЭГ присоединены к линкеру, причем обе молекулы ПЭГ имеют одинаковую молекулярную массу 10 кДа (у каждой молекулы η примерно равно 230), суммарная молекулярная масса на одном линкере примерно равна 20 кДа. Молекулярная масса молекул ПЭГ, присоединенных к линкеру, может быть разной, например из двух молекул на одном линкере одна молекула может иметь молекулярную массу 5 кДа, а другая молекула ПЭГ может иметь молекулярную массу 15 кДа. Молекулярная масса всегда отражает среднюю молекулярную массу.

В приведенных ниже примерах описаны некоторые предпочтительные реагенты для получения аминореактивных пэгилированных вариантов ИФР-Ι. Очевидно, что модификации, основанные на методах, описанных Уегопеке Р.М. в Вюта!епа18 22, 2001, с. 405-417, могут проводиться в той степени, в которой они позволяют получать конъюгаты согласно настоящему изобретению.

Наличие до трех потенциально реактивных первичных аминогрупп в целевом белке (до двух лизинов и одной концевой аминокислоты) приводит к сериям изомеров пэгилированных вариантов ИФР-Ι, которые отличаются в точке присоединения цепи полиэтиленгликоля.

Настоящее изобретение предусматривает пэгилированные формы варианта ИФР-Ι с улучшенными свойствами. Такие конъюгаты пэгилированного варианта ИФР-Ι содержат одну или две случайным образом присоединенные линейные или разветвленные группы ПЭГ, поэтому средняя молекулярная масса всех групп ПЭГ в конъюгате предпочтительно составляет примерно 20-80 кДа. Специалистам в данной области очевидно, что возможны незначительные отклонения от этого диапазона молекулярной массы до тех пор, пока пэгилированный вариант ИФР-Ι проявляет активность по снижению уровней амилоидных β-пептидов (Άβ) в мозге. Кроме того, пэгилирование варианта ИФР-Ι с ПЭГ, чья молекулярная масса превышает 80 кДа, приводит к повышению биодоступности. Однако предполагается, что такая активность снижается по мере увеличения молекулярной массы из-за пониженной активации рецептора ИФР-Ι и ухудшенного транспорта через гематоэнцефалический барьер. Таким образом, диапазон 20-100 кДа для молекулярной массы ПЭГ расценивается оптимальным для конъюгата ПЭГ и варианта ИФР-Ι, пригодных для эффективного лечения пациентов с БА.

В контексте настоящего изобретения понятие «молекулярная масса» означает среднюю молекулярную массу ПЭГ.

Приводимые ниже пэгилированные формы вариантов ИФР-Ι являются примерами, соответствующими конъюгатам настоящего изобретения:

монопэгилированный вариант ИФР-Ι, в котором молекулярная масса группы ПЭГ составляет 20-80 кДа (460-1840 звеньев ПЭГ);

дипэгилированный вариант ИФР-Ι, в котором молекулярная масса каждой группы ПЭГ составляет примерно 10-50 кДа (230-1150 звеньев ПЭГ) и их смеси.

Особенно предпочтительным является монопэгилированный ИФР-Ι, выбранный из группы, включающей КККК, КККК, КККК и КККК, в котором разветвленная группа ПЭГ имеет молекулярную массу 30-45, предпочтительно 40-45 кДа (примерно 920 звеньев). Например, при средней молекулярной массе ПЭГ 44 кДа и молекулярной массе ИФР-Ι 7,6 кДа суммарная средняя молекулярная масса такого монопэгилированного ИФР-Ι составляет примерно 51,6 кДа. Предпочтительным также является монопэгилированный ИФР-Ι, выбранный из группы, включающей КККК, РИКК КККК и КККК в котором средняя молекулярная масса ПЭГ составляет 30 или 40 кДа.

Понятие «ПЭГ или группа ПЭГ» согласно настоящему изобретению означает остаток, чьей значительной частью является полиэтиленгликоль. Такой ПЭГ может содержать дополнительные химические группы, которые необходимы для реакций связывания, образуются в результате химического синтеза молекулы или являются спейсером для оптимального расстояния между разными частями молекулы. Кроме того, ПЭГ может содержать одну или несколько боковых цепей ПЭГ, связанных вместе. Группы ПЭГ, содержащие более одной цепи ПЭГ, являются разветвленными полиэтиленгликолями. Разветвленные ПЭГ могут быть получены, например, добавлением полиэтиленоксида к различным полиолам, включая глицерин, пентаэритрит и сорбит. Например, ПЭГ с четырьмя разветвлениями может быть получен из пентаэритрита и этиленоксида. Разветвленные полиэтиленгликоли обычно имеют 2-8 цепей, они описаны, например, в ЕР-А-0473084 и в патенте И8 5932462. Особенно предпочтительными являются полиэтиленгликоли с двумя боковыми ПЭГ-цепями (ПЭГ2), связанными по первичным аминогруппам лизина (МопГагбйи С. и др. Вюсои)ида!е Сйет. 6, 1995, с. 62-69).

Понятие «в значительной степени гомогенные» в контексте настоящего изобретения означает, что получены молекулы только одного пэгилированного варианта ИФР-Ι, содержащие только одну или две присоединенные группы ПЭГ. Препарат может содержать небольшое количество нереакционноспособного (т.е. утратившего группу ПЭГ) белка. С помощью пептидного картирования и Ν-концевого секвенирования в одном из приводимых ниже примеров предусмотрен способ получения препарата, состоящего по меньшей мере на 90% из конъюгата варианта ПЭГ -ИФР-Ι и не более чем 5% непрореагировав

- 5 011284 шего белка. Выделение и очистка таких гомогенных препаратов изолированного варианта ИФР-Ι может быть проведена обычными способами очистки, предпочтительно эксклюзионной хроматографией.

Понятие «монопэгилированный» в контексте настоящего изобретения означает, что вариант ИФР-Ι пэгилирован только по одному лизину в молекуле варианта ИФР-Ι, т.е. только одна группа ПЭГ ковалентно присоединена к этому сайту. Такой монопэгилированный ИФР-Ι может быть дополнительно пэгилирован по Ν-концу до определенной длины. Чистый вариант монопэгилированного ИФР-Ι (без Ν-концевого пэгилирования) составляет по меньшей мере 80% препарата, предпочтительно 90% и наиболее предпочтительно монопэгилированный вариант ИФР-Ι составляет 92% в препарате или более, остальной состав препарата представлен нереакционноспособным (непэгилированным) ИФР-Ι и/или Ν-концевым пэгилированным вариантом ИФР-Ι. Таким образом, препараты монопэгилированного варианта ИФР-Ι согласно настоящему изобретению являются достаточно гомогенными и в качестве гомогенного препарата обладают преимуществом, например, для фармацевтического применения. Таким же качеством обладают дипэгилированные препараты.

«Активированные полиэтиленгликоли или активированные полиэтиленгликолевые реагенты» хорошо известны в данной области. Предпочтительно используются электрофильно активированные полиэтиленгликоли, например алкоксимасляной кислоты сукцинимидные эфиры полиэтиленгликоля («низшие алкокси-ПЭГ-СМК»), или алкоксипропионовой кислоты сукцинимидные эфиры полиэтиленгликоля («низшие алкокси-ПЭГ-СПК»), или Ν-гидроксисукцинимидактивированные полиэтиленгликоли. Может быть применен любой способ осуществления взаимодействия активированного сложного эфира с амином для образования амида. В реакции активированного ПЭГ с ИФР-Ι приводимый сукцинимидильный сложный эфир является отщепляемой группой, вызывающей образование амида. Применение сукцинимидных сложных эфиров для получения конъюгатов с белками описано в патенте И8 5672662.

Условия проведения реакции влияют на соотношение различных пэгилированных вариантов ИФР-Ι. Изменяя условия проведения реакции (например, соотношение реагентов, рН, температуру, длительность реакции и т.д.), можно варьировать соотношение различных пэгилированных вариантов ИФР-Ι. Предпочтительно реакцию проводят в буферном водном растворе с рН 8-10, содержащем 5-15 об.% этанола и 0,5-4 об.% этиленгликоля. Соотношение белок:ПЭГ предпочтительно составляет от 1:0,5 до 1:2, если получают монопэгилированные варианты, и от 1:2 до 1:5, если получают дипэгилированные варианты. Температуру и время реакции можно варьировать по решению специалиста, причем высокая температура и увеличенная длительность реакции приводят к усилению пэгилирования. Если получают монопэгилированные варианты, предпочтительнее проводить реакцию при 4°С на протяжении до 30 мин. Если пэгилированный реагент объединяют с вариантом ИФР-Ι в реакционном буфере, предпочтительно содержащем 50 ммоль бората натрия, 10% этанола и 1% диэтиленгликоля (ДЭГ), при величине рН примерно 9,0, соотношение белок:ПЭГ составляет примерно 1:1,5, температура при проведении реакции 4°С, получают смесь моно-, ди- и следовые количества трипэгилированных молекул. Если соотношение белок:ПЭГ составляет примерно 1:3, получают преимущественно ди- и олигопэгилированные молекулы.

Конъюгаты варианта ИФР-Ι согласно настоящему изобретению могут быть получены ковалентным взаимодействием первичной аминогруппы лизина варианта ИФР-Ι с бифункциональным реагентом для получения промежуточного соединения с амидной связью, а также ковалентным взаимодействием промежуточного соединения, содержащего амидную связь, с активированным производным полиэтиленгликоля для получения конъюгата варианта ИФР-Ι. В последующем процессе бифункциональным реагентом предпочтительно является №сукцинимидил-8-ацетилтиопропионат или Ν-сукцинимидил-Зацетилтиоацетат, а активированное производное полиэтиленгликоля предпочтительно выбрано из группы, включающей йод-ацетилметокси-ПЭГ, метокси-ПЭГ-винилсульфон и метокси-ПЭГ-имид малеиновой кислоты.

Особенно предпочтительным является применение Ν-гидроксисукцинимидилактивированного разветвленного сложного эфира ПЭГ (тПЭГ2-ИГС) с молекулярной массой 40 кДа (МопГатб1ш С. и др. Βίοсонщда!е Сйет. 6, 1995, с. 62-69, Уетопеке Г.М. и др. 1. Вюасбуе СотрабЫе Ро1утет§ 12, 1997, с. 197-207, патент И8 5932462).

Конъюгаты варианта ИФР-Ι могут быть получены аминореактивным ковалентным связыванием тиоловых групп с вариантом ИФР-Ι («активация») и взаимодействием получаемого активированного варианта ИФР-Ι с производным полиэтиленгликоля (ПЭГ). Первая стадия заключается в ковалентном связывании тиоловых групп с ПН₂-группами лизина варианта ИФР-Ι. Активация варианта ИФР-Ι проводится бифункциональными реагентами, несущими защищенную тиоловую группу и дополнительную реактивную группу, например активными сложными эфирами (например, сложный эфир сукцинимидила), ангидридами, сложными эфирами сульфоновых кислот, галогенидами карбоновых кислот и сульфоновых кислот соответственно. Тиоловая группа защищена группами, известными в данной области, например, ацетильными группами. Бифункциональные реагенты способны реагировать с ε-аминогруппами аминокислот с образованием амидной связи. Получение бифункциональных реагентов известно в данной области. Предшественники бифункциональных Ν-гидроксисукцинильных сложных эфиров описаны в ΌΕ 3924705, а получение ацетилтиопроизводного соединения описано Матсй 1. Абуапсеб Отдашс Сйет

- 6 011284

181гу, 1977, с. 375-376. Бифункциональный реагент 8АТА коммерчески доступен (фирма Мо1еси1аг РгоЬек, Еидеие, Орегон, США и фирма Р1егсе, Рокфорд, Иллинойс) и описан в Эипсап К.1. Апа1. Вюсйет. 132, 1983, с. 68-73.

Реакцию проводят, например, в водном буферном растворе, рН 6,5-8,0, например в 10 мМ фосфате калия, 300 мМ №1С1. рН 7,3. Бифункциональный реагент может добавляться в ДМСО. После завершения реакции, предпочтительно через 30 мин, реакцию прекращают добавлением лизина. Избыток бифункционального реагента может быть отделен способами, известными в данной области, например диализом или колоночной фильтрацией. Среднее число тиоловых групп, добавленных к варианту ИФР-Ι, может быть определено фотометрическими методами, описанными, например, СтакеШ Э.К. и Мштау ЕЕ. АгсЬ. Вюсйет. Вюрйук. 119, 1967, с. 41-49. Указанная выше реакция сопровождается ковалентным связыванием активированного производного полиэтиленгликоля.

Активированные производные ПЭГ известны в данной области и описаны, например, Мотритдо М. и др. 1. Вюсонщда1е СЬет. 7, 1996, с. 363-368, для ПЭГ-винилсульфона. Полиэтиленгликоли с линейной и разветвленной цепью пригодны для получения соединений формулы Ι. Примерами реагентов реактивных ПЭГ являются йод-ацетилметокси-ПЭГ и метокси-ПЭГ-винилсульфон. Использование этих йодактивированных веществ известно в данной области и описано, например, Негтапкоп С.Т. Вюсонщда1е Тесйшдиек, Асабетю Ргекк, 8ап □(едо, 1996, с. 147-148.

Дальнейшая очистка соединений согласно настоящему изобретению включает разделение монои/или дипэгилированных вариантов ИФР-Ι, предпочтительно от Ν-концевых пэгилированных форм, и может быть осуществлена способами, известными в данной области, например колоночной хроматографией, предпочтительно ионообменной хроматографией, особенно катионообменной хроматографией.

Процентное содержание монопэгилированных конъюгатов, а также соотношение моно- и дипэгилированных вариантов может контролироваться более широким объединением фракций вокруг пика элюции для понижения процентного содержания монопэгилированных конъюгатов или более узким сбором фракций для повышения процентного содержания монопэгилированных конъюгатов в композиции. Примерно 90% монопэгилированных конъюгатов составляет хороший баланс выхода и активности. Могут быть желательными некоторые композиции, в которых, например, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% конъюгатов являются монопэгилированными формами. В варианте осуществления настоящего изобретения процентное содержание монопэгилированных конъюгатов составляет 90-98%.

В настоящем изобретении понятие «полярная аминокислота» относится к аминокислоте, выбранной из группы, включающей цистеин (С), аспарагиновую кислоту (ϋ), глутаминовую кислоту (Е), гистидин (Н), аспарагин (Ν), глутамин (О), аргинин (К), серин (8) и треонин (Т). Лизин также является полярной аминокислотой, однако он не входит в указанную группу, поскольку замещается согласно настоящему изобретению. Предпочтительно в качестве полярной аминокислоты используется аргинин.

Фармацевтические составы

Пэгилированный ИФР-Ι согласно настоящему изобретению предусматривает улучшенную стабильность при циркуляции в организме, обеспечивающую устойчивый доступ к рецепторам ИФР-Ι по всему организму при низких интервалах применения.

Варианты пэгилированного 1СЕ-1 могут вводиться в организм в виде смеси или в качестве различных отдельных пэгилированных образцов, разделенных ионобменной хроматографией или эксклюзионной хроматографией. Соединения настоящего изобретения могут быть переработаны методами получения фармацевтических композиций, известными специалистам в данной области. Для получения таких композиций варианты пэгилированного 1СЕ-1 по настоящему изобретению объединяют в смесь с фармацевтически приемлемым носителем предпочтительно путем диализа против водного раствора, содержащего желаемые ингредиенты фармацевтических композиций. Такие приемлемые носители, например, описаны в кн.: «Кетшдоп'к Р11агтасеибса1 8с1епсек», 18-е изд. изд-во Маск РиЬНкЫпд Сотрапу, под ред. Ок1о и др., с. 1435-1712. Типичные композиции содержат эффективное количество вещества согласно настоящему изобретению, например примерно 0,1-100 мг/мл, вместе с приемлемым количеством носителя. Композиции могут быть введены парентерально. Пэгилированные 1СЕ-1 согласно настоящему изобретению вводят предпочтительно внутрибрюшинно, подкожно, внутривенно или интраназально. Фармацевтические составы согласно настоящему изобретению могут быть получены известными в данной области способами. Обычно растворы пэгилированного варианта ИФР-Ι диализируют против буфера, применяемого в фармацевтических композициях, и величину необходимой конечной концентрации белка доводят путем концентрирования или разведения.

Такие фармацевтические композиции могут применяться для введения инъекцией или инфузией предпочтительно внутрибрюшинно, подкожно, внутривенно или интраназально и содержать эффективное количество пэгилированного варианта ИФР-Ι вместе с фармацевтически приемлемыми растворителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие композиции включают растворители с различными буферными компонентами (например, аргинином, ацетатом, фосфатом), величиной рН и ионной силой, добавками, например разрыхлителями и солюбилизирующими агентами (например, продуктом Ттеееи™ 80/полисорбатом, продуктом Р1итошс™ Е68), антиоксидантами (например, аскорбиновой кислотой, метабисульфитом натрия), консервантами (продуктом

- 7 011284

Т1тег8о1™, бензиловым спиртом), наполнителями (например, сахарозой, маннитом), а также полимерными соединениями, например полимерами молочной кислоты, полигликолевой кислоты и др. для включения материалов в частицы или липосомы. Такие композиции могут влиять на состояние физической стабильности при высвобождении и клиренсе монопэгилированного ИФР-Ι согласно настоящему изобретению.

Дозировки и концентрации лекарственных средств.

Обычно при стандартном режиме лечения пациентов лечат дозами в диапазоне 0,001-3 мг, предпочтительно 0,01-3 мг пэгилированного варианта ИФР-1/кг/сутки на протяжении определенного периода, составляющего 1-30 суток или даже больше. Лекарственное средство применяют один раз в сутки в виде подкожной, внутривенной или внутрибрюшинной болюсной инъекции или инфузии фармацевтического состава, содержащего 0,1-100 мг пэгилированного ИФР-Ι в мл. Такое лечение может сочетаться с какимлибо стандартным (например, химиотерапевтическим) лечением, при этом применяют пэгилированный ИФР-Ι до, во время или после стандартного лечения. Это приводит к улучшенному результату по сравнению с применением только одного стандартного лечения.

Установлено, что для успешного лечения пэгилированный ИФР-Ι по настоящему изобретению может вводиться только один или два раза в неделю. В другом варианте осуществления настоящего изобретения описан способ лечения болезни Альцгеймера, заключающийся во введении пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества пэгилированного ИФР-Ι согласно настоящему изобретению в виде одной дозы, находящейся в диапазоне 0,001-3 мг, предпочтительно 0,01-3 мг варианта пэгилированного ИФР-Ι на 1 кг на протяжении 3-8 суток, предпочтительно 7 суток. В качестве пэгилированного ИФР-Ι предпочтительно используют монопэгилированный ИФР-Ι, предпочтительно в виде композиции варианта лизин-пэгилированного ИФР-Ι согласно настоящему изобретению и варианта ИФР-Ι, пэгилированного с Ν-конца в молярном соотношении по меньшей мере 1:1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют пэгилированный ИФР-Ι согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера, которое вводят пациенту, нуждающемуся в этом, в терапевтически эффективном количестве в виде одной или двух доз, находящихся в диапазоне 0,001-3 мг, предпочтительно 0,01-3 мг варианта пэгилированного ИФР-Ι на 1 кг на протяжении 6-8 суток, предпочтительно 7 суток. В качестве пэгилированного ИФР-Ι предпочтительно используют монопэгилированный ИФР-Ι, предпочтительно в виде композиции варианта лизин-пэгилированного ИФР-Ι по настоящему изобретению и варианта ИФР-Ι, пэгилированного с Ν-конца в молярном соотношении по меньшей мере 1:1.

Приводимые ниже примеры, ссылки и фигуры поясняют настоящее изобретение, но не ограничивают его области охвата, описанной в формуле изобретения. Очевидно, что в приводимых ниже методиках могут быть произведены изменения, которые также соответствуют сути настоящего изобретения.

Перечень последовательностей

8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1 аминокислотная последовательность ИФР-Ι человека (аминокислоты 1-70 ИФР-Ι, аминокислоты 71-105 пропептида согласно δ^ίδδΡτοΐ Р01343).

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Ионообменная хроматография-ВЭЖХ пэгилированного ИФР. Чистые изомеры положения отделяют от пэгилированной смеси, используя препаративную строго катионообменную колонку (фирма ΤΟ8ΟΗ-ΒΙΟ8ΕΡ, колонка 8Ρ-5Ρ\ν). Фракции пяти разных пиков (обозначенных 0-4) выделены и процессированы для дальнейшего анализа.

Фиг. 2. Анализ методом электрофореза в натрий додецилсульфат-полиакриламидном геле пиков монопэгилированных ИФР-Ι. Фракции пяти очищенных пиков (обозначенных 0-4) подвергают электрофорезу в 4-12% трис-глицин натрий додецилсульфат-полиакриламидном геле в условиях без восстановления (А) и при восстановлении (Б) и гели окрашивают красителем для белков кумасси голубым. Ммм - маркер молекулярной массы.

Фиг. 3. Пептидный анализ пиков 1, 2 и 3 монопэгилированного ИФР-Ι. Пики 1, 2 и 3 очищенного монопэгилированного ИФР-Ι разрушают с помощью Λφ-Ν и полученные пептидные фрагменты разделяют ВЭЖХ.

Пептидные последовательности пэгилированных фрагментов получают методом Ν-концевого разрушения пептидов по Эдману.

А - Методом ВЭЖХ получено 6 разных пептидных фрагментов рчИФР-Ι с временем задержки от 30 до 45 мин и седьмой крупный фрагмент (и минорный фрагмент 7') пэгилированных пиков с примерным временем задержки 70 мин. Стрелки показывают соответствующие крупные изменения в пептидных фрагментах различных пиков по сравнению с рчИФР-Ι.

Б - Пептидная последовательность 6 фрагментов, полученных в результате расщепления рчИФР-Ι с помощью Λφ-Ν. Лизины (К) выделены жирным шрифтом во фрагментах 3 и 4. Фрагмент 5 обозначает Ν-концевой пептид.

В - Пептидная последовательность пэгилированных пептидных фрагментов 7 после разрушения методом Эдмана. Остатки цистеина и пэгилированного лизина вызывают разрывы пептидной последовательности.

- 8 011284

Фиг. 4. Иерархическое кластерирование БА разных профилей глобальной экспрессии от ИФР-Ι и монопэгилированных изомеров. Время инкубирования ИРФ-Ι и пэгилированных вариантов составляло 24 ч; использовали мышей линии ΝΙΗ-3Τ3. Условия и результаты анализа описаны в тексте:

А - кластеры генов, регуляция которых ослабляется;

Б - кластеры генов, регуляция которых усиливается.

Фиг. 5. Фосфорилирование ИФР-ΙΚ с помощью рчИФР-Ι и монопэгилированного ИФР-Ι. Клетки линии ΝΙΗ-3Τ3, стабильно трансфецированные ИФР-ΙΚ. человека, в течение ночи выдерживают в среде без сыворотки и затем инкубируют с возрастающими дозами (0,01-10 мкг/мл) рчИФР-Ι или монопэгилированными ИФР-Ι изомерами (пики 1, 2, 3, смесь пиков, Ие5(1-3) пик 3) в течение 30 мин. Затем клетки обрабатывают для Вестерн-блоттинга или внутриклеточного анализа, описанных в методах. Кривые дозы-ответа с рчИФР-Ι (А), пиком 1 (Б), пиком 2 (В), пиком 3 (Г), смесью пиков (Д) и Ие§(1-3) пика 3 (Е) соответственно. Сигнал фосфорилирования нормализовали для уровней ИФР-ΙΚ в отдельных лунках. Представленные точки показывают средние значения ±8ЕМ по 6 измерениям для 3 независимых культур.

Фиг. 6. Количественный анализ фосфорилирования ИФР-ΙΚ в клетках линии ΝΙΗ-3Τ3. Кривые дозы-ответа, полученные в ходе экспериментов примера 7, были положены в основу кинетики связывания по одной точке для получения показателей специфического связывания (В_Мах), 50% от концентраций связывания (ЕС₅₀) и коэффициентов Хилла (η_Η). Представленные данные показывают средние значения ±8ЕМ по 6 измерениям для 3 независимых культур.

Фиг. 7. Снижение содержания Αβ ίη νίνο у мышей линии Р82АРР за счет применения рчИФР-Ι. Дважды трансгенных мышей линии Р82ААР в возрасте 2-3 месяцев (η=10) лечат в течение 2 ч рчИФР-Ι (50 мкг/кг, внутрибрюшинное введение). Получают экстракты коры головного мозга и оценивают уровни содержания АБП, С99, Αβ и контрольного белка (альбумина) согласно описанному в методах способу. Исходя из нормализованных по альбумину значений, подсчитывают соотношения С99/АБП, Ав/АБП и С.'99/Λβ. выражают в виде % от контроля без лечения и представляют средние значения ±8ЕМ:

А - представлены результаты Вестерн-блоттинга экстрактов коры головного мозга двухмесячных мышей. Выражено четкое снижение уровней содержания Ав, однако в результате лечения рчИФР-Ι уровни других соединений остаются неизменившимися;

Б - количественный анализ экстрактов коры головного мозга мышей линии Р82АРР (**р<0,01 по сравнению с контролем без лечения).

Фиг. 8. Динамика понижения ίη νίνο у мышей линии Р82АРР содержания Ав за счет применения рчИФР-Ι. Двухмесячных мышей лечат рчИФР-Ι (50 мкг/кг, внутрибрюшинное введение) 2, 6 или 24 ч. Затем определяют и высчитывают соотношения уровней Ав/АПБ и С99/АПБ описанным способом. Полученные данные выражают в виде % по отношению к контролю без лечения и представляют средним значением ±8ЕМ (η=10-13):

А - соотношения Ав/АПБ и

В - соотношения С99/Ав через 2, 6 и 24 ч после инъекции (**р<0,01 по сравнению с контролем без лечения).

Фиг. 9. Снижение содержания Ав ίη νίνο у мышей линий ААР и Р82АРР за счет применения пиков 1-3. Эксперименты проводят на смешанных популяциях однократно трансгенных (АРР) и дважды трансгенных (Р82АРР) мышей. Соотношения Ав/АПБ и С99/Ав для пиков 1, 2 и 3 представлены вместе для непосредственного сопоставления их воздействий на снижение содержания Ав и клиренс (η=8-10):

А - соотношения Ав/АПБ, показывающие воздействие пиков 1-3 на содержание в мозге Ав;

Б - соотношения С99/Ав, показывающие клиренс Ав из мозга (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 по сравнению с контролем без лечения).

Фиг. 10. Динамика понижения ίη νίνο у мышей ААР и Р82АРР содержания Ав за счет применения пика 3. Двухмесячных мышей в смешанных популяциях, включающих АРР и Р82АРР мышей, лечат введением пика 3 (50 мкг/кг, внутрибрюшинное введение) 2, 6, 24, 48 или 72 ч. Затем определяют уровни содержания АПБ, С99, Ав и актина и подсчитывают их соотношения описанным способом. Полученные данные выражают в виде % по отношению к контролю без лечения и представляют средним значением ±8ЕМ (η=10-15):

А - соотношения Ав/АПБ и

В - соотношения С99/АР через 6, 24 и 48 ч после инъекции (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 по сравнению с контролем без лечения).

Фиг. 11. Понижения содержания Ав ίη νίνο у мышей линии Р82АРР за счет применения пиков пэгилированных ИФР 1-3. Соотношения Ав/АПБ для пиков 1, 2 и 3 представлены вместе для непосредственного сопоставления их воздействий на понижение содержания Ав и клиренс (η=3-13; *р<0,05 по сравнению с контролем без лечения).

Фиг. 12. Динамика понижения ίη νίνο у мышей линии Р82АРР содержания Ав за счет применения пика 3. Двухмесячных мышей линии Р82АРР лечат в течение 2, 6, 24, 48 или 72 ч после однократной

- 9 011284 внутрибрюшинной инъекцией пика 3 (50 мкг/кг). Затем определяют соотношения Αβ/АБП согласно описанному способу. Полученные данные выражают в виде % по отношению к контролю без лечения и представляют средним значением ±8ЕМ (п=4-13; *р<0,05; **р<0,01 по отношению к контрольным животным, не подвергавшимся лечению).

Примеры

Материалы и методы.

Рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста человека (рчИФР-Ι) приобретают в фирме РертоТеей (Воску НШ, Нью-Джерси, США) через фирму Се11 Сопсер1к (иткпсй, Германия), а Эек(1-3)-ИФР-[ приобретают в фирме СтоРер (Аделаида, Австралия). Полиэтиленгликолевый реагент может быть приобретен в фирме №к1ат Ь1й. (Сан-Карлос, Калифорния, США). Все другие химикаты и растворители выбирают самой высокой степени чистоты из доступных химикатов и реактивов. Варианты ИФР-Ι могут быть получены рекомбинацией с помощью методов, известных в данной области, например, с помощью сайт-специфичного мутагенеза в сочетании со способами экспрессии, предпочтительно в Е.со11, например, согласно описанным методам в патентах И8 6509443 или И8 6403764.

Пэгилирование ИФР-Ι.

Получают изомеры ИФР-Ι, пэгилированные по одному сайту (монопэгилированные ИФР-Ι). Монопэгилированный ИФР-Ι получают сопряжением ε-аминогрупп лизина, расположенных по длине молекулы или по Ν-концу молекулы ИФР-Ι с активированной разветвленной частью ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа. Реакционная смесь для пэгилирования содержит реагенты рчИФР-Ι и ПЭГ-NГС с молекулярной массой 40 кДа в молярном соотношении 1:1,5 в буфере 50 мМ бората натрия (10% этанола и 1% ДЭГ), рН 9,0. Реакцию проводят в течение 30 мин при 4°С. Основываясь на том, что у применяемой части молекулы ПЭГ средняя молекулярная масса составляет 44 кДа, а у ИФР-Ι молекулярная масса составляет 7,6 кДа, следует ожидать, что молекулярная масса монопэгилированного ИФР-Ι примерно будет составлять 51,6 кДа.

Разделение позиционированных ПЭГ -ИФР-Ι изомеров ионообменной хроматографией.

Применяют схему очистки с помощью препаративной строго катионобменной колонки (фирма ΤΟ8ΟΗ-ΒΙΟ8ΕΡ, колонка 8Ρ-5Ρν, внутренний диаметр 30 мм, длина 75 мм) для получения изоформ чистых монопэгилированных ИФР-Ι. У буферной системы, включающей два буфера, доводят величину рН у буфера, состоящего из 7,5 ммоль ацетата натрия, 10% этанола и 1% диэтиленгликоля (буфера А), до 4,5, а у буфера, состоящего из 20 ммоль фосфата калия, 10% этанола и 1% диэтиленгликоля, доводят величину рН до 6,5 (буфер Б).

Колонку предварительно уравновешивают 25% буфера Б. После загрузки пэгилированных образцов ИФР-Ι колонку промывают 35% буфера Б, затем восходящим линейным градиентом до концентрации 65% буфера Б для разделения изомеров. Для элюции непэгилированных ИФР-Ι систему изменяют, используя модифицированный буфер Б с величиной рН 8,0. Скорость тока составляет 8 мл/мин, определение проводят при 218 нм. Получаемые образцы белка собирают вручную и аликвоты хранят при -20°С для анализа разнообразия белков химическими и биологическими методами исследования (см. ниже).

Используют аналитическую строго катионобменную колонку (фирма ΤΟ8ΟΗ-ΒΙΟ8ΕΡ, колонна 8Ρ-ΝΡΒ, размер частиц 2,5 мкм, диаметр 4,6 мм, длина 3,5 см) для изучения чистоты разделенных позиционированных изомеров. Для этой аналитической колонки применяют те же мобильные фазы, что и для препаративной колонки, но с уменьшенной скоростью тока и боле кратким временем пробега. Концентрацию монопэгилированных изомеров ИФР-Ι определяют с помощью спектрофотометрии по адсорбции при 280 нм (Е^1тд/т1 ₂₈₀=0,584) белковой части монопэгилированных ИФР-Ι.

Анализ чистоты монопэгилированных ИФР-Ι.

Отдельные изомеры монопэгилированных ИФР-Ι анализируют с помощью 4-12% трис-глицин додецилсульфат натрия-электрофореза в полиакриламидном геле или в условиях восстановления или при условиях не восстановления. Белки фиксируют и окрашивают красителем 81тр1е В1ие 8ауе81аш (фирма йуйгодеп, Базель, Швейцария).

Идентификация изомеров монопэгилированных ИФР-Ι методом масспектроскопии.

Очищенные изомеры монопэгилированных ИФР-Ι расщепляют ферментом Акр-Ν для идентификации четырех возможных сайтов пэгилирования по Ν-концу, К27, К65 или К68. Буфер для расщепления включает 100 ммоль трис/НС1 рН 8,0 с 0,04 мкг/мкл Акр-Ν (фирма Воске Э|адпок11ск СтЬН, Делавэр). 20 мкг монопэгилированного ИФР инкубируют в буфере для расщепления в течение 16 ч при 37°С с 1 мкг Акр-Ν. После 16 ч реакционную смесь разводят добавлением трихлорэтилфосфата (10 ммоль) на 1,5 ч при 37°С. Затем реакционный раствор блокируют внесением 1/20 объема 10% ТЕА для прекращения реакции расщепления. Полученную пептидную смесь также либо непосредственно анализируют методом ВЭЖХ-ионообменной хроматографии-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-ИОХ-МС) в оперативном режиме, ВЭЖХ, либо хранят при -80°С.

Для проведения анализа методом ионообменной хроматографии-жидкостной хроматографии-массспектрометрии (ИОХ-ЖХ-МС) пептидную смесь разделяют в системе АД1еп1 1100 ВЭЖХ, оснащенной колонкой Ρкеηотеηеx 1ирйет С18 с обратной фазой (1x250 мм, 5 мкм, 300 А) со скоростью тока

- 10 011284 мкл/мин. УФ-сигнал записывают также при длине волны 220 нм. А О-ТоЕ II или ЬСТ массспектрометр (фирма М1етота55) непосредственно объединяют с системой ВЭЖХ. Спектры ИОХ-ТоЕ записывают со скоростью 1 сканирование/с в диапазоне массы 200-2000 т/ζ. Оценивают УФ и Т1С спектры и каждый пептид определяют в виде отдельного пика на хроматограмме.

Для анализа методом ВЭЖХ смесь пептидов разделяют в системе АдПеп! 1100 ВЭЖХ, оснащенной колонкой РЫепотепех 1ирйет С18 с обратной фазой (1x250 мм, 5 мкм, 300 А) со скоростью тока 40 мкл/мин. УФ-сигнал записывают при 220 нм. Время задержки пептидов ПЭГ сдвинуто в ответ на повышенные концентрации ацетонитрила, отбор соединений проводят вручную и подвергают Ν-концевому расщеплению по Эдману.

Условия проведения ВЭЖХ (растворитель А: 0,1% ТЕА в воде, растворитель Б: 0,1% ТЕА в ацетонитриле) показаны в табл. 1.

Таблица 1

Градиент

Ν-концевое расщепление аминокислотной последовательности по Эдману проводят в системе АррПеб Вю8у81ет8 Ртос18е 492 с программным обеспечением точной системы контроля согласно инструкциям производителя. Фракции объемом 20 мкл, собранные с помощью ВЭЖХ, сразу переносят на ВюВтепе Р1и8™ стандартные микро-ТЕА-фильтры. Фильтры высушивают в атмосфере аргона и помещают в секвинатор белка. Применяют автоматизированную стандартную программу для проведения последовательного разрушения полипептида. Анализ хроматограмм ВЭЖХ для каждого цикла расщепления с применением АррПеб Вю8у81ет8 и программного обеспечения 610А показывает положение каждой аминокислоты. Цистеины, а также модифицированные аминокислоты, например пэгилированный лизин, проявляются в качестве пробелов на хроматограмме.

Транскрипционный анализ олигонуклеотидной последовательности.

Для анализа транскрипционального профиля различных монопэгилированных ИФР-Ι изомеров клетки линии ΝΙΗ-ЗТЗ, стабильно трансфецированные геном ИФР-ΙΡ. в течение 2 ч выдерживают в среде без сыворотки и затем инкубируют на протяжении 24 ч без сыворотки с 0,1 или 1 мкг/мл рчИФР и 1 мкг/мл соответствующих монопэгилированных ИФР-Ι изомеров или смеси всех изомеров, полученной без разделения. Затем культивировавшиеся клетки собирают и суммарную клеточную РНК экстрагируют РНК-ВееТМ. Из каждого образца 10 мкг РНК подвергают обратной транскрипции, наносят метку и процессируют с применением коммерческих наборов и руководствуясь инструкциями производителя (фирма 1пуйтодеп, Базель, Швейцария, фирма АтЫоп, Хантингдон, Великобритания). Способы фрагментации нагревом в щелочной среде и условия гибридизации для МОЕ 430А СепеСЫр последовательностей являются стандартными методами, предоставленными производителем (фирма АЛутейтх, США).

Флюоресценцию последовательностей (плотность клеток) записывают с помощью конфокального лазерного сканера и полученные данные анализируют с применением программного обеспечения МА8 5,0 (фирма А£1уте1пх, США). Уровень экспрессии каждого гена подсчитывают в качестве стандартизированного среднего отклонения интенсивности флюоресценции при сравнении с гибридизацией с ошибочно спаренными олигонуклеотидами и выражают в качестве среднего отклонения (СО). Каждый опыт проводят в трех повторах для учета биологических вариаций.

Следующие два критерия были выбраны для отбора генов с отличающейся экспрессией:

ί) значения уровней содержания иРНК в обработанных клетках должны быть по меньшей мере в пять раз выше или в пять раз ниже по сравнению с необработанными клетками;

ίί) стандартное отклонение должно быть значительно меньше абсолютного изменения среднего отличия, а подсчитанный доверительный уровень гена выше 97% (р<0,03).

Исследование фосфорилирования ИФР-ΙΚ

Для этих исследований используют клетки линии ΝΙΗ-ЗТЗ, трансфецированные геном человека ИФР-ΙΚ, после проведения 2-4 пассажей. Клетки культивируют в 24- или 96-луночных планшетах до 70% слияния клеток. Затем клетки в течение ночи выдерживают в среде без сыворотки и затем инкубируют с рчИФР-Ι или с соответствующими пиками (или смесью пиков) пэгилированных ИФР-Ι в течение 30 мин. Затем клетки либо лизируют в буфере Лэммли для Вестерн-блоттинга, либо фиксируют 4% параформальдегидом в течение 30 мин для внутриклеточного анализа фосфорилирования ИФР-ΙΡ. Для

- 11 011284

Вестерн-блоттинга экстракты белков разделяют с помощью 10% бис-трис электрофореза в натрий додецилсульфат-полиакриламидном геле и осаждают на нитроцеллюлозных мембранах. Пятна инкубируют совместно с мышиным антителом к фосфотирозину (4С10, 1:1000, фирма ирк1а1е) и кроличьим антителом к ИФР-ΙΚ (С-20, 1:1000, фирма 8аи1а Сгих) первичными антителами и метят мышиным антителом А1еха680 (1:10000, фирма Мо1еси1аг РгоЬек) и вторичными мышиными антителами 1КЭуе800 (1:10000, фирма .касккоп). Для внутриклеточного анализа фиксированные клетки блокируют и насыщают 2% козьей сывороткой и тритоном Х-100 (0,1%) и инкубируют с теми же первичными и вторичными антителами. Полосы белка идентифицируют по флуоресценции с помощью системы Обуккеу ипащпд кук1ет (фирма Ысог Вюкаепсек). У цифровых изображений подсчитывают интенсивность пикселей полос белка и анализируют кривые дозы-ответа с применением программного обеспечения ОгарйРаб Рпкт. Уровни фосфотирозина стандартизируют значениями ИФР-ΙΚ, полученными из тех же областей интереса для получения значений реальных изменений активирования ИФР-ΙΚ. Эксперименты дублируют и повторяют трижды для получения 6 независимых исследований каждой дозы. Результаты выражают средним значением ±8ЕМ.

Эксперименты ίη у1уо с рчИФР-Ι и пэгилированными ИФР-Ι изомерами.

Используют модельных мышей для изучения болезни Альцгеймера, являющихся однократно трансгенными (линия ААР) или дважды трансгенными (линия Р82ААР) (Шсйагбк Ю. и др. ί. Хеигокск 23, 2003, с. 8989-9003), для изучения воздействия рчИФР-Ι (и монопэгилированного ИФР-Ι) на амилоидоз мозга, ранее установленного на других модельных мышах и крысах (Сагго Е. и др. №11. Меб. 8, 2002, с. 1390-1397). Установлено, что у модельных мышей линии Р82АРР развивается амилоидоз с фиксируемыми уровнями Ав в возрасте 2 месяцев, а начало отложения бляшек происходит в возрасте 8 месяцев (Кюйагбк Ю. и др. ί. Хеигокск 23, 2003, с. 8989-9003). Однократно трансгенные мыши линии ААР обладают весьма схожими уровнями Ав в таком раннем возрасте и, следовательно, были включены в испытуемые группы животных. Анализируют возраст, предшествующий возрасту формирования бляшек (2-3 месяца) для исследования воздействия рчИФР-Ι и пэгилированных ИФР-Ι изомеров на уровни растворимого Ав в мозге. Все эксперименты проводят в соответствии со шведскими правилами защиты животных, сводя к минимуму страдания животных. Из исходных растворов в 1 мМ НС1 (рчИФР-Ι) или ФСБ с 10% глицерина (монопэгилированные ИФР-Ι изомеры) приготовляют инъекционные растворы в 0,9% Мао с содержанием растворителя менее 1%. Контроли вводят инъекцией с 0,9% ЫаС1. Инъекции проводят внутрибрюшинно при слабой анестезии изофлюраном. В разное время после инъекции (2, 6, 24, 48 или 72 ч) животных, находящихся под анестезией изофлюраном, умерщвляют. Мышей обезглавливают и удаляют мозг для отделения конечного мозга (коры, включая гиппокамп). Экстракты белков коры мозга приготовляют в изотоническом литическом буфере, содержащем 4 ммоль триса, рН 7,4 и 320 ммоль сахарозы (оба реактива фирмы Е1ика) с протеазным и фосфатазным ингибирующими коктейлями (оба реактива фирмы 81§та). Буфером для образца является буфер Лэммли, содержащий 8 М мочевины (фирма Е1ика). Белки разделяют с помощью 4-12% бис-трис электрофореза в натрий додецилсульфатполиакриламидном геле и осаждают на нитроцеллюлозных мембранах. Пятна инкубируют совместно с мышиным антителом к амилоидному белку-предшественнику (АПБ) (клон АО-2, 1:5000, фирма Т1е Сепебск Сотрапу), обнаруживая первичные антитела к АПБ, С99 фрагменту, Ав и мышиному антителу к козьему актину (С-11, 1:5000, фирма 8ап1а Сгих) и меченые мышиным антителом А1еха680 (1:10000, фирма Мо1еси1аг РгоЬек) и вторичными козьими антителами 1КЭуе800 (1:10000, фирма 1асккоп). Обнаружение по флуоресценции полос белка проводят с использованием системы визуализации Обуккеу (фирма Ьюог Вюкаепсек). У цифровых изображений подсчитывают интенсивность пикселей полос белка и анализируют с применением программного обеспечения ОгарйРаб Рпкт. Результаты выражают средним значением ±8ЕМ.

Все значения стандартизируют по актину (или альбумину в качестве контрольного белка) и высчитывают соотношения С99/АПБ, Ав/АПБ, С99/Ав. Соотношение С99/АПБ свидетельствует об активности в- и γ-секретаз, поскольку С99 является продуктом β-секретазы и субстратом для γ-секретазы; изменения в этом измерении может свидетельствовать о модулирующем воздействии на одну из этих секретаз независимо от дальнейшей судьбы Ав. При постоянных уровнях С99/АПБ после определенного лечения соотношение С99/Ав отражает клиренс Ав независимо от его образования, причем оно выше при повышенной скорости клиренса и ниже при пониженной скорости клиренса. Кроме того, Ав нормализуется для АПБ, поскольку его образование зависит от трансгенной экспрессии АПБ, которая варьирует у отдельных мышей. Подсчеты соотношений вычисляют для каждого конкретного животного. Все полученные данные выражают в виде процента от данных, полученных от животных контрольной группы, присутствовавших в каждом эксперименте, которых не подвергали лечению. Отдельные эксперименты с 2-5 животными на дозу/временной интервал повторяют 2-4 раза. Статистические отличия оцениваются по среднему значению ±8ЕМ непарными ΐ тестами с р<0,05 как статистически достоверные.

- 12 011284

Пример 1. Хроматографическое разделение монопэгилированных ИФР-Ι позиционированных изомеров.

ИФР-1 содержит 4 аминогруппы, которые являются точками возможного пэгилирования, поэтому можно ожидать возникновение 4 монопэгилированных ИФР-Ι (моно-ПЭГ-ИФР-Ι) изомера. Другие возможные производные могут быть олигопэгилированными в зависимости от условий реакции. Применяют метод строго катионобменной жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) для разделения пэгилированных ИФР-Ι или пэгилированных Пек(1-3)-ИФР-1 изомеров, основываясь на отличиях их локальных зарядов. Профиль препаративной элюции 5 мг ПЭГ-ИФР-Ι показан на фиг. 1. Результат этого метода заключается в разделении на 5 больших пиков, 3 пика с основным разделением и 2 пика с частичным разделением. Снижение базисной адсорбции к концу хроматограммы означает, что больше нет дополнительных типов монопэгилированных ИФР-Ι, элюируемых при большем времени задержки. Дополнительный пик появляется между пиками 3 и 4, образуясь при переходе на модифицированный буфер Б с отличным рН. Аналитическую катионобменную ЖХВД применяют для установки чистоты отдельных изомеров и загрязнения другими позиционированными изомерами фракций катионобменной хроматографии. Все пики монопэгилированных соединений обладают чистотой >99%.

Пример 2. Анализ методом электрофореза в натрий додецилсульфат-полиакриламидном геле изомеров монопэгилированного ИФР-Ι.

Анализ методом электрофореза в натрий додецилсульфат-полиакриламидном геле осуществляют в условиях восстановления, а также в условиях без восстановления, для элюции различных нежелательных молекул ИФР-Ι, которые могли образоваться за счет перекрестных внутримолекулярных бисульфидных мостиков. Оба условия проведения реакции дают схожие результаты, показывая, что значительного количества нежелательного белка с перекрестными связями не образуется (фиг. 2). Анализ методом электрофореза в натрий додецилсульфат-полиакриламидном геле показывает, что молекулярная масса пика 0 очевидно >100 кДа, а крупные обнаруживаемые полосы являются пиками 1-3 с молекулярной массой ~70 кДа, пик 4 выявляется с молекулярной массой ~7 кДа - размер, ожидаемый для непэгилированного ИФР-Ι (фиг. 2). Из профиля пробега и времени задержки, полученных с помощью ВЭЖХ, следует, что пик 0 состоит, наиболее вероятно, из ди- и олигопэгилированных вариантов ИФР-Ι. И напротив, пики 1-3 соответствуют трем разным монопэгилированным изомерам ИФР-Ι. Наблюдается несоответствие между ожидаемой молекулярной массой монопэгилированного ИФР-Ι (51,6 кДа) и очевидной полученной массой ~70 кДа, однако наблюдаемое завышение молекулярной массы может быть объяснено большим гидродинамическим объемом ПЭГ из-за связывания воды, значительно снижающей электрофоретическую подвижность пэгилированного ИФР-Ι и повышающей определяемую молекулярную массу (Рокег 8. и др. Рйагтасодеиот1с 1. 3, 2003, с. 319). Из результатов ионообменной хроматографии (ИОХ)-жидкостной хроматографии высокого давления и электрофореза в натрий додецилсульфат-полиакриламидном геле следует, что чистоту фракций ИОХ можно считать достаточной для дальнейшего описания. Пэгилирование и разделение монопэгилированного-Оек(1-3)-ИФР-[ проводят аналогично пэгилированию и разделению рчИФР-Ι и в результате получают схожим образом 3 основных монопэгилированных-Эек(1-3)-ИФРΙ пика.

Пример 3. Анализ монопэгилированных изомеров ИФР- Ι.

Расщепление рчИФР-Ι с помощью Акр-Ν высвобождает 6 независимых пептидных фрагментов, которые разделяют с помощью ВЭЖХ со временем задержки 30-45 мин (фиг. 3А, верхняя панель). После расщепления очищенных пиков 1-3 (фиг. 3А, нижние панели) наблюдают различные распределения 6 фрагментов и присутствие дополнительного фрагмента (фрагмента 7), которые элюируют со временем задержки ~70 мин. У пика 1 количество специфического пептидного фрагмента 4 уменьшается с одновременным увеличением содержания фрагмента 7. У пика 2 наблюдают четкое снижение содержания фрагмента 3 и небольшое понижение фрагмента 5, а также появление крупного и минорного пэгилированных фрагментов (7 и 7'). Сходным образом анализ ВЭЖХ пика 3 показывает четкое понижение фрагментов 3 и 5 и одновременное появление фрагментов 7 и 7'. Фиг. 3Б показывает пептидные последовательности соответствующих фрагментов, которые получают расщеплением рчИФР-Ι с помощью Акр-Ν. Используя Ν-концевое расщепление пептидов по Эдману, анализируют пептидные последовательности крупных фрагментов 7, полученных от пэгилированных пиков 1, 2 и 3. Таким образом, цистеины и пэгилированные аминокислоты поставляют разрывы в пептидной последовательности. Используя такой методический прием, можно четко подтвердить, что пик 1 является рчИФР-Ι, пэгилированным по аминокислоте К27 (фиг. 3В). Для пика 2 показано, что крупный фрагмент 7 (>90%) является пэгилированным по аминокислоте К65, поскольку установлено разрушением по Эдману, что К68 представляет собой немодифицированный лизин (К). Напротив, фракция пика 3 поставляет пэгилированный по К68 вариант (интервал в последовательности) с аминокислотой К65, проявляющейся в качестве сигнала при хроматографировании ВЭЖХ после разрушения по Эдману (фиг. 3В). Минорный пик 7' не может быть секвенирован по Эдману, следовательно, Ν-конец недоступен для реакции, наиболее вероятно для пэгилирования. Общий анализ полученных данных показывает, что пик 1 состоит из К27 пэгилированного изомера, пик 2 является ИФР-Ι, пэгилированным по аминокислоте К65, а пик 3 пэгилирован по аминокислоте К68 и значительное количество ИФР-Ι пэгилировано с Ν-конца.

- 13 011284

Пример 4. Профиль транскрипции рчИФР-Ι и изомеров монопэгилированных ИФР-Ι.

Используя микропоследовательности ДНК, определяют ответную транскрипцию клеток линии ΝΙΗ-3Τ3, стабильно трансфецированных ИФР-ΙΕ человека, на протяжении 24 ч лечения рчИФР-Ι или пэгилированными ИФР-Ι изомерами. Для этого стимулируют клетки с помощью 0,1 и 1 мкг/мл ИФР-Ι, или 1 мкг/мл пиков монопэгилированных ИФР-Ι, или смеси пиков, полученных в результате реакции пэгилирования. Сравнивают общую транскрипционную активность стимулированных клеток с контрольными культурами, используя коммерческий фрагментный тип (продукт МОЕ 430А, фирма АГГушеМх Ιηο.). включающий примерно 14000 генов мыши, в том числе все известные гены ответа на ИФР-Ι. Нагрузку иРНК выражают в виде средней разницы (СР) между совершенной парой олигонуклеотидных зондов и соответствующего зонда, несущего ошибочное спаривание оснований в центральном положении. Учитывают только гены с фактором изменения выше пяти и 97% воспроизводимостью (р<0,03) в рамках трех биологических репликаций. Такой анализ выявил в общей сложности 162 гена, из которых у 86 регуляция усиливается, а у 76 регуляция ослабляется под воздействием всех вариантов ИФР-Ι. Общий профиль относительной транскрипциональной активности разных монопэгилированных ИФР-Ι изомеров показан в виде иерархической группы генов с усиленной или ослабленной регуляцией на фиг. 4. Анализ уровней индукции отдельных генов, вызванной 0,1 мкг/мл и 1,0 мкг/мл ИФР-Ι, показывает, что выбранные кластеры весьма схожи. Пик 3 формирует профиль экспрессии, схожий с профилем экспрессии непэгилированного ИФР-Ι, причем в той же концентрации, и проявляет большую активность по сравнению со смесью пэгилированных ИФР и другими пиками. Интересно отметить, что пик 2 индуцирует схожий ответ транскрипции, что и смесь пэгилированных ИФР. Помимо биологической активности пик 1 показывает самый слабый ответ транскрипции, демонстрируя, что пэгилирование препятствует рецепторному взаимодействию.

Примеры 5 и 6. Фосфорилирование ИФР4К ίη νίίτο с помощью рчИФР-Ι и монопэгилированного ИФР-Ι.

Для анализа ίη νίίτο активности ИФР4К используют клетки ΝΙΗ-3Τ3, стабильно экспрессирующие ИФР4К человека. После пребывания в течение ночи в условиях голодания (в среде без сыворотки), клетки обрабатывают повышенными дозами рчИФР-Ι или соответствующим пэгилированным ИФР-Ι изомером (0,003-10 мкг/мл). Вестерн-блоттинг фосфорилированного ИФР4К проводят согласно описанному выше, и полученные кривые дозы-ответа совпадают с кинетическими кривыми связывания по одной точке, включая коэффициент Хилла (η_Η); количественные данные ассоциированных кривых показаны в таблице фиг. 6. Дозовый ответ рчИФР-Ι (фиг. 5А) имеет значение ЕС₅₀ 6,3 нмоль и наблюдается почти по принципу «все или ничего» при η_Η 2,27 (фиг. 6). Напротив, пик 1 монопэгилированного ИФР-Ι не показывает четкого дозового ответа в отсутствие насыщения, η_Η 0,34 и определенная величина ЕС₅₀ составляет 91,5 нмоль (фиг. 5Б, 6). Пики 2 и 3 (фиг. 5В и 5Г) показывают схожее связывающее сродство при значениях ЕС₅₀ 13,4 и 21,5 нмоль соответственно (фиг. 6). В обоих случаях η_Η является упорядоченным при 1,27 и 1,19, соответственно. Пик смеси показывает схожий с ИФР4К тип активации с немного сниженным сродством при ЕС₅₀ 28,8 нмоль и упорядоченной величиной η_Η 1,28 (фиг. 5Д, 7). В итоге, пэгилированный ^еκ(1-3)-ИФР-I пик 3 обладает самым высоким сродством из всех ПЭГ-изомеров с ЕС₅₀10,8 нмоль и упорядоченной величиной ηΗ 1,08 (фиг. 5Е, 7). Эти данные доказывают, что все пики, кроме пика 1, специфически активируют ИФР4К человека с 2-5-кратной потерей сродства по сравнению с рчИФР-Ι.

Пример 7. Понижение ίη νίνο содержания Ав у двухмесячных мышей линии РБ2АРР за счет применения рчИФП-Ι.

Используют дважды трансгенных мышей линии РБ2АРР для анализа краткосрочных воздействий рчИФР-Ι на нагрузку мозга Ав. Этих мышей лечат внутрибрюшинным введением 50 мкг/кг рчИФР-Ι и анализируют содержание Ав в коре головного мозга через 2 ч после инъекции. Фиг. 7 показывает результаты Вестерн-блоттинга экстрактов мозга двухмесячных мышей, согласно которым уровни АПБ, С99 и контрольного белка (альбумина) остаются неизменными после применения рчИФР-Ι, а уровни Ав снижаются через 2 ч после инъекции рчИФР-Ι. Проводят количественный анализ и подсчитывают соотношения соответствующих интенсивностей пикселей для получения информации о силе воздействия рчИФР-Ι на образование Ав. Этот анализ показывает, что соотношения АПБ/контрольный белок (97,5±5,7% контроля) и С99/АПБ (87,2±9,8% контроля) не изменяются, доказывая, что ни экспрессия АПБ, ни процессинг АПБ, не изменяются через 2 ч после лечения рчИФР-Ι (фиг. 7Б). Напротив, соотношение Ав/АПБ значительно снижается до 68,4±7,1% от контроля (р<0,01), а соотношение С99/Ав - до 157,9±16,6% от контроля (р<0,01), показывая, что рчИФР-Ι понижает содержание Ав. Рассмотрение всех полученных данных позволяет сделать вывод, что лечение молодых мышей линии РБ2АРР рчИФР-Ι приводит к значительному повышению клиренса Ав из мозга.

Пример 8. Динамика понижения содержания Ав ίη νίνο у мышей линии РБ2АРР за счет применения рчИФР-Ι.

Для оценки динамики краткосрочного воздействия рчИФР-Ι на растворимые Ав в мозге молодых мышей линии РБ2АРР, не имеющих бляшек в мозге (двухмесячного возраста), животных лечат внутри

- 14 011284 брюшинным введением 50 мкг/кг рчИФР-Ι и определяют в коре головного мозга уровни АПБ, С99, Ав и актина через 2, 6 или 24 ч. Соотношения АПБ/альбумин и С99/АПБ существенно не изменяются под воздействием рчИФР-Ι на протяжении исследования. Понижение соотношений Ав/АПБ за счет применения рчИФР-Ι наблюдают через 2 ч после инъекции, но эффект отсутствует через 6 и 24 ч (фиг. 8А). Аналогичным образом усиление падения концентрации Ав, мониторинг которых проводят по соотношению С99/Ав, определяется только через 2 ч и исчезает через 6 и 24 ч (фиг. 8Б). Отсюда следует, что эффект рчИФР-Ι на клиренс Αβ происходит на протяжении короткого периода, возможно из-за короткого полупериода распада выделенного из крови ИФР-Ι.

Пример 9. Сравнительный анализ воздействия пиков 1-3 на интенсивность клиренса Ав ίη νίνο у двухмесячных мышей линий АРР и Р82АРР.

В данном примере показаны вместе результаты по пикам 1-3 пэгилированных ИФР-Ι для прямого сопоставления способностей снижения содержания Ав и клиренса Ав. Подобно рчИФР-Ι, соотношения АПБ/актин (актин в данном случае является контрольным белком) или С99/АПБ не изменяются под воздействием каких-либо концентраций пиков 1, 2 или 3. Пик 3 имеет самую высокую активность по снижению Ав/АПБ через 6 ч после внутрибрюшинной инъекции (фиг. 9А). Напротив, пик 1 не проявляет активность во всем диапазоне исследованных концентраций, а пик 2 проявляет достоверный эффект по снижению Ав/АПБ только при самой высокой из применявшихся концентраций (500 мкг/кг). Из фиг. 9Б следует, что подобным же образом пик 3 является единственным соединением, действующим в низких дозах (15-50 мкг/кг) и повышающим соотношение С99/Ав, что характерно для повышенного клиренса Ав. Также следует, что пик 1 неактивен, а пик 2 проявляет значимые активности при концентрации 500 мкг/кг. При совместном рассмотрении этих результатов следует, что пик 3 является наиболее активным монопэгилированным ИФР-Ι изомером в таком эксперименте ίη νίνο. Фиг. 11 показывает результаты, полученные только на модели дважды трансгенных мышей линии Р82АРР.

Пример 10. Динамика понижения содержания Ав ίη νίνο у мышей линии Р82АРР за счет применения пика 3.

Через 6 ч после внутрибрюшинной инъекции пик 3 в дозе 50 мкг/кг проявляет значительный эффект, проявляющийся в виде снижения уровней Ав в мозге. Для того чтобы определить, насколько долго сохраняется этот эффект, изучают экстракты мозга мышей линии Р82АРР, которых лечили пиком 3 в количестве 50 мкг/кг, через 2, 6, 24, 48 и 72 ч. На протяжении всего периода не наблюдают значительных изменений соотношений АПБ/актин или С99/АПБ.

Напротив, уровни Ав/АПБ были значительно снижены через 6, 24 и 48 ч после внутрибрюшинной инъекции (р<0,05, р<0,001 и р<0,01 соответственно), что свидетельствует о воздействии пика 3 на снижение Ав на протяжении по меньшей мере 48 ч (фиг. 10А). Соотношения С99/Ав, представляющие клиренс Ав независимо от выработки Ав (поскольку соотношение С99/АПБ остается неизменным), значительно возросли при весьма схожей динамике и хорошо поддерживаются на протяжении по меньшей мере 24 ч после инъекции (фиг. 10Б). Рассмотренные вместе эти данные показывают, что пик 3 способен понизить содержание Ав в мозге мышей линии Р82АРР. Фиг. 12 показывает результаты, полученные только на модели дважды трансгенных мышей линии Р82АРР.

Пример 11. Связывание ИФР-связывающих белков ИФРСБ4 (СБ4) и ИФРСБ5 (СБ5).

Соединение ИФРСБ4 (§^18зРго1 22692) идентифицируют и клонируют (8Н1такак1 8. в Мо1. Епбосппо1. 4, 1990, с. 1451-1458). Соединение ИФРСБ5 (8\\'ккРго1 24593) идентифицируют и клонируют (К1е£ег М.С. в ВюсНет. ВюрНук. Кек. Соттип. 176, 1991, с. 219-225).

Оба связывающих белка получают рекомбинацией в Е.соН.

Для анализа взаимодействия белков методом поверхностного плазменного резонанса (ППР) используют инструмент В1асоге 3000. Для пробега и проведения реакции используют буфер НВ8-Р (10 ммоль НЕРЕ8, 150 ммоль №С1, 0,005% полимерного поверхностно-активного вещества, рН 7,4) при 25°С. Все образцы предварительно охлаждают при 12°С. ИФРСБ4 и ИФРСБ5 спаривают с амином в концентрациях 5 мкг/мл. Сопряжение с фрагментом СМ5 приводит к загрузке сигнала размером ~700 Кик. Образцы пэгилированных ИФР-Ι (анализируемые соединения) вводят инъекцией в пяти концентрациях, находящихся в диапазоне от 1,23 до 100 нмоль в течение 5 мин (фаза ассоциации) и промывают НВ8-Р в течение 5 мин при скорости тока 50 мкл/мин. Поверхность фрагмента регенерируют одной инъекцией 100 ммоль НС1 в течение 1 мин.

Фрагмент, формат исследования и последовательность инъекций соответствуют описанию в табл. 2. Оценку результатов проводят с применением ленгмюровской модели связывания 1:1.

- 15 011284

Таблица 2

Фрагмент	Лиганд	Анализируемое соединение	ка (1/Мк)	кб (1/5)	КО (М)
СМ5	ВР4	ИФР4	4,0x10°	7,2x1 О*⁴	1,8χ10’^ιυ
СМ5	ВР4	40кДа/МТ-КРК.К	5,4 х10⁴	1,5x1 О*⁴	2,8 х10'^в
СМ5	ВР4	40кДа/ КК.В.К	7,1 хЮ⁴	6,8x10*	9,5 хЮ'⁹
СМ5	ВР4	КОМПОЗИЦИЯ	6,9 Х10⁴	5,3 хЮ'⁴	7,7 хЮ‘^У
СМ5	ВР5	ИФР-1	9,6x10°	1,6x10'·’	1,7 χ10'^ιυ
СМ5	ВР5	40кДа/Г1Т-1ШК.К	1,1 хЮ⁵	2,1 хЮ'⁴	2,0 х10'^в
СМ5	ВР5	40кДа/ КК.КК	1,5 хЮ⁵	2,0x10’⁴	1,3 х10'^в
СМ5	ВР5	композиция	1,1 хЮ⁵	2,5 хЮ'⁴	2,3 х10'^В

кДа: разветвленный ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа.

кДа/ΝΤ-КККК: КККК, пэгилированный с Ν-конца ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа. 40кДа/КККК: КККК, пэгилированный по лизину в положении К68 ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа.

Состав: состав из 40 кДа/И-концевого КККК и 40 кДа/КККК (1:1).

Эти результаты подтверждают, что все пэгилированные образцы ИФР активно связываются с ИФРВР4 и ИФРВР5 в сходном диапазоне. Все пэгилированные образцы показывают существенно уменьшенную константу скорости связывания по сравнению с непэгилированным ИФР.

Данные отрицательного контроля (например, кривые буферов) вычитают от данных кривых образцов для коррекции сдвига системной естественной линии отсчета и для уменьшения шума сигнала.

Пример 12. Аутофосфорилирование ИФР-Ι лигандами.

Для определения способности полипептидов настоящего изобретения активировать ИФР-ГК и индуцировать фосфорилирование ИФР-ГК, клетки с повышенной экспрессией ИФР-ГК стимулируют полипептидами согласно настоящему изобретению и последовательно определяют статус фосфорилирования ИФР4К методом ЕЫ8А.

Для осуществления метода ЕЫ8А в 96-луночные полистроловые планшеты с покрытием из стрептавидина (фирма Димс) наносят по 100 мкл моноклонального антитела против ИФРЛКа человека (0,5 мг/мл), разведенного 1:350 в буфере РВ8Т с 3% БСА. После инкубирования в течение 1 ч при комнатной температуре на качалке для планшеток покровный раствор удаляют и планшетки промывают трижды РВ8Т в количестве 200 мкл на лунку.

Клетки линии ΝΙΗ-3Τ3, трансфецированные ИФР4К, помещают в среду МЕМ Эн1Ьессо (продукт ΌΜΕΜ) с высоким содержанием глюкозы (фирма РАА, номер в каталоге Е15-009) с добавлением 2 ммоль Ь-глутамина (фирма С1Ьсо, номер в каталоге 25030-024) и 0,5% активированной нагреванием ФСТ (фирма РАА, номер в каталоге А15-771). Для определения значений ЕС₅₀ инкубируют 96-луночные планшеты, инокулированные клетками в количестве 1,3-10⁴ клеток/лунку, в течение 2 суток при 37°С в атмосфере 5% СО2.

Через 48 ч культивирования в среде с низким содержанием сыворотки среду аккуратно удаляют и замещают разными концентрациями полипептидов настоящего изобретения, разведенными в 50 мкл соответствующей среды. Через 10 мин инкубации при 37°С в атмосфере 5% СО₂ среду аккуратно удаляют отсасыванием и добавляют по 120 мкл холодного литического буфера в лунку (50 ммоль трис рН 7,5, 1 ммоль ЭДТА (этилендиамин-тетрауксусной кислоты), 1 ммоль ЭГТА (этиленгликолевой тетраацетиловой кислоты), 20% глицерина, 1% тритон-Х100, 100 ммоль NаΕ, 1 ммоль №1УО.-|. ингибитор протеазы (продукт Сотр1е!е™). Планшеты инкубируют с литическим буфером в течение 15 мин при 4°С на качалке для планшеток и затем по 100 мкл содержимого лунок переносят в планшетки для метода ЕЫ8А с покрытием моноклональными антителами против ИФР-ΙΡα человека. Лизаты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре на качалке для планшеток, для того чтобы ИФР4К соединился с иммобилизованным антителом, и затем тщательно отсасывают. Несвязанный материал удаляют путем трехкратного промывания 200 мкл РВ8Т/лунку.

Для определения связанного фосфорилированного ИФР4К, по 100 мкл поликлонального ΙβΟ кроличьего антитела против ИФРЛКа человека, разведенного 1:12650 в 3% БСА/РВ8Т, добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре на качалке для планшеток. Затем содержание лунок опять аккуратно удаляют и лунки трижды промывают 200 мкл РВ8Т/лунку.

Для определения поликлонального кроличьего антитела по 100 мкл поликлонального антитела против кроличьего Ι§Ο, соединенного с НКР (фирма Се11 81дпа1тд Тесйпо1о§у Шс. США), разведенного 1:6000 в 3% БСА/РВ8Т, добавляют в каждую лунку. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре на качалке несвязанное выявляемое антитело удаляют путем шестикратного промывания планшеток 200 мкл РВ8Т/лунку. В качестве субстрата для антителосвязанного НКР, в каждую лунку добавляют по 100 мкл из 3,3'-5,5'-тетраметилбензидина и еще раз инкубируют в течение 0,5 ч при комнатной температуре на качалке.

- 16 011284

Количественную оценку проводят после остановки реакции внесением 1 М Η₂8Ο₄ по 25 мкл/лунку путем измерения абсорбции при длине волны 450 нм.

Полученные значения ΟΌ₄₅₀ образцов переводят в процент активирования, используя 10 нмоль ИФР-Ι в качестве 100% контроля (контроль тах), и контроль, не содержащий ИФР-Ι, в качестве 0% (контроль тш), используя формулу: процент активации = (образец-тт)/(тах-тш). Получаемые значения ЕС₅₀ (концентрации полипептида при активности, равной половине максимальной активации ЮЕ-1К), представлены в табл. 3.

Таблица 3

Образец	ЕС50 [нМ]	Среднеквадратичное отклонение
К68-КККК 20 кДа линейный	2,1	0,2
ΝΤ-ΚΚΚΚ 20 кДа линейный	29,6	1,9
композиция 20 кДа линейная	7,6
К68-КККК 30 кДа линейный	4,7	0,9
ΝΤ-ΚΚΚΚ 30 кДа линейный	44,5	5,0
композиция 30 к Да линейная	9,2	1,1
композиция 40 кДа разветвленная	16,4	0,7
К68-К.ККК 20 кДа разветвленный	1,5	1,1
композиция 20 кДа разветвленная	5Д	0,5
ΝΤ-ΚΚΚΚ 40 кДа разветвленный	19,9	1,1

Список литературы

ВизЬ Α.Ι., Ί'ίΐιιζ.ί Κ.Ε. Ргос. №Й. Асаб. 8οΐ. И8А 99, 2002, с. 7317-7319

Сагго Ε. и др. Ναι. Меб. 8, 2002, с. 1390-1397

С11ато\у 8.М. и др. Вюсонщда!е СЬет. 5, 1994, с. 133-140

С1агк К. и др. 1. Вю1. СЬет. 271, 1996, с. 21969-21977

СипшпдЬат В.С. и др. 8с1епсе 254, 1991, с. 821-825 бе Ρадΐе^-Ηοййи^ζеη Р. и др. ΕΕΒ8 Ьей. 195, 1986, с. 179-184

ΌΕ 39 24 705

Эе1дабо С. и др. Сгй. Кеу. ТЬег. Эгид Сатег 8уЧ. 9, 1992, с. 249-304

Эоге 8. и др. Апп. ΝΥ Асаб. 8ск 890, 1999, с. 356-364

Эоге 8. и др. Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 94, 1997, с. 4772-4777

Эппсам К.1. Апа1. ВюсЬет. 132, 1983, с. 68-73

ΕΡ 0123228

ΕΡ 0128733

ΕΡ 0597033

ΕΡΑ-0400472

ΕΡΑ-0473084

Еозег 8. и др. ΡЬа^тасοдеηοт^с 1. 3, 2003, с. 319

Егапсщ, Ο.Ε. е! а1. Ιώ. 1. Нета!о1. 68, 1998, с. 1-18

Егапсщ Ρ.Τ. и др. 1. №иго1. №иго8игд. Ρ8усЫаΐ^у 66, 1999, с. 137-147

Сообзоп Кб., Ка!ге Ν.ν. ВюТесйпо1оду 8, 1990, с. 343-346

Сгазей1 Э.К., Миггау 1.Е. АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬуз. 119, 1967, с. 41-49

Нагбу 1., 8е1кое Ό6. 8аепсе 297, 2002, с. 353-356

Негтапзоп С.Т. в кн.: «Вюсопщда!е Тесйшдиез», Асабеппс ΡΐΌ55. Сан-Диего, 1996, с. 147-148

НегзЬйе1б М.8. и др. Ν. Ε^1. 1. Меб. 316, 1987, с. 589-596

Июне Н. и др. 1. ЬаЬ. С1т. Меб. 124, 1994, с. 529-536

Кафе М. и др. Вгаш Кез. 486, 1989, с. 396-398

Кайе, Абуапсеб Эгид ЭеКуегу 8уз!ет5 10, 1993, с. 91

Кайе Ν.ν. и др. Ρι-ос. Ыаб. Асаб. 8ск И8А 84, 1987, с. 1487-1491

Кайе Ν.ν. 1. ]ттипо1. 144, 1990, с. 209-213

1<теГег М.С. ВюсЬет. ВюрЬуз. Кез. Соттип. 176, 1991, с. 219-225

КтзИег О. и др. Абу. Эгид Эеку. Кеу. 54, 2002, с. 477-485

Кпизе1 В. и др. 1. Пентозск 10, 1990, с. 558-570

Кобега Υ. и др. Огодгезз ш 0о1утег 8с1епсе 23, 1998, с. 1233-1271

Киттег А. и др. Ш!. 1. Εχρ. Э1аЬе8Йу Кез. 4, 2003, с. 45-57

1е Войс Υ. и др. ΕΕΒ8 Ьей. 196, 1986, с. 108-112

МагсЬ 1. Абуапсеб Οι^πιχ СЬет18йу, 1977, с. 375-376

МсМотз Е.А., 0иЬо15-0а1сс.| М. 1. №иго8с1. Кез. 21, 1988, с. 199-209

МсМотз Е.А. и др. Ριό^ №11. Асаб. 8ск И8А 83, 1986, с. 822-826

- 17 011284

Мети в кн.: «А ТехЛоок о£ №иго1оду», 6-е изд. 1979, изд-во Ьеа& РеЫдег, Филадельфия, с. 484489

Меуегк Р.Р и др. СРп. РРагтасо1. ТРег. 49, 1991, с. 307-313

Моп£агб1ш С. и др. В|осопщда1е СРет. 6, 1995, с. 62-69

Могригдо М. и др. I. Вюсопщда1е СРет. 7, 1996, с. 363-368

Мохе11 КЬ., МсМотк Р.А. I. №игокс1. Иек. 30, 1991, с. 382-390 №1кига Т. и др. I. №игокс1. 21, 2001, с. 1902-1910. В кн.: «Иеттд!оп'к РРагтасеибса1 8с1епсек», 18-е изд. 1990, изд-во Маск РиЬРкЫпд Сотрапу, под ред. Ок1о и др. (например, с. 1435-1712)

ИкРагбк 1.6. и др. I. №игокс1. 23, 2003, с. 8989-9003

8апбЬегд №гбс.|У1к1 А.С. и др. Вгаш Иек. Мо1. Вгаш Иек. 12, 1992, с. 275-277 8а1аке-[к1ика\уа И. и др. Се11 81гис1. Рипс!. 17, 1992, с. 157-160

8е1кое Ό.Ι. РРукю1. Кеу. 81, 2001, с. 741-766

8Ытакак1 8. Мо1. Епбосппо1. 4, 1990, с. 1451-1458

8!еепЬегдР Р.Н. и др. ВюсРет. ВюрРук. Иек. Соттип. 175, 1991, с. 507-514

8угас Ό., 8сРиЬеп Ό. ВюсРет. ВюрРук. Иек. Соттип. 172, 1990, с. 54-60

Тапака Н. и др. Сапсег Иек. 51, 1991, с. 3710-3714

Таппег ЬМ. и др. Ас!а Епбосппо1. (СорепР.) 84, 1977, с. 681-696

Тки!кит1 Υ. и др. 1рп. I. Сапсег Иек. 85, 1994, с. 9-12

И8 5093317

И8 5672662

И8 5714460

И8 5861373 и8 5932462

И8 6403764

И8 6509443

ЫНпе К. и др. I. СРп. Епбосппо1. Ме!аЬ. 39, 1974, с. 548-554

Уегопеке Р.М. Вюта!епа1к 22, 2001, с. 405-417

Уегопеке Р.М. и др. 1оита1 о£ Вюасйуе апб СотрабЫе Ро1утегк 12, 1997, с. 196-207 \Уег111ег 6.А. и др. Мо1. Епбосппо1. 4, 1990, с. 773-778 νθ 02/32449 νθ 2004/60300 νθ 93/02695 νθ 94/12219 νθ 95/32003 \Уо)с1ю\укк| О.М. и др. ВюсЫт. ВюрРук. Ас!а 910, 1987, с. 224-232

- 18 011284

Перечень последовательностей <110> Ф.Хоффманн-Ля Реш АГ <120> Конъюгаты инсулиноподобного фактора роста I и полиэтиленгликоля <130>22904 <150> ЕР 04030415 <151> 2004-12-22 <16О>1 <170> РаСепЫп νβτδϊοη 3.2 <210> 1 <2Ц>105 <212> РРТ <213> Ното зархепз <400> 1

<Э1у 1

Рго

С?1и

Ткг

Ъеи 5

Суз

<31у А1а

С1и

Ъеи 10

Уа1

Азр

А1а

Ъеи

О1п 15

РЬе

Уа1

Суз

С1у

Азр

Агд

С1у

Рке

Туг

РЬе

Азп

Ъуз

Рго

Ткг

С1у

Туг

<Э1у

20

25

30

Зег

Еег

Зег

Агд

А1а

Рго

С1п

Ткг

С1у

Не

Уа1

Азр

С1и

Суз

Суе

35

40

45

РЬе

Агд

Зег

Суз

Азр

Ъеи

Агд

Ъеи

С1и

Мее

Туг

Суз

А1а

РГО

Ьей

50

55

60

Ъуз

Рго

А1а

Ъуз

Зег

А1а

Агд

Зег

νβΐ

Агд

А1а

С1п

Агд

ΗΪ3

Ткг

Аар

65

70

75

80

МеП

Рго

Ъуз

Ткг

□1п

Ъуз

<31и

Уа1

ΗΪΞ

Ъеи

Ъуз

Азп

А1а

Зег

Агд

61у

85

90

95

Зег

А1а

С1у

Азп

Ъуз

Азп

Туг

Агд

Мее

100 105

Claims

1. Конъюгат, включающий вариант инсулиноподобного фактора роста Ι (ИФР-Ι) и полиэтиленгликоль (ПЭГ), отличающийся тем, что указанный вариант ИФР-Ι содержит замены (замену) аминокислот в положениях 27, 37, 65, 68 в последовательности исходного ИФР-Ι таким образом, что одна или несколько аминокислот в положениях 37, 65, 68 являются лизином (К), а аминокислота в положении 27 является полярной аминокислотой, но не лизином, причем указанный ПЭГ конъюгирован с указанным вариантом ИФР-Ι по первичной аминогруппе (аминогруппам).

2. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что указанный ПЭГ имеет молекулярную массу в среднем равную 20-100 кДа.

3. Конъюгат по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный вариант ИФР-Ι дополнительно пэгилирован по Ν-концевой аминокислоте.

4. Конъюгат по п.1 или 3, отличающийся монопэгилированием по аминокислотам К65, К68 или К37 или двойным пэгилированием по К65 и К68.

5. Конъюгат по пп.1-4, отличающийся тем, что указанный вариант ИФР-Ι является К27, К37, К65, К68 (КККК), К27, К37, К65, К68 (КККК), К27, К37, К65, К68 (КККК), К27, К37, К65, К68 (КККК).

6. Конъюгат по пп.1-5 или вариант ИФР-Ι по п.5, отличающийся тем, что у варианта ИФР-Ι до трех аминокислот с Ν-конца процессировано.

7. Конъюгат по пп.1-6, отличающийся тем, что группа(ы) полиэтиленгликоля является разветвленной группой(ами) полиэтиленгликоля.

- 19 011284

8. Конъюгат по пп.1-7, отличающийся тем, что средняя молекулярная масса группы (групп) полиэтиленгликоля равна 20-100 кДа.

9. Вариант ИФР-Ι, отличающийся наличием замены (замен) аминокислоты в положениях 27, 37, 65, 68 в последовательности исходного ИФР-Ι, из которых одна или несколько аминокислот в положениях 37, 65, 68 являются лизином (К), а аминокислота в положении 27 является полярной аминокислотой, но не лизином.

10. Применение варианта ИФР-Ι по п.9 в качестве промежуточного соединения для получения пэгилированного варианта ИФР-Ι.

11. Способ получения конъюгата, включающего вариант ИФР-Ι и одну или две полиэтиленгликолевые группы со средней молекулярной массой примерно от 20 до примерно 100 кДа, который предусматривает взаимодействие промежуточного соединения ИФР по п.9 с активированным полиэтиленгликолем в условиях, когда указанный полиэтиленгликоль химически связан с указанным промежуточным соединением ИФР-Ι по первичным аминогруппам лизина варианта ИФР-Ι.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный полиэтиленгликоль дополнительно химически связан с указанным промежуточным соединением ИФР-Ι по Ν-концевой аминогруппе варианта ИФР-Ι.

13. Фармацевтическая композиция, включающая конъюгат по пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.

14. Применение конъюгата по пп.1-8 для получения лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера.

15. Способ лечения болезни Альцгеймера, предусматривающий введение в организм пациента, нуждающегося в этом, терапевтически эффективного количества конъюгата по пп.1-8.

16. Композиция лизин-пэгилированного варианта ИФР-Ι, содержащего замену (замены) аминокислот в положениях 27, 37, 65, 68 в аминокислотной последовательности исходного ИФР-Ι, из которых одна или несколько аминокислот в положениях 37, 65, 68 являются лизином (К), аминокислота в положении 27 является полярной аминокислотой, но не лизином, причем указанный ПЭГ конъюгирован с указанным вариантом ИФР-Ι по первичной аминогруппе (аминогруппам), а вариант ИФР-Ι пэгилирован по Ν-концу.

17. Фармацевтическая композиция, включающая лизин-пэгилированный вариант ИФР-Ι, содержащий замену (замены) аминокислот в положениях 27, 37, 65, 68 в аминокислотной последовательности исходного ИФР-Ι, из которых одна или несколько аминокислот в положениях 37, 65, 68 являются лизином (К), аминокислота в положении 27 является полярной аминокислотой, но не лизином, причем указанный ПЭГ конъюгирован с указанным вариантом ИФР-Ι по первичной аминогруппе (аминогруппам), а вариант ИФР-Ι пэгилирован по Ν-концу, и фармацевтически приемлемый носитель.

18. Применение композиции лизин-пэгилированного варианта ИФР-Ι, содержащего замену (замены) аминокислот в положениях 27, 37, 65, 68 в аминокислотной последовательности исходного ИФР-Ι, из которых одна или несколько аминокислот в положениях 37, 65, 68 являются лизином (К), аминокислота в положении 27 является полярной аминокислотой, но не лизином, указанный ПЭГ конъюгирован с указанным вариантом ИФР-Ι по первичной аминогруппе (аминогруппам), а вариант ИФР-Ι пэгилирован по Ν-концу, для получения лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера.

19. Способ лечения болезни Альцгеймера, предусматривающий введение в организм пациента, нуждающегося в этом, терапевтически эффективного количества композиции по п.16 или 17.