EA012586B1 - Rage-слитые белки и способы их применения - Google Patents

Rage-слитые белки и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA012586B1
EA012586B1 EA200700402A EA200700402A EA012586B1 EA 012586 B1 EA012586 B1 EA 012586B1 EA 200700402 A EA200700402 A EA 200700402A EA 200700402 A EA200700402 A EA 200700402A EA 012586 B1 EA012586 B1 EA 012586B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cace
domain
human
polypeptide
sequence
Prior art date
Application number
EA200700402A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200700402A1 (ru
Inventor
Аднан М.М. Мджалли
Дэвид М. Стерн
Йе Э. Тянь
Джеффри К. Вебстер
Роберт Ротлейн
Анн Мари Шмидт
Ши Ду Янь
Original Assignee
Транстек Фарма, Инк.
Дзе Трастиз Оф Коламбия Юниверсити Ин Дзе Сити Оф Нью Йорк
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35427536&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA012586(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Транстек Фарма, Инк., Дзе Трастиз Оф Коламбия Юниверсити Ин Дзе Сити Оф Нью Йорк filed Critical Транстек Фарма, Инк.
Publication of EA200700402A1 publication Critical patent/EA200700402A1/ru
Publication of EA012586B1 publication Critical patent/EA012586B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

Описаны RAGE-слитые белки, содержащие последовательности полипептида RAGE, связанные со вторым, не-RAGE-полипептидом. RAGE-слитый белок может использовать домен полипептида RAGE, содержащий лигандсвязывающий сайт RAGE, и междоменный линкер, непосредственно связанный с CH-доменом иммуноглобулина. Такие слитые белки могут обеспечивать специфическое высокоаффинное связывание с лигандами RAGE. Описано также применение RAGE-слитых белков в качестве терапевтических средств для опосредуемых RAGE патологий.

Description

Перекресная ссылка на родственные заявки
В настоящей заявке заявлен приоритет, согласно Разделу 35 Кодекса законов США 119(2), по предварительной заявке на патент США с регистрационным номером 60/598362, поданной 3 августа 2004 года. Описание предварительной заявки на патент США 60/598362 включено здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Область техники, к которой относится данное изобретение
Данное изобретение относится к регуляции Рецептора для Продвинутых Гликозилированных Конечных продуктов (КАСЕ, КесерЮг Еот Абуаисеб С1уса(е6 Еибртобисй). Более конкретно, данное изобретение относится к слитым белкам, содержащим полипептид КАСЕ, способам получения таких слитых белков и применению таких белков для лечения нарушений на основе КАСЕ.
Уровень техники
Инкубирование белков или липидов с альдозными сахарами приводит к неферментативному гликозилированию и окислению аминогрупп на белках с образованием аддуктов Амадори. Со временем эти аддукты подвергаются дополнительным перегруппировкам, дегидратациям и сшиванию с другими белками, с образованием комплексов, известных как Продвинутые Конечные Продукты Гликозилирования (АСЕ). Факторы, которые стимулируют образование АСЕ, включают в себя замедленное обновление белка (например, как при амилоидозе), накопление макромолекул с высоким содержанием лизина и высокие уровни глюкозы в крови (например, как при диабете) (Ной е! а1., 1. Вю1. СНет. 270: 25752-761, (1995)). Предполагалось, что АСЕ участвуют в различных нарушениях, в том числе осложнениях, ассоциированных с диабетом и нормальным старением.
АСЕ обнаруживают специфическое и насыщаемое связывание с рецепторами клеточной поверхности на моноцитах, макрофагах, эндотелиальных клетках микроциркуляторных сосудов, клетках гладких мышц, мезангиальных клетках и нейронах. Рецептор для Продвинутых Гликозилированных Конечных Продуктов (КАСЕ) является членом семейства молекул супергенов иммуноглобулинов.
Внеклеточный (Ν-концевой) домен КАСЕ включает в себя три района иммуноглобулинового типа: один домен V (вариабельного) типа, за которым следуют два домена С (константного) типа (№ерет е! а1., 1. Бю1. СНет., 267:14998-15004 (1992); 8с1иш6( е! а1., Сйс. (8ирр1.) 96#194 (1997)). Единственный трансмембранный (прошивающий мембрану) домен и короткий, высокозаряженный цитозольный хвост следуют за внеклеточным доменом. Ν-концевой, внеклеточный домен может быть выделен протеолизом КАСЕ или молекулярно-биологическими подходами для генерирования растворимого КАСЕ (АКАСЕ), содержащего V- и С-домены.
КАСЕ экспрессируется на множественных типах клеток, включая лейкоциты, нейроны, микроглиальные клетки и эндотелий сосудов (например, Ной е! а1., 1. Бю1. СНет. 270: 25752-761, (1995)). Увеличенные уровни КАСЕ обнаружены также в стареющих тканях (8сЫеюйег е! а1., 1. Сйи. 1пуей., 99 (3): 457468 (1997)) и в диабетической сетчатке, сосудистой сети и почке (8с1иш6( е! а1., №Щ.1ге Меб., 1:1002-1004 (1994)).
Кроме АСЕ другие соединения могут связываться с КАСЕ и модулировать КАСЕ. КАСЕ связывается со множественными фракционно и структурно различающимися лигандами, включая амилоид бета (Ав), сывороточный амилоид А (8АА), Продвинутые Конечные Продукты Гликозилирования (АСЕ), 8100 (провоспалительный член семейства кальгранулинов), карбоксиметиллизин (СМЬ), амфотерин и СИ11Ь/СО18 (ВисшатеШ е! а1., Се11 Мо1. Ь1Ее 8с1., 59:1117-128 (2002); СНауакА е! а1., М1стоЬе8 1пЕес!., 6:1219-1225 (2004); Кокко1а е! а1., 8сап6. 1. 1ттипо1., 61:1-9 (2005); 8ст1б! е! а1., 1. С1ш. Шуей., 108:949955 (2001); Коскеп е! а1., Ат. 1. РаЛо1., 162:1213-1220 (2003)).
Было показано, что связывание лигандов, таких как АСЕ, 8100/кальгранулин, β-амилоид, СМЬ (Νεкарбоксиметиллизин) и амфотерин, с КАСЕ модифицирует экспрессию различных генов. Эти взаимодействия могут затем инициировать механизмы трансдукции сигнала, включая активацию р38, р21та§, МАР-киназ, фосфорилирования Егк1-2 и активацию транскрипционного медиатора передачи воспалительного сигнала, ΝΕ-кВ (Уеп е! а1., П1аЬе!е8, 50:1495-1504 (2001)). Например, во многих типах клеток взаимодействие между КАСЕ и его лигандами может генерировать окислительный стресс, который тем самым приводит к активации чувствительного к свободным радикалам фактора транскрипции ΝΕ-кВ и активации ΝΕ-кВ-регулируемых генов, таких как цитокины ΣΠ-1β и ΤΝΕ-α. Кроме того, экспрессия КАСЕ отрицательно регулируется посредством ΝΕ-кВ и обнаруживает повышенную экспрессию в участках воспаления или окислительного стресса (Тапака е! а1., 1. Вю1. СНет., 275:25781-25790 (2000)). Таким образом, восходящая и часто вредная спираль может возбуждаться петлей положительной обратной связи, инициированной связыванием лиганда.
Активация КАСЕ в различных тканях и органах может приводить к ряду патофизиологических последствий.
Предполагалось, что КАСЕ участвует в ряде состояний, включающих в себя: острое и хроническое воспаление (НоЕтапи е! а1., Се11 97:889-901 (1999)), развитие поздних диабетических осложнений, таких как увеличенная проницаемость сосудов (^аийет е! а1., 1. С1ш. 1пуе8!., 97:238-243 (1995)), нефропатия (ТеШе! е! а1., 1. Ат. 8ос. НерНго!., 11:1488-1497 (2000)), артериосклероз (Абакката е! а1., ТНе ΕίηηΑΙι Ме61
- 1 012586 са1 8ос1еку ΌυΘΌΕΟΙΜ, Αηη. Меб., 28:419-426 (1996)) и ретинопатия (Наттек ек а1., Э|аЬеЮ1од1а. 42:603607 (1999)). Предполагалось, что РАСЕ участвует также в болезни Альцгеймера (Уап ек а1., Иакиге, 382:685-691 (1996)) и опухолевой инвазии и метастазировании (ТадисЫ ек а1., Ыакиге, 405:354-357 (2000)).
Несмотря на широкую экспрессию РАСЕ и его явную плейотропную роль во множественных различных моделях заболеваний, РАСЕ, по-видимому, не играет важной роли в нормальном развитии. Например, мыши с нокаутом РАСЕ не имеют очевидного аномального фенотипа, что предполагает, что РАСЕ может играть роль в патологии заболеваний, когда хронически стимулируемое ингибирование РАСЕ, по-видимому, не способствует какому-либо нежелательному острому фенотипу (ЬШепыек ек а1., 1. С1ш. 1п\еД. 113:1641-50 (2004)).
Противодействие связыванию физиологических лигандов с РАСЕ может отрицательно регулировать патофизиологические изменения, вызываемые избыточными концентрациями АСЕ и других лигандов РАСЕ. Посредством уменьшения связывания эндогенных лигандов с РАСЕ, симптомы, ассоциированные с РАСЕ-опосредованными нарушениями, могут быть уменьшены. Растворимый РАСЕ (&РАСЕ) способен эффективно противодействовать связыванию лигандов РАСЕ с РАСЕ. Однако &РАСЕ может иметь полупериод существования при введении ίη νίνο, который может быть слишком коротким, чтобы быть терапевтически полезным, для одного или нескольких нарушений. Таким образом, существует потребность в развитии соединений, которые противодействуют связыванию АСЕ и других физиологических лигандов с рецептором РАСЕ, причем такие соединения должны иметь желаемый фармакокинетический профиль.
Сущность изобретения
Варианты осуществления данного изобретения содержат РАСЕ-слитые белки и способы применения таких белков. Данное изобретение может быть осуществлено различными путями. Варианты осуществления данного изобретения могут содержать слитый белок, содержащий полипептид РАСЕ, связанный со вторым, не-РАСЕ-полипептидом. В одном варианте осуществления этот слитый белок содержит сайт связывания лиганда РАСЕ. Этот слитый белок может дополнительно содержать полипептид РАСЕ, непосредственно связанный с полипептидом, содержащим СН2-домен иммуноглобулина или часть этого СН2-домена.
Данное изобретение содержит также способ получения РАСЕ-слитого белка. В одном варианте осуществления этот способ предусматривает связывание полипептида РАСЕ со вторым, не-РАСЕполипептидом. В одном варианте осуществления полипептид РАСЕ содержит лигандсвязывающий сайт РАСЕ. Этот способ может предусматривать связывание полипептида РАСЕ непосредственно с полипептидом, содержащим СН2-домен иммуноглобулина или часть этого СН2-домена.
В других вариантах осуществления данное изобретение может содержать способы и композиции для лечения РАСЕ-опосредованного нарушения в субъекте. Этот способ может предусматривать введение слитого белка данного изобретения субъекту. Эта композиция может содержать РАСЕ-слитый белок данного изобретения в фармацевтически приемлемом носителе.
Имеются различные преимущества, которые могут быть связаны с конкретными вариантами осуществления данного изобретения. В одном варианте осуществления слитые белки данного изобретения могут быть метаболически стабильными при введении субъекту. Слитые белки данного изобретения могут также проявлять высокоаффинное связывание в отношении лигандов РАСЕ. В некоторых вариантах осуществления слитые белки данного изобретения связываются с лигандами РАСЕ с аффинностями в высоком наномолярном - низком микромолярном диапазоне. Посредством связывания с высокой аффинностью с физиологическими лигандами РАСЕ слитые белки данного изобретения могут быть использованы для уменьшения интенсивности РАСЕ-опосредованных заболеваний.
Слитые белки данного изобретения могут быть также обеспечены в форме белка или форме нуклеиновой кислоты. В одном варианте-примере слитый белок может вводиться системно и оставаться в сосудистой сети для потенциального лечения сосудистых заболеваний, частично опосредуемых РАСЕ. В другом варианте-примере слитый белок может вводиться локально для лечения заболеваний, в которых лиганды РАСЕ способствуют патологии заболевания. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, может доставляться в определенный участок с использованием подходящего носителя, такого как вирус или голая ДНК, где транзиторная локальная экспрессия может локально ингибировать взаимодействие между лигандами и рецепторами РАСЕ. Таким образом, введение может быть транзиторным (например, когда вводят этот слитый белок) или более перманентным по характеру (например, когда слитый белок вводят в виде рекомбинантной ДНК).
Имеются дополнительные признаки этого изобретения, которые будут описаны далее. Должно быть понятно, что данное изобретение не ограничивается в его применении подробностями, представленными в следующей формуле изобретения, описании и фигурах. Данное изобретение может иметь другие варианты осуществления и практиковаться или выполняться различными путями.
Краткое описание фигур
Различные признаки, аспекты и преимущества данного изобретения станут более очевидными со ссылкой на следующие фигуры.
Фиг. 1 показывает различные последовательности РАСЕ в соответствии с дополнительными вари
- 2 012586 антами данного изобретения: Панель А, 8ЕО ΙΌ N0:1, аминокислотная последовательность для КАСЕ человека; и 8Е0 ΙΌ N0:2, аминокислотная последовательность для КАСЕ человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-22; Панель В, 8Е0 ΙΌ N0:3, аминокислотная последовательность для КАСЕ человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-23; Панель С, 8Е0 ΙΌ N0:4, аминокислотная последовательность 5КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:5, аминокислотная последовательность для 5КАСЕ человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-22, и 8Е0 ΙΌ N0:6, аминокислотная последовательность 5КАСЕ человека без сигнальной последовательности аминокислот 1-23; Панель Ό, 8Е0 ΙΌ N0:7, аминокислотная последовательность, содержащая У-домен КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:8, альтернативная аминокислотная последовательность, содержащая У-домен КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:9, №концевой фрагмент У-домена КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:10, альтернативный №концевой фрагмент У-домена КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:11, аминокислотная последовательность для аминокислот 124-221 КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:12, аминокислотная последовательность для аминокислот 227317 КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:13, аминокислотная последовательность для аминокислот 23-123 КАСЕ человека; Панель Е, 8Е0 ΙΌ N0:14, аминокислотная последовательность для аминокислот 24-123 КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:15, аминокислотная последовательность для аминокислот 23-136 КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:16, аминокислотная последовательность для аминокислот 24-136 КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:17, аминокислотная последовательность для аминокислот 23-226 КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:18, аминокислотная последовательность для аминокислот 24-226 КАСЕ человека; Панель Е, 8Е0 ΙΌ N0:19, аминокислотная последовательность для аминокислот 23-251 КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:20, аминокислотная последовательность для аминокислот 24-251 КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:21, междоменный линкер КАСЕ; 8Е0 ΙΌ N0:22, второй междоменный линкер КАСЕ; 8Е0 ΙΌ N0:23, третий междоменный линкер КАСЕ; 8Е0 ΙΌ N0:24, четвертый междоменный линкер КАСЕ; Панель С, 8Е0 ΙΌ N0:25, ДНК, кодирующая аминокислоты 1-118 КАСЕ человека; 8Е0 ΙΌ N0:26, ДНК, кодирующая аминокислоты 1123 КАСЕ человека; и 8Е0 ΙΌ N0:27, ДНК, кодирующая аминокислоты 1-136 КАСЕ человека; Панель Н, 8Е0 ΙΌ N0:28, ДНК, кодирующая аминокислоты 1-230 КАСЕ человека; и 8Е0 ΙΌ N0:29, ДНК, кодирующая аминокислоты 1-251 КАСЕ человека; Панель Ι, 8Е0 ПЭ N0:38, частичная аминокислотная последовательность для доменов Сн2 и Сн3 ΙβΟ человека; 8Е0 ΙΌ N0:39, ДНК, кодирующая часть доменов Сц2 и Сн3 ΙβΟ человека; 8Е0 ΙΌ N0:40, аминокислотная последовательность для доменов Сн2 и Сн3 ΙβΟ человека; Панель 1, 8Е0 ΙΌ N0:41, ДНК, кодирующая домены Сн2 и Сн3 ΙβΟ человека; 8Е0 ΙΌ N0:42, аминокислотная последовательность для домена Сн2 ΙβΟ человека; 8Е0 ΙΌ N0: 43, аминокислотная последовательность для домена Сн3 ΙβΟ человека; и 8Е0 ΙΌ N0:44, пятый междоменный линкер КАСЕ.
Фиг. 2 показывает ДНК-последовательность (8Е0 ΙΌ N0:30) кодирующего района КАСЕ-слитого белка (ТТР-4000) в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения. Кодирующая последовательность 1-753, выделенная жирным шрифтом, кодирует №концевую последовательность белка КАСЕ, тогда как последовательность 754-1386 кодирует последовательность белка Ес ΙβΟ (γ1) человека.
Фиг. 3 показывает ДНК-последовательность (8Е0 ΙΌ N0:31) кодирующего района другого КАСЕслитого белка (ТТР-3000) в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения. Кодирующая последовательность 1-408, выделенная жирным шрифтом, кодирует №концевую последовательность белка КАСЕ, тогда как последовательность 409-1041 кодирует последовательность белка Ес ΙβΟ (γ1) человека.
Фиг. 4 показывает аминокислотные последовательности, 8Е0 ΙΌ N0:32 (ТТР-4000), 8Е0 ΙΌ N0:33 и 8Е0 ΙΌ N0:34, которые, каждая, кодируют КАСЕ-слитый белок из четырех доменов в соответствии с альтернативными вариантами осуществления данного изобретения. Последовательность КАСЕ выделена жирным шрифтом.
Фиг. 5 показывает аминокислотные последовательности, 8Е0 ΙΌ N0:35 (ТТР-3000), 8Е0 ΙΌ N0:36 и 8Е0 ΙΌ N0:37, которые, каждая, кодируют КАСЕ-слитый белок из трех доменов в соответствии с альтернативными вариантами осуществления данного изобретения. Последовательность КАСЕ выделена жирным шрифтом.
Фиг. 6, Панель А, показывает сравнение доменов белков в КАСЕ человека и Ес-белке Ιβ гамма-1 человека, и точки расщепления, использованные для получения ТТР-3000 (в положении 136) и ТТР-4000 (в положении 251) в соответствии с альтернативными вариантами осуществления данного изобретения; и панель В показывает структуру доменов для ТТР-3000 и ТТР-4000 в соответствии с альтернативными вариантами осуществления данного изобретения.
Фиг. 7 показывает результаты анализа связывания ίη νίίτο для 5КАСЕ и КАСЕ-слитых белков ТТР4000 (ТТ4) и ТТР-3000 (ТТ3) с амилоидом-бета (А-бета), 8100Ь (8100) и амфотерином (Ашрйо), в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения.
Фиг. 8 показывает результаты анализа связывания ίη νίίτο для КАСЕ-слитого белка ТТР-4000 (ТТ4) (Протеин) с амилоидом-бета в сравнении с отрицательным контролем, включающим в себя только реагенты иммунодетектирования (Только комплекс), и противодействие такому связыванию посредством антагониста КАСЕ (лиганда КАСЕ) в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобре
- 3 012586 тения.
Фиг. 9 показывает результаты анализа связывания ίη νίίτο для КАСЕ-слитого белка ТТР-3000 (ТТ3) (Протеин) с амилоидом-бета в сравнении с отрицательным контролем, включающим в себя только реагенты иммунодетектирования (Только комплекс), и противодействие такому связыванию посредством антагониста КАСЕ (лиганда КАСЕ) в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения.
Фиг. 10 показывает результаты анализа на основе клеток, измеряющего ингибирование 8100ЬКАСЕ-индуцированного продуцирования ΤΝΕ-α КАСЕ-слитыми белками ТТР-3000 (ТТ3) и ТТР-4000 (ТТ4) и &КАСЕ в соответствии с одним вариантом данного изобретения.
Фиг. 11 показывает фармакокинетический профиль для КАСЕ-слитого белка ТТР-4000 в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения, в котором каждая кривая представляет отличающееся животное в одних и тех же экспериментальных условиях.
Фиг. 12 показывает относительные уровни высвобождения Т№-а из клеток ТНР-1 вследствие стимуляции КАСЕ-слитым белком ТТР-4000 и стимуляции 1дС человека как меру воспалительной реакции в соответствии с одним вариантом данного изобретения.
Фиг. 13 показывает применение КАСЕ-слитого белка ТТР-4000 для уменьшения рестеноза у диабетических животных в соответствии с альтернативными вариантами данного изобретения, где панель А показывает, что КАСЕ-слитый белок ТТР-4000 уменьшал отношение интима/медиа в сравнении с отрицательным контролем (1дС), а панель В показывает, что КАСЕ-слитый белок ТТР-4000 уменьшал пролиферацию клеток гладких мышц зависимым от дозы образом.
Фиг. 14 показывает применение КАСЕ-слитого белка ТТР-4000 для уменьшения образования амилоида и когнитивной дисфункции у животных с болезнью Альцгеймера (АО) в соответствии с альтернативными вариантами данного изобретения, где панель А показывает, что КАСЕ-слитый белок ТТР-4000 уменьшал амилоидную нагрузку в головном мозге, а панель В показывает, что КАСЕ-слитый белок ТТР4000 улучшал когнитивную функцию.
Фиг. 15 показывает кривые насыщения-связывания ТТР-4000 с различными иммобилизованными известными лигандами КАСЕ в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения.
Подробное описание
Для целей этого описания, если нет других указаний, все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакций и т. д., используемые в этом описании, должны пониматься как модифицируемые во всех случаях термином «приблизительно». Таким образом, если нет противоположного указания, численные параметры, представленные в следующем описании, являются приближениями, которые могут варьироваться в зависимости от желаемых свойств, которые авторы стремятся получить с использованием данного изобретения. И, наконец, и не в качестве попытки ограничения применения доктрины эквивалентов к объему формулы изобретения, каждый численный параметр должен, по меньшей мере, рассматриваться в свете количества сообщенных значимых чисел и с применением простых способов округления.
Не возражая против того, что численные диапазоны и параметры, устанавливающие широкий объем данного изобретения, являются приближенными, численные величины, представленные в конкретных примерах, авторы сообщают с максимальной возможной точностью. Однако любая численная величина неотъемлемо содержит определенные ошибки, обязательно происходящие из стандартных отклонений, обнаруживаемых в соответствующих измерениях испытаний. Кроме того, следует понимать, что все описанные здесь диапазоны включают в себя любые и все поддиапазоны, заключенные в них. Например, следует рассматривать, что указанный диапазон «1-10» включает в себя любые и все поддиапазоны между (и включительно) минимальной величиной 1 и максимальной величиной 10; т.е. все поддиапазоны, начиная с минимальной величины 1 или более, например 1-6,1, и кончая максимальной величиной 10 или менее, например 5,5-10. Кроме того, любая ссылка, о которой говорится, что она является «включенной здесь», должна пониматься как ссылка, включенная в ее полном объеме.
Дополнительно следует отметить, что используемые в этом описании единственные формы а, ап и Шс включают в себя множественные референты (относящиеся к ним слова), если они не ограничиваются явно и недвусмысленно одним референтом. Термин «или» используется взаимозаменяемо с термином «и/или», если в контексте нет другого указания.
Термины «часть» и «фрагмент» используются также взаимозаменяемо для обозначения частей полипептида, нуклеиновой кислоты или другой молекулярной конструкции.
В данном контексте термин «против хода» (слева, выше избранного остатка) относится к остатку, который является Ν-концевым относительно второго остатка, когда эта молекула является белком, или 5' относительно второго остатка, когда эта молекула является нуклеиновой кислотой. В этом контексте также, термин «по ходу» (справа, ниже избранного остатка) относится к остатку, который является Сконцевым относительно второго остатка, когда эта молекула является белком, или 3' относительно второго остатка, когда эта молекула является нуклеиновой кислотой.
Если нет другого определения, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют
- 4 012586 значение, обычно понимаемое специалистом с обычной квалификацией в данной области. Практики, в частности, отсылаются к Сштеи! Рго1оео1§ ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν (Аи8иЬе1) в отношении определений и терминов данной области. Аббревиатуры для аминокислотных остатков являются стандартными 3буквенными и/или 1-буквенными кодами, используемыми в данной области для обозначения одной из 20 обычных Ь-аминокислот.
«Нуклеиновая кислота» представляет собой полинуклеотид, такой как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) или рибонуклеиновая кислота (РНК). Этот термин включает в себя одноцепочечные нуклеиновые кислоты, двухцепочечные нуклеиновые кислоты и РНК и ДНК, полученные из нуклеотидных и нуклеозидных аналогов.
Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может быть использована для транспорта второй нуклеиновой кислоты в клетку. В одном варианте осуществления этот вектор делает возможной репликацию ДНК-последовательностей, встроенных в этот вектор. Этот вектор может содержать промотор для усиления экспрессии этой молекулы нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, в некоторых клетках-хозяевах. Векторы могут реплицироваться автономно (внехромосомно) или могут быть интегрированы в хромосому клетки-хозяина. В одном варианте осуществления вектор может быть экспрессионным (экспрессирующим) вектором, способным продуцировать белок, произведенным из по меньшей мере части последовательности нуклеиновой кислоты, встроенной в этот вектор.
Как известно в данной области, условия для гибридизации последовательностей нуклеиновых кислот могут быть описаны как находящиеся в диапазоне от низкой до высокой строгости. Обычно, условиями гибридизации высокой строгости называют промывку гибридов в низкосолевом буфере при высоких температурах. Гибридизация может состоять в фильтровании связанной ДНК с использованием условий гибридизации, стандартных в данной области, таких как 0,5 М ЫаНРОд, 7% додецилсульфат натрия (ДСН), при 65°С и промывании в 0,25 М ЫаНРОд, 3,5% ДСН с последующим промыванием 0.1х88С/0.1% ДСН при температуре в диапазоне от комнатной температуры до 68°С в зависимости от длины зонда (см., например, Аи8иЬе1, Р.М. е1 а1., 81юг1 РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 4'1' Еб., 011ар1ег 2, бо11п \Убеу & 8оп§, Ν.Υ.). Например, промывание высокой строгости предусматривает промывание в 6х88С/0,05% пирофосфат натрия при 37°С для олигонуклеотидного зонда из 14 оснований, или при 48°С для олигонуклеотидного зонда из 17 оснований, или при 55°С для олигонуклеотидного зонда из 20 оснований, или при 60°С для олигонуклеотидного зонда из 25 оснований, или при 65°С для нуклеотидного зонда с длиной приблизительно 250 нуклеотидов. Зонды нуклеиновых кислот могут быть помечены радионуклеотидами концевым мечением, например [у-32Р]АТР, или включением радиоактивно меченых нуклеотидов, таких как [а-32Р]бСТР, случайным мечением праймера. Альтернативно, зонды могут быть помечены включением биотинилированных или меченых флуоресцеином нуклеотидов, и этот зонд может быть детектирован с использованием стрептавидина или антител против флуоресцеина.
В данном контексте «малые органические молекулы» являются молекулами с молекулярной массой, меньшей чем 2000 Да, которые содержат по меньшей мере один атом углерода.
«Полипептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо для описания молекул белков, которые содержат частичные или полноразмерные белки.
Термин «слитый белок» относится к белку или полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, полученную из двух или более белков. Слитый белок может также включать в себя связывающие районы аминокислот между аминокислотными частями, полученными из отдельных белков.
В данном контексте не-КАОЕ-полипептид является любым полипептидом, который не произведен из КАСЕ или его фрагмента. Такие не-КАСЕ-полипептиды включают в себя пептиды иммуноглобулина, димеризующие полипептиды, стабилизирующие полипептиды, амфифильные пептиды или полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, которые обеспечивают «метки» для нацеливания или очистки этого белка.
В данном контексте «белки иммуноглобулинов» могут включать в себя тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть. В одном варианте осуществления частью тяжелой цепи может быть Ее-фрагмент или его часть. В данном контексте Ес-фрагмент содержит шарнирный полипептид тяжелой цепи и домены СН2 и СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина, в мономерной или димерной форме. Или СН1 и Есфрагмент могут быть использованы в качестве иммуноглобулинового полипептида. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: 1дС (γ), 1дМ (μ), ΙμΌ (δ), 1дЕ (ε) или 1дА (α). Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: 1дС1 (γ1), 1дС2 (γ2), 1дС3 (γ3), 1дС4 (γ4), 1дА1 (α1), 1дА2 (α2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Пример биологической активности, которая может быть изменена, включает в себя уменьшение способности изотипа связываться с некоторыми Ес-рецепторами, например, модификацией шарнирной области.
Термины «идентичность» или «процентная идентичность» относится к идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя последовательностями нуклеиновых кислот. Процентная идентичность может быть определена сопоставлением двух по- 5 012586 следовательностей и относится к количеству идентичных остатков (например, аминокислот или нуклеотидов) в положениях, общих для сравниваемых последовательностей. Сопоставление и сравнение последовательностей могу проводиться с использованием алгоритмов, стандартных в данной области (например, 8ιηί11ι апб \Уа1сгшап. 1981, Абт. Αρρί. Ма1й. 2:482; №ееб1етап апб ^иизсй, 1970, 1. Μοί. ΒίοΙ. 48:443; Реагзоп апб Ыртап, 1988, Ргос. №а!1. Асаб. 8с1. И8А, 85:2444), или с использованием компьютеризованных версий этих алгоритмов (ХУйсопып Сепебсз 8оП\саге Раскаде Ке1еа5е 7.0, Сепебсз Сотри1ет Стоир, 575 8с1епсе Опте, Мабкоп, VI), публично доступных в виде ВЬА8Т и РА8ТА. Для сравнения последовательностей может быть использована также программа ΕΝΤΚΕΖ, доступная через №Шопа1 Иъбипез ок НеаШт ВеШезба ΜΌ. В одном варианте осуществления, процентная идентичность двух последовательностей может быть определена с использованием ССС с весом гэпа 1, так что гэп каждой аминокислоты является взвешенным, как если бы было несовпадение единственной аминокислоты между этими двумя последовательностями.
В данном контексте термин «консервативные остатки» относится к аминокислотам, которые являются одинаковыми среди множества белков, имеющих одну и ту же структуру и/или функцию. Область консервативных остатков может быть важной для структуры и функции белка. Таким образом, смежные консервативные остатки, идентифицированные в трехмерном белке, могут быть важными для структуры и функции белка. Для нахождения консервативных остатков или консервативных районов трехмерной структуры может быть выполнено сравнение последовательностей для одних и тех же или сходных белков из разных видов или индивидуумов одного и того же вида.
В данном контексте термин «гомолог» обозначает полипептид, имеющий степень гомологии с аминокислотной последовательностью дикого типа. Сравнения гомологии могут проводиться визуально или, более часто, с использованием легко доступных программ сравнения последовательностей. Эти коммерчески доступные компьютерные программы могут рассчитывать процентную гомологию между двумя или более последовательностями (например, ^ИЬит, V.! апб Ыртап, Ό.Τ, 1983, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 80:726-730). Например, гомологичными последовательностями могут считаться последовательности, которые включают в себя аминокислотные последовательности, которые в альтернативных вариантах осуществления являются идентичными по меньшей мере на 75%, идентичными на 85%, идентичными на 90%, идентичными на 95% или идентичными на 98% относительно друг друга.
В данном контексте «домен» полипептида или белка содержит район вдоль полипептида или белка, который содержит независимую единицу. Домены могут определяться по структуре, последовательности и/или биологической активности. В одном варианте осуществления домен полипептида может содержать район белка, который укладывается таким образом, что он является по существу независимым от остальной части этого белка. Домены могут быть идентифицированы с использованием баз данных доменов, таких как, но не только, РЕАМ, РИОСОМ, РКО81ТЕ, ВЬОСК8, РКП№Т8, 8ВА8Е, 18КЕС РКОЕ1ЬЕ8, 8АМКТ и РКОСЬА88.
В данном контексте «иммуноглобулиновым доменом» является последовательность аминокислот, которая является структурно гомологичной, или идентичной, домену иммуноглобулина. Длина этой последовательности аминокислот иммуноглобулинового домена может быть любой длиной. В варианте осуществления иммуноглобулиновый домен может быть меньшим по длине, чем 250 аминокислот. В варианте-примере иммуноглобулиновый домен может иметь длину приблизительно 80-150 аминокислот. Например, вариабельный район и районы Сн1, Сн2 и Сн3 1дС, каждый, являются иммуноглобулиновыми доменами. В другом примере вариабельный район, районы Сн1, Сн2, Сн3 и Сн4 1дМ, каждый, являются иммуноглобулиновыми доменами.
В данном контексте «иммуноглобулиновый домен КАСЕ» является последовательностью аминокислот из белка КАСЕ, которая является структурно гомологичной, или идентичной, домену иммуноглобулина. Например, иммуноглобулиновый домена КАСЕ может содержать У-домен КАСЕ, 1д-подобный домен С2-типа 1 КАСЕ (С1-домен) или 1д-подобный домен С2-типа 2 КАСЕ (С2-домен).
В данном контексте междоменный линкер содержит полипептид, который соединяет два домена вместе. Ес-шарнирная часть является примером междоменного линкера в 1дС.
В данном контексте термин непосредственно связанный идентифицирует ковалентную связь между двумя различными группами (например, последовательностями нуклеиновых кислот, полипептидами, доменами полипептидов), которая не имеет промежуточных атомов между двумя группами, которые связываются.
В данном контексте лигандсвязывающий домен обозначает домен белка, ответственный за связывание лиганда. Термин лигандсвязывающий домен включает в себя гомологи лигандсвязывающего домена или его части. В этом отношении, произвольные аминокислотные замены могут быть произведены в лигандсвязывающем сайте на основании сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности или гидрофильности остатков, пока сохраняется специфичность связывания этого лигандсвязывающего домена.
В данном контексте лигандсвязывающий сайт содержит остатки в белке, которые непосредственно взаимодействуют с лигандом, или остатки, участвующие в позиционировании этого лигнада в тесной близости к тем остаткам, которые непосредственно взаимодействуют с этим лигандом. Взаимодействие
- 6 012586 остатков в лигандсвязывающем сайте может определяться пространственной близостью этих остатков к лиганду в модели или структуре. Термин лигандсвязывающий сайт включает в себя гомологи лигандсвязывающего сайта или его части. В этом отношении произвольные аминокислотные замены могут быть произведены в лигандсвязывающем сайте на основании сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности или гидрофильности остатков, пока сохраняется специфичность связывания этого лигандсвязывающего сайта. Лигандсвязывающий сайт может существовать в одном или нескольких лигандсвязывающих доменах белка или полипептида.
В данном контексте термин «взаимодействуют» относится к состоянию близости между лигандом или соединением, или их частями или фрагментами, и частью второй представляющей интерес молекулы. Это взаимодействие может быть нековалентным, например, в результате образования водородной связи, вандерваальсовых взаимодействий или электростатических или гидрофобных взаимодействий, или оно может быть ковалентным.
В данном контексте «лиганд» обозначает молекулу, или соединение, или молекулярную частицу, которые взаимодействуют с лигандсвязывающим сайтом, в том числе субстраты или аналоги или их части. Как описано здесь, термин «лиганд» может обозначать соединения, которые связываются с представляющим интерес белком. Лигандом может быть агонист, антагонист или модулятор. Или лиганд может не иметь биологического действия. Лиганды могут включать в себя, но не ограничиваются ими, ингибиторы с малыми молекулами. Эти малые молекулы могут включать в себя пептиды, пептидомиметики, органические соединения и т.п. Лиганды могут включать в себя также полипептиды и/или белки.
В данном контексте модуляторное соединение обозначает молекулу, которая изменяет или переделывает биологическую активность представляющей интерес молекулы. Модуляторное соединение может увеличивать или уменьшать активность или изменять физические или химические характеристики или функциональные или иммунологические свойства представляющей интерес молекулы. Для ВАСЕ, модуляторное соединение может увеличивать или уменьшать активность или изменять характеристики или функциональные или иммунологические свойства ВАСЕ или его части. Модуляторное соединение может включать в себя природные и/или химически синтезированные или искусственные пептиды, модифицированные пептиды (например, фосфопептиды), антитела, углеводы, моносахариды, олигосахариды, полисахариды, гликолипиды, гетероциклические соединения, нуклеозиды или нуклеотиды или их части и малые органические или неорганические молекулы. Модуляторное соединение может быть эндогенным физиологическим соединением, или оно может быть природным или синтетическим соединением. Или это модуляторное соединение может быть малой органической молекулой. Термин модуляторное соединение включает в себя также химически модифицированные лиганд или соединение и включает в себя изомеры и рацемические формы.
Агонист является соединением, которое связывается с рецептором с образованием комплекса, который индуцирует фармакологическую реакцию, специфическую в отношении участвующего рецептора.
Антагонист является соединением, которое связывается с агонистом или рецептором с образованием комплекса, который не вызывает фармакологической реакции и может ингибировать биологическую реакцию, индуцированную агонистом.
Таким образом, агонисты ВАСЕ могут связываться с ВАСЕ и стимулировать ВАСЕ-опосредуемые клеточные процессы, а антагонисты ВАСЕ могут ингибировать ВАСЕ-опосредуемые клеточные процессы, препятствуя их стимуляции агонистом ВАСЕ. Например, в одном варианте осуществления клеточный процесс, стимулируемый агонистами ВАСЕ, включает в себя активацию транскрипции гена ΤΝΕ-α.
Термин пептидомиметики обозначает структуры, которые служат в качестве заменителей пептидов во взаимодействиях между молекулами (Могдап с1 а1., 1989, Апп. Веройя Меб. Сйеш., 24:243-252). Пептидомиметики могут включать в себя синтетические структуры, которые могут содержать или могут не содержать аминокислоты и/или пептидные связи, но сохраняют структурные и функциональные признаки пептида или агониста или антагониста. Пептидомиметики включают в себя также пептоиды, олигопептоиды (81шоп е1 а1., 1972, Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8с1. И8А, 89:9367); и пептидные библиотеки, содержащие пептиды сконструированной длины, представляющие все возможные последовательности аминокислот, соответствующие пептиду, агонисту или антагонисту данного изобретения.
Термин «излечение» относится к улучшению симптома заболевания или нарушения и может включать в себя излечение данного нарушения, по существу предотвращение возникновения этого нарушения или улучшение состояния субъекта. Термин «лечение» обозначает в данном контексте полный спектр способов лечения для конкретного нарушения, от которого страдает пациент, в том числе ослабление одного симптома или большинства симптомов, вызываемых этим нарушением, излечение конкретного нарушения или предотвращение возникновения этого нарушения.
В данном контексте термин «ЕС5о» определяется как концентрация агента, которая приводит к 50% измеренного биологического действия. Например, ЕС50 терапевтического агента, имеющего измеримое биологическое действие, может быть величиной, при которой этот агент вызывает 50% этого биологического действия.
В данном контексте термин 1С50 определяется как концентрация агента, которая приводит к 50% ингибированию измеряемого действия. Например, 1С50 антагониста связывания ВАСЕ может быть вели- 7 012586 чиной, при которой этот антагонист уменьшает связывание лиганда с лигандсвязывающим сайтом КАСЕ на 50%.
В данном контексте эффективное количество обозначает количество агента, которое является эффективным для получения желаемого действия в субъекте. Термин терапевтически эффективное количество обозначает количество лекарственного средства или фармацевтического агента, которое будет индуцировать терапевтическую реакцию животного или человека, которую стремятся получить. Фактическая доза, которая содержит это эффективное количество, может зависеть от способа введения, размера и здоровья субъекта, подлежащего лечению нарушения и т.п.
Термин фармацевтически приемлемый носитель может относиться в данном контексте к соединениям и композициям, которые пригодны для применения у субъектов-людей и субъектов-животных, например, к терапевтическим композициям, вводимым для лечения КАСЕ-опосредуемого нарушения или заболевания.
Термин фармацевтическая композиция обозначает в данном контексте композицию, которая может вводиться млекопитающему-хозяину, например, перорально, парентерально, топически, ингаляцией, в виде спрея, интраназально или ректально, в унифицированных дозированных готовых формах, содержащих общепринятые нетоксичные носители, разбавители, адъюванты, эксципиенты и т.п.
Термин парентеральные включает в себя, в данном контексте, подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутриполостные инъекции или инфузионные способы.
КАСЕ-слитые белки
Варианты осуществления данного изобретения включают в себя КАСЕ-слитые белки, способы получения таких слитых белков и способы применения таких слитых белков. Данное изобретение может быть осуществлено различными путями.
Например, варианты осуществления данного изобретения обеспечивают слитые белки, содержащие полипептид КАСЕ, связанный со вторым, не-КАСЕ-полипептидом. В одном варианте осуществления слитый белок может содержать лигандсвязывающий сайт КАСЕ. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт содержит наиболее Ν-концевой домен слитого белка. Лигандсвязывающий сайт КАСЕ может содержать У-домен КАСЕ или его часть. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт КАСЕ содержит 8Е0 ΙΌ N0:9 или последовательность, идентичную ей на 90%, или 8Е0 ΙΌ N0:10 или последовательность, идентичную ей на 90%.
В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может быть связан с полипептидом, содержащим иммуноглобулиновый домен или часть (например, его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте осуществления полипептид, содержащий иммуноглобулиновый домен, содержит часть по меньшей мере одного из доменов Сн2 или Сн3 1дС человека.
Белок или полипептид КАСЕ может содержать полноразмерный белок КАСЕ человека (например, 8Е0 ΙΌ N0:1) или фрагмент КАСЕ человека. В данном контексте, фрагмент полипептида КАСЕ имеет по меньшей мере 5 аминокислот в длину, может быть большим, чем 30 аминокислот в длину, но является меньшим, чем полная аминокислотная последовательность. В альтернативных вариантах осуществления полипептид КАСЕ может содержать последовательность, которая является на 70, или 80, или 85, или 90% идентичной КАСЕ человека или его фрагменту. Например, в одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать КАСЕ человека или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, №ерег е! а1., (1992)). Или КАСЕ человека может содержать полноразмерный КАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ΙΌ N0:2 или 8Е0 ΙΌ N0:3) (фиг. 1А и 1В) или частью этой аминокислотной последовательности.
Слитые белки данного изобретения могут также содержать кКАСЕ (например, 8Е0 ΙΌ N0:4), полипептид, на 90% идентчиный кКАСЕ, или фрагмент кКАСЕ. В данном контексте кКАСЕ является белком КАСЕ, который не включает в себя трансмембранный район или цитоплазматический хвост (Рагк е! а1., №1Ц.1ге Меб., 4:1025-1031 (1998)). Например, полипептид КАСЕ может содержать кКАСЕ человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, №ерег е! а1., (1992)). Или полипептид КАСЕ может содержать кКАСЕ человека с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ΙΌ N0:5 или 8Е0 ΙΌ N0:6) (фиг. 1С) или частью этой аминокислотной последовательности.
В других вариантах осуществления белок КАСЕ может содержать У-домен КАСЕ (например, 8Е0 ΙΌ N0:7 или 8Е0 ΙΌ N0:8: фиг. ΙΌ) (№ерег е! а1., (1992); 8ейш1б1 е! а1. (1997)). Или может быть использована последовательность, на 90% идентичная У-домену КАСЕ или его фрагменту.
Или белок КАСЕ может содержать фрагмент У-домена КАСЕ (например, 8Е0 ΙΌ N0:9 или 8Е0 ΙΌ N0:10: фиг. 1Ό). В одном варианте осуществления белок КАСЕ может содержать лигандсвязывающий сайт. В одном варианте осуществления этот лигандсвязывающий сайт может содержать 8Е0 ΙΌ N0:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или 8Е0 ΙΌ N0:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Еще в одном варианте осуществления этот фрагмент КАСЕ является синтетическим пептидом.
Таким образом, полипептид КАСЕ, используемый в слитых белках данного изобретения, может содержать фрагмент полноразмерного КАСЕ. Как известно в данной области, КАСЕ содержит три имму- 8 012586 ноглобулинподобных полипептидных домена, У-домен и С1- и С2-домены, каждый из которых связан с каждым другим междоменным линкером. Полноразмерный КАСЕ включает в себя также трансмембранный полипептид и цитоплазматический хвост справа (С-концевой) от С2-домена и связанный с С2доменом.
В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ не включает в себя никакой сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность КАСЕ может содержать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 полноразмерного КАСЕ.
Например, полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-116 КАСЕ человека (5ЕС ГО N0:7) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-116 КАСЕ человека (5Е0 ГО N0:8) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену КАСЕ. Или полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 124-221 КАСЕ человека (5Е0 ГО N0:11) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С1-домену КАСЕ. В другом варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 227-317 КАСЕ человека (5Е0 ГО N0:12) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С2-домену КАСЕ человека. Или полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-123 КАСЕ человека (5Е0 ГО N0:13) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-123 КАСЕ человека (5Е0 ГО N0:14) или последовательность на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену КАСЕ человека и междоменному линкеру справа. Или полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-226 КАСЕ человека (5Е0 ГО N0:17) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-226 КАСЕ человека (5Е0 ГО N0:18) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену, С1-домену и междоменному линкеру, связывающему эти два домена. Или полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-339 КАСЕ человека (5Е0 ГО N0:5) или последовательность, на 90% идентичную ей, или 24-339 КАСЕ человека (5Е0 ГО N0:6) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую &КАСЕ (т.е. кодирующую У-, С1- и С2-домены и междоменные линкеры). Или могут быть использованы фрагменты каждой из этих последовательностей.
Слитый белок может включать в себя несколько типов пептидов, которые не произведены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид слитого белка может содержать полипептид, произведенный из иммуноглобулина. В одном варианте осуществления этот иммуноглобулиновый полипептид может содержать тяжелую цепь иммуноглобулина или ее часть (т. е. фрагмент). Например, фрагмент тяжелой цепи может содержать полипептид, произведенный из Ес-фрагмента иммуноглобулина, где этот Ес-фрагмент содержит шарнирный полипептид тяжелой цепи и домены Сц2 и Сц3 тяжелой цепи иммуноглобулина в виде мономера. Эта тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: 1дС (γ), 1дМ (μ), ΙμΩ (δ), 1дЕ (ε) или 1дА (α). Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: 1дС1 (γ1), 1дС2 (γ2), 1дС3 (γ3), 1дС4 (γ4), 1дА1 (α1), 1дА2 (α2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Второй полипептид может содержать домены Сц2 и Сц3 1дС 1 человека или части любого, или обоих, из этих доменов. В качестве вариантов-примеров, полипептид, содержащий домены Сц2 и Сн3 1дС1 человека или их часть, может содержать 8Е0 ГО N0:38 или 8Е0 ГО N0:40.
Ес-часть цепи иммуноглобулина может быть провоспалительной ίη νίνο. Таким образом, в одном варианте осуществления, КАСЕ-слитый белок данного изобретения содержит междоменный линкер, полученный из КАСЕ, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина.
Таким образом, в одном варианте осуществления слитый белок может дополнительно содержать полипептид КАСЕ, непосредственно связанный с полипептидом, содержащим домен Сн2 иммуноглобулина, или фрагмент, или часть домена Сн2 иммуноглобулина. В одном варианте осуществления этот домен Сн2, или его фрагмент, содержит 8Е0 ГО N0:42. В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать лигандсвязывающий сайт. Лигандсвязывающий сайт КАСЕ может содержать Удомен КАСЕ или его часть. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт КАСЕ содержит 8Е0 ГО N0:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или 8Е0 ГО N0:10 или последовательность, на 90% идентичную ей.
Полипептид КАСЕ, используемый в слитых белках данного изобретения, может содержать иммуноглобулиновый домен КАСЕ. Дополнительно или альтернативно, этот фрагмент КАСЕ может содержать междоменный линкер. Или полипептид КАСЕ может содержать иммуноглобулиновый домен КАСЕ, связанный с левым (т.е. более близким к №концу) или правым (т.е. более близким к С-концу) междоменным линкером. Еще в одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать два (или более) иммуноглобулиновых домена КАСЕ, каждый из которых связан с каждым другим междоменным линкером. Кроме того, полипептид КАСЕ может содержать множественные иммуноглобулиновые домены КАСЕ, связанные друг с другом одним или несколькими междоменными линкерами и имеющие концевой междоменный линкер, присоединенный к ^концевому иммуноглобулиновому домену КАСЕ и/или С-концевому иммуноглобулиновому домену. Дополнительные комбинации иммуноглобулиновых доменов КАСЕ и междоменных линкеров находятся в объеме данного изобретения.
В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ содержит междоменный линкер КАСЕ, свя- 9 012586 занный с иммуноглобулиновым доменом КАСЕ таким образом, что С-концевая аминокислота этого иммуноглобулинового домена КАСЕ связана с Ν-концевой аминокислотой междоменного линкера, а Сконцевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно связана с Ν-концевой аминокислотой полипептида, содержащего домен Сн2 иммуноглобулина, или его фрагмент. Полипептид, содержащий домен Сн2 иммуноглобулина, может содержать домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. Например, полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3, или их часть, 1дС1 человека, может содержать 8ЕО ΙΌ N0:38 или 8Е0 ГО N0:40.
Как описано выше, слитый белок данного изобретения может содержать единственный домен или множественные домены из КАСЕ. Полипептид КАСЕ, содержащий междоменный линкер, связанный с доменом полипептида КАСЕ, может также содержать фрагмент полноразмерного белка КАСЕ. Например, полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-136 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:15) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-136 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:16) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену КАСЕ и междоменному линкеру справа. Или полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-251 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:19) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-251 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:20) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену, С1-домену, междоменному линкеру, связывающему эти два домена, и второму междоменному линкеру справа от С1.
Например, в одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Есполипептида человека. Этот слитый белок может содержать первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер КАСЕ, связанные со вторым иммуноглобулиновым доменом КАСЕ и вторым междоменным линкером КАСЕ, так что ^концевая аминокислота первого междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой первого иммуноглобулинового домена КАСЕ, ^концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ связана с С-концевой аминокислотой первого междоменного линкера, ^концевая аминокислота второго междоменного линкера связана с Сконцевой аминокислотой второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно связана с ^концевой аминокислотой иммуноглобулинового домена Сн2. В одном варианте осуществления КАСЕ-слитый белок из четырех доменов может содержать 8Е0 ГО N0:32. В альтернативных вариантах осуществления КАСЕ-слитый белок из четырех доменов содержит 8Е0 ГО N0:33 или 8Е0 ГО N0:34.
Альтернативно слитый белок из трех доменов может содержать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес-полипептида человека. Например, этот слитый белок может содержать единственный иммуноглобулиновый домен КАСЕ, связанный через междоменный линкер КАСЕ с ^концевой аминокислотой иммуноглобулинового домена Сн2 или частью иммуноглобулинового домена Сн2. В одном варианте осуществления КАСЕ-слитый белок из трех доменов может содержать 8Е0 ГО N0:35. В альтернативных вариантах осуществления, КАСЕ-слитый белок из трех доменов может содержать 8Е0 ГО N0:36 или 8Е0 ГО N0:37.
Междоменный линкерный фрагмент КАСЕ может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от иммуноглобулинового домена КАСЕ и, следовательно, связана с ним. Например, для У-домена КАСЕ этот междоменный линкер может содержать аминокислотные последовательности, которые находятся природно справа от У-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать 8Е0 ГО N0:21, соответствующую аминокислотам 117-123 полноразмерного КАСЕ. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности КАСЕ. Например, может быть использован междоменный линкер, содержащий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5 или 1-10 или 1-15 аминокислот) слева и справа от 8Е0 ГО N0:21. Так, в одном варианте осуществления междоменный линкер содержит 8Е0 ГО N0:23, содержащую аминокислоты 117-136 полноразмерного КАСЕ. Или могут быть использованы фрагменты 8Е0 ГО N0:21 с делецией, например, 1, 2 или 3 аминокислот из любого конца этого линкера. В альтернативных вариантах осуществления этот линкер может содержать последовательность, которая на 70% идентична, или на 80% идентична, или на 90% идентична 8Е0 ГО N0:21 или 8Е0 ГО N0:23.
Для С1-домена КАСЕ этот линкер может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от этого С1-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать 8Е0 ГО N0:22, соответствующую аминокислотам 222-251 полноразмерного КАСЕ. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности КАСЕ. Например, может быть использован линкер, содержащий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от 8Е0 ГО N0:22. Или могут быть использованы фрагменты 8Е0 ГО N0:22 с делецией, например, 1-3, 1-5 или 1-10 или 1-15 аминокислот из любого конца этого линкера. Например, в одном варианте осуществления междоменный линкер КАСЕ может содержать 8Е0 ГО N0:24, соответствующую аминокислотам 222-226. Или междоменный линкер может содержать 8Е0 ГО N0:44, соответствующую аминокислотам 318-342 КАСЕ.
Способы получения КАСЕ-слитых белков
Данное изобретение относится также к способу получения КАСЕ-слитого белка. Таким образом, в
- 10 012586 одном варианте осуществления данное изобретение относится к способу получения КАСЕ-слитого белка, предусматривающему стадию ковалентного связывания полипептида КАСЕ, связанного со вторым, не-КАСЕ-полипептидом, где полипептид КАСЕ содержит лигандсвязывающий сайт КАСЕ. Например, эти связанные полипептид КАСЕ и второй, не-КАСЕ-полипептид, могут кодироваться рекомбинантной конструкцией ДНК. Этот способ может дополнительно предусматривать стадию включения этой конструкции ДНК в экспрессирующий вектор. Этот способ может также предусматривать стадию введения этого экспрессирующего вектора в клетку-хозяина.
Например, варианты данного изобретения обеспечивают слитые белки, содержащие полипептид КАСЕ, связанный со вторым, не-КАСЕ-полипептидом. В одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать лигандсвязывающий сайт КАСЕ. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт содержит наиболее Ν-концевой домен слитого белка. Лигандсвязывающий сайт КАСЕ может содержать У-домен КАСЕ или его часть. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт КАСЕ содержит 8ЕО ГО N0:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или 8Е0 ГО N0:10 или последовательность, на 90% идентичную ей.
В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может быть связан с полипептидом, содержащим иммуноглобулиновый домен или часть (например, его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте осуществления полипептид, содержащий иммуноглобулиновый домен, содержит часть по меньшей мере одного из доменов Сн2 или Сн3 1дС человека.
Этот слитый белок может быть сконструирован способами рекомбинантных ДНК. Например, в одном варианте осуществления данное изобретение может содержать выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид КАСЕ, связанный со вторым, не-КАСЕ-полипептидом. В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать лигандсвязывающий сайт КАСЕ.
Белок или полипептид КАСЕ может содержать полноразмерный КАСЕ (например, 8Е0 ГО N0:1) или фрагмент КАСЕ человека. В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ не содержит никаких остатков сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность КАСЕ может содержать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 полноразмерного КАСЕ (8Е0 ГО N0:1). В альтернативных вариантах осуществления полипептид КАСЕ может содержать последовательность на 70, или 80, или 90% идентичную КАСЕ человека или его фрагменту. Например, в одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать КАСЕ человека или его фрагмент с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, №ерег е! а1., (1992)). Или КАСЕ человека может содержать полноразмерный КАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ГО N0:2 или 8Е0 ГО N0:3) (фиг. 1А и 1В) или частью этой аминокислотной последовательности. Слитые белки данного изобретения могут также содержать кКАСЕ (например, 8Е0 ГО N0:4), полипептид, на 90% идентичный &КАСЕ, или фрагмент &КАСЕ. Например, полипептид КАСЕ может содержать &КАСЕ человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, №ерег е! а1., (1997)). Или КАСЕ человека может содержать &КАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ГО N0:5 или 8Е0 ГО N0:6) (фиг. 1С) или частью этой аминокислотной последовательности. В других вариантах осуществления белок КАСЕ может содержать У-домен (например, 8Е0 ГО N0:7 или 8Е0 ГО N0:8; фиг. 1Ό). Или может быть использована последовательность, на 90% идентичная У-домену или его фрагменту. Или белок КАСЕ может содержать фрагмент КАСЕ, содержащий часть У-домена КАСЕ (например, 8Е0 ГО N0:9 или 8Е0 ГО N0:10, фиг. 1Ό). В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт может содержать 8Е0 ГО N0:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или 8Е0 ГО N0:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Еще в одном варианте осуществления фрагмент КАСЕ является синтетическим пептидом.
В одном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит 8Е0 ГО N0:25, кодирующую аминокислоты 1-118 КАСЕ человека, или ее фрагмент. Например, последовательность, содержащая нуклеотиды 1-348 8Е0 ГО N0:25, может быть использована для кодирования аминокислот 1-116 КАСЕ человека. Или эта нуклеиновая кислота может содержать 8Е0 ГО N0:26 для кодирования аминокислот 1-123 КАСЕ человека. Или эта нуклеиновая кислота может содержать 8Е0 ГО N0:27 для кодирования аминокислот 1-136 КАСЕ человека. Или эта нуклеиновая кислота может содержать 8Е0 ГО N0:28 для кодирования аминокислот 1-230 КАСЕ человека. Или эта нуклеиновая кислота может содержать 8Е0 ГО N0:29 для кодирования аминокислот 1-251 КАСЕ человека. Или фрагменты этих последовательностей нуклеиновых кислот могут быть использованы для кодирования фрагментов полипептида КАСЕ.
Слитый белок может включать в себя несколько типов пептидов, которые не произведены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид этого слитого белка может содержать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: 1дС (γ), 1дМ (μ), 1дЭ (δ), 1дЕ (ε) или 1дА (α). Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: 1дС1 (γ1), 1дС2 (γ2), 1дС3 (γ3), 1дС4 (γ4), 1дА1 (α1), 1дА2 (α2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Второй полипептид может содержать домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека или части лю
- 11 012586 бого, или обоих, из этих доменов. В качестве вариантов-примеров, полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека или их часть, может содержать 8ЕО ΙΌ N0:38 или 8Е0 ГО N0:40. Этот пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ГО N0:39 или 8Е0 ГО N0:41.
Ее-часть цепи иммуноглобулина может быть провоспалительной ίη νίνο. Таким образом, в одном варианте осуществления КАСЕ-слитый белок данного изобретения содержит междоменный линкер, полученный из КАСЕ, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина. Например, в одном варианте осуществления слитый белок может кодироваться рекомбинантной конструкцией ДНК. Этот способ может также предусматривать стадию включения ДНК-конструкции в экспрессирующий вектор. Этот способ может также включать в себя трансфекцию этого экспрессирующего вектора в клетку-хозяина.
Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение относится к способу получения КАСЕ-слитого белка, предусматривающему стадию ковалентного связывания полипептида КАСЕ с полипептидом, содержащим Сн2-домен иммуноглобулина или часть Сн2-домена иммуноглобулина. В одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать лигандсвязывающий сайт КАСЕ. Лигандсвязывающий сайт КАСЕ может содержать У-домен КАСЕ или его часть. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт КАСЕ содержит 8Е0 ГО N0:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или 8Е0 ГО N0:10 или последовательность, на 90% идентичную ей.
Например, в одном варианте осуществления данное изобретение содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид КАСЕ, непосредственно связанный с полипептидом, содержащим Сн2-домен иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте осуществления этот Сн2-домен, или его фрагмент, содержит 8Е0 ГО N0:42. Этот второй полипептид может содержать домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека. В качестве варианта-примера, полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека, может содержать 8Е0 ГО N0:38 или 8Е0 ГО N0:40. Этот пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ГО N0:39 или 8Е0 ГО N0:41.
В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать междоменный линкер КАСЕ, связанный с иммуноглобулиновым доменом КАСЕ таким образом, что С-концевая аминокислота этого иммуноглобулинового домена КАСЕ связана с №концевой аминокислотой междоменного линкера, а С-концевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно связана с №концевой аминокислотой полипептида, содержащего домен Сн2 иммуноглобулина, или его фрагмент. Полипептид, содержащий домен Сн2 иммуноглобулина, может содержать полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. Например, полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека, или их часть, может содержать 8Е0 ГО N0:38 или 8Е0 ГО N0:40.
Слитый белок данного изобретения может содержать единственный домен или множественные домены из КАСЕ. Полипептид КАСЕ, содержащий междоменный линкер, связанный с иммуноглобулиновым доменом КАСЕ, может также содержать фрагмент полноразмерного белка КАСЕ. Например, в одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес-полипептида человека. Этот слитый белок может содержать первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер КАСЕ, связанные со вторым иммуноглобулиновым доменом КАСЕ и вторым междоменным линкером КАСЕ, так что N-концевая аминокислота первого междоменного линкера связана с Сконцевой аминокислотой первого иммуноглобулинового домена КАСЕ, №концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ связана с С-концевой аминокислотой первого междоменного линкера, №концевая аминокислота второго междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно связана с №концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен Сн2, или его фрагмент. Например, полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-251 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:19) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-251 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:20) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену, С1-домену, междоменному линкеру, связывающему эти два домена, и второму междоменному линкеру, справа от С1. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая 8Е0 ГО N0:30 или ее фрагмент, может кодировать КАСЕ-слитый белок из четырех доменов.
Альтернативно, слитый белок из трех доменов может содержать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес-полипептида человека. Например, этот слитый белок может содержать единственный иммуноглобулиновый домен КАСЕ, связанный через междоменный линкер КАСЕ с №концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен Сн2 или его фрагмент. Например, этот полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-136 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:15) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-136 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:16) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену КАСЕ и междоменному линкеру справа. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая 8Е0 ГО N0:31 или ее фрагмент, может кодировать КАСЕ-слитый белок из трех доменов.
- 12 012586
Междоменный линкерный фрагмент ЛАСЕ может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от иммуноглобулинового домена ЛАСЕ и, следовательно, связана с ним. Например, для У-домена ЛАСЕ, этот междоменный линкер может содержать аминокислотные последовательности, которые находятся природно справа от У-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать 8ЕЦ ΙΌ N0:21, соответствующую аминокислотам 117-123 полноразмерного ЛАСЕ. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности ЛАСЕ. Например, может быть использован междоменный линкер, содержащий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5 или 1-10 или 1-15 аминокислот) слева и справа от 8Е0 ΙΌ N0:21. Таким образом, в одном варианте осуществления междоменный линкер содержит 8ЕЦ ΙΌ N0:23, содержащую аминокислоты 117-136 полноразмерного ЛАСЕ. Или могут быть использованы фрагменты 8ЕЦ ΙΌ N0:21 с делецией, например, 1, 2 или 3 аминокислот из любого конца этого линкера. В альтернативных вариантах осуществления этот линкер может содержать последовательность, которая на 70% идентична, или на 80% идентична, или на 90% идентична 8Е0 ΙΌ N0:21 или 8Е0 ΙΌ N0:23.
Для С1-домена ЛАСЕ этот линкер может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от этого С1-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать 8Е0 ΙΌ N0:22, соответствующую аминокислотам 222-251 полноразмерного ЛАСЕ. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности ЛАСЕ. Например, может быть использован линкер, содержащий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от 8Е0 ΙΌ N0:22. Или могут быть использованы фрагменты 8Е0 ΙΌ N0:22 с делецией, например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот из любого конца этого линкера. Например, в одном варианте осуществления междоменный линкер ЛАСЕ может содержать 8Е0 ΙΌ N0:24, соответствующую аминокислотам 222-226. Или междоменный линкер может содержать 8Е0 ΙΌ N0:44, соответствующую аминокислотам 318-342 ЛАСЕ.
Этот способ может дополнительно предусматривать стадию включения конструкции ДНК в экспрессирующий вектор. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение относится к экспрессирующему вектору, который кодирует слитый белок, содержащий полипептид ЛАСЕ, непосредственно связанный с полипептидом, содержащим Сн2-домен иммуноглобулина или часть Сн2-домена иммуноглобулина. В одном варианте осуществления полипептид ЛАСЕ содержит конструкции, такие как описанные здесь, имеющие междоменный линкер ЛАСЕ, связанный с иммуноглобулиновым доменом ЛАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена ЛАСЕ связана с ^концевой аминокислотой междоменного линкера, а С-концевая аминокислота междоменного линкера ЛАСЕ непосредственно связана с ^концевой аминокислотой полипептида, содержащего Сн2-домен иммуноглобулина или его часть. Например, экспрессирующий вектор, используемый для трансфекции клеток, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0:30, или ее фрагмент, или 8Е0 ΙΌ N0:31, или ее фрагмент.
Кроме того, этот способ может дополнительно предусматривать стадию трансфекции клетки экспрессирующим вектором данного изобретения. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение содержит клетку, трансфицированную экспрессирующим вектором, который экспрессировал ЛАСЕ-слитый белок данного изобретения, так что эта клетка экспрессирует слитый белок, содержащий полипептид ЛАСЕ, непосредственно связанный с полипептидом, содержащим Сн2-домен иммуноглобулина или часть Сн2-домена иммуноглобулина. В одном варианте осуществления полипептид ЛАСЕ содержит конструкции, такие как конструкции, описанные выше, имеющие междоменный линкер ЛАСЕ, связанный с иммуноглобулиновым доменом ЛАСЕ, так что С-концевая аминокислота иммуноглобулинового домена ЛАСЕ связана с ^концевой аминокислотой междоменного линкера, а С-концевая аминокислота междоменного линкера ЛАСЕ непосредственно связана с ^концевой аминокислотой полипептида, содержащего Сн2-домен иммуноглобулина или его часть. Например, экспрессирующий вектор, используемый для трансфекции клеток, может содержать последовательность нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0:30, или ее фрагмент, или 8Е0 ΙΌ N0:31, или ее фрагмент.
Например, могут быть сконструированы плазмиды для экспрессии слитых белков ЛАСЕИдС Есслиянием различных длин 5'-кДНК-последовательности ЛАСЕ человека с 3'-кДНК-последовательностью Ιβ61 Ес (γ1) человека. Эти последовательности экспрессионной кассеты могут быть встроены в экспрессирующий вектор, такой как экспрессирующий вектор рсЭНА3.1 (ΙηνίίΓΟβοη. СА), с использованием стандартных рекомбинантных способов.
Этот способ может также включать в себя трансфекцию экспрессирующего вектора в клеткухозяина. В одном варианте осуществления рекомбинант может быть трансфицирован в клетки яичника китайского хомячка и оптимизирован для экспрессии. В альтернативных вариантах осуществления эти клетки могут продуцировать 0,1-20 г/л, или 0,5-10 г/л, или приблизительно 1-2 г/л.
Как известно в данной области, такие конструкции нуклеиновых кислот могут быть модифицированы мутацией, например, посредством ПЦР-амплификации нуклеиновой кислоты-матрицы с праймерами, содержащими представляющую интерес мутацию. Таким путем могут быть сконструированы полипептиды, имеющие варьирующуюся аффинность в отношении лигандов ЛАСЕ. В одном варианте осуществления мутированные последовательности могут быть на 90% или более идентичными с исходной
- 13 012586
ДНК. Такие варианты могут включать в себя нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются при строгих условиях (т.е. эквивалентных температурам, на приблизительно 20-27°С более низким, чем температура плавления (Тт) ДНК-дуплекса в 1 М соли).
Кодирующая последовательность может быть экспрессирована трансфекцией экспрессирующего вектора в подходящего хозяина. Например, рекомбинантные векторы могут быть стабильно трансфицированы в клетки яичника китайского хомячка (СНО), и клетки, экспрессирующие слитый белок, могут быть отобраны и клонированы. В одном варианте осуществления клетки, экспрессирующие рекомбинантную конструкцию, отбирают на кодируемую плазмидой устойчивость к неомицину, с использованием антибиотика С418. Индивидуальные клоны могут быть отобраны, и клоны, экспрессирующие высокие уровни рекомбинантного белка, детектированные при помощи Вестерн-блот-анализа клеточного супернатанта, могут быть размножены, и продукт этого гена может быть очищен аффинной хроматографией с использованием Белок А-колонок.
Варианты проб рекомбинантных нуклеиновых кислот, которые кодируют слитые белки данного изобретения, показаны на фигурах 2-5. Например, как описано выше, слитый белок, продуцируемый рекомбинантной ДНК-конструкцией, может содержать полипептид РАСЕ, слитый со вторым, не-РАСЕполипептидом. Этот слитый белок может содержать два домена, полученные из белка РАСЕ, и два домена, полученные из иммуноглобулина. Пример конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, ТТР-4000 (ТТ4), имеющий этот тип структуры, показан в виде фиг. 2 (8Е0 ΙΌ N0:30). Как показано на фиг. 2, кодирующая последовательность 1-743 (выделенная жирным шрифтом), кодирует Νконцевую последовательность РАСЕ, тогда как последовательность 754-1386 кодирует последовательность белка Бс 1дС.
Происходящий из 8Е0 ΙΌ N0:30 или последовательности, на 90% идентичной ей, слитый белок может содержать аминокислотную последовательность из четырех доменов 8Е0 ΙΌ N0:32 или полипептид с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ΙΌ N0:33 или 8Е0 ΙΌ N0:34) (фиг. 4). На фиг. 4 аминокислотная последовательность РАСЕ выделена жирным шрифтом. Иммуноглобулиновая последовательность является СН2- и СН3-иммуноглобулиновыми доменами Ι§0. Как показано на фиг. 6В, первые 251 аминокислот полноразмерного РАСЕ-слитого белка ТТР-4000 содержат в качестве последовательности полипептида РАСЕ сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-22/23, У-домен иммуноглобулина (в том числе лигандсвязывающий сайт), содержащий аминокислоты 23/24116, междоменный линкер, содержащий аминокислоты 117-123, второй иммуноглобулиновый домен (С1), содержащий аминокислоты 124-221, и справа междоменный линкер, содержащий аминокислоты 222-251.
В одном варианте осуществления слитый белок может необязательно содержать второй иммуноглобулиновый домен РАСЕ. Например, слитый белок может содержать один иммуноглобулиновый домен, происходящий из РАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, происходящих из Бс-полипептида человека. Пример конструкции нуклеиновой кислоты, кодирующей этот тип слитого белка, показан в виде фиг. 3 (8Е0 ΙΌ N0:31). Как показано на фиг. 3, кодирующая последовательность, содержащая нуклеотиды 1-408 (выделенные жирным шрифтом), кодирует ^концевую последовательность белка РАСЕ, тогда как последовательность, содержащая нуклеотиды 409-1041, кодирует последовательность белка Бс ^С1 (γ1).
Происходящий из 8Е0 ΙΌ N0:31 или последовательности, на 90% идентичной ей, слитый белок может содержать аминокислотную последовательность из трех доменов 8Е0 ΙΌ N0:35 или полипептид с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ΙΌ N0:36 или 8Е0 ΙΌ N0:37) (фиг. 5). На фиг. 5 аминокислотная последовательность РАСЕ выделена жирным шрифтом. Как показано на фиг. 6В, первые 136 аминокислот полноразмерного РАСЕ-слитого белка ТТР-3000 содержат в качестве последовательности полипептида РАСЕ сигнальную последовательность, содержащую аминокислоты 1-22/23, иммуноглобулиновый У-домен (в том числе лигандсвязывающий сайт), содержащий аминокислоты 23/24-116, междоменный линкер, содержащий аминокислоты 117-136.
Последовательность 137-346 включает в себя иммуноглобулиновые домены СН2 и СН3 Ι§0.
Слитые белки данного изобретения могут иметь улучшенную стабильность ίη νίνο в сравнении с полипептидами РАСЕ, не содержащими второго полипептида. Этот слитый белок может быть дополнительно модифицирован для увеличения стабильности, эффективности, активности и биодоступности. Таким образом, слитые белки данного изобретения могут быть модифицированы посттрансляционным процессингом или химической модификацией. Например, слитый белок может быть получен синтетически для включения Ь-, Ό- или неприродных аминокислот, альфа-дизамещенных аминокислот или N алкиламинокислот. Кроме того, белки могут быть модифицированы ацетилированием, ацилированием, АДФ-рибозилированием, амидированием, присоединением липидов, таких как фосфатидилинозит, образованием дисульфидных связей, и т.п. Кроме того, может быть добавлен полиэтиленгликоль для увеличения биологической стабильности слитого белка.
Связывание антагонистов РАСЕ с РАСЕ-слитыми белками.
Слитые белки данного изобретения могут иметь ряд применений. Например, слитые белки данного изобретения могут быть использованы в анализе связывания для идентификации лигандов РАСЕ, таких
- 14 012586 как агонисты, антагонисты или модуляторы КАСЕ.
Например, в одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ детектирования модуляторов КАСЕ, предусматривающий: (а) обеспечение слитого белка, содержащего полипептид КАСЕ, связанный со вторым, не-КАСЕ-полипептидом, где этот полипептид КАСЕ содержит лигандсвязывающий сайт; (Ь) смешивание представляющего интерес соединения и лиганда, имеющего известную активность связывания в отношении КАСЕ, со слитым белком; и (с) измерение связывания известного лиганда КАСЕ с КАСЕ-слитым белком в присутствии представляющего интерес соединения. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт содержит наиболее Ν-концевой домен слитого белка.
КАСЕ-слитые белки могут также обеспечивать наборы для детектирования модуляторов КАСЕ. Например, в одном варианте осуществления набор данного изобретения может содержать (а) соединение, имеющее известную аффинность связывания в отношении КАСЕ в качестве положительного контроля; (Ь) КАСЕ-слитый белок, содержащий полипептид КАСЕ, связанный со вторым, не-КАСЕполипептидом, где этот полипептид КАСЕ содержит лигандсвязывающий сайт; и (с) инструкции для применения. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт содержит наиболее Ν-концевой домен слитого белка.
Белок или полипептид КАСЕ может содержать полноразмерный КАСЕ человека (например, 8ЕО ΙΌ N0:1) или фрагмент КАСЕ человека. В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ не содержит никаких остатков сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность КАСЕ может содержать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 полноразмерного КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0:1). В альтернативных вариантах осуществления полипептид КАСЕ может содержать последовательность, на 70, или 80, или 90% идентичную КАСЕ человека или его фрагменту. Например, в одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать КАСЕ человека или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, №ерег с1 а1., (1992)). Или КАСЕ человека может содержать полноразмерный КАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ΙΌ N0:2 или 8Е0 ΙΌ N0:3) (фиг. 1А и 1В) или частью этой аминокислотной последовательности. Слитые белки данного изобретения могут также содержать кКАСЕ (например, 8Е0 ΙΌ N0:4), полипептид, на 90% идентичный кКАСЕ, или фрагмент кКАСЕ. Например, полипептид КАСЕ может содержать кКАСЕ человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, №ерег еί а1., (1997)). Или КАСЕ человека может содержать кКАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ΙΌ N0:5 или 8Е0 ΙΌ N0:6) (фиг. 1С) или частью этой аминокислотной последовательности. В других вариантах осуществления белок КАСЕ может содержать У-домен (например, 8Е0 ΙΌ N0:7 или 8Е0 ΙΌ N0:8, фиг. ΙΌ). Или может быть использована последовательность, на 90% идентичная У-домену или его фрагменту. Или белок КАСЕ может содержать фрагмент КАСЕ, содержащий часть Vдомена КАСЕ (например, 8Е0 ΙΌ N0:9 или 8Е0 ΙΌ N0:10: фиг. ΙΌ). В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт может содержать 8Е0 ΙΌ N0:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или 8Е0 ΙΌ N0:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Еще в одном варианте осуществления фрагмент КАСЕ является синтетическим пептидом.
Слитый белок может включать в себя несколько типов пептидов, которые не произведены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид этого слитого белка может содержать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: ΙμΟ (γ), Ι§Μ (μ), ΙμΌ (δ), !дЕ (ε) или !дА (α). Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: ΙβΟ1 (γ1), ΙβΟ2 (γ2), ΙβΟ3 (γ3), ЦС4 (γ4), Ι^Ι (α1), ЦА2 (α2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Второй полипептид может содержать домены Сн2 и Сц3 ΙβΟ1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. В качестве вариантов-примеров, полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 ΙμΟ1 человека или их часть, может содержать 8Е0 ΙΌ N0:38 или 8Е0 ΙΌ N0:40. Этот пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0:39 или 8Е0 ΙΌ N0:41.
Ес-часть цепи иммуноглобулина может быть провоспалительной ίη νίνο. Таким образом, КАСЕслитый белок данного изобретения может содержать Ес-последовательность, полученную из КАСЕ, а не из цепи иммуноглобулина. В одном варианте осуществления слитый белок может содержать иммуноглобулиновый домен КАСЕ, связанный с полипептидом, содержащим Сн2-домен иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать междоменный линкер КАСЕ, связанный с иммуноглобулиновым доменом КАСЕ, так что С-концевая аминокислота этого иммуноглобулинового домена КАСЕ связана с №концевой аминокислотой междоменного линкера, а Сконцевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно связана с №концевой аминокислотой полипептида, содержащего домен Сн2 иммуноглобулина, или его фрагмент. Полипептид, содержащий домен Сн2 иммуноглобулина, может содержать полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 ΙβΟ1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. Например, полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 ΙμΟ1 человека, или их часть, может содержать 8Е0 ΙΌ N0:38 или 8Е0 ΙΌ N0:40.
Слитый белок данного изобретения может содержать единственный домен или множественные до
- 15 012586 мены из ВАСЕ. Полипептид ВАСЕ, содержащий междоменный линкер, связанный с иммуноглобулиновым доменом ВАСЕ, может также содержать фрагмент полноразмерного белка ВАСЕ. Например, в одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка ВАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес-полипептида человека. Этот слитый белок может содержать первый иммуноглобулиновый домен ВАСЕ и первый междоменный линкер ВАСЕ, связанные со вторым иммуноглобулиновым доменом ВАСЕ и вторым междоменным линкером ВАСЕ, так что Ν-концевая аминокислота первого междоменного линкера связана с Сконцевой аминокислотой первого иммуноглобулинового домена ВАСЕ, Ν-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена ВАСЕ связана с С-концевой аминокислотой первого междоменного линкера, Ν-концевая аминокислота второго междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой второго иммуноглобулинового домена ВАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера ВАСЕ непосредственно связана с Ν-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен Сн2, или его фрагмент. Например, полипептид ВАСЕ может содержать аминокислоты 23-251 ВАСЕ человека (8ЕР ΙΌ ΝΟ:19) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-251 ВАСЕ человека (8ЕР ΙΌ ΝΟ:20) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену, С1-домену, междоменному линкеру, связывающему эти два домена, и второму междоменному линкеру, справа от С1. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая 8ЕР ΙΌ ΝΟ:30 или ее фрагмент, может кодировать ВАСЕ-слитый белок из четырех доменов.
Альтернативно, слитый белок из трех доменов может содержать один иммуноглобулиновый домен, полученный из ВАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес-полипептида человека. Например, этот слитый белок может содержать единственный иммуноглобулиновый домен ВАСЕ, связанный через междоменный линкер ВАСЕ с Ν-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен Сн2 или его фрагмент. Например, этот полипептид ВАСЕ может содержать аминокислоты 23-136 ВАСЕ человека (8ЕР ΙΌ ΝΟ:15) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-136 ВАСЕ человека (8ЕР ΙΌ ΝΟ:16) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену ВАСЕ и междоменному линкеру справа. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая 8ЕР ΙΌ ΝΟ:31 или ее фрагмент, может кодировать ВАСЕ-слитый белок из трех доменов.
Как описано здесь, междоменный линкерный фрагмент ВАСЕ может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от иммуноглобулинового домена ВАСЕ и, следовательно, связана с ним. Например, для У-домена ВАСЕ этот междоменный линкер может содержать аминокислотные последовательности, которые находятся природно справа от У-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать 8ЕР ΙΌ ΝΟ:21, соответствующую аминокислотам 117-123 полноразмерного ВАСЕ. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности ВАСЕ. Например, может быть использован междоменный линкер, содержащий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от 8ЕР ΙΌ ΝΟ:21. Таким образом, в одном варианте осуществления междоменный линкер содержит 8ЕР ΙΌ ΝΟ:23, содержащую аминокислоты 117-136 полноразмерного ВАСЕ. Или могут быть использованы фрагменты 8ЕР ΙΌ ΝΟ:21 с делецией, например, 1, 2 или 3 аминокислот из любого конца этого линкера. В альтернативных вариантах осуществления этот линкер может содержать последовательность, которая на 70% идентична, или на 80% идентична, или на 90% идентична 8ЕР ΙΌ ΝΟ:21 или 8ЕР ΙΌ ΝΟ:23.
Для С1-домена ВАСЕ этот линкер может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от этого С1-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать 8ЕО ΙΌ ΝΟ:22, соответствующую аминокислотам 222-251 полноразмерного ВАСЕ. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности ВАСЕ. Например, может быть использован линкер, содержащий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от 8ЕР ΙΌ ΝΟ:22. Или могут быть использованы фрагменты 8ЕР ΙΌ ΝΟ:22 с делецией, например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот из любого конца этого линкера. Например, в одном варианте осуществления междоменный линкер ВАСЕ может содержать 8 Ер ΙΌ ΝΟ:24, соответствующую аминокислотам 222-226. Или междоменный линкер может содержать 8ЕР ΙΌ ΝΟ:44, соответствующую аминокислотам 318-342 ВАСЕ.
Например, ВАСЕ-слитый белок может быть использован в анализе связывания для идентификации потенциальных лигандов ВАСЕ. В одном варианте-примере такого анализа связывания известный лиганд ВАСЕ может быть нанесен на твердый субстрат (например, планшеты МахщогЬ) в концентрации приблизительно 5 микрограммов на лунку, где каждая лунка содержит общий объем приблизительно 100 микролитров (мкл). Планшеты могут инкубироваться при 4°С в течение ночи для абсорбции лиганда. Альтернативно, могут быть использованы более короткие периоды инкубации при более высокой температуре (например, при комнатной температуре). После некоторого периода времени, необходимого для связывания лиганда с субстратом, тест-лунки могут быть аспирированы и может быть добавлен блокирующий буфер (например, 1% БСА в 50 мМ имидазоловом буфере, рН 7,2) для блокирования неспецифического связывания. Например, блокирующий буфер может быть добавлен к планшетам и оставлен в планшетах на 1 час при комнатной температуре. Затем планшеты аспирируют и/или промывают промы
- 16 012586 вочным буфером. В одном варианте осуществления в качестве промывочного буфера может быть использован буфер, содержащий 20 мМ имидазол, 150 мМ №1С1. 0,05% Твин-20, 5 мМ СаС12 и 5 мМ МдС12, рН 7,2. Затем в эти тест-лунки добавляют слитый белок в увеличивающихся разведениях. Затем КАСЕслитому белку может быть позволено инкубироваться с иммобилизованным лигандом в тест-лунке для достижения уравновешивания связывания. В одном варианте осуществления КАСЕ-слитому белку дают инкубироваться с иммобилизованным лигандом в течение приблизительно одного часа при 37°С. В альтернативных вариантах осуществления могут быть использованы более продолжительные периоды инкубации при более низких температурах. После инкубации слитого белка и иммобилизованного лиганда планшет может быть промыт для удаления любого несвязанного слитого белка. Слитый белок, связанный с иммобилизованным лигандом, может детектироваться различными путями. В одном варианте осуществления детектирование использует ЕП8А. Таким образом, в одном варианте осуществления комплекс для иммунодетектирования, содержащий моноклональное мышиное антитело против 1дС1 человека, биотинилированное козье антитело против мышиного 1дС и связанную с авидином щелочную фосфатазу, может быть добавлен к слитому белку, иммобилизованному в тест-лунке. Комплексу для иммунодетектирования дают связываться с иммобилизованным слитым белком так, чтобы связывание между слитым белком и комплексом для иммунодетектирования достигло равновесия. Например, этому комплексу дают связываться со слитым белком в течение одного часа при комнатной температуре. В этой временной точке любой несвязанный комплекс может быть удален промыванием тест-лунки промывочным буфером. Связанный комплекс может детектироваться добавлением субстрата щелочной фосфатазы, паранитрофенилфосфата (ΡΝΡΡ), и измерением превращения ΡΝΡΡ в паранитрофенол (ΡΝΡ) в виде увеличения оптической плотности при 405 нм.
В одном варианте осуществления лиганд КАСЕ связывается с КАСЕ-слитым белком с наномолярной (нМ) или микромолярной (мкМ) аффинностью. Эксперимент, иллюстрирующий связывание лигандов КАСЕ с КАСЕ-слитыми белками данного изобретения, показан на фиг. 7. Готовили растворы ТТР3000 (ТТ3) и ТТР-4000 (ТТ4), имеющие исходные концентрации 1,082 мг/мл и 370 мкг/мл, соответственно. Как показано на фиг. 7, при различных разведениях, слитые белки ТТР-3000 и ТТР-4000 способны связываться с иммобилизованными лигандами КАСЕ амилоидом-бета (АЬс1а) (Ату1о1Е Ве1а (1-40), Βίοкоигсе), 8100Ь (8100) и амфотерином (Атрйо), приводя к увеличению оптической плотности. В отсутствие лиганда (т.е. только с покрытием БСА) не было увеличения оптической плотности.
Анализ связывания данного изобретения может быть использован для количественного определения связывания лиганда с КАСЕ. В альтернативных вариантах осуществления лиганды КАСЕ могут связываться со слитым белком данного изобретения с аффинностями связывания в диапазоне 0,1-1000 наномолярных концентраций (нМ), или 1-500 нМ, или 10-80 нМ.
Слитый белок данного изобретения может быть также использован для идентификации соединений, способных связываться с КАСЕ. Как показано на фиг. 8 и 9, соответственно, лиганд КАСЕ может анализироваться на его способность конкурировать с иммобилизованным амилоидом бета за связывание со слитыми белками ТТР-4000 (ТТ4) или ТТР-3000 (ТТ3). Таким образом, можно видеть, что лиганд КАСЕ в конечной тест-концентрации (ГАС) 10 мкМ может замещать связывание КАСЕ-слитого белка с амилоидом-бета в концентрациях 1:3, 1:10, 1:30 и 1:100 исходного раствора ТТР-4000 (фиг. 8) или ТТР-3000 (фиг. 9).
Модуляция клеточных эффекторов
Варианты слитых белков данного изобретения могут быть использованы для модуляции биологической реакции, опосредуемой КАСЕ. Например, могут быть сконструированы слитые белки для модуляции КАСЕ-индуцируемых увеличений экспрессии генов. Таким образом, в одном варианте осуществления слитые белки данного изобретения могут быть использованы для модуляции функции биологических ферментов. Например, взаимодействие между КАСЕ и его лигандами может генерировать окислительный стресс и активацию ΝΓ-κΒ и ΝΓ-κΒ-регулируемых генов, таких как гены цитокинов ΣΠ-1β, ΓΝΕα и т.п. Кроме того, было показано, что несколько других регуляторных путей, таких как пути с участием р21гак, МАР-киназ, ЕКК1 и ЕКК2, активируются связыванием АСЕ и других лигандов с КАСЕ.
Применение слитых белков данного изобретения для модуляции экспрессии клеточного эффектора ТИГ-а показано на фиг. 10. Миелоидные клетки ТНР-1 могут культивироваться в среде ΡΡΜΙ-1640, дополненной 10% ФТС, и индуцироваться для секреции ΓΝΓ-α посредством стимуляции КАСЕ при помощи 8100Ь. Когда такая стимуляция происходит в присутствии КАСЕ-слитого белка, индукция ТИГ-а посредством связывания 8100Ь с КАСЕ может быть ингибирована. Таким образом, как показано на фиг. 10, добавление 10 мкг слитого белка ТТР-3000 (ТТ3) или ТТР-4000 (ТТ4) уменьшает индукцию ТИГ-а посредством 8100Ь на приблизительно 50-75%. Слитый белок ТТР-4000 может быть, по меньшей мере, таким же эффективным в блокировании индукции ТИГ-а посредством 8100Ь, каким является &КАСЕ (фиг. 10).
Специфичность ингибирования для КАСЕ-последовательностей ТТР-4000 и ТТР-3000 показана экспериментом, в котором к 8100Ь-стимулированным клеткам добавляли только 1дС. Добавление 1дС и 8100Ь в анализ показывает те же самые уровни ΓΝΓ-α, что и добавление только 8100Ь.
- 17 012586
Физиологические характеристики КАСЕ-слитых белков
Хотя кКАСЕ может иметь терапевтическую пользу в модуляции КАСЕ-опосредованных заболеваний, кКАСЕ человека может иметь недостатки в качестве независимого терапевтического средства вследствие относительно короткого полупериода существования кКАСЕ в плазме. Например, в то время как кКАСЕ грызуна имеет полупериод существования в нормальных и диабетических крысах приблизительно 20 ч, кКАСЕ человека имеет полупериод существования, меньший, чем 2 ч, при оценке по сохранению иммунореактивности кКАСЕ (Кепагб е! а1., ί. Рйагтасо1. Ехр. Тйег., 290:1458-1466 (1999)).
Для получения терапевтического агента на основе КАСЕ, который имеет такие же характеристики связывания, какие имеет кКАСЕ, но более стабильный фармакокинетический профиль, может быть использован КАСЕ-слитый белок, содержащий лигандсвязывающий сайт КАСЕ, связанный с одним или несколькими иммуноглобулиновыми доменами человека. Как известно в данной области, эти иммуноглобулиновые домены могут включать в себя Ес-часть тяжелой цепи иммуноглобулина.
Ес-часть иммуноглобулина может сообщать несколько характерных признаков слитому белку. Например, Ес-слитый белок может увеличивать полупериод существования в сыворотке такого слитого белка, часто от часов до нескольких дней. Увеличение фармакокинетической стабильности обычно является результатом взаимодействия линкера между Сн2- и Сн3-районами Ес-фрагмента с ЕсКп-рецептором (\\'тек е! а1., 1. ]ттипо1., 164:5213-5318 (2000)).
Хотя слитые белки, содержащие Ес-полипептид иммуноглобулина, могут обеспечивать преимущество увеличенной стабильности, иммуноглобулин-слитые белки могут индуцировать воспалительную реакцию при введении в хозяина. Эта воспалительная реакция может быть обусловлена, в значительной степени, Ес-частью иммуноглобулина этого слитого белка. Провоспалительная реакция может быть желательным признаком, если предполагаемая мишень экспрессируется на патологическом типе клеток, который должен быть элиминирован (например, на раковой клетке или популяции лимфоцитов, вызывающих аутоиммунное заболевание). Провоспалительная реакция может быть нейтральным признаком, если мишенью является растворимый белок, так как большинство растворимых белков не активируют иммуноглобулины. Однако эта провоспалительная реакция может быть отрицательным признаком, если эта мишень экспрессируется на типах клеток, разрушение которых привело бы к вредным побочным эффектам. Провоспалительная реакция может быть также отрицательным признаком, если воспалительный каскад устанавливается в месте связывания слитого белка с тканью-мишенью, так как многие медиаторы воспаления могут быть вредными для окружающей ткани и/или могут вызывать системные эффекты.
Первичный провоспалительный сайт Ес-фрагментов иммуноглобулина находится на шарнирной области между Сн1 и Сн2. Эта шарнирная область взаимодействует с ЕсК1-3 на различных лейкоцитах и запускает эти клетки к атаке мишени (\1пек е! а1., 1. Iттиηо1., 164:5313-5318 (2000)).
В качестве терапевтических средств для КАСЕ-опосредуемых заболеваний КАСЕ-слитые белки данного изобретения могут не требовать генерирования воспалительной реакции. Таким образом, варианты КАСЕ-слитых белков данного изобретения могут содержать слитый белок, содержащий полипептид КАСЕ, связанный с иммуноглобулиновым доменом (иммуноглобулиновыми доменами), где Есшарнирная область из иммуноглобулина удалена и заменена полипептидом КАСЕ. Таким путем может быть минимизировано взаимодействие КАСЕ-слитого белка и Ес-рецепторов на воспалительных клетках. Однако может быть важным поддержание правильного стекинга и других трехмерных структурных взаимодействий между различными иммуноглобулиновыми доменами этого слитого белка. Таким образом, варианты слитых белков данного изобретения могут заменять биологически инертный, но структурно сходный междоменный линкер КАСЕ, который разделяет У- и С1-домены КАСЕ, или линкер, который разделяет С1- и С2-домены КАСЕ, вместо нормальной шарнирной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Таким образом, полипептид КАСЕ этого слитого белка может содержать междоменную линкерную последовательность, которая природно обнаруживается справа от иммуноглобулинового домена КАСЕ, с образованием фрагмента иммуноглобулиновый домен КАСЕ/линкер. Таким путем могут поддерживаться трехмерные взаимодействия между иммуноглобулиновыми доменами, которым способствуют либо КАСЕ, либо иммуноглобулин.
В одном варианте осуществления КАСЕ-слитый белок данного изобретения может иметь существенное увеличение фармакокинетической стабильности в сравнении с кКАСЕ. Например, фиг. 11 показывает, что как только КАСЕ-слитый белок ТТР-4000 насытил его лиганды, он может сохранять полупериод существования, больший, чем 300 ч. Это может быть противопоставлено полупериоду существования для кКАСЕ, который составляет только несколько часов в плазме человека.
Таким образом, в одном варианте осуществления КАСЕ-слитые белки данного изобретения могут быть использованы для противодействия связыванию физиологических лигандов с КАСЕ в качестве средства для лечения КАСЕ-опосредуемых заболеваний без генерирования неприемлемой степени воспаления. Слитые белки данного изобретения могут проявлять существенное уменьшение генерирования противовоспалительной реакции в сравнении с ΙβΟ. Например, как показано на фиг. 12, КАСЕ-слитый белок ТТР-4000 не стимулирует высвобождения Т№-а из клеток в условиях, в которых детектируется стимуляция высвобождения Т№-а посредством ЦС человека.
- 18 012586
Лечение заболевания КАСЕ-слитыми белками
Данное изобретение может также включать в себя способы для лечения КАСЕ-опосредуемого нарушения у субъекта-человека. В одном варианте осуществления этот способ может предусматривать введение субъекту слитого белка, содержащего полипептид КАСЕ, содержащий лигандсвязывающий сайт КАСЕ, связанный со вторым, не-КАСЕ-полипептидом. В одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать лигандсвязывающий сайт КАСЕ. В одном варианте осуществления этот лигандсвязывающий сайт содержит наиболее ^концевой домен этого слитого белка. Лигандсвязывающий сайт КАСЕ может содержать У-домен КАСЕ или его часть. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт КАСЕ содержит 8Е0 ΙΌ N0:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или 8Е0 ΙΌ N0:10 или последовательность, на 90% идентичную ей.
В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может быть связан с полипептидом, содержащим иммуноглобулиновый домен или часть (например, его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте осуществления полипептид, содержащий иммуноглобулиновый домен, содержит часть по меньшей мере одного из доменов Сн2 или Сн3 1дС человека.
Белок или полипептид КАСЕ может содержать полноразмерный КАСЕ (например, 8Е0 ΙΌ N0:1) или фрагмент КАСЕ человека. В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ не содержит никаких остатков сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность КАСЕ может содержать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 полноразмерного КАСЕ (8Е0 ΙΌ N0:1). В альтернативных вариантах осуществления полипептид КАСЕ может содержать последовательность, на 70, или 80, или 90% идентичную КАСЕ человека или его фрагменту. Например, в одном варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать КАСЕ человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, №ерег с1 а1., (1992)). Или КАСЕ человека может содержать полноразмерный КАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 5Е0 ΙΌ N0:2 или 8Е0 ΙΌ N0:3) (фиг. 1А и 1В) или частью этой аминокислотной последовательности. Слитые белки данного изобретения могут также содержать кКАСЕ (например, 8Е0 ΙΌ N0:4), полипептид, на 90% идентичный кКАСЕ, или фрагмент кКАСЕ. Например, полипептид КАСЕ может содержать кКАСЕ человека или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, №ерег е1 а1., (1997)). Или КАСЕ человека может содержать полноразмерный кКАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8Е0 ΙΌ N0:5 или 8Е0 ΙΌ N0:6) (фиг. 1С) или частью этой аминокислотной последовательности. В других вариантах осуществления белок КАСЕ может содержать У-домен (например, 8Е0 ΙΌ N0:7 или 8Е0 ΙΌ N0:8; фиг. 1Ό). Или может быть использована последовательность, на 90% идентичная Удомену или его фрагменту. Или белок КАСЕ может содержать фрагмент КАСЕ, содержащий часть Удомена КАСЕ (например, 5Е0 ΙΌ N0:9 или 8Е0 ΙΌ N0:10, фиг. 1Ό). В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт может содержать 8Е0 ΙΌ N0:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или 8Е0 ΙΌ N0:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Еще в одном варианте осуществления фрагмент КАСЕ является синтетическим пептидом.
Слитый белок может включать в себя несколько типов пептидов, которые не произведены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид этого слитого белка может содержать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: Ι§0 (γ), Ι§Μ (μ), Ι§Ό (δ), ΙμΞ (ε) или ΙμΛ (α). Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: ΙβΟ1 (γ1), ΙβΟ2 (γ2), ΙβΟ3 (γ3), ΙβΟ4 (γ4), IдΛ1 (α1), Ι^Σ (α2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Второй полипептид может содержать домены Сн2 и Сн3 ΙβΟ1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. В качестве вариантов-примеров, полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 Ι§01 человека или их часть, может содержать 8Е0 ΙΌ N0:38 или 8Е0 ΙΌ N0:40. Этот пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ΙΌ N0:39 или 8Е0 ΙΌ N0:41.
Например, полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-116 КАСЕ человека (5Е0 ΙΌ N0:7) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-116 КАСЕ человека (5Е0 ΙΌ N0:8) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену КАСЕ. Или полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 124-221 КАСЕ человека (5Е0 ΙΌ N0:11) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С1-домену КАСЕ. В другом варианте осуществления полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 227-317 КАСЕ человека (5Е0 ΙΌ N0:12) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С2-домену КАСЕ человека. Или полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-123 КАСЕ человека (5Е0 ΙΌ N0:13) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-123 КАСЕ человека (5Е0 ΙΌ N0:14) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену КАСЕ человека и междоменному линкеру справа. Или полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-226 КАСЕ человека (5Е0 ΙΌ N0:17) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-226 КАСЕ человека (5Е0 ΙΌ N0:18) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену, С1-домену и междоменному линкеру, связывающему эти два домена. Или полипептид КАСЕ может содержать ами
- 19 012586 нокислоты 23-339 КАСЕ человека (БЕО ΙΌ №О:5) или последовательность, на 90% идентичную ей, или 24-339 КАСЕ человека (БЕО ΙΌ №О:6) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую зКАСЕ (т.е. кодирующую V-, С1- и С2-домены и междоменные линкеры). Или могут быть использованы фрагменты каждой из этих последовательностей.
Ес-часть цепи иммуноглобулина может быть провоспалительной ш т1то. Таким образом, в одном варианте осуществления КАСЕ-слитый белок данного изобретения содержит междоменный линкер, полученный из КАСЕ, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина.
Таким образом, в одном варианте осуществления слитый белок может дополнительно содержать полипептид КАСЕ, непосредственно слитый с полипептидом, содержащим домен Сн2 иммуноглобулина или его фрагмент. В одном варианте осуществления этот домен Сн2 или его фрагмент содержит 8ЕО ΙΌ №О:42.
В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ содержит междоменный линкер КАСЕ, связанный с иммуноглобулиновым доменом КАСЕ таким образом, что С-концевая аминокислота этого иммуноглобулинового домена КАСЕ связана с Ν-концевой аминокислотой междоменного линкера, а Сконцевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно связана с Ν-концевой аминокислотой полипептида, содержащего домен Сн2 иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, содержащий домен Сн2 иммуноглобулина, может содержать домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека. Например, полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека, может содержать 8ЕО ΙΌ №О:38 или 8ЕО ΙΌ №О:40.
Слитый белок данного изобретения может содержать единственный домен или множественные домены из КАСЕ. Полипептид КАСЕ, содержащий междоменный линкер, связанный с доменом полипептида КАСЕ, может также содержать фрагмент полноразмерного белка КАСЕ. Например, в одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес-полипептида человека. Этот слитый белок может содержать первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер КАСЕ, связанные со вторым иммуноглобулиновым доменом КАСЕ и вторым междоменным линкером КАСЕ, так что Ν-концевая аминокислота первого междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой первого иммуноглобулинового домена КАСЕ, Ν-концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ связана с С-концевой аминокислотой первого междоменного линкера, Νконцевая аминокислота второго междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно связана с Ν-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен Сн2 или его фрагмент. Например, полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-251 КАСЕ человека (БЕО ΙΌ NО:19) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24251 КАСЕ человека (БЕО ΙΌ NО:20) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену, С1-домену, междоменному линкеру, связывающему эти два домена, и второму междоменному линкеру, справа от С1. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая 8ЕО ΙΌ NО:30 или ее фрагмент, может кодировать КАСЕ-слитый белок из четырех доменов.
Альтернативно, слитый белок из трех доменов может содержать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес-полипептида человека. Например, этот слитый белок может содержать единственный иммуноглобулиновый домен КАСЕ, связанный через междоменный линкер КАСЕ с Ν-концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен Сн2 или его фрагмент. Например, этот полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-136 КАСЕ человека (БЕО ΙΌ NО:15) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-136 КАСЕ человека (БЕО ΙΌ NО:16) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену КАСЕ и междоменному линкеру справа. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая 8ЕО ΙΌ NО:31 или ее фрагмент, может кодировать КАСЕ-слитый белок из трех доменов.
Междоменный линкерный фрагмент КАСЕ может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от иммуноглобулинового домена КАСЕ и, следовательно, связана с ним. Например, для У-домена КАСЕ этот междоменный линкер может содержать аминокислотные последовательности, которые находятся природно справа от У-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать 8ЕО ΙΌ NО:21, соответствующую аминокислотам 117-123 полноразмерного КАСЕ. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности КАСЕ. Например, может быть использован междоменный линкер, содержащий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от 8ЕО ΙΌ NО:21. Таким образом, в одном варианте осуществления междоменный линкер содержит 8ЕО ΙΌ NО:23, содержащую аминокислоты 117-136 полноразмерного КАСЕ. Или могут быть использованы фрагменты 8ЕО ΙΌ NО:21 с делецией, например 1, 2 или 3 аминокислот из любого конца этого линкера. В альтернативных вариантах осуществления этот линкер может содержать последовательность, которая на 70% идентична, или на 80% идентична, или на 90% идентична 8ЕО ΙΌ NО:21 или 8ЕО ΙΌ NО:23.
Для С1-домена КАСЕ этот линкер может содержать пептидную последовательность, которая нахо
- 20 012586 дится природно справа от этого С1-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать 8Е0 ΙΌ N0:22, соответствующую аминокислотам 222-251 полноразмерного КАСЕ. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности КАСЕ. Например, может быть использован линкер, содержащий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от 8Е0 ΙΌ N0:22. Или могут быть использованы фрагменты 8Е0 ΙΌ N0:22 с делецией, например, 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот из любого конца этого линкера. Например, в одном варианте осуществления междоменный линкер КАСЕ может содержать 8Е0 ΙΌ N0:24, соответствующую аминокислотам 222-226. Или междоменный линкер может содержать 8Е0 ΙΌ N0:44, соответствующую аминокислотам 318-342 КАСЕ.
В одном варианте осуществления слитый белок данного изобретения может вводиться различными способами. Введение КАСЕ-слитого белка данного изобретения может использовать внутрибрюшинную (ГР) инъекцию. Альтернативно, КАСЕ-слитый белок может вводиться перорально, интраназально или в виде аэрозоля. В другом варианте осуществления введение является внутривенным (Ιν). КАСЕ-слитый белок может также инъецироваться подкожно. В другом варианте осуществления введение этого слитого белка является внутриартериальным. В другом варианте осуществления введение является сублингвальным. Введение может также использовать капсулу с пролонгированным высвобождением. Еще в одном варианте осуществления введение может быть трансректальным, например, с использованием суппозитория или т. п. Например, подкожное введение может быть применимо для лечения хронических нарушений, когда желательным является самостоятельное введение.
Для валидизации применения соединений, которые модулируют КАСЕ, в качестве терапевтических средств использовали различные модели животных. Примерами этих моделей являются следующие модели:
a) ингибируемое кКАСЕ образование новой интимы (внутренней оболочки сосудов) в крысиной модели рестеноза после артериального повреждения как у диабетических, так и у нормальных крыс ингибированием активации эндотелиальных клеток, клеток гладких мышц и макрофагов посредством КАСЕ (/Нои е! а1., С1гси1абоп 107:2238-2243 (2003));
b) ингибирование взаимодействий КАСЕ/лиганд с использованием либо кКАСЕ, либо анти-КАСЕантитела, уменьшенное образование амилоидных бляшек в мышиной модели системного амилоидоза (Υηη е! а1., №11. Меб., 6:643-651 (2000)). Уменьшение числа амилоидных бляшек сопровождалось уменьшением воспалительных цитокинов, интерлейкина-6 (ΙΕ-6) и макрофагального колониестимулирующего фактора (М-С8Е), а также уменьшенной активацией №-кВ у получавших лечение животных;
c) КАСЕ-трансгенные мыши (сверхэкспрессирующие и КАСЕ-доминантно-негативные) обнаруживают образование бляшек и нарушения познавательной способности (когнитивные нарушения) в мышиной модели ΆΌ (Агапсю е! а1., ЕМВ0 Е, 23:4096-4105 (2004));
б) лечение диабетических крыс с использованием кКАСЕ уменьшало проницаемость сосудов (Воппагбе1-РНи е! а1., О1аЬе!ек, 48:2052-2058 (1999));
е) лечение кКАСЕ уменьшало атеросклеротические повреждения у диабетических аполипопротеин Е-нуль-мышей и предотвращало возникновение функциональных и морфологических показателей диабетической нефропатии у мышей бЬ/бЬ (Нибкоп е! а1., АгсН. ВюсНеш. ВюрНук.. 419:80-88 (2003)); и
Г) кКАСЕ аттенуировал тяжесть воспаления в мышиной модели индуцированного коллагеном артрита (НоГтапп е! а1., Сепек ^типоЕ, 3:123-135 (2002)), мышиной модели экспериментального аллергического энцефаломиелита (Υηπ е! а1., N31. Меб. 9:28-293 (2003)) и мышиной модели воспалительного заболевания кишечника (НоГтапп е! а1., Се11, 97:889-901 (1999)).
Таким образом, в одном варианте осуществления белки данного изобретения могут быть использованы для лечения симптома диабета и/или осложнений, происходящих из диабета, опосредуемых КАСЕ. В альтернативных вариантах осуществления симптом диабета или поздние диабетические осложнения могут включать в себя диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, диабетическую язву стопы, сердечно-сосудистое осложнение диабета или диабетическую нефропатию.
Первоначально идентифицированный в качестве рецептора для молекул, экспрессиия которых ассоциирована с патологией диабета, КАСЕ, сам, является важным для патофизиологии диабетических осложнений. Было показано, что ш у1уо ингибирование взаимодействия КАСЕ с его лигандом (лигандами) является терапевтическим во множественных моделях диабетических осложнений и воспаления (Нибкоп е! а1., АгсН. ВюсНеш. ВюрНук.. 419:80-88 (2003)). Например, двухмесячное лечение анти-КАСЕантителами нормализовало функцию почек и уменьшало аномальную гистопатологию почек у диабетических мышей (Е1ууЬ)ег§ е! а1., Э|аЬе1ек 53:166-172 (2004)). Кроме того, лечение растворимой формой КАСЕ (кКАСЕ), которая связывается с лигандами КАСЕ и ингибирует взаимодействия КАСЕ/лиганд, уменьшало атеросклеротические повреждения у диабетических аполипопротеин Е-нуль-мышей и аттенуировало функциональную и морфологическую патологию диабетической нефропатии у мышей бЬ/бЬ (ВисаагеШ е! а1., Спси1а1юп 106:2827-2835 (2002)).
Было показано также, что гликоокисление макромолекул, в конечном счете приводящее к образованию продвинутых конечных продуктов гликозилирования (АСЕ), усиливается в местах воспаления, при почечной недостаточности, в присутствии гипергликемии и других состояний, ассоциированных с
- 21 012586 системным или локальным окислительным стрессом (Эуег е! а1., 1. Сбп 1пуез!., 91:2463-2469 (1992); Кедду е! а1., Бюсбеш., 34:10872-10878 (1995); 1Хег е! а1., 1. Бю1. Сбет., 266:11654-11660 (1991); Оеуепбагд! е! а1., Се11 Мо1. Βίο1., 44:1139-1145 (1998)). Накопление АСЕ в сосудистой сети может происходить локализованно (в виде очагов), как в случае амилоида суставов, состоящего из АСЕ-р2-микроглобулина, обнаруживаемого у пациентов со связанным с диализом амилоидозом (М1уа!а е! а1., 1. Сбп 1пуез!., 92:1243-1252 (1993); М1уа!а е! а1., 1. Сбп 1пуез!., 98:1088-1094 (1996)), или генерализованно, как, например, в сосудистой сети и тканях пациентов с диабетом (8сбт1д! е! а1., №1иге Мед., 1:1002-1004 (1995)).
Прогрессирующее накопление АСЕ во времени у пациентов с диабетом предполагает, что эндогенные механизмы клиренса не способны эффективно функционировать в местах отложения АСЕ. Такие накапливаемые АСЕ способны изменять клеточные свойства посредством ряда механизмов. Хотя КАСЕ экспрессируется при низких уровнях в нормальных тканях и сосудистой сети, было показано, что в среде, в которой накапливаются лиганды рецептора, КАСЕ становится положительно регулируемым (Ь1 е! а1., 1. Βιο1. Сбет., 272:16498-16506 (1997); Ь1 е! а1., 1. Βιο1. Сбет., 273:30870-30878 (1998); Тапака е! а1., 1. Βίο1. Сбет., 275:25781-25790 (2000)). Экспрессия КАСЕ увеличивается в эндотелии, клетках гладких мышц и инфильтрирующих мононуклеарных фагоцитах в сосудистой сети диабетиков. Исследования в клеточной культуре также продемонстрировали, что взаимодействие АСЕ-КАСЕ вызывает изменения в клеточных свойствах, важных в гомеостазе сосудов.
Применение КАСЕ-слитых белков в лечении связанной с диабетом патологии иллюстрируется на фиг. 13. КАСЕ-слитый белок ТТР-4000 оценивали в модели рестеноза диабетических крыс, которая включала в себя измерение пролиферации гладких мышц и развития интимы после васкулярного повреждения. Как показано на фиг. 13, лечение ТТР-4000 может значимо уменьшать отношение интима-медиа (внутренняя оболочка сосудов - средняя оболочка сосудов) (Ι/М) (фиг. 13 А; табл. 1) в ассоциированном с диабетом рестенозе зависимым от дозы образом. Лечение с использованием ТТР-4000 может также значимо уменьшать связанную с рестенозом пролиферацию клеток гладких мышц сосудов зависимым от дозы образом.
Таблица 1. Действие ТТР-4000 в крысиной модели рестеноза
1дС (п=9) ТТР-4000 (п=9) Низкая доза** (0,3 мг/животное ςοάχ4) ТТР-4000 (п=9) Высокая доза** (1,0 мг/животное дос1х4)
Площадь просвета (мм2) 0,2±0,03 0,18±0,04 0,16±0,02
Площадь медии (мм2) 0,12±0,01 0,11±0,02 0,11±0,01
Отношение Ι/Μ 1,71±0,27 1,61±0,26 1,44*±0,15
*Р<0,05 ** Как для высокой, так и для низкой дозы использовали ударную дозу 3 мг/животное.
В других вариантах осуществления слитые белки данного изобретения могут быть также использованы для лечения или обращения развития амилоидоза и болезни Альцгеймера. КАСЕ является рецептором амилоида бета (Ар), а также других амилоидогенных белков, в том числе 88А и амилина (Уап е! а1., №1ыге, 382:685-691 (1996); Уап е! а1., Ргос. №!1. Асад. 8с1. И8А, 94:5296-5301 (1997); Уап е! а1., №!. Мед., 6:643-651 (2000); 8оиза е! а1., ЬаЬ 1пуез!., 80:1101-1110 (2000)). Лиганды КАСЕ, в том числе белки АСЕ, 81006 и Ар обнаружены в ткани, окружающей старческую бляшку у людей (Ьи!б е! а1., СегеЬ. Сог1ех 15:211-220 (2005); Рекго1д е! а1., №игозсь Ье!!., 336:167-170 (2003); 8азак1 е! а1., Бгат Кез., 12:256-262 (2001); Уап е! а1., Кез!ог. №ыго1 №игозсь, 12:167-173 (1998)). Было показано, что КАСЕ связывает рскладчатый фибриллярный материал независимо от состава субъединиц (пептид амилоида-р, амилин, сывороточный амилоид А, полученный из прионов пептид) (Уап е! а1., №1ыге, 382:685-691 (1996); Уап е! а1., №1. Мед., 6:643-651 (2001)). Кроме того, было показано, что отложение амилоида приводит к усиленной экспрессии КАСЕ. Например, в головном мозгу пациентов с болезнью Альцгеймера (АЭ) экспрессия КАСЕ увеличивается в нейронах и глии (Уап е! а1., №1иге 382:685-691 (1996)). Одновременно с экспрессией лигандов КАСЕ, КАСЕ положительно регулируется в астроцитах и микроглиальных клетках в гиппокампе индивидуумов с АЭ, но не регулируется положительно в индивидуумах, которые не имеют ΛΩ (Ьие е! а1., Ехр. №иго1., 171:29-45 (2001)). Эти открытия предполагают, что клетки, экспрессирующие КАСЕ, активируются взаимодействиями КАСЕ/лиганд КАСЕ вблизи старческой бляшки. Аропосредованная активация микроглиальных клеток ш У1!го может также блокироваться антителами, направленными против лигандсвязывающего домена КАСЕ (Уап е! а1., Ргос. №!1. Асад. 8сь, И8А, 94:52965301 (1997)). Было также продемонстрировано, что КАСЕ может служить в качестве фокальной точки для сборки фибрилл (Эеапе е! а1., №!. Мед. 9:907-913 (2003)).
- 22 012586
Ингибирование ίη νίνο взаимодействий КАСЕ/лиганд с использованием либо зКАСЕ, либо антиКАСЕ-антитела может также уменьшать образование амилоидных бляшек в мышиной модели системного амилоидоза (Уап βΐ а1., N31. Ме4, 6:643-651 (2000)). Дважды трансгенные мыши, которые сверхэкспрессируют КАСЕ человека и амилоидный белок-предшественник человека (АРР) с мутациями §шеб1зИ и Εοηάοη (мутантный ИАРР) в нейронах, развивают дефекты научения и невропатологические аномалии раньше, чем их моносайтовые мутантные трансгенные йАРР-копии. В противоположность этому, дважды трансгенные мыши с уменьшенной способностью передачи сигнала Ав вследствие нейронов, экспрессирующих доминантно-негативную форму КАСЕ на том же самом мутантном генетическом фоне ИАРР, обнаруживают задержанное возникновение невропатологических аномалий и аномалий научения в сравнении с их моносайтовой АРР-трансгенной копией (Агапсю еΐ а1., ЕМВ0 I., 23:4096-4105 (2004)).
Кроме того, было показано, что ингибирование взаимодействия КАСЕ-амилоид уменьшает экспрессию клеточного КАСЕ и маркеров клеточного стресса (а также активацию NЕ-κВ) и уменьшает отложение амилоида (Уап еΐ а1., N31. Ме4, 6:643-651 (2000)), что предполагает роль взаимодействия КАСЕамилоид как в пертурбации клеточных свойств в среде, обогащенной амилоидом (даже на ранних стадиях), так и в накоплении амилоида.
Таким образом, КАСЕ-слитые белки данного изобретения могут быть также использованы для лечения и уменьшения амилоидоза и для уменьшения амилоидных бляшек и когнитивной дисфункции, связанной с болезнью Альцгеймера (АЭ). Как описано выше, было показано, что зКАСЕ уменьшает как образование амилоидных бляшек в головном мозгу, так и последующее увеличение количества воспалительных маркеров в модели АЭ животных. Фиг. 14А и 14В показывают, что мыши, которые имеют АЭ и лечатся в течение 3 месяцев либо ТТР-4000, либо мышиным зКАСЕ, имели меньше бляшек амилоида бета (Ав) и меньшую когнитивную дисфункцию, чем животные, которые получали носитель или 1дС человека в качестве отрицательного контроля (1дС1). Подобно зКАСЕ, ТТР-4000 может также уменьшать количество воспалительных цитокинов 1С-1 и ЮТ-а (данные не показаны), связанных с Λϋ.
Слитые белки данного изобретения могут быть также использованы для лечения атеросклероза и других сердечно-сосудистых нарушений. Так, было показано, что ишемическая болезнь сердца является особенно высокой у пациентов с диабетом (КоЬеАзоп, еΐ а1., ЕаЬ Iηνе8ΐ., 18:538-551 (1968); Каппе1 еΐ а1., I. Ат. Ме4 Аззос, 241:2035-2038 (1979); Каппе1 еΐ а1., О1аЬ. Саге, 2:120-126 (1979)). Кроме того, исследования показали, что атеросклероз у пациентов с диабетом является более ускоренным и экстенсивным, чем у пациентов, не страдающих от диабета (см., например, Ша11ег еΐ а1., Ат. I. Ме4, 69:498-506 (1980); Сга11 еΐ а1., Ат. I. Ме4 64:221-230 (1978); НатЬу еΐ а1., СИез^ 2:251-257 (1976) и Руога1а еΐ а1., О1аЬ. МеΐаЬ. Ееу., 3:463-524 (1978)). Хотя причинами ускоренного атеросклероза в условиях диабета являются множественные причины, было показано, что уменьшение АСЕ может уменьшать образование бляшек.
Например, КАОЕ-слитые белки данного изобретения могут быть также использованы для лечения инсульта (внезапного мозгового приступа сосудистой природы). При сравнении ТТР-4000 с зКАСЕ в релевантной для этого заболевания модели инсульта у животного было обнаружено, что ТТР-4000 обеспечивает значимо большее уменьшение объема повреждения. В этой модели среднюю сонную аретрию мыши лигируют и затем реперфузируют для образования повреждения. Для оценки эффективности КАСЕ-слитых белков для лечения или предупреждения инсульта мышей лечили зКАСЕ или ТТР-4000 или контрольным иммуноглобулином непосредственно перед реперфузией. Как можно видеть в таблице 2, ТТР-4000 был более эффективным, чем зКАСЕ, в ограничении площади повреждения у этих животных, что предполагает, что ТТР-4000, вследствие его лучшего полупериода существования в плазме, был способен поддерживать большую защиту, чем зКАСЕ.
Таблица 2. Уменьшение повреждения при инсульте
** в сравнении с солевым раствором.
В другом варианте осуществления слитые белки данного изобретения могут быть использованы для лечения рака. В одном варианте осуществления рак, подвергнутый лечению с использованием слитых белков данного изобретения, содержит раковые клетки, которые экспрессируют КАСЕ. Например, виды рака, которые могут лечиться КАСЕ-слитым белком данного изобретения, включают в себя некоторые виды рака легкого, некоторые глиомы, некоторые папилломы и т.п. Амфотерин является негистоновым
- 23 012586 связывающим хромосомную ДНК белком группы I высокой подвижности (Каиуа1а е! а1., Σ. Вю1. СНет., 262:16625-16635 (1987); Рагк1ктеи е! а1., I Вю1. СНет., 268:19726-19738 (1993)), который, как было показано, взаимодействует с КАСЕ. Было показано, что амфотерин стимулирует разрастание неврита, а также служит в качестве поверхности для сборки протеазных комплексов в фибринолитической системе (о которой также известно, что она способствует подвижности клеток). Кроме того, наблюдали ингибиторное действие блокирования КАСЕ на локальный рост опухоли в модели первичной опухоли (глиомы С6), модели легочного метастазирования Льюиса (ТадисЫ е! а1., №1иге 405:354-360 (2000)) и спонтанно возникающих папилломах у мышей, экспрессирующих трансген ν-На-гак (Ьебег е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1., 87:9178-9182 (1990)).
В других вариантах осуществления слитые белки данного изобретения могут быть использованы для лечения воспаления. Например, в дополнительных вариантах осуществления слитый белок данного изобретения используют для лечения воспаления, связанного с аутоиммунитетом, воспаления, связанного с воспалительным заболеванием кишечника, воспаления, связанного с ревматоидным артритом, воспаления, связанного с псориазом, воспаления, связанного с рассеянным склерозом, воспаления, связанного с гипоксией, воспаления, связанного с инсультом, воспаления, связанного с сердечным приступом, воспаления, связанного с геморрагическим шоком, воспаления, связанного с сепсисом, воспаления, связанного с трансплантацией органа, или воспаления, связанного с ухудшенным заживлением ран.
Например, после тромболитической обработки воспалительные клетки, такие как гранулоциты, инфильтрируют ишемическую ткань и продуцируют радикалы кислорода, которые могут разрушать больше клеток, чем количество клеток, убитых гипоксией. Было показано, что ингибирование этого рецептора на нейтрофилах, ответственного за способность нейтрофилов инфильтрировать эту ткань, антителами или другими антагонистами белка ослабляет эту реакцию. Поскольку КАСЕ является лигандом для этого рецептора нейтрофилов, слитый белок, содержащий фрагмент КАСЕ, может действовать в качестве ловушки и предотвращать транспорт нейтрофилов в реперфузированный участок и, следовательно, предотвращать дополнительную деструкцию ткани. Роль КАСЕ в предупреждении воспаления может быть продемонстрирована исследованиями, показывающими, что кКАСЕ ингибировал разрастание новой интимы в крысиной модели рестеноза после артериального повреждения как у диабетических, так и у здоровых крыс, предположительно ингибируя пролиферацию эндотелиальных клеток, клеток гладких мышц и активацию макрофагов через КАСЕ (2Нои е! а1., С1гси1абои, 107:2238-2243 (2003)). Кроме того, кКАСЕ ингибировал модели воспаления, в том числе аллергию замедленного типа, экспериментальный аутоиммунный энцефалит и воспалительное заболевание кишечника (НоЕтаи е! а1., Се11, 97:889-901 (1999)).
В одном варианте осуществления слитые белки данного изобретения могут быть также использованы для лечения аутоиммунных нарушений. Например, слитые белки данного изобретения могут быть использованы для лечения почечной недостаточности. Таким образом, слитые белки данного изобретения могут быть использованы для лечения системной красной волчанки или воспалительного люпуснефрита (волчаночного нефрита). Например, было показано, что 8100Ь/кальгранулины представляют семейство близкородственных кальцийсвязывающих полипептидов, характеризуемых двумя кальцийсвязывающими ЕΕ-Наηб-мотивами (петлями из 12 аминокислот, обеспечивающими октаэдральную координацию для иона кальция), связанными соединительным пептидом (8сНаЕег е! а1., Т1В8, 21:134-140 (1996); 21штег е! а1., Вгат Кек. Ви11., 37:417-429 (1995); Каттек е! а1., Σ. Вю1. СНет., 272:9496-9502 (1997); Ьидегтд е! а1., Еиг. Σ. С11п. 1пуек!., 25:659-664 (1995)). Хотя они и не имеют сигнальных пептидов, давно было известно, что 8100Ь/кальгранулины получают доступ во внеклеточное пространство, особенно в местах хронических иммунных/воспалительных реакцией, таких как муковисцидоз и ревматоидный артрит. КАСЕ является рецептором многих членов семейства 8100Ь/кальгранулина и опосредует их провоспалительные действия на клетки, такие как лимфоциты и мононуклеарные фагоциты. Исследования на моделях аллергической реакции замедленного типа, колита у 1Ь-10-нуль-мышей, индуцированного коллагеном артрита и экспериментального аутоиммунного энцефалита также предполагают, что взаимодействие КАСЕ-лиганд (предположительно с 8-100Ь/кальгранулинами) имеет непосредственную роль в воспалительном каскаде.
Таким образом, в различных выбранных вариантах осуществления данное изобретение может обеспечивать способ ингибирования взаимодействия АСЕ с КАСЕ у субъекта введением этому субъекту терапевтически эффективного количества слитого белка данного изобретения. Субъектом для лечения КАСЕ-слитыми беклами данного изобретения может быть животное. В одном варианте осуществления этим субъектом является человек. Этот субъект может страдать от АСЕ-связанного заболевания, такого как диабет, диабетические осложнения, такие как нефропатия, невропатия, ретинопатия, язва стопы, амилоидоз или почечная недостаточность, и воспаление. Или субъект может быть индивидуумом с болезнью Альцгеймера. В альтернативном варианте осуществления этот субъект может быть индивидуумом, страдающим от рака. В других вариантах осуществления этот субъект может страдать от системной красной волчанки или воспалительного люпус-нефрита. Другие заболевания могут быть опосредованы КАСЕ и, следовательно, могут лечится с использованием слитых белков данного изобретения. Таким образом, в дополнительных альтернативных вариантах осуществления данного изобретения слитые белки могут быть использованы для лечения болезни Крона, артрита, васкулита, нефропатий, ретинопатий и
- 24 012586 невропатий у субъектов-людей или субъектов-животных.
Терапевтически эффективное количество может быть количеством, которое способно предотвращать взаимодействие ЛАСЕ с АСЕ или другими типами лигандов ЛАСЕ у субъекта. Соответственно, это количество будет варьироваться в зависимости от получающего лечение субъекта. Введение этого соединения может выполняться один раз в час, один раз в день, один раз в неделю, один раз в месяц, один раз в год или в виде единственного введения. В различных альтернативных вариантах осуществления эффективное количество этого слитого белка может быть в диапазоне приблизительно 1 нг/кг массы тела - приблизительно 100 мг/кг массы тела, или приблизительно 10 мкг/кг массы тела - приблизительно 50 мг/кг массы тела, или приблизительно 100 мкг/кг массы тела - приблизительно 10 мг/кг массы тела. Фактическое эффективное количество может быть установлено анализами зависимости реакции от дозы с использованием способов, стандартных в данной области ЦоЕпзоп с1 а1., П1аЬе1ез, 42: 1179, (1993)). Таким образом, как известно специалистам с квалификацией в данной области, эффективное количество может зависеть от биодоступности, биологической активности и биодеградируемости этого соединения.
Композиции
Данное изобретение может содержать композицию, содержащую слитый белок данного изобретения, смешанный с фармацевтически приемлемым носителем. Слитый белок может содержать полипептид ЛАСЕ, связанный со вторым, не-ЛАСЕ-полипептидом. В одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать лигандсвязывающий сайт ЛАСЕ. В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт ЛАСЕ содержит наиболее ^концевой домен этого слитого белка. В одном варианте осуществления, лигандсвязывающий сайт ЛАСЕ может содержать У-домен ЛАСЕ или его часть. В одном варианте осуществления, лигандсвязывающий сайт ЛАСЕ содержит 8ЕЦ ΙΌ N0:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или 8ЕЦ ΙΌ N0:10 или последовательность, на 90% идентичную ей.
В одном варианте осуществления полипептид ЛАСЕ может быть связан с полипептидом, содержащим иммуноглобулиновый домен или часть (например, его фрагмент) иммуноглобулинового домена. В одном варианте осуществления полипептид, содержащий иммуноглобулиновый домен, содержит по меньшей мере часть одного из доменов Сн2 или Сн3 Ι§6 человека.
Белок или полипептид ЛАСЕ может содержать полноразмерный ЛАСЕ (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:1) или фрагмент ЛАСЕ человека. В одном варианте осуществления полипептид ЛАСЕ не содержит никаких остатков сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность ЛАСЕ может содержать либо остатки 1-22, либо остатки 1-23 полноразмерного ЛАСЕ (8ЕЦ ΙΌ N0:1). В альтернативных вариантах осуществления полипептид ЛАСЕ может содержать последовательность, на 70%, или 80%, или 90% идентичную ЛАСЕ человека или его фрагменту. Например, в одном варианте осуществления, полипептид ЛАСЕ может содержать ЛАСЕ человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, №ерег е1 а1., (1992)). Или ЛАСЕ человека может содержать полноразмерный ЛАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:2 или 8ЕЦ ΙΌ N0:3) (фиг. 1А и 1В) или частью этой аминокислотной последовательности. Слитые белки данного изобретения могут также содержать зЛАСЕ (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:4), полипептид, на 90% идентичный зЛАСЕ, или фрагмент зЛАСЕ. Например, полипептид ЛАСЕ может содержать зЛАСЕ человека, или его фрагмент, с глицином в качестве первого остатка, а не с метионином (см., например, №ерег е1 а1., (1997)). Или ЛАСЕ человека может содержать зЛАСЕ с удаленной сигнальной последовательностью (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:5 или 8ЕЦ ΙΌ N0:6) (фиг. 1С) или частью этой аминокислотной последовательности. В других вариантах осуществления белок ЛАСЕ может содержать У-домен (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:7 или 8ЕЦ ΙΌ N0:8; фиг. ΙΌ). Или может быть использована последовательность, на 90% идентичная У-домену или его фрагменту. Или белок ЛАСЕ может содержать фрагмент ЛАСЕ, содержащий часть Удомена ЛАСЕ (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:9 или 8ЕЦ ΙΌ N0:10, фиг. ΙΌ). В одном варианте осуществления лигандсвязывающий сайт может содержать 8ЕЦ ΙΌ N0:9 или последовательность, на 90% идентичную ей, или 8ЕЦ ΙΌ N0:10 или последовательность, на 90% идентичную ей. Еще в одном варианте осуществления фрагмент ЛАСЕ является синтетическим пептидом.
Например, полипептид ЛАСЕ может содержать аминокислоты 23-116 ЛАСЕ человека (8ЕЦ ΙΌ N0:7) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-116 ЛАСЕ человека (8ЕЦ ΙΌ N0:8) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену ЛАСЕ. Или полипептид ЛАСЕ может содержать аминокислоты 124-221 ЛАСЕ человека (8ЕЦ ΙΌ N0:11) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С1-домену ЛАСЕ. В другом варианте осуществления, полипептид ЛАСЕ может содержать аминокислоты 227-317 ЛАСЕ человека (8ЕЦ ΙΌ N0:12) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую С2-домену ЛАСЕ человека. Или полипептид ЛАСЕ может содержать аминокислоты 23-123 ЛАСЕ человека (8ЕЦ ΙΌ N0:13) или последовательность на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-123 ЛАСЕ человека (8ЕЦ ΙΌ N0:14) или последовательность на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену ЛАСЕ человека и междоменному линкеру справа. Или полипептид ЛАСЕ может содержать аминокислоты 23-226 ЛАСЕ человека (8ЕЦ ΙΌ N0:17) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-226 ЛАСЕ человека (8ЕЦ ΙΌ N0:18) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую У-домену, С1-домену и междоменному линкеру, связывающему эти два домена. Или полипептид ЛАСЕ может содержать ами- 25 012586 нокислоты 23-339 КАСЕ человека (8ЕО ГО N0:5) или последовательность, на 90% идентичную ей, или 24-339 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:6) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую кКАСЕ (т.е. кодирующую V-, С1- и С2-домены и междоменные линкеры). Или могут быть использованы фрагменты каждой из этих последовательностей.
Слитый белок может включать в себя несколько типов пептидов, которые не произведены из КАСЕ или его фрагмента. Второй полипептид этого слитого белка может содержать полипептид, полученный из иммуноглобулина. Тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных изотипов тяжелой цепи: 1дС (γ), 1дМ (μ), ΙμΌ (δ), 1дЕ (ε) или 1дА (α). Кроме того, тяжелая цепь (или ее часть) может быть получена из любого из известных подтипов тяжелой цепи: 1дС1 (γ1), 1дС2 (γ2), 1дС3 (γ3), 1дС4 (γ4), 1дА1 (α1), 1дА2 (α2) или мутаций этих изотипов или подтипов, которые изменяют биологическую активность. Второй полипептид может содержать домены Сц2 и Сц3 1дС1 человека или часть любого, или обоих, из этих доменов. В качестве вариантов-примеров, полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека или их часть, может содержать 8Е0 ГО N0:38 или 8Е0 ГО N0:40. Этот пептид иммуноглобулина может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты 8Е0 ГО N0:39 или 8Е0 ГО N0:41.
Ее-часть цепи иммуноглобулина может быть провоспалительной ίη νίνο. Таким образом, в одном варианте осуществления КАСЕ-слитый белок данного изобретения содержит междоменный линкер, полученный из КАСЕ, а не междоменный шарнирный полипептид, полученный из иммуноглобулина.
Таким образом, в одном варианте осуществления слитый белок может дополнительно содержать полипептид КАСЕ, непосредственно слитый с полипептидом, содержащим домен Сн2 иммуноглобулина, или его фрагмент. В одном варианте осуществления этот домен Сн2 или его фрагмент содержит 8Е0 ГО N0:42.
В одном варианте осуществления полипептид КАСЕ содержит междоменный линкер КАСЕ, связанный с иммуноглобулиновым доменом КАСЕ таким образом, что С-концевая аминокислота этого иммуноглобулинового домена КАСЕ связана с ^концевой аминокислотой междоменного линкера, а Сконцевая аминокислота междоменного линкера КАСЕ непосредственно связана с ^концевой аминокислотой полипептида, содержащего домен Сн2 иммуноглобулина или его фрагмент. Полипептид, содержащий домен Сн2 иммуноглобулина, может содержать домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека. Например, полипептид, содержащий домены Сн2 и Сн3 1дС1 человека, может содержать 8Е0 ГО N0:38 или 8Е0 ГО N0:40.
Слитый белок данного изобретения может содержать единственный домен или множественные домены из КАСЕ. Полипептид КАСЕ, содержащий междоменный линкер, связанный с доменом полипептида КАСЕ, может также содержать фрагмент полноразмерного белка КАСЕ. Например, в одном варианте осуществления этот слитый белок может содержать два иммуноглобулиновых домена, полученных из белка КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес-полипептида человека. Этот слитый белок может содержать первый иммуноглобулиновый домен КАСЕ и первый междоменный линкер КАСЕ, связанные со вторым иммуноглобулиновым доменом КАСЕ и вторым междоменным линкером КАСЕ, так что ^концевая аминокислота первого междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой первого иммуноглобулинового домена КАСЕ, ^концевая аминокислота второго иммуноглобулинового домена КАСЕ связана с С-концевой аминокислотой первого междоменного линкера, N концевая аминокислота второго междоменного линкера связана с С-концевой аминокислотой второго иммуноглобулинового домена КАСЕ и С-концевая аминокислота второго междоменного линкера КАСЕ непосредственно связана с ^концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен Сн2 или его фрагмент. Например, полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-251 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:19) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24251 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:20) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую ν-домену, С1-домену, междоменному линкеру, связывающему эти два домена, и второму междоменному линкеру, справа от С1. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая 8Е0 ГО N0:30 или ее фрагмент, может кодировать КАСЕ-слитый белок из четырех доменов.
Альтернативно, слитый белок из трех доменов может содержать один иммуноглобулиновый домен, полученный из КАСЕ, и два иммуноглобулиновых домена, полученных из Ес-полипептида человека. Например, этот слитый белок может содержать единственный иммуноглобулиновый домен КАСЕ, связанный через междоменный линкер КАСЕ с ^концевой аминокислотой полипептида, содержащего иммуноглобулиновый домен Сн2 или его фрагмент. Например, этот полипептид КАСЕ может содержать аминокислоты 23-136 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:15) или последовательность, на 90% идентичную ей, или аминокислоты 24-136 КАСЕ человека (8Е0 ГО N0:20) или последовательность, на 90% идентичную ей, соответствующую ν-домену КАСЕ и междоменному линкеру справа. В одном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая 8Е0 ГО N0:31, или ее фрагмент может кодировать КАСЕ-слитый белок из трех доменов.
Междоменный линкерный фрагмент КАСЕ может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от иммуноглобулинового домена КАСЕ и, следовательно, связана с ним.
- 26 012586
Например, для У-домена РАСЕ этот междоменный линкер может содержать аминокислотные последовательности, которые находятся природно справа от У-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать 8ЕО ΙΌ N0:21, соответствующую аминокислотам 117-123 полноразмерного РАСЕ. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности РАСЕ. Например, может быть использован междоменный линкер, содержащий несколько аминокислот (например, 1-3, 1-5 или 1-10 или 1-15 аминокислот) слева и справа от 8Е0 ΙΌ N0:21. Таким образом, в одном варианте осуществления междоменный линкер содержит 8Е0 ΙΌ N0:23, содержащую аминокислоты 117-136 полноразмерного РАСЕ. Или могут быть использованы фрагменты 8Е0 ΙΌ N0:21 с делецией, например 1, 2 или 3 аминокислот из любого конца этого линкера. В альтернативных вариантах осуществления, этот линкер может содержать последовательность, которая на 70% идентична или на 80% идентична, или на 90% идентична 8Е0 ΙΌ N0:21 или 8Е0 ΙΌ N0:23.
Для С1-домена РАСЕ этот линкер может содержать пептидную последовательность, которая находится природно справа от этого С1-домена. В одном варианте осуществления этот линкер может содержать 8Е0 ΙΌ N0:22, соответствующую аминокислотам 222-251 полноразмерного РАСЕ. Или этот линкер может содержать пептид, имеющий дополнительные части природной последовательности РАСЕ. Например, может быть использован линкер, содержащий несколько аминокислот (1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот) слева и справа от 8Е0 ΙΌ N0:22. Или могут быть использованы фрагменты 8Е0 ΙΌ N0:22 с делецией, например 1-3, 1-5, или 1-10, или 1-15 аминокислот из любого конца этого линкера. Например, в одном варианте осуществления, междоменный линкер РАСЕ может содержать 8Е0 ΙΌ N0:24, соответствующую аминокислотам 222-226. Или междоменный линкер может содержать 8Е0 ΙΌ N0:44, соответствующую аминокислотам 318-342 РАСЕ.
Фармацевтически приемлемые носители могут содержать любой из фармацевтически признанных носителей, известных в данной области. Этот носитель может содержать разбавитель. В одном варианте осуществления фармацевтический носитель может быть жидкостью и слитый белок, или конструкция нуклеиновой кислоты, может быть в форме раствора. В другом варианте осуществления фармацевтически приемлемый носитель может быть твердым веществом в форме порошка, лиофилизированного порошка или таблетки. Или фармацевтический носитель может быть гелем, суппозиторием или кремом. В альтернативных вариантах осуществления этот носитель может включать в себя липосому, микрокапсулу, инкапсулированную полимером клетку или вирус. Таким образом, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает в себя, но не ограничивается ими, любые стандартные фармацевтически признанные носители, такие как вода, спирты, забуференный фосфатом солевой раствор, сахара (например, сахароза или маннит), масла или эмульсии, такие как эмульсии типа масло/вода или триглицеридная эмульсия, различные типы увлажняющих агентов, таблетки, таблетки с покрытием и капсулы.
Введение РАСЕ-слитых белков данного изобретения может использовать различные способы. Так, введение РАСЕ-слитого белка данного изобретения может использовать внутрибрюшинную (ΙΡ) инъекцию. Альтернативно, РАСЕ-слитый белок может вводиться перорально, интраназально или в виде аэрозоля. В другом варианте осуществления введение является внутривенным (ГУ). РАСЕ-слитый белок может также инъецироваться подкожно. В другом варианте осуществления, введение этого слитого белка является внутриартериальным. В другом варианте осуществления введение является сублингвальным. Введение может также использовать капсулу с пролонгированным высвобождением. Еще в одном варианте осуществления введение может быть трансректальным, например, с использованием суппозитория или т.п. Например, подкожное введение может быть применимо для лечения хронических нарушений, когда желательным является самостоятельное введение.
Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильного инъекционного раствора в нетоксичном парентерально приемлемом растворителе или носителе. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, находятся вода, раствор Рингера, 3-бутандиол, изотонический раствор хлорида натрия или водные буферы, такие как, например, физиологически приемлемые цитратный, ацетатный, глициновый, гистидиновый, фосфатный, трис- или сукцинатный буферы. Инъекционный раствор может содержать стабилизаторы для защиты против химической деградации и образования агрегатов. Стабилизаторы могут включать в себя антиоксиданты, такие как бутилированный гидроксианизол (ВНА) и бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), буферы (цитратный, глициновый, гистидиновый) или поверхностно-активные вещества (полисорбат 80, полоксамеры). Этот раствор может также содержать антимикробные консерванты, такие как бензиловый спирт и парабены. Этот раствор может также содержать поверхностно-активные вещества для уменьшения агрегации, такие как полисорбат 80, полоксомер или другие поверхностно-активные вещества, известные в данной области. Этот раствор может также содержать другие добавки, такие как сахар (сахара) или солевой раствор, для коррекции осмотического давления композиции, чтобы оно было сходным с осмотическим давлением крови человека.
Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильного лиофилизированного порошка для инъекции после воссоздания с разбавителем. Этим разбавителем может быть вода для инъекции, бактериостатическая вода для инъекции или стерильный солевой раствор. Лиофилизированный порошок может быть получен лиофилизацией раствора слитого белка для получения этого белка в сухом виде. Как
- 27 012586 известно в данной области, лиофилизированный белок обычно имеет увеличенную стабильность и более продолжительный период хранения, чем жидкий раствор этого белка. Лиофилизированный порошок (брикет) может содержать буфер для коррекции рН, такой как, например, физиологически приемлемый цитратный, ацетатный, глициновый, гистидиновый, фосфатный, трис- или сукцинатный буфер. Этот лиофилизированный порошок может также содержать лиопротекторы для поддержания его физической и химической стабильности. Обычно используемыми лиопротекторами являются нередуцирующие сахара и дисахариды, такие как сахароза, маннит или трегалоза. Лиофилизированный порошок может содержать стабилизаторы для защиты против деградации и образования агрегатов. Стабилизаторы могут включать в себя, но не ограничиваются ими, антиоксиданты (ВНА, ВНТ), буферы (цитратный, глициновый, гистидиновый) или поверхностно-активные вещества (полисорбат 80, полоксамеры). Лиофилизированный порошок может также содержать антимикробные консерванты, такие как бензиловый спирт и парабены. Лиофилизированный порошок может также содержать поверхностно-активные вещества для уменьшения агрегации, такие как, но не только, Полисорбат 80 и полоксомер. Лиофилизированный порошок может также содержать добавки (например, сахара или солевой раствор) для коррекции осмотического давления, чтобы оно было сходным с осмотическим давлением крови человека после воссоздания этого порошка в раствор. Лиофилизированный порошок может также содержать наполнители, такие как сахара и дисахариды.
Фармацевтические композиции для инъекции могут находиться также в форме маслянистой суспензии. Эта суспензия может быть приготовлена в соответствии с известными способами с применением подходящих диспергирующих и увлажняющих агентов и суспендирующих агентов, описанных выше. Кроме того, стерильные, нелетучие масла обычно используются в качестве растворителя или суспендирующей среды. Например, любое легкое нелетучее масло может быть использовано с использованием синтетических моно- или диглицеридов. Масляные суспензии могут быть также приготовлены суспендированием активного ингредиента в растительном масле, например арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Например, в приготовлении инъекционных растворов находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. Масляные суспензии могут содержать загущающий агент, например пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Эти композиции могут сохраняться добавлением антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
Фармацевтические композиции данного изобретения могут также быть в форме эмульсий типа масло в воде или водных суспензий. Масляной фазой может быть растительное масло, например оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, например жидкий парафин, или их смесь. Подходящими эмульгирующими агентами могут быть природно встречающиеся камеди, например, аравийская камедь или трагакантовая камедь, природно встречающиеся фосфатиды, например, соя, лецитин и сложные эфиры или неполные эфиры, полученные из жирных кислот и ангидридов гекситов, например моноолеат сорбитана, и продукты конденсации указанных неполных эфиров с этиленоксидом, например полиоксиэтиленсорбитан.
Водные суспензии могут также содержать активные соединения в смеси с эксципиентами. Такие эксципиенты могут включать в себя суспендирующие агенты, например натрий-карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или увлажняющие агенты, такие как природно встречающийся фосфатид, такой как лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с алифатическими спиртами с длинной цепью, например гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбита, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гекситов, например моноолеат полиэтиленсорбитана.
Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для приготовления водной суспензии добавлением воды, могут обеспечивать активное соединение в смеси с диспергирующим агентом, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Подходящие консерванты, диспергирующие агенты и суспендирующие агенты описаны выше.
Эти композиции могут быть в форме суппозиториев для ректального введения соединений данного изобретения. Эти композиции могут быть приготовлены смешиванием лекарственного средства с подходящим нераздражающим эксципиентом, который является твердым при обычных температурах, но жидким при ректальной температуре и, следовательно, будет плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие материалы включают в себя, например, какао-масло и полиэтиленгликоли.
Для местного применения могут быть использованы кремы, мази, гели, растворы или суспензии, содержащие соединения этого изобретения. Местные применения могут также включать в себя жидкости для промывания полости рта и полоскания горла. Могут быть использованы подходящие консерванты, антиоксиданты, такие как ВНА и ВНТ, диспергирующие агенты, поверхностно-активные вещества или буферы.
- 28 012586
Соединения данного изобретения могут также вводиться в форме липосомных систем доставки, таких как небольшие однослойные пузырьки (везикулы), большие однослойные пузырьки и многослойные пузырьки. Липосомы могут быть приготовлены из различных фосфолипидов, таких как холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины.
В некоторых вариантах осуществления соединения данного изобретения могут быть модифицированы для дополнительного замедления клиренса из кровотока метаболическими ферментами. В одном варианте осуществления эти соединения могут быть модифицированы ковалентным присоединением водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры ПЭГ и полипропиленгликоля, поливинилпирролидон или полипролин, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт и т. п. Такие модификации могут также увеличивать растворимость этого соединения в водном растворе. Полимеры, такие как ПЭГ, могут быть ковалентно присоединены к одному или нескольким реакционноспособным аминоостаткам, сульфгидрильным остаткам или карбоксильным остаткам. Были описаны многочисленные активированные формы ПЭГ, в том числе активные эфиры карбоновой кислоты или карбонатные производные, в частности, такие, в которых уходящими (отщепляемыми) группами являются №гидроксисукцинимид, п-нитрофенол, имидазол или 1-гидрокси-2-нитробензол-3-сульфон, для реакции с аминогруппами, многомодальные или галогенацетильные производные для реакции с сульфгидрильными группами, и производные аминогидразина или гидразида для реакции с углеводными группами.
Дополнительные способы получения белковых композиций, которые могут быть использованы со слитыми беклами данного изобретения, описаны в патентах США № 6267958 и 5567677.
В следующем аспекте данного изобретения модуляторы КАСЕ данного изобретения используются в адъювантных терапевтических или комбинированных терапевтических способах лечения с другими известными терапевтическими агентами. Далее приведен неисчерпывающий перечень адъювантов и дополнительных терапевтических агентов, которые могут быть использованы в комбинации с модуляторами КАСЕ-слитых белков данного изобретения:
Фармакологические классификации противораковых агентов:
1. Алкилирующие агенты: циклофосфамид, нитрозомочевины, карбоплатин, цисплатин, прокарбазин.
2. Антибиотики: блеомицин, даунорубицин, доксорубицин.
3. Антиметаболиты: метотрексат, цитарабин, фторурацил.
4. Алкалоиды растений: винбластин, винкристин, этопозид, паклитаксел.
5. Гормоны: тамоксифен, октреотида ацетат, финастерид, флутамид.
6. Модификаторы биологической реакции: интерфероны, интерлейкины.
Фармакологические классификации для лечения ревматоидного артрита:
1. Анальгетики: аспирин.
2. №А1Э (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства): ибупрофен, напроксен, диклофенак.
3. ЭМАКИ (модифицирующие заболевание противоревматические лекарственные средства): метотрексат, препараты золота, гидроксихлороквин, сульфазалазин.
4. Модификаторы биологической реакции, ЭМАКЭ: этанерцепт, инфликсимаб, глюкокортикоиды.
Фармакологические классификации для лечения сахарного диабета:
1. Сульфонилмочевины: толбутамид, толазамид, глибурид, глипизид.
2. Бигуанидины: метформин.
3. Разносторонние пероральные агенты: акарбоза, троглитазон.
4. Инсулин.
Фармакологические классификации для лечения болезни Альцгеймера:
1. Ингибитор холинэстеразы: такрин, донепезил.
2. Антипсихотические средства: галоперидол, тиоридазин.
3. Антидепрессанты: дезипрамин, флуоксетин, тразодон, пароксетин.
4. Противосудорожные средства: карбамазепин, вальпроевая кислота.
Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение может обеспечивать способ лечения опосредуемых КАСЕ заболеваний, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в нем, терапевтически эффективного количества КАСЕ-слитого белка в комбинации с терапевтическими агентами, выбранными из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, алкалоидов растений, антибиотиков, гормонов, модификаторов биологической реакции, анальгезирующих агентов, Н8АГО. ЭМАКИ, глюкокортикоидов, сульфонилмочевин, бигуанидов, инсулина, ингибиторов холинэстеразы, антипсихотических средств, антидепрессантов и антиконвульсантов (противосудорожных средств). В дополнительном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию данного изобретения, описанную выше, дополнительно содержащую один или несколько терапевтических агентов, выбранных из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, алкалоидов растений, антибиотиков, гормонов, модификаторов биологической реакции, анальгезирующих агентов, №АГО, ЭМАКЭ, глюкокортикоидов, сульфонилмочевин, бигуанидов, инсу
- 29 012586 лина, ингибиторов холинэстеразы, антипсихотических средств, антидепрессантов и антиконвульсантов (противосудорожных средств).
Примеры
Признаки и преимущества идеи изобретения, охватываемой данным изобретением, иллюстрируются дополнительно в следующих далее примерах.
Пример 1. Получение слитых белков КАСЕ-Ес ΙβΟ.
Конструировали две плазмиды для экспрессии слитых белков КАСЕ-Ес ЦС. Обе плазмиды конструировали лигированием различных длин 5'-кДНК-последовательности из КАСЕ человека с той же самой 3'-кДНК-последовательностью из Ес ΙβΟ человека (γ1). Затем эти экспрессионные последовательности (т.е. продукты лигирования) встраивали в экспрессирующий вектор рсЭНА3.1 (ΙηνίίΓο^η, СА). Последовательности нуклеиновых кислот, которые являются кодирующим районом слитого белка, показаны на фиг. 2 и 3. Для слитого белка ТТР-4000 последовательность нуклеиновой кислоты 1-753 (выделенная жирным шрифтом) кодирует №концевую последовательность белка КАСЕ, тогда как последовательность нуклеиновой кислоты 754-1386 кодирует последовательность Ес-белка ЦС (фиг. 2). Для ТТР3000, последовательность нуклеиновой кислоты 1-408 (выделенная жирным шрифтом) кодирует N концевую последовательность белка КАСЕ, тогда как последовательность нуклеиновой кислоты 4091041 кодирует последовательность Ес-белка ЦС (фиг. 3).
Для получения КАСЕ-слитых белков экспрессирующие векторы, содержащие последовательности нуклеиновых кислот либо 8ЕО ΙΌ N0:30, либо 8Е0 ΙΌ N0:31, стабильно трансфицировали в клетки СНО. Положительные трансформанты отбирали на устойчивость к неомицину, сообщаемую этой плазмидой, и клонировали.
Высокопроизводительные клоны, детектируемые при помощи Вестерн-блот-анализа супернатанта, размножали и продукт гена очищали аффинной хроматографией с использованием Белок А-колонок. Экспрессию оптимизировали таким образом, что клетки продуцировали рекомбинантный ТТР-4000 при уровнях приблизительно 1,3 г/л.
Экспрессируемые полипептиды, представляющие два слитых белка, иллюстрированы на фиг. 4-6. Для содержащей четыре домена структуры ТТР-4000, первые 251 аминокислота (показанные жирным шрифтом на фиг. 4) содержат сигнальную последовательность (1-22/23), иммуноглобулиновый (и лигандсвязывающий) У-домен (23/24-116), второй междоменный линкер (117-123), второй иммуноглобулиновый домен (Сн2) (124-221) и второй линкер (222-251) КАСЕ-белка человека (фиг. 4, 6В). Последовательность 252-461 включает в себя иммуноглобулиновые домены Сн2 и Сн3 ΙβΟ.
Для содержащей три домена структуры ТТР-3000, первые 136 аминокислот (показанные жирным шрифтом) содержат сигнальную последовательность 1-22/23) иммуноглобулиновый (и лигандсвязывающий) У-домен (23/24-116) и междоменную линкерную последовательность (117-136) КАСЕ-белка человека (фиг. 5, 6В). Кроме того, для ТТ3 последовательность 137-346 включает в себя иммуноглобулиновые домены Сн2 и Сн3 ΙβΟ.
Пример 2. Способ испытания активности слитого белка КАСЕ4дС1.
А. Связывание лиганда ίη νίίΓο.
Известные лиганды КАСЕ наносили в виде покрытия на поверхность планшетов МахбогЬ в концентрации 5 мкг на лунку. Планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи. После инкубирования лигандов планшеты аспирировали и в планшеты добавляли блокирующий буфер 1% БСА в 50 мМ имидазоловом буфере (рН 7,2) и выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты аспирировали и/или промывали промывочным буфером (20 мМ имидазол, 150 мМ №С1, 0,05% Твин-20, 5 мМ СаС12 и 5 мМ МдС12, рН 7,2). Готовили раствор ТТР-3000 (ТТ3) в исходной концентрации 1,082 мг/мл и раствор ТТР-4000 (ТТ4) в исходной концентрации 370 мкг/мл. Этот слитый белок добавляли при увеличивающихся разведениях исходной пробы. КАСЕ-слитому белку давали инкубироваться с иммобилизованным лигандом при 37°С в течение одного часа, после чего этот планшет промывали и анализировали на связывание слитого белка. Связывание детектировали добавлением комплекса иммунодетектирования, содержащего моноклональное мышиное антитело против ΙβΟ1 человека, разведенное 1:11000 до конечной тест-концентрации (ЕАС) 21 нг/100 мкл, биотинилированное козье антитело против мышиного ЦС, разведенное 1:500, до ЕАС 500 нг/мкл, и связанную с авидином щелочную фосфатазу. Этот комплекс инкубировали с иммобилизованным слитым белком в течение одного часа при комнатной температуре, после чего планшет промывали и добавляли субстрат для щелочной фосфатазы паранитрофенилфосфат ОРР). Связывание этого комплекса с иммобилизованным слитым белком определяли количественно измерением превращения Р№Р в пара-нитрофенол (Р№), который измеряли спектрофотометрически при 405 нм.
Как показано на фиг. 7, слитые белки ТТР-4000 (ТТ4) и ТТР-3000 (ТТ3) специфически взаимодействуют с известными лигандами КАСЕ амилоидом-бета (АЬеίа), 8100Ь (8100) и амфотерином (Атрбо). В отсутствие лиганда, т.е. только с БСА-покрытием (БСА или БСА + промывка), не было увеличения оптической плотности в сравнении с уровнями, относимыми к неспецифическому связыванию комплекса иммунодетектирования. При использовании амилоида-бета в качестве меченого лиганда может быть необходимым предынкубирование амилоида-бета перед анализом.
- 30 012586
Предынкубирование может позволить амилоиду-бета самоагрегироваться в форму складчатого листа, так как амилоид-бета может преимущественно связываться с КАСЕ в форме складчатого листа.
Дополнительное доказательство специфического взаимодействия между КАСЕ-слитыми белками ТТР-4000 и ТТР-3000 с лигандами КАСЕ представлено в виде примера в исследованиях, показывающих, что лиганд КАСЕ способен эффективно конкурировать с известным лигандом КАСЕ за связывание с этими слитыми белками. В этих исследованиях амилоид-бета (А-бета) иммобилизовали на планшете Мах1когЬ и слитый белок добавляли, как описано выше. Кроме того, в некоторые лунки добавляли лиганд КАСЕ одновременно со слитым белком.
Было обнаружено, что лиганд КАСЕ мог блокировать связывание ТТР-4000 (ТТ4) на приблизительно 25%-30%, когда ТТР-4000 присутствовал при 123 мкг/мл (разведение 1:3, фиг. 8). Когда исходный раствор ТТР-4000 разбавляли в 10 или 30 раз (1:10 или 1:30), связывание этого слитого белка с иммобилизованным лигандом полностью ингибировалось лигандом КАСЕ. Подобным образом, этот лиганд КАСЕ блокировал связывание ТТР-3000 (ТТ3) на приблизительно 50%, когда ТТР-300 присутствовал при 360 мкг/мл (разведение 1:3, фиг. 9). Когда исходный раствор ТТР-300 разводили в 10 раз (1:10), связывание этого слитого белка с иммобилизованным лигандом полностью ингибировалось этим лигандом КАСЕ. Таким образом, специфичность связывания КАСЕ-слитого белка с лигандом КАСЕ была зависимой от дозы. Как показано на фиг. 8 и 9, также не детектировали существенного связывания в отсутствие слитого белка, т.е. при использовании только комплекса иммунодетектирования (Только комплекс).
В. Действие КАСЕ-слитых белков в анализе на основе клеток.
Предыдущее исследование показало, что миелоидные клетки ТНР-1 могут секретировать ЮТ-а в ответ на лиганды КАСЕ. В этом анализе клетки ТНР-1 культивировали в среде ΗΡΜΙ-1640, дополненной 10% ФТС, с использованием протокола, обеспеченного АТСС. Эти клетки индуцировали для секреции Т№-а посредством стимуляции КАСЕ с использованием 0,1 мг/мл 8100Ь как в отсутствие, так и в присутствии слитых белков ТТР-3000 (ТТ3) или ТТР-4000 (ТТ4) (10 мкг), кКАСЕ (10 мкг) и ЦС человека (10 мкг) (т.е. в качестве отрицательного контроля). Количество Т№-а, секретируемое клетками ТНР-1, измеряли спустя 24 ч после добавления этих белков в культуре клеток с использованием коммерчески доступного набора ЕЫ8А для Т>-а ( (К&П 8ук!етк, М1ппеаро11к, МЩ). Результаты на фиг. 10 демонстрируют, что эти слитые белки ингибируют 8100Ь/К АСЕ-индуцированное продуцирование Т№-а в этих клетках. Как показано на фиг. 10, после добавления 10 мкг КАСЕ-слитого белка ТТР-3000 или ТТР-4000 индукция Т№-а 8100Ь (0,1 мг/мл ЕАС) уменьшалась на приблизительно 45-70%, соответственно. Слитый белок ТТР-4000 может быть, по меньшей мере, таким же эффективным в блокировании 8100Ьиндукции Т№-а, что и кКАСЕ (фиг. 10). Специфичность ингибирования в отношении КАСЕпоследовательностей ТТР-4000 и ТТР-3000 показана экспериментом, в котором к 8100Ь-стимулируемым клеткам добавляли только ЦС. Добавление ΙβΟ и 8100Ь в анализ показывает такие же уровни Т№-а, что и один 8100Ь. Специфичность ингибирования индукции ЮТ-а посредством ТТР-4000 и ТТР-3000 в отношении КАСЕ-последовательностей этого слитого белка показана экспериментом, в котором к 8100Ьстимулированным клеткам добавляли только ЦС. Можно видеть, что добавление ЦС. т.е. ΙβΟ человека без КАСЕ-последовательности (ЦС человека 81дта добавляли при 100 мкг на лунку) и 8100Ь в анализ показывает те же самые уровни Т№-а, что и один 8100Ь.
Пример 3. Фармакокинетический профиль ТТР-4000.
Для определения, имеет ли ТТР-4000 лучший фармакокинетический профиль в сравнении с кКАСЕ человека, крысам и приматам (не являющимся человеком) вводили внутривенной инъекцией ЦУ) ТТР4000 (5 мг/кг) и затем плазму оценивали на присутствие ТТР-4000. В этих экспериментах два самца обезьян получали единственную болюсную дозу ГУ ТТР-4000 (5 мг/мл/кг) в периферическую вену с последующим введением приблизительно 1,0 мл солевого раствора. Пробы крови (приблизительно 1,0 мл) собирали перед введением дозы (т.е. перед инъекцией ТТР-4000) или при 0,083, 0,25, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288 и 336 часах после введения дозы в пробирки, содержащие гепарин-литий. После сбора проб крови пробирки помещали на увлажненный лед (максимально на 30 минут) до центрифугирования при охлаждении (при 2-8°С) при 1500/д в течение 15 мин. Затем каждую собранную пробу плазмы хранили в замороженном виде (-70°С±10°С) до анализа на полипептид КАСЕ с использованием ЕЫ8А в разных временных точках после инъекции, как описано в примере 6.
Этот кинетический профиль, показанный на фиг. 11, выявил, что как только ТТР-4000 насыщал его лиганды, как видно по довольно крутому наклону альфа-фазы у 2 животных, он сохранял конечный полупериод существования, больший, чем 300 ч. Этот полупериод существования в плазме является значимо большим, чем полупериод существования кКАСЕ человека в плазме (обычно около 2 ч), и обеспечивает возможность единственных инъекций для острых и полухронических показаний. На фиг. 11 каждая кривая представляет разных животных при одних и тех же экспериментальных условиях.
Пример 4. ТТР-4000-активация Ес.
Выполняли эксперименты для измерения активации Ес-рецептора КАСЕ-слитым белком ТТР-4000 в сравнении с ЦС человека. Активацию Ес-рецептора измеряли измерением секреции ЮТ-а из клеток ТНР-1, которые экспрессируют Ес-рецептор. В этих экспериментах 96-луночный планшет покрывали 10
- 31 012586 мкг на лунку ТТР-4000 или Ι§0 человека. Стимуляция Ес приводит к секреции ΤΝΕ-α. Количество ΤΝΕα измеряли твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЬРЗА).
Таким образом, в этом анализе, миелоидную клеточную линию, ТНР-1 (АТСС № ΤΙΒ-202) поддерживали в среде ΚΡΜΙ-1640, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой в соответствии с инструкциями АТСС. Обычно 40000-80000 клеток на лунку индуцировали для секреции ΤΝΕ-альфа посредством стимуляции Ес-рецептора предварительным покрытием лунки 10 мкг/мл либо агрегированного нагреванием (63°С в течение 30 минут) ТТР-4000, либо ΙβΟ1 человека. Количество ΤΝΕ-альфа, секретируемого клетками ТНР-1, измеряли в супернатантах, собранных из 24-часовых культур клеток в обработанных лунках с использованием коммерчески доступного набора ΤΝΕ ЕЫЗА (В&О 8у81ешк, МшпеароНк, ΜΝ # ΟΤΛ00ί.') в соответствии с инструкциями.
Результаты показаны на фиг. 12, где можно видеть, что ТТР-4000 генерирует менее чем 2 нг/лунку ΤΝΕ, а ΙβΟ генерирует более чем 40 нг/лунку.
Пример 5. Активность ТТР-4000 ίη νί\Ό.
Активность ТТР-4000 сравнивали с кВАСЕ в нескольких моделях заболеваний человека ίη νί\Ό.
A. ТТР-4000 в модели рестеноза животного.
ВАСЕ-слитый белок ТТР-4000 оценивали в модели рестеноза диабетической крысы, которая включала в себя измерение пролиферации гладких мышц и расширения интимы спустя 21 день после сосудистого повреждения. В этих экспериментах баллонное повреждение левой общей сонной артерии выполняли у крыс с сахарным диабетом и недиабетических крыс с использованием стандартных процедур. Ударную дозу (3 мг на крысу) ΙβΟ, ΤΤΡ-4000 или забуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР) вводили внутрибрюшинно (ΙΡ) за один день перед повреждением. Поддерживающую дозу доставляли каждый второй день до 7 дней после повреждения (т.е. в день 1, 3, 5 и 7 после повреждения). Подерживающая доза была высокой, равной 1 мг на животное для одной группы, или низкой, равной 0,3 мг на животное для второй группы. Для измерения пролиферации клеток гладких мышц сосудов (У8МС) животных умерщвляли при 4 днях и 21 дне после повреждения.
Для измерения пролиферации клеток 4-дневные животные получали внутрибрюшинную инъекцию бромдезоксиуридина (ВгОбИ) 50 мг/кг при 18, 12 и 2 ч перед эвтаназией. После умерщвления собирали все левые и правые сонные артерии. Образцы хранили в Шйосйоюе в течение по меньшей мере 24 ч перед заливкой. Оценку пролиферации У8МС выполняли с использованием мышиного моноклонального анти-Вгби-антитела. Использовали флуоресцентно меченое козье вторичное антитело против мышиного антитела. Количество ВгбИ-положительных ядер на срез считали два наблюдателя, которым не были известны схемы лечения.
Остальных крыс умерщвляли в день 21 для морфометрического анализа. Морфометрические анализы выполнялись наблюдателем, которому не были известны группы исследования, с использованием цифрового программного обеспечения микроскопической планиметрии Ипаде-Рго Р1ик на серийных срезах (с интервалом 5 мм) сонных артерий, окрашенных по Уап С1екоп. Все данные выражали в виде среднего ± стандартное отклонение (80). Статистический анализ выполняли с использованием программы 8Р88. Непрерывные переменные сравнивали с использованием непарных ΐ-критериев. Величины Р<0,05 считали статистически значимыми.
Как видно на фиг. 13 А и 13В, обработка ТТР-4000 значимо уменьшала отношение интима/медиа и пролиферацию клеток гладких мышц сосудов зависимым от дозы образом. На фиг. 13В ось у представляет количество пролиферирующих ВгбИ-клеток.
B. ТТР-4000 в модели АО животного.
Эксперименты выполняли для оценки, может ли ТТР-4000 влиять на образование амилоида и когнитивную дисфункцию в мышиной модели АО. Эти эксперименты использовали трансгенных мышей, экспрессирующих белок-предшественник амилоида человека с мутацией 8\\ό6ι81ι (АРР) под контролем промотора РОСЕ-В-цепи. На протяжении времени эти мыши генерировали высокие уровни лиганда ВАСЕ, амилоида-бета (Ав). Ранее было показано, что лечение кВАСЕ в течение 3 месяцев уменьшало как образование амилоидных бляшек в головном мозгу, так и связанное с ними увеличение воспалительных маркеров в этой модели.
АРР-мышей (самцов), используемых в этом эксперименте, получали микроинъекцией гена АРР человека (с мутациями 8\уеб1к11 и Ьопбоп) в яйцеклетки мыши под контролем промотора гена В-цепи фактора роста человека (РОСЕ-В). Эти мыши были получены на основе фенотипа С57ВБ/6 и разработаны в Мо1еси1аг ^егерен^к Шс. Животных кормили аб НЬйиш и поддерживали спариванием братьев с сестрами. Мыши, полученные из этой конструкции, развивали амилоидные отложения, начиная с 6-месячного возраста. Животным давали достичь возраста 6 месяцев и затем их поддерживали в течение 90 дней и умерщвляли для определения количества амилоида.
АРР-трансгенным мышам вводили носитель или ТТР-4000 каждый второй день |с.|об (1.р.)] в течение 90 дней, начиная с 6-месячного возраста. В конце этого эксперимента животных умерщвляли и испытывали на нагрузку Ав-бляшек в головном мозге (т.е. на количество бляшек), 6-месячную контрольную АРР-группу использовали для определения фона отложения амилоида. Кроме того, в конце этого
- 32 012586 исследования животных подвергали бихевиористическому (поведенческому) анализу (с использованием водного лабиринта Морриса). Исследователям не были известны соединения исследования. Пробы давали мышам при 0,25 мл/мышь каждый второй день. Кроме того, одна группа мышей получали 200 мкг/день кКАСЕ человека.
1. Отложение амилоида-бета.
Для гистологического испытания животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией (ΙΡ) натрий-пентобарбитала (50 мг/кг). Животных транскардиально перфузировали забуференным фосфатом солевым раствором 4°С (ЗФР) и затем 4% параформальдегидом. Головной мозг извлекали и помещали в 4% параформальдегид и выдерживали в течение ночи. Этот головной мозг обрабатывали парафином и заливали. Получали 10-серийные срезы толщиной 30 мкм головного мозга. Срезы подвергали действию первичного антитела в течение ночи при 4°С (анти-Ав-пептид-антитела) для детектирования отложений амилоида в головном мозге трансгенных животных (Сио с1 а1., I. №игоксг, 22:5900-5909 (2002)). Срезы промывали в забуференном Трисом солевом растворе (ТВ8) и добавляли вторичное антитело и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания эти срезы инкубировали в соответствии с инструкциями в наборе УесЮг АВС Е111е (Усс1ог БаЬо1а1опек) и окрашивали диаминобензойной кислотой (ИАВ). Реакции останавливали в воде и накрывали покровным стеклом после обработки ксилолом. Площадь амилоида в каждом срезе определяли с использованием компьютерной системы анализа изображения, состоящей из компьютера Ротеег МаспИокН с Ошск Саркис Ггате дгаЬЬег сагб, камеры Ш1ас1а ССЭ, смонтированной на микроскопе 01утрик и штатива для камеры. Использовали программу NIΗ Инаде Апа1ук1к 8ойтеаге, ν. 1.55. Изображения захватывали и общую площадь амилоида определяли в десяти срезах. Все измерения выполнял единственный оператор, не знающий статуса обработки. Для расчета объема амилоида выполняли суммирование объемов амилоидов этих срезов и деление на общее количество срезов.
Для количественного анализа использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) для измерения уровней общего Ав человека, Ав1оа1 и Ав1-42 в головном мозге АРР-трансгенных мышей (Вюкоигсе ИНегпаИопаИ СашагШо, СА). Ав±оШ1 и Ав1-42 экстрагировали из головного мозга мышей гидрохлоридом гуанидина и определяли количественно, как описано изготовителем. Этот анализ экстрагирует общий Ав-пептид из головного мозга (как растворимый, так и агрегированный).
2. Когнитивная функция.
Тестирование с использованием водного лабиринта Морриса выполняли следующим образом: всех мышей тестировали один раз в тесте водного лабиринта Морриса в конце этого эксперимента. Мышей тренировали в открытом водном лабиринте 1,2 м. Бассейн наполняли до глубины 30 см водой и поддерживали при 25°С. Платформу для выхода (10 см2) помещали на 1 см ниже поверхности воды. Во время этих испытаний платформу вынимали из этого бассейна. Инициирующий (сигнальный) тест проводили в бассейне, окруженном белыми занавесками, для сокрытия каких-либо сигналов, находящихся вне лабиринта. Всех животных подвергали непространственной предварительной тренировке (№Р) в течение трех последовательных дней. Эти испытания предназначены для подготовки этих животных к конечному поведенческому тесту для определения удерживания в памяти того, как найти эту платформу. Эти испытания не регистрировались и предназначались только для целей тренировки. Для исследований тренировки и научения занавески удаляли для доступа сигналов вне лабиринта (это позволяло идентифицировать животных с нарушениями плавания). В день 1 мышей помещали на скрытую платформу на 20 с (испытание 1), для испытаний 2-3 животных выпускали в воду на расстоянии 10 см от сигнальной платформы или скрытой платформы (испытание 4) и позволяли им плыть к этой платформе. На второй день испытаний скрытую платформу перемещали случайным образом между центром бассейна или центром каждого квадранта. Животных выпускали в бассейн случайным образом обращенными к стенке и давали им 60 с для достижения платформы (3 испытания). В третьем испытании животных подвергали трем испытаниям, двум со скрытой платформой и одному с сигнальной платформой. Спустя два дня после этой предварительной тренировки (№Р) животных подвергали конечным поведенческим испытаниям (тесту водного лабиринта Морриса). Для этих испытаний (3 испытания на одно животное) платформу помещали в центре одного квадранта бассейна и животных выпускали случайным образом обращенными к стенке. Животному давали найти платформу или плыть в течение 60 с (латентный период, время, которое занимает нахождение платформы). Всех животных испытывали в пределах 4-6 ч введения дозы и отбирали случайным образом для тестирования оператором, который является «слепым» в отношении тест-группы.
Результаты выражают в виде среднего ± стандартное отклонение (8Ό). Значимость различий в исследованиях с амилоидом и поведенческих исследованиях анализировали с использованием ί-критерия. Сравнения выполняли между 6-месячной АРР-контрольной группой и обработанными ТТР-4000 животными, а также 9месячной обработанной носителем АРР группой и обработанными ТГР-400 животными. Различия с Р<0,05 считали значимыми. Процентные изменения в амилоиде и поведении определяли суммированием данных в каждой группе и делением на сравнение (т.е. 1, гр./6-месячный контроль = % изменение).
Фиг. 14А и 14В показывают, что мыши, обработанные в течение 3 месяцев либо ТТР-4000, либо мышиным кКАСЕ, имели меньше Ав-бляшек и меньшую когнитивную дисфункцию, чем обработанные
- 33 012586 носителем и ^С1 человека ЦдС1) (отрицательный контроль) животные. Эти данные указывают на то, что ТТР-40000 является эффективным в уменьшении патологии АО в модели трансгенных животных. Выло также обнаружено, что, как и зКАСЕ, ТТР-4000 может уменьшать количество воспалительных цитокинов ГС-1 и ТИГ-а (данные не показаны).
С. Эффективность ТТР-4000 в модели инсульта.
ТТР-4000 сравнивали также с зКАСЕ в релевантной для этого заболевания модели инсульта животного. В этой модели среднюю сонную артерию мыши лигировали в течение 1 ч с последующими 23 ч реперфузии, после чего этих мышей умерщвляли и оценивали площадь повреждения в головном мозге. Мышей обрабатывали зКАСЕ или ТТР-4000 или контрольным иммуноглобулином непосредственно перед реперфузией.
В этих экспериментах самцов мышей С57ВЬ/6 инъецировали носителем при 250 мкл/мышь или тест-изделиями ТТР (ТТР-3000, ТТР-4000 при 250 мкл/мышь). Мышей инъецировали внутрибрюшинно, спустя 1 ч после инициации ишемии. Мышей подвергали одному часу церебральной ишемии с последующими 24 ч реперфузии. Для индукции ишемии каждую мышь анестезировали и температуру тела поддерживали при 36-37°С наружным согреванием. Левую общую сонную артерию (ССА) обнажали разрезом по средней линии в шее. Помещали микрохирургический зажим вокруг начала внутренней сонной артерии (Ιί.Ά). Дистальный конец этой ЕСА лигировали шелковой нитью и рассекали. Хирургическую шелковую нить 6-0 обвязывали слабо вокруг культи ЕСА. Отполированный огнем кончик найлонового шовного материала осторожно вводили в культю ЕСА. Петлю шелковой нити 6-0 затягивали вокруг этой культи и найлоновый шовный материал продвигали во внутреннюю сонную артерию и через нее (ЮА), пока он не находился в передней мозговой артерии, закупоривая тем самым переднюю соединяющую и среднюю мозговые артерии. После того как найлоновый шовный материал находился на месте в течение 1 ч, животное повторно анестезировали, регистрировали ректальную температуру и этот шовный материал удаляли и разрез закрывали.
Объем повреждения определяли анестезированием этих животных внутрибрюшинной инъекцией натрий-пентобарбитала (50 мг/кг) и затем удалением головного мозга. Затем получали четыре 2 мм-среза головного мозга через поврежденную область и помещали в 2% трифенилтетразолийхлорид (ТТС) на 30 мин. После этого, эти срезы помещали в 4% параформальдегид и выдерживали в течение ночи. Площадь повреждения в каждом срезе определяли с использованием компьютерной системы анализа изображения, состоящей из компьютера Ро\тег МастФкй с Ошск СарПте Ггате дгаЬЬег сагб, камеры нйасЫ ССО, смонтированной на микроскопе О1утри§ и штатива для камеры. Использовали программу ΝΙ4 Инаде АпаГъй 8ойгате, ν. 1.55. Изображения захватывали и общую площадь амилоида определяли в десяти срезах. Все измерения выполнял единственный оператор, не знающий статуса обработки. Суммированием объемов повреждений этих срезов рассчитывали общий объем повреждения. Результаты выражены в виде среднего ± стандартное отклонение (80). Значимость различия в данных по объемам повреждений анализировали с использованием ΐ-критерия.
Как иллюстрировано данными, приведенными в табл. 2, ТТР-4000 был более эффективным, чем зКАСЕ, в ограничении площади повреждения в этих животных, что позволяет предположить, что ТТР4000, вследствие его лучшего полупериода существования в плазме, был способен поддерживать лучшую защиту у этих мышей.
Пример 6. Детектирование КАСЕ-слитого белка при помощи ЕЫ8А.
Сначала 50 мкл КАСЕ-специфического моноклонального антитела 1НВ1011 в концентрации 10 мкг/мл в 1хЗФР рН 7,3 наносят в виде покрытия на планшеты инкубированием в течение ночи. Готовые к использованию планшеты промывают три раза 300 мкл промывочным буфером 1Х имидазол-Твин и блокируют 1% БСА. Пробы (разведенные) и стандартные разведения известных разведений ПР-4000 добавляют при конечном объеме 100 мкл. Пробам дают инкубироваться при комнатной температуре в течение 1 ч. После инкубации планшеты промывают три раза. Конъюгат козьих антител против Ι§61 человека (81дта А3312) в 1 хЗФР с 1% БСА добавляют и дают инкубироваться при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты промывают три раза. Окрашивание выполняли с использованием паранитрофенилфосфата.
Пример 7. Количественное определение связывания лиганда КАСЕ с КАСЕ-слитым белком.
Фиг. 15 показывает кривые насыщения-связывания ТТР-4000 с различными иммобилизованными известными лигандами КАСЕ. Эти лиганды иммобилизуют на микротитрационном планшете и инкубируют в присутствии увеличивающихся концентраций слитого белка от 0 до 360 нМ. Взаимодействие белок-лиганд детектируют с использованием поликлонального антитела, конъюгированного со щелочной фосфатазой, которое является специфическим в отношении. ЦС-части этой слитой химеры. Относительные К.) рассчитывали с использованием программы Старйраб Рпхш и сопоставляли с установленными литературными величинами величин КАСЕ-КАСЕ-лигандов. нМС1В = амфотерин, СМЬ = карбоксиметиллизин, А-бета = Амилоид-бета 1-40.
Вышеописанное рассматривается как иллюстрация только сущности данного изобретения. Поскольку специалистам с квалификацией в данной области легко могут прийти на ум многочисленные модификации и изменения, авторы изобретения не имеют в виду ограничения данного изобретения кон
- 34 012586 кретными показанными и описанными вариантами осуществления, и предполагается, что все подходящие модификации и эквиваленты, попадающие в объем прилагаемой формулы изобретения, находятся в пределах данной идеи изобретения.

Claims (23)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Слитый белок, содержащий полипептид КАСЕ, связанный на его карбоксиконце с аминоконцом не-КАСЕ-полипептида, где полипептид КАСЕ является фрагментом человеческого кКАСЕ, где последовательность человеческого кКАСЕ приведена в 8Е0 ΙΌ N0: 5 или 6, и где последовательность указанного фрагмента содержит на своем аминоконце 8Е0 ΙΌ N0: 9, 8Е0 ΙΌ N0: 10 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 9 или 10; и где не-КАСЕполипептид содержит домен Сн2 или домен Сн3 человеческого ΙβΟ.
  2. 2. Слитый белок по п.1, где аминокислотная последовательность человеческого кКАСЕ приведена в 8ЕО ΙΌ N0: 5.
  3. 3. Слитый белок по п.1, где аминокислотная последовательность человеческого кКАСЕ приведена в 8ЕО ΙΌ N0: 6.
  4. 4. Слитый белок по п.2, где последовательность фрагмента содержит на своем аминоконце 8Е0 ΙΌ N0: 9.
  5. 5. Слитый белок по п.3, где последовательность фрагмента содержит на своем амино конце 8Е0 ΙΌ N0: 10.
  6. 6. Слитый белок по п.1, где аминокислотная последовательность фрагмента человеческого кКАСЕ приведена в 8ЕО ΙΌ N0: 7, в 8ЕО ΙΌ N0: 8, в 8ЕО ΙΌ N0: 13, в 8ЕО ΙΌ N0: 14, в 8ЕО ΙΌ N0: 15, в 8ЕО ΙΌ N0: 16, в 8ЕО ΙΌ N0: 17, в 8ЕО ΙΌ N0: 18, в 8ЕО ΙΌ N0: 19 или в 8ЕО ΙΌ N0: 20.
  7. 7. Слитый белок по любому из пп.1-6, содержащий как домен Сн2, так и домен Сн3 человеческого ΙβΟ.
  8. 8. Слитый белок по п.7, содержащий Гс-фрагмент человеческого ΙβΟ.
  9. 9. Слитый белок по любому из пп.1-8, где человеческий иммуноглобулин Ι§0 представляет собой человеческий ΙβΟΕ
  10. 10. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, содержащий полипептид КАСЕ, связанный на его карбоксиконце с аминоконцом не-КАСЕ-полипептида, где полипептид КАСЕ является фрагментом человеческого кКАСЕ, где последовательность человеческого кКАСЕ приведена в 8Е0 ΙΌ N0: 5 или 6, и где последовательность фрагмента содержит на своем аминоконце 8Е0 ΙΌ N0: 9, 8Е0 ΙΌ N0: 10 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 9 или 10; и где не-КАСЕ-полипептид содержит домен Сн2 или домен Сн3 человеческого ΙβΟ.
  11. 11. Нуклеиновая кислота по п.10, где аминоконцевая последовательность фрагмента человеческого кКАСЕ приведена в любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 7, 8, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.
  12. 12. Нуклеиновая кислота по п.11, где последовательность нуклеиновой кислоты фрагмента кКАСЕ приведена в любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 25, 26, 27, 28 или 29.
  13. 13. Нуклеиновая кислота по любому из пп.10-12, содержащая как домен Сн2, так и домен Сн3 человеческого ΙβΟ.
  14. 14. Нуклеиновая кислота по п.13, содержащая Гс-фрагмент человеческого ΙβΟ.
  15. 15. Нуклеиновая кислота по любому из пп.10-14, где человеческий Ι§0 представляет собой человеческий ΙβΟΕ
  16. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество КАСЕслитого белка по любому из пп.1-9 в фармацевтически приемлемом носителе.
  17. 17. Композиция по п.16, составленная в виде инъекционного раствора или в виде стерильного лиофилизированного порошка.
  18. 18. Применение слитого белка по любому из пп.1-9 для изготовления лекарственного средства для лечения опосредованного КАСЕ нарушения у субъекта.
  19. 19. Применение по п.18, согласно которому лекарственное средство предназначено для внутривенного, внутрибрюшинного или подкожного введения.
  20. 20. Применение по п.18, согласно которому опосредованным КАСЕ нарушением является симптом диабета или симптом поздних осложнений диабета.
  21. 21. Применение по п.20, согласно которому симптомом диабета или симптомом поздних осложнений диабета является диабетическая нефропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая язва стопы, сердечно-сосудистое осложнение или диабетическая невропатия.
  22. 22. Применение по п.18, согласно которому опосредованным КАСЕ нарушением является амилоидоз, болезнь Альцгеймера, рак, воспаление или почечная недостаточность.
  23. 23. Применение по п.22, согласно которому воспалением является воспаление, ассоциированное с аутоиммунитетом, воспалительным заболеванием кишечника, ревматоидным артритом, псориазом, рассеянным склерозом, гипоксией, инсультом, сердечным приступом, геморрагическим шоком, сепсисом, трансплантацией органа или заживлением ран.
EA200700402A 2004-08-03 2005-08-03 Rage-слитые белки и способы их применения EA012586B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US59836204P 2004-08-03 2004-08-03
PCT/US2005/027694 WO2006017643A1 (en) 2004-08-03 2005-08-03 Rage fusion proteins and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200700402A1 EA200700402A1 (ru) 2007-08-31
EA012586B1 true EA012586B1 (ru) 2009-10-30

Family

ID=35427536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200700402A EA012586B1 (ru) 2004-08-03 2005-08-03 Rage-слитые белки и способы их применения

Country Status (23)

Country Link
US (2) US20060078562A1 (ru)
EP (1) EP1776459A1 (ru)
JP (1) JP2008508882A (ru)
KR (1) KR20070057818A (ru)
CN (1) CN101010430A (ru)
AP (1) AP2007003893A0 (ru)
AU (2) AU2005271449A1 (ru)
BR (1) BRPI0514013A (ru)
CA (1) CA2575830A1 (ru)
CR (2) CR8897A (ru)
EA (1) EA012586B1 (ru)
EC (1) ECSP077297A (ru)
GE (1) GEP20105111B (ru)
IL (1) IL180555A0 (ru)
MA (1) MA28781B1 (ru)
MX (1) MX2007001556A (ru)
NO (1) NO20070062L (ru)
NZ (1) NZ552842A (ru)
SG (1) SG161242A1 (ru)
TN (1) TNSN07040A1 (ru)
UA (1) UA92154C2 (ru)
WO (1) WO2006017643A1 (ru)
ZA (1) ZA200700641B (ru)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6790443B2 (en) * 1996-11-22 2004-09-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for treating symptoms of diabetes
US7258857B2 (en) * 1996-11-22 2007-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage-related methods for treating inflammation
US6465422B1 (en) * 1998-04-17 2002-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject
AU765719B2 (en) * 1998-10-06 2003-09-25 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Extracellular novel rage binding protein (EN-RAGE) and uses thereof
AU2002213192A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York A method for inhibiting new tissue growth in blood vessels in a patient subjected to blood vessel injury
EP1575513A4 (en) * 2002-08-16 2007-04-04 Wyeth Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING RAGE-ASSOCIATED DISEASES
WO2004100890A2 (en) * 2003-05-09 2004-11-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage g82s-related methods and compositions for treating inflammatory disorders
WO2006012415A2 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Rage protein derivatives
SG161242A1 (en) * 2004-08-03 2010-05-27 Transtech Pharma Inc Rage fusion proteins and methods of use
CA2570324C (en) * 2004-08-03 2014-07-22 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
WO2006036922A2 (en) 2004-09-27 2006-04-06 Centocor, Inc. Srage mimetibody, compositions, methods and uses
EP1869464A4 (en) * 2005-03-17 2009-12-02 Univ Columbia RAGE / DIAPHANE INTERACTION AND ASSOCIATED COMPOSITIONS AND METHODS
US20070087406A1 (en) * 2005-05-04 2007-04-19 Pei Jin Isoforms of receptor for advanced glycation end products (RAGE) and methods of identifying and using same
US20080207499A1 (en) * 2005-06-29 2008-08-28 Gaetano Barile Rage-related methods for treating and preventing diabetic retinopathy
ES2431632T3 (es) * 2005-12-23 2013-11-27 Gcoder Systems Ab Patrón de posicionamiento
KR20080105066A (ko) * 2006-02-09 2008-12-03 트랜스테크 파르마, 인크. Ｒａｇｅ 융합 단백질 및 이의 사용 방법
NZ571692A (en) * 2006-05-05 2012-01-12 Transtech Pharma Inc Rage fusion proteins, formulations, and methods of use thereof
CA2677073C (en) 2007-01-30 2016-03-15 Epivax, Inc. Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof
WO2008100470A2 (en) * 2007-02-15 2008-08-21 Transtech Pharma, Inc. Rage - immunoglobulin fusion proteins
WO2008153957A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of rage antagonists for treating obesity and related diseases
WO2008157378A2 (en) 2007-06-14 2008-12-24 Galactica Pharmaceuticals Page fusion proteins
NL2001553C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001557C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001556C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001552C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001555C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001551C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001558C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001554C2 (nl) * 2008-05-06 2009-05-07 Transtech Pharma Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
KR20110139292A (ko) 2009-04-20 2011-12-28 화이자 인코포레이티드 단백질 글리코실화의 제어 및 그와 관련된 조성물 및 방법
WO2013103688A1 (en) * 2012-01-03 2013-07-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human soluble receptors for advanced glycation end products (srage), methods of preparing human srage, and treatment methods using srage
CN103376328A (zh) * 2013-07-18 2013-10-30 上海交通大学医学院附属瑞金医院 血清sRAGE水平的检测试剂在筛选改善胰岛素β细胞功能的糖尿病治疗药物中的应用
KR101645654B1 (ko) * 2014-05-02 2016-08-05 서울대학교산학협력단 Rage로부터 유래된 폴리펩티드 및 이를 유효성분으로 포함하는 뇌혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2020056379A1 (en) 2018-09-14 2020-03-19 BioAge Labs, Inc. Rage fusion proteins with improved stability and ligand binding affinity and uses thereof
JP7479039B2 (ja) 2019-02-21 2024-05-08 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 糖尿病診断技術
JP7477141B2 (ja) 2019-02-21 2024-05-01 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 肝疾患診断技術

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004016229A2 (en) * 2002-08-16 2004-02-26 Wyeth Compositions and methods for treating rage-associated disorders

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4166452A (en) * 1976-05-03 1979-09-04 Generales Constantine D J Jr Apparatus for testing human responses to stimuli
US4356108A (en) * 1979-12-20 1982-10-26 The Mead Corporation Encapsulation process
US4265874A (en) * 1980-04-25 1981-05-05 Alza Corporation Method of delivering drug with aid of effervescent activity generated in environment of use
US4867973A (en) * 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
US5567584A (en) * 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US6018026A (en) * 1988-01-22 2000-01-25 Zymogenetics, Inc. Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions
NZ235148A (en) * 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
IE922437A1 (en) * 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
SE9201073D0 (sv) * 1992-04-03 1992-04-03 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
FI119756B (fi) * 1995-01-18 2009-03-13 Alteon Inc Tiatsoliumyhdisteiden käyttö pitkälle edenneen glykosylaation lopputuotteiden muodostumisen estossa ja suunnan muutoksessa
US5656261A (en) * 1995-01-18 1997-08-12 The Picower Institute For Medical Research Preventing and reversing advanced glycosylation endproducts
ATE245420T1 (de) * 1995-01-18 2003-08-15 Alteon Inc Verwendung von thiazoliumverbindungen zum verhindern und umkehren der bildung von endprodukten der fortgeschrittenen glykosylierung
CA2217572A1 (en) * 1995-04-05 1996-10-10 The Picower Institute For Medical Research Agents for binding to advanced glycosylation endproducts, and methods of their use
US5747035A (en) * 1995-04-14 1998-05-05 Genentech, Inc. Polypeptides with increased half-life for use in treating disorders involving the LFA-1 receptor
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US5864018A (en) * 1996-04-16 1999-01-26 Schering Aktiengesellschaft Antibodies to advanced glycosylation end-product receptor polypeptides and uses therefor
US7258857B2 (en) * 1996-11-22 2007-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage-related methods for treating inflammation
US6790443B2 (en) * 1996-11-22 2004-09-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for treating symptoms of diabetes
US6555651B2 (en) * 1997-10-09 2003-04-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Ligand binding site of rage and uses thereof
US7081241B1 (en) * 1998-10-06 2006-07-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Extracellular rage binding protein (EN-RAGE) and uses thereof
US7101838B2 (en) * 1997-08-05 2006-09-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to prevent accelerated atherosclerosis using (sRAGE) soluble receptor for advanced glycation endproducts
MY131805A (en) * 1997-09-18 2007-09-28 Biogen Idec Inc Synergistic composition and methods for treating neoplastic or cancerous growths and for restoring or boosting hematopoiesis.
US6380165B1 (en) * 1997-09-19 2002-04-30 The Picower Institute For Medical Research Immunological advanced glycation endproduct crosslink
US6761888B1 (en) * 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US6323218B1 (en) * 1998-03-11 2001-11-27 The General Hospital Corporation Agents for use in the treatment of Alzheimer's disease
US7198789B2 (en) * 1998-03-17 2007-04-03 Genetics Institute, Llc Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity
US6465422B1 (en) * 1998-04-17 2002-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for inhibiting tumor invasion or spreading in a subject
US6753150B2 (en) * 1998-10-05 2004-06-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for determining whether a compound is capable of inhibiting the interaction of a peptide with rage
AU765719B2 (en) * 1998-10-06 2003-09-25 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Extracellular novel rage binding protein (EN-RAGE) and uses thereof
US6787566B2 (en) * 1999-04-05 2004-09-07 City Of Hope Breakers of advanced glycation endproducts
US6605642B2 (en) * 1999-04-05 2003-08-12 City Of Hope Inhibitors of formation of advanced glycation endproducts (AGES)
US6939545B2 (en) * 1999-04-28 2005-09-06 Genetics Institute, Llc Composition and method for treating inflammatory disorders
EP1307219A4 (en) * 1999-08-13 2005-04-06 Univ Columbia PROCESS FOR INHIBITING THE BINDING OF BETA FOLDED FIBRILLES TO RAGE (ADVANCED GLYCATION ENDPRODUCT RECEPTOR)
US20050170382A1 (en) * 1999-10-06 2005-08-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York. RAGE-related compositions
EP1252305A2 (en) * 1999-12-08 2002-10-30 Genset Full-length human cdnas encoding potentially secreted proteins
AU5355501A (en) * 2000-04-14 2001-10-30 Niadyne Corp Method for identifying regulators of protein-advanced glycation end product (protein-age) formation
US6613801B2 (en) * 2000-05-30 2003-09-02 Transtech Pharma, Inc. Method for the synthesis of compounds of formula I and their uses thereof
US6563015B1 (en) * 2000-08-14 2003-05-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Transgenic mice over-expressing receptor for advanced glycation endproduct (RAGE) and mutant APP in brain and uses thereof
US6825164B1 (en) * 2000-08-14 2004-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method to increase cerebral blood flow in amyloid angiopathy
WO2002029091A2 (en) * 2000-10-02 2002-04-11 Reddy Us Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of inflammatory diseases
AU2002213192A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York A method for inhibiting new tissue growth in blood vessels in a patient subjected to blood vessel injury
US20050244849A1 (en) * 2000-12-15 2005-11-03 Genetics Institute, Llc Screening assays for rheumatoid arthritis
PL366250A1 (en) * 2000-12-29 2005-01-24 Reddy Us Therapeutics, Inc. Detection of compounds that modulate inflammatory responses
AU2002233340B2 (en) * 2001-02-19 2008-05-22 Merck Patent Gmbh Artificial fusion proteins with reduced immunogenicity
WO2002069965A1 (en) * 2001-03-05 2002-09-12 Transtech Pharma, Inc. Benzimidazole derivatives as therapeutic agents
AU2002245591B2 (en) * 2001-03-05 2007-05-17 Transtech Pharma, Inc. Carboxamide derivatives as therapeutic agents
JP3837494B2 (ja) * 2001-03-19 2006-10-25 国立大学法人金沢大学 可溶型ｒａｇｅタンパク質
US6861888B2 (en) * 2002-01-16 2005-03-01 Agilent Technologies, Inc. High-sensitivity differential data latch system
DK1482931T3 (da) * 2002-03-05 2011-12-19 Transtech Pharma Inc Mono- og bicycliske azolderivater der inhiberer interaktionen af ligander med RAGE
WO2004100890A2 (en) * 2003-05-09 2004-11-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage g82s-related methods and compositions for treating inflammatory disorders
US20050008649A1 (en) * 2003-06-02 2005-01-13 University Of Miami Chimeric molecules and methods of use
US6969545B2 (en) * 2003-07-28 2005-11-29 Deere & Company Hydrogen storage container
CA2536512A1 (en) * 2003-09-05 2005-03-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rage-related methods and compositions for treating glomerular injury
US20070167360A1 (en) * 2003-10-31 2007-07-19 Yan Shi D Methods for treating multiple sclerosis
US20080260717A1 (en) * 2003-10-31 2008-10-23 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for Reducing Seizure-Induced Neuronal Damage
WO2006012415A2 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Critical Therapeutics, Inc. Rage protein derivatives
CA2570324C (en) * 2004-08-03 2014-07-22 Transtech Pharma, Inc. Rage fusion proteins and methods of use
SG161242A1 (en) * 2004-08-03 2010-05-27 Transtech Pharma Inc Rage fusion proteins and methods of use
WO2006036922A2 (en) * 2004-09-27 2006-04-06 Centocor, Inc. Srage mimetibody, compositions, methods and uses
EP1869464A4 (en) * 2005-03-17 2009-12-02 Univ Columbia RAGE / DIAPHANE INTERACTION AND ASSOCIATED COMPOSITIONS AND METHODS
US20080207499A1 (en) * 2005-06-29 2008-08-28 Gaetano Barile Rage-related methods for treating and preventing diabetic retinopathy
KR20080105066A (ko) * 2006-02-09 2008-12-03 트랜스테크 파르마, 인크. Ｒａｇｅ 융합 단백질 및 이의 사용 방법
NZ571692A (en) * 2006-05-05 2012-01-12 Transtech Pharma Inc Rage fusion proteins, formulations, and methods of use thereof
WO2008100470A2 (en) * 2007-02-15 2008-08-21 Transtech Pharma, Inc. Rage - immunoglobulin fusion proteins
WO2008153957A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of rage antagonists for treating obesity and related diseases
US9491184B2 (en) * 2008-04-04 2016-11-08 Samsung Electronics Co., Ltd. Method and apparatus for managing tokens for digital rights management

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004016229A2 (en) * 2002-08-16 2004-02-26 Wyeth Compositions and methods for treating rage-associated disorders

Also Published As

Publication number Publication date
CN101010430A (zh) 2007-08-01
WO2006017643A1 (en) 2006-02-16
ZA200700641B (en) 2008-10-29
EP1776459A1 (en) 2007-04-25
SG161242A1 (en) 2010-05-27
CR8897A (es) 2007-06-29
MA28781B1 (fr) 2007-08-01
IL180555A0 (en) 2007-06-03
GEP20105111B (en) 2010-11-10
JP2008508882A (ja) 2008-03-27
ECSP077297A (es) 2007-05-30
CR20110557A (es) 2011-12-05
EA200700402A1 (ru) 2007-08-31
AU2005271449A1 (en) 2006-02-16
AU2010201531A1 (en) 2010-05-06
UA92154C2 (ru) 2010-10-11
NZ552842A (en) 2010-05-28
US20060078562A1 (en) 2006-04-13
MX2007001556A (es) 2008-03-05
TNSN07040A1 (fr) 2008-06-02
KR20070057818A (ko) 2007-06-07
AP2007003893A0 (en) 2007-02-28
CA2575830A1 (en) 2006-02-16
US20090060925A1 (en) 2009-03-05
BRPI0514013A (pt) 2008-05-27
NO20070062L (no) 2007-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA012586B1 (ru) Rage-слитые белки и способы их применения
ES2473587T3 (es) Proteínas de fusión de RAGE y métodos de uso
JP5558810B2 (ja) Ｒａｇｅ融合タンパク質、製剤及びその使用方法
EA015657B1 (ru) Слитые белки rage и способы применения
NL2001556C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001554C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001558C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.
NL2001557C2 (nl) Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU