PT1272843E - Método para identificação de reguladores da formação de age de proteínas - Google Patents

Description

ΕΡ 1 272 843/ΡΤ

DESCRIÇÃO

"Método para identificação de reguladores da formação de AGE de proteínas"

CAMPO DO INVENTO

Este invento refere-se a um método para identificação de inibidores da formação de produtos finais de glicação avançada de proteínas ("AGE de proteínas" daqui em diante). A metodologia é útil na determinação de substâncias de interesse com impacto em condições patológicas com as quais está associada a formação de AGE de proteínas, tais como diabetes, aterosclerose, doenças neurodegenerativas crónicas, tais como a doença de Alzheimer, fotoenvelhecimento da pele e outras doenças degenerativas características do processo de envelhecimento.

ANTECEDENTES E ARTE ANTERIOR A glicação, tal como aqui utilizada, é uma modificação não enzimática, pós-tradução das proteínas por açúcares redutores e outras espécies de carbonilo reactivas, que afectam adversamente a função proteica. A deterioração e o envelhecimento dos tecidos têm sido extensivamente associados a acumulação de danos dos processos químicos induzidos pela glicação, bem como ao stress oxidativo e à irradiação com UV. A acumulação em proteínas com uma vida longa de produtos de glicação e produtos AGE derivados de glicação foi implicada em várias doenças relacionadas com a idade incluindo complicações diabéticas de longo prazo (Thorpe, et ai., Drugs Aging 9: 69-77, 1996), aterosclerose (Ruderman, et al., FASEB J. 6: 2905-2914, 1993; erratum FASEB J. 7(1): 237, 1993), doença de Alzheimer (Vitek, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 4766-4770, 1994), fotoenvelhecimento da pele (Mizutani, et al., J. Invest. Dermatol. 797-802, 1997) e em patologias gerais do processo de envelhecimento (Frye, et al., J. Biol. Chem. 273: 18714-18719, 1998). As complicações diabéticas de longo prazo da hiperglicemia causam eventualmente patologias graves e ameaçadoras da vida tais como doença renal de fase terminal (Baynes, et al., Diabetes 40: 405-412, 1991). As complicações microvasculares e 2 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ macrovasculares irreversíveis incluindo retinopatia, neuropatia, nefropatia, aterosclerose e doença cerebrovascular foram todas mecanisticamente ligadas à formação de AGE de proteínas em tecido conjuntivo, especialmente em colagénio e componentes proteicos da matriz. Para além disso, acontecimentos semelhantes que ocorrem a uma velocidade mais lenta parecem ser de igual relevância para o processo normal de envelhecimento (Thorpe, et ai., supra). A glicação e a subsequente formação de AGE de proteínas têm um papel central no stress celular de carbonilo e na toxidade da glucose. A administração do inibidor da glicação aminoguanidina suprime eficazmente complicações secundárias em roedores com diabetes experimental (Edelstein, et al., Diabetologica 35: 96-97, 1992); no entanto, a aminoguanidina é um derivado de hidrazina que mostra toxidade sistémica após administração a longo prazo, uma vez que é um potente inibidor da catalase (Ou, et al., Biochem. Phamacol. 46: 1139-1144, 1993) e da óxido nítrico-sintetase indutível (Okuda, et al., J. Neurolmmunol. 81: 201-210, 1998). O perfil de toxidade da aminoguanidina torna improvável que esta seja utilizada clinicamente. Portanto, existe uma necessidade clínica urgente de identificação e caracterização de novos compostos que inibam eficazmente a glicação e suas consequências patológicas associadas. Um ensaio de pesquisa de alto rendimento que poderia ser aplicado a grandes bibliotecas combinatórias de compostos conduziria provavelmente à identificação de novos inibidores da glicação.

As espécies de oxigénio reactivas ("ROS") e as espécies de carbonilo reactivas ("RCS"), especialmente compostos de dicarbonilo, são mediadores chave dos danos celulares causados pelo stress oxidativo, pela glicação e pela radiação UV. A origem do stress celular de carbonilo em consequência da glicação, peroxidação dos lípidos, auto-oxidação e metabolismo dos açúcares pode ser observada, p.ex., na Figura 1. As vias dependentes e independentes do oxigénio conduzem à formação de várias espécies de carbonilo reactivas, incluindo 2-dicarbonilos como o metilglioxal e o glioxal, como intermediários chave para a acumulação de danos proteicos através da formação de AGE. O stress de carbonilo 3 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ tem adicionalmente origem a partir da criação metabólica de metilglioxal. Resumidamente, os produtos iniciais de glicação são derivados da reacção de um açúcar redutor com grupos amino das proteínas (lisina e arginina) para gerar aldiminas (aductos de bases de Schiff) que se podem submeter a rearranjo de Amadori para formar aductos de cetoamina (Hodge, et al., J. Am. Chem Soc. 75: 316-322, 1953). Os AGE de proteínas são gerados a partir dos produtos iniciais de glicação através de ambas as vias oxidativa e não oxidativa nas quais uma variedade de compostos de dicarbonilo reactivos tais como glioxal, metilglioxal e 3-desoxiosonas são intermediários sugeridos (Thornalley, et ai., Biochem. J. 344: 109-116, 1999). Mostrou-se que a ADP-ribose é um potente agente de glicação e glicoxidação de histonas in vitro (Cervantes-Laurean, et ai., J. Biol. Chem. 271: 10461-10469, 1996) .

Os AGE de proteínas incluem resíduos de Νε-(carboximetil)lisina (CML) das proteínas (Ahmed, et ai., J. Biol. Chem. 261: 889-4894, 1986), e um grupo heterogéneo de modificações complexas tais como pentosidina (Sell, et ai., J. Biol. Chem. 264: 21597-21602, 1989) que são caracterizadas pela sua elevada fluorescência e capacidade para causar reticulações proteína-proteína. A acumulação de fluorescência específica de AGE (ex. 370 nm; em. 440 nm) é uma medida geral dos danos globais nas proteínas e é uma ferramenta amplamente utilizada da investigação da glicação in vitro e in vivo. Nalguns casos, os compostos dicarbonilo reactivos podem formar-se através de auto-oxidação do próprio açúcar sem requerer glicação, e a presença de quantidades vestigiais de iões de metais de transição (Fe, Cu) foi implicada na formação de compostos de dicarbonilo e de espécies de oxigénio reactivas tais como peróxido de hidrogénio (Elgawish, et al., J. Biol. Chem. 271: 12964- 12971, 1996). Outros aminoácidos para além da lisina e da arginina são também modificados através de glicoxidação. Por exemplo, os resíduos de metionina expostos à superfície nas proteínas são muito sensíveis à oxidação proteica (Hall, et al., Biochem. Biophys. Acta 1121: 325-330, 1992).

Devido à sua abundância, assume-se que a glucose é a principal fonte de glicação e de formação de AGE de proteínas 4 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ em proteínas extracelulares in vivo; no entanto, a glucose é apenas um fraco agente de glicação e a reacção química com proteínas sob condições fisiológicas ocorre apenas ao longo de meses e anos (Higgins, et al.r J. Biol. Chem. 256: 5204-5208, 1981) . Em contraste com a glucose, as pentoses mais reactivas foram implicadas como fontes de açúcar para glicoxidação de proteínas intracelulares, porque são precursores muito mais eficientes da formação de AGE fluorescente tal como a pentosidina (Sell, et al., supra). Uma pentose celular abundante é a ADP-ribose, que é gerada a partir de NAD através de múltiplas vias metabólicas (Cervantes-Laurean, et al., Biochemistry 32: 1528-1534, 1993; Jacobson, et al., Mol. Cell Biochem. 138: 207-212, 1994). Os estudos iniciais centraram-se numa via que envolve a geração intranuclear de ADP-ribose (ADPR). A investigação demonstrou que o núcleo da célula é um local provável para a glicação in vivo pela ADP-ribose. O stress oxidativo e outras condições que causam ruptura das cadeias de ADN estimulam a síntese de polímeros nucleares de ADP-ribose, que são rapidamente reciclados gerando ADP-ribose muito próximo das histonas de vida longa ricas em resíduos de lisina e arginina (Cervantes-Laurean, et al., supra).

Para além dos artigos acima referidos, a deterioração e o envelhecimento dos tecidos foram amplamente associados a acumulação de danos dos processos químicos induzidos pelo stress oxidativo, pela glicação e pela irradiação de UV. (Halliwell, et al., "Free radicais in Biology and Medicine" (Clarendon Press, Oxford, 1989); Berlett, et al., J. Biol. Chem. 272: 20313-20316, 1997). Todos estes são potentes indutores de Espécies de Oxigénio Reactivas ("ROS") e de Espécies de Carbonilo Reactivas ("RCS") (Anderson et al., J. Chem. Invest. 104: 103-113, 1999), que são intermediários chave dos danos cumulativos nas proteínas durante o envelhecimento geral e várias condições patológicas, p.ex. doenças inflamatórias crónicas (Dimon-Gadal, et al., J. Invest. Dermatol. 114: 984-989, 2000); psoríase e diabetes (Brownlee, et al., Ann. Rev. Med. 46: 223-234, 1995);

Brinkmann, et al., J. Biol. Chem. 273: 18714-18719, 1998). As RCS como intermediários reactivos do stress celular de carbonilo originam-se a partir de uma variedade de vias mecanisticamente relacionadas, tais como a glicação 5 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ (Thornalley, et al., BioChem. J. 344: 109-116, 1999), auto-oxidação dos açúcares (Wolffi, et al., Prog. Clin. Biol. Res. 304: 259-75, 1989), peroxidação dos lípidos (Fu, et al., J. Biol. Chem. 271: 9982-64996), e fotodanificação por UV (Mizutani, et al., J. Invest. Dermatol. 108: 797-802, 1997). A glicação, uma reacção amino-carbonilo espontânea entre açúcares redutores e proteínas de vida longa é uma das principais fontes de produção de RCS conduzindo ao stress celular de carbonilo. Os intermediários reactivos de α-dicarbonilo, tais como glioxal, metilglioxal e 3-desoxiosonas são gerados através de vias de glicação de reacção oxidativa (glicoxidativa) e não oxidativa. A sequência complexa da reacção é iniciada através da formação reversível de uma base de Schiff, que se submete a um rearranjo de Amadori para formar um produto relativamente estável de cetoamina durante a glicação inicial. Uma série de outras reacções envolvendo fragmentação de açúcares e formação de compostos de α-dicarbonilo como intermediários reactivos chave produz produtos finais de glicação avançada (AGEs) estáveis ligados a proteínas (Thornalley, et al., supra; Glomb, et al., J. Biol. Chem. 270: 10017-10026, 1995; Wondrak, et al., Free Radical Biol. Med. 29: 557-567, 2000). (Lander, et al., J. Biol. Chem. 272: 17810-14, 1997). Interessantemente, os RCS e AGEs podem exercer os seus efeitos celulares prejudiciais através do aumento da produção de ROS, formando deste modo um ciclo vicioso de produção de ROS e RCS. A formação de AGE é acompanhada por acumulação de fluorescência específica de AGE (Àex-370 nm, Àem-440 nm) e reticulações de proteínas, que são medidas dos danos globais das proteínas nos tecidos. (Brownlee, et al., supra). Os produtos AGE de imidazólio derivados de arginina (Westwood, et al., J. Protein Chem. 14: 359-72, 1995); o dímero glioxal-lisina (GOLD) e o dímero metilglioxal-lisina (MOLD) (Brinkmann, et al., J. Biol. Chem. 273: 18714-18719, 1998) foram identificados no cristalino e no colagénio da pele humanos envelhecidos implicando o stress de α-dicarbonilo no envelhecimento dos tecidos. Adicionalmente, RCS como o glioxal, o precursor directo do AGE Ns-carboximetil-L-lisina (CML), são gerados por danos através de radicais livres nos ácidos gordos polinsaturados das membranas celulares. (Fu, et al., supra). A irradiação UV é outra fonte de stress de carbonilo dos tecidos, tal como evidenciado pela acumulação 6 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ de CML em lesões expostas ao sol de elastose actínica. (Mizutani, et al., supra). Portanto, produtos AGE como CML e GOLD podem ser considerados como biomarcadores do stress de carbonilo dos tecidos. 0 metilglioxal é um importante intermediário da glicação (Thornalley, et ai., supra) que é também gerado como metabolito biológico através da degradação não enzimática e enzimática de intermediários glicoliticos da triose-fosfato e do catabolismo da treonina. (Thornalley, et al., Gen.

Pharmac. 27: 565-573, 1996). Verificam-se maiores niveis de metilglioxal no sangue de pacientes diabéticos (Beisswenger, et al., Diabetes 48: 198-202, 1999), e no cristalino de ratos diabéticos induzidos com estreptozotocina. Um estudo recente sobre a formação de AGEs em células endoteliais cultivadas sob condições hiperglicémicas indicou que o metilglioxal era o principal precursor dos AGEs (Shinohara, et al., J. Clin. Invest. 101: 1142-7, 1998). Vários AGEs derivados de metilglioxal foram identificados em tecidos humanos, tais como derivados fluorescentes de 5-metilimidazolona, em lesões ateroscleróticas da aorta (Uchida, et al., FEBS Lett. 410: 313-318, 1997), ou MOLD e Ns-carboxietil-L-lisina em colagénio de pele envelhecida (Brinkmann, et al., supra). Recentemente, os efeitos citotóxicos dos intermediários da glicação metilglioxal e 3-desoxiglucosona em células neuronais tais como células PC12 (Suzuki, et al., J. Biochem (Tóquio) 123: 353-7, 1998) e neurónios corticais cultivados (Kikuchi, et al., J. Neurosci. Res. 57: 280-289, 1999) atraíram considerável atenção devido à suspeita da sua participação na patogénese de doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer (Vitek, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 4766-70, 1994) e esclerose lateral amiotrófica (Shinpo, et al., Brain Res. 861: 151-9, 2000).

Como outro resultado do stress oxidativo e de carbonilo, os danos nas proteínas pela carbonilação foram associados ao envelhecimento e a várias doenças, tais como as doenças de envelhecimento prematuro, Progeria e sindroma de Werner (Berlett, et al., J. Biol. Chem. 272: 20313-20316, 1997). A quantidade de grupos carbonilo em proteínas de fibroblastos da pele humana correlaciona-se fortemente com a idade do dador (Oliver, et al., J. Biol. Chem. 262: 5488-5491, 1987). 7 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ

Recentemente, foram relatados elevados níveis de carbonilação da histona Hl in vivo como um indicador de stress oxidativo e glico-oxidativo nuclear (Wondrak, et al., J. Biochem. 351: 769-777, 2000) .

Em contraste com o seu potencial terapêutico, até à data apenas foi identificado um número muito limitado de inibidores biológicos do stress celular de carbonilo, tais como a glutationa sequestrante de carbonilo nucleófila. No entanto, alguns inibidores da glicação interferem com a reacção aprisionando α-dicarbonilos intermediários, enquanto que outras substâncias inibidoras actuam meramente como antioxidantes e quelantes de metais de transição, inibindo assim a glicoxidação avançada, mas não a glicação (Elgwash, et al., J. Biochem. 271: 12964-71, 1996). A administração sistémica do derivado de hidrazina e do reagente de carbonilo aminoguanidina, um membro da primeira classe de inibidores da glicação, suprime eficazmente complicações secundárias em roedores diabéticos com diabetes experimental e inibe a reticulação de colagénio da pele (Edelstein, et al., Diabetes 41: 26-9, 1992; Fu, et al., Diabetes 43: 676-683, 1994).

Recentemente, mostrou-se que um brometo de fenilaciltiazólio bidentado nucleófilo protege E. coli contra a toxidade do metilglioxal (Ferguson, et al., Chem. Res. Tox. 12: 617-622, 1999). Outros compostos nucleófilos que actuam como armadilhas de carbonilo como o tenilsetam (Shoda, et al., Endocrinol. 138: 1886-92, 1997), a piridoxamina (Onorato, et al., J. Biol. Chem. 275: 21177-21184, 2000) e a metformina (Ruggiero-Lopez, et al., Biochem) estão a ser avaliados para prevenção de complicações diabéticas secundárias. A pesquisa in vitro de potenciais sequestrantes de α-dicarbonilo é complicada pela natureza da maioria dos sistemas de reacção glicoxidativa actualmente empregues, que medem a supressão da formação de AGE dependente de oxigénio avaliada através da fluorescência de AGE ou da quantificação imunológica de AGEs especificos tais como CML (Elgawish, et al., supra; Shoda, et al., supra; Ruggiero-Lopez, et al., supra). Consequentemente, nestes sistemas de glicoxidação a formação de AGE é inibida eficazmente por compostos com actividade antioxidante e quelante de metais. Recentemente, a glicação avançada independente de oxigénio através de 8 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ pentoses com formação de fluorescência de AGE e reticulações das proteínas foi demonstrada e mecanisticamente ligada à formação não oxidativa de desoxipentosonas como intermediários reactivos de α-dicarbonilo (Litchfield, et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31: 1297-1305, 1999). O antecedente mostra que há uma necessidade urgente de identificação e caracterização de compostos que inibam eficazmente a glicação e suas consequências patológicas associadas. Um tal ensaio seria útil, p.ex., na análise de grandes bibliotecas combinatórias, para identificar compostos relevantes. Um tal ensaio foi descrito no pedido provisório referido supra e também descrito aqui. Ver também Wondrak, et al., Biochem J. 351: 769-777, 2000. O trabalho aqui descrito foi continuado, para desenvolver um ensaio de elevado rendimento para identificação de inibidores da glicação que actuem como sequestrantes de carbonilo. Antes destes desenvolvimentos, tinham sido desenvolvidos diversos métodos de ensaio para identificar inibidores de glicação para fins de investigação (Khalifah, et al.r Biochem. Biophys. Res. Commun. 257: 251-258, 1999; Rahbar, et al., Clin. Chem. Acta 287: 123-130, 1999; Ruggiero-Lopez, et al., Biochem. Pharmacol. 58: 1765-1773, 1999). Os parâmetros que são medidos são geralmente a fluorescência especifica de AGE, as reticulações das proteínas e a determinação imunológica de AGE de proteínas. A maioria de ensaios de glicação emprega glucose ou uma pentose como agente de glicação resultando numa reacção lenta requerendo várias semanas para a sua revelação. Estes ensaios utilizam tipicamente concentrações de açúcar ou tampões fosfato não fisiológicos para aumentar a velocidade das reacções. A sensibilidade medida através do nível de detecção da formação de AGE é baixa e a precisão dos ensaios é também limitada por baixas razões de sinal para ruído. Os ensaios mais sensíveis baseiam-se na avaliação imunológica da formação de AGE através de ELISA. Os anticorpos para AGE utilizados nestes ensaios são extremamente dispendiosos ou não estão comercialmente disponíveis. Assim, é altamente desejável ter disponível um ensaio barato, rápido e fácil de implementar para identificar inibidores de glicação de proteínas, tais como inibidores de glicação não oxidativa de proteínas. É também desejável ter ensaios disponíveis que mecanisticamente não identifiquem 9 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ antioxidantes, mas materiais como sequestrantes de carbonilo. Tais ensaios foram desenvolvidos pelos inventores, tal como será observado na descrição que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 proporciona uma perspectiva geral da glicação de proteínas. A Figura 2 mostra a via através da qual se gera adpr. A Figura 3 apresenta a química das reacções de glicação através de ADP-ribose. A Figura 4 expõe os dados que mostram que a reacção entre a ADP-ribose e histona Hl prossegue rapidamente em condições que se assemelham às condições fisiológicas. A Figura 5 compara glucose, ribose, ADP-glucose e ADP-ribose no método do presente invento. A Figura 6 compara a albumina de soro bovino com a histona Hl como alvos de glicação. A Figura 7 mostra que a aminoguanidina suprime a glicação da histona Hl pela ADP-ribose. A Figura 8 mede a formação de reticulações das proteínas na reacção histona Hl/ADP-ribose. A Figura 9 apresenta resultados de experiências que medem a carbonilação das proteínas. A Figura 10 elabora um desenho para pesquisa primária e secundária de inibidores. A Figura 11 apresenta dados de experiências que identificaram potenciais inibidores. A Figura 12 apresenta dados para dois compostos negativos, i.e., compostos que não foram inibidores da glicação. 10 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ A Figura 13 representa os resultados de um ensaio desenhado para identificar falsos positivos. A Figura 14 mostra os resultados de um teste de confirmação de reticulações para determinar glicação, e deste modo os danos das proteínas. A Figura 15 mostra os resultados das experiências que mostraram a capacidade de vários compostos para inibir reticulações induzidas pela glicação da histona Hl. A Figura 16 mostra as estruturas de vários reagentes que foram identificados numa análise espectral de RMN-1H.

As Figuras 17 e 18 representam os resultados das experiências desenhadas para determinar o efeito protector da D-penicilamina nas células.

As Figuras 19A-D mostram estudos sobre o efeito de vários açúcares (A e B) e inibidores (C e D).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Verificou-se que a ADP-ribose e a histona Hl sofrem uma rápida e potente reacção de glicação, e esta reacção é uma característica chave do presente invento aqui descrito. A química das reacções de glicação pela ADP-ribose é única. Estas foram elucidadas em detalhe, tal como mostrado na Figura 3. Mais, a reacção prossegue de modo suficientemente rápido em condições que simulam as condições fisiológicas (tampão fosfato 50 mM, pH 7,4, tal como mostrado na Figura 4), ara garantir a consideração do ensaio como útil em pesquisa de compostos de interesse, tal como descrito infra. As cetoaminas e outros produtos AGE semelhantes são formados tanto pela ADP-ribose como pela glucose; no entanto, a velocidade de formação do produto pela ADP-ribose é pelo menos mil vezes mais rápida do que a formação pela glucose (Cervantes-Laurean, et al., J. Biol. Chem. 271: 10461-10469, 1996). As reacções que envolvem ADP-ribose são muito rápidas; no entanto, e isto é chave para o presente invento, as vias de reacção que envolvem a ADP-ribose e a histona Hl são semelhantes, mas muito mais rápidas que as iniciadas por 11 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ outros açúcares, sugerindo que os inibidores da reacção rápida entre a ADP-ribose e a histona Hl devem inibir reacções de glicação em geral. Por exemplo, num conjunto de experiências que compararam a reacção de glucose, ribose, ADP-glucose e ADP-ribose com a histona Hl, a quantidade de AGE fluorescente gerada a partir da ADP-ribose excedeu de longe todas as outras. Ver a Figura 5, representando tais ensaios, nas condições expostas supra. De modo semelhante, a histona Hl é um excelente alvo de glicação. A Figura 6 mostra os resultados de experiências em que a histona Hl foi comparada com a albumina de soro bovino como alvo de glicação. A potência da ADP-ribose como agente de glicação é conhecida. A histona Hl básica rica em lisina e arginina é um excelente substrato. Assim, observou-se que, sob condições ligeiramente alcalinas (i.e., cerca de pH 9,0), a reacção in vítro entre a ADP-ribose e a histona Hl prossegue em minutos, gerando desse modo fluorescência de AGE (Jacobson, et al., ADP-Ribose In Glycation and Glycoxidation Reactions, em Koch-Nolte, ed., "ADP-Ribosylation In Animal Tissues", Plenum Press, 1997, páginas 371-379), e reticulações nas proteínas.

Para um ensaio ser eficaz na pesquisa de compostos que inibem e/ou aumentam a glicação, deve ser testado com um agente com um efeito conhecido no processo em consideração. A Figura 7 apresenta dados mostrando que, quando o inibidor da glicação conhecido aminoguanidina foi testado, novamente nos níveis fisiológicos expostos supra, o seu efeito inibidor foi detectado muito rapidamente. Assim, o ensaio aqui descrito pode ser utilizado tal como reivindicado.

Os dados adicionais aqui apresentados mostram que os métodos padrão de medição da glicação de proteínas indicaram que a fluorescência de tipo AGE que é medida mede de facto os danos nas proteínas. Tanto a reticulação das proteínas como a carbonilação das proteínas são indícios bem estabelecidos de glicação das proteínas. Ver Schacter, et al., Free Radie. Biol. Med. 17: 429-437, 1994. Em resumo, após os ensaios descritos infra, a formação de reticulação das proteínas foi medida em SDS-PAGE a 12%, seguido de coloração com Coomassie e prata. Estes resultados são expostos na Figura 8. As reticulações eram detectáveis com um elevado grau de sensibilidade, quando a reacção entre a ADP-ribose e a 12 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ histona Hl era realizada a pH 9,0. Na Figura 8, a pista 1 mostra o tempo (daqui em diante "t")=0, enquanto que as pistas 2 e 3 mostram t=2 e t=24 horas, respectivamente. Na Figura 8, as abreviaturas "M," "D" e "O" representam "monómero," "dímero" e "oligómero", respectivamente. A coloração com prata é a maneira preferida de determinar a reticulação. A carbonilação de proteínas foi determinada através de "Western blotting". Especificamente, BSA-AGE, que tinha sido preparado através de incubação de BSA com glucose 1,66 M, a pH 7,4 durante 90 dias a 37°C, foram reconhecidos após serem derivados com 2,4-dinitrofenil-hidrazina ("DNP"), quando testados com anticorpos específicos para a proteina ligada, epítopos de DNP. Isto pode ser observado na pista 2, enquanto que a pista 1 mostra BSA não tratada, que serviu como controlo. Na figura 9, o painel A representa uma coloração com Coomassie, enquanto que o painel B mostra uma imunocoloração de carbonilo.

Nos exemplos que se seguem, o perito apreciará que são expostas várias concretizações e características do presente invento. EXEMPLO 1

Este exemplo descreve conjuntos de experiências realizadas em duplicado; no entanto, compreender-se-á que tal não é necessário, nem é necessário para ensaiar o número de amostras ensaiadas (48), numa placa de microtítulo de 96 poços. Este e os restantes exemplos estão resumidos na Figura 10.

Foi utilizada uma placa de microtítulo de 96 poços para realizar 48 reacções em duplicado. O primeiro par de poços continha os reagentes ADP-ribose e histona Hl, sem nenhuns potenciais inibidores. Um segundo par de poços contém os reagentes e o conhecido inibidor de glicação aminoguanidina, e funciona como controlo positivo. A histona Hl está comercialmente disponível e pode ser preparada seguindo os procedimentos expostos em Johns, et al., Biochem J. 92: 55-59, 1964. 13 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ

Os compostos de teste foram adicionados aos poços, a um nivel de 5 mM, ou no limite da solubilidade se esta fosse abaixo de 5 mM. 0 sistema de reacção é tampão fosfato de potássio 50 mM, a pH 7,4 ao qual foram adicionadas 1,5 mg/ml de histona Hl e ADP-ribose 1,0 mM. O volume reaccional foi de 300 μΐ. A fluorescência de AGE foi medida ao longo do tempo, com incubação a 37°C, a 355 nm (ex) e 405 nm (em) . Após comparação com o controlo, um composto de teste foi considerado potencialmente positivo se a fluorescência de AGE era suprimida. A Figura 11 apresenta resultados de um ensaio que identificou um potencial inibidor, i.e., cisteina e cisteina-metiléster. Se um composto de teste não suprimisse a fluorescência, era categorizado como um verdadeiro negativo e não se prosseguia mais. Verificou-se que tanto a beta-alanina como a arginina eram verdadeiros negativos, tal como mostrado na Figura 12.

Os falsos negativos podem ser facilmente determinados, através da medição da fluorescência no dia 0, para determinar a auto-fluorescência. Nenhum desses compostos é testado na pesquisa secundária, descrita infra. EXEMPLO 2 O Exemplo anterior discutiu os verdadeiros positivos, os verdadeiros negativos e os falsos negativos. No entanto, os falsos positivos são também possíveis. Estes suprimem a formação de fluorescência de AGE através de interferência fisica com as medições da fluorescência. Para eliminar tais compostos, eles são testados quanto à sua capacidade para extinguir formas AGE da albumina de soro bovino ("BSA-AGE"), no seguinte ensaio. A BSA-AGE foi preparada de acordo com Ikeda, et al., Biochemistry 35: 8075-8083, 1996. A BSA-AGE foi então adicionada a um poço que continha o composto de teste, ADP-ribose e histona Hl, e foi medida a fluorescência. O valor obtido foi comparado com um valor obtido quando a BSA-AGE foi adicionada a um poço contendo o inibidor aminoguanidina. Uma diminuição na fluorescência de BSA-AGE na presença do 14 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ potencial composto resulta na classificação como negativo e na exclusão de mais pesquisa. Um resumo geral da metodologia da pesquisa que é elaborada nestes exemplos é exposto na Figura 10. EXEMPLO 3

Este exemplo descreve uma pesquisa secundária, para avaliar melhor os compostos que foram considerados positivos após os ensaios dos Exemplos 1 e 2. Especificamente, recordar-se-á que cada amostra foi testada em dois poços, um dos quais foi testado no Exemplo 2, supra. A amostra não utilizada foi analisada, através de SDS-PAGE a 12%, seguido de coloração com prata para visualizar as reticulações das proteínas. Isto serve como medida independente dos danos nas proteínas causados pela glicação. Uma ausência de danos nas proteínas indica que o composto de teste inibe realmente a glicação.

Os resultados de um tal ensaio confirmando um positivo utilizando fluorescência são mostrados na Figura 13, e utilizando o teste das reticulações na Figura 14. EXEMPLO 4

Estas experiências descrevem o desenvolvimento posterior do ensaio discutido supra.

Para detalhar, a histona Hl foi isolada de timo fresco de vitelo. Primeiro, foi extraida cromatina de amostras de timo fresco de vitelo, através de extracção com NaCl 0,14 M e Na2s205 0,05 M, pH 5, de acordo com Wondrak, et al., Biochem. J. 351: 769-777, 2000. Após extracção repetida com HCIO4 a 5% e centrifugação a 1500 xg, a histona Hl foi precipitada do sobrenadante através de adição de TCA (concentração final de 20% v/v). O precipitado de histona Hl foi recolhido através de centrifugação a 12000 xg e água desionizada. A amostra foi sujeita a diálise extensiva (limiar de PM: 12 000-14 000) contra água durante 48 horas, e depois liofilizada. Foi utilizada SDS-PAGE (12%) para analisar a pureza da amostra. Qualquer proteina recolhida deste modo foi armazenada a 4°C. 15 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ A histona Hl (1,5 mg/ml) foi combinada com ADP-ribose 1 mM, em tampão KH2P04 50 mM (pH 7,4, 37°C, adicionado NaN3 a 0,015%, para inibir o crescimento microbiano). Esta mistura reaccional foi adicionada a placas de microtitulo de 96 poços. Os compostos de teste foram adicionados à mistura reaccional, em concentrações variando de 1 a 10 mM, em volumes reaccionais de 300 μΐ. Os testes foram corridos em duplicado.

Os danos acumulados nas proteínas foram determinados medindo a fluorescência de AGE, a comprimentos de onda (Àex = 370 nm; Àem = 440 nm). A fluorescência é suprimida na presença de compostos com actividade inibidora. Os ensaios foram lidos numa placa de microtitulo convencional, com um conjunto de filtros que se aproximava das condições acima (Àex: 355 nm, Àex: 405 nm), que está no intervalo dos máximos amplos de excitação/emissão dos compostos AGE. A fluorescência foi medida no início e após 5 dias de incubação. Qualquer composto que fosse inerentemente fluorescente era identificado através da medição inicial, e era considerado falso negativo; no entanto, porque podia de facto ter propriedades inibidoras, era testado num segundo estádio do ensaio, descrito infra. O inibidor de glicação conhecido aminoguanidina foi utilizado como controlo. Adicionalmente, a histona Hl e a ADP-ribose foram ensaiadas sem um potencial inibidor, e a histona Hl foi também incubada sem ADP-ribose.

Após 5 dias de incubação, a mistura histona Hl/ADP-ribose produziu cerca de 20 vezes mais fluorescência de AGE que a fluorescência de fundo produzida pela histona Hl sozinha. A ADP-ribose incubada sem histona Hl não gerou fluorescência.

Esta primeira fase do ensaio identificou potenciais inibidores; no entanto, era possível que tais compostos fossem extintores da fluorescência em vez de inibidores de glicação. Como tal, foram testados num ensaio adicional, tal como descrito infra. 16 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ

Para resumir, este passo do ensaio de pesquisa identificou verdadeiros negativos, que não necessitam continuar a ser considerados. Identificou também compostos que poderiam ser inibidores de glicação e compostos com actividade incerta. Estas duas últimas classes de compostos foram testadas nos ensaios agora descritos. EXEMPLO 5

Estas experiências descrevem como os falsos positivos, i.e., os extintores de fluorescência, são identificados e excluídos dos potenciais positivos identificados no Exemplo 1. Essencialmente, foi utilizada uma proteína modificada por AGE possuindo uma actividade de fluorescência conhecida, numa mistura do composto de teste com outros materiais descritos acima. A "BSA-AGE" ou albumina de soro bovino modificada por AGE possui uma actividade de fluorescência conhecida. Foi preparada de acordo com Takata, et al., J. Biol. Chem. 263: 14819-14825, 1988. Em resumo, cinco dias após a revelação da fluorescência no ensaio descrito supra, 1,6 g de albumina de soro bovino ("BSA") e 3,0 g de D-glucose foram dissolvidos em 10 ml de tampão fosfato de sódio 0,5 M, pH 7,4, contendo NaN3 a 0,05%. A solução foi esterilizada por filtração através de um filtro de 0,45 pm e incubada no escuro durante 90 dias a 37°C. As amostras foram dialisadas contra água e depois liofilizadas.

Os testes foram corridos através da adição de 1 mg/ml da BSA/AGE às misturas reaccionais, tal como descrito supra. Qualquer composto que extinguisse a fluorescência inerente da molécula de BSA-AGE era considerado falso positivo e era excluído de mais análises. EXEMPLO 6 O passo seguinte da metodologia de pesquisa envolveu o ensaio dos potenciais inibidores para determinar a sua capacidade para inibir reticulação nas proteínas. Para testar isto, alíquotas da reacção das misturas de incubação de 5 dias, descritas no Exemplo 1, supra, foram ensaiadas em SDS-PAGE a 12%. Tanto a histona Hl não tratada como a 17 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ aminoguanidina contendo ο controlo positivo foram testadas da mesma maneira. Todos foram visualizados através de coloração com prata.

Os resultados das experiências descritas nos Exemplos 1-5 são expostos na Tabela que segue. A medição da fluorescência de NADH no dia 0 mostrou que era uma substância fortemente fluorescente, i.e., um composto com actividade desconhecida. No entanto, quando foi testado em experiências de reticulação não mostrou actividade inibidora. Assim, a combinação de ensaios mostra que o composto é um "verdadeiro" negativo. A rutina foi identificada como um falso positivo, porque extinguiu a fluorescência de BSA-AGE, mas não inibiu a reticulação da histona Hl. TABELA 1. Pesquisa de inibidores de glicação avançada não oxidativa:

Fluorescência de AGE em placas de microtítulo de 96 poços amostra fluorescência fluorescência % de Teste de AGE (dia 0) de AGE (dia 5) inibição BSA-AGE branco de histona Hl 1,1(0, ) 1,5(0,2) reacção completa -sob árgon (+ DPTA 5 mM) 1,1 (0,1) 23(1,1) 32 -sob ar 1,1 (0,1) 21 (0,9) 30 + composto Aminoguanidina 1 mM 1,2(0,1) 4,3(0,2) 84 5 mM 1,2 (0,1) 2,2 (0,0) 96 10 mM 1,3(0,1) 1,8(0,0) 97 10 Rutina 200 μΜ Ι,ΚΟ,Ο) 3,0 (0,1) 90 5,7 NADH 5 mM 52 (0,3) 31 (0,0) L-Cys-Gly 1 mM 1,3 (0,3) 17 (0,0 20 5 mM 1,2 (0,2) 26 (0,4) 0 10 mM 1,2 (0,1) 40 (0,0) 0 GSH 1 mM 1,3 (0,0) 19 (0,3) 10 5 mM 1,1 (0,3) 17 (0,3) 20 10 mM 1,1 (0,0) 14 (0,5) 35 L-Cys 1 mM 1,2 (0,1) 14 (0,3) 36 5 mM 1,1 (0,1) 11 (0,2) 50 10 mM 1,2 (0,1) 9,0 (0,2) 61 L-Cys-OMe 1 mM 1,2 (0,1) 15(0,1) 31 5 mM 1,3 (0,1) 12 (0,8) 46 10 mM 1,2 (0,1) 9,0 (0,2) 61 NAC 1 mM 1,2 (0,2) 11 (0,6) 51 5 mM 1,0(0,1) 10(0,4) 55 10 mM 1,1 (0,1) 9,4 (0,6) 58 18 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ

Fluorescência de AGE em placas de microtítulo de 96 poços amostra fluore de AGE scência (dia 0) fluorescência de AGE (dia 5) % de inibição Teste BSA-AGE D,L-Homocisteína 1 mM 1,3 (0,0) 16 (1,1) 26 5 mM 1,2 (0,2) 22 (0,1) 0 10 mM 1,1 (0,1) 27 (1,7) 0 Cisteamina 1 mM 1,0 (0,1) 10 (0,6) 55 5 mM 1,1 (0,1) 9,0 (0,7) 60 10 mM 1,2 (0,2) 6, 0 (0,3) 76 D,L-Penicilamina 1 mM 1,1 (0,2) 13 (0,0) 40 5 mM 1,1 (0,1) 2,7 (0,0) 92 10 mM 1,1 (0,1) 1,7 (0,0) 97 15 D-Penicilamina 1 mM 1,2 (0,0) 11 (0,6) 51 5 mM 1,1 (0,1) 2,9 (0,3) 91 10 mM 1,1 (0,0) 1,4 (0,1) 99 12 Ácido 2-tiobarbitúrico 1 mM 1,1 (0,1) 12 (0,4) 45 5 mM 1,2(0,1) 5,5(0,4) 78 10 mM 1,3 (0,1) 2,3 (0,0) 95 12 L-Ezgotioneína 1 mM 1,0 (0,1) 13 (0,0) 40 5 mM 1,2 (0,0) 9,3 (0,2) 59 10 mM 1,2 (0,1) 7,4 (0,1) 69 Tioureia 1 mM 1,1 (0,1) 181 (0,1) 15 5 mM 1,1(0,1) 15 (0,0) 30 10 mM 1,1 (0,2) 11(0,3) 50 EXEMPLO 7

Os compostos nucleófilos têm o potencial de eliminar compostos electrófilos α-dicarbonilo intermediários. Ver, p.ex., Ferguson, et al., Chem. Res. Tox. 12: 617-622, 1999. Como tal, estes compostos devem ser uma promessa como inibidores de glicação avançada. Vários dos compostos tiol testados apresentaram actividade inibidora, incluindo L-cisteina-metiléster ("L-cys-OMe"), L-cisteina (L-Cys) e Ν-α-acetil-L-cisteina (NAC); no entanto, mostraram apenas 61% de inibição na concentração mais elevada testada, 10 mM. A tiol-cisteamina e o derivado mercaptomidazole L-ergotioneina mostraram uma inibição um tanto melhor, enquanto que a D,L-homocisteína e a NH2-L-cys-gly-COOH aumentaram a fluorescência de AGE, indicando que estas provavelmente sofrem elas próprias reacções de glicação. A D-penicilamina e a mistura racémica D,L-penicilamina foram os melhores dos compostos testados. Verificou-se que os compostos, quando testados com BSA-AGE, não eram falsos positivos. Assim, o seu 19 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ potencial inibidor foi testado, i.e., a sua capacidade para inibir a reticulação induzida pela glicação da histona Hl. De facto, verificou-se que os seus efeitos inibidores eram mais potentes do que os da aminoguanidina. Os resultados são expostos na Figura 15, que mostra tanto a fluorescência em comparação com a fluorescência da aminoguanidina, como os resultados da análise das reticulações. Estes dados mostram que o l-amino-2-mercapto-2,2-dimetiletano é o farmacóforo, i.e., a porção activa da molécula envolvida na inibição da formação de AGE de proteínas. EXEMPLO 8 A actividade inibidora exibida pela D-penicilamina sugeriu que actuava como agente de limpeza contra espécies reactivas de carbonilo. Para testar isto, foram realizadas experiências para avaliar a reactividade quimica para compostos de α-dicarbonilo, a pH e temperatura fisiológicos.

Uma solução de D-penicilamina (350 mg, 2,3 mmol) foi preparada em 50 ml de tampão fosfato aquoso 0,2 M (pH 7,4) e foi-lhe adicionado metilglioxal (40% em H2O/620 μΐ, 3,45 mmol). A mistura foi agitada durante 24 horas a 37°C, após o que o solvente foi concentrado até metade do volume a pressão reduzida, seguido de dessalinação numa coluna. A coluna foi revelada com água, os picos de absorção de UV foram reunidos e a água foi evaporada a pressão reduzida. O produto bruto foi purificado através de cromatografia de permuta aniónica numa coluna QAE Sephadex de 1,5 χ 45 cm, que foi revelada através da aplicação de um gradiente linear formado entre 200 ml de água destilada e 200 ml de NH4HCO3 0,2 M. As fracções foram recolhidas e a absorvência foi medida a 254 nm. O espectro de RMN-1H exibiu os seguintes sinais: [5H(D20) em ppm] : 1,03 (3H, s, CH3) ; 1,05 (3H, s, CH3) ; 1,90 (3H, s, CO-CH3) ; 3,96 e 3,98 (diastereoisomérico, 1H, s, CH-COOH). A análise espectrométrica de massa através de "MALD-TOF-MS" revelou uma [M + Na]+ de 226 Da. Esta é comparável com a massa calculada para C8Hi3N03S, que é de 203, 26 Da. O aducto de aldeido-tiazolidina formou-se, presumivelmente, após o fecho do anel nucleófilo da base de Schiff formada 20 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ inicialmente. Ver a Figura 16 para as estruturas dos reagentes.

Todos os sinais de RMN-1H podiam ser atribuídos ao ácido 2-acetil-5,5-dimetiltiazolidino-4-carboxilico como estrutura do produto da reacção. A única excepção é o sinal em falta da proteína muito ácida na posição 2 do anel de tiazolidina, que provavelmente troca com D20. Não foi detectado nenhum protão de aldeido, excluindo a formação da tiazolidina isomérica em C-2 do metilglioxal. Mais, a análise de RMN-C do composto indicou claramente dois grupos carbonilo, em 5=199 ppm (CH3C=0) e 5=209 ppm (COOH).

Para aprender mais sobre a reacção, fizemos reagir a D-penicilamina com fenilglioxal. Do modo descrito supra, o fenilglioxal, numa concentração final de 10 mM, e a D-penicilamina, numa concentração final de 20 mM foram feitos reagir em tampão KH2P04 50 mM, pH 7,4, à temperatura ambiente. O progresso da reacção foi monitorizado através de análise de hplc de alíquotas da reacção a 254 nm. Após 40 minutos, observou-se mais de 90% de conversão do pico de fenilgloxal num único pico. O produto foi obtido através de HPLC preparativa, foi liofilizado e analisado através de espectroscopia de RMN-H. O espectro exibiu os seguintes sinais: [5H (D20) em ppm]: 1,38 (3H5, CH3), 1,45 (3H, s, CH3), 4,12 (1H, s, CH-COOH), 7,42-7,82 (5H, m, ArH). Novamente, um sinal correspondendo ao protão ácido na posição 2 do anel de tiazolidina não foi detectado, devido à troca esperada com D20, e não foi observado nenhum protão de aldeido. Assim, a estrutura do aducto fenilglioxal-D-penicilamina foi atribuída como ácido 2-benzoil-5,5-dimetiltiazolidino-4-carboxílico.

As estruturas observadas sugerem que o aprisionamento de α-dicarbonilo através da formação de 2-acil-5,5-dialciltiazolidina como mecanismo de inibição da glicação avançada não oxidativa pode explicar a eficácia da inibição da D-penicilamina. A substituição do 5,5-dialcilo pode favorecer espacialmente o fecho do anel de tiazolidina, impedindo a reacção reversa através de hidrólise. 21 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ EXEMPLO 9

As experiências descritas neste exemplo foram desenhadas para avaliar as velocidades relativas do aprisionamento de a-dicarbonilo por D-penicilamina e aminoguanidina, utilizando fenilglioxal como modelo.

As reacções foram realizadas em tampão fosfato 10 mM, pH 7,4, a 37°C, e foram seguidas de análise de HPLC. Foi utilizado fenilglioxal a uma concentração de 50 mM, enquanto que a D-penicilamina e a aminoguanidina foram utilizadas a concentrações de 250 mM e 500 mM. O fenilglioxal foi utilizado como um composto α-oxoaldeído activo em UV. Durante o curso da reacção, foram analisadas aliquotas através de HPLC. Para as reacções envolvendo D-penicilamina, foram tomadas aliquotas a intervalos de 20 segundos que foram mantidas em gelo seco para análise. As velocidades iniciais de reacção do fenilglioxal e compostos de teste foram monitorizadas seguindo o desaparecimento do fenilglioxal ao longo do tempo. A reacção entre o fenilglioxal e os compostos de teste é uma reacção de segunda ordem, onde a equação da velocidade é: -dc = (k2a) [fenilglioxal] [sequestrante de dicarbonilo] dt

Tal como pode ser observado a partir da concentração dos reagentes, havia excesso de composto de teste em todas as reacções (1:5 ou 1:10) para converter a reacção para uma cinética de reacção de pseudo-primeira ordem, uma vez que a constante de velocidade de reacção (ki>) depende aparentemente da concentração do composto de teste.

Um gráfico do log de AUC para fenilglioxal versus o tempo resultou num declive de kia/2,303. A constante de velocidade de primeira ordem (kiO medida foi utilizada para calcular a constante de velocidade de segunda ordem (k20, de acordo com: k2a = kia [sequestrante de a-dicarbonilo] 22 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ

As constantes de velocidade de segunda ordem calculadas foram determinadas a duas velocidades do reagente (5:1 e 10:1) e estavam de acordo. A D-penicilamina aprisionou o fenilglioxal mais de 60 vezes mais rapidamente do que a aminoguanidina. Para determinar se a substituição α-oxo teve algum impacto no progresso da reacção de aprisionamento de aldeído, a reactividade de D-penicilamina com o aldeído correspondente ao fenilglioxal, i.e., fenilacetaldeído, foi realizada, da mesma maneira que é descrita aqui.

Verificou-se que a D-penicilamina aprisionava o fenilacetaldeído cerca de 14 vezes menos eficientemente do que o fenilglioxal, levando à conclusão de que a D-penicilamina aprisiona compostos de carbonilo α-oxo mais eficientemente do que os aldeídos. EXEMPLO 10

Foi estabelecido que compostos tais como o glioxal e o metilglioxal são tóxicos para as células, tais como células neuronais (Kikuchi, et al.f J. Neurosci. Res. 57: 280-289, 1999; Shinpo, et al., Brain Res. 861: 151-159, 2000) e linhas celulares derivadas de macrófagos (Okada, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 225: 219-229, 1996). Como tal, foi testada a capacidade dos sequestrantes de α-dicarbonilo para proteger contra toxidade de α-dicarbonilo.

Linhas celulares continuamente cultivadas "He-Cat" (queratinócitos epidérmicos humanos) e "CF-3" (fibroblastos dérmicos humanos), foram cultivadas sob condições padrão, divididas bissemanalmente em dmem contendo albumina de soro bovino a 10%, e foram mantidas numa atmosfera humidificada contendo CO2 a 5% a 37°C. Para dividir as células, foi utilizada tripsina a 5% nos queratinócitos e foi utilizada tripsina a 1% nos fibroblastos.

Os queratinócitos foram semeados a 2xl04 células/poço e os fibroblastos a 4xl04 células/poço, utilizando caixas de 6 poços. Permitiu-se que as células se ligassem à placa de um dia para o outro. Foi adicionada às placas D-penicilamina ou 23 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ aminoguanidina (1 mM de cada) 15 minutos antes da adição de glioxal ou metilglioxal. 0 α-dicarbonilo foi deixado durante 72 horas. Foram utilizadas concentrações variáveis de α-dicarbonilo. As células foram contadas com um contador Coulter após 72 horas de stress. Foram também corridas culturas onde o glioxal ou o metilglioxal foi utilizado sem o sequestrante. Foi utilizada L-alanina como controlo negativo uma vez que não se esperava que tivesse um efeito protector.

Os resultados indicaram que concentrações crescentes de metilglioxal resultavam em inibição do crescimento dependente da dose com concentrações de 600 μΜ completamente inibidoras para ambas as linhas. O glioxal afectou igualmente ambos os tipos celulares, embora os fibroblastos fossem menos sensíveis ao glioxal. A L-alanina não mostrou qualquer efeito protector. A aminoguanidina salvou em parte ambas as linhas celulares da inibição do crescimento induzida por metilglioxal, embora a D-penicilamina fosse superior, e tivesse bloqueado quase completamente a toxidade do metilglioxal. Ambos os compostos pareceram proteger queratinócitos contra a inibição do crescimento por glioxal. O efeito protector pode ser observado na Figura 17. Presumivelmente, a eliminação directa dos agentes de carbonilo tóxicos reactivos é a causa, porque a pré-incubação das células com os compostos protectores durante 24 horas seguida de exposição aos α-dicarbonilos não mostrou qualquer efeito protector.

Era interessante determinar se a D-penicilamina exibia um efeito citoprotector com um intervalo de dose. A concentração crescente de D-penicilamina resultou em maior protecção. Observou-se que os fibroblastos eram, de facto, mais sensíveis à actividade do metilglioxal do que os queratinócitos, com a D-penicilamina a apresentar uma sobrevivência de 47% nos fibroblastos tratados com os metilglioxal 6004 M, em comparação com uma sobrevivência de 100% dos queratinócitos. A Figura 18 mostra isto. EXEMPLO 11

Este exemplo é também relatado em Wondrak, et al., Biochem J. 351: 769-777, 2000. 24 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ

Os exemplos aqui descritos mostram a potência da ADP-ribose a causar carbonilação da histona Hl. É também relatado, supra, que a qlucose reage fracamente.

Foi realizada uma série de experiências para comparar diferentes açúcares redutores como agentes de glicação. Para além da ADP-ribose, foram testadas a ADP-glucose, a D-ribose e a D-glucose. Resumidamente, a histona Hl foi combinada com 1 mM de cada açúcar e a mistura foi incubada a pH 7,4. Após 7 dias de incubação, foram analisadas alíquotas da reacção em géis de SDS-PACE a 12%, com coloração com prata. Os resultados são apresentados nas Figuras 19A e B. Em cada uma destas, a pista 1 é um controlo, sem açúcar adicionado, enquanto que as pistas 2-5 mostram resultados utilizando D-glucose, D-ribose, ADP-glucose e ADP-ribose, respectivamente. A ADP-ribose causou carbonilação extensiva, enquanto que a D-ribose causou uma quantidade menor. Nem a D-glucose nem a ADP-glucose causaram carbonilação significativa. A quantidade de carbonilação causada pela ADP-ribose (0,82 moles/mole de histona Hl) e a D-ribose (0,06 moles/mole de histona Hl) correlacionaram-se com a imunocoloração.

Para determinar se a carbonilação da histona Hl pela ADP-ribose envolvia uma via oxidativa, vários compostos, que se sabe interferirem com a glicoxidação de proteínas através da D-glucose, foram testados para determinar se tinham interferido com esta acção pela ADP-ribose. Os compostos testados incluíam DTPA 5 mM sob árgon, aminoguanidina 5 mM, N“-acetil-L-cisteína 5 mM, manitol 5 mM e 100 unidades/ml de catalase. Estes resultados são representados nas Figuras 19C e D, e mostram que nenhum destes interferiu com a carbonilação, com excepção da aminoguanidina, a qual mostrou um ligeiro efeito. A reticulação das proteínas, no entanto, foi completamente bloqueada, o que sugere que a carbonilação da histona Hl pela ADP-ribose é um resultado de glicação inicial, em vez de glicoxidação. A descrição anterior expõe vários aspectos do presente invento, que se relacionam com um método para identificação de substâncias que efectuam stress celular. O "stress celular" tal como aqui utilizado refere-se a stress induzido, p.ex., por stress oxidativo, glicação, radiação UV, e por 25 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ assim por adiante. Isto, por sua vez, conduz à deterioração e ao envelhecimento dos tecidos. De preferência, o método refere-se à identificação de substâncias que actuam como sequestrantes de carbonilo, tais como sequestrantes de dicarbonilo, e que inibem assim a formação de produtos AGE das proteínas. Em paralelo, estes ensaios permitem que o perito elimine antioxidantes no ensaio de pesquisa, porque os ensaios funcionam na ausência de oxigénio. Assim, pode-se identificar sequestrantes de dicarbonilo utilizando este método e pode-se também pesquisar compostos para determinar se eles funcionam ou não como antioxidantes.

Tal como indicado, supra, o método envolve essencialmente a mistura de um composto ou de uma substância em estudo com a proteína histona Hl e ADP-ribose. Sabe-se que a histona Hl e a ADP-ribose interagem, conduzindo à formação de um produto fluorescente. Se o composto de interesse, quando misturado com a histona Hl e a ADP-ribose resultar numa redução da fluorescência, a substância pode ser um inibidor da formação de AGE de proteínas. Inversamente, agonistas da formação de AGE de proteínas podem ser identificados da mesma maneira.

Tal como exemplos indicam, a substância de interesse pode ser testada em pelo menos dois ensaios adicionais diferentes, incluindo um onde a substância é misturada com BSA-AGE bem como histona Hl e ADP-ribose, e um ensaio para determinar se as moléculas de histona Hl têm reticulações, quando estas eram combinados com ADP-ribose e a substância de interesse.

De particular interesse são os compostos considerados nucleófilos, em particular compostos contendo tiol. Tal como os exemplos mostram, compostos com as propriedades desejadas foram identificados deste modo.

Note-se que se pode medir a glicação dos compostos de muitas maneiras. Por exemplo, a arte é familiar com ensaios para determinar o teor de frutosamina de moléculas e tais são, de facto, ensaios para determinar a glicação. Estes, assim como outros ensaios, podem ser utilizados neste invento. 26 ΕΡ 1 272 843/ΡΤ

Em concretizações preferidas, são realizados pelo menos dois ensaios diferentes, para confirmar os resultados revelados num primeiro ensaio, mas tal não é necessário. Mais, os ensaios podem ser corridos, em cadeia, com um controlo positivo, um controlo negativo ou de preferência com ambos. Novamente, o tipo de ensaio de controlo utilizado pode variar e este está à discrição do perito.

Para além dos ensaios do presente invento, fazem também parte deste estojos. Estes estojos compreendem, no mínimo, um meio recipiente, tal como uma caixa, que contém então porções separadas de cada um de ADP-ribose e histona Hl, em solução, liofilizadas, em pó, em comprimidos ou nalguma outra forma conveniente ao perito. Tais estojos contêm de preferência instruções para a realização do ensaio e podem opcionalmente conter amostras de um ou ambos os reagentes de controlo, positivo e negativo, tais como os supra descritos.

Outros aspectos do presente invento serão claros para o perito e não necessitam de ser mais elaborados.

Os termos e expressões que foram empregues são utilizados como termos de descrição e não de limitação, e não há nenhuma intenção na utilização de tais termos e expressões de excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções destas, sendo reconhecido que são possíveis várias modificações dentro do âmbito do presente invento.

Lisboa,

Claims (9)

1. ΕΡ 1 272 843/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para determinar uma substância que regule a glicação de uma proteina, compreendendo a mistura de (i) uma substância a testar, em que a referida substância é um sequestrante de dicarbonilo, (ii) uma histona Hl e (iii) ADP-ribose, e a determinação de se a referida substância a testar tem um efeito na glicação da histona Hl pela ADP-ribose, em que a indicação de um efeito na referida glicação indica que a referida substância regula a glicação.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida substância não é um antioxidante.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a determinação da glicação através da medição da fluorescência da histona Hl glicada.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda a comparação do referido efeito com o efeito alcançado através da mistura de aminoguanidina, histona Hl e ADP-ribose.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a medição da fluorescência cerca de 5 dias após a mistura de (i), (ii) e (iii).
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda a combinação da mistura de (i), (ii) e (iii) num ensaio separado com BSA-AGE, e medição do efeito de (i) sobre a fluorescência de BSA-AGE.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda a determinação de reticulação nas moléculas de histona Hl.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida substância é um composto nucleófilo. ΕΡ 1 272 843/ΡΤ 2/2
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o referido composto nucleófilo é um composto contendo tiol. Lisboa,