ES2286117T3 - Metodo para identificar reguladores dela formacion de proteina-age. - Google Patents

Abstract

Método para determinar una sustancia que regula la glucosilación de una proteína, que comprende mezclar (i) una sustancia que va a someterse a prueba en la que dicha sustancia es un eliminador de dicarbonilo, (ii) una histona H1, y (iii) ADP-ribosa, y determinar si dicha sustancia que va a someterse a prueba tiene un efecto sobre la glucosilación de la histona H1 mediante ADP-ribosa, en el que la indicación de un efecto sobre dicha glucosilación indica que dicha sustancia regula la glucosilación.

Description

Método para identificar reguladores de la formación de proteína-AGE.

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Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método para identificar inhibidores de la formación de proteína-producto final de glucosilación avanzada (a continuación en el presente documento "proteína-AGE"). La metodología es útil para determinar sustancias de interés para tener impacto en estados patológicos con los que está asociada la formación de proteína-AGE, tales como la diabetes, aterosclerosis, enfermedades neurodegenerativas crónicas, tales como enfermedad de Alzheimer, fotoenvejecimiento de la piel y otras enfermedades degenerativas características del proceso de envejecimiento.

Antecedentes y técnica anterior

La glucosilación, tal como se usa en el presente documento, es una modificación no enzimática tras la traducción de proteínas mediante azúcares reductores y otras especies con carbonilo reactivo, lo que afecta adversamente a la función de la proteína. La deterioración y envejecimiento de tejidos se han asociado ampliamente con la acumulación de daño a partir de procesos químicos inducidos por la glucosilación, así como estrés oxidativo e irradiación UV. La acumulación en proteínas de larga vida de productos de glucosilación y productos AGE derivados de la glucosilación se ha implicado en varias enfermedades relacionadas con la edad incluyendo complicaciones diabéticas a largo plazo (Thorpe, et al., Drugs Aging 9: 69-77 (1996)), aterosclerosis (Ruderman, et al., FASEB J 6:2905-2914 (1993); fe de erratas FASEBJ 7(1):237 (1993)), enfermedad de Alzheimer (Vitek, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4766-4770 (1994)), fotoenvejecimiento de la piel (Mizutani, et al., J. Invest. Dermatol 797-802 (1997) y en la patología general del proceso de envejecimiento (Frye, et al., J. Biol Chem 273:18714-18719 (1998)). Las complicaciones diabéticas a largo plazo de la hiperglucemia provocan eventualmente patologías graves y potencialmente mortales tales como enfermedad renal de estadio final (Baynes, et al., Diabetes 40:405-412 (1991)). Se han relacionado mecanísticamente complicaciones macrovasculares y microvasculares irreversibles incluyendo retinopatía, neuropatía, nefropatía, aterosclerosis y enfermedad cerebrovascular con la formación de proteína-AGE en el tejido conjuntivo, especialmente en el colágeno, y componentes de proteína de matriz. Además, acontecimientos similares que se producen con una tasa inferior parecen ser de igual relevancia para el proceso de envejecimiento normal (Thorpe, et al., mencionado anteriormente).

La glucosilación y posterior formación de proteína-AGE desempeña un papel central en el estrés carbonilo celular y toxicidad de la glucosa. Administrar el inhibidor de glucosilación aminoguanidina suprime eficazmente las complicaciones secundarias en roedores con diabetes experimental (Edelstein, et al., Diabetologica 35:96-97 (1992)); sin embargo, la aminoguanidina es un derivado de hidrazina que muestra toxicidad sistémica con la administración a largo plazo, ya que es un potente inhibidor de la catalasa (Ou, et al., Biochem Phamacol 46:1139-1144 (1993)) y la óxido nítrico sintasa inducible (Okuda, et al., J. Neuroimmunol 81:201-210(1998)). El perfil de toxicidad de la aminoguanidina hace que sea improbable que se utilice clínicamente. Por tanto, existe una necesidad clínica urgente para la identificación y caracterización de nuevos compuestos que inhiban eficazmente la glucosilación y sus consecuencias patológicas asociadas. Sería probable que un ensayo de selección de alto rendimiento que pueda aplicarse a grandes bibliotecas combinatorias de compuestos condujese a la identificación de nuevos inhibidores de glucosilación.

Las especies reactivas de oxígeno ("ROS") y especies reactivas de carbonilo ("RCS"), especialmente compuestos de dicarbonilo, son mediadores clave en el daño celular provocado por el estrés oxidativo, la glucosilación y la radiación UV. El origen del estrés carbonilo celular como resultado de la glucosilación, peroxidación de lípidos, autooxidación de azúcares y metabolismo puede observarse, por ejemplo, en la figura 1. Lar rutas dependientes e independientes de oxígeno conducen a la formación de diversas especies reactivas de carbonilo, incluyendo 2-dicarbonilos tales como metilglioxal y glioxal, como productos intermedios clave para la acumulación de daño de proteínas mediante formación de AGE. El estrés carbonilo se origina adicionalmente de la generación metabólica de metilglioxal. En resumen, los productos de glucosilación temprana se derivan de la reacción de un azúcar reductor con grupos amino de proteínas (lisina y arginina) para generar aldiminas (aductos de base de Schiff) que pueden experimentar una transposición de Amadori para formar aductos de cetoamina (Hodge, et al., J. Am. Chem Soc. 75:316-322 (1953)). Los proteína-AGE se generan a partir de productos de glucosilación temprana mediante rutas tanto oxidativas como no oxidativas en las que se sugieren una variedad de compuestos reactivos de dicarbonilo tales como glioxal, metilglioxal y 3-desoxiosonas como productos intermedios (Thornalley, et al., Biochem J. 344:109-116 (1999)). Se ha mostrado que la ADP-ribosa es un potente agente de glucosilación de histona y glucoxidación in vitro (Cervantes-Laurean, et al., J. Biol. Chem.271:10461-10469 (1996)).

Los proteína-AGE incluyen residuos de N^{\varepsilon}-(carboximetil)lisina (CML) de proteínas (Ahmed, et al., J. Biol. Chem 261:4889-4894 (1986)) y un grupo heterogéneo de modificaciones complejas tal como pentosidina (Sell, et al., J. Biol. Chem.264:21597-21602 (1989)) que se caracterizan por su alta fluorescencia y capacidad para provocar reticulaciones proteína-proteína. La acumulación de fluorescencia específica de AGE (ex. 370 nm; em. 440 nm) es una medida general del daño total de proteínas y es una herramienta ampliamente usada de investigación de glucosilación in vitro y in vivo. En algunos casos, los compuestos reactivos de dicarbonilo pueden formarse mediante autooxidación del propio azúcar sin requerir la glucosilación, y la presencia de cantidades traza de iones de metales de transición (Fe, Cu) se ha implicado en la formación de compuestos de dicarbonilo y especies reactivas de oxígeno tales como peróxido de hidrógeno (Elgawish, et al., J. Biol. Chem 271:12964-12971 (1996)). Los aminoácidos distintos de lisina y arginina también se modifican mediante glucoxidación. Por ejemplo, los residuos de metionina expuestos en la superficie en proteínas son muy sensibles a la oxidación de proteínas (Hall, et al., Biochem. Biophys. Acta 1121:325-330 (1992)).

Debido a su abundancia, se supone que la glucosa es una fuente principal de glucosilación y formación de proteína-AGE en proteínas extracelulares in vivo; sin embargo, la glucosa sólo es un agente de glucosilación débil y la reacción química con proteínas en condiciones fisiológicas sólo se produce a lo largo de meses y años (Higgins, et al., J. Biol. Chem 256:5204-5208 (1981)). Al contrario que la glucosa, las pentosas más reactivas se han implicado como fuentes de azúcar para la glucoxidación de proteínas intracelulares, dado que son precursores mucho más eficaces para la formación de AGE fluorescente tal como pentosidina (Sell, et al., mencionado anteriormente). Una pentosa celular abundante es la ADP-ribosa, que se genera a partir de NAD mediante múltiples rutas metabólicas (Cervantes-Laurean, et al., Biochemistry 32:1528-1534 (1993); Jacobson, et al., Mol. Cell Biochem.138:207-212 (1994)). Estudios anteriores se han centrado en una ruta que implica la generación intranuclear de ADP-ribosa (ADPR). La investigación demostró que el núcleo celular es un sitio posible para la glucosilación in vivo mediante ADP-ribosa. El estrés oxidativo y otros estados que provocan la rotura de hebras de ADN estimula la síntesis de polímeros nucleares de ADP-ribosa, que se giran rápidamente generando ADP-ribosa en estrecha proximidad a las histonas de larga vida ricas en residuos de lisina y arginina (Cervantes-Laurean, et al., mencionado anteriormente).

Además de los puntos a los que se hizo referencia anteriormente, el envejecimiento y deterioro tisular se han asociado ampliamente con la acumulación de daño a partir de procedimientos químicos inducidos por el estrés oxidativo, glucosilación, e irradiación UV. Halliwell, et al., Free Radicals in Biology and Medicine (Clarendon Press, Oxford, 1989). Berlett, et al., J. Biol Chem 272:20313-20316 (1997). Todos ellos son potentes inductores de especies reactivas de oxígeno ("ROS") y especies reactivas de carbonilo ("RCS") (Anderson et al., J. Chem, Invest. 104:103-113 (1999)), que son productos intermedios clave del daño de proteínas acumulativo durante el envejecimiento general y varios estados patológicos, por ejemplo, enfermedades inflamatorias crónicas (Dimon-Gadal, et al., J. Invest. Dermatol 114:984-989 (2000)); psoriasis y diabetes. Brownlee, et al., Ann. Rev. Med 46:223-234 (1995); Brinkmann, et al., J. Biol Chem 273:18714-18719 (1998)). Las RCS como productos intermedios reactivos del estrés carbonilo celular se originan de una multitud de rutas mecanísticamente relacionadas, tales como la glucosilación (Thornalley, et al., BioChemJ 344:109-116 (1999), a autooxidación de azúcares (Wolffi, et al., Prog. Clin. Biol. Res 304:259-75 (1989), peroxidación de lípidos (Fu, et al., J. Biol Chem 271:9982-64996) y fotodaño UV (Mizutani, et al., J. Invest. Dermatol 108:797-802 (1997)). La glucosilación, una reacción espontánea amino-carbonilo entre azúcares reductores y proteínas de larga vida es una fuente principal de producción de RCS que conduce a estrés carbonilo celular. Los productos intermedios reactivos de \alpha-dicarbonilo, tales como glioxal, metilglioxal y 3-desoxiosonas, se generan mediante rutas de glucosilación de reacciones tanto oxidativas (glucoxidativa) como no oxidativas. La compleja secuencia de reacciones se inicia mediante la formación reversible de una base de Schiff, que experimenta una transposición de Amadori para formar un producto de cetoamina relativamente estable durante la glucosilación temprana. Una serie de reacciones adicionales que implican la fragmentación de azúcares y formación de compuestos de \alpha-dicarbonilo como productos intermedios reactivos clave proporciona productos finales de glucosilación avanzada (AGE) unidos a proteína estables (Thornalley, et al., mencionado anteriormente; Glomb, et al., J. Biol. Chem 270:10017-10026 (1995); Wondrak, et al., Free Radical Biol. Med. 29:557-567 (2000)). Lander, et al., J. Biol Chem 272:17810-14 (1997). De manera interesante, los RCS y AGE pueden ejercer sus efectos celulares perjudiciales aumentando la producción de ROS, formando así un ciclo vicioso de producción de ROS y RCS. La formación de AGE está acompañada por la acumulación de fluorescencia específica de AGE (\lambdaex-370 nm, \lambdaem-440 nm) y reticulación de proteínas, que son medidas del daño de proteínas total en el tejido. Brownlee, et al., mencionado anteriormente. Se han identificado los productos AGE de imidazolio derivados de arginina (Westwood, et al., J. Proteína Chem14:359-72 (1995); el dimero glioxal-lisina (GOLD) y el dimero metilglioxal-lisina (MOLD) (Brinkmann, et al., J.Biol Chem 273:18714-18719 (1998)) en colágeno de la piel y cristalino humanos envejecidos implicando un estrés \alpha-dicarbonilo en el envejecimiento de tejidos. Adicionalmente, las RCS tales como glioxal, el precursor directo de la N^{\varepsilon}-carboximetil-L-lisina (CML) de AGE, se generan mediante daño por radicales libres de ácidos grasos poliinsaturados en membranas celulares. Fu, et al., mencionado anteriormente. La irradiación UV es otra fuente de estrés carbonilo tisular, tal como se demuestra por la acumulación de CML en lesiones expuestas al sol de elastosis actínica. Mizutani, et al., mencionado anteriormente. Por tan-
to, los productos de AGE tales como CML y GOLD pueden considerarse biomarcadores del estrés carbonilo tisular.

Metilglioxal es un producto intermedio de glucosilación importante (Thornalley, et al., mencionado anteriormente) que también se genera como metabolito biológico mediante degradación enzimática y no enzimática de productos intermedios de fosfato de triosa glucolítico y a partir del catabolismo de la treonina. (Thornalley, et al., Gen. Pharmac 27:565-573 (1996)). Se encuentran niveles aumentados de metilglioxal en la sangre de pacientes diabéticos (Beisswenger, et al., Diabetes 48:198-202 (1999)) y en el cristalino de ratas diabéticas inducidas mediante estreptozotocina. Un estudio reciente sobre la formación de AGE en células endoteliales cultivadas en condiciones hiperglucémicas indicó que el metilglioxal era el precursor principal de AGE (Shinohara, et al., J. Clin. Invest. 101:1142-7 (1998)). Se han identificado diversos AGE derivados de metilglioxal en tejidos humanos, tales como derivados de 5-metilimidazolona fluorescentes, en lesiones ateroscleróticas de la de aorta (Uchida, et al., FEBS Lett 410:313-318 (1997)), o MOLD y N^{\varepsilon}-carboxietil-L-lisina en colágeno de la piel envejecido (Brinkmann, et al., mencionado anteriormente). Recientemente, los efectos citotóxicos de los productos intermedios de glucosilación metilglioxal y 3-desoxiglucosona sobre las células neuronales tales como células PC12 (Suzuki, et al., J. Biochem (Tokio) 123:353-7 (1998)) y neuronas corticales en cultivo (Kih-uchi, et al., J. Neurosci Res 57:280-289 (1999)) han atraído una atención considerable debido a su supuesta participación en la patogénesis de enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer (Vitek, et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 91:4766-70 (1994)) y esclerosis lateral amiotrófica (Shinpo, et al., Brain Res. 861:151-9 (2000)).

Como otro resultado del estrés oxidativo y carbonilo, el daño de proteínas mediante la carbonilación se ha asociado con el envejecimiento y varias enfermedades, tales como enfermedades de envejecimiento prematuro, progeria y síndrome de Werner (Berlett, et al., J. Biol Chem 272:20313-20316 (1997)). La cantidad de grupos carbonilo en proteínas de fibroblastos de la piel se correlaciona fuertemente con la edad del donante (Oliver, et al., J. Biol Chem 262:5488-5491 (1987). Recientemente, se han notificado elevados niveles de carbonilación de histona H1 in vivo como indicadores del estrés glucoxidativo y oxidativo nuclear (Wondrak, et al Biochem J 351:769-777 (2000)).

En contraste con su potencial terapéutico, sólo se han identificado hasta la fecha un número muy limitado de inhibidores biológicos del estrés carbonilo celular, tales como el glutatión eliminador de carbonilo nucleófilo. Sin embargo, algunos inhibidores de la glucosilación interfieren con la reacción atrapando \alpha-dicarbonilos intermedios, mientras que otras sustancias inhibidoras actúan meramente como antioxidantes y quelatantes de metales de transición, inhibiendo así la glucoxidación avanzada, pero no la glucosilación (Elgwash, et al., J. Biochem. 271:12964-71 (1996)). La administración sistémica de aminoguanidina reactiva con carbonilo y derivada de hidrazina, un miembro de la primera clase de inhibidores de glucosilación, suprime eficazmente las complicaciones secundarias en roedores diabéticos con diabetes experimental e inhibe la reticulación del colágeno de la piel (Edelstein, et al., Diabetes 41:26-9(1992); Fu, et al., Diabetes 43: 676-683 (1994)). Recientemente, se ha mostrado que un compuesto bidentado nucleófilo, bromuro de fenilaciltiazolio, protege E. coli frente a la toxicidad de metilglioxal (Ferguson, et al., Chem. Res. Tox 12:617-622 (1999)). Están evaluándose otros compuestos nucleófilos que actúan como trampas de carbonilo tales como tenilsetam (Shoda, et al., Endocrinol 138:1886-92 (1997)), piridoxamina (Onorato, et al., J. Biol. Chem 275:21177-21184 (2000)) y metformina (Ruggiero-Lopez, et al., Biochem) para determinar la prevención de complicaciones diabéticas secundarias.

La exploración in vitro para seleccionar posibles eliminadores de \alpha-dicarbonilo es complicada debido a la naturaleza de la mayoría de lo sistemas de reacción glucoxidativa actualmente empleados, que mide la supresión de la formación de AGE dependiente de oxígeno tal como se evalúa mediante fluorescencia de AGE o cuantificación inmunológica de AGE específicos tales como CML (Elgawish, et al., mencionado anteriormente; Shoda, et al., mencionado anteriormente, Ruggiero-Lopez, et al., mencionado anteriormente). En consecuencia, en estos sistemas de glucoxidación la formación de AGE se inhibe eficazmente por compuestos con actividad antioxidante y quelatante de metales. Recientemente, se ha demostrado la glucosilación avanzada independiente del oxígeno mediante pentosas con formación de fluorescencia de AGE y reticulación de proteínas y se ha relacionado mecanísticamente con la formación no oxidativa de desoxipentosonas como productos intermedios reactivos de \alpha-dicarbonilo (Litchfield, et al., Int. J. Biochem Cell Biol 31:1297-1305 (1999)).

Lo anterior muestra que hay una necesidad urgente para la identificación y caracterización de compuestos que inhiban eficazmente la glucosilación y sus consecuencias patológicas asociadas. Un ensayo de este tipo sería útil, por ejemplo, para analizar grandes bibliotecas combinatorias, de manera que se identifiquen compuestos relevantes. Se describió un ensayo de este tipo en la solicitud provisional a la que se hizo referencia anteriormente, y también se describe en el presente documento. Véase también Wondrak, et al., Biochem J. 351:769-777(2000). El trabajo descrito en ese documento se ha seguido continuando de manera que se desarrolle un ensayo de selección de alto rendimiento para identificar inhibidores de glucosilación que actúan como eliminadores de carbonilo. Antes de estos desarrollos, se han desarrollado varios métodos de ensayo para identificar inhibidores de la glucosilación para fines de investigación (Khalifah, et al., Biochem Biophys Res Commun 257:251-258 (1999); Rahbar, et al., Clin. Chem. Acta 287:123-130 (1999); Ruggiero-Lopez, et al., Biochem. Pharmacol 58:1765-1773 (1999)). Los parámetros que se miden son normalmente la fluorescencia específica de AGE, reticulación de proteínas y determinación inmunológica de proteína-AGE. La mayoría de los ensayos de glucosilación emplean glucosa o pentosa como agente de glucosilación dando como resultado una reacción lenta que requiere varias semanas para el desarrollo. Estos ensayos utilizan normalmente concentraciones de azúcar no fisiológicas o tampones fosfato para aumentar la velocidad de las reacciones. La sensibilidad según se mide por el nivel de detección de la formación de AGE es baja y la precisión de los ensayos también está limitada por las bajas razones de señal con respecto a ruido. Los ensayos más sensibles se basan en la evaluación inmunológica de la formación de AGE mediante ELISA. Los anticuerpos frente a AGE usados en estos ensayos o bien son extremadamente caros o bien no están comercialmente disponibles. Por tanto, es extremadamente deseable tener disponible un ensayo económico, rápido y fácil de poner en práctica para identificar inhibidores de glucosilación de proteínas, tales como inhibidores de glucosilación de proteínas no oxidativa. También se desea tener ensayos disponibles que mecanísticamente no identifiquen antioxidantes, sino materiales tales como eliminadores de carbonilo. Tales ensayos se han desarrollado por los inventores, tal como se observará en la descripción a continuación.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 proporciona un resumen de la glucosilación de proteínas.

La figura 2 muestra la ruta mediante la cual se genera ADPR.

La figura 3 presenta la química de las reacciones de glucosilación mediante ADP-ribosa.

La figura 4 expone datos que muestran que la reacción entre ADP-ribosa e histona H1 avanza rápidamente en condiciones que se asemejan a las condiciones fisiológicas.

La figura 5 compara glucosa, ribosa, ADP-glucosa y ADP-ribosa en el método de la invención.

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La figura 6 compara albúmina de suero bovino e histona H1 como dianas de glucosilación.

La figura 7 muestra que la aminoguanidina suprime la glucosilación de histona H1 por ADP-ribosa.

La figura 8 mide la formación de reticulación de proteínas en la reacción de histona H1/ADP-ribosa.

La figura 9 presenta resultados de experimentos que miden la carbonilación de proteínas.

La figura 10 elabora un diseño para la selección primaria y secundaria de inhibidores.

La figura 11 presenta datos de experimentos que identificaron posibles inhibidores.

La figura 12 presenta datos para dos compuestos negativos, es decir, compuestos que no son inhibidores de glucosilación.

La figura 13 representa resultados de un ensayo diseñado para identificar falsos positivos.

La figura 14 muestra resultados de una prueba de reticulación de confirmación para determinar la glucosilación, y por tanto el daño de proteínas.

La figura 15 muestra los resultados de experimentos que mostraron la capacidad de diversos compuestos para inhibir la reticulación de la histona H1 inducida por glucosilación.

La figura 16 muestra la estructuras de diversos reactivos que se identificaron en un análisis de espectro de ^{1}H-RMN.

La figuras 17 y 18 representan resultados de experimentos diseñados para determinar el efecto protector de D-penicilamina sobre las células.

La figuras 19 A-D muestran estudios sobre el efecto de diversos azúcares (A y B), e inhibidores (C y D).

Descripción detallada de realizaciones preferidas

Se ha encontrado que la ADP-ribosa y la histona H1 experimentan una reacción de glucosilación rápida y potente, y esta reacción es un rasgo característico clave de la invención descrita en el presente documento. La química de las reacciones de glucosilación por la ADP-ribosa es única. Éstas se han aclarado en detalle, tal como se muestra en la figura 3. Además, la reacción avanza de manera suficientemente rápida en condiciones que simulan las condiciones fisiológicas (tampón fosfato 50 mM, pH 7,4, tal como es muestra en la figura 4), para justificar que se considere el ensayo como útil en la exploración para seleccionar compuestos de interés, tal como se describe a continuación. Las cetoaminas y otros productos AGE similares se forman tanto por ADP-ribosa como por glucosa; sin embargo, la velocidad de formación de producto por ADP-ribosa es al menos mil veces más rápida que la formación por glucosa (Cervantes-Laurean, et al., J. Biol. Chem. 271:10461-10469 (1996)). Las reacciones que implican ADP-ribosa son muy rápidas; sin embargo, y esto es clave para la invención, las rutas de reacción que implican ADP-ribosa e histona H1 son similares, pero mucho más rápidas que las iniciadas por otros azúcares, sugiriendo que inhibidores de la reacción rápida entre ADP-ribosa e histona H1 deberán inhibir generalmente las reacciones de glucosilación. Por ejemplo, en un conjunto de experimentos que compararon la reacción de glucosa, ribosa, ADP-glucosa y ADP-ribosa con histona H1, la cantidad de AGE fluorescente generada a partir de ADP-ribosa superó por mucho a todas las otras. Véase la figura 5, que representa tales ensayos, en las condiciones expuestas anteriormente. De manera similar, la histona H1 es una diana de glucosilación excelente. La figura 6 muestra los resultados de experimentos en los que se comparó histona H1 con albúmina de suero bovino como diana de glucosilación. Se conoce la potencia de la ADP-ribosa como agente de glucosilación. La histona H1 básica, rica en lisina y arginina es un sustrato excelente. Por tanto, se ha observado que, en condiciones ligeramente alcalinas (es decir, aproximadamente pH 9,0), la reacción in vitro entre ADP-ribosa e histona H1 avanza en un plazo de minutos, generando así fluorescencia de AGE (Jacobson, et al., "ADP-Ribosa In Glycation and Glycoxydation Reactions", en Koch-Nolte, ed., ADP-Ribosylation In Animal Tissues, Plenum Press, 1997, páginas 371-379) y reticulación de proteínas.

Para que un ensayo sea eficaz en la exploración para seleccionar compuestos que o bien inhiben y/o bien potencian la glucosilación, debe someterse a prueba con un agente con un efecto conocido sobre el proceso que está considerándose. La figura 7 presenta datos que muestran que, cuando se sometió a prueba el inhibidor de glucosilación conocido aminoguanidina, de nuevo a los niveles fisiológicos expuestos anteriormente, se detectó su efecto inhibidor muy rápidamente. Por tanto, el ensayo descrito en el presente documento puede usarse tal como se reivindica.

Datos adicionales presentados en el presente documento muestran que los métodos habituales de medición de la glucosilación de proteínas indicaron que la fluorescencia de tipo AGE que se mide mide realmente el daño de proteínas. Tanto la reticulación de proteínas como la carbonilación de proteínas son indicios bien establecidos de la glucosilación de proteínas. Véase Schacter, et al., Free Radic Biol Med. 17:429-437(1994). En resumen, tras los ensayos descritos a continuación, se midió la formación de reticulación de proteínas en SDS-PAGE al 12%, seguido por tinción con Coomassie y plata. Estos resultados se exponen en la figura 8. La reticulación podía detectarse con un alto grado de sensibilidad cuando la reacción entre ADP-ribosa e histona H1 se llevaba a cabo a pH 9,0. En la figura 8, el carril 1 muestra el tiempo ("t" a continuación en el presente documento) = 0, mientras que los carriles 2 y 3 muestran
t = 2 y 24 horas, respectivamente. En la figura 8, las abreviaturas "M", "D", y "O" representan "monómero", "dímero" y "oligómero", respectivamente. La tinción con plata es la manera preferida de determinación de la reticulación. Se determinó la carbonilación de proteínas mediante inmunotransferencia de tipo Western. Específicamente, se reconoció AGE-BSA, que se había preparado incubando BSA con glucosa 1,66 M, a pH 7,4 durante 90 días a 37ºC, tras haberse derivatizado con 2,4-dinitrofenilhidrazina ("DNP"), cuando se sometió a prueba con anticuerpos específicos para epítopos de DNP unidos a proteína. Esto puede observarse en el carril 2, mientras que el carril 1 muestra BSA sin tratar, que sirvió como control. En la figura 9, el panel A representa una tinción con Commasie, mientras que el panel B muestra una inmunotinción con carbonilo.

En los ejemplos siguientes, el experto en la técnica apreciará que se exponen a continuación diversas realizaciones y rasgos característicos de la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe conjuntos de experimentos llevados a cabo por duplicado; sin embargo, se entenderá que esto no se requiere, ni es necesario para someter a ensayo el número de muestras sometidas a ensayo (48), en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Éste y todos los demás ejemplos se resumen en la figura 10.

Se usó una placa de microtitulación de 96 pocillos para llevar a cabo 48 reacciones por duplicado. El primer par de pocillos contenía los reactivos ADP-ribosa e histona H1, sin ningún posible inhibidor. Un segundo par de pocillos contenía los reactivos y el inhibidor de glucosilación conocido aminoguanidina, y funciona como control positivo. La histona H1 está comercialmente disponible y puede prepararse siguiendo los procedimientos expuestos en Johns, et al., Biochem J. 92:55-59 (1964).

Se añadieron compuestos de prueba a los pocillos, a un nivel de 5 mM, o al límite de solubilidad si éste era inferior a 5 mM. El sistema de reacción es tampón fosfato de potasio 50 mM, a pH 7,4 al que se añadieron histona H1 1,5 mg/ml y ADP-ribosa 1,0 mM. El volumen de reacción era de 300 \mul. Se midió la fluorescencia de AGE a lo largo del tiempo, con una incubación a 37ºC, a 355 nm (ex) y 405 nm (em). Al comparar con el control, se consideró un compuesto de prueba posiblemente positivo si se suprimía la fluorescencia de AGE.

La figura 11 presenta resultados de un ensayo que identificó un posible inhibidor, es decir, cisteína y éster metílico de cisteína. Si un compuesto de prueba no suprimía la fluorescencia, se clasificaba como verdadero negativo, y no se continuaba. Se encontró que tanto beta-alanina como arginina eran verdaderos negativos, tal como se muestra en la figura 12.

Pueden determinarse fácilmente falsos negativos, midiendo la fluorescencia el día 0, para determinar la autofluorescencia. Cualquier compuesto de este tipo se somete a prueba en la selección secundaria, descrita a continuación.

Ejemplo 2

El ejemplo anterior trató verdaderos positivos, verdaderos negativos y falsos negativos. Sin embargo, son posibles los falsos positivos. Estos suprimen la formación de fluorescencia de AGE mediante interferencia física con las mediciones de fluorescencia. Con el fin de eliminar tales compuestos, se someten a prueba para detectar su capacidad para extinguir formas de AGE de albúmina de suero bovino ("AGE-BSA"), en el siguiente ensayo.

Se preparó AGE-BSA según Ikeda, et al., Biochemistry 35:8075-8083 (1996). Entonces se añadió AGE-BSA a un pocillo que contenía el compuesto de prueba ADP-ribosa e histona H1, y se midió la fluorescencia. Se comparó el valor obtenido con un valor obtenido cuando se añadió AGE-BSA a un pocillo que contenía el inhibidor aminoguanidina. Una reducción en la fluorescencia de AGE-BSA en presencia del posible compuesto da como resultado una clasificación como negativo, y la exclusión de selecciones adicionales. En la figura 10 se expone un resumen general de la metodología de selección que se elabora en estos ejemplos.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe una selección secundaria, para evaluar adicionalmente compuestos que se consideran positivos tras los ensayos de los ejemplos 1 y 2. Específicamente, se recordará que cada muestra se sometió a prueba en dos pocillos, uno de los cuales se sometió a prueba en el ejemplo 2, mencionado anteriormente. La muestra no usada se analizó mediante SDS-PAGE al 12%, seguido por tinción con plata, con el fin de visualizar la reticulación de proteínas. Esto sirve como medición independiente del daño de proteínas provocado por la glucosilación. Una falta de daño de proteínas indica que el compuesto de prueba realmente inhibe la glucosilación.

Los resultados de un ensayo de este tipo que confirman un positivo usando fluorescencia se muestran en la figura 13, y usando la prueba de reticulación en la figura 14.

Ejemplo 4

Estos experimentos describen el desarrollo adicional del ensayo tratado anteriormente.

Para explicarlo, se aisló histona H1 a partir de timo de ternero reciente. En primer lugar, se extrajo cromatina de muestras de timo de ternero reciente, mediante extracción con NaCl 0,14 M y Na_{2}S_{2}O_{5} 0,05 M, pH 5, según Wondrak, et al., Biochem J. 351: 769-777 (2000). Tras la extracción repetida con HClO_{4} al 5%, y centrifugación a 1500 x g, se precipitó la histona H1 a partir del sobrenadante añadiendo TCA (concentración final al 20% v/v). Se recogió el precipitado de histona H1 mediante centrifugación a 12.000 x g, y agua desionizada. Se sometió la muestra a diálisis exhaustiva (punto de corte de PM: 12.000-14.000) frente a agua durante 48 horas, y después se liofilizó. Se usó SDS-PAGE (12%) para analizar la pureza de la muestra. Se almacenó toda la proteína recogida de esta manera a 4ºC.

Se combinó la histona H1 (1,5 mg/ml) con ADP-ribosa 1 mM, en tampón KH_{2}PO_{4} 50 mM (pH 7,4, 37ºC, NaN_{3} al 0,015% añadido, para inhibir el crecimiento microbiano). Se añadió esta mezcla de reacción a placas de microtitulación de 96 pocillos. Se añadieron compuestos de prueba a la mezcla de reacción, a concentraciones que oscilaban desde 1 hasta 10 mM, en volúmenes de reacción de 300 \mul. Se realizaron las pruebas por duplicado.

Se determinó el daño de proteínas acumulado midiendo la fluorescencia de AGE, a longitudes de onda de \lambdaex = 370 nm; \lambdaem = 440 nm. Se suprimió la fluorescencia en presencia de compuestos con actividad inhibidora. Se leyeron los ensayos en una placa de microtitulación convencional, con un ajuste de filtros que se aproximaba a las condiciones anteriores (\lambdaex: 355 nm, \lambdaex: 405 nm), que está en el intervalo del máximo de excitación/emisión amplio de compuestos de AGE.

Se midió la fluorescencia al comienzo y tras 5 días de incubación. Se identificaron todos los compuestos que eran inherentemente fluorescentes mediante medición inicial, y se consideraron falsos negativos; sin embargo, dado que pueden de hecho tener propiedades inhibidoras, se sometieron a prueba en una segunda fase del ensayo, descrita a continuación.

Se usó el inhibidor de glucosilación conocido aminoguanidina como control. Además, se sometieron a ensayo histona H1 y ADP-ribosa sin inhibidor potencial, y también se incubó histona H1 sin ADP-ribosa.

Tras 5 días de incubación, la mezcla histona H1/ADP-ribosa produjo fluorescencia de AGE aproximadamente 20 veces superior a la fluorescencia de fondo producida por histona H1 sola. La ADP-ribosa incubada sin histona H1 no generó fluorescencia.

Esta primera fase del ensayo identificó posibles inhibidores; sin embargo, era posible que tales compuestos fueran extinguidores de la fluorescencia en vez de inhibidores de la glucosilación. Como tales, se sometieron a prueba en un ensayo adicional, tal como se describe a continuación.

Para resumir, esta etapa del ensayo de selección identificó verdaderos negativos, que no necesitaban considerarse adicionalmente. También identificó compuestos que podrían ser inhibidores de glucosilación, y compuestos con una actividad incierta. Estas dos últimas clases de compuestos se sometieron a prueba en ensayos descritos a continuación.

Ejemplo 5

Estos experimentos describen cómo se identifican falsos positivos, es decir, extinguidores de la fluorescencia, y se excluyen de los posibles positivos identificados en el ejemplo 1. Esencialmente, se usó una proteína modificada con AGE que tiene actividad de fluorescencia conocida, en una mezcla del compuesto de prueba y otros materiales descritos anteriormente.

La "AGE-BSA", o albúmina de suero bovino modificada con AGE, tiene actividad de fluorescencia conocida. Se preparó según Takata, et al., J. Biol. Chem. 263: 14819-14825 (1988). En resumen, cinco días tras el desarrollo de fluorescencia en el ensayo descrito anteriormente, se disolvieron 1,6 g de albúmina de suero bovino ("BSA") y 3,0 g de D-glucosa en 10 ml de tampón fosfato de sodio 0,5 M, pH 7,4, que contenía NaN_{3} al 0,05%. Se esterilizó por filtración la solución a través de un filtro de 0,45 \mum, y se incubó en la oscuridad durante 90 días a 37ºC. Se sometieron las muestras a diálisis frente a agua, y luego se liofilizaron.

Se realizaron las pruebas añadiendo 1 mg/ml de AGE/BSA a las mezclas de reacción, tal como se describió anteriormente. Todos los compuestos que extinguieron la fluorescencia inherente de la molécula de AGE-BSA se consideraron falsos positivos, y se excluyeron de análisis adicionales.

Ejemplo 6

La siguiente etapa de la metodología de selección implicó someter a ensayo posibles inhibidores para determinar su capacidad para inhibir la reticulación de proteínas. Para someter esto a prueba, se sometieron a ensayo alícuotas de reacción de las mezclas de incubación de 5 días, descritas en el ejemplo 1, mencionado anteriormente, sobre SDS-PAGE al 12%. Se sometieron a prueba de la misma manera tanto histona H1, como el control positivo que contenía aminoguanidina no tratados. Se visualizó todo mediante tinción con plata.

Los resultados de los experimentos descritos en los ejemplos 1-5 se exponen en la tabla siguiente. La medición de fluorescencia de NADH en el día 0 mostró que era una sustancia fuertemente fluorescente, es decir, un compuesto con actividad desconocida. Sin embargo, cuando se sometió a prueba en experimentos de reticulación, no mostró actividad inhibidora. Por tanto, la combinación de los ensayos mostró que el compuesto es un "verdadero" negativo. La rutina se identificó como un falso positivo, ya que extinguió la fluorescencia de AGE-BSA, pero no inhibió la reticulación de histona H1.

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TABLA 1 Selección de inhibidores de la glucosilación avanzada no oxidativa: fluorescencia de AGE en placas de microtitulación de 96 pocillos

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1

2

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Ejemplo 7

Los compuestos nucleófilos tienen el potencial para eliminar compuestos intermedios de \alpha-dicarbonilo electrófilos. Véase, por ejemplo, Ferguson, et al., Chem. Res. Tox 12: 617-622 (1999). Como tales, estos compuestos deben mostrarse prometedores como inhibidores de glucosilación avanzada. Varios de los compuestos de tiol sometidos a prueba mostraron actividad inhibidora, incluyendo el éster metílico de L-cisteína ("L-cys-OMe"), L-cisteína (L-Cys), y N-\alpha-acetil-L-cisteína (NAC); sin embargo, sólo mostraron una inhibición del 61% a la mayor concentración sometida a prueba, 10 mM. La tiol-cisteamina y el derivado de mercaptomidazol L-ergotioneína mostraron una inhibición algo mejor, mientras que la D,L-homocisteína, y NH_{2}-L-cys-gly-COOH aumentaron la fluorescencia de AGE, indicando que probablemente experimentan ellos mismos reacciones de glucosilación. La D-penicilamina y la mezcla racémica de D,L-penicilamina fueron los mejores de los compuestos sometidos a prueba. Se encontró que los compuestos, cuando se sometieron a prueba con AGE-BSA, no eran falsos positivos. Por tanto, se sometió a prueba su potencial inhibidor, es decir, su capacidad para inhibir la reticulación inducida por glucosilación de la histona H1. De hecho, se encontró que sus efectos inhibidores eran más potentes que los de la aminoguanidina. Los resultados se exponen en la figura 15, que muestra tanto fluorescencia comparada con la fluorescencia con aminoguanidina, como los resultados de análisis de reticulación. Estos datos muestran que el 1-amino-2-mercapto-2,2-dimetiletano es el farmacóforo, es decir, la parte activa de la molécula implicada en la inhibición de la formación de AGE-proteína.

Ejemplo 8

La actividad inhibidora mostrada por la D-penicilamina sugirió que actuaba como un agente eliminador frente a especies reactivas de carbonilo. Para someter esto a prueba, se llevaron a cabo experimentos para evaluar la reactividad química frente a compuestos de \alpha-dicarbonilo, a temperatura y pH fisiológicos.

Se preparó una solución de D-penicilamina (350 mg, 2,3 mmol) en 50 ml de tampón fosfato 0,2 M acuoso (pH 7,4) y se añadió metilglioxal (al 40% en H_{2}O/620 \mul, 3,45 mmol) a la misma. Se agitó la mezcla durante 24 horas a 37ºC, tras lo cual se concentró el disolvente hasta la mitad del volumen a presión reducida, seguido por desalación en una columna. Se reveló la columna con agua, se combinaron los máximos de absorción de UV, y se evaporó el agua a presión reducida. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía de intercambio aniónico sobre una columna QAE Sephadex 1,5 x 45 cm, que se reveló mediante aplicación de un gradiente lineal formado entre 200 ml de agua destilada, y 200 ml de NH_{4}HCO_{3} 0,2 M. Se recogieron las fracciones y se midió la absorbancia a 254 nm.

El espectro de ^{1}H-RMN mostró las siguientes señales: [\delta_{H}(D_{2}O) en ppm]: 1,03 (3H, s, CH_{3}); 1,05 (3H, s, CH_{3}); 1,90 (3H, s, CO-CH_{3}); 3,96 y 3,98 (diastereoisoméricos, 1H, s, CH-COOH). El análisis de espectrometría de masas mediante "MALD-TOF-MS" reveló una [M + Na]^{+} de 226 Da. Esto es comparable a la masa calculada para C_{8}H_{13}NO_{3}S, que es de 203,26 Da. El aducto de aldehído-tiazolidina se formó presumiblemente tras el cierre de anillo nucleófilo de la base de Schiff inicialmente formada. Véase la figura 16 para las estructuras de los reactivos.

Todas las señales de ^{1}H-RMN pudieron asignarse a ácido 2-acetil-5,5-dimetil-tiazolidina-4-carboxílico como la estructura del producto de reacción. La única excepción es la señal que falta de la proteína muy ácida en posición 2 del anillo de tiazolidina, que probablemente se intercambia con D_{2}O. No se detectó ningún protón de aldehído, excluyendo la formación de la tiazolidina isómera en C-2 del metilglioxal. Además, el análisis de C-RMN del compuesto indicó claramente dos grupos carbonilo, en \delta = 199 ppm (CH_{3}C=O), y \delta = 209 ppm (COOH).

Para aprender más sobre la reacción, se hizo reaccionar D-penicilamina con fenilglioxal. De la manera descrita anteriormente, se hicieron reaccionar fenilglioxal, a la concentración final de 10 mM, y D-penicilamina, a la concentración final de 20 mM en tampón KH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 7,4, a temperatura ambiente. Se monitorizó el avance de la reacción mediante análisis de HPLC de alícuotas de reacción a 254 nm. Tras 40 minutos, se observó una conversión de más del 90% del pico de fenilglioxal en un único pico. Se obtuvo el producto mediante HPLC preparativa, se liofilizó y se analizó mediante espectroscopia de H-RMN.

El espectro mostró las siguientes señales: [\delta H (D_{2}O) en ppm]: 1,38 (3H_{5}, CH_{3}), 1,45 (3H, s, CH_{3}), 4,12 (1H, s, CH-COOH), 7,42-7,82 (5H, m, ArH). De nuevo, no se detectó una señal correspondiente al protón ácido en la posición 2 del anillo de tiazolidina, debido al intercambio esperado con D_{2}O, y no se observó ningún protón de aldehído. Por tanto, se asignó la estructura del aducto de fenilglioxal-D-penicilamina como ácido 2-benzoil-5,5-dimetil-tiazolidina-4-carboxílico.

Las estructuras observadas sugieren que una trampa de \alpha-dicarbonilo mediante formación de 2-acil-5,5-dialquiltiazolidina como mecanismo de inhibición de la glucosilación avanzada no oxidativa puede explicar la eficacia de inhibición de la D-penicilamina. La sustitución con 5,5-dialquilo puede favorecer estéricamente el cierre del anillo de tiazolidina, evitando la reacción inversa mediante hidrólisis.

Ejemplo 9

Los experimentos descritos en este ejemplo se diseñaron para evaluar las velocidades relativas de atrapamiento de \alpha-dicarbonilo mediante D-penicilamina y aminoguanidina, usando fenilglioxal como modelo.

Se llevaron a cabo reacciones en tampón fosfato 10 mM, pH 7,4, a 37ºC, y se realizó un seguimiento mediante análisis HPLC. Se usó fenilglioxal a una concentración de 50 mM, mientras que se usaron D-penicilamina y aminoguanidina a concentraciones de 250 mM y 500 mM. Se usó fenilglioxal como compuesto de \alpha-oxoaldehído activo frente a UV. A lo largo del transcurso de la reacción, se analizaron alícuotas mediante HPLC. Para las reacciones que implicaban D-penicilamina, se extrajeron alícuotas a intervalos de 20 segundos y se conservaron en anhídrido carbónico sólido para su análisis. Se monitorizaron las velocidades de reacción iniciales de fenilglioxal y compuestos de prueba realizando un seguimiento de la desaparición de fenilglioxal a lo largo del tiempo.

La reacción entre fenilglioxal y los compuestos de prueba es una reacción de segundo orden, en la que la ecuación de la velocidad es:

\frac{\text{-}dc}{dt} = (k_{2nd})[fenilglioxal][eliminador \ de \ dicarbonilo]

Tal como puede observarse a partir de la concentración de reactivos, había un exceso de compuesto de prueba en todas las reacciones (1:5 o 1:10), con el fin de convertir la reacción para obtener una cinética de reacción de pesudoprimer orden, ya que la constante de velocidad de reacción (k_{1}^{er}) depende aparentemente de la concentración del compuesto de prueba.

Una gráfica de log AUC para fenilglioxal frente al tiempo dio como resultado una pendiente de k_{1}^{er}/2,303. Se usó la constante de velocidad de primer orden medida (k_{1}^{er}) para calcular la constante de velocidad de segundo orden (k_{2^{o}}), según:

k_{2^{o}} = k_{1^{er}} [eliminador de \alpha - dicarbonilo]

Las constantes de velocidad de segundo orden calculadas se determinaron con dos tasas de reactivos (5:1 y 10:1), y se correspondían bien.

La D-penicilamina atrapó fenilglioxal más de 60 veces más rápido que la aminoguanidina. Con el fin de determinar si la sustitución en \alpha-oxo tenía algún impacto sobre el avance de la reacción de atrapamiento de aldehído, se determinó la reactividad de D-penicilamina con el aldehído correspondiente a fenilglioxal, es decir, fenilacetaldehído, de la misma manera en la que se describe en el presente documento.

Se encontró que la D-penicilamina atrapaba fenilacetaldehído de una manera aproximadamente 14 veces menos eficaz que el fenilglioxal, conduciendo a la conclusión de que la D-penicilamina atrapa compuestos de \alpha-oxo-carbonilo más eficazmente que aldehídos.

Ejemplo 10

Se han establecido que compuestos tales como glioxal y metilglioxal son tóxicos para células, tales como las células neuronales (Kikuchi, et al., J. Neurosci Res. 57: 280-289 (1999); Shinpo, et al., Brain Res. 861:151-159(2000), y líneas celulares derivadas de macrófagos (Okada, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 225:219-229 (1996)). Como tales, se sometió a prueba la capacidad de eliminadores \alpha-dicarbonilo para proteger frente a la toxicidad de \alpha-dicarbonilo.

Se cultivaron líneas celulares cultivadas de manera continua "He-Cat" (queratinocitos epidérmicos humanos), y "CF-3" (fibroblastos dérmicos humanos), en condiciones habituales, se dividieron cada dos semanas en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%, y se mantuvieron en una atmósfera humidificada que contenía CO_{2} al 5% a 37ºC. Con el fin de dividir las células, se usó tripsina al 5% en los queratinocitos, y se usó tripsina al 1% en los fibroblastos.

Se sembraron queratinocitos a 2 x 10^{4} células/pocillo, y los fibroblastos a 4 x 10^{4} células/pocillo, usando placas de 6 pocillos. Se dejaron que se uniesen las células a la placa durante la noche. Se añadió o bien D-penicilamina o bien aminoguanidina (1 mM cada una) a las placas 15 minutos antes de la adición de glioxal o metilglioxal. Se dejó el \alpha-dicarbonilo durante 72 horas. Se usaron concentraciones variables del \alpha-dicarbonilo. Se contaron las células en un contador Coulter tras 72 horas de estrés. También se realizaron cultivos en los que se usó glioxal o metilglioxal sin el eliminador. Se usó L-alanina como control negativo ya que no se esperaba que tuviese un efecto protector.

Los resultados indicaron que las concentraciones crecientes de metilglioxal dieron como resultado una inhibición del crecimiento dependiente de la dosis siendo concentraciones de 600 \muM completamente inhibidoras en ambas líneas. El glioxal afectó a ambos tipos celulares igualmente, aunque los fibroblastos fueron menos sensibles frente a glioxal. La L-alanina no mostró efecto protector. La aminoguanidina rescató ambas líneas celulares de la inhibición de crecimiento inducida por metilglioxal en parte, aunque la D-penicilamina fue superior, y bloqueó casi completamente la toxicidad de metilglioxal. Ambos compuestos parecieron proteger a los queratinocitos frente a la inhibición del crecimiento por glioxal. Puede observarse el efecto protector en la figura 17. Presumiblemente, la eliminación directa de agentes reactivos de carbonilo, tóxicos, son la causa, dado que la incubación previa de células con los compuestos protectores durante 24 horas seguida de exposición a los \alpha-dicarbonilos no mostró ningún efecto protector.

Resultó interesante determinar si la D-penicilamina mostraba un intervalo de dosis con efecto citoprotector. El aumento de la concentración de D-penicilamina dio como resultado un aumento de la protección. Se observó que los fibroblastos eran de hecho más sensibles a la actividad de metilglioxal que los queratinocitos, mostrando la D-penicilamina una supervivencia del 47% en los fibroblastos tratados con metilglioxal 6004 M, comparado con la supervivencia del 100% de los queratinocitos. La figura 18 muestra esto.

Ejemplo 11

Este ejemplo también se notifica en Wondrak, et al., Biochem J. 351:769-777 (2000).

Los ejemplos descritos en el presente documento muestran la potencia de ADP-ribosa para provocar la carbonilación de histona H1. También se notifica, mencionado anteriormente, que la glucosa reacciona débilmente.

Se llevó a cabo una serie de experimentos para comparar diferentes azúcares reductores como agentes de glucosilación. Además de ADP-ribosa, se sometieron a prueba ADP-glucosa, D-ribosa y D-glucosa. En resumen, se combinó histona H1 con 1 mM de cada azúcar, y se incubó la mezcla a pH 7,4. Tras 7 días de incubación, se analizaron alícuotas de reacción en geles de SDS-PAGE al 12%, con tinción de plata. Se presentan los resultados en las figuras 19A y B. En cada una de éstas, el carril 1 es un control, sin azúcar añadido, mientras que los carriles 2-5 muestran los resultados usando D-glucosa, D-ribosa, ADP-glucosa y ADP-ribosa, respectivamente. La ADP-ribosa provocó una extensa carbonilación, mientras que la D-ribosa provocó una cantidad menor. Ni la D-glucosa ni la ADP-glucosa provocaron carbonilación significativa. La cantidad de carbonilación provocada por la ADP-ribosa (0,82 moles/mol de histona H1) y D-ribosa (0,06 moles/mol de histona H1) se correspondieron con la inmunotinción.

Con el fin de determinar si la carbonilación de la histona H1 mediante ADP-ribosa implicaba una ruta oxidativa, se sometieron a prueba varios compuestos, que se sabía que interferían con la glucoxidación de proteínas mediante D-glucosa para determinar si interferían con esta acción mediante ADP-ribosa. Los compuestos sometidos a prueba incluyeron DTPA 5 mM en argón, aminoguanidina 5 mM, N^{\alpha} acetil-L-cisteína 5 mM, manitol 5 mM y catalasa 100 unidades/ml. Estos resultados se describen en las figuras 19C y D, y muestran que ninguno de éstos interfirieron con la carbonilación, a excepción de la aminoguanidina, que mostró un ligero efecto. Sin embargo, la reticulación de proteínas se bloqueó completamente, lo que sugiere que la carbonilación de la histona H1 mediante ADP-ribosa es un resultado de glucosilación temprana, en vez de glucoxidación.

La descripción anterior expone diversos aspectos de la invención, que se refiere a un método para identificar sustancias que afectan al estrés celular. El "estrés celular" tal como se usa en el presente documento se refiere al estrés inducido, por ejemplo, por el estrés oxidativo, glucosilación, radiación UV y similares. A su vez, esto conduce al envejecimiento y al deterioro tisular. Preferiblemente, el método se refiere a identificar sustancias que actúan como eliminadores de carbonilo, tales como eliminadores de dicarbonilo, y así inhiben la formación de productos proteína-AGE. En paralelo, estos ensayos permiten al experto eliminar antioxidantes en el ensayo de selección, dado que los ensayos funcionan en ausencia de oxígeno. Por tanto, pueden identificarse eliminadores de carbonilo usando este método, y también pueden explorarse compuestos para determinar si funcionan o no como antioxidantes.

Tal como se indicó anteriormente, el método implica esencialmente mezclar un compuesto o sustancia que está estudiándose con la proteína histona H1 y ADP-ribosa. Se sabe que la histona H1 y la ADP-ribosa interaccionan, conduciendo a la formación de un producto fluorescente. Si el compuesto de interés, cuando se mezcla con la histona H1 y la ADP-ribosa da como resultado una reducción de la fluorescencia, la sustancia puede ser un inhibidor de la formación de proteína-AGE. Al contrario, pueden identificarse de la misma manera los agonistas de la formación de proteína-AGE.

Tal como indican los ejemplos, la sustancia de interés puede someterse a prueba en al menos dos ensayos adicionales diferentes, incluyendo uno en el que se mezcla la sustancia con AGE-BSA así como con histona H1 y ADP-ribosa, y un ensayo para determinar si las moléculas de histona H1 se han reticulado, cuando éstas se combinan con ADP-ribosa y la sustancia de interés.

Son de interés particular los compuestos que se consideran que son nucleófilos, en particular compuestos que contienen tiol. Tal como muestran los ejemplos, se identificaron compuestos con las propiedades deseadas de esta manera.

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Se observa que puede medirse la glucosilación de compuestos de muchas maneras. Por ejemplo, la técnica está familiarizada con ensayos para determinar el contenido en fructosamina de moléculas y estos son, de hecho, ensayos para determinar la glucosilación. Pueden usarse estos, así como otros ensayos, en esta invención.

En realizaciones preferidas, se llevan a cabo al menos dos ensayos diferentes, de manera que se confirmen los resultados desarrollados en un primer ensayo, pero no se requiere. Además, los ensayos pueden realizarse en serie, o bien con un control positivo, con un control negativo o bien de la manera más preferible con ambos. De nuevo, el tipo de ensayo de control usado puede variar, y esto depende del criterio del experto en la técnica.

Además de los ensayos de la invención, los kits también son parte de la misma. Estos kits comprenden, como mínimo, un medio recipiente, tal como una caja, que contiene entonces partes separadas de ADP-ribosa e histona H1, en solución, liofilizadas, en polvo, en comprimidos o alguna otra forma conveniente para el experto. Tales kits contienen preferiblemente instrucciones para llevar a cabo el ensayo, y pueden contener opcionalmente muestras de uno o ambos de un reactivo de control positivo y negativo, tales como los descritos anteriormente.

Otros aspectos de la invención resultarán evidentes para el experto en la técnica, y no necesitan elaborarse adicionalmente.

Los términos y expresiones que se han empleado se utilizan como términos de descripción, y no de limitación, y no hay intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir ningún equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, reconociéndose que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención.

Claims (9)

1. Método para determinar una sustancia que regula la glucosilación de una proteína, que comprende mezclar (i) una sustancia que va a someterse a prueba en la que dicha sustancia es un eliminador de dicarbonilo, (ii) una histona H1, y (iii) ADP-ribosa, y determinar si dicha sustancia que va a someterse a prueba tiene un efecto sobre la glucosilación de la histona H1 mediante ADP-ribosa, en el que la indicación de un efecto sobre dicha glucosilación indica que dicha sustancia regula la glucosilación.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha sustancia no es un antioxidante.

3. Método según la reivindicación 1, que comprende determinar la glucosilación midiendo la fluorescencia de la histona H1 glucosilada.

4. Método según la reivindicación 1, que comprende además comparar dicho efecto con el efecto logrado mezclando aminoguanidina, histona H1 y ADP-ribosa.

5. Método según la reivindicación 1, que comprende medir la fluorescencia aproximadamente 5 días tras mezclar (i), (ii) y (iii).

6. Método según la reivindicación 1, que comprende además la combinación de mezclar (i), (ii) y (iii) en un ensayo separado con AGE-BSA, y medir el efecto de (i) sobre la fluorescencia de AGE-BSA.

7. Método según la reivindicación 1, que comprende además determinar la reticulación de moléculas de histona H1.

8. Método según la reivindicación 1, en el que dicha sustancia es un compuesto nucleófilo.

9. Método según la reivindicación 6, en el que dicho compuesto nucleófilo es un compuesto que contiene tiol.