ES2197689T3 - Procedimientos para inhibir complicaciones diabeticas. - Google Patents
Procedimientos para inhibir complicaciones diabeticas.Info
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Abstract
Utilización de una cantidad eficaz, para tratar la hiperlipidemia asociada a la diabetes, de un compuesto de fórmula general: **FORMULA** en la que R1 es CH2NH2, CH2SH, COOH, CH2CH2NH2, CH2CH2SH ó CH2COOH; R2 y R6 son H, OH, SH, NH2, alquil C1_18, alcoxi o alqueno; R4 y R5 son H, alquil C1_18, alcoxi o alqueno; Y es N ó C, de manera que cuando Y es N, R3 no es nada, y cuando Y es C, R3 es NO2 u otro grupo que cede electrones, y sales de los mismos, para la preparación de un medicamento para tratar la hiperlipidemia asociada a la diabetes en un mamífero.
Description
Procedimientos para inhibir complicaciones
diabéticas.
La presente invención se refiere al campo de los
productos finales de la glucosilación avanzada (AGE), de su
formación, detección, identificación, inhibición y de los
inhibidores de los mismos.
La glucosilación no enzimática mediante la
glucosa y otros azúcares reductores es una modificación importante
tras la traducción de las proteínas que está cada vez más implicada
en diversas patologías. La glucosilación irreversible no enzimática
y la reticulación a través de un proceso lento, provocado por la
glucosa puede mediar muchas de las complicaciones asociadas a la
diabetes. La hiperglucemia crónica asociada a la diabetes puede
producir alteraciones crónicas en el tejido que pueden conducir a
complicaciones tales como las enfermedades retinopatía, nefropatía
y arterioesclerosis. (Cohen y Ziyadeh, 1996, J. Amer. Soc.
Nephrol. 7:183-190). Se ha demostrado
que la alteración crónica del tejido producida, asociada a la
diabetes mellitus proviene a largo plazo en parte de la formación
in situ del complejo inmunitario por las inmunoglobulinas
acumuladas y/o los antígenos unidos a proteínas estructurales de
vida larga que han experimentado la formación del producto final de
la glucosilación avanzada (AGE), a través de la glucosilación no
enzimática (Brownlee et al., 1983, J. Exp. Med.
158:1739-1744). El objetivo de la proteína
primaria se cree que es el colágeno asociado a la matriz
extracelular. La glucosilación no enzimática de proteínas, lípidos
y ácidos nucleicos puede desempeñar un importante papel en los
procesos naturales de envejecimiento. Recientemente, la
glucosilación avanzada de proteínas se ha asociado a los depósitos
\beta-amiláceos y a la formación de marañas
neurofibrilares en la enfermedad de Alzheimer, y posiblemente en
otras enfermedades neurodegenerativas que ocasionan amiloidosis
(Colaco y Harrington, 1994, NeuroReport
5:859-861). Se ha demostrado también que las
proteínas glucosiladas son tóxicas, antigénicas y capaces de
activar las respuestas celulares de la lesión después de la
absorción por receptores celulares específicos (véase por ejemplo,
Vlassara, Bucala & Striker, 1994, Lab. Invest.
70:138-51; Vlassara et al., 1994,
PNAS (USA) 91:11704-11708; Daniels y
Hauser, 1992, Diabetes 41:1415-1421;
Brownlee, 1994, Diabetes 43:836-841;
Cohen et al., 1994, Kidney Int.
45:1673-1679; Brett et al., 1993,
Am. J. Path. 143:1699-1712; y Yan
et al., 1994, PNAS (USA)
91:7787-7791).
El aspecto de los pigmentos marrones durante el
cocinado de alimentos es un fenómeno reconocido mundialmente, cuya
química fue descrita en primer lugar por Maillard en 1912, y que ha
conducido posteriormente a investigar el concepto de envejecimiento
de las proteínas. Se sabe que los alimentos almacenados y
calentados experimentan un oscurecimiento no enzimático que está
caracterizado por proteínas reticuladas que disminuyen su
biodisponibilidad. Se observó que esta reacción de Maillard tenía
lugar también in vivo, cuando se observó que una glucosa
estaba unida a través de una reestructuración de Amadori al terminal
amino de la cadena \alpha de hemoglobina.
La presente exposición enseña el mecanismo
impredicho y desconocido anteriormente de la formación de productos
finales de la glucosilación avanzada post-Amadori
(productos Maillard; AGE) y de los procedimientos para identificar
y caracterizar inhibidores eficaces de la formación de AGE
post-Amadori. La presente exposición demuestra el
único aislamiento y la caracterización cinética de un componente
reactivo intermedio de proteína en la formación de AGE
post-Amadori y para los procedimientos de enseñanza
del primer periodo que permiten la aclaración específica y el
estudio cinético cuantitativo rápido de las ``últimas'' etapas de
la reacción de glucosilación de la proteína.
A diferencia de dicha ``última'' formación de
AGE, las etapas ``primeras'' de la reacción de glucosilación se han
caracterizado e identificado relativamente bien para varias
proteínas (Harding, 1985, Adv. Protein Chem.
37:248-334; Monnier & Baynes eds., 1989;
The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition
(Alan R. Liss; Nueva York); Finot et al., 1990, eds. The
Maillard Reaction in Food Processing, Human Nutrition and
Physiology (Birkhauser Verlag, Basilea)). Se sabe que las
reacciones de glucosilación se inician por reacciones de adición
con una base de Schiff reversible (aldimina o cetimina) con y
\varepsilon-amino con cadena lateral de lisina y
grupos \alpha-amino terminal, seguidas de
reestructuraciones de Amadori esencialmente irreversibles para dar
productos de cetoamina, p. ej.:
1-amino-1-desoxi-cetosas
a partir de la reacción de aldosas (Baynes et al., 1989, en
The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition, ed.
Monnier and Bayner, (Alan R. Liss, Nueva York, págs.
43-67). Típicamente, los azúcares reaccionan al
principio en sus formas aldehído o ceto de cadena abierta (no las
estructuras predominantes de piranosa y furanosa) con grupos
\alpha-amino terminal y
\varepsilon-amino con cadena lateral de lisina por
condensación reversible con la base de Schiff (Figura 30A). Los
productos aldimina o cetimina resultantes experimentan a
continuación reestructuraciones de Amadori para dar productos de
Amadori de cetoamina, es decir,
1-amino-1-desoxi-cetosas
procedentes de la reacción de las aldosas (Means & Chang, 1982,
Diabetes 31, supl. 3:1-4; Harding,
1985, Adv. Protein Chem. 37:248-334).
Estos productos de Amadori experimentan a continuación, durante un
periodo de semanas y meses, reacciones lentas e irreversibles de
``oscurecimiento'' de Maillard, que forman productos fluorescentes y
otros productos mediante reestructuración, deshidratación,
fragmentación oxidativa y reacciones de reticulación. Estas
reacciones post-Amadori, (reacciones lentas de
``oscurecimiento'' de Maillard), conducen a productos finales poco
caracterizados de glucosilación avanzada (AGE).
Como en el caso de los productos de Amadori y
otros productos intermedios de glucosilación, la propia glucosa
libre puede experimentar reacciones oxidativas que conducen a la
producción de peróxido y fragmentos muy reactivos como los glioxal
dicarbonilos y el glucoaldehído. Por lo tanto la aclaración del
mecanismo de formación de una variedad de AGE ha sido sumamente
compleja ya que la mayoría de los estudios in vitro se han
realizado a concentraciones sumamente altas de azúcar.
A diferencia de la formación relativamente bien
caracterizada de estos productos ``primeras'', ha existido una clara
falta de comprensión de los mecanismos de formación de los
``últimos'' productos de Maillard producidos en las reacciones
post-Amadori, debido a su heterogeneidad,
prolongados tiempos de reacción y complejidad. La falta de
información detallada acerca de la química de la ``última''
reacción de Maillard estimuló la investigación para identificar
cromóforos fluorescentes de AGE procedentes de la reacción de la
glucosa con los grupos amino de los polipéptidos. Se identificó
dicho cromófero,
2-(2-furoil)-4(5)-(2-furanil)-1H-imidazol
(FFI) después del oscurecimiento no enzimático de la albúmina de
suero bovino y de la polilisina con glucosa y se admitió como
postulado que era representativo del cromóforo presente en los
polipéptidos íntegros. (Pongor et al., 1984,
PNAS(USA) 81:2684-2688).
Estudios posteriores demostraron que FFI era un artefacto formado
durante la hidrólisis ácida para análisis.
Se han concedido una serie de patentes U.S.
referidas al campo de la inhibición de la glucosilación de
proteínas y la reticulación de aminas gluproteicas basadas en la
premisa de que el mecanismo de tal glucosilación y reticulación
tiene lugar mediante glucosilación saturada y posterior reticulación
de las amino glucoproteicas a través de una sola reacción
básica y repetitiva. Estas patentes comprenden las
patentes U.S. nº 4.665.192; nº 5.017.696; nº 4.758.853; nº
4.908.446; nº 4.983.604; nº 5.140.048; nº 5.130.337; nº
5.262.152; nº 5.130.324; nº 5.272.165; nº 5.221.683; nº
5.258.381; nº 5.106.877; nº 5.128.360; nº 5.100.919; nº
5.254.593; nº 5.137.916; nº 5.272.176; nº 5.175.192; nº
5.218.001; nº 5.238.963; nº 5.358.960; nº 5.318.982 y nº
5.334.617.
El centro de atención de estas patentes U.S., es
un procedimiento para la inhibición de la formación de AGE enfocado
en el grupo carbonilo del producto Amadori inicial de la
glucosilación y en particular la inhibición más eficaz demostrada
enseña la utilización de aminoguanidina administrada por vía
exógena. La eficacia de la aminoguanidina como inhibidor de la
formación de AGE se está experimentando actualmente en estudios
clínicos.
La inhibición de la formación de AGE presenta
utilidad en las áreas, por ejemplo, de la alteración de alimentos,
envejecimiento de las proteínas animales e higiene personal, tal
como para combatir el oscurecimiento de los dientes. Algunos
notables, aunque cuantitativamente menores, productos finales de la
glucosilación avanzada son la pentosidina y la
N^{\varepsilon}-carboximetil-lisina
(Sell y Monnier, 1989, J. Biol. Chem. 264:21597
-21602; Ahmed et al., 1986, J. Biol. Chem.
261:4889-4894).
El producto intermedio de Amadori y la posterior
formación de AGE post-Amadori según se enseña en la
presente invención, no está totalmente inhibido por la reacción con
aminoguanidina. Por lo tanto, la formación de los AGE
post-Amadori como se enseña en la presente
exposición tiene lugar mediante una importante y única etapa de
reacción que no ha sido demostrada anteriormente, o que incluso es
posible que anteriormente se haya demostrado en aislamiento. Es un
objetivo muy deseable disponer de un procedimiento eficaz y
efectivo para identificar y caracterizar los inhibidores de AGE
post-Amadori efectivos de esta ``última'' reacción.
Probando procedimientos de identificación y sistemas de modelos
eficaces, se puede emplear la química combinatoria para identificar
compuestos experimentales con eficacia y de este modo reducir en
gran medida el tiempo, coste y esfuerzo en la eventual validación
de los compuestos inhibidores. Sería muy útil disponer de
procedimientos in vivo para modelar y estudiar los efectos
de la formación de AGE post-Amadori que permitieran
a continuación la caracterización eficaz de inhibidores
efectivos.
Los compuestos inhibidores que son biodegradables
o que se metabolizan de forma natural son más deseables de utilizar
como terapéuticos que los compuestos muy reactivos que pueden
presentar efectos secundarios tóxicos, tal como la
aminoguanidina.
El documento
FR-A-2349330 da a conocer una
composición que se compone de piridoxina y de un antioxidante para
el tratamiento de la hiperlipidemia.
El documento
US-A-5.288.716 se refiere a la
utilización de derivados de piridoxina para la prevención y el
tratamiento de la hiperlipidemia y de la aterosclerosis.
El documento
GB-A-1478560 da a conocer derivados
de piridoxina para el tratamiento y la prevención de la
hiperlipoproteinemia.
El documento
JP-A-10175954 describe la
utilización de derivados de piridina para el tratamiento y la
prevención de las complicaciones diabéticas.
El documento
WO-A-9709981 da a conocer la
pirodoxamina y el pirofosfato de tiamina como inhibidores de la
formación de AGE post-Amadori.
Bucala et al., 1994, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 91: 9441-9445 informa sobre
las formas LDL modificadas por AGE en pacientes con insuficiencia
renal.
Booth et al., 1996, Biochem. Biophys.
Res. Com. 220:113-119 da a conocer que
la pirodoxamina y el pirofosfato de tiamina fueron más eficaces
para inhibir la formación de AGE que la aminoguanidina.
Williamson et al., 1993, Diabetes
42:801-813 describe los mecanismos del
desequilibrio celular de oxidorreducción provocado por la
hiperglucemia y las consiguientes alteraciones en el tejido.
La presente invención se refiere a la utilización
de un compuesto de fórmula general
en la que R_{1} es CH_{2}NH_{2},
CH_{2}SH, COOH, CH_{2}CH_{2}NH_{2}, CH_{2}CH_{2}SH ó
CH_{2}COOH;
R_{2} y R_{6} son H, OH, SH, NH_{2}, alquil
C 1-18, alcoxi o alqueno;
R_{4} y R_{5} son H, alquil C
1-18, alcoxi o alqueno;
Y es N ó C, de manera que cuando Y es N, R_{3}
no es nada, y cuando Y es C, R_{3} es NO_{2} u otro grupo que
cede electrones, y sales de los mismos, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de un patología seleccionada de
entre hiperlipidemia asociada a la diabetes, desequilibrio celular
de oxidorreducción asociado a la diabetes, hipercolesterolemia
asociada a la diabetes e hipertrigliceridemia asociada a la
diabetes. En una forma de realización preferida el compuesto es la
piridoxamina.
Los compuestos utilizados en la presente
invención pueden incorporar uno o más grupos que ceden electrones,
tales como y no limitados a -NH_{2}, -NHR, -NR_{2}, -OH,
-OCH_{3}, -OCR y -NH-COCH_{3}, en los que R es
alquil C 1-18.
``Alquil'' en la presente invención significa
grupos alquil de cadena lineal o ramificada con 1 a 18 átomos de
carbono, tal como, por ejemplo, metil, etil, propil, isopropil,
n-butil, sec-butil,
terc-butil, pentil, 2-pentil,
isopentil, neopentil, hexil, 2-hexil,
3-hexil y 3-metilpentil. Excepto que
se indique de otra manera, los sustituyentes del grupo alquil en la
presente memoria están opcionalmente sustituidos con, por lo menos,
un grupo seleccionado independientemente de entre hidro, mono- o
dialquilamino, fenil o piridil.
``Alcoxi'' en la presente invención significa
grupos alquoxi de cadena lineal o ramificada con 1 a 18 átomos de
carbono, tal como, por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi,
n-butoxi, sec-butoxi,
terc-butoxi, pentoxi, 2-pentil,
isopentoxi, neopentoxi, hexoxi, 2-hexoxi,
3-hexoxi y 3-metilpentoxi.
``Alqueno'' en la presente invención significa
grupos alqueno de cadena lineal o ramificada con 2 a 18 átomos de
carbono, tal como, por ejemplo, etileno, propileno,
1-buteno, 1-penteno,
1-hexeno, cis y trans
2-buteno ó 2-penteno, isobutileno,
3-metil-1-buteno,
2-metil-2-buteno y
2,3-dimetil-2-buteno.
``Sales de los mismos'' en la presente invención
significa los compuestos utilizados en la presente invención como
sales y complejos metálicos con dichos compuestos, tales como con,
y no limitados a, Al, Zn, Mg, Cu y Fe.
La Figura 1 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE en la albúmina de suero bovino (BSA). Figura
1A: piridoxamina (PM); Figura 1B: fosfato de pirodoxal (PLP);
Figura 1C: pirodoxal (PL); Figura 1D: piridoxina (PN).
La Figura 2 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{1} y de
la aminoguanidina (AG) sobre la formación de AGE en la albúmina de
suero bovino. Figura 2A: pirofosfato de tiamina (TPP); Figura 2B:
monofosfato de tiamina (TP); Figura 2C: tiamina (T); Figura 2D:
aminoguanidina (AG).
La Figura 3 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE en la metahemoglobina humana (Hb). Figura 3A:
piridoxamina (PM); Figura 3B: fosfato de piridoxal (PLP); Figura
3C: piridoxal (PL); Figura 3D: piridoxina (PN).
La Figura 4 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{1} y de
la aminoguanidina (AG) sobre la formación de AGE en la
metahemaglobina humana. Figura 4A: pirofosfato de tiamina (TPP);
Figura 4B: monofosfato de tiamina (TP); Figura 4C: tiamina (T);
Figura 4D: aminoguanidina (AG).
La Figura 5 es una comparación en diagrama de
barras de la inhibición de la glucosilación de la ribonucleasa A con
el pirofosfato de tiamina (TPP), piridoxamina (PM) y aminoguanidina
(AG).
La Figura 6A es un gráfico de la cinética de
glucosilación de la RNasa A (10 mg/ml) por la ribosa controlada por
ELISA. La Figura 6B es un gráfico de muestra la dependencia de los
tiempos medios recíprocos en la concentración de ribosa a pH
7,5.
La Figura 7 son dos gráficos que muestran una
comparación de la glucosilación ininterrumpida e interrumpida de la
RNasa por la glucosa (7B) y por la ribosa (7A), detectadas por
ELISA.
La Figura 8 son dos gráficos que demuestran que
las cinéticas de fluorescencia de la pentosidina (unidades
arbitrarias) aumentan durante la glucosilación por la ribosa
ininterrumpida e interrumpida de la RNasa. Figura 8A: glucosilación
ininterrumpida en presencia de ribosa 0,05 M. Figura 8B:
glucosilación interrumpida después de 8 y 24 horas de
incubación.
La Figura 9 es un gráfico que muestra las
cinéticas del crecimiento reactivo intermedio.
La Figura 10 son gráficos de inhibición
post-Amadori de la formación de AGE por la ribosa.
Figura 10A: datos gráficos en los que las alícuotas se diluyeron en
inhibidor que contiene tampones en el tiempo 0. Figura 10B: datos
gráficos en los que las muestras se interrumpieron a las 24 h, y a
continuación se diluyeron en inhibidor que contiene tampones.
La Figura 11 es un gráfico que muestra la
dependencia de la velocidad inicial de formación de AGE antigénicos
sobre el pH, seguido de interrupción de la glucosilación.
La Figura 12 son dos gráficos que muestran el
efecto del salto de pH sobre la formación de AGE detectada por
ELISA después de interrumpir la glucosilación. Las muestras
interrumpidas, dejadas 12 días a 37ºC en tampón de pH 5,0
produjeron fundamentalmente AGE (33%; Figura 12B) cuando se cambió
el pH a 7,5, en comparación con la muestra normal de referencia no
expuesta a pH bajo (Figura 12A).
La Figura 13 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE durante la glucosilación ininterrumpida de la
ribonucleasa A (RNasa A) por la ribosa. Figura 13A: piridoxamina
(PM); Figura 13B: 5'-fosfato de piridoxal (PLP);
Figura 13C: piridoxal (PL); Figura 13D: piridoxina (PN).
La Figura 14 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{1} y de
la aminoguanidina (AG) sobre la formación de AGE durante la
glucosilación ininterrumpida de la ribonucleasa A (RNasa A) por la
ribosa. Figura 14A: pirofosfato de tiamina (TPP); Figura 14B:
monofosfato de tiamina (TP); Figura 14C: tiamina (T); Figura 14D:
aminoguanidina (AG).
La Figura 15 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE durante la glucosilación ininterrumpida de la
albúmina de suero bovino (BSA) por la ribosa. Figura 15A:
piridoxamina (PM); Figura 15B: 5'-fosfato de
piridoxal (PLP); Figura 15C: piridoxal (PL); Figura 15D: piridoxina
(PN).
La Figura 16 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{1} y de
la aminoguanidina (AG) sobre la formación de AGE durante la
glucosilación ininterrumpida de la albúmina de suero bovino (BSA)
por la ribosa. Figura 16A: pirofosfato de tiamina (TPP); Figura
16B: monofosfato de tiamina (TP); Figura 16C: tiamina (T); Figura
16D: aminoguanidina (AG).
La Figura 17 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE durante la glucosilación ininterrumpida de la
metahemoglobina humana (Hb) por la ribosa. Figura 17A: piridoxamina
(PM); Figura 17B: 5'-fosfato de piridoxal (PLP);
Figura 17C: piridoxal (PL); Figura 17D: piridoxina (PN).
La Figura 18 es una serie de gráficos que
representan el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} sobre
la formación de AGE post-Amadori después de la
glucosilación interrumpida por la ribosa. Figura 18A: BSA y
piridoxamina (PM); Figura 18B: BSA y
5'-fosfato de piridoxal (PLP); Figura 18C: BSA y
piridoxal (PL); Figura 18D: RNasa y piridoxamina (PM).
La Figura 19 son gráficos que representan el
efecto del pirofosfato de tiamina sobre la formación de AGE
post-Amadori después de la glucosilación
interrumpida por la ribosa. Figura 19A: RNasa, Figura 19B: BSA.
La Figura 20 son gráficos que representan el
efecto de la aminoguanidina sobre la formación de AGE
post-Amadori después de la glucosilación
interrumpida por la ribosa. Figura 20A: RNasa, Figura 20B: BSA.
La Figura 21 es un gráfico que representa el
efecto de
N-acetil-L-lisina
sobre la formación de AGE post-Amadori después de
la glucosilación interrumpida por la ribosa.
La Figura 22 son diagramas de barras que muestran
una comparación de la inhibición post-Amadori de la
formación de AGE por el pirofosfato de tiamina (TPP), piridoxamina
(PM) y aminoguanidina (AG) después de la glucosilación interrumpida
de la RNasa (Figura 22A) y BSA (Figura 22B) por la ribosa.
La Figura 23 es un diagrama de barras que muestra
los efectos del tratamiento in vivo con ribosa solo sobre la
presión sanguínea en el puño del ratón. El tratamiento fue con
ribosa (R) 0,05 M, 0,30 M y 1 M inyectada durante 1, 2 u 8 días
(D).
La Figura 24 es un diagrama de barras que muestra
los efectos del tratamiento in vivo con ribosa solo sobre la
eliminación de la creatinina de rata (eliminación por 100 g de peso
corporal). El tratamiento fue con ribosa (R)
\hbox{0,05
M}, 0,30 M y 1 M inyectada durante 1, 2 u 8 días (D).
La Figura 25 es un diagrama de barras que muestra
los efectos del tratamiento in vivo con ribosa solo sobre la
albuminuria (índice de derrame de albúmina) de rata. El tratamiento
fue con ribosa (R) 0,30 M y 1 M inyectada durante 1, 2 u 8 días
(D).
La Figura 26 es un diagrama de barras que muestra
los efectos del tratamiento in vivo, con o sin ribosa sobre
la presión sanguínea en el puño del ratón. Los grupos de
tratamiento fueron: 25 mg de aminoguanidina (AG)/kg de peso
corporal; 25 ó 250 mg de piridoxamina (P)/kg de peso corporal; 250
mg de pirofosfato de tiamina (T)/kg de peso corporal o con ribosa 1
M (R).
La Figura 27 es un diagrama de barras que muestra
los efectos del tratamiento in vivo, con o sin ribosa, solo
sobre la eliminación de la creatinina de rata (Eliminación por 100
g de peso corporal). Los grupos de tratamiento fueron:
\hbox{25 mg/kg} de peso corporal de aminoguanidina (AG);
25 ó 250 mg/kg de peso corporal de piridoxamina (P); 250 mg/kg de
peso corporal de pirofosfato de tiamina (T) o con ribosa 1 M
(R).
La Figura 28 es un diagrama de barras que muestra
los efectos del tratamiento in vivo con inhibidor sin ribosa
y con ribosa sola, sobre la albuminuria (índice de derrame de
albúmina) de rata. Los grupos de tratamiento fueron: 25 mg de
aminoguanidina (AG)/kg de peso corporal; 250 mg de pirofosfato de
tiamina (T)/kg de peso corporal o tratamiento con ribosa 1 M (R)
durante 8 días (D). El grupo de referencia no se trató.
La Figura 29 es un diagrama de barras que muestra
los efectos del tratamiento con inhibidor in vivo con ribosa
1 M sobre la albuminuria (índice de derrame de albúmina) de rata.
Los grupos de tratamiento fueron: 25 mg de aminoguanidina (AG)/kg
de peso corporal; 25 y 250 mg de piridoxamina (P)/kg de peso
corporal; y 250 mg de pirofosfato de tiamina (T)/kg de peso
corporal o tratamiento con ribosa 1 M (R) sola durante 8 días (D).
El grupo de referencia no se trató.
La Figura 30A representa el Esquema 1 mostrando
un diagrama de la formación de AGE a partir de proteínas. La Figura
30B representa el Esquema 2, estructura química de la
aminoguanidina. La Figura 30C representa el Esquema 3, estructuras
químicas de la tiamina, 5'-fosfato de tiamina y
pirofosfato de tiamina. La Figura 30D representa el Esquema 4,
estructuras químicas de piridoxina, piridoxamina,
5'-fosfato de piridoxal y piridoxal. La Figura 30E
representa el Esquema 5, representación cinética de la formación de
AGE. La Figura 30F representa el Esquema 6, representación cinética
de la formación de AGE y de la formación del producto
intermedio.
La Figura 31 muestra un espectro de resonancia
RMN con C-13 a 125 MHz del producto intermedio
Amadori de ribonucleasa preparado por reacción de 24 h con
[2-C13]ribosa al 99%.
La Figura 32 son gráficos que muestran la
formación intermedia de AGE utilizando las pentosas xilosa, lixosa,
arabinosa y ribosa.
La Figura 33 es un gráfico que muestra los
resultados de los glomérulos que se tiñen a pH 2,5 con azul de
Alcian.
La Figura 34 es un gráfico que muestra los
resultados de los glomérulos que se tiñen a pH 1,0 con azul de
Alcian.
La Figura 35 es un gráfico que muestra los
resultados de los glomérulos inmunofluorescentes que se tiñen con
RSA.
La Figura 36 es un gráfico que muestra los
resultados de los glomérulos inmunofluorescentes que se tiñen a pH
2,5 con la nucleoproteína del proteoglucano sulfato de Heparan.
La Figura 37 es un gráfico que muestra los
resultados de los glomérulos inmunofluorescentes que se tiñen con la
cadena lateral del proteoglucano sulfato de Heparan.
La Figura 38 es un gráfico que muestra los
resultados del análisis de las secciones de los glomérulos para el
volumen glomerular medio.
Figura 39. Efecto de AG y PM sobre el desarrollo
de la nefropatía en ratas diabéticas STZ. Se recogieron muestras de
orina (muestras cada 24 horas) y de sangre a intervalos de 4
semanas para medición de albuminuria (A) y creatinina (B) del
plasma. Los datos se expresan como media \pm SEM para los grupos
no diabéticos de referencia (\newmoon), no diabéticos de
referencia + PM (\blacksquare), diabéticos sin tratar
(\medcirc), diabéticos + PM (\Box) y diabéticos + AG
(\Delta). Se cuantificó la proteinuria (C) en una recogida de 24
horas al final del experimento (28 semanas de diabetes). Se
determinaron los resúmenes estadísticos mediante la prueba de la
suma del orden de Mann-Whitney: todos los grupos
diabéticos frente a las referencias no diabéticas en A, B y C, p
\leq 0,001. (A, albuminuria): D-PM frente a D, p
\leq 0,0001; D-AG frente a D, p = 0,05;
D-PM frente a D-AG, p < 0,01. (B,
creatininemia): D-PM frente a D, p < 0,0001;
D-AG frente a D,
\hbox{p < 0,05};
D-PM frente a D-AG, p = 0,02. (C,
proteinuria): D-PM frente a D, p < 0,001;
D-AG frente a D, p < 0,01;
\hbox{D-PM} frente a
D-AG, NS.
Figura 40. Efecto de AG y PM sobre la
dislipidemia en ratas diabéticas STZ. Se analizó el triglicérido
(A), el colesterol (B), los ácidos grasos libres (C) y el glicerol
(D) en el plasma obtenido al final del experimento (28 semanas). Los
datos son la media \pm SD para el grupo no diabético de
referencia (\newmoon),no diabético de referencia + PM
(\blacksquare), grupo diabético sin tratar (\medcirc), grupo
diabético + PM (\Box) y grupo diabético + AG (\Delta). Se
realizaron análisis estadísticos mediante la prueba de la suma del
orden de Mann-Whitney: todos los grupos diabéticos
frente a las referencias no diabéticas en A, B , C y D, p \leq
0,001. (A): D-PM frente a D, p = 0,0001;
D-AG frente a D, p < 0,05; D-PM
frente a D-AG, p < 0,01. (B):
D-PM frente a D: D-AG frente a D,
NS; D-PM frente a D-AG, p < 0,01.
(C): D-PM frente a D, p = 0,002;
D-AG frente a D, p < 0,001; D-PM
frente a D-AG, NS. (D): D frente a C, p <
0,0001; D-PM frente a D,
\hbox{p <
0,0001}; D-AG frente a D, p < 0,0001;
D-PM frente a D-AG, NS.
Figura 41. Efecto de AG y PM sobre los
desequilibrios de oxidorreducción en ratas diabéticas STZ. Se
analizaron las concentraciones de lactato (A) y piruvato (B)
obtenidas en el plasma al final del experimento (28 semanas). Su
relación de lactato/piruvato, como índice del estado de
oxidorreducción, se muestra en el cuadro (C). Los símbolos están
definidos en la leyenda de la Fig. 2. Se realizaron análisis
estadísticos mediante la prueba de la suma del orden de
Mann-Whitney. (C, lactato/piruvato): D frente a C, p
< 0,0001; D-PM frente a D, p < 0,001;
D-AG frente a D,
\hbox{p = 0,002};
D-PM frente a D- AG, p < 0,01.
Figura 42. Correlaciones entre los AGE en el
colágeno de la piel y los parámetros bioquímicos y fisiológicos. Su
muestran las correlaciones entre CML y los triglicéridos del plasma
(A), la albúmina de la orina y las concentraciones de triglicérido
en el plasma (B) y CML y la concentración de albúmina en la orina
(C). Se realizaron análisis estadísticos mediante cálculos del
momento del producto de Pearson. Los símbolos están definidos en la
leyenda de la Fig. 2. En la Tabla 3 se resumen los coeficientes de
correlación y los valores p.
Se han utilizado ratas de Lewis con diabetes
provocada con aloxano como modelo de envejecimiento de proteínas
para demostrar la eficacia in vivo de los inhibidores de la
formación de AGE. La correlación que se demostró está entre la
inhibición de la patología relacionada con la diabetes última y la
inhibición eficaz de la formación de AGE (Brownlee, Cerami y
Vlassara, 1988, New Eng. J. Med.
318(20):1315-1321). Se ha utilizado
además la provocación de la diabetes con estreptozotocina en ratas
de Lewis, conejos blancos de Nueva Zelanda con diabetes provocada y
ratas BB de Worcester genéticamente diabéticas, como se describe
en, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.334.617. El principal
problema con estos sistemas de modelo es el dilatado periodo de
tiempo necesario para demostrar la lesión relacionada con AGE y por
lo tanto los compuestos de la prueba para la inhibición de AGE. Por
ejemplo, se necesitaron 16 semanas de tratamiento para los estudios
con ratas descritos en la patente U.S. nº 5.334.617 y 12 semanas
para los estudios con conejos. Por ello sería muy deseable y útil
disponer de un sistema de modelo para la patología diabética
relacionada con AGE que se manifieste en un periodo de tiempo más
corto, permitiendo una determinación más eficiente y rápida de la
lesión relacionada con AGE y de la efectividad de los inhibidores de
la formación de AGE post-Amadori.
Una herramienta importante para estudiar la
formación de AGE es la utilización de anticuerpos policlonales y
monoclonales que son específicos para los AGE producidos mediante
la reacción de varios azúcares con una variedad de proteínas
objetivo. Se detecta la especificidad resultante para AGE en los
anticuerpos que es independiente de la naturaleza del componente
proteico del AGE (Nakayama et al., 1989, Biochem.
Biophys. Res. Comm. 162: 740-745;
Nakayama et al., 1991, J. Immunol. Methods
140: 119-125; Horiuchi et al., 1991,
J. Biol. Chem. 266: 7329-7332; Araki
et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:
10211-10214; Makita et al., 1992, J. Biol.
Chem. 267: 5133-5138). Dichos
anticuerpos se han utilizado para controlar la formación de AGE
in vivo e in vitro.
El primer compuesto del complejo vitamínico B que
se identificó, la tiamina está prácticamente exento de acciones
farmacodinámicas cuando se administra a las dosis terapéuticas
habituales; e incluso a dosis mayores no se conoce que presente
ningún efecto. El pirofosfato de tiamina es la forma
fisiológicamente activa de la tiamina y funciona como coenzima
principalmente en el metabolismo de los carbohidratos en la
descarboxilación de los \alpha-cetoácidos. Los
comprimidos de hidroclururo de tiamina están disponibles en
cantidades que oscilan entre 5 y 500 mg cada uno. Las soluciones en
inyección de hidroclururo de tiamina están disponibles, las cuales
contienen entre 100 y 200 mg/ml.
Para el tratamiento de la deficiencia de tiamina,
se utilizan generalmente dosis intravenosas tan altas como
\hbox{100 mg/l} de fluido parenteral, estando
comprendida la dosis típica administrada entre 50 y 100 mg. La
absorción GI de la tiamina se cree que está limitada entre 8 y 15
mg por día, pero se puede superar por administración oral en dosis
divididas con alimentos.
La administración repetida de la glucosa puede
precipitar la deficiencia de tiamina en pacientes insuficientemente
alimentados y esto se ha notado durante la corrección de la
hiperglucemia.
Sorprendentemente, en la presente invención se ha
descubierto, como se muestra mediante la prueba in vitro, que
la administración de pirofosfato de tiamina en concentraciones por
encima de las que se encuentra normalmente en el cuerpo humano o
administrado durante la terapia alimenticia, es un inhibidor eficaz
de la formación post-Amadori de AGE antigénico y
que esta inhibición es más completa que la posible por
administración de aminiguanidina.
La vitamina B_{6} está típicamente disponible
en forma de hidroclururo de piridoxina en las preparaciones
comerciales disponibles procedentes de muchos suministradores. Por
ejemplo, los comprimidos farmacéuticos Beelith de Beach contienen
25 mg de hidroclururo de piridoxina que es equivalente a 20 mg de
B_{6}, otras preparaciones comprenden Marlyn Heath Care Marlyn
Formula 50 que contiene 1 mg de piridoxina HCl y Marlyn Formula 50
Mega Forte que contiene 6 mg de piridoxina HCl, comprimidos
Wyeth-Ayerst Stuart Prenatal® que contienen 2,6 mg
de piridoxina HCl, los comprimidos J&J-Merck
Corp. Stuart Formula® contienen 2 mg de piridoxina HCl y las
multivitaminas masticables para niños de CIBA Consumer Sunkist que
contienen 1,05 mg de piridoxina HCl, el 150% de los U.S. RDA para
niños de 2 a 4 años de edad y el 53% de los U.S. RDA para niños
mayores de 4 años de edad y adultos. (Physician's Desk Reference for
nonprescription drugs, 14ª edición (Medical Economics Data
Production Co., Montvale, N.J., 1993).
Existen tres formas relacionadas de piridoxina,
que se diferencian en la naturaleza de la sustitución en el átomo
de carbono en posición 4 de los núcleos de piridina: piridoxina es
un alcohol primario, piridoxal es el correspondiente aldehído y
piridoxamina contiene un grupo aminometil en esa posición. Cada una
de estas formas puede ser utilizada por los mamíferos después de la
transformación por el hígado en 5'-fosfato de
piridoxal, forma activa de la vitamina. Se cree desde hace tiempo
que estas tres formas son equivalentes en sus propiedades
biológicas y han sido tratadas por la técnica como formas
equivalentes de vitamina B_{6}. El Council on Pharmacy and
Chemistry ha asignado la denominación de piridoxina para la
vitamina.
El antimetabolito más activo para la piridoxina
es la 4-desoxipiridoxina, para la cual se ha
atribuido actividad antimetabolito para la formación in
vivo del 5-fosfato de
4-desoxipiridoxina, inhibidor competitivo de varios
enzimas dependientes del fosfato de piridoxal. Las acciones
farmacológicas de la piridoxina están limitadas, ya que producen
acciones farmacodinámicas no destacadas tras la administración oral
o intravenosa y presentan baja toxicidad instantánea, siendo
solubles en agua. Se ha sugerido que se puede desarrollar
neurotoxicidad después de la ingestión prolongada de una cantidad
tan pequeña como 200 mg de piridoxina al día. Fisiológicamente, el
fosfato de piridoxina está implicado como coenzima en diversas
transformaciones metabólicas de aminoácidos incluyendo la
descarboxilación, transaminación y racemización, así como en las
etapas enzimáticas en el metabolismo de los aminoácidos que
contienen azufre y de los hidroxiaminoácidos. En el caso de la
trasaminación, el aminoácido donante amina el fosfato de piridoxal
a fosfato de piridoxamina y el aceptor
\alpha-cetoácido desamina a continuación a fosfato
de piridoxal el fosfato de piridoxamina unido. De este modo, el
complejo vitamínico B es conocido por ser un complemento
alimenticio necesario implicado en la degradación específica de los
aminoácidos. Para un examen general del complejo vitamínico B véase
The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8ª edición,
Gilman, Rall, Nies y Taylor (Pergamon Press, Nueva York, 1990, págs.
1293-4; págs. 1523-1540).
Sorprendentemente, en la presente invención se ha
descubierto que las dosis eficaces de la forma de piridoxal amina
metabólicamente transitoria de la vitamina B_{6} (piridoxamina),
en concentraciones superiores a las que normalmente se encuentran
en el cuerpo humano, son un inhibidor eficaz de la formación
post-Amadori de AGE antigénico y que esta inhibición
puede ser más completa que la posible mediante administración de
aminoguanidina.
El estudio típico de la reacción de una proteína
con la glucosa para formar AGE se ha realizado por ELISA utilizando
anticuerpos dirigidos hacia AGE antigénicos y la detección de la
producción de un AGE fluorescente estable en ácido, pentosidina,
mediante HPLC seguido de hidrólisis ácida. Se comparó la
glucosilación de las proteínas objetivo (a saber, BSA ó RNasa A) con
glucosa y ribosa controlando la reactividad por ELISA de la
anti-glucosa-AGE-RNasa
policlonal de conejo y de los anticuerpos
anti-glucosa-AGE-BSA.
El antígeno se generó haciendo reaccionar glucosa 1 M con RNasa
durante 60 días y BSA durante 90 días. Se identificaron los
anticuerpos (R618 y R479) y mostraron reactividad solamente con AGE
y no con la proteína, excepto para el vehículo BSA inmunógeno.
Algunas vitaminas B_{6}, especialmente el
fosfato de piridoxal (PLP), han sido propuestas anteriormente para
actuar como ``inhibidores competitivos'' de glucosilación
preliminar, ya que como aldehídos ellos mismos pueden formar
aductos de bases de Schiff con los grupos amino de las proteínas
(Khatami et al., 1988, Life Sciences
43:1725-1731) y de este modo limitan la
cantidad de aminas disponible para la unión de la glucosa. No
obstante, la eficacia para limitar la unión inicial al azúcar no es
un factor predisponente de inhibición de la conversión de algunos
productos de Amadori formados para los AGE. La presente invención
describe inhibidores de reacciones de glucosilación ``última''
indicados por sus efectos sobre la formación in vitro de los
AGE antigénicos (Booth et al., 1996, Biochem. Biophys.
Res. Com. 220:113-119).
La ribonucleasa A pancreática bovina (RNasa) fue
cromatograficamente pura, de calidad exenta de agregados, de
Worthington Biochemicals. La albúmina de suero bovino (BSA;
fracción V, exenta de ácidos grasos), metahemoglobina humana (Hb),
D-glucosa, piridoxina, piridoxal,
5'-fosfato de piridoxal, piridoxamina, tiamina,
monofosfato de tiamina, pirofosfato de tiamina e IgG
anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina de
cabra procedían todos de Sigma Chemicals. El hidrocloruro de
aminoguanidina se adquirió en Aldrich Chemicals.
Se incubaron albúmina de suero bovino,
ribonucleasa A y hemoglobina A con glucosa a 37ºC en tampón de
fosfato sódico 0,4 M de pH 7,5, conteniendo azida de sodio al
0,02%. La proteína, glucosa (1,0 M) y los inhibidores preventivos
(0,5, 3, 15 y 50 mM) se introdujeron simultáneamente en la mezcla
de incubación. Se mantuvieron las soluciones en la oscuridad en
tubos tapados. Se tomaron alícuotas y se congelaron inmediatamente
hasta que se analizaron por ELISA al final de la reacción. Las
incubaciones fueron durante 3 semanas (Hb) ó 6 semanas (RNasa,
BSA).
La preparación inmunógena siguió a los protocolos
preliminares (Nakayama et al., 1989, Biochem. Biophys.
Res. Comm. 162:740-745; Horiuchi et
al., 1991, J. Biol. Chem. 266:
7329-7332; Makita et al., 1992, J. Biol.
Chem. 267: 5133-5138). En resumen, se
preparó inmunógeno por glucosilación de BSA (anticuerpos R479) ó
RNasa (anticuerpos R618) en 1,6 g de proteína en 15 ml durante 60 a
90 días utilizando glucosa 1,5 M en tampón de fosfato de sodio
\hbox{0,4 M} de pH 7,5 conteniendo azida sódica al
0,05% a pH 7,4 y 37ºC. Se inmunizaron conejos machos blancos de
Nueva Zelanda, de 8 a 12 semanas por administración subcutánea de 1
ml de una solución que contenía 1 mg/ml de proteína glucosilada en
adyuvante de Freund. La inyección primaria utilizó el adyuvante
completo y se administraron tres dosis de refuerzo a intervalos de
tres semanas con adyuvante incompleto de Freund. Tres semanas
después del último refuerzo se extrajo sangre a los conejos. Se
recogió el suero por centrifugación de la sangre completa coagulada.
Los anticuerpos son específicos para AGE, no reaccionando con las
proteínas naturales (excepto para el vehículo) o con los productos
intermedios de Amadori. Los anticuerpos policlonales
anti-AGE han demostrado ser una herramienta
analítica sensible y valiosa para el estudio de la formación
``última'' de AGE in vitro e in vivo. La naturaleza
del epítopo del AGE antigénico dominante o hapteno permanece
dudosa, aunque hace poco se ha propuesto que la carboximetil lisina
(CML) producto de glucoxidación de la proteína puede ser un
antígeno dominante de algunos anticuerpos (Reddy et al.,
1995, Biochem. 34:10872-10878). Los
estudios iniciales han fracasado para dar a conocer la reactividad
por ELISA con el modelo de los compuestos CmL (Makita et al.,
1992, J. Biol. Chem. 267:
5133-5138).
Se utilizó el procedimiento general de Engvall
(1981, Methods Enzymol. 70:419-439)
para realizar el ELISA. Típicamente, se diluyeron muestras de
proteína glucosilada hasta aproximadamente 1,5 \mug/ml en tampón
de carbonato de sodio 0,1 M de pH 9,5 a 9,7. Se recubrió con la
proteína toda la noche a temperatura ambiente sobre las placas de
poliestireno de 96 pocillos pipeteando 200 \mul de la solución de
proteína en cada pocillo (0,3 \mug/pocillo). Después de
recubrirlos, se lavó la proteína procedente de los pocillos con una
solución salina que contenía Tween-20 al 0,05%. Los
pocillos se bloquearon a continuación con 200 \mul de caseína al
1% en tampón de carbonato durante 2 h a 37ºC seguido de lavado. Los
anticuerpos anti-AGE de conejo se diluyeron hasta un
valor de aproximadamente 1:350 en tampón de incubación y se
incubaron durante 1 h a 37ºC, seguido de lavado. Para minimizar las
lecturas de fondo, los anticuerpos R479 utilizados para detectar
RNasa glucosilada se reunieron contra BSA glucosilada y los
anticuerpos R618 utilizados para detectar BSA glucosilada y Hb
glucosilada se reunieron contra la RNasa glucosilada. A
continuación se añadió un anticuerpo conjugado con fosfatasa
alcalina a la IgG de conejo como anticuerpo secundario con un valor
de 1:2000 ó 1:2500 (dependiendo del lote) y se incubaron durante 1
h a 37ºC seguido de lavado. A continuación se añadió la solución
del sustrato p-itrofenilfosfato (200
\mul/pocillo) a las placas, siendo controlada la absorbancia del
p-nitrofenolato liberado a 410 nm con un lector de
microplacas Dynatech MR 4000.
Se incluyeron como rutina las referencias que
contenían proteína sin modificar y se sustrajeron sus lecturas,
siendo despreciables generalmente las correcciones. La validez de
la utilización del procedimiento ELISA para estudiar
cuantitativamente la cinética de la formación de AGE depende de la
linealidad del análisis (Kemeny & Challacombe, 1988, ELISA
and Other Solid Phase Immunoassays, John Wiley & Sons,
Chichester, G.B.). Se realizaron experimentos de control, por
ejemplo demostrando que el intervalo lineal para RNasa está por
debajo de una concentración de recubrimiento de aproximadamente 0,2
a 0,3 mg/pocillo.
Las Figuras 1 A-D son gráficos
que muestran el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} en
la formación post-Amadori de AGE en albúmina de
suero bovino glucosilada con glucosa. Se incubó BSA (10 mg/ml) con
glucosa
\hbox{1,0 M}, en presencia y ausencia de varios
derivados indicados, en tampón de fosfato de sodio 0,4 M de pH 7,5
a 37ºC durante 6 semanas. Se analizaron alícuotas por ELISA
utilizando anticuerpos R618 anti-AGE. Las
concentraciones de los inhibidores fueron 3, 15 y 50 mM.
Inhibidores utilizados en las Figuras (1A): piridoxamina (PM); (1B):
fosfato de pirodoxal (PLP); (1C): piridoxal (PL); (1D): piridoxina
(PN).
La Figura 1 (curvas de referencia) demuestra que
la reacción de BSA con glucosa 1,0 M es lenta e incompleta después
de 40 días, incluso a la alta concentración de azúcar utilizada
para acelerar la reacción. La inclusión simultánea de diferentes
concentraciones de varias vitaminas B_{6} afecta notablemente la
formación de AGE antigénicos. (Figuras 1A-D):
piridoxamina y fosfato de piridoxal suprimieron fuertemente la
formación de AGE antigénico incluso a las concentraciones más bajas
probadas, mientras que piridoxal fue eficaz por encima de 15 mM. La
piridoxina fue ligeramente eficaz a las concentraciones más altas
probadas.
Las Figuras 2A-D son gráficos que
muestran el efecto de los derivados de la vitamina B_{1} y la
aminoguanina (AG) en la formación de AGE en albúmina de suero
bovino. Se incubó BSA (10 mg/ml) con glucosa 1,0 M, en presencia o
ausencia de varios derivados indicados, en tampón de fosfato de
sodio 0,4 M de pH 7,5 a 37ºC durante 6 semanas. Se analizaron
alícuotas por ELISA utilizando anticuerpos R618
anti-AGE. Las concentraciones de los inhibidores
fueron 3, 15 y 50 mM. Inhibidores utilizados en las Figuras (2A):
pirofosfato de tiamina (TPP); (2B): monofosfato de tiamina (TP);
(2C): tiamina (T); (2D): aminoguanidina (AG).
De las varias vitaminas B_{1} probadas de forma
similar (Figuras 2A-D), el pirofosfato de tiamina
fue eficaz a todas las concentraciones probadas (Figura 2C),
mientras que la tiamina y el monofosfato de tiamina no fueron
inhibidores. Es destacable de forma más significativa indicar la
disminución en las concentraciones finales de los AGE formados,
observados con pirofosfato de tiamina, fosfato de piridoxal y
piridoxamina. La aminoguanidina (Figura 2D) produjo alguna
inhibición de la formación de AGE en BSA, pero menos que en los
anteriores compuestos. Se realizaron estudios similares con
metahemoglobina humana y ribonucleasa A bovina.
Las Figuras 3A-D son gráficos que
muestran el efecto de los derivados de la vitamina B_{6} en la
formación de AGE en metahemoglobina humana. Se incubó Hb (1 mg/ml)
con glucosa 1,0 M, en presencia y ausencia de varios derivados
indicados, en tampón de fosfato de sodio 0,4 M de pH 7,5 a 37ºC
durante 3 semanas. Se analizaron alícuotas por ELISA utilizando
anticuerpos R618 anti-AGE. Las concentraciones de
los inhibidores fueron 0,5, 3, 15 y 50 mM. Inhibidores utilizados
en las Figuras (3A): piridoxamina (PM); (3B): fosfato de pirodoxal
(PLP); (3C): piridoxal (PL); (3D): piridoxina (PN).
Se ha expuesto anteriormente que la Hb de un
paciente diabético contiene un componente que se une a los
anticuerpos anti-AGE y se propuso que esta Hb
glucosilada (denominada Hb-AGE, no se debe confundir
con Hb_{Alc}) podría se útil para medir la exposición a la
glucosa a largo plazo. La incubación in vitro de Hb con
glucosa produce AGE antigénico a una velocidad aparentemente más
rápida que la observada con BSA. No obstante, las diferentes
vitaminas B_{6} (Figura 3A-D) y B_{1} (Figura
4A-C) presentaron las mismas tendencias para la
inhibición en Hb, con piridoxamina y pirofosfato de tiamina, siendo
los inhibidores más efectivos en cada una de sus respectivas
familias. Significativamente, en Hb, la aminoguanidina solamente
inhibió la velocidad de formación de AGE y no las concentraciones
finales formadas de AGE (Figura 4D).
La velocidad de formación de AGE antigénico con
RNasa por la glucosa fue intermedia entre la de Hb y la de BSA,
pero se mantuvo el alcance de la inhibición dentro de cada serie de
vitaminas. De nuevo la piridoxamina y el pirofosfato de tiamina
fueron más eficaces que la aminoguanidina (Figura 5).
Las Figuras 4A-D son gráficos que
muestran el efecto de los derivados de la vitamina B_{1} y de la
aminoguanina (AG) sobre la formación de AGE en la metahemaglobina
humana. Se incubó Hb (1 mg/ml) con glucosa 1,0 M, en presencia y
ausencia de varios derivados indicados, en tampón de fosfato de
sodio 0,4 M de pH 7,5 a 37ºC durante 3 semanas. Se analizaron
alícuotas por ELISA utilizando anticuerpos R618
anti-AGE. Las concentraciones de los inhibidores
fueron 0,5, 3, 15 y 50 mM. Inhibidores utilizados en las Figuras
(4A): pirofosfato de tiamina (TPP); (4B): monofosfato de tiamina
(TP); (4C): tiamina (T); (4D): aminoguanidina (AG).
La Figura 5 es un diagrama de barras que muestra
una comparación de la inhibición de la glucosilación de la
ribonucleasa A por el pirofosfato de tiamina (TPP), piridoxamina
(PM) y aminoguanidina (AG). Se incubó Rnasa (
\hbox{1
mg/ml}) con glucosa 1,0 M (glc) en presencia y ausencia de
varios derivados indicados, en tampón de fosfato de sodio 0,4 M de
pH 7,5 a 37ºC durante 6 semanas. Se analizaron alícuotas por ELISA
utilizando anticuerpos R479 anti-AGE. El porcentaje
de inhibición se informatizó a partir de las lecturas del ELISA en
ausencia y presencia de los inhibidores en el punto de tiempo de la
semana 6. Las concentraciones de inhibidores fueron 0,5, 3, 15 y 50
mM.
Estos resultados demuestran que determinados
derivados de las vitaminas B_{1} y B_{6} son capaces de inhibir
la formación ``última'' de AGE. Algunas de estas vitaminas
inhibieron con éxito las concentraciones finales de AGE producidas,
a diferencia de la aminoguanidina, lo que sugiere que presentan
interacciones mayores con los precursores de Amadori o
post-Amadori para los AGE antigénicos. Los
productos intermedios de Amadori y post-Amadori
representan una coyuntura crucial en la que la vía ``clásica'' de
glucosilación no enzimática comienza a hacerse esencialmente
irreversible (Figura 30A). En los estudios de inhibición
preliminares las ``glucosilación'' se determinó generalmente como
base de Schiff formada (después de la reducción con cianoborohidruro
marcado) o como producto de Amadori formado (después de la
precipitación ácida utilizando azúcar marcado). Dichos análisis no
proporcionan información sobre la inhibición de las etapas de
conversión post-Amadori para los productos de AGE
``últimos'', ya que tales etapas no conducen a ningún cambio en la
cantidad de azúcar marcado que se une a las proteínas. Otros
análisis de ``glucosilación'' han contado con el aumento provocado
por el azúcar de la fluorescencia no específica de la proteína, pero
esto puede también ser provocado por los fragmentos oxidativos del
dicarbinilo del azúcar libre, tales como glucoaldehído o glioxal
(Hunt et al., 1988, Biochem.
256:205-212), independientemente de la
formación del producto de Amadori.
En el caso del piridoxal (PL) y del fosfato de
piridoxal (PLP), los datos apoyan el mecanismo sencillo de
inhibición que implica la condensación competitiva de la base de
Schiff de estos aldehídos con los grupos amino de la proteína en las
zonas de glucosilación. Debido a la formación interna del
hemiacetal en el piridoxal, pero no en el fosfato de piridoxal, se
espera la inhibición más fuerte de la formación de AGE
post-Amadori por PLP mediante este mecanismo
competitivo. Esto realmente se observa en los datos (Figura 1B, 1C,
Figura 3B, 3C). La inhibición por piridoxamina es necesariamente
diferente, ya que la piridoxamina carece de grupo aldehído. Sin
embargo, la piridoxamina es una amina experimental potencialmente
capaz de formar un enlace de base de Schiff con los carbonilos de
los azúcares de cadena abierta, con fragmentos dicarbonilo, con los
productos Amadori, o con los productos intermedios
post-Amadori. El mecanismo de la inhibición de los
compuestos B_{1} no es obvio. Todas las formas contienen un grupo
funcional amino, de modo que la eficacia señalada de solamente la
forma pirofosfato sugiere un requisito importante para una fuerte
carga negativa.
Una observación inesperada importante es que el
alcance de la inhibición por la aminoguanidina, y algunos de los
demás compuestos, es considerablemente menor en las últimas etapas
de la reacción, que durante la fase inicial preliminar. Esto
sugiere un mecanismo de acción diferente que el de la piridoxamina y
el del pirofosfato de tiamina, sugiriendo que el potencial
terapéutico de estos compuestos aumentará por la administración
conjunta con aminoguanidina.
Aunque se utilizan altas concentraciones de
glucosa para producir la glucosilación no enzimática de las
proteínas, paradójicamente, se observó que la ribosa en grandes
concentraciones es inhibidora para la formación de AGE
post-Amadori en la ribonucleasa actuando sobre las
``últimas'' etapas post-Amadori de la reacción de
glucosilación. Este efecto inhibidor inesperado sugiere que los
reactivos intermedios ``preliminares'', supuestamente productos de
Amadori, se pueden acumular con poca formación de productos AGE
post-Amadori ``últimos'' (AGE; productos de
Maillard). La investigación en este fenómeno ha demostrado (1)
capacidad para definir las condiciones de aislamiento cinético de
el/los producto(s) intermedio(s) glucosilado(s)
de Amadori (o post-Amadori); (2) capacidad para
estudiar la cinética rápida de construcción de dicho producto
intermedio; (3) capacidad para estudiar la cinética
sorprendentemente rápida de la transformación de dichos productos
intermedios en productos de AGE en ausencia de azúcar unido libre
o reversiblemente; (4) capacidad para utilizar estos productos
intermedios para estudiar y caracterizar la inhibición de las
etapas post-Amadori de formación de AGE,
proporcionando de este modo un nuevo sistema para investigar el
mecanismo de la reacción y la eficacia de los agentes potenciales
que podrían bloquear la formación de AGE; y (5) con este
conocimiento es también posible además utilizar RMN con ^{13}C
para estudiar los productos intermedios reactivos y controlar su
transformación en varios AGE experimentales (Khalifah et
al., 1996, Biochemistry
35(15):4645-4654).
Se realizaron análisis de aminoácidos en
Biotechnology Support Facility del Centro Médico de la Universidad
de Kansas. Se realizaron análisis después de la hidrólisis de la
proteína glucosilada (reducida con cianoborohidruro de sodio) con
HCl 6 N a 110ºC durante 18 a 24 h. Se utilizó isotiocianato de
fenilo para la derivación y los derivados de PTH se analizaron por
HPLC en fase inversa en un analizador de aminoácidos de Applied
Biosystems (derivador 420A, sistema de separación 130A, sistema de
análisis de datos 920A).
Se analizó cuantitativamente la producción de
pentosidina en RNasa por HPLC (Sell & Monnier, 1989, J.
Biol. Chem. 264:21597-21602; Odetti et
al., 1992, Diabetes 41:153-159).
Las muestras de proteína modificada con ribosa se hidrolizaron en
HCl 6 N durante 18 h a 100ºC y a continuación se secó en un Speed
Vac. A continuación se redisolvieron las muestras, y se tomaron
alícuotas en ácido trifluoracético al 0,1% y se analizaron por HPLC
en un sistema Shimadzu utilizando una columna Vydac
C-18 equilibrada con TFA al 0,1%. Se pasó un
gradiente de acetonitrilo del 0 al 6% (0,1% en TFA) en 30 min a un
caudal de aproximadamente 1 ml/min. La pentosidina se detectó
mediante fluorescencia de excitación de 335 nm/emisión de 385 nm, y
su tiempo de elución se determinó pasando un patrón sintetizado.
Debido a las concentraciones sumamente pequeñas de pentosidina
esperadas (Grandhee & Monnier, 1991, J. Biol. Chem.
266:11649-11653; Dyer et al.,
1991, J. Biol. Chem. 266:11654-11660),
no se ha realizado ningún intento para cuantificar las
concentraciones absolutas. Solamente se determinaron las
concentraciones relativas a partir de las áreas de los picos.
La modificación con ribosa o glucosa se realizó
generalmente a 37ºC en tampón de fosfato 0,4 M de pH 7,5,
conteniendo azida de sodio al 0,02%. Se utilizó siempre alta
concentración del tampón con modificaciones de ribosa 0,5 M. Las
soluciones se mantuvieron en tubos tapados y se abrieron solamente
para retirar alícuotas medidas que se congelaron inmediatamente
para realizar más tarde varios análisis. Los experimentos de
``glucosilación interrumpida'' se realizaron por primera vez
incubando la proteína con la ribosa a 37ºC durante 8 ó 24 h, seguida
de diálisis general contra los cambios frecuentes de tampón frío a
4ºC. A continuación se volvieron a incubar las muestras por
calentamiento rápido a 37ºC en ausencia de ribosa externa. Se
tomaron alícuotas y se congelaron en varios intervalos para
análisis posterior. Debido al bajo peso molecular de la RNasa, se
volvieron a medir las concentraciones de proteína después de la
diálisis aún cuando se utilizó entubado para diálisis con corte por
bajo peso molecular. Se ideó también un procedimiento alternativo
(véase a continuación) en el que se consiguió la interrupción por
simple dilución de 100 veces a partir de las mezclas de reacción
que contenían ribosa 0,5 M. Se estimaron las concentraciones de
proteína a partir de los espectros UV. La diferencia en la extinción
molar entre el pico (278 nm) y el valle (250 nm) se utilizó para
las determinaciones de la concentración de RNasa para compensar el
aumento general de absorbancia UV que acompaña a la glucosilación.
Se realizaron estudios espectrales de diferencia de UV
dependientes del tiempo para caracterizar las contribuciones del
espectro UV en la glucosilación.
Se establecieron de forma rutinaria los datos
cinéticos para las funciones monoexponencial o biexponencial
utilizando procedimientos no lineales de mínimos cuadrados. Se han
examinado los mecanismos cinéticos de los Esquemas 5 a 6 (Figura
30F) mediante simulacioes numéricas de las ecuaciones diferenciales
de la reacción. Tanto las simulaciones como el ajuste para los
datos cinéticos observados se realizó con el paquete de software
SCIENTIST 2.0 (Micromath, Inc.). La determinación de los tiempos
medios aparentes (Figura 6B) a partir de los datos cinéticos
establecida para dos funciones exponenciales (Figura 6A) se realizó
con la función de ``resolución'' del software MathCAD 4.0 (MathSoft,
Inc.).
La reacción de la Rnasa A con ribosa y glucosa se
ha seguido principalmente con los análisis ELISA, utilizando
anticuerpos R479 específicos para AGE de conejo desarrollados
contra BSA modificado con glucosa. En una extensión menor, la
producción de pentosidina, el único AGE fluorescente estable en
ácido conocido, se analizó cuantitativamente por HPLC seguida de
hidrólisis ácida. Estudios preliminares utilizando ribosa 0,05 M a
37ºC mostraron que la velocidad de formación de AGE antigénico
parece aumentar modestamente (aproximadamente 2 a 3 veces la medida
por el tiempo medio aparente) a medida que el pH aumenta de 5,0 a
7,5, con un periodo aparente de inducción pequeño al principio de la
cinética en todos los casos. La glucosilación de RNasa con ribosa
0,05 M a pH 7,5 (tiempo medio cerca de 6,5 días) parece ser casi un
orden de magnitud más rápido que el de la glucosilación con glucosa
\hbox{1,0 M} (tiempo medio mayor de 30 días; véase
Figura 7B, línea llena). La cinética última presenta además un
pequeño periodo de inducción pero que se nivela de forma incompleta
aún después de 60 días, haciendo difícil de estimar un tiempo medio
verdadero.
Cuando se examinó la dependencia de la cinética
sobre la concentración de ribosa a pH 7,5, se obtuvo un resultado
más inesperado. La velocidad de reacción aumentó al principio con
aumento de la concentración de ribosa, pero a concentraciones
superiores a 0,15 M la velocidad de reacción se niveló y a
continuación disminuyó significativamente (Figura 6A). Un gráfico de
la dependencia del tiempo medio recíproco sobre la concentración de
ribosa (Figura 6B) muestra que estas altas concentraciones de ribosa
son paradójicamente inhibidoras para la formación
post-Amadori de AGE antigénico. Este raro pero
consistente efecto se observó que era independiente de los cambios
en la concentración del tampón (2 veces) o de la RNasa (10 veces) y
no se cambió mediante purificación por afinidad del anticuerpo R479
en una columna de RNasa con AGE inmovilizado. Esto tampoco se debe
a los efectos de la ribosa en el propio análisis ELISA. El efecto
inhibidor medido mediante ribosa en la formación de AGE
post-Amadori no se debe probablemente a la
interferencia de la ribosa con reconocimiento por el anticuerpo de
las zonas antigénicas de Age en la proteína en el análisis ELISA.
Antes del primer contacto con el anticuerpo primario
anti-AG en las placas de ELISA, la proteína
glucosilada se ha diluido más de 1000 veces, se ha lavado
extensamente con Tween-20 después de la adsorción y
se ha bloqueado con un recubrimiento de caseína al 1% seguido de un
lavado adicional con Tween-20.
En vista del pequeño periodo de inducción
observado, se intentó determinar si existía alguna acumulación
durante la reacción del precursor primario, tal como un producto
intermedio de Amadori, capaz de producir los AGE antigénicos
post-Amadori detectables por ELISA. Se glucosiló
RNasa a pH 7,5 y 37ºC con una alta concentración de ribosa de 0,5 M
y se interrumpió la reacción después de 24 h mediante enfriamiento
brusco a 4ºC y diálisis contra diversos cambios de tampón frío
durante un periodo de 24 h para eliminar la ribosa libre y unida
reversiblemente (base de Schiff). Dicha muestra exenta de ribosa se
calentó a continuación rápidamente a 37ºC sin añadir ribosa y se
tomó una muestra para la formación de AGE
post-Amadori durante varios días. La producción de
antígeno AGE de esta muestra de ``glucosilación interrumpida'' de 24
h se muestra en líneas de trazos y triángulos blancos en la Figura
7A, el tiempo transcurrido en la diálisis fría no está incluido. Se
muestra también para comparación una referencia ininterrumpida
(línea llena y círculos negros). Las diferentes cinéticas de
formación de AGE antigénico post-Amadori son
evidentes de forma drástica en las dos muestras. La cinética de
producción del antígeno AGE de la muestra interrumpida exenta de
ribosa muestra ahora (1) cinética monoexponencial sin ningún
periodo de inducción, (2) una velocidad muy aumentada de formación
del AGE antigénico, con notables tiempos medios del orden de 10 h,
y (3) producción de niveles de antígeno comparables con los
observados en incubaciones prolongadas en presencia continua de
ribosa (véase Figura 6A). Igualmente significativos, los datos
demuestran también que se formó antígeno AGE despreciable durante
el periodo de diálisis en frío, como se muestra por la pequeña
diferencia entre los puntos de triángulo en blanco y círculo negro
en el tiempo del día 1 en la Figura 7A. Se formó muy poco AGE, si es
que se formó alguno, por el propio procedimiento de
``interrupción''. Estas observaciones muestran que se ha generado
un producto intermedio o precursor competente aislable para el AGE
antigénico durante el contacto de 24 h con ribosa antes de la
eliminación del azúcar libre y reversiblemente unido.
Las muestras interrumpidas después de solamente 8
h produjeron una cantidad final de antígeno de AGE que fue
aproximadamente el 72% de la muestra interrumpida de 24 h. Las
muestras de RNasa glucosilada con sólo ribosa 0,05 M e
interrumpidas a las 8 h por diálisis en frío y reincubación a 37ºC
revelaron menos del 5% de producción de antígeno reactivo por ELISA
después de 9 días. La interrupción a las 24 h, sin embargo, produjo
un aumento rápido del antígeno por ELISA (similar a la Figura 7A)
para un nivel aproximadamente del 50% del producido en presencia
ininterrumpida de ribosa 0,05 M.
Los mismos efectos de interrupción general se
observaron también con otras proteínas (BSA y hemoglobina). Excepto
para un valor absoluto algo diferente de las constantes de
velocidad y de la cantidad de AGE antigénicos formada durante la
incubación de ribosa 0,05 M de 24 h, se observó el mismo drástico
aumento en la velocidad de formación de antígeno de AGE después de
la eliminación de la ribosa 0,5 M.
La glucosilación es mucho más lenta con glucosa
que con ribosa (obsérvese la diferencia en las escalas de tiempo
entre la Figura 7A y la Figura 7B). Sin embargo, excepto en el caso
de la ribosa, la interrupción después de 3 días de glucosilación
mediante glucosa 1,0 M produjo una concentración despreciable de
precursor para antígenos de AGE reactivos por ELISA (Figura 7B,
curva de trazos).
En las muestras sometidas a análisis ELISA se
analizó también la producción de pentosidina y el AGE estable en
ácido. Se cuantificó el contenido de pentosidina en las mismas
muestras de RNasa en las que se analizó por ELISA la reactividad
del anticuerpo. La glucosilación mediante ribosa en tampón de
fosfato 0,4 M a pH 7,5 produjo pentosidina en RNasa A que se
determinó cuantitativamente por fluorescencia después de la
hidrólisis ácida. La Figura 8A muestra que en condiciones
ininterrumpidas, la ribosa 0,05 M produce un aumento progresivo de
pentosidina. Sin embargo, cuando la glucosilación se realiza en
condiciones ``interrumpidas'' utilizando ribosa 0,5 M, se observa
un aumento drástico en la velocidad de formación de la pentosidina
inmediatamente después de la eliminación de la ribosa sobrante
(Figura 8B), que es similar a, pero ligeramente más rápida que, la
cinética de aparición de los AGE antigénicos (Figura 7A). Una
cantidad mayor de pentosidina se produjo también en la interrupción
a las 24 h en comparación con la de las 8 h. Se han observado
también diferencias reproducibles entre las cinéticas de formación
de la pentosidina y de los AGE antigénicos. Una cantidad
significativa de pentosidina se forma durante la incubación de 24 h
y también durante la diálisis en frío, produciendo un salto de la
línea vertical de trazos en la Figura 8B. Nuestras observaciones
demuestran por lo tanto que un precursor de pentosidina se acumula
durante la glucosilación de la ribosa, el cual puede producir
rápidamente pentosidina después de la eliminación de la ribosa
(véase Odetti et al., 1992, Diabetes
41:153-159).
Los experimentos de ``glucosilación
interrumpida'' descritos anteriormente demuestran que un precursor
o precursores de los AGE antigénicos post-Amadori y
de pentosidina se pueden acumular durante la glucosilación con
ribosa. La cinética de formación de este producto intermedio puede
ser seguida independientemente y cuantificada mediante una
variación de los experimentos descritos anteriormente. La cantidad
de producto intermedio generado en la RNasa a diferentes tiempos de
contacto con la ribosa se puede analizar con el máximo alcance al
que se puede producir el AGE antigénico después de la interrupción.
En tiempos variables después de iniciar la glucosilación, la ribosa
libre y unida reversiblemente se elimina por diálisis en frío o por
dilución rápida (véase más adelante). Se deja a continuación tiempo
suficiente (5 días, que representa varias vidas medias según la
Figura 7A), después se calienta a 37ºC para el desarrollo máximo de
los AGE antigénicos post-Amadori. Las lecturas de
ELISA 5 días después de cada punto de interrupción, representando el
desarrollo máximo de AGE, serían entonces proporcionales a la
concentración de producto intermedio presente en el momento de la
interrupción.
La Figura 9 muestra dicho experimento en el que
se miden las cinéticas de la concentración de producto intermedio
para RNasa en presencia de ribosa 0,5 M (símbolos negros y curva).
Por comparación, se muestra también la cantidad de AGE presente
antes de la eliminación de la ribosa en cada punto de interrupción
(símbolos blancos y líneas de trazos). Como es de esperar (véase
Figura 7A), se forma poco AGE antes de la eliminación (o dilución)
de la ribosa, de modo que las lecturas de ELISA después de periodos
de 5 días de incubación secundaria son principalmente una medida
del AGE formado después de la eliminación de la ribosa. Los
resultados de la Figura 9 muestran que el índice de concentración
del producto intermedio en ribosa 0,5 M es exponencial y muy rápido,
con un tiempo medio de aproximadamente de 3,3 h. Éste es
aproximadamente 3 veces más rápido que la velocidad de conversión
observada de producto intermedio en AGE antigénicos después de la
interrupción (símbolos blancos y curva de trazos de la Figura
7A).
En estos experimentos la eliminación de la ribosa
en cada periodo de interrupción se consiguió por dilución 100 veces
y no por diálisis. La simple dilución redujo la concentración de la
ribosa desde 0,05 M a 0,005 M. Esto determinó independientemente
(Figura 6A) que se produce poco AGE en esta escala de tiempo con
ribosa 5 mM residual. Este enfoque de dilución se dispuso
principalmente por la necesidad de la precisión cuantitativa punto a
punto. Dicha precisión no se habría conseguido por el procedimiento
de diálisis que se realizaría independientemente para cada muestra
en cada punto de interrupción. Nuestros resultados muestran que la
dilución fue equivalente a la diálisis.
Un experimento de referencia independiente (véase
la Figura 10 más adelante) demostró que la dilución de 100 veces
instantánea dio casi resultados idénticos a los del procedimiento
de diálisis. Estos experimentos de referencia demuestran que el
equilibrio de la unión reversible ribosa-proteína
(base de Schiff) es bastante rápido en esta escala de tiempo. Esto
es consistente con los datos de Bunn y Higgins (1981),
Scienie 213:222-224) que indican que
el tiempo medio para la formación de la base de Schiff con ribosa
0,5 M debería ser del orden de unos pocos minutos. El procedimiento
de dilución rápida por 100 veces para reducir la ribosa es un
procedimiento válido en el que la precisión cuantitativa es
esencial y no se puede conseguir mediante diálisis múltiple de
muchas muestras.
El aumento en la velocidad de formación de Age
después de la interrupción y la dilución con azúcar sugiere, pero no
demuestra, que altas concentraciones de ribosa estén inhibiendo la
reacción en o más allá del primer producto intermedio ``estable'',
supuestamente el derivado de Amadori (representado en la Figura
30A). Se realizó a continuación una prueba de esto estudiando el
efecto de añadir directamente la ribosa, en la reacción
post-Amadori. En primer lugar se incubó RNasa
durante 24 h en ribosa 0,5 M para preparar el producto intermedio.
Se realizaron a continuación dos protocolos para medir la posible
inhibición de la formación post-Amadori de los AGE
antigénicos mediante diferentes concentraciones de ribosa. En el
primer experimento, la muestra de ribosa de 24 h se diluyó
simplemente 100 veces en soluciones que contienen concentraciones
finales variables de ribosa que oscilan entre 0,005 M y 0,505 M
(Figura 10A). La velocidad y el alcance de la formación de AGE se
observan claramente al estar disminuidos por las concentraciones de
ribosa en aumento. De forma significativa, hasta la mayor
concentración de ribosa 0,5 M, la cinética parece exponencial y no
presenta el periodo de inducción que tiene lugar en la
glucosilación ininterrumpida (Figuras 6A y 7A) a altas
concentraciones de ribosa.
Se realizó también un segundo experimento (Figura
10B) en el que la muestra interrumpida a las 24 h se dializó
generalmente en frío para liberar la ribosa libre y unida
reversiblemente así como cualquiera de los productos inhibidores
que se pueden haber formado durante las 24 h de incubación con
ribosa. Después de esto, las alícuotas se diluyeron 100 veces en
concentraciones variables de ribosa reciente y se controló la
formación de los productos AGE antigénicos como anteriormente.
Estos resultados fueron casi idénticos a los experimentos de la
Figura 10A, en los que se omitió la etapa de diálisis. En ambos
casos, la velocidad y alcance de la formación de AGE disminuyeron
al aumentar las concentraciones de ribosa y la cinética pareció
exponencial sin periodo de inducción.
Se investigó también la cuestión de si la glucosa
u otros azúcares pueden también inhibir la formación de los AGE a
partir del producto intermedio reactivo obtenido mediante
glucosilación ininterrumpida en ribosa 0,5 M. Se probaron los
efectos de la glucosa a concentraciones de 1,0 a 2,0 M (datos no
mostrados). La glucosa no fue tan claramente inhibidora como la
ribosa. Cuando la muestra de ribosa interrumpida a las 24 h se
diluyó 100 veces en estas soluciones de glucosa, la cantidad de AGE
antigénico formada disminuyó en aproximadamente el 30%, pero esto
supuso poca disminución en la constante de velocidad aparente. De
nuevo, la cinética pareció exponencial.
Se utilizó el procedimiento de glucosilación
interrumpida para investigar la dependencia del pH de la cinética
post-Amadori de formación de AGE a partir del
producto intermedio reactivo. En estos experimentos, se hizo
reaccionar en primer lugar RNasa A durante 24 h con ribosa 0,5 M a
pH 7,5 para generar el producto intermedio reactivo. Se
determinaron a continuación por ELISA las cinéticas de la
disminución del producto intermedio a AGE. La Figura 11 demuestra
que se consiguió un intervalo de pH sumamente amplio de 5,0 a 9,5
cuando se determinaron las cinéticas por velocidades iniciales. Se
observó una dependencia notable en forma de campana, mostrando que
las cinéticas de formación de los AGE antigénicos disminuyen tanto
en el intervalo de pH ácido como en el alcalino, con un pH óptimo
próximo a 8.
Se realizó también un sencillo experimento de
``salto de pH'' en la muestra de pH 5,0 estudiada anteriormente que
presentaba la velocidad de formación de AGE antigénico más baja.
Después de 12 días a 37ºC en tampón de pH 5,0, se ajustó el pH
rápidamente a 7,5, y se controló mediante ELISA la formación de AGE
antigénico. Dentro del error experimental, la muestra presentó
idéntica cinética (la misma constante de velocidad de primer orden)
de formación de AGE para las muestras de glucosilación interrumpida
que se habían estudiado directamente a pH 7,5 (Figura 12). En este
experimento, las cantidades relativas de AGE antigénico no se
podrían comparar directamente en la misma placa de ELISA, pero la
muestra con salto de pH pareció haber formado concentraciones
sustanciales, aunque de algún modo disminuidas, de AGE antigénicos.
Estos resultados demuestran que el producto intermedio se puede
preparar exento de AGE y almacenar a pH 5 para posteriores estudios
de conversión en AGE.
La eficacia de la aminoguanidina se probó
mediante este procedimiento de glucosilación interrumpida, es decir,
probando su efecto en la formación post-Amadori de
los AGE antigénicos después de la eliminación de la ribosa sobrante
y unida revesiblemente. La Figura 20A demuestra que la
aminoguanidina presenta efectos modestos sobre el bloqueo de la
formación de los AGE antigénicos en la RNasa en estas condiciones,
con poca inhición por debajo de 50 mM. Se consigue aproximadamente
el 50% de inhibición sólo a o aproximadamente 100 a 250 mM.
Obsérvese de nuevo que en estos experimentos, la proteína se expuso
a la aminoguanidina sólo después de la interrupción y de la
eliminación de la ribosa libre y unida de forma reversible.
Resultados comparables se obtuvieron también en la glucosilación
interrumpida de BSA (Figura 20B).
Se realizó el análisis de aminoácidos en RNasa
después de un contacto de 24 h con ribosa 0,5 M (sin dializar),
después de la diálisis general de la muestra glucosilada de 24 h y
después de 5 días de incubación de la última muestra a 37ºC. Estas
determinaciones se realizaron después de la reducción con
cianoborohidruro de sodio, que reduce la base de Schiff presente en
las lisinas o en el grupo amino terminal. Las tres muestras,
normalizadas a alanina (12 residuos), mostraron el mismo contenido
de lisina residual (4,0 \pm 0,5 fuera del original 10 en RNasa).
Esto indica que después del contacto de 24 h con ribosa 0,5 M, la
mayoría de los aductos de base de Schiff formados se ha
transformado en productos de Amadori o posteriores. No se perdieron
los residuos de arginina ni de histidina en la modificación.
La utilización de ribosa que reacciona
rápidamente y el descubrimiento de su inhibición reversible de las
etapas post-Amadori han permitido la disección y la
determinación de la cinética en diferentes etapas de la
glucosilación proteica en RNasa. La mayoría de los estudios
cinéticos anteriores de ``glucosilación'' proteica se han limitado
realmente a las ``primeras'' etapas de la formación de la base de
Schiff y a la posterior reestructuración de Amadori. Se han
realizado algunos estudios cinéticos partiendo de fructosilaminas
sintetizadas, es decir compuestos de Amadori de modelo pequeño de
glucosa (Smith y Thornalley, 1992, Eur. J. Biochem.
210:729-739 y referencias citadas en esta
memoria), pero tales estudios, con pocas excepciones, no han sido
posibles hasta ahora con las proteínas. Una excepción destacable es
la demostración por Monnier (Odetti et al., 1992,
supra) de que BSA glicolado parcialmente con ribosa puede
producir rápidamente pentosidina después de la eliminación de la
ribosa. La mayor reactividad de la ribosa también ha demostrado una
ventaja distinta al definir cuantitativamente el trascurso del
tiempo para la formación de AGE. Se observa que la glucosa y la
ribosa son capaces de producir productos AGE similares, tales como
pentosidina (Grandhee y Monnier, 1991, supra; Dyer et
al. 1991, supra), y se ha realizado algún trabajo del
compuesto del modelo ^{13}C RMN con ADP-ribosa
(Cervantes-Laurean et al., 1993,
Biochemistry 32:1528-1534). El
presente trabajo muestra que los productos de AGE antigénico de
ribosa interreaccionan completamente con los anticuerpos
anti-AGE dirigidos contra las proteínas modificadas
con glucosa, sugiriendo que la ribosa y la glucosa producen
similares AGE antigénicos. Las diferencias de cinética primaria
observadas entre estos dos azúcares se deben probablemente a las
diferencias relativas en las constantes de velocidad de las etapas
que conducen a la formación de AGE post-Amadori,
más que al mecanismo.
Los resultados presentados revelan una marcada y
paradójica ihibición de la formación global de AGE por
concentraciones altas de ribosa (Figura 6) que no han sido
previstas por los primeros estudios. Esta inhibición es rápidamente
reversible en el sentido que se elimina mediante diálisis de la
proteína modificada inicialmente (Figura 7A) o por simple dilución
de 100 veces (como se utiliza en la Figura 11). Los experimentos de
la Figura 10 demuestran que no se debe a la acumulación de los
productos intermedios inhibidores dializables durante la
glucosilación inicial, ya que la diálisis de la proteína modificada
a las 24 h seguida de adición de concentraciones diferentes de
ribosa reciente provoca la misma inhibición. Los datos de la Figura
10A, B demuestran que la inhibición tiene lugar por interacción
reversible y rápida de la ribosa con el producto intermedio
proteico que contiene productos reactivos de Amadori. Es poco
probable que la inhibición se aplique en la etapa inicial de la
formación del producto Amadori debido a la velocidad rápida de
formación del supuesto producto intermedio de Amadori que se
determinó en el experimento de la Figura 9. La identificación del
producto intermedio reactivo como producto de Amadori está bien
apoyada por el análisis de aminoácidos realizado (después de la
reducción con cianoborohidrato de sodio) antes y después de la
diálisis en el punto de interrupción de 24 h. El contenido de
lisina residual inalterada indica que cualesquiera de las bases de
Schiff se ha transformado ya de forma irreversible (supuestamente
mediante reestructuración de Amadori) en el periodo de 24 h.
La supresión de la ribosa secundaria de las
etapas de glucosilación ``últimas'' pero no de las ``primeras''
aumenta de forma significativa la acumulación de un producto
intermedio de Amadori reactivo totalmente competente que contiene
poco AGE. Su aislamiento por el procedimiento de interrupción es de
importancia para los estudios cinéticos y estructurales, ya que
permite a uno realizar estudios en ausencia de azúcar libre o unido
a la base de Schiff y sus reacciones y complicaciones acompañantes.
Por ejemplo, se han medido las velocidades de conversión
post-Amadori en AGE antigénico y productos AGE de
pentosidina (Figura 7A, símbolos en blanco y Figura 8B) y ha
demostrado ser mucho más rápido (t ½ \sim 10 h) que el reflejado
en la cinética general en condiciones ininterrumpidas (Figura 6A y
Figura 8A). La formación rápida de pentosidina que se determinó
parece consistente con un primer experimento con ribosa
interrumpido en BSA por Odetti et al. (1992, supra).
Como la ribosa y los derivados tales como ADP-ribosa
son metabolitos normales, las velocidades muy altas de formación de
AGE observadas en la presente memoria sugieren que se deberían
considerar más seriamente como fuentes de glucosilación potencial
en varios compartimentos celulares
(Cervantes-Laurean et al., 1993,
supra), aún cuando sus concentraciones están muy por debajo
de las de la glucosa menos reactiva.
Otra nueva aplicación de aislamiento del producto
intermedio tiene en estudio la dependencia del pH de esta compleja
reacción. El raro perfil del pH con forma de campana observado en
la formación de AGE post-Amadori (Figura 11) está en
sorprendente contraste con la dependencia del pH moderado de la
reacción global. La cinética última refleja un efecto compuesto del
pH en todas las etapas de la reacción, incluyendo la formación de
la base de Schiff y del producto de Amadori, cada uno de los cuales
puede tener una única dependencia del pH. Esta complejidad está
especialmente bien ilustrada en los estudios de glucosilación de
hemoglobina (Lowery et al., 1985, J. Biol. Chem.
260:11611-11618). El perfil de pH en forma de
campana sugiere, pero no demuestra, la implicación de dos grupos
ionizantes. Si es cierto, los datos pueden implicar la
participación de un segundo grupo amino, tal como el procedente de
una lisina próxima, en la formación de los AGE antigénicos
dominantes. El perfil de pH observado y las observaciones del salto
de pH descritas sugieren que una vía útil para aislar y mantener el
producto intermedio reactivo sería mediante la disminución rápida
del pH hasta cerca de 5,0 después de la interrupción de 24 h.
Los estudios cinéticos proporcionan nuevos
conocimientos en los mecanismos de acción de la aminoguanidina
(guanilhidrazina), inhibidor de AGE propuesto por Cerami y
colaboradores para combinar con los productos intermedios de Amadori
(Brownlee et al., 1986, supra). Este agente
farmacológico propuesto está ahora en pruebas clínicas en fase III
para posibles efectos terapéuticos en el tratamiento de la diabetes
(Vlassara et al., 1994, supra). Sin embargo, su
mecanismo de inhibición de AGE es probable que sea bastante
complejo, ya que es multifuncional. Como hidrazina nucleófila, se
puede añadir de forma reversible para los carbonilos activos,
incluyendo los aldehidocarbonilos de glucosa y ribosa de cadena
abierta (Khatami et al., 1988, Life Sci.
43:1725-1731; Hirsch et al., 1995,
Carbohyd. Res. 267:17-25), así como
los cetocarbonilos de los compuestos de Amadori. Es además un
compuesto de guanidinio que puede secuestrar productos intermedios
de la glucosilación con dicarbonilo muy reactivo tales como glioxal
y glucosonas (Chen y Cerami, 1993, J. Carbohyd. Chem.
12:731-742; Hirsch et al., 1992,
Carbohyd. Res. 232:125-130; Ou y
Wolff, 1993, Biochem. Pharmacol.
46:1139-1144). El procedimiento de
glucosilación interrumpido permitió el examen de la eficacia de la
aminogunidina solamente en etapas post-Amadori de
formación AGE. Igualmente importante, permitió estudios en ausencia
de azúcar libre o de fragmentos reactivos de dicarbonilo procedentes
del azúcar libre (Wolf y Dean, 1987, Biochem. J. 245:
243-250; Wells-Knect et al.,
1995, Biochesmistry 34: 3702-3709) que
se pueden combinar con aminoguanidina. Los resultados de la Figura
20 demuestran que la aminoguanidina presenta, en el mejor de los
casos, solamente un efecto modesto en las reacciones de formación
de AGE post-Amadori, consiguiendo una inhibición
del 50% a concentraciones mayores de 100 a 250 mM. La eficacia de la
aminoguanidina por lo tanto aumenta predominantemente a partir de
las etapas iniciales de inhibición de la glucosilación (formación
de la base de Schiff) o a partir del secuestro de dicarbonilos muy
reactivos generados durante la glucosilación. Al contrario de las
reivindicaciones originales, no parece inhibir la formación de AGE
acomplejando el producto intermedio de Amadori.
La utilización de la glucosilación interrumpida
no está limitada por estudios cinéticos. La glucosilación
interrumpida puede simplificar los estudios estructurales de las
proteínas glucosiladas e identificar los AGE desconocidos
utilizando técnicas tal como ^{13}C RMN que se han utilizado para
detectar aductos de Amadori de RNasa (Neglia et al., 1983,
J. Biol. Chem. 258:14279-14283, J.
Biol. Chem. 260:5406-5410). La
utilización combinada de enfoques estructurales y cinéticos sería
también de especial interés. Por ejemplo, aunque permanece incierta
la identidad de los AGE antigénicos dominantes al reaccionar con
los anticuerpos policlonales, los AGE experimentales, tal como la
(carboximetil)lisina propuesta recientemente (Reddy et
al., 1995, Biochemistry 34:
10872-10878; véase Makita et al., 1992,
J. Biol. Chem. 267: 5133-5138) debería
presentar la misma cinética de formación del producto intermedio
reactivo que se ha observado. La disponibilidad del enfoque de la
cinética interrumpida ayudará también a determinar la importancia
de la vía de Amadori para la formación de este AGE. De forma
similar, el control de la reacción de glucosilación interrumpida
mediante técnicas tal como ^{13}C RMN debería identificar
resonancias de otros AGE antigénicos experimentales como los que
están presentando cinéticas similares de aspecto. La Tabla I
relaciona los picos de ^{13}C RMN del producto intermedio de
Amadori de RNasa preparado por reacción con ribosa enriquecida con
C-2. El pico en sentido descendente próximo a 205
ppm se debe probablemente al carbonilo del producto de Amadori. En
todos los casos, la capacidad para eliminar azúcares en exceso,
libres y con base de Schiff por glucosilación interrumpida
simplificará considerablemente el aislamiento, la identificación y
la caracterización estructural.
La Tabla I relaciona los picos que se asignaron
al producto intermedio post-Amadori debido a su
intensidad invariable o decreciente con el tiempo. Las posiciones
del pico se listan en ppm en sentido descendente a partir de
TMS.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
216,5 ppm \+ \+ \+ 108,8 ppm\cr 211,7 \+ \+ \+ 105,9\cr 208
\+ \+ \+ 103,9\cr \+ \+ \+ 103\cr 172 \+ \+ \+ 95,8\cr
165\+\+\+\cr 163,9 \+ \+ \+ 73,65\cr 162,1 \+ \+ \+ 70,2\cr
\+ \+ \+
69,7\cr}
La ribonucleasa A se hizo reaccionar durante 24 h
con ribosa 0,5 M al 99% enriquecida en C-2, después
de lo cual se eliminó la ribosa sobrante y unida a la base Schiff
por diálisis frecuente en frío. A continuación se volvió a calentar
la muestra a 37ºC inmediatamente antes de hacer un barrido por RMN
de 2 h. Las señales de RNasa que reaccionaron con ribosa natural en
abundancia en condiciones idénticas se sustrajeron a continuación
del espectro RMN. De este modo todos los picos mostrados son
debidos a C-13 enriquecido que se originó en la
posición C-2. Algunos de los picos proceden de
productos de degradación del producto intermedio y estos se pueden
identificar por el aumento en la intensidad del pico a lo largo del
tiempo. La Figura 31 muestra el espectro RMN obtenido.
El procedimiento de glucosilación interrumpido
para la siguiente cinética post-Amadori de la
formación de AGE permite el estudio cuantitativo rápido de las
etapas ``finales'' de la reacción de glucosilación. De forma
importante, este procedimiento permite los estudios de inhibición
que están exentos de vías de formación de AGE que surgen a partir
de productos glucoxidativos de azúcar libre o base de Schiff (vía
de Namiki) como se ilustra en la Figura 30A. Por lo tanto el
procedimiento de glucosilación interrumpida permite la
identificación rápida y única y la caracterización de inhibidores de
las ``últimas'' etapas de glucosilación que conducen a la formación
de AGE antigénico.
Entre los derivados de las vitaminas B_{1} y
B_{6} examinados, la piridoxamina y el pirofosfato de tiamina son
los únicos inhibidores de la vía post-Amadori de la
formación de AGE. De forma importante, se ha descubierto que la
eficacia de la inhibición de la glucosilación total de la proteína,
en presencia de grandes cantidades de azúcar, no es un factor
predisponente de la capacidad para inhibir las etapas
post-Amadori de la formación de AGE donde se
elimina el azúcar libre. De este modo mientras que la piridoxamina,
el pirofosfato de tiamina y la aminoguanidina son potentes
inhibidores de la formación de AGE en la glucosilación total de la
proteína por la glucosa, la aminoguanidina se diferencia de los
otros dos en que no es un inhibidor eficaz de la formación
post-Amadori de AGE. La aminoguanidina disminuye
notablemente la velocidad inicial de formación de AGE por la ribosa
en condiciones ininterrumpidas, pero no tiene efecto sobre las
concentraciones finales de los AGE antigénicos producidos. El examen
de diferentes proteínas (RNasa, BSA y hemoglobina), confirmó que
los resultados de la inhibición son generalmente no específicos en
relación con la proteína utilizada, aún cuando existen variaciones
individuales en las velocidades de formación e inhibición de
AGE.
Se incubaron albúmina de suero bovino,
ribonucleasa A y hemoglobina humana con ribosa a 37ºC en tampón de
fosfato sódico 0,4 M de pH 7,5, conteniendo azida de sodio al
0,02%. La proteína (10 mg/ml ó 1 mg/ml), ribosa
\hbox{0,05
M} e inhibidores preventivos (a 0,5, 3, 15 y 50 mM) se
introdujeron simultáneamente en la mezcla de incubación. Se
mantuvieron las soluciones en la oscuridad en tubos tapados. Se
tomaron alícuotas y se congelaron inmediatamente hasta que se
analizaron por ELISA al final de la reacción. Las incubaciones
fueron durante 3 semanas (Hb) ó 6 semanas (RNasa, BSA). Se controló
el pH constante en las reacciones de glucosilación en toda la
duración de los experimentos.
Se realizó en primer lugar la glucosilación
incubando la proteína (10 mg/ml) con ribosa 0,5 M a 37ºC en tampón
de fosfato sódico 0,4 M de pH 7,5, que contenía azida de sodio al
0,2% durante 24 h en ausencia de inhibidores. A continuación se
interrumpió la glucosilación para eliminar el azúcar sobrante y el
unido reversiblemente (base de Schiff) por diálisis general contra
los cambios frecuentes de tampón frío a 4ºC. Las muestras de
producto intermedio glucosilado que contiene cantidades máximas de
producto de Amadori y poco AGE (dependiendo de la proteína) se
calentaron a continuación rápidamente a 37ºC sin volver añadir
ribosa. Esto inició la transformación de productos intermedios de
Amadori en productos AGE en ausencia o presencia de varias
concentraciones (típicamente 3, 15 y 50 mM) de inhibidores
preventivos. Se tomaron alícuotas y se congelaron en varios
intervalos para análisis posterior. Las soluciones se mantuvieron
en tubos tapados y se abrieron solamente para eliminar las
alícuotas analizadas que se congelaron inmediatamente para realizar
más tarde diversos análisis.
Se establecieron rutinariamente los datos
cinéticos (curvas de evolución en el tiempo) para las funciones
mono o biexponenciales utilizando procedimientos no lineales de
mínimos cuadrados, empleando bien el software SCIENTIST 2.0
(Micromath, Inc.) u ORIGIN (Microcal, Inc.) que permite iterar en
las funciones definidas por el usuario y en el control de
parámetros. Las desviaciones estándar de los parámetros de las
funciones ajustadas (valores ordenados inicial y final y constantes
de velocidad) se devolvieron como medidas de la precisión de los
ajustes. Los tiempos medios aparentes para los ajustes de la
cinética biexponencial se determinaron con la función ``solve'' del
software de MathCAD (MathSoft, Inc.).
Se evaluaron los efectos inhibidores de los
derivados de las vitaminas B_{1} y B_{6} sobre la cinética de
la formación de AGE antigénico mediante anticuerpos policlonales
específicos para los AGE. Se realizaron estudios de inhibición
inicial sobre la glucosilación de la ribonucleasa A bovina (RNasa)
en presencia continua de ribosa 0,05 M, que es la concentración de
ribosa en la que la velocidad de formación de AGE es casi máxima.
La Figura 13 (curvas de referencia, rectángulos negros) demuestra
que la formación de AGE antigénicos en RNasa cuando se incuba con
ribosa 0,05 M es relativamente rápida, con un tiempo medio de
aproximadamente 6 días en estas condiciones.
\hbox{5'-fosfato} de piridoxal (Figura
13B) y piridoxal (Figura 13C) inhibieron significativamente la
velocidad de formación de AGE en RNasa a concentraciones de 50 mM y
15 mM. Sorprendentemente, piridoxina, forma alcohólica de la
vitamina B_{6}, inhibió también de forma moderada la formación de
AGE en RNasa (Figura 13D). De los derivados de B_{6} examinados,
la piridoxamina a 50 mM fue el mejor inhibidor de las
concentraciones ``finales'' del AGE formado en RNasa durante el
periodo de tiempo de 6 semanas controlado (Figura 13A).
Todas las vitaminas B_{1} inhibieron la
formación de AGE en RNasa a concentraciones elevadas, pero la
inhibición pareció más compleja que para los derivados de B_{6}
(Figuras 14A-C). En el caso del pirofosfato de
tiamina como inhibidor (Figura 14A), tanto la velocidad de
formación de AGE como las concentraciones finales de AGE producido
en el tramo horizontal perecieron disminuidas. En el caso del
pirofosfato de tiamina como inhibidor (Figura 14B), y de la tiamina
(Figura 14C), pereció ser un efecto pequeño sobre la velocidad de
formación de AGE, pero se formó una disminución sustancial en la
concentración final de AGE en presencia de la mayor concentración de
inhibidor. En general, el pirofosfato de tiamina demostró mayor
inhibición que los otros dos compuestos, a las concentraciones más
bajas examinadas.
La inhibición de la formación de AGE por la
aminoguanidina (Figura 14D) fue muy diferente de la observada en los
experimentos con B_{1} y B_{6}. El aumento de concentración de
aminoguanidina disminuyó la velocidad de formación de AGE en la
RNasa, pero no redujo la concentración final de AGE formado. La
concentración final de AGE formado después de 6 semanas fue casi
idéntica a la de referencia para todas las concentraciones probadas
de aminoguanidina.
Se realizaron estudios comparativos con BSA y
metahemoglobina humana (Hb) para determinar si la inhibición
observada era específica de la proteína. Los diferentes derivados
de la vitamina B_{6} (Figuras 15A-D) y de la
vitamina B_{1} (Figuras 16A-C) presentaron
tendencias de inhibición similares cuando se incubaron con BSA como
con RNasa, piridoxamina y pirofosfato de tiamina siendo los
inhibidores más eficaces de cada familia. La piridoxina fracasó en
la inhibición de la formación de AGE en BSA (Figura 15D). El
fosfato de piridoxal y el piridoxal (Figuras 15B-C)
inhibieron principalmente la velocidad de formación de AGE, pero no
las concentraciones finales de AGE formadas. La piridoxamina
(Figura 15A) presentó cierta inhibición a concentraciones más
bajas, y a la concentración mayor probada pareció inhibir las
concentraciones finales del AGE formado más eficazmente que
cualquiera de los demás derivados de B_{6}. En el caso de los
derivados de B_{1}, el alcance total de la inhibición de la
formación de AGE con BSA (Figuras 16A-C), fue menor
que el observado con RNasa (Figuras 14A-C).
Concentraciones mayores de tiamina y de pirofosfato de tiamina
inhibieron las concentraciones finales de los AGE formados, sin
afectar en gran medida la velocidad de formación de AGE (Figura
16C). La aminoguanidina presentó de nuevo los mismos efectos de
inhibición con BSA que los observados con RNasa (Figura 16D),
pareciendo que disminuye la velocidad de formación de AGE sin
afectar de forma significativa las concentraciones finales de AGE
formado.
Se examinó también la cinética de formación de
AGE utilizando Hb en presencia de los derivados de las vitaminas
B_{6} y B_{1} y aminoguanidina. Las velocidades aparentes
absolutas de formación de AGE fueron significativamente más altas
con Hb que con RNasa o BSA. Sin embargo, los inhibidores probados
mostraron esencialmente un comportamiento similar. En la Figura 17
se muestran los efectos de los derivados de la vitamina B_{6}. La
piridoxamina presentó la mayor inhibición a concentraciones de 3 mM
y superiores (Figura 17A), y fue más eficaz cuando se compara con
el fosfato de piridoxal (Figura 17B), piridoxal (Figura 17C) y
piridoxina (Figura 17D). EN el caso de los derivados de la vitamina
B_{1} (datos no mostrados) los efectos inhibidores fueron más
similares a las tendencias de inhibición de BSA que a las de RNasa.
La inhibición fue sólo modesta a las mayores concentraciones
probadas (50 mM), siendo casi del 30 al 50% para los tres derivados
de B_{1}. La inhibición se manifestó principalmente en la
reducción de las concentraciones finales de AGE formado.
Utilizando el modelo de glucosilación
interrumpida para determinar la inhibición de la formación
``última'' de AGE post-Amadori se examinaron las
cinéticas incubando los productos intermedios de Amadori aislados de
RNasa o de BSA a 37ºC en ausencia de ribosa libre o unida
reversiblemente. El azúcar ribosa que se utilizó al principio para
preparar los productos intermedios se eliminó por diálisis en frío
después de un periodo inicial de reacción de glucosilación de 24 h.
Después de la formación de AGE se dejó recobrar, la formación de AGE
es bastante rápida (tiempos medios de aproximadamente 10 h) en
ausencia de cualquier inhibidor. La Figura 18 muestra los efectos
de la piridoxamina (Figura 18A), del fosfato de piridoxal (Figura
18B) y del piridoxal (Figura 18C) sobre la cinética
post-Amadori de BSA. La piridoxina no produce
ninguna inhibición (datos no mostrados). Se realizaron experimentos
similares en RNasa. La pirioxamina produjo inhibición casi completa
de la formación de AGE con RNasa a 15 mM y 50 mM (Figura 18D). El
piridoxal no mostró ninguna inhibición significativa a 15 mM (la
mayor probada), pero el fosfato de piridoxal mostró una inhibición
significativa a 15 mM. El fosfato de piridoxal se sabe que es capaz
de marcar por afinidad la zona activa de RNasa (Raetz y Auld, 1972,
Biochemistry 11:2229-2236).
Con BSA, a diferencia de RNasa, se formó una
cantidad importante de AGE antigénico durante la incubación inicial
de 24 h con RNasa (25 a 30%), como se evidenció mediante las
lecturas más altas de ELISA después de la eliminación de ribosa en
el tiempo cero para las Figuras 18A-C. Para BSA y
RNasa, la inhibición, cuando se observa parece manifestarse como
una disminución de las concentraciones finales del AGE formado en
lugar de una disminución de la velocidad de formación de AGE.
El pirofosfato de tiamina inhibió la formación de
AGE más eficazmente que los demás derivados de B_{1} tanto con
RNasa como con BSA (Figura 19). La tiamina no mostró ningún efecto,
mientras que el fosfato de tiamina mostró algún efecto intermedio.
Como en el caso de los análisis de B_{6}, la inhibición
post-Amadori se manifestó de forma más aparente como
una disminución de las concentraciones finales del AGE formado.
La Figura 20 muestra los resultados de la prueba
con aminoguanidina para la inhibición de la cinética de formación de
AGE post-Amadori tanto con BSA como con RNasa. A 50
mM, la inhibición fue aproximadamente el 20% en el caso de BSA
(Figura 20B), y menos del 15% con RNasa (Figura 20A). La posibilidad
de inhibición por los grupos funcionales sencillos que contienen
amino se probó también utilizando
N^{\alpha}-acetil-L-lisina
(Figura 21), que contiene sólo un grupo
N^{\varepsilon}-amino.
N^{\alpha}-acetil-L-lisina
hasta 50 mM fracasó en presentar alguna inhibición significativa de
la formación de AGE.
Numerosos estudios han demostrado que la
aminoguanidina es un inhibidor aparentemente potente de muchas
manifestaciones de glucosilación no enzimática (Brownlee et
al., 1986; Brownlee, 1992, 1994 y 1995). Los efectos
inhibidores de la aminoguanidina sobre varios fenómenos que están
provocados por azúcares reductores se consideran generalmente como
prueba de la implicación de la glucosilación en muchos de tales
fenómenos. La aminoguanidina se ha introducido hace poco en una
segunda ronda de pruebas clínicas en fase III para mejorar las
complicaciones de la diabetes que se cree que están producidas por
la glucosilación de las proteínas del tejido conectivo, debido a
altos niveles de azúcar.
Los datos del estudio cinético de la formación de
AGE ``lenta'' ininterrumpida con RNasa provocada por la glucosa
(Ejemplo 1) confirmaron que la aminoguanidina es un inhibidor
eficaz y además identificaron un número de derivados de las
vitaminas B_{1} y B_{6} como inhibidores igual o ligeramente más
eficaces. Sin embargo, la inhibición mediante aminoguanidina
pareció inesperadamente disminuir en efecto en las últimas etapas
de la reacción de formación de AGE. Debido a la lentitud de la
glucosilación de la proteína con glucosa, esta sorprendente
observación no se podría examinar totalmente. Además, se ha sugerido
que pueden ser cuestiones sobre la estabilidad a largo plazo de la
aminoguanidina (Ou y Wolff, 1993, supra).
Los análisis que utilizan la glucosilación por la
ribosa mucho más rápida permitieron durante el transcurso de tiempo
completo de la formación de AGE ser observados y cuantificados
completamente durante la glucosilación ininterrumpida de la
proteína. La utilización de la glucosilación interrumpida permitió
únicamente el aislamiento y el examen adicionales de sólo la
formación de AGE antigénico post-Amadori en
ausencia de ribosa libre y unida reversiblemente (base de Schiff).
La comparación de los datos de estos dos enfoques con la cinética
inicial de la glucosilación con glucosa ha proporcionado nuevas
ideas en los mecanismos y eficacia de varios inhibidores. La Figura
22 son diagramas de barras que representan datos comparativos
resumidos del porcentaje de inhibición en puntos de tiempo
definidos utilizando varias concentraciones de inhibidor. La Figura
22A grafica los datos para la inhibición después de la
glucosilación interrumpida de la formación de AGE por BSA en ribosa.
La Figura 22B grafica los datos para la inhibición después de la
glucosilación interrumpida de la formación de AGE con BSA por
ribosa.
Los resultados globales demuestran sin
ambigüedades que la aminoguanidina disminuye la velocidad de
formación de AGE antigénico en presencia de azúcar pero presenta
poco efecto sobre la cantidad final de AGE
post-Amadori formado. Por lo tanto, las
observaciones limitadas únicamente a las etapas ``primeras''
iniciales de formación de AGE que indican la eficacia como inhibidor
pueden de hecho llevar a conclusiones erróneas en relación con la
eficacia verdadera de la inhibición de la formación de AGE
post-Amadori. Por lo tanto, la capacidad para
observar un curso completo de la reacción utilizando ribosa y
glucosilación interrumpida proporciona una imagen más completa de
la eficacia de la inhibición de la formación de AGE
post-Amadori.
La hiperglucemia se puede provocar rápidamente
(en uno o dos días) en ratas mediante la administración de
estreptozocina (aka. Estreptozocina, STZ) o aloxano. Este se
ha convertido en un modelo corriente para la diabetes mellitus. Sin
embargo, estas ratas manifiestan nefropatía únicamente después de
muchos meses de hiperglucemia y en general inmediatamente antes de
la muerte a partir de la enfermedad renal en la etapa final (ESRD).
Se cree que esta patología está producida por la modificación
química irreversible de la glucosa de las proteínas de larga vida,
tal como el colágeno de la membrana basal. Las ratas diabéticas por
STZ muestran albuminuria mucho después de la provocación de la
hiperglucemia, aproximadamente 40 semanas, en general inmediatamente
antes de la muerte.
Debido a los drásticos efectos rápidos de la
ribosa demostrados in vitro en los ejemplos anteriores, se
emprendió a examinar los efectos de la administración de ribosa a
las ratas y la posible provocación de los AGE por la rápida
glucosilación de la ribosa. A partir de este estudio, se ha
desarrollado un modelo de rata para la patología acelerada
provocada por la ribosa.
Se administró a dos grupos de seis ratas cada uno
en un día:
- a.
- ribosa 300 mM (dos infusiones intraperitoneales, cada 6 a 8 horas, cada una del 5% del peso corporal en ml); o
- b.
- ribosa 50 mM (una infusión)
A continuación las ratas se mantuvieron durante 4
días sin ninguna administración adicional de ribosa, en cuyo tiempo
se sacrificaron y se determinaron las siguientes mediciones
fisiológicas: (i) peso corporal inicial y final; (ii) peso del
riñón en la etapa final; (iii) presión sanguínea en el ratón
inicial y final; (iv) eliminación de creatinina por cada 100 g de
peso corporal.
No se determinaron los índices de filtración de
la albúmina, ya que no se previeron inicialmente cambios rápidos.
La experiencia pasada con las ratas diabéticas por STZ demuestra
que la albuminuria se desarrolla muy tarde (quizás a las 40
semanas) después de la provocación de la hiperglucemia e
inmediatamente antes de que expiren los animales.
- a.
- El peso corporal final y el peso final de un solo riñón fueron los mismos para los grupos de tratamiento con ribosa a alta y baja dosis.
- b.
- La presión
sanguínea del ratón aumentó desde 66 \pm 4 hasta 83 \pm 3 en
ratas tratadas con ribosa a baja dosis (
\hbox{1 \times 50 mM}) y desde 66 \pm 4 a 106 \pm 5 para las ratas tratadas con ribosa a alta dosis (2 \times 300 mM). Estos resultados se muestran en el diagrama de barras de la Figura 23.
- c.
- La eliminación de creatinina, como cc por cada 100 g de peso corporal, disminuyó (intervalo normal esperado aproximadamente de 1,0 a 1,2) en función de la dosis, hasta 0,87 \pm 0,15 para el grupo con ribosa a baja dosis y disminuyó todavía más del 30% hasta 0,62 \pm 0,13 para el grupo con ribosa a alta dosis. Estos resultados se muestran en el diagrama de barras de la Figura 24.
Un único tratamiento de ribosa al día produjo una
hipertensión dependiente de la dosis y una disminución dependiente
de la dosis al manifestarse la función de eliminación glomerular 4
días después. Estos son los cambios metabólicos significativos de
la diabetes observados únicamente mucho más tarde en las ratas
diabéticas por STZ. Este fenómeno se puede suponer que se debe a la
modificación química irreversible de la ribosa (glucosilación) de
la proteína in vivo.
Se administraron a grupos de ratas (3 a 6) 0,3 M
``dosis baja de ribosa'' (LR) ó 1,0 M ``dosis alta de ribosa'' (HR)
mediante inyecciones dos veces al día para (i) 1 día, (ii) un
``corto plazo'' (S) de 4 días, ó (ii) un ``largo plazo'' (L) de 8
días. Además, estas concentraciones de ribosa se incluyeron en agua
potable.
- a.
- La presión sanguínea del ratón aumentó en todos los grupos de ratas tratadas con ribosa, confirmando los resultados de la fase I. (Figura 23).
- b.
- La eliminación de creatinina disminuyó en todos los grupos en función de la dosis de ribosa y en función del tiempo (Figura 24).
- c.
- El índice de derrame de albúmina (AER) aumentó de forma significativa en función de la ribosa en las exposiciones de 1 día y de 4 días. Sin embargo, presentó cierta recuperación a los 8 días en relación con la de 4 días en el grupo de dosis alta pero no en el grupo de dosis baja. Estos resultados se muestran en el diagrama de barras de la Figura 25.
- d.
- La eliminación de la creatinina por cada 100 g de peso corporal disminuyó tanto para los grupos con alta dosis como para los de baja dosis de ribosa en aproximadamente la misma extensión en función del tiempo (Figura 24).
La exposición a la ribosa durante como mínimo 4
días conduce a hipertensión y a disfunción renal, como se manifiesta
tanto por la disminución de la eliminación de creatinina como por
el aumento de la filtración de albúmina. Estos cambios son típicos
de la diabetes y se observan en momentos mucho después en ratas
diabéticas por STZ.
Se distribuyeron al azar sesenta ratas en 9
grupos diferentes, que incluyen los expuestos a ribosa 1 M durante 8
días en presencia o ausencia de aminoguanidina, piridoxamina y
pirofosfato de tiamina como sigue:
Grupos de referencia:
- (i)
- sin tratamiento;
- (ii)
- dosis alta (250 mg/kg de peso corporal) de piridoxamina (``compuesto-P'');
- (iii)
- dosis alta (250 mg/kg de peso corporal) de pirofosfato de tiamina (``compuesto-T'' ó ``TPP''); y
- (iv)
- dosis baja (25 mg/kg de peso corporal) de aminoguanidina (``AG'').
Grupos de prueba:
- (i)
- sólo solución salina de ribosa 1 M (2 \times 9 cc al día IP, durante 8 días);
- (ii)
- ribosa más dosis baja (``LP'') de piridoxamina (25 mg/kg de peso corporal inyectado como 0,5 ml con 9 cc de ribosa);
- (iii)
- ribosa más dosis alta (``HP'') de piridoxamina (250 mg/kg de peso corporal inyectado como 0,5 ml con 9 cc de ribosa);
- (iv)
- ribosa más dosis alta (``HP'') de pirofosfato de tiamina (250 mg/kg de peso corporal inyectado como 0,5 ml con 9 cc de ribosa); y
- (v)
- ribosa más dosis baja de aminoguanidina (25 mg/kg de peso corporal inyectado como 0,5 ml con 9 cc de ribosa).
A diferencia de la fase II, no se administró
ribosa en el agua potable. Se administraron previamente compuestos
quirúrgicos un día antes de introducirlos con ribosa.
- a.
- La presión sanguínea aumentó muy ligeramente para los tres compuestos solos (grupo de referencia); la BP elevada por ribosa no mejoró mediante la administración conjunta de los compuestos. Estos resultados se muestran en el diagrama de barras de la Figura 26.
- b.
- La eliminación de creatinina en la muestras de referencia quedó inalterada, excepto para TPP que disminuyó.
- c.
- La eliminación de
creatinina se normalizó cuando la ribosa se administró conjuntamente
con bajas dosis
\break
(\hbox{25 mg/kg}) de aminoguanidina o de piridoxamina. Estos resultados se muestran en el diagrama de barras de la Figura 27.
- d.
- Concentraciones altas (250 mg/kg) de piridoxamina y de TPP presentaron únicamente protección parcial frente a la disminución de la eliminación de creatinina provocada por la ribosa (Figura 27).
- e.
- La ribosa elevó el índice de derrame de albúmina (AER), así como la dosis alta de piridoxamina y TPP y la dosis baja de aminoguanidina en ausencia de ribosa. Estos resultados se muestran en el diagrama de barras de la Figura 28.
- f.
- El índice de derrame de albúmina se reestableció a normal mediante la administración conjunta de bajas dosis tanto de aminoguanidina como de piridoxamina. Estos resultados se muestran en el diagrama de barras de la Figura 29.
Tal como se determinó por los dos índices de la
función renal, la piridoxamina y la aminoguanidina, ambas a
\hbox{25 mg/kg}, fueron aparentemente eficaces, e
igualmente así, previniendo la disminución provocada por la ribosa
de la eliminación de la creatinina y del aumento moderado de
albuminuria provocado por la ribosa.
(i) El pirofosfato de tiamina no se probó a 25
mg/kg; (ii) el pirofosfato de tiamina y la piridoxamina, a 250
mg/kg, fueron parcialmente eficaces para prevenir las disminuciones
de eliminación de creatinina pero posiblemente no para prevenir la
proteinuria moderada; (iii) a estas concentraciones muy altas y en
ausencia de ribosa, el pirofosfato de tiamina solo produjo una
disminución en la eliminación de creatinina y ambos produjeron
aumentos moderados en la albuminuria.
La hiperglucemia persistente en la diabetes
mellitus conduce a la nefropatía diabética en quizás un tercio de
los pacientes humanos. Clínicamente, la nefropatía diabética se
define por la presencia de:
- 1. una disminución de la función renal (eliminación glomerular deficiente)
- 2. un aumento de las proteínas en la orina (filtración deficiente)
- 3. la presencia simultánea de hipertensión
La función renal depende de la circulación
sanguínea (no medida) y de la eliminación glomerular, que se puede
medir por eliminación de inulina (no medida) o eliminación de
creatinina. La permeabilidad glomerular se mide por la velocidad de
filtración de la albúmina, pero este parámetro es bastante
variable. También es una función de distribución logarítmica: un
aumento de 100 veces de excreción de albúmina representa únicamente
una disminución de dos veces la capacidad de filtración.
Según los criterios anteriores, la ribosa parece
que provoca muy rápidamente manifestaciones de nefropatía diabética,
reflejadas en la hipretensión, eliminación de creatinina y
albuminuria, aún cuando la última no sea grande. En la conocida
rata diabética STZ, la hiperglucemia se demuestra rápidamente en 1 a
2 días, pero las manifestaciones clínicas de la nefropatía
diabética aparecen muy tarde, quizás tanto como 40 semanas para la
albuminuria. En general, la albuminuria es muy variable de día en
día y de animal en animal, aunque a diferencia del hombre, la
mayoría de ratas STZ desarrolla a la larga la nefropatía.
Utilizando animales tratados con ribosa, la
piridoxamina a 25 mg/kg de peso corporal parece evitar eficazmente
dos de cada tres manifestaciones atribuidas generalmente a la
diabetes, a saber la deficiencia de la eliminación de creatinina y
de la filtración de albúmina. Esto lo efectuó tan eficazmente como
la aminoguanidina. La eficacia del pirofosfato de tiamina no fue
manifiesta, pero debería hacerse hincapié en que ésta puede ser
debida a su utilización a elevadas concentraciones de 250 mg/kg de
peso corporal. La piridoxamina habría parecido mucho menos eficaz si
solamente se consideran los resultados a 250 mg/kg de peso
corporal.
En conjunto, las ratas parecían tolerar bien los
compuestos. Los pesos de los riñones no fueron destacables y se
desarrolló una pequeña hipertensión. Los efectos fisiológicos de
los compuestos se probaron solamente a 250 mg/kg. El pirofosfato de
tiamina, pero no la piridoxamina, parece disminuir la eliminación
de creatinina a esta concentración. Ambos parecen aumentar
ligeramente la albuminuria, pero estas mediciones fueron quizás las
menos fiables.
Un típico paciente humano es un adulto de talla
media, peso entre 66 a 77 kg. Típicamente, los pacientes diabéticos
pueden tender a tener sobrepeso y éste puede estar por encima de
112 kg. Las raciones alimenticias recomendadas para un varón adulto
de entre 66 a 77 kg, según se revisó en 1989, requirieron 1,5 mg al
día de tiamina y 2,0 mg al día de vitamina B_{6} (Merck Manual of
Diagnosis and Therapy, 16ª edición (Merck & Co. Rathaway, N.J.,
1992 págs. 938-939).
Sobre la base del enfoque de modelo de rata, un
intervalo de dosis para administración de piridoxamina o de
pirofosfato de tiamina que se pronostica que es eficaz para inhibir
la formación de AGE post-Amadori y que inhibe de
este modo las patologías relacionadas, se situaría en el intervalo
de 1 mg/100 g de peso corporal a 200 mg/100 g de peso corporal. El
intervalo apropiado cuando se administra junto con aminoguanidina
será similar. Calculado para un adulto medio de 75 kg, el intervalo
(a 10 mg/1 kg de peso corporal) puede ser aproximadamente 750 mg
hasta más de 150 g (a 2 g/1 kg de peso corporal). Esto variará
naturalmente según el paciente en particular.
El procedimiento de glucosilación interrumpida,
tal como se describió en los ejemplos anteriores, permite la rápida
generación de productos intermedios de Amadori con proteínas bien
definidas a partir de ribosa y de otros azúcares de pentosa para su
utilización en los estudios in vivo.
Los efectos de 25 mg/kg/día de piridoxamina (PM)
y aminoguanidina (AG) sobre la patología renal provocada al inyectar
a ratas Sprague-Dawley diariamente 50 mg/kg/día de
albúmina de suero de rata con Amadori glucosilado con ribosa (RSA),
AGE-RSA y RSA sin modificar durante 6 semanas. La
hiperfiltración (aumento de la eliminación de creatinina) se
observó transitoriamente en ratas que recibieron
Amadori-RSA y AGE-RSA,
independientemente de la presencia de PM y AG.
Los individuos de cada grupo que recibe
Amadori-RSA y AGE-RSA presentaron
microalbuminuria, pero no se observó en ninguno si se había
administrado conjuntamente PM. La inmunotinción con
anti-RSA puso de manifiesto la tinción glomerular
en ratas tratadas con AGE-RSA y con
Amadori-RSA; y esta tinción disminuyó por
tratamiento con PM pero no por tratamiento con AG. Se observó
además una disminución en glucosaminoglucanos glomerulares
sulfatados (mancha con azul de Alcian a pH 1,0) en ratas tratadas
con RSA glucolado (Amadori y AGE). Esto parece que se debe a los
proteoglucanos de sulfato de heparan reducidos (HSPG), tal como se
demuestra mediante la tinción disminuida con mAb
JM-403 que es específica para la cadena lateral de
HSPG. Estos cambios en HSPG mejoraron por tratamiento con PM, pero
no por tratamiento con AG.
Por lo tanto se concluye que la piridoxamina
puede evitar tanto la pérdida glomerular pseudodiabética del
sulfato de heparan como la deposición glomerular de la albúmina
glucosilada en ratas SD con tratamiento de larga duración con
albúmina glucosilada con ribosa.
Albúmina de suero de rata (RSA) (fracción V,
esencialmente exenta de ácidos grasos al 0,005%; A2018),
\hbox{D-ribosa}, piridoxamina y IgG
anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina de
cabra fueron todos de Sigma Chemicals. El hidrocloruro de
aminoguanidina se adquirió en Aldrich Chemicals.
Se pasó albúmina de suero de rata a través de una
columna con Affi-Gel Blue
(Bio-Rad), columna CL-6B con
heparina-Sefarosa (Pharmacia) y una columna con
afinidad para la unión a la endotoxina (Detoxigel, Pierce
Scientific) para eliminar los posibles contaminantes. A
continuación la albúmina purificada de suero de rata (RSA) se
dializó en tampón de fosfato 0,2 M (pH 7,5). A continuación se
incubó una parte de RSA (20 mg/ml) con ribosa 0,5 M durante 12
horas a 37ºC en la oscuridad. Después de 12 horas de incubación la
mezcla de reacción se dializó en tampón de fosfato de sodio 0,2 M
en frío, durante un periodo de 36 horas a 4ºC (esta diálisis elimina
no solamente la ribosa libre, sino también los productos
intermedios con base de Schiff). En esta etapa del procedimiento de
glucosilación, la proteína con ribosa se clasifica como
Amadori-RSA y es negativa para los AGE antigénicos,
tal como se determina mediante anticuerpos reactivos con proteína
de AGE tal como se describió anteriormente; R618,
AGE-RNasa modificada por antígeno:glucosa). La
proteína con ribosa se divide a continuación en porciones que se
inyectan como: a) Amadori-RSA, b)
Amadori-RSA reducido por NaBH_{4}, c)
AGE-RSA.
La proteína con ribosa que se ha de inyectar como
Amadori-RSA está dializada simplemente contra PBS
frío a 4ºC durante 24 horas. Una porción de
Amadori-RSA en fosfato de sodio 0,2 M se reduce con
NaBH_{4} para formar Amadori-RSA reducido con
NaBH_{4}. En resumen, se redujeron alícuotas añadiendo 5 \mul
de solución patrón de NaBH_{4} (100 mg/ml en NaOH 0,1 M) por mg de
proteína, se incubaron durante 1 hora a 37ºC, se trataron con HCl
para descargar el NaBH_{4} en exceso y a continuación se dializó
varias veces en PBS frío a 4ºC durante 36 horas. Se formó
AGE-RSA reincubando el Amadori-RSA
en ausencia de azúcar durante 3 días. La mezcla se dializó a
continuación frente a PBS frío a 4ºC durante 24 horas. Todas las
soluciones se filtraron (filtro de 22 \mum), se esterilizaron y
se controlaron las endotoxinas por un análisis de lisado de
limulus amoebocyte (E-toxate, Sigma Chemical)
y contenían < 0,2 ng/ml antes de ser congeladas (-70ºC) en
alícuotas individuales hasta el momento de la inyección.
Se utilizaron ratas macho
Sprague-Dawley (Sasco, 100 g). Después de un periodo
de adaptación de 1 semana, las ratas se colocaron en jaulas
metabólicas para obtener una muestra de orina de 24 horas durante 2
días antes de la administración de las inyecciones. A continuación
las ratas se dividieron en grupos experimentales y de referencia y
se administraron inyecciones en la vena de la cola con solución
salina, RSA sin modificar (50 mg/kg), Amadori-RSA
(50 mg/kg), Amadori-RSA reducido con NaBH_{4} (50
mg/kg) ó AGE-RSA (50 mg/kg).
Las ratas inyectadas con
Amadori-RSA y AGE-RSA se dejaron sin
tratar a continuación o se trataron además mediante administración
de aminoguanidina (AG; 25 mg/kg), piridoxamina (PM; 25 mg/kg) o una
combinación de AG y PM (10 mg/kg de cada uno) mediante agua
potable. Se controló semanalmente en las ratas el peso corporal y
la absorción de agua para ajustar las dosis. Al final del estudio
experimental las ratas se colocaron en jaulas metabólicas para
obtener una muestra de orina de 24 horas durante 2 días antes de
sacrificar los animales.
Se determinó la proteína total en las muestras de
orina mediante el análisis Bio-Rad. Se determinó la
albúmina en la orina por ELISA competitivo utilizando albúmina de
conejo con suero anti-rata (Cappell) como anticuerpo
principal (1/2.000) e IgG anti-conejo de cabra
(Sigma Chemical) como anticuerpo secundario (1/2.000). Se analizó
glucosa, cetona, peso específico relativo, sangre, pH, proteína,
nitrito y leucocitos en la orina con Multistix 8 SG (Miles
Laboratories). No se detectó nada notable aparte de alguna
proteína.
Se realizaron mediciones de creatinina con un
analizador II de cratinina Beckman. Se recogieron muestras de
sangre mediante punción en el corazón antes de la terminación y se
utilizaron en la determinación de la eliminación de creatinina,
glucosa en sangre (glucosaoxidasa, Sigma Chemical), fructosamina
(nitroazul tetrazolio, Sigma Chemical) y Hb glucosilada (columnas,
Pierce Chemicals). Se inspeccionaron visualmente la aorta, el
corazón, ambos riñones y la cola de la rata y a continuación se
eliminaron rápidamente después de perfundir con solución salina a
través del ventrículo derecho del corazón. Se congelaron
rápidamente un riñón, la aorta, la cola de la rata y los 2/3
inferiores del corazón y a continuación se guardaron permanentemente
a -70ºC. El otro riñón se seccionó eliminando ambos extremos
(córtex) para ser congelado rápidamente, con las porciones
restantes del riñón que se seccionó en tercios en dos porciones que
se colocaron en formalina neutra tamponada y el tercio restante se
picó y se colocó en glutaraldheído al 2,5%/paraformaldehído al
2%.
Después de la perfusión con solución salina las
secciones del riñón se fijaron en formalina neutra tamponada al 10%
enfriada en hielo. Las secciones de tejido empapadas en parafina de
todos los grupos de ratas (n = 4 por grupo), se procesaron para
tinción con hematoxilina de alumbre de Harris y eosina (H&E),
ácido peryódico/reactivo de Schiff (PAS) y manchas de azul de Alcian
(pH 1,0 y pH 2,5) para examen histológico. Dos investigadores
puntuaron las secciones de azul de Alcian a ciegas.
Se fijaron los tejidos en glutaraldheído al
2,5%/paraformaldheído al 2% (cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,4), se
fijaron posteriormente durante 1 hora en tetróxido de osmio
tamponado (1,0%) teñido previamente en acetato de uranilo al 0,5%
durante 1 hora y empapado en resina Effapoxy. Se examinaron las
secciones ultrafinas por microscopía electrónica.
Se desparafinaron las secciones empapadas en
parafina y a continuación se bloquearon con suero de cabra al 10% en
PBS durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación se
incubaron las secciones durante 2 horas a 37ºC con anticuerpo
primario, anticuerpo anti-AGE de conejo policlonal
purificado por afinidad o anticuerpo de albúmina de suero
anti-rata de oveja policlonal (Cappell). A
continuación se lavaron las secciones durante 30 min con PBS y se
incubaron con anticuerpo secundario, IgG anti-conejo
FITC-cabra purificada por afinidad (H+L) calidad
doble tinción (Zymed) o IgG anti-oveja
rodamina-conejo (global) (Cappell) durante 1 hora a
37ºC. Las secciones se enjuagaron a continuación durante 30 min con
PBS en la oscuridad, preparadas en un medio con soporte acuoso para
inmunocitoquímica (Biomeda), y se taparon rápidamente. Se puntuaron
a ciegas las secciones. Se evaluaron las secciones del riñón por el
número y la intensidad de la tinción glomerular en 5 zonas en torno
a la periferia del riñón. Las puntuaciones se normalizaron para la
puntuación inmunofluorescente por 100 glomérulos con un sistema de
puntuación de 0 a 3.
Se preparó inmunógeno por glucosilación de BSA
(anticuerpos R479) o de RNasa (anticuerpos R618) en 1,6 g de
proteína, en 15 ml durante 60 a 90 días, utilizando glucosa 1,5 M
en fosfato 0,4 M que contiene azida de sodio al 0,05% a pH 7,4 y
37ºC. Se inmunizaron conejos macho blancos de Nueva Zelanda de 8 a
12 semanas mediante administración subcutánea de una solución de 1
ml que contiene 1 mg/ml de proteína glucosilada en adyuvante de
Freund. La inyección primaria utilizó el adyuvante completo y se
realizaron tres refuerzos a intervalos de tres semanas con el
adyuvante incompleto de Freund. Se extrajo sangre a los conejos
tres semanas después del último refuerzo. Se recogió suero por
centrifugación de sangre completa coagulada. Los anticuerpos son
específicos para AGE siendo no reactivos con otras proteínas
naturales o con productos intermedios de Amadori.
Se utilizó el procedimiento general de Engvall
(21) para realizar el ELISA. Se diluyeron muestras de proteína
glucosilada a aproximadamente 1,5 \mug/ml en tampón de carbonato
de sodio 0,1 molar de pH 9,5 a 9,7. La proteína se recubrió toda la
noche a temperatura ambiente sobre una placa de poliestireno de 96
pocillos pipeteando 200 \mul de solución de proteína en cada
pocillo (aproximadamente 0,3 \mug/pocillo). Después del
recubrimiento, se lavó la proteína sobrante de los pocillos con una
solución salina que contenía Tween-20 al 0,05%. Se
bloquearon a continuación los pocillos con 200 \mul de caseína al
1% en tampón de carbonato durante 2 horas a 37ºC seguido de lavado.
Los anticuerpos anti-AGE de conejo se diluyeron a un
valor de 1:350 en tampón de incubación y se incubaron durante 1
hora a 37ºC, seguido de lavado. Para minimizar las lecturas de
fondo, se generó el anticuerpo R618 utilizado para detectar RSA
glucosilado por inmunización contra RNasa glucosilada. Se añadió a
continuación un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina para IgG
de conejo como anticuerpo secundario a un valor de 1:2.000 y se
incubó durante 1 hora a 37ºC, seguido de lavado. El
p-nitrofenolato se controla a 410 nm con un lector
de microplacas Dynatech MR4000.
En este estudio las ratas sobrevivieron a los
tratamientos y no mostraron señales externas de ninguna patología
macroscópica. Alguna de las ratas presentó algunos cambios pequeños
de peso y la cola con costras.
La identificación inicial de la secciones del
riñón con los colorantes PAS y H&E no puso de manifiesto ningún
cambio evidente, y algunas secciones de EM no pusieron de
manifiesto ningún cambio macroscópico en la membrana basal
glomerular (GBM). Sin embargo, en la tinción con azul de Alcian, se
descubrieron diferencias sorprendentes. La tinción con azul de
Alcian está dirigida a grupos cargados negativamente en los tejidos
y se puede hacer selectiva mediante cambios en el pH de tinción. A
pH 1,0 el azul de Alcian es selectivo para los mucopolisacáridos y
a pH 2,5 detecta grupos glucurónicos. Por lo tanto, se detectan
cargas negativas dependiendo del pH del colorante.
A pH 2,5 la tinción con azul de Alcian demostró
que Amadori-RSA (p<0,05) y
AG-RSA (p<0,01) provocaban aumento de coloración
para los glucosaminoglucanos ácidos (GAG) durante los niveles de
referencia (Figura 33). Tanto para AGE-RSA como
para Amadori-RSA, el tratamiento con piridoxamina
(PM) evitó el aumento de la coloración (p<0,05 comparado con las
referencias). En cambio, el tratamiento con aminoguanidina (AG) o
con PM y AG combinados a 10 mg/kg cada uno, no evitó el
aumento.
A pH 1,0 la tinción con azul de Alcian disminuyó
significativamente por AGE-RSA (p<0,001) (Figura
34). Sin embargo, no se observó ninguna diferencia significativa
con Amadori-RSA. Debido a la pálida coloración, el
tratamiento con PM, AG y combinado no se pudo cuantificar.
La tinción glomerular inmunofluorescente para RSA
mostró una coloración elevada con animales inyectados con
Amadori-RSA y AGE-RSA (Figura 35).
Se observó una reducción significativa de este efecto en las ratas
tratadas con PM y no con AG ni con AG y PM combinados.
La tinción glomerular inmunofluorescente para la
nucloproteína del proteoglucano de sulfato de Heparan presentó una
coloración ligeramente reducida en animales inyectados con
Amadori-RSA y AGE-RSA pero no fueron
estadísticamente significativos (Figura 36). Se observó una
reducción de este efecto en las ratas tratadas con PM y no con AG
ni con AG y PM combinados. Sin embargo, la tinción glomerular
inmunofluorescente para la cadena lateral del proteoglucano de
sulfato de heparan presentó una coloración muy reducida en animales
inyectados con Amadori-RSA y
AGE-RSA (Figura 37). Una reducción significativa de
este efecto se observó en las ratas tratadas con PM y no con AG ni
con AG y PM combinados.
El análisis del volumen glomerular medio mediante
puntuación a ciegas demostró que Amadori-RSA y
AGE-RSA producían un aumento significativo del
volumen glomerular medio (Figura 38). Una reducción significativa
de este efecto se observó en el tratamiento de las ratas con PM. No
se observó ningún efecto en el tratamiento con AG ni con AG y PM
combinados a 10 mg/kg de cada uno.
En un esfuerzo para inhibir la formación de los
AGE y el desarrollo de la nefropatía diabética, se trataron con
piridoxamina ratas con diabetes provocada por estreptozotocina. Se
publica ahora que la piridoxamina inhibe el desarrollo de la
nefropatía en la rata diabética, medida por sus efectos en la
albuminuria, proteinuria y creatinina en el plasma; corrige la
dislipidemia en las ratas diabéticas, medida por la inhibición del
aumento del colesterol y triglicéridos en el plasma y corrige los
desequilibrios de oxidorreducción resultantes de la hipoxia o
pseudohipoxia, medidas por cambios en la relación lactato a piruvato
en el plasma. A dosis comparables, la piridoxamina fue menos eficaz
que el prototipo de aminoguanidina inhibidor de AGE en la
protección contra la nefropatía diabética y al contrario de la
dislipidemia y anormalidades metabólicas de la diabetes. Tal como se
utiliza en la presente memoria, ``mamífero diabético'' comprende
tanto los mamíferos que son diabéticos actualmente como los que no
toleran la glucosa y/o presentan una insuficiencia pancreática,
independientemente de su concentración de azúcar en sangre. Se
concluye que ambos inhibidores de AGE protegen contra la neuropatía
diabética y ejercen una amplia gama de efectos sobre la química de
los lípidos y de los hidratos de carbono y en el metabolismo.
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto
de PM y AG en la formación de los AGE y el desarrollo de la
nefropatía en la rata diabética. Al final del experimento de 30
semanas, se observó que el plasma de ratas diabéticas era
visiblemente más lipidemico que la de las ratas de referencia y
esto parece ser una disminución de la lipidemia tanto en los
animales diabéticos tratados con PM como con AG. Se señala que tanto
PM como AG no sólo retardaron el desarrollo de la nefropatía en la
rata diabética por STZ, sino que además inhibieron el aumento del
colesterol y los triglicéridos en el plasma en las ratas diabéticas
e invirtieron el aumento en el lactato del plasma y la relación
lactato/piruvato, indicadora del estado de oxidorreducción alterado
en la diabetes. Se expone también el origen del aumento de la
modificación química del colágeno en los animales diabéticos y la
importancia relativa del sustrato y de la tensión oxidativa y de los
lípidos frente a los hidratos de carbono en la formación de AGE.
Estos resultados sugieren que PM puede ser un agente terapéutico
eficaz para inhibir el desarrollo tanto de la nefrapatía como de la
angiopatía en la diabetes.
Excepto que se indique de otra manera, los
reactivos y enzimas se adquirieron en Sigma Chemical Co., San
Luis.
Estos experimentos se realizaron en ratas hembra
Sprague-Dawley, convertidas en diabéticas por
inyección de STZ. La diabetes se provocó mediante una simple
inyección en la vena de la cola de 45 mg/kg de STZ en tampón de
citrato de sodio 0,1 M, pH 4,5. Se inyectó a los animales de
referencia de forma simulada solamente con tampón. La diabetes se
confirmó cuantificando las concentraciones de glucosa en sangre a
los 2 y 3 días después de la inyección de STZ. Los animales con
glucosa en el plasma superior a 16 mM se clasificaron como
diabéticos. Las ratas diabéticas se dividieron al azar en un grupo
diabético sin tratar (n = 12) y dos grupos diabéticos con
tratamiento, recibiendo ambos PM (n = 13) ó AG (n = 12) a 1 g/l en
agua potable. Se incluyeron dos grupos de referencia no diabéticos
uno sin recibir tratamiento (n = 13), el otro recibiendo
PM(HCl)_{2} a 2 g/l en agua potable (n =12); la
dosis más alta de PM en el grupo de referencia tratado con PM se
diseñó para compensar, en parte, el menor consumo de agua de los no
diabéticos comparado con el de los animales diabéticos. Todos los
animales se alojaron individualmente en un ciclo
luz-oscuridad de 12 horas cada uno y tuvieron
acceso libre al alimento y al agua. Para mantener el peso corporal y
limitar la hiperglucemia, los animales diabéticos recibieron 3 UI
de insulina ultralenta (Humulin U, Eli Lilly) tres veces por
semana; ésta se aumentó hasta 5 UI después de la semana 15 para
ajustarse al aumento del peso corporal
Se evaluó la evolución de la nefropatía mediante
mediciones mensuales de albúmina y de proteína total en la orina y
de creatinina en el plasma. Para las mediciones en la orina, las
ratas se alojaron en jaulas metabólicas para ratas (Nalgene, Nalge
Company, Rochester, NY) durante 24 horas. Se añadieron varias gotas
de toleno al vaso de recogida de orina para prevenir el desarrollo
bacteriano. Todos los análisis de proteínas y metabolitos en el
plasma y en la orina se realizaron mediante adaptaciones de los
procedimientos actuales en microplacas, utilizando un lector de
placas multietiqueta modelo 1420 de Wallac Victor (Wallac, Inc.,
Gaithersburg, MD). Los experimentos de control demostraron que ni
PM ni AG, a las concentraciones presentes en el plasma o en la
orina, producían interferencia en ninguno de los análisis, excepto
para la proteína en la orina (véase a continuación).
La albúmina en la orina se analizó
cuantitativamente por un análisis de ELISA. El antisuero de conejo
para albúmina de rata y la IgG anti-conejo de cabra
conjugada con peroxidasa del rábano picante (HRP) se adquirieron en
ICN Biomedical Research Products, Costa Mesa, CA. En resumen, se
recubrieron los pocillos con 50 ng de albúmina de rata (Sigma, San
Luis) en tampón de carbonato de sodio 0,1 M, pH 10,4, toda la noche
a 4ºC. En la etapa de competencia, se incubó 100 \mul de muestra
patrón o de orina diluida con 100 \mul de antisuero de albúmina
de anti-rata de conejo durante 3 horas a temperatura
ambiente en un agitador de microplaca. Después del lavado, se
aplicó la IgG anti-conejo de cabra conjugada con
peroxidasa del rábano picante (200 \mul) durante 1 hora a 25ºC en
agitación, y la placa se desarrolló con 200 \mul de reactivo ABTS
(2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido
sulfónico) durante 45 minutos a temperatura ambiente, y se midió la
absorbancia a 405 nm.
Se determinó la proteína total en la orina al
final del experimento utilizando el equipo Sigma
Microprotein-PR. En resumen, se añadió una alícuota
de muestra o del patrón a la solución del reactivo, que contiene
rojo de pirogalol y molibdato de sodio, se incubó durante 3 minutos
a 37ºC y se midió la absorbancia a 570 nm. Se aplicó una corrección
(< 10%) para el contenido en PM o AG de la muestra. Se determinó
la concentración de creatinina en el plasma por el procedimiento
del ácido pícrico de Jaffé, utilizando el equipo Sigma nº
555-A. En resumen, se mezclaron 20 \mul de muestra
o de patrón con 200 \mul de solución de picrato. Se leyó la
absorbancia a 490 nm antes y después de la adición del reactivo
ácido.
Se cuantificaron el colesterol total y los
triglicéridos mediante análisis enzimáticos, colorimétricos de
punto final utilizando equipos Sigma para colesterol total (nº 352)
y triglicéridos totales (nº 37, GPO Trinder), incluyendo los
calibradores para ambos análisis. Los ácidos grasos libres se
cuantificaron como complejos orgánicos solubles de cobre, como
describe Noma et al. (1973) (Noma et al., 1973.
Clin. Chem. Acta 43:317-320). El
glicerol se cuantificó por análisis enzimático espectrométrico
utilizando glicerol quinasa y glicerol 3-fosfato
deshidrogenasa, como describe Bergman (Bergman, 1974. Assay of
glycerol-phosphate dehydrogenase. En Methods of
Enzymatic Analysis, vol. 3. Bergman, H.V. Berlín: Verlag Chemie.
1404-1408).
Se cuantificaron espectrofotométricamente el
lactato, el piruvato y el \beta-hidroxibutirato,
utilizando análisis ligados a NADH/NAD^{+} (equipos de Sigma nº
826, 726 y 310, respectivamente). Se cuantificó el acetoacetato por
inversión del análisis del \beta-hidroxibutirato
utilizando la sal de litio del ácido acetoacético,
\beta-hidroxibutirato deshidrogenasa de tipo II y
NADH, como describe Li et al. (Li et al., 1980.
Clin. Chem. 26:1713-1717).
Se cortó en secciones de 2 milímetros de espesor
un lado del riñón derecho utilizando una serie de cuchillas
paralelas. Se seleccionó sistemáticamente la mitad de las secciones
sin sesgo y se colocaron en formalina. Se deshidrataron estas
secciones mediante una serie de alcoholes y se empaparon en
JB-4™ (Polysciences, Inc. Warrington PA). A partir
de cada bloque con JB-4™, se cortó una sección de
cinco micrómetros de espesor, se coloreó con azul de toluidina y se
utilizó para la determinación de volumen glomerular. A partir de las
rodajas no seleccionadas, los pequeños bloques de córtex se fijaron
en glutaraldehído al 2,5% en tampón de Millonig, mediante una serie
de alcoholes y se empaparon en PolyBed 812® (Polysciences, Inc.
Warrington PA). Para seleccionar glomérulos sin sesgo, se cortaron
secciones de un micrómetro de espesor a partir de los bloques
PolyBed 812® y se colorearon con azul de toluidina. Se seleccionó
la mayoría de los glomérulos centrales por microscopía electrónica.
Se cortaron secciones de plata-oro utilizando un
ultramicrotomo Reichert Ultracut E, se colocaron sobre unas
cuadrículas con ranuras recubiertas de formvar y coloreadas con
acetato de uranilo y citrato de plomo. Se obtuvieron imagenes
utilizando un microscopio electrónico JEOL 100CX. Se utilizaron
tres glomérulos de cada animal para medir los parámetros por
microscopía electrónica.
Para la medición del volumen glomerular se
utilizó un microscopio Olympus BH-2 ajustado con un
pequeño espejo unido al monocular para proyectar una imagen sobre
la parte superior del banco. Se seleccionaron sistemáticamente los
campos de las secciones JB-4™ sin sesgo moviendo la
platina del microscopio en incrementos de 2,5 mm. Se midió el área
de todos los perfiles glomerulares dentro de cada campo
superponiendo una cuadrícula de puntos sobre la imagen proyectada.
Se contó el número de puntos que alcanza cada perfil glomerular. Se
calculó el área glomerular media mediante la ecuación, Área =
(\sumP/\sumG) \times (5.000/150)^{2} en la que
\sumP era la suma de puntos que alcanzan los perfiles
glomerulares y \sumG era el número de perfiles medido, 5.000 era
la distancia comprendida entre los puntos de la cuadrícula en
micrómetros y 150 era el aumento de las imágenes proyectadas. El
volumen se calculó por el procedimiento de Weibel y Gómez (Weibel y
Gómez, 1962, J. Appl. Physiol.
17:343-348) utilizando la ecuación Volumen =
Área^{3/2} \times 1,38/1,01 en la que 1,38 es un factor de
corrección para las partículas esféricas y 1,01 es un factor de
corrección para la variación de volumen entre los glomérulos. Para
la determinación del volumen glomerular se midió una media de 65
perfiles. Se utilizó una sección de calibración para confirmar que
el aumento de las imágenes proyectadas era de 150\times.
Para la medición de la anchura de la membrana
glomerular basal (GBM), se obtuvieron sistemáticamente imágenes sin
sesgo utilizando posiciones preestablecidas de los controles de la
pletina de los microscopios. Se obtuvo una imagen de
aproximadamente el 25 por ciento de cada perfil glomerular para un
aumento final de 15.000\times. Se midió la anchura de la membrana
glomerular basal utilizando el procedimiento de corte ortogonal
(Jensen et al. 1979, J. Microscopy
115:19-33). Se realizó una media de 169
mediciones de la membrana glomerular basal por animal. Para la
medición por unidad de volumen del mesangio por glomérulo [Vv
(Mes/Glom)], se obtuvieron imágenes y se empalmaron para formar un
montaje del perfil glomerular completo en una ampliación final de
3.900\times. Se colocó una cuadrícula de puntos gruesos y finos
sobre el montaje. Se contó el número de puntos finos que se
encuentra sobre el mesangio y el número de puntos gruesos que se
encuentra sobre el glomérulo (Weibel, E.R. 1979. Practical
Methods for Biological Morphometry, Stereological Methods, vol.
I. Nueva York, Academic Press. 332 págs.). Vv (Mes/Glom) =
\sumFP/(\sumCP \times 4) en la que \sumFP es el número de
puntos finos que se encuentran sobre el mesangio y \sumCP es el
número de puntos gruesos que se encuentra sobre los tres glomérulos.
La cuadrícula se construyó de tal modo que hubiera cuatro puntos
finos por cada punto grueso. Una media de 174 puntos gruesos
alcanzaron el glomérulo y 164 puntos finos alcanzaron el mesangio
por cada animal. Se fotografió una cuadrícula de calibración tanto
a gran como a bajo aumento de cada carrete de película para
determinar el aumento exacto de cada imagen medida. El volumen
total del mesangio se calculó multiplicando el volumen glomerular
por Vv(Mes/Glom).
Se realizaron análisis estadísticos utilizando
Sigma Stat para Windows V1.00 (SPSS, Inc., Chicago, IL). Se
calcularon los valores p mediante análisis
Mann-Whitney Rank Sum no paramétrico. Se realizaron
análisis de correlación por el procedimiento Product Moment de
Pearson.
Se utilizaron las concentraciones de albúmina en
la orina, de excreción de proteínas y de creatinina en el plasma
como mediciones de la nefropatía diabética (Fig. 39). Las
referencias de los no diabéticos tratados con PM no se
distinguieron de las referencias de los no diabéticos no tratados en
todo el experimento, sin embargo el aumento de albuminuria a lo
largo del tiempo en todos los grupos diabéticos, en animales
diabéticos sin tratar presenta los aumentos mayores en albuminuria.
A las 23 semanas de la diabetes, los tres grupos diabéticos se
diferencian significativamente, entre sí y entre los controles no
diabéticos, con respecto a la albuminuria (Fig. 39A). PM
proporcionó una protección significativamente mayor contra la
albuminuria que AG. Como se muestra en la Fig. 39B, los valores de
creatinina en el plasma también comienzan a aumentar por encima de
lo normal a la 17ª semana aproximadamente. Como se observa en la
albuminuria y proteinuria, tanto PM como AG moderaron el aumento en
la creatinina del plasma, aunque PM fue significativamente más
eficaz que AG. Los efectos sobre la albuminuria se reflejaron por
las diferencias en la proteinuria, se cuantificaron al final del
experimento (Fig. 39C), aunque la albuminuria parece ser el
indicador más sensible de la nefropatía.
En la necropsia se observó que la sangre de los
animales diabéticos no tratados era visiblemente más lipidémica que
la sangre de los animales de referencia y tratados con PM ó AG. El
análisis de lípidos en el plasma (Fig. 40) demostró un aumento
sustancial de lipidemia en los animales diabéticos no tratados y
una corrección sustancial de la hiperlipidemia tanto en PM como en
AG. Los triglicéridos (Fig. 40A) aumentaron hasta una media de
\sim
\hbox{700 mg/dl} en ratas diabéticas, comparados
con los 100 mg/dl en las referencias no diabéticas y se redujeron a
medias de 220 y 350 mg/dl en PM y AG, respectivamente. El
colesterol en el plasma (Fig. 40B) aumentó en \sim 50% y se
normalizó mediante PM y se corrigió en parte mediante AG. Aunque el
aumento en la lipidemia se puede atribuir a la disminución de
absorción de lipoproteína de baja densidad en los tejidos
periféricos a causa de un defecto en la actividad de la lipoproteína
lipasa en la diabetes, existe además una indicación de aumento de
lipólisis, basado en aumento tanto de ácidos grasos como de
glicerol en el plasma. Como se muestra en las Figuras 40C y 40D,
las concentraciones en el plasma de ácido graso libre y de glicerol
aumentaron 2 a 3 veces en las ratas diabéticas y se normalizaron
aproximadamente al 50% mediante tratamiento con PM ó AG.
Las alteraciones en el metabolismo de los lípidos
pueden ser el resultado de desequilibrios de oxidorreducción
provocados por la glucosa (pseudohipoxia) (Williamson et al.
1993, Diabetes 42:801-813) o por
disminución de la oxigenación del tejido (Mayrovitz y Larsen, 1996.
Microvasc. Res. 52:115-126; Tesfaye
et al., 1994. Diabetologia
37:847-854) (hipoxia) en la diabetes. Estos
cambios se reflejan en un cambio de la relación citosólica de
NADH/NAD^{+}, que se puede evaluar indirectamente determinando la
relación de lactato a piruvato en el plasma. Como se muestra en la
Fig. 41, los animales diabéticos presentaron concentraciones
significativamente más altas tanto de lactato como de piruvato en el
plasma y también un aumento de la relación lactato/piruvato. PM, y
en menor extensión AG, corrigieron en parte estas deficiencias en
el metabolismo oxidativo de los carbohidratos. Se ha medido además
las concentraciones de
\hbox{ \beta -hidroxibutirato} y de
acetoacetato en el plasma, utilizadas algunas veces como indicar
de estado de oxidorreducción mitocondrial. Las concentraciones de
estos metabolitos oscilaron en gran medida entre los animales.
Aunque existieron claras tendencias hacia un aumento de
\beta-hidroxibutirato y de acetoacetato en los
animales diabéticos y una indicación de que tanto PM como AG
corrigieron estos cambios, las diferencias no alcanzaron
importancia estadística.
Como se muestra en la Tabla 1, los pesos medios
del riñón y del hígado aumentaron en las ratas diabéticas, en
términos absolutos y como fracción de la masa corporal total. PM y
AG invirtieron en parte estos cambios en el peso del tejido. Se
observaron quistes esporádicos en los riñones de animales
diabéticos, pero no aumentaron en los grupos tratados con el
fármaco. No existió ninguna prueba de aumento en los tumores en los
órganos principales, ni de otras patologías raras asociadas tanto a
la terapia con PM o con AG. Cambios significativos en la morfología
renal fueron observables en un periodo de 7 meses de duración de
diabetes en la rata, incluyendo un aumento del 30% en el espesor de
la membrana glomerular basal (GBM), un aumento del 60% en el volumen
glomerular, un aumento del 25% de la fracción de volumen del
mesangio y un aumento del 100% en el volumen del mesangio (Tabla
2). PM produjo una significativa, pero parcial corrección del
aumento del volumen glomerular y existió una tendencia de PM hacia
la reducción del espesor de GBM y del volumen del mesangio. El
aumento en la fracción de volumen del mesangio en las ratas
tratadas con PM puede ser el resultado de una disminución
desproporcionada del volumen glomerular en los animales tratados
con PM. No se evaluaron los efectos de AG sobre estos
parámetros.
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|}\hline
Grupo \+ Riñón \+ Riñón \+ Hígado \+ Hígado \\ \+ (g) \+
(g/100 g) \+ (g) \+ (g/100 g) \\\hline Referencia \+ 0,80 \pm
0,04 \+ 032 \pm 0,02 \+ 7,96 \pm 0,5 \+ 3,37 \pm 0,22
\\\hline Diabético sin tratar \+ 1,53 \pm 0,21 \+ 0,73 \pm
0,23 \+ 16,7 \pm 3,4 \+ 7,03 \pm 0,94 \\\hline Diabético +
PM \+ 1,25 \pm 0,30 \+ 0,59 \pm 0,05 \+ 12,8 \pm 2,1 \+
6,00 \pm 0,59 \\\hline Diabético + AG \+ 1,31 \pm 0,18 \+
0,59 \pm 0,07 \+ 14,0 \pm 2,6 \+ 6,20 \pm 0,99 \\\hline
Valor p: D + PM vs. D \+ NS \+ < 0,001 \+ = 0,0025 \+ =
0,002 \\\hline Valor p: D + AG vs. D \+ NS \+ = 0,002 \+ <
0,05 \+ > 0,05
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|c|c|c|c|}\hline
\+ Espesor de \+ Volumen \+ Fracción de \+ Volumen del \\ \+
GBM \+ glomerular \+ volumen del \+ mesangio \\ \+ \+ \+
mesangio \+ \\\hline Grupo \+ \+ \+ \+ \\\hline No diabético \+
201 \pm 14,9 ^{B} \+ 1,30 \pm 0,10 ^{B} \+ 0,19 \pm
0,03 ^{C} \+ 0,25 \pm 0,05 ^{B} \\ (n=12) \+ \+ \+ \+ \\\hline
Diabético \+ 229 \pm 19,4 \+ 2,08 \pm 0,27 \+ 0,24 \pm
0,06 \+ 0,52 \pm 0,22 \\ (n=13) \+ \+ \+ \+ \\\hline Diabético
+ PM \+ 225 \pm 25,1 \+ 1,68 \pm 0,08 ^{C} \+ 0,27 \pm
0,06 \+ 0,46 \pm 0,12 \\ (n=13) \+ \+ \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
^{A} Los espesores de la membrana glomerular
basal y las fracciones de volumen del mesangio se midieron por
microscopía electrónica y los volúmenes glomerular y del mesangio
por microscopía óptica, tal como se describe en Materiales y
procedimientos.
^{B}p < 0,001 frente a animales diabéticos
no
tratados.
^{C}p < 0,025 frente a animales diabéticos
no
tratados.
Debido a que los lípidos aumentaron
significativamente en las ratas diabéticas y además disminuyeron
por PM y AG, y debido a que los lípidos están reconocidos como
fuentes de CML (13), CEL (14) y productos fluorescentes, p. ej.: en
lipofuscina y estructuras reticuladas (excepto para pentosidina) en
las proteínas tisulares, se examinó la relación entre los lípidos,
la nefropatía diabética y la modificación química de las proteínas
de la rata diabética. Como se muestra en la Figura 42, existe una
fuerte correlación entre CML en el colágeno de la piel y los
triglicéridos del plasma, y tanto CML como los triglicéridos están
correlacionados con la microalbuminuria. En la Tabla 3 se resumen
otras correlaciones. Ninguna de estas mediciones está
correlacionada con la glucemia o con la glucosilación de proteínas,
ya que estos parámetros no están afectados o, en el caso de la
glucosilación del colágeno, sólo ligeramente afectados por la
terapia del fármaco.
(Tabla 3 pasa a página
siguiente)
^{A}Derivados estadísticos procedentes del
cálculo Product Moment de
Pearson.
Estos estudios se diseñaron para evaluar la
eficacia de PM en la formación de los AGE y el desarrollo de la
nefropatía en ratas diabéticas por STZ. En el presente informe se
muestra que PM retardó el desarrollo de la nefropatía en las ratas
diabéticas, tal como se determinó por las disminuciones tanto en la
concentración de albúmina en la orina como de creatinina en el
plasma. La proteinuria, determinada al final del estudio, disminuyó
también de forma significativa en las ratas tratas con PM. Se
observaron efectos similares tanto para PM como para AG, aunque PM
fue significativamente más eficaz para inhibir los aumentos de
microalbuminuria y creatininemia y para corregir la dislipidemia y
los desequilibrios de oxidorreducción en las ratas diabéticas.
Estos efectos terapéuticos se consiguieron sin cambios
significativos en la glucemia o en la hemoglobina glucosilada en
las ratas diabéticas.
Todos los animales diabéticos presentaron cambios
característicos en la estructura renal, incluyendo hipertrofia
renal (Tabla 1), el espesamiento acelerado de las membranas
glomerulares basales (GBM), el aumento del volumen glomerular y la
expansión del mesangio (Tabla 2). Aunque PM (y AG) inhibieron
parcialmente la ganancia de peso del riñón, PM presentó efectos
limitados sobre los cambios ultraestructurales en el riñón (Tabla
2). No se determinaron en este estudio los efectos de AG sobre la
morfología renal, pero otros estudios sobre tratamiento de AG de la
rata diabética por STZ han producido resultados mixtos. Un estudio
describió la inhibición del espesamiento de GBM en la rata de Lewis
(Ellis y Good, 1991. Metabolism
40:1016-1019), aunque existen dos informes
de que AG no tuvo efecto sobre el espesamiento de GBM en las ratas
Sprague Dawley (Oturai et al., 1996. APMIS
104:259-264; Soulis-Liparota
et al., 1991. Diabetes
40:1328-1334).
En uno de los últimos estudios, sin embargo, AG
no inhibió parcialmente la expansión del mesangio
(Soulis-Liparota et al., 1991.
Diabetes 40:1328-1334). En un informe
relacionado, AG inhibió el aumento de espesamiento de la membrana
glomerular basal y el volumen fraccional del mesangio en ratas
gruesas de Otsuka Long-Evans Tokushima, modelo para
la diabetes de tipo 2 (Yamauchi et al. 1997. Diab. Res.
Clin. Pract. 34:127-133). Los potentes
efectos de los inhibidores de AGE en la nefropatía diabética, pero
efectos variables en la morfología renal, sugieren que se pueden
impulsar cambios morfológicos renales por hiperfiltración o
hipertensión (no determinadas) u otros aspectos de la hemodinámica
renal que no se determinaron en estos experimentos. Estudios futuros
sobre cambios celulares en el riñón diabético, p. ej.: cambios en
el número de podocitos y de células del mesangio, pueden
proporcionar mejor percepción en la relación entre los cambios
estructurales y funcionales en el riñón diabético.
Aunque se han descrito anteriormente los efectos
de AG que disminuyen los lípidos en pacientes diabéticos (Bucala
et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci.
91:9441-9445), la magnitud de los efectos de
PM y AG sobre el colesterol y los triglicéridos del plasma en ratas
diabéticas por STZ fue sorprendente. Estos cambios, junto con los
efectos sobre los ácidos grasos libres del plasma y el glicerol,
indican que, además de su actividad inhibidora para AGE, AG y PM
afectan las vía centrales del metabolismo de los lípidos. Ya que
existe poca similitud estructural entre AG y PM, es poco probable
que los efectos de PM provengan de su conversión en fosfato de
piridoxal u otras vitaminas B_{6}.
La hiperglucemia es conocida por provocar cambios
en las relaciones intracelulares de coenzimas de oxidorreducción,
tanto in vitro como in vivo, que conducen a un estado
de pseudohipoxia (Williamson et al. 1993. Diabetes
42:801-813). La magnitud del aumento del
lactato en el plasma y de la relación lactato:piruvato en las ratas
diabéticas sugiere un cambio de oxidorreducción o hipoxia en los
tejidos principales del cuerpo, p. ej.: músculos o nervios. Estos
cambios pueden resultar de la disminución de la perfusión y de la
oxigenación del tejido periférico y desempeñan un papel importante
en el desarrollo de la microangiopatía diabética y la neuropatía
tanto en los modelos humanos como animales (Mayrovitz y Larsen,
1996. Microvasc. Res. 52:115-126;
Tesfaye et al., 1994. Diabetologia
37:847-854; Cameron y Cotter, 1994. Diab.
Metab. Rev. 10:189-224; Boulton y Malik,
1999. Organ specific vascular changes. En Diabetic
Angiopathy. Toke, J.E., editor. Nueva York: Oxford University
Press. págs. 267-275).
Un informe reciente (Pyke et al., 1999.
Diabetes 48 (Supl. 593 (Res.)) en el que el riñón
diabético es además hipóxico sugiere que la hipoxia puede ser un
mecanismo frecuente que contribuye al metabolismo alterado y al
desarrollo de patología en la diabetes. El aumento resultante en el
metabolismo anaerobio de los carbohidratos sugiere que el
metabolismo aerobio de los lípidos se puede también alterar,
contribuyendo en parte a la hiperlipidemia en la rata diabética. Es
posible que todos estos efectos sean secundarios para la inhibición
de la formación de AGE en el sistema vascular, pero no se pueden
excluir los múltiples mecanismos de acción de los fármacos. La
evaluación de la cinética de los efectos de PM sobre la tensión del
oxigeno en el tejido, la resistencia vascular periférica, las
concentraciones de lípidos y la relación lactato:piruvato en el
plasma de la rata diabética proporcionarán importantes ideas en el
mecanismo de acción del fármaco y en el papel de la hipoxia en el
desarrollo de los cambios metabólicos y funcionales en la rata
diabética por STZ.
Los efectos de PM y AG son consistentes con la
hipótesis de AGE en las complicaciones diabéticas. Ambos fármacos
inhiben la formación de CML y de CEL, atrapando teóricamente los
productos intermedios reactivos de carbonilo implicados en la
formación de AGE, y también retardan el desarrollo de la nefropatía
diabética. Sin embargo, el fallo de PM o de AG que afecta la
formación de pentoxidina, combinado con las fuertes correlaciones
entre triglicéridos y CML, y entre triglicéridos y albuminuria o
cretininemia, sugiere que los lípidos pueden ser importantes tanto
en la formación de los AGE como en el desarrollo de la nefropatía.
De hecho, tanto CML como CEL se forman durante las reacciones de
peroxidación de lípidos (resultados no publicados, y Fu, et
al., 1996. J. Biol. Chem.
271:9982-9986), y se podría argumentar que
la disminución de su concentración en colágeno podría ser un
resultado directo de la disminución de los triglicéridos en el
plasma efectuada por los inhibidores de AGE. Sin embargo, el hecho
de que la pentosidina, producto derivado exclusivamente de los
carbohidratos (Pyke et al., 1999. Diabetes 48 (Supl.
1) 593 (Res.)) aumente tanto en la piel como en el colágeno renal
de las ratas diabéticas indica que la autooxidación y glucoxidación
de los carbohidratos contribuye a la formación de AGE. Aunque ni PM
ni AG evitaron el aumento de pentosidina en el colágeno de la piel,
esto puede reflejar el hecho de que es más difícil inhibir la
formación de pentosidina, comparada con CML, in vitro (Dyer
et al., 1991. J. Biol. Chem.
266:11654-11660; Litchfield et al.,
1999. Int. J. Biochem. En imprenta). El aumento relativo de
CML, CEL y pentosidina son también similares en los diabéticos
comparado con las ratas de referencia, consistente con su origen a
partir de un precursor común, el cual, en el caso de la
pentosidina, puede ser un carbohidrato natural. Las concentraciones
relativas de CML y de pentosidina en la piel (Degenhardt et
al., en imprenta) y de colágeno renal son también consistentes
con los rendimientos relativos de estos compuestos durante la
modificación del colágeno por la glucosa in vitro (Dyer
et al., 1991. J. Biol. Chem.
266:11654-11660; Litchfield et al.,
1999. Int. J. Biochem. En imprenta), es decir una
concentración 50 a 100 veces más alta de CML, comparada con la de
pentosidina. Por lo tanto, parece más probable que estos tres estos
productos, además de el aumento de fluorescencia y la reticulación
del colágeno diabético, provengan de las reacciones de
glucoxidación.
La dislipidemia está reconocida como un factor de
riesgo para el desarrollo de la nefropatía diabética (Oda y Keane,
1997. Kidney Internat. 52, supl. 2:S36-S38;
Smulders, et al., 1997. Eur. J. Clin. Invest.
27:997-1002), pero además está generalmente
asociada a la nefropatía, independiente de la diabetes (Guijarro y
Keane, 1993. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens.
2:372-379: Saito, T. 1997. Tohoku J. Exp.
Med. 181:321-337). Parece más probable
que las anormalidades en el metabolismo de los lípidos se hubieran
desarrollado al principio en la diabetes, a la vez que el
desarrollo de hiperlipidemia. En este caso, la dislipidemia puede
haber acelerado el desarrollo de la nefropatía, posiblemente por
oxidación localizada de las lipoproteínas atrapadas en el riñón (o
en el sistema vascular) y la posterior formación de productos
finales de lipoxidación avanzada (ALE). Tanto AG (Picard et
al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:6876-6880; Giardino et al., 1998.
Diabetes 47:1114-1120) como PM
(resultados no publicados) se conocen por inhibir la modificación
de las proteínas durante las reacciones de peroxidación de lípidos,
sugiriendo un mecanismo, además de la inhibición de las reacciones
de glucoxidación, mediante las cuales estos fármacos pueden
proporcionar protección contra la nefropatía diabética. Un efecto
concertado en la formación tanto de los AGE como de los ALE puede
conducir a la disminución de la modificación (espesamiento, rigidez)
del colágeno vascular, a la mejora de la perfusión y oxigenación
periféricas, a la normalización del metabolismo de los lípidos y a
la corrección de la dislipidemia. Las relaciones
causa-efecto entre estas patologías, no se pueden
determinar mediante los presentes experimentos y datos disponibles,
sin embargo la medición de los ALE en los tejidos de referencia,
diabéticos y animales diabéticos tratados con PM pueden dejar al
descubierto un intervalo más amplio de efectos de los inhibidores
de AGE en la modificación química de las proteínas y el desarrollo
de complicaciones en la diabetes.
Existen múltiples causas de dislipidemia,
incluyendo factores genéticos, nutritivos y patológicos, además de
una compleja interacción entre estas varias causas de dislipidemia.
Los procedimientos para evitar y/o tratar la dislipidemia pueden
entonces depender de sus factores causales. Se ha informado
anteriormente que la piridoxamina disminuye parcialmente los niveles
elevados de lípidos en el suero producidos por excesiva ingestión
de lípidos (es decir, dieta rica en colesterol) en un modelo de
rata. (Speck, patente nº 5.288.716). Speck no expone otras causas
de hiperlipidemia, tales como el fallo renal o las deficiencias
genéticas en el metabolismo de los lípidos. Antes de los datos
presentados en la presente solicitud, no existía ningún dato para la
utilización de piridoxamina para tratar o prevenir la
hiperlipidemia producida por el metabolismo deficiente de los
lípidos. En particular, Speck et al., no proporcionaron
ninguna orientación con respecto al efecto de la piridoxamina en el
tratamiento o prevención de la hiperlipidemia asociada a la
diabetes, enfermedad conocida por efectuar drásticamente numerosas
vías metabólicas y por presentar una amplia gama de efectos
fisiológicos.
En resumen, se ha demostrado que los inhibidores
PM y AG de AGE inhiben la modificación química de las proteínas de
los tejidos, retardan el desarrollo de la nefropatía e invierten
sustancialmente la dislipidemia en la rata diabética por STZ. Se ha
demostrado también que PM y AG invierten sustancialmente los
desequilibrios de oxidorreducción en la rata diabética por STZ. Los
desequilibrios de oxidorreducción generalizados son indicadores de
pseudohipoxia, hipoxia e isquemia en los tejidos, enfermedades que
desempeñan un importante papel en muchos estados patológicos, que
incluyen, pero no se limitan a, complicaciones diabéticas,
enfermedades neurodegenerativas, tales como la de Alzheimer y la
esclerosis lateral amiotrófica; el síndrome de insuficiencia
cardiocirculatoria, lesiones y enfermedades inflamatorias,
envejecimiento e isquemia tisular. (Véase por ejemplo, Andrus et
al., J. Neurochem. 71:2041-2048 (1998);
Hall et al., J. Neurosci. Res.
53:66-77 (1998); Smith et al., J.
Histochem. Cytochem. 46:731-735 (1998);
Smith et al., J. Neurochem.
70:2212-2215 (1998); Russell et al., Arch.
Biochem. Biophys. 370:236-239 (1999);
Flowers y Zimmerman, New Horizons
6:169-180 (1998); Piedimonte et al., J.
Infect. Disease 176:655-664 (1997). Por
lo tanto, los procedimientos para tratar y prevenir los
desequilibrios de oxidorreducción son útiles para tratar estas
enfermedades.
En general, PM parecía ser comparable a AG en la
inhibición de las modificaciones no enzimáticas del colágeno, pero
significativamente más eficaz para inhibir los cambios bioquímicos
y fisiológicos en las ratas diabéticas. Estos resultados sugieren
una compleja telaraña de interacciones entre la química y
bioquímica alteradas tanto de los carbohidratos como de los lípidos
en la diabetes. Estudios de toxicología animal han demostrado que
PM presenta baja toxicidad y un buen perfil de seguridad y ahora
están en marcha pruebas clínicas en fase I en un esfuerzo para
evaluar la eficacia de PM para el tratamiento de las complicaciones
diabéticas.
Las concentraciones de colesterol y triglicéridos
en el plasma disminuyeron también mediante PM en los estudios con
ratas diabéticas. No se conoce el mecanismo por el cual PM
disminuiría el colesterol y los triglicéridos, pero se sugiere que
PM puede afectar determinadas vías enzimáticas de síntesis y
degradación de colesterol. Por ejemplo, PM puede inhibir la
hidroximetilglutaril-coenzima A
(HMG-CoA) reductasa o el enzima convertidor de la
angiotensina (ACE). La disminución de la creatinina en el plasma y
de la albúmina en la orina, de la formación de AGE en la piel y del
colesterol y triglicéridos totales en un modelo de animal diabético
apoya la hipótesis de que PM es un fármaco versátil capaz de
inhibir varios procesos metabólicos alterados y la alteración de la
proteína asociada al desarrollo de las complicaciones que surgen
tanto de la diabetes como de la dislipidemia.
Además la sugerencia de que la administración de
PM puede demostrar ser útil para el tratamiento de la angiopatía,
también para la prevención de las complicaciones de la diabetes
asociadas a la disfunción vascular, que incluyen neuropatía,
retinopatía y el retraso en la cicatrización de la herida, además
del tratamiento de la angiopatía, hipoxia tisular e isquemia en
pacientes sin diabetes.
Claims (7)
1. Utilización de una cantidad eficaz, para
tratar la hiperlipidemia asociada a la diabetes, de un compuesto de
fórmula general:
en la que R_{1} es CH_{2}NH_{2},
CH_{2}SH, COOH, CH_{2}CH_{2}NH_{2}, CH_{2}CH_{2}SH ó
CH_{2}COOH;
R_{2} y R_{6} son H, OH, SH, NH_{2}, alquil
C_{1-18}, alcoxi o alqueno;
R_{4} y R_{5} son H, alquil
C_{1-18}, alcoxi o alqueno;
Y es N ó C, de manera que cuando Y es N, R_{3}
no es nada, y cuando Y es C, R_{3} es NO_{2} u otro grupo que
cede electrones, y sales de los mismos, para la preparación de un
medicamento para tratar la hiperlipidemia asociada a la diabetes en
un mamífero.
2. Utilización de una cantidad eficaz, para
tratar desequilibrios de oxidorreducción celulares, de un compuesto
de fórmula general:
en la que R_{1} es CH_{2}NH_{2},
CH_{2}SH, COOH, CH_{2}CH_{2}NH_{2}, CH_{2}CH_{2}SH ó
CH_{2}COOH;
R_{2} y R_{6} son H, OH, SH, NH_{2}, alquil
C_{1-18}, alcoxi o alqueno;
R_{4} y R_{5} son H, alquil
C_{1-18}, alcoxi o alqueno;
Y es N ó C, de manera que cuando Y es N, R_{3}
no es nada, y cuando Y es C, R_{3} es NO_{2} u otro grupo que
cede electrones, y sales de los mismos, para la preparación de un
medicamento para tratar el desequilibrio de oxidorreducción celular
en un mamífero diabético.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que el desequilibrio de oxidorreducción celular está producido por
hipoxia o por pseudohipoxia.
4. Utilización según la reivindicación 3, en la
que la hipoxia o la pseudohipoxia produce un aumento de la relación
NADH/NAD.
5. Utilización de una cantidad eficaz, para
tratar la diabetes asociada a la hipercolesterolemia, de un
compuesto de fórmula general:
en la que R_{1} es CH_{2}NH_{2},
CH_{2}SH, COOH, CH_{2}CH_{2}NH_{2}, CH_{2}CH_{2}SH ó
CH_{2}COOH;
R_{2} y R_{6} son H, OH, SH, NH_{2}, alquil
C_{1-18}, alcoxi o alqueno;
R_{4} y R_{5} son H, alquil
C_{1-18}, alcoxi o alqueno;
Y es N ó C, de manera que cuando Y es N, R_{3}
no es nada, y cuando Y es C, R_{3} es NO_{2} u otro grupo que
cede electrones, y sales de los mismos, para la preparación de un
medicamento para tratar la diabetes asociada a la
hipercolesterolemia en un mamífero.
6. Utilización de una cantidad eficaz, para
tratar la diabetes asociada a la hipertrigliceridemia, de un
compuesto de fórmula general:
en la que R_{1} es CH_{2}NH_{2},
CH_{2}SH, COOH, CH_{2}CH_{2}NH_{2}, CH_{2}CH_{2}SH ó
CH_{2}COOH;
R_{2} y R_{6} son H, OH, SH, NH_{2}, alquil
C_{1-18}, alcoxi o alqueno;
R_{4} y R_{5} son H, alquil
C_{1-18}, alcoxi o alqueno;
Y es N ó C, de manera que cuando Y es N, R_{3}
no es nada, y cuando Y es C, R_{3} es NO_{2} u otro grupo que
cede electrones, y sales de los mismos, para la preparación de un
medicamento para tratar la diabetes asociada a la
hipertrigliceridemia en un mamífero.
7. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que el compuesto es piridoxamina.
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