JP6148127B2

JP6148127B2 - ピリドキサール・アミノグアニジン誘導体またはそれらの塩、及び、その製造方法

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Publication number: JP6148127B2
Application number: JP2013185970A
Authority: JP
Inventors: 一智三輪; 敬一郎谷川; 道治杉浦; 暢也稲垣; 新平藤本; 佐藤　雄一; 雄一佐藤; 潔石井; 圭司大脇
Original assignee: Permachem Asia Ltd
Current assignee: Permachem Asia Ltd
Priority date: 2013-09-09
Filing date: 2013-09-09
Publication date: 2017-06-14
Anticipated expiration: 2033-09-09
Also published as: JP2015051956A

Description

本発明は、経口投与した際の吸収性が良好で、安全性の高い血糖低下剤として有用なピリドキサール・アミノグアニジン誘導体またはそれらの塩、及び、その製造方法に関する。

現在の糖尿病の薬物療法では、高血糖状態を抑える血糖降下薬の投与が主流である。ところが、このような薬物療法を行っている糖尿病患者が、網膜症、腎症、神経障害などの糖尿病合併症を発症することが少なくない。
このため、合併症の発症を直接防止できる医薬品の開発が望まれている。

糖尿病合併症の原因として、酸化ストレスの亢進や、タンパク質の非酵素的糖化（グリケーション）による終末糖化産物（Advanced Glycation End-products：以下、これを「ＡＧＥ」と呼ぶことがある）の生成などが深く関与していることが明らかとなっている。
従来、このようなＡＧＥの生成反応を阻害する化合物として、特許文献１，２に記載のピリドキサミン（次式（Ｖ）で表される化合物）をはじめ、いくつかのビタミンＢ₆の誘導体が提案されている。

しかし、上記特許文献に記載されたビタミンＢ₆誘導体では、糖尿病の特徴である多飲や多尿が十分に抑えられないなど、ＡＧＥの生成反応のインヒビターとしては、改良の余地があった。

他方、日本では医薬品としてまだ承認されていないが、ＡＧＥの生成阻害剤としてアミノグアニジン（次式（ＶＩ）で表される化合物）も知られている。
このアミノグアニジンは、体内のビタミンＢ₆と結合しやすいので、長期投与するとビタミンＢ₆欠乏症を起こす虞があった。

これに対し、ビタミンＢ₆欠乏症の虞が無いものとして、上記アミノグアニジンと、前記ビタミンＢ₆の誘導体の一つであるピリドキサールとの付加物であるＰＬ−ＡＧ（次式（ＶＩＩ）で表される化合物）が提案されたものの、非特許文献１に記載するように、ラットでの経口投与実験の結果、腸管からの吸収率が極めて低いことが問題になっている。

特許第３７６９００３号公報特表２００８−５０９１６９号公報

Free Radic. Biol. Med. 35:1392-1403, 2003

本発明は、上記のような状況に鑑み、経口投与した際の吸収性が良好で、安全性の高い血糖低下剤として有用な化合物の提供を課題とする。

本発明者らは、ビタミンＢ₆欠乏症の虞が無いにも拘らず、体内への吸収率が高い化合物について種々検討を行ったところ、４つのピリドキサール・アミノグアニジン誘導体を見出し、それら誘導体や塩に優れた血糖低下作用があることをも見出し、本発明を提案するに至った。

すなわち、本発明は、次式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかで表されるピリドキサール・アミノグアニジン誘導体またはそれらの塩を要旨とする。

また、本発明は、ピリドキサール塩酸塩に、１−アミノ−３−プロピルグアニジンヨウ化水素酸塩、４−メチル−Ｓ−メチルイソチオセミカルバジドヨウ化水素酸塩、３−メチルイソセミカルバジド塩酸塩、モルホリン−４−カルボキシイミドヒドラジドヨウ化水素酸塩のいずれかを加え撹拌した後、
さらに、炭酸水素ナトリウムを加え攪拌し、
析出した固体を、メタノールに加熱溶解し、精製することを特徴とする上式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表されるピリドキサール・アミノグアニジン誘導体の製造方法をも要旨とする。

本発明のピリドキサール・アミノグアニジン誘導体（Ｉ）〜（ＩＶ）およびそれらの塩は、ＡＧＥの生成を効果的に阻害する作用を有しながら、体内のビタミンＢ₆とも結合しないので、長期投与してもビタミンＢ₆欠乏症の虞がない。
したがって、血糖低下剤をはじめ、糖尿病合併症の予防および治療薬としても広範囲な用途が期待され、非常に有用な化合物である。特に、式（ＩＩＩ）で表される誘導体は、抗酸化作用、抗グリケーション作用、吸収されやすさにおいて、総合的に優れている。
また、本発明の製造方法によれば、これら化合物（Ｉ）〜（ＩＶ）を簡便な操作により、容易に合成することができる。

実施例１の工程３で得た化合物（Ｉ）のＮＭＲ分析結果を示す図である。実施例２の工程２で得た化合物（ＩＩ）のＮＭＲ分析結果を示す図である。実施例３の工程２で得た化合物（ＩＩＩ）のＮＭＲ分析結果を示す図である。実施例４の工程２で得た化合物（ＩＶ）のＮＭＲ分析結果を示す図である。実施例１の工程３で得た化合物（Ｉ）のＩＲ分析結果を示す図である。実施例２の工程２で得た化合物（ＩＩ）のＩＲ分析結果を示す図である。実施例３の工程２で得た化合物（ＩＩＩ）のＩＲ分析結果を示す図である。実施例４の工程２で得た化合物（ＩＶ）のＩＲ分析結果を示す図である。実施例１〜４の各化合物の経時的な血中濃度変化を示すグラフである。比較例１〜７の各化合物の経時的な血中濃度変化を示すグラフである。実施例３、比較例１，２，８の各化合物の３つの反応に対するＩＣ₅₀値を示す表である。正常マウス（正常群）と糖尿病マウス（コントロール群、比較例１群、実施例３群）の体重変化を示すグラフである。上記４群の飲水量変化を示すグラフである。上記４群の尿量変化を示すグラフである。上記４群の２０週齢時における尿中8-OHdG値を示すグラフである。上記４群の８〜２０週齢時における随時血糖値を示すグラフである。上記４群の２０週齢時における血漿中の総コレステロール値を示すグラフである。上記４群の２０週齢時における血漿中のトリグリセライド値を示すグラフである。上記４群の２０週齢時における血中HbA_1c値を示すグラフである。

本発明の上式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかで表されるピリドキサール・アミノグアニジン誘導体の塩としては、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、メタンスルホン酸塩、ヨウ化水素酸塩等の酸付加塩が挙げられ、中でも、水溶性が良好な塩酸塩が好ましく、２塩酸塩が特に好ましい。

本発明のピリドキサール・アミノグアニジン誘導体（Ｉ）〜（ＩＶ）の物性を、表１に示す。
表１中、ｃｌｏｇＰとは、水・オクタノール分配係数の予測計算値（Calculated-log P）であり、ＴＰＳＡ（Topological Polar Surface Area）とは、分子表面の極性分布の予測計算値である。
一般的に、ｃｌｏｇＰが大きいほど脂溶性（疎水性）が強い。また、ＴＰＳＡが１４０以上だと生体内への吸収が悪くなると言われている。

また、本発明のピリドキサール・アミノグアニジン誘導体（Ｉ）〜（ＩＶ）は、シッフ塩基というユニークな構造を有する。シッフ塩基は、生体内でも徐々に分解していくので、安全性が高い医薬品となり得るものである。
また、いわゆる活性酸素の一つであるヒドロキシラジカル（・ＯＨ）を除去する作用や、強い銅イオン（Ｃｕ²⁺）キレート作用を有するゆえ、抗酸化作用（酸化反応を阻害する作用）に優れている。

上記４つのピリドキサール・アミノグアニジン誘導体（Ｉ）〜（ＩＶ）の中では、抗酸化作用、抗グリケーション作用、および吸収されやすさ等を総合的に判断すると、式（ＩＩＩ）で表される誘導体が好ましく、より好ましくは、当該誘導体（ＩＩＩ）の２塩酸塩である。

実施例１
本発明に係るピリドキサール・アミノグアニジン誘導体のうち、３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（１−アミノ−３−プロピル）グアニジン≪式（Ｉ）≫を、以下のようにして合成した。

工程１
チオセミカルバジド９．１１ｇ（０．１ｍｏｌ）をエタノール１８０ｍＬに溶解し、ヨウ化メチル６．２２ｍＬ（０．１ｍｏｌ）を加えて４時間加熱還流した。
反応液を氷冷し、析出した結晶をろ取することにより、Ｓ−メチルイソチオセミカルバジドのヨウ化水素酸塩１５．６ｇ（無色結晶：収率６７％）を得た。

工程２
上記工程１で得られたＳ−メチルイソチオセミカルバジドのヨウ化水素酸塩１．０ｇ（４．０５ｍｍｏｌ）をエタノール４．０ｍＬに溶解し、プロピルアミン１．０ｍＬ（１２ｍｍｏｌ）を加えて４時間加熱還流した。
反応液を減圧下に濃縮し、得られた残さ（褐色オイル：１−アミノ−３−プロピルグアニジンのヨウ化水素酸塩）を精製することなく次の反応（下記工程３）に使用した。

工程３
ピリドキサール塩酸塩４００ｍｇ（１．９６ｍｍｏｌ）を水２ｍＬに溶解し、上記工程２で得られた１−アミノ−３−プロピルグアニジンのヨウ化水素酸塩４８０ｍｇ（１．９６ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌した。シリカゲルをアミノ基でコーティングした薄層クロマトグラフィー（抽出溶媒は、メタノール：酢酸エチル＝１：５）にて、原料の消失を確認した後、炭酸水素ナトリウム３３０ｍｇ（３．９３ｍｍｏｌ）と水１ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌した。
析出固体をろ取し、少量の水で洗浄した後、減圧下に乾燥した。得られた固体をメタノール３０ｍＬに加熱溶解し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（富士シリシア化学（株）製商品名“クロマトレックスＮＨ”。抽出溶媒は、メタノール：酢酸エチル＝１：４）で精製した。
目的物を含むフラクションを濃縮し、残さにエーテル−エタノールを加えて結晶化し、ろ取することにより、３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（１−アミノ−３−プロピル）グアニジン≪式（Ｉ）≫３００ｍｇを黄白色粉末として得た（収率５８％）。

実施例２
本発明に係るピリドキサール・アミノグアニジン誘導体のうち、３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（４−メチル−Ｓ−メチル）イソチオセミカルバジド≪式（ＩＩ）≫を、以下のようにして合成した。

工程１
４−メチル−３−チオセミカルバジド１．０ｇ（９．５ｍｍｏｌ）をエタノール２ｍＬに溶解し、ヨウ化メチル０．５９ｍＬ（９．５ｍｍｏｌ）を加えて３時間加熱還流した。
放冷後、反応液を氷水冷却下に撹拌し、析出した結晶をろ取することにより、４−メチル−Ｓ−メチルイソチオセミカルバジドのヨウ化水素酸塩１．９６ｇ（無色結晶：収率８３％）を得た。

工程２
ピリドキサール塩酸塩４００ｍｇ（１．９６ｍｍｏｌ）を水２ｍＬに溶解し、上記実施例２の工程１で得られた４−メチル−Ｓ−メチルイソチオセミカルバジドのヨウ化水素酸塩４９０ｍｇ（１．９６ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌した。実施例１と同様の薄層クロマトグラフィーにて、原料の消失を確認した後、炭酸水素ナトリウム３３０ｍｇ（３．９３ｍｍｏｌ）と水３ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌した。
析出固体をろ取し、少量の水で洗浄した後、減圧下に乾燥した。得られた固体をメタノール５０ｍＬに加熱溶解し、実施例１と同様のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。
目的物を含むフラクションを濃縮し、残さにエタノールを加えて結晶化し、ろ取することにより、３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（４−メチル−Ｓ−メチル）イソチオセミカルバジド≪式（ＩＩ）≫４９０ｍｇを黄白色粉末として得た（収率９３％）。

実施例３
本発明に係るピリドキサール・アミノグアニジン誘導体のうち、３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（３−メチル）イソセミカルバジド≪式（ＩＩＩ）≫を、以下のようにして合成した。

工程１
エタンイミド酸エチル塩酸塩０．５ｇ（４．０５ｍｍｏｌ）をエタノール４０ｍＬに溶解し、ドライアイス−アセトン冷却下に、ヒドラジン１水和物０．２０ｍＬ（４．０５ｍｍｏｌ）を含むエタノール溶液１０ｍＬを加えて、室温で３０分間撹拌した。
反応液を減圧下に濃縮し、析出した結晶に少量のエタノールを加えてろ取し、少量のエタノールおよびエーテルで洗浄し、減圧下に乾燥することにより、３−メチルイソセミカルバジド塩酸塩０．２８ｇ（淡紅白色結晶：収率６３％）を得た。

工程２
ピリドキサール塩酸塩４００ｍｇ（１．９６ｍｍｏｌ）を水２ｍＬに溶解し、上記実施例３の工程１で得られた３−メチルイソセミカルバジド塩酸塩０．２２ｇ（１．９６ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌した。実施例１と同様の薄層クロマトグラフィーにて、原料の消失を確認した後、炭酸水素ナトリウム０．３４ｇ（３．９３ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３０分間攪拌した。
析出固体をろ取し、減圧下に乾燥した。得られた固体をメタノール６０ｍＬに加熱溶解し、不溶物（メタノールに溶けなかったピリドキサール塩酸塩や３−メチルイソセミカルバジド塩酸塩）をろ過し、ろ液を実施例１と同様のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。
目的物を含むフラクションを濃縮し、残さにエーテル−エタノールを加えて結晶化し、ろ取することにより、３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（３−メチル）イソセミカルバジド≪式（ＩＩＩ）≫２１０ｍｇを黄白色粉末として得た（収率４８％）。

実施例４
本発明に係るピリドキサール・アミノグアニジン誘導体のうち、３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（３−モルホリノ）セミカルバジド≪式（ＩＶ）≫を、以下のようにして合成した。

工程１
実施例１の工程１で得られたＳ−メチルイソチオセミカルバジドのヨウ化水素酸塩２．０ｇ（８．５８ｍｍｏｌ）をエタノール８ｍＬに溶解し、モルホリン２．１ｍＬ（２４．１ｍｍｏｌ）を加えて４時間加熱還流した。
放冷後、反応液を氷水冷却下に撹拌し、析出した結晶をろ取することにより、モルホリン−４−カルボキシイミドヒドラジドのヨウ化水素酸塩２．３１ｇ（橙色結晶：収率９８．９５％）を得た。

工程２
ピリドキサール塩酸塩１４２ｍｇ（０．７０ｍｍｏｌ）を水０．７ｍＬに溶解し、上記実施例４の工程１で得られたモルホリン−４−カルボキシイミドヒドラジドのヨウ化水素酸塩１９０ｍｇ（０．７０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間攪拌した。シリカゲルをアミノ基でコーティングした薄層クロマトグラフィー（抽出溶媒は、メタノール：ジクロロメタン＝１：９）にて、原料の消失を確認した後、炭酸水素ナトリウム１１７ｍｇ（１．３９ｍｍｏｌ）と水０．７ｍＬを加えて、室温で１時間攪拌した。
析出固体をろ取し、少量の水で洗浄した後、減圧下に乾燥した。得られた固体をメタノール５ｍＬに加熱溶解し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（富士シリシア化学（株）製商品名“クロマトレックスＮＨ”。抽出溶媒は、メタノール：ジクロロメタン＝１：９）。
目的物を含むフラクションを濃縮し、残さにエーテル−ヘキサンを加えて結晶化し、ろ取することにより、３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（３−モルホリノ）セミカルバジド≪式（ＩＶ）≫１８７ｍｇを淡黄色粉末として得た（収率９１％）。

実施例１〜４で合成した化合物（式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される化合物）の融点測定、ＮＭＲ分析、ＩＲ分析を行った。結果を下に示す。

〔融点測定〕
融点測定装置（独国ＢＵＣＨＩ社製商品名“Ｂ５４５”）を使用して行った。この結果は、下記の通りであった；

・式（Ｉ）で表される化合物：１６１．０℃
・式（ＩＩ）で表される化合物：２２２．９℃
・式（ＩＩＩ）で表される化合物：２２５．８℃
・式（ＩＶ）で表される化合物：２０７．３℃

〔ＮＭＲ分析〕
日本電子社製商品名“ＪＮＭ−Ａ６００”を使用して測定を行った。この結果は、図１〜４の通りであった。

〔ＩＲ分析〕
Thermo scientific社製商品名“Thermo Nicolet is１０”）を使用して測定を行った。この結果は、図５〜８の通りであった。

実施例５
３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（３−メチル）イソセミカルバジド≪式（ＩＩＩ）≫の２塩酸塩を以下のようにして合成した。

実施例３の工程１，２を繰り返し、３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（３−メチル）イソセミカルバジド≪式（ＩＩＩ）≫を２０ｇ得た。
この３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（３−メチル）イソセミカルバジド≪式（ＩＩＩ）≫１６ｇ（７２ｍｍｏｌ）に、０．２５Ｍ塩酸５７６ｍＬ（１４４ｍｍｏｌ）を加えた。さらに、水１００ｍＬを加えながら７０〜９０℃の湯浴で温めた後、フリーズドライにかけ、粉末状の３−ヒドロキシ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリジン−４−イルメチレン−（３−メチル）イソセミカルバジドの２塩酸塩を得た（黄色結晶）。

比較例１，２
ピリドキサミン≪式（Ｖ）≫の２塩酸塩（Calbiochem社製）を比較例１、ＰＬ−ＡＧ≪式（ＶＩＩ）≫を比較例２とした。

比較例３〜７
実施例１〜４とは異なる構造式を有するピリドキサール・アミノグアニジン誘導体を５つ合成し、比較例３〜７とした。
比較例３〜７は、次式（ＶＩＩＩ）〜（ＸＩＩ）で表される化合物であり、その物性を、表１と同様に、表２に示す。

比較例８
アミノグアニジン≪式（ＶＩ）≫の塩酸塩（Sigma/Aldrich社製）を比較例８とした。

＜経口投与した化合物の血中濃度変化の測定＞
・供試動物
９週齢のWistar系雄性ラット（日本クレア社製）１１個体

・化合物投与、採血、除タンパク
５％アラビアゴム０．７５ｍＬに、実施例１〜４，比較例１〜７の化合物１５ｍｇをそれぞれ加え（２０ｍｇ／ｍＬとする）、乳鉢を用いて混和したものを、５時間絶食させた各ラットに、ゾンデで１００ｍｇ／ｋｇ体重となるように単回経口投与（１．２５〜１．５ｍＬ）した。
投与０．５、１、２、４、６時間後毎に、エーテル麻酔下、眼窩静脈叢より採血を行い、その５０μＬにすばやく０．４５Ｍ過塩素酸１００μＬを加えよく混合し、５分間遠心した。上清をミリポアフィルター（０．２２μｍ）付チューブに入れ、さらに8000×gで５分間遠心した。ろ液を測定時まで冷凍保存し、表３，４に示す測定条件にてＨＰＬＣで各化合物の濃度を測定した。
図９，１０に、各化合物の経時的な血中濃度変化の結果を示す。

図９，１０の各グラフにおいて、横軸は、経過時間（hr）を、縦軸は、血中濃度（μg/mL）を示している（なお、濃度変化の推移をわかりやすく表すため、縦軸の目盛は統一させていない）。各化合物（１００ｍｇ／ｋｇ）が経口投与された時間を、横軸０（ゼロ）とした。
図９から、実施例１〜４の化合物はいずれも最高血中濃度が高く、ラット体内における腸管からの吸収性が著しくよいことがわかった。
中でも、実施例３≪化合物（ＩＩＩ）≫が、経口投与後０．５時間で血中濃度がもっとも高くなり（１０．０μｇ／ｍＬ）、６時間後においても３．１μｇ／ｍＬであった。これに対し、比較例２≪化合物（ＶＩＩ）≫の最高血中濃度は、０．３６μｇ／ｍＬと低いものであった。

＜抗酸化作用と抗グリケーション作用の測定＞
実施例３，比較例１，２，８の各化合物について、３つの反応：１）安息香酸の水酸化反応、２）デオキシリボースの酸化反応、３）タンパク質のグリケーション反応、のＩＣ₅₀（５０％阻害濃度）を求めた。
結果を図１１に示す。
図１１中の数値の単位はμＭであり、“ＮＤ”とは、Not Determinedの略である。
図１１から、３つの全ての反応において、実施例３が最も強い阻害作用を有することがわかった。

＜マウスの体重・飲水量・尿量の測定＞
・供試動物
７週齢のICR系雄性マウス（日本クレア社製）。
７週齢のKK-A^y/Ta雄性マウス（日本クレア社製）。

KK-A^y/Taマウスは、２型糖尿病モデルマウスとして市販されており、ポリジーン支配によると考えられる軽度糖尿病のKKマウスに肥満遺伝子（A^y）を導入したもので、肥満と顕著な糖尿病を特徴とするマウスである。

・飼育方法
正常群として、上記ICR系マウス（ｎ＝１１）を標準飼料（日本クレア社製 “CE-2”）にて、また、KK-A^y/Taマウスを３群に分け、標準飼料飼育群（ｎ＝１１）、比較例１（ピリドキサミン（Ｖ）２塩酸塩）含有飼料飼育群（ｎ＝１０）、実施例３（化合物（ＩＩＩ））含有飼料飼育群（ｎ＝１０）とし、２０週齢まで飼育を行った。なお、実験開始時の４群の各個体の体重はほぼ同じ値（３５〜３７ｋｇ）であった。
マウスはそれぞれ１匹ずつケージに入れ、１２時間の明暗サイクル（8:00〜20:00を明とした）で、温度２５〜２７℃に保たれた部屋で飼育した。水はそれぞれ自由に摂取させ、正常群も含めて１１週齢から１日６ｇ（約１５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）に制限給餌した。

・統計学的処理
実験結果は、平均値±ＳＤ（ｎ＝１０〜１１）で示し、有意差検定には多群間比較においてDunnett検定を用いた。検定は正常群（ICR系マウス標準飼料飼育群）、KK-A^y/Taマウスの標準飼料飼育群（以下、「コントロール群」とする）に対してそれぞれ行い、危険率（Ｐ）が０．０５以下のとき、統計学的に有意とみなした。

上記４群の体重変化の結果を、図１２に示す。
図１２において、横軸は、週齢を、縦軸は、体重（g）を示し、○：正常群、●：コントロール群、□：比較例１（ピリドキサミン（Ｖ）２塩酸塩）含有飼料飼育群（以下、「比較例１群」とする）、■：実施例３（化合物（ＩＩＩ））含有飼料飼育群（以下、「実施例３群」とする）である。
図１２のように、実験終了の２０週齢まで４群は同様の体重増加を示した。

上記４群の飲水量変化の結果を、図１３に示す。
図１３において、横軸は、週齢を、縦軸は、飲水量（mL/day）を示し、○：正常群、●：コントロール群、□：比較例１群、■：実施例３群である。
図１３から、正常群に対し、１０週齢以降では、コントロール群の飲水量は約１．５倍と、糖尿病の特徴である多飲の結果をたどったことがわかる。
これに対し、実験期間を通して、実施例３群は、正常群とほぼ同じ飲水量であった。また、比較例１群は、コントロール群よりも多めの飲水量を示し、多飲が抑えられていなかった。

上記４群の尿量変化の結果を、図１４に示す。
図１４において、横軸は、週齢を、縦軸は、尿量（mL/day）を示し、○：正常群、●：コントロール群、□：比較例１群、■：実施例３群である。
図１４から、正常群に対し、コントロール群の尿量は約３〜４倍と、糖尿病の特徴である多尿の結果となった。
これに対し、実験期間を通して、実施例３群は、正常群とほぼ同じで多尿が抑えられていたことがわかった。また、比較例１群では、コントロール群とほぼ同じで尿量であり、多尿は抑制されなかった。
実施例３群の尿量が少なかったのは、後述の随時血糖値（図１６参照）の上昇が抑制されていることを反映したものと考えられる。

＜マウスの尿中・血中各種成分の測定＞
・供試動物と飼育方法
前述の＜マウスの体重・飲水量・尿量の測定＞と同様とした。

尿中成分は、前記４群の２０週齢時に採取した２４時間尿について調べた。
また、前記４群の血中成分は、後述の随時血糖値以外は、２０週齢時にクロロホルム麻酔下に心臓よりヘパリン採血を行い、血液を1500×gで１５分間遠心して得た血漿について調べた。

１）尿中8-hydroxydeoxyguanosine（8-OHdG）値
高感度8-OHdG Check（日本老化制御研究所製）を用いてELISA法により測定した。なお、体内の8-OHdGは、主にミトコンドリアＤＮＡの酸化傷害で生じるといわれていて、酸化ストレスの指標として測定されるものである。
尿中8-OHdG値の結果を、図１５に示す。
図１５において、縦軸が尿中8-OHdG値（ng/day）である。
図１５から、正常群に対し、コントロール群の尿中8-OHdG値は約２倍に増加しており、酸化ストレス状態にあることが推測できた。実施例３群において、尿中8-OHdG値が有意に抑制されているのに対して、比較例１群ではコントロール群と比べて有意に増加していた。

２）随時血糖値
２週間おきに、１６〜１８時の間に、ジェントレット（三和化学製）を用いて尾静脈に穿刺して出血させ、グルテストネオスーパー（三和化学製）を用いて、血糖を測定した。
血糖値の結果を、図１６に示す。
図１６において、横軸は、週齢を、縦軸は、随時血糖値（mg/dL）を示し、○：正常群、●：コントロール群、□：比較例１群、■：実施例３群である。
図１６から、実施期間（８週齢〜２０週齢）を通して１００〜１１０mg/dLの随時血糖値を示していた正常群に対し、コントロール群では８週齢ですでに３００mg/dLとなり、以後は４００mg/dL前後の高血糖状態を示した。比較例１群も、コントロール群と同様の経過をたどり、血糖上昇の抑制は見られなかったが、実施例３群においては、コントロール群よりも常に低い随時血糖値を維持しており、血糖値の上昇が有意に抑えられていた。

３）血漿総コレステロール値
コレステロール−Ｅテストワコー（和光純薬工業）を用いて測定した。
血漿総コレステロール値の結果を、図１７に示す。
図１７において、縦軸が血漿総コレステロール値（mg/dL）である。
図１７から、コントロール群と比較例１群の血漿総コレステロール値は、正常群とほぼ同じ値であったが、実施例３群は、正常群およびコントロール群よりも有意に低かった。

４）血漿トリグリセライド値
トリグリセライド−Ｅテストワコー（和光純薬工業）を用いて測定した。なお、インスリンの作用不足によって脂肪組織において脂肪分解の促進が起こり、血漿中のトリグリセライド値の上昇をもたらすと言われている。
血漿トリグリセライド値の結果を、図１８に示す。
図１８において、縦軸が血漿トリグリセライド値（mg/dL）である。
図１８から、正常群と比較して、コントロール群の血漿トリグリセライド値は約２倍に増加しているのに対して、実施例３群は、血漿トリグリセライド値の上昇を有意に抑制していたが、比較例１群には、そのような効果は見られなかった。

５）血中ＨｂＡ_1c（ヘモグロビン・エイワンシー）値
前述のヘパリン採血した血液について、ラピディアオートＨｂＡ_1c（富士レビオ）を用いて測定した。なお、ＨｂＡ_1cとは、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）にグルコース（血糖）が結合したものであり、正常な人の場合、血中ＨｂＡ_1cの正常値は６．２％以下であり、６．５％以上は糖尿病とされている。
血中ＨｂＡ_1c値の結果を、図１９に示す。
図１９において、縦軸が血中ＨｂＡ_1c値（％）である。
図１９から、正常群に対し、コントロール群と比較例１群の血中ＨｂＡ_1c値は約２倍に増加しており、図１６に示した随時血糖値の増加を裏付ける結果となった。実施例３群は、血中ＨｂＡ_1c値の上昇を有意に抑制し、コントロール群より随時血糖値が低かったこととよく符号していた。

本発明のピリドキサール・アミノグアニジン誘導体は、経口投与における吸収性が良好なので、糖尿病合併症の発症・進行を抑える医薬品になる可能性が高いものである。
また、本発明のピリドキサール・アミノグアニジン誘導体はシッフ塩基であるゆえ、生体内で徐々に分解していくと考えられ、安全性が高い医薬品になり得るものである。

Claims

次式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかで表されるピリドキサール・アミノグアニジン誘導体またはそれらの塩。
ピリドキサール塩酸塩に、１−アミノ−３−プロピルグアニジンヨウ化水素酸塩、４−メチル−Ｓ−メチルイソチオセミカルバジドヨウ化水素酸塩、３−メチルイソセミカルバジド塩酸塩、モルホリン−４−カルボキシイミドヒドラジドヨウ化水素酸塩のいずれかを加え撹拌した後、
さらに、炭酸水素ナトリウムを加え攪拌し、
析出した固体を、メタノールに加熱溶解し、精製することを特徴とする請求項１に記載のピリドキサール・アミノグアニジン誘導体（Ｉ）〜（ＩＶ）の製造方法。