JP3864050B2 - 糖尿病合併症を治療または予防するための医薬組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の背景
本発明は、高次的グリケーション最終産物（ＡＧＥ）、それらの形成、検出、同定、阻害およびその阻害剤の分野にある。
【０００２】
タンパク質加齢および高次的グリコシル化最終産物
グルコースおよび他の還元糖による非酵素的グリケーションは、多様な病理学に徐々に影響を及ぼしたタンパク質の重要な後期翻訳修飾である。ゆっくりしたグルコース誘導過程を通して不可逆な非酵素的グリケーションおよび架橋は、糖尿病と関連した多くの合併症をもたらし得る。糖尿病と関連した慢性高血糖症は、網膜症、ネフロパシー、およびアテローム性動脈硬化疾病のような合併症に至る可能性のある慢性の組織損傷を引き起こし得る。（ＣｏｈｅｎおよびＺｉｙａｄｅｈ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：１８３−１９０、１９９６年）。長期真性糖尿病に関連して生じる慢性組織損傷は、非酵素的グリコシル化を介した高次的グリコシル化最終産物（ＡＧＥ）形成を受けた持続する構造タンパク質に結合して蓄積した免疫グロブリンおよび／または抗原による原位置免疫複合体形成からある程度生じることが示された（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１７３９−１７４４、１９８３年）。一次タンパク質標的は、コラーゲンに関連した細胞外マトリクスであると考えられている。タンパク質、脂質、および核酸の非酵素的グリケーションは、自然の加齢の過程で重要な役割を果し得る。最近、タンパク質高次的グリケーションは、アルツハイマー病におけるβ−アミロイドの沈着および神経細線維の混乱の形成に、そしておそらくアミロイドーシスに関与する他の神経変性疾病に関連している（ＣｏｌａｃｏおよびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ５：８５９−８６１、１９９４年）。グリケート化タンパク質は、毒性で、抗原性で、そして特定の細胞レセプターによる取込の後、細胞の損傷応答を誘発する能力があることも示された（例えば、Ｖｌａｓｓａｒａ、ＢｕｃａｌａおよびＳｔｒｉｋｅｒ、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０：１３８−１５１、１９９４年；Ｖｌａｓｓａｒａら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：１１７０４−１１７０８、１９９４年；ＤａｎｉｅｌｓおよびＨａｕｓｅｒ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４１：１４１５−１４２１、１９９２年；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４３：８３６−８４１、１９９４年；Ｃｏｈｅｎら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４５：１６７３−１６７９、１９９４年；Ｂｒｅｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４３：１６９９−１７１２、１９９３年；およびＹａｎら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：７７８７−７７９１、１９９４年参照）。
【０００３】
食品の調理の間の茶色色素の出現は、世界的に認識された現象であり、その化学は、１９１２年にＭａｉｌｌａｒｄによって最初に記述され、そしてそれは、タンパク質加齢の概念まで続いて研究に導いた。保存され、そして加熱処理した食品が、それらの生物利用性を減少させる架橋タンパク質によって特徴付けられる非酵素的褐色化を受けることが知られている。このメイラード反応は、グルコースが、ヘモグロビンのα鎖のアミノ末端へのアマドリ転位を介して付着することが分かったときと同様にインビボで生じることが分かった。
【０００４】
本開示は、後期アマドリ高次的グリケーション最終産物（メイラード産物；ＡＧＥ）の形成の先に未知であり、そして推定できない機構、および後期アマドリＡＧＥ形成の有効な阻害剤を同定および特徴付けする方法を教示する。本開示は、後期アマドリＡＧＥを形成する上で反応性タンパク質中間体成分の特徴的な単離および速度論的態特徴付けを例示し、そして初めて、タンパク質グリケーション反応の「後期」段階の特定の解明および高速定量的速度論の研究に対処する方法が教示される。
【０００５】
このような「後期」ＡＧＥ形成と対照的に、グリケーション反応の「初期」段階は、数種のタンパク質について比較的よく特徴付けられ、そして同定された（Ｈａｒｄｉｎｇ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３７：２４８−３３４、１９８５年；ＭｏｎｎｉｅｒおよびＢａｙｎｅｓ編、Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｇｉｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｒｉｏｎ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８９年；Ｆｉｎｏｔら、１９９０年編、Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｈｕｍａｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂａｓｅｌ））。グリケーション反応は、リシン側鎖ε−アミノおよび末端α−アミノ基との可逆性シッフ塩基（アルジミンまたはケチミン）付加反応、続いて基本的に不可逆性アマドリ転位によって開始されて、ケトアミド産物、例えばアルドースの反応から１−アミノ−１−デオキシケトースを生じることが知られている（Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｇｉｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ａｎｄ ＮｕｔｒｉｔｉｏｎにおけるＢａｙｎｅｓら、ＭｏｎｎｉｅｒおよびＢａｙｎｅｓ編（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、４３−６７）、１９８９年）。典型的には、糖は、それらの開放鎖（優勢なピラノースおよびフラノース構造ではない）アルデヒドまたはケト形態で、可逆性シッフ塩基縮合を通してリシン側鎖ε−アミノおよび末端α−アミノ基と最初に反応する。その後、生じたアルジミンまたはケチミン産物が、アマドリ転位を受けて、ケトアミンアマドリ産物、すなわち、アルドースの反応からの１−アミノ−１−デオキシケトースを得る（ＭｅａｎｓおよびＣｈａｎｇ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：補追３：１−４、１９８２年；Ｈａｒｄｉｎｇ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３７：２４８−３３４、１９８５年）。その後、これらのアマドリ産物は、週および月の期間中、遅くて、そして不可逆性メイラード「褐色化」反応を受け、それにより転位、脱水、酸化的切断、および架橋反応を介して蛍光および他の産物を形成する。これらの後期アマドリ反応（低速メイラード「褐色化」反応）は、重症に特徴付けられた高次的グリケーション最終産物（ＡＧＥ）になる。
【０００６】
アマドリおよび他のグリケーション中間体とのように、遊離グルコースそれ自身は、ジカルボニルグリオキサルおよびグリコアルデヒドのような過酸化の産物および非常に反応性の断片に至る酸化的反応を受ける可能性がある。したがって、多様なＡＧＥの形成の機構の解明は、ほとんどのインビトロでの研究が、極端に高い糖濃度で行われたので、極端に複雑であった。
【０００７】
これらの「初期」産物の比較的十分に特徴付けられた形成と対照的に、それらの異種遺伝性、反応時間が長いこと、および複雑さのため、後期アマドリ反応で生じた「後期」メイラード産物を形成する機構の理解につい明らかに欠如していた。「後期」メイラード反応の化学についての詳細な情報の欠如は、ポリペプチドのアミノ基とグルコースとの反応から誘導される蛍光ＡＧＥ発色団を同定する研究を刺激した。このような発色団の１つである、２−（２−フロイル）−４（５）−（２−フラニル）−１Ｈ−イミダゾール（ＦＦＩ）は、ウシ血清アルブミン、およびグルコースを伴うポリリシンの非酵素的褐色化の後に同定され、そして無傷のポリペプチドに存在する発色団の代表であることが仮定された（Ｐｏｎｇｏｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８１：２６８４−２６８８、１９８４）。後の研究は、ＦＦＩが、分析のための酸加水分解の間に形成された人工産物であることを確立した。
【０００８】
一連の米国特許は、このようなグリコシル化および架橋の機構が、飽和グリコシル化および単一の塩基を介した糖タンパク質アミンの連続架橋、および反復反応を介して生じるという前提に基づいて、タンパク質グリコシル化の阻害および糖タンパク質アミンの架橋の領域で公告された。これらの特許としては、米国特許番号第４，６６５，１９２号；第５，０１７，６９６号；第４，７５８，８５３号；第４，９０８，４４６号；第４，９８３，６０４号；第５，１４０，０４８号；第５，１３０，３３７号；第５，２６２，１５２号；第５，１３０，３２４号；第５，２７２，１６５号；第５，２２１，６８３号；第５，２５８，３８１号；第５，１０６，８７７号；第５，１２８，３６０号；第５，１００，９１９号；第５，２５４，５９３号；第５，１３７，９１６号；第５，２７２，１７６号；第５，１７５，１９２号；第５，２１８，００１号；第５，２３８，９６３号；第５，３５８，９６０号；第５，３１８，９８２号；および第５，３３４，６１７号が挙げられる。（引用される全ての米国特許は、全体的に参照してここに組込まれる）。
【０００９】
これらの米国特許の焦点は、初期グリコシル化アマドリ産物のカルボニル部分に焦点を置いてＡＧＥ形成を阻害する方法であり、そして特に、例示された最も効果的な阻害は、外因で投与されたアミノグアニジンの使用を教示する。最近、ＡＧＥ形成の阻害剤としてのアミノグアニジンの効力は、治験で試験される予定である。
【００１０】
ＡＧＥ形成の阻害は、例えば、食品腐敗、動物タンパク質加齢、および歯の褐色化と戦うことのような個人的衛生の領域で有用性を示す。定量的に僅かではあるが、ある程度際立った高次的グリケーション最終産物は、ペントシジンおよびＮ^ε−カルボキシメチルリシン（ＳｅｌｌおよびＭｏｎｎｉｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１５９７−２１６０２、１９８９年；Ａｈｍｅｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４８８９−４８９４、１９８６年）
本発明によって教示されたとおり、アマドリ中間産物および連続後期アマドリＡＧＥ形成は、アミノグアニジンとの反応によって完全には阻害されない。したがって、本開示によって教示されるとおり、後期アマドリＡＧＥの形成は、先に示されなかったか、または先に隔離して例示する可能性がある重要でそして特徴的な反応経路を介して起こる。この「後期」反応の有効な後期アマドリＡＧＥ阻害剤を同定および特徴付けする十分でそして効果的な方法を示すことが、非常に所望される到達点である。十分なスクリーニング法およびモデル系を提供することによって、コンビナトリアル化学を用いて、有効に、候補化合物をスクリーニングし、そしてそれにより、阻害剤化合物の最終認定における時間、経費および努力を大いに減じることができる。その後、有効な阻害剤の十分な特徴付けに対処する後期アマドリＡＧＥ形成の効果をモデル化および研究するインビボでの方法を示すことは、非常に有用である。
【００１１】
生物分解性および／または自然に代謝される阻害性化合物は、アミノグアニジンのような毒性のある副作用を示し得る非常に反応性のある化合物より治療剤として使用するのにいっそう望ましい。
【００１２】
発明の概要
本発明によって、その後、後期アマドリＡＧＥへの後期アマドリ変換を迅速に完了するのに使用され得る安定な後期アマドリ高次的グリケーション最終産物（ＡＧＥ）前駆体が同定された。この安定な産物は、より多くの糖との初期段階のタンパク質／糖アマドリ産物の別の反応によって生成された推定糖飽和アマドリ／シッフ塩基産物である。好ましい実施形態では、この後期アマドリ／シッフ中間性塩基は、標的タンパク質とリボース糖との反応によって発生された。
【００１３】
本発明は、糖阻害の高い新規方法を介して安定なタンパク質−糖ＡＧＥ形成中間前駆体を発生する方法を提供する。好ましい実施形態では、使用される糖は、リボースである。
【００１４】
本発明は、安定な後期アマドリＡＧＥ中間体を生成するのに十分な濃度で、そして十分な長さの時間、タンパク質を糖とインキュベートすることによって、安定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体を発生し；上記安定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体を、阻害剤候補と接触させ；糖誘導平衡からの安定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体の放出後に、後期アマドリＡＧＥの形成を監視することによって、有効な阻害を同定することを特徴とする、後期メイラード産物の形成についての有効な阻害剤を同定する方法を提供する。適切な糖としては、それに限定されないが、リボース、リキソース、キシロースおよびアラビノースが挙げられる。特定の条件は、グルコースおよび他の糖の使用に対処もすると思われる。好ましい実施形態では、使用される糖は、リボースである。
【００１５】
本発明は、「後期」反応を介した後期アマドリＡＧＥ形成の有効な阻害剤が、安定な後期アマドリＡＧＥ中間体を生成するのに十分な濃度で、そして十分な長さの時間、タンパク質を糖とインキュベートすることによって、安定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体を発生し；上記安定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体を、阻害剤候補と接触させ；糖誘導平衡からの安定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体の放出後に、後期アマドリＡＧＥの形成を監視することによって、有効な阻害を同定することを特徴とする、アッセイ中で後期アマドリＡＧＥ最終産物の形成を阻害する能力によって同定および特徴付けされ得ることを教示する。好ましい実施形態では、使用される糖は、リボースである。
【００１６】
したがって、本発明の方法は、効力についての候補後期アマドリＡＧＥ形成阻害剤の高速スクリーニングに対処し、それにより後期アマドリＡＧＥ形成の有効な小型分子阻害剤の開発に必要とされる仕事の経費と量を大いに減じられる。本発明は、ＡＧＥ形成の後期アマドリ「後期」反応の有効な阻害剤として、ビタミンＢ_６、およびビタミンＢ_１の誘導体が挙げられることを教示し、そして好ましい実施形態では、特定の種は、ピリドキサミンおよびピロリン酸チアミンである。
【００１７】
本発明は、対象動物にリボースを投与することを特徴とする、ラットでの糖尿病様病理学を迅速に誘導する新たな方法を教示する。さらに、提供されるのは、インビボで同定阻害剤ピリドキサミンおよびピロリン酸チアミンを使用して、後期アマドリＡＧＥ誘導病理学を阻害することである。
【００１８】
本発明は、ＡＧＥ形成および後期アマドリＡＧＥ病理学の阻害で使用するための化合物、および一般式：
【化６】

（式中、Ｒ_１は、ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＨ、またはＣＨ_２ＣＯＯＨである；
Ｒ_２は、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ_２である；
Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ_３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ_３はＮＯ_２または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである）
を示すこのような化合物、およびその塩を含有する医薬組成物を包含する。
【００１９】
本発明は、一般式
【化７】

（式中、Ｒ_１は、ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＨ、またはＣＨ_２ＣＯＯＨである；
Ｒ_２およびＲ_６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ_２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである；
Ｒ_４およびＲ_５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである；
Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ_３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ_３はＮＯ_２または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである）
を示す化合物、およびその塩も包含する。
【００２０】
好ましい実施形態では、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６のうちの少なくとも１つは、Ｈである。
【００２１】
さらに、本発明は、式
【化８】

を示す化合物も予想される。
【００２２】
本発明の化合物は、それに限定されないが、ＲがＣ１−６アルキルである場合、−ＮＨ_２、−ＮＨＲ、−ＮＲ_２、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＲ、および−ＮＨ−ＣＯＣＨ_３のような１つまたはそれ以上の電子抜取基を例示できる。
【００２３】
本発明は、適切な担体中の本発明の化合物のうちの１つまたはそれ以上、またはその塩を含む医薬組成物を包含する。本発明は、インビボでのＡＧＥ形成に関連する病理学の治療的介在のための本発明の治療剤を投与する方法を包含する。本発明の１つの好ましい実施形態では、治療されるべきＡＧＥ関連病理学は、糖尿病神経傷害に関する。
【００２４】
本発明は、それを必要とする哺乳類に、本発明の化合物を投与することを特徴とする、高脂血症、細胞酸化還元不均衡、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症およびアテローム性動脈硬化を治療または防止する方法をも教示する。
【００２５】
詳細な説明
タンパク質加齢についての動物モデル
アロキサンで誘導される糖尿病ルイスラットを、タンパク質加齢についてのモデルとして使用して、ＡＧＥ形成の阻害剤のインビボでの効力を例示した。例示されるべき相互関係は、後期糖尿病関連病理学の阻害と、ＡＧＥ形成の有効な阻害との間にある（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、ＣｅｒａｍｉおよびＶｌａｓｓａｒａ、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８（２０）：１３１５−１３２１、１９８８年）。ルイスラット、誘発糖尿病に罹ったニュージーランドの白ウサギ、および遺伝的に糖尿病のＢＢ／ウスターラットでの糖尿病のストレプトゾトシン誘発も、例えば、米国特許番号第５，３３４，６１７号で記述されるとおり利用された（参照して組込まれた）。これらのモデル系に伴う主要な問題は、ＡＧＥ関連損傷を示し、したがってＡＧＥ阻害について化合物を試験するために必要とされる長い期間である。例えば、１６週の治療が、米国特許番号第５，３３４，６１７号で記述されるラット研究に、そして１２週がウサギの研究に必要とされた。したがって、短い期間で現れるＡＧＥ関連糖尿病病理学についてのモデル系を有することは、非常に望ましく、そして有用であり、それにより、ＡＧＥ関連損傷および後期アマドリＡＧＥ形成の阻害剤の効力のより十分に、そして迅速な測定に対処する。
【００２６】
ＡＧＥに対する抗体
ＡＧＥ形成を研究するための重要な道具は、多様な標的タンパク質との数種の糖の反応によって引出されたＡＧＥに特異的であるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の使用である。ＡＧＥのタンパク質成分の特性とは関係ないＡＧＥについての結果物である特異性について、抗体をスクリーニングする（Ｎａｋａｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６２：７４０−７４５、１９８９年；Ｎａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４０：１１９−１２５、１９９１年；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：７３２９−７３３２、１９９１年；Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０２１１−１０２１４、１９９２年；Ｍａｋｉｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５１３３−５１３８、１９９２年）。このような抗体は、インビボで、そしてインビトロでＡＧＥ形成を監視するのに使用されてきた。
【００２７】
ピリドキシン−ビタミンＢ_６
ビタミンＢ_６は、典型的に、多くの起源から入手可能な一般市販薬製品で塩酸ピリドキシンの形態で利用できる。例えば、ビーチ製薬（Ｂｅａｃｈ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のビーリス錠剤（Ｂｅｅｌｉｔｈ Ｔａｂｌｅｔｓ）は、２０ｍｇのＢ_６に等価である２５ｍｇの塩酸ピリドキシンを含有し、他の製品としては、１ｍｇのピリドキシＨＣｌを含有するマーリンヘルスケア（Ｍａｒｌｙｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）のマーリンフォーミュラ５０（Ｍａｒｌｙｎ Ｆｏｒｍｕｌａ ５０）、および６ｍｇのピリドキシンＨＣｌを含有するマーリンフォーミュラ５０メガフォルテ（Ｍａｒｌｙｎ Ｆｏｒｍｕｌａ ５０ Ｍｅｇａ Ｆｏｒｔｅ）、２．６ｍｇピリドキシンＨＣｌを含有するワイエス−アイエルスト（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）のスチュアートプレナタル（Ｓｔｕａｒｔ Ｐｒｅｎａｔａｌ(登録商標)）錠剤、２ｍｇのピリドキシＨＣｌを含有するジェイアンドジェイ（Ｊ＆Ｊ−Ｍｅｒｋ Ｃｏｒｐ）のスチュアートフォーミュラ（Ｓｔｕａｒｔ Ｆｏｒｍｕｌａ(登録商標)）錠剤、および１．０５ｍｇのピリドキシＨＣｌ、１５０％の２−４歳の子供用の米国ＲＤＡ、および５３％の４歳以上の子供および成人用の米国ＲＤＡを含有するチバ（ＣＩＢＡ）のコンシューマーサンキスト（Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｓｕｎｋｉｓｔ）子供用チュアブル複合ビタミンが挙げられる（非処方箋薬についてのＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１４版（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｄａｔａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏ．，Ｍｏｎｔｖａｌ，Ｎ．Ｊ．，１９９３年）。
【００２８】
ピリジン核の位置４にある炭素原子における置換の特性に違いがある３つの関連形態のピリドキシンがある。ピリドキシンは、一次アルコールであり、ピリドキサルは、対応のアルデヒドであり、そしてピリドキサミンは、この位置にアミノメチル基を含む。これらの３つの形態の各々は、肝臓により、活性形態のビタミンであるピリドキサル−５’−リン酸塩への変換の後に哺乳類によって利用され得る。これらの３つの形態が、生物学上の特性で等価であることが長年信じられ、そして当分野によってビタミンＢ_６の等価形態として処置されてきた。薬学および化学における審議会は、そのビタミンに名称ピリドキシンを付与した。
【００２９】
ピリドキシンに対する最も活性な抗代謝産物は、４−デオキシピリドキシンであり、それについて、抗代謝産物活性は、数種のリン酸ピリドキサル依存性酵素の競合阻害剤である４−デオキシピリドキシン−５−リン酸塩のインビボでの形成に起因した。ピリドキシンの薬理学作用は、それが、経口または静脈投与のいずれかの後に何ら顕著な薬力学作用を引き起こさない場合、限定され、そして水溶性でありながら、低い急性毒性を示す。神経毒性は、日当たり２００ｍｇと同じ程度に少ないピリドキシンの長期摂取の後に発生し得ることが示唆された。生理学的には、補酵素として、リン酸ピリドキシンは、脱カルボキシル化、アミノ転移、およびラセミ化を含めたアミノ酸のいくつかの代謝性形質転換に、並びに硫黄含有およびヒドロキシ−アミノ酸の代謝での酵素的段階に関与する。アミノ転移の場合に、リン酸ピリドキサルを、ドナーアミノ酸によってリン酸ピリドキサミンにアミノ化し、そしてその後、結合リン酸ピロドキサミンを、受容体α−ケト酸によってリン酸ピリドキサルに脱アミノ化する。したがって、ビタミンＢ複合体は、アミノ酸の特定の分解に関与した必須補助食品であることが知られている。ビタミンＢ複合体の一般の検討については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｇｉｌｍａｎ、Ｒａｌｌ、ＮｉｅｓおよびＴａｙｌｏｒ編（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０年、１２９３−４；１５２３−１５４０）参照。
【００３０】
驚くべきことに、本発明では、人体で通常に見られるものより上の濃度でのビタミンＢ_６の代謝的に一時的なピリドキサルアミン形態（ピリドキサミン）の有効な投与が、後期アマドリ抗原性ＡＧＥ形成の有効な阻害剤であること、およびこの阻害が、アミノグアニジンの投与により可能なものよりいっそう完全であり得ることが知見された。
【００３１】
安定な中間のアマドリ／シッフ塩基の形成
ＡＧＥを形成するタンパク質とグルコースとの反応の典型的な研究は、抗原性ＡＧＥに誘導される抗体を用いてＥＬＩＳＡによって行われ、そして酸安定性蛍光ＡＧＥの生成物ペントシジンの検出は、酸加水分解に続くＨＰＬＣによって行われた。グルコースおよびリボースとの標的タンパク質のグリケーション（すなわち、ＢＳＡまたはＲＮアーゼＡ）を、ポリクローナルのウサギ抗−グルコース−ＡＧＥ−ＲＮアーゼおよび抗−グルコース−ＡＧＥ−ＢＳＡ抗体のＥＬＩＳＡ活性を監視することによって比較した。１Ｍグルコースを、６０日間ＲＮアーゼと、そして９０日間ＢＳＡと反応させることによって、抗原を生成した。抗体（Ｒ６１８およびＲ４７９）をスクリーニングし、そしてＡＧＥのみと反応性を示し、担体免疫原ＢＳＡ以外のタンパク質と反応性を示さなかった。
【００３２】
実施例１ 高血糖症に関連した高脂血症の阻害
ＡＧＥの形成および糖尿病性ネフロパシーの発生を阻害する努力で、我々は、ストレプトゾトシンで誘導した糖尿病ラットをピリドキサミンで処置した。我々は、ここで、アルブミン尿症、蛋白尿症、および血漿クレアチニンにおけるそれの影響によって測定されるときに、ピリドキサミンが、糖尿病性ラットにおけるネフロパシーの発生を阻害し、血漿コレステロールおよびトリグリセリドにおける増大の阻害によって測定するときに、糖尿病性ラットでの異脂血症を修正し、そして血漿乳酸塩対ピルビン酸塩比における変化によって測定されるとおり、低酸素症または偽低酸素症のいずれかから生じる酸化還元不均衡を補正することを報告する。比較できる用量で、ピリドキサミンは、糖尿病性ネフロパシーに対する保護の上でプロトタイプのＡＧＥ−阻害剤アミノグアニジンよりいっそう有効であり、糖尿病の異脂血症および代謝の異常性の逆転であった。ここに使用される場合、「糖尿病性哺乳類」は、現に糖尿病である哺乳類、およびグルコースに寛容でないものおよび／またはそれらの血中糖濃度に関係なく、膵臓の不十分さを示すものを包含する。我々は、ＡＧＥ阻害剤が両方とも、糖尿病性ネフロパシーに対して保護し、そして脂質および炭化水素化学および代謝における広範な効果を発揮すると結論づける。
【００３３】
導入
この研究の目的は、ＡＧＥの形成におけるＰＭおよびＡＧの効果および糖尿病性ラットにおけるネフロパシーの発生を評価することである。３０週の実験の終わりに、我々は、糖尿病性ラットから得た血漿が、対照ラットからのものより目視でいっそう脂ぎっていること、そしてＰＭ−およびＡＧ−処置糖尿病性動物の両方で脂血症における減少があるようであることを観察した。我々は、ＰＭおよびＡＧの両方が、ＳＴＺ−糖尿病性ラットにおけるネフロパシーの発生を阻止したのみならず、糖尿病性ラットにおける血漿コレステロールおよびトリグリセリドにおける増大をも阻害し、そして糖尿病での改変された状態の指標である血漿ラクトースおよびラクトース／ピルビン酸塩比における増加を逆転させたことを報告する。我々は、ＡＧＥの形成における、糖尿病性動物でのコラーゲンの増加した化学的修飾の起点および基質および酸化的ストレスの相対的重要さ、そして脂質対炭化水素についても検討した。我々の結果は、ＰＭが、糖尿病におけるネフロパシーおよび血管疾病の両方の発生を阻害する有効な治療剤であり得ることを示唆する。
【００３４】
材料および方法
特に指示されない限り、試薬および酵素は、セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，）から購入した。
【００３５】
実験の設計
ＳＴＺの注入により糖尿病になった雌のスプレーグ−ドーリーラットでこれらの実験を行った。糖尿病は、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中の４５ｍｇ／ｋｇのＳＴＺの単回の尾部静脈注射によって誘導された。対照動物は、緩衝液のみで偽注射した。糖尿病は、ＳＴＺ注射の後、２および３日で、血中グルコース濃度を測定することによって確認された。１６ｍＭより高い血漿グルコースを示す動物は、糖尿病と分類された。糖尿病性ラットを、未処置糖尿病群（ｎ＝１２）および飲料水中に１ｇ／ＬでＰＭ（ｎ＝１３）またはＡＧ（ｎ＝１２）のいずれかを受ける２つの糖尿病処置群に任意に分けた。２つの非糖尿病対照群が含まれ、一方は、処置を受けず（ｎ＝１３）、他方は、飲料水中に２ｇ／ＬでＰＭ（ＨＣｌ）_２を受ける（ｎ＝１２）；ＰＭ処置対照群におけるＰＭの用量が高いほど、糖尿病動物に比較して、非糖尿病の水摂取が低いことを部分的に補償するように設計した。全ての動物を、各々１２時間の明暗サイクルで個々に収容し、そして食物および水に自由に接触させた。体重を維持するため、および高血糖症を制限するために、糖尿病動物は、３ＩＵのウルトラレンテインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ Ｕ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）を週当たり三回受けた。これは、体重における増加のために調整する１５週の後に５ＩＵに増加された。
【００３６】
ネフロパシー
ネフロパシーの進行は、尿中のアルブミンおよび総タンパク質の、そして血漿中のクレアチニンの月毎の測定によって評価された。尿測定のために、ラットを、代謝ラットケージ（Ｎｅｌｇｅｎｅ、Ｎｅｌｇｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に２４時間収容した。数滴のトルエンを尿収集ビーカーに添加して、微生物の成長を防止した。ウォラックビクターモデル（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ）１４２０多標識プレート読み取り装置（Ｗａｌｌａｃ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ．）を用いた最近の方法のマイクロプレート適用によって、血漿および尿中のタンパク質および代謝産物についての全アッセイを行った。対照実験は、ＰＭもＡＧもいずれも、血漿または尿中に存在する濃度で、尿タンパク質を除いて、アッセイのいずれかに干渉を引き起こさないことを示した（下記参照）。
【００３７】
尿アルブミンは、ＥＬＩＳＡアッセイによって定量された。ラットアルブミンおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗−ウサギＩｇＥに対するウサギ抗血清を、カリフォルニア州コスタメサのアＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入した。簡潔には、ウェルを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．４）中の５０ｎｇのラットアルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で、一夜、４℃で被覆した。競合段階で、１００μＬの標準または希釈尿サンプルを、マイクロプレート振蘯装置上で、室温で３時間、１００μＬのウサギ抗−ラットアルブミン抗血清とインキュベートした。洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（２００μＬ）を、振蘯させながら、２５℃で1時間使用し、そしてプレートを、室温で４５分間、２００μＬのＡＢＴＳ−試薬（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）で展開させ、そして４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００３８】
総尿タンパク質を、シグママイクロプロテイン（Ｓｉｇｍａ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）−ＰＲキットを用いた実験の終わりに測定した。簡潔には、サンプルおよび標準のアリコート量を、ピロガロールレッドおよびナトリウムモリブデートを含有する試薬溶液に添加し、３７℃で３分間インキュベートし、そして５７０ｎｍで吸光度を測定した。サンプルのＰＭまたはＡＧ定数についての修正（＜１０％）を行った。シグマキット番号５５５−Ａを用い、ジャフェのピクリン酸手段によって、血漿クレアチニン濃度を測定した。簡潔には、２０μｌのサンプルまたは標準を、２００μＬのピクリン酸と混合した。４９０ｎｍでの吸光度を、酸試薬を添加する前後に読み取った。
【００３９】
血漿中のコレステロール、ゴリグリセリド遊離脂肪酸およびグリセロール
両方のアッセイのためのカリブレーターを含めて総コレステロール（番号３５２）および総トリグリセリド（番号３７、ＧＰＯ帯）のためのシグマキットを用いた酵素的、色測定最終点アッセイによって、総コレステロールおよびグリセリドを測定した。Ｎｏｍａら（１９７３年）により記述されるとおり、有機溶解性銅複合体として遊離脂肪酸を測定した（Ｎｏｍａら、１９９３年、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４３：３１７−３２０）。Ｂｅｒｇｍａｎによって記述されるとおり、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた分光測定酵素的アッセイによって、グリセロールを測定した（Ｂｅｒｇｍａｎ、１９７４年、グリセロール−リン酸デヒドロゲナーゼのアッセイ。Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｏｌ．３におけるＢｅｒｇｍａｎ，Ｈ．Ｖ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ。１４０４−１４０８）。
【００４０】
乳酸塩、ピルビン酸塩、およびケトン体
ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋結合アッセイ（それぞれ、シグマキット番号８２６、７２６および３１０）を用いて、乳酸塩、ピルビン酸塩およびβ−ヒドロキシブチラートを、分光光学的に測定した。ＬＩらにより記述されるとおり、アセト酢酸リチウム塩、β−ヒドロキシブチラートデヒドロゲナーゼＩＩ型およびＮＡＤＨを用いたβ−ヒドロキシブチラートアッセイの逆転によって、アセト酢酸を測定した（Ｌｉら、１９８０年、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：１７１３−１７１７）。
【００４１】
腎臓の形態測定
右腎臓の１側面を、一組の平行カミソリ板を使用して、２ミリメートル厚のスライスに切った。そのスライスの一方の半分を、先入観なしに全身で選択し、ホルマリンに入れた。これらのスライスを、一連のアルコールを通して脱水し、そしてＪＢ−４^ＴＭ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ．ＰＡ）に埋設した。各ＪＢ−４^ＴＭブロックから、５マイクロメートル厚の切片を切取り、トルイジンブルーで染色し、そして糸球体容積の測定のために使用した。非選択スライスから、皮質の小さなブロックを、ミロニグ緩衝液中の２．５％グルタルデヒド中で固定し、一連のアルコールを通して、ポリベッド（ＰｏｌｙＢｅｄ）８１２(登録商標)（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ．ＰＡ）に埋設した。先入観なしに糸球体を選択するために、１マイクロメートル厚の切片を、ポリベッド（ＰｏｌｙＢｅｄ）８１２(登録商標)ブロックから切取り、そしてトルイジンブルーで染色した。真中の糸球体を、電子顕微鏡のために選択した。レイチャートウルトラカット（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔｒａｃｕｔ）Ｅウルトラマイクロトムを用いて銀−金切片を切取り、スロット格子に載せ、そして酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。ＪＥＯＬ１００ＣＬ電子顕微鏡を用いて、画像を得た。各動物から得られる３つの糸球体を、電子顕微鏡パラメータを測定するために使用した。
【００４２】
糸球体の容積を測定するために、単眼鏡に付着した小型鏡を具備したオリンパスＢＨ−２顕微鏡を、画像をベンチトップに投影するために使用した。２．５ｍｍ増加で顕微鏡ステージを移動することによって、各ＪＢ−４^ＴＭ切片から得たフィールドを、先入観なしに全身で選択した。投影した画像の上にグリッドの点を重ね合せることによって、各フィールド内の全糸球体のプロファイルの領域を測定した。各糸球体プロファイルに当たる点の数を計測した。方程式、領域＝（ΣＰ／ΣＧ）×（５０００／１５０）^２（式中、ΣＰは、糸球体プロファイルを当てる点の総計であり、そしてΣＧは、測定されたプロファイルの数であった）によって平均糸球体領域を計算し、５００は、マイクロメートルでグリッド点の間の距離であり、１５０は、投影された画像の倍率であった。方程式、容積＝領域^３／２×１．３８／１．０１（式中、１．３８は、球形粒子についての修正因子であり、そして１．０１は、糸球体の中の多様な容積についての修正因子である）を用いて、ＷｅｉｂｅｌおよびＧｏｍｅｚの方法によって容積を計算した（ＷｅｉｂｅｌおよびＧｏｍｅｚ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７：３４３−３４８、１９６２年）。糸球体の容積測定のために、６５プロファイルの平均を測定した。目盛スライスを、投影画像の倍率が１５０×であることを確認するために使用した。
【００４３】
糸球体の基底膜（ＧＢＭ）の幅を測定するために、顕微鏡ステージコントロールの現在位置を用いて、先入観なしに画像を全身的に得た。およそ２５パーセントの各糸球体プロファイルが、１５，０００×の最終倍率で作画された。オルトゴナル切片法（Ｊｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ １１５：１９−３３、１９７９年）を用いて、糸球体基底膜幅を測定した。糸球体の基底膜の１６９測定の平均を、動物当たりで行った。糸球体当たりの糸球体間質の容積密度［Ｖｖ（糸球体間質／糸球体）］の測定のために、画像を得て、そして一緒に合せて、３９００×の最終倍率で、全糸球体プロファイルのモンタージュを形成した。粗大な、および微細な点のグリッドを、モンタージュの上に載せた。糸球体間質に入る微細な点の数および糸球体に入る粗大な点の数を計測した（Ｗｅｉｂｅｌ，Ｅ．Ｒ．、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ，Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．１、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、３３２、１９７９年）。Ｖｖ（糸球体間質／糸球体）＝ΣＦＰ／（ΣＣＰ×４）（式中、ΣＦＰは、糸球体間質に入る微細な点の数であり、そしてΣＣＰは、全ての３つの糸球体に入る粗大な点の数である）。各粗大な点について４つの微細な点があるように、グリッドを行った。１７４の粗大な点の平均は、糸球体を当て、そして１６４の微細な点は、動物当たり糸球体間質を当てた。目盛グリッドを、高および低倍率で、フィルムの各ロールについて写真に撮り、各測定画像の正確な倍率を測定した。Ｖｖ（糸球体間質／糸球体）により糸球体の容積を増大させることによって、総糸球体間質の容積を計算した。
【００４４】
統計的分析
ウインドウズ（Ｗｉｎｄｏｗｓ）Ｖ１．００のためのシグマスタット（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ）を用いて、統計的分析を行った。非パラメータ性マン−ホワイトニーランク総計分析によって、Ｐ値を計算した。パーソンの産物モーメント法によって、修正分析を行った。
【００４５】
結果
ネフロパシーの進行
尿中アルブミンおよびタンパク質分泌、および血漿クレアチニン濃度を、糖尿病性ネフロパシーの測定として使用した（図１）。ＰＭ−処置非糖尿病対照は、実施例を通して、非処置の非糖尿病対照と区別できなかったが、しかし、アルブミン尿症は、全糖尿病群で時間と共に増加し、そして未処置糖尿病動物は、アルブミン尿症で最大の増加を示す。糖尿病の２３週で、全３つの糖尿病群は、互いに、そしてアルブミン尿症に関しては、非糖尿病対照と明らかに異なっていた（図１Ａ）。ＰＭは、ＡＧより、アルブミン尿症に対する明らかに大きな保護を提供した。図１Ｂに示されるとおり、血漿クレアチニン値も、約第１７週で正常より上昇し始めた。アルブミン尿症および蛋白尿症で観察されるとき、ＰＭは、ＡＧより明らかにいっそう有効であるが、ＰＭおよびＡＧの両方とも、血漿クレアチニンでの上昇を鈍らせた。アルブミン尿症での効果は、蛋白尿症での差異によって監視され、アルブミン尿症は、ネフロパシーのいっそう感受性のある指標であるようだが、実験の終わりに測定された（図１Ｃ）。
【００４６】
異脂血症
ネフロパシーで、我々は、未処置糖尿病動物の血液が、対照およびＰＭ−またはＡＧ−処置動物から得られる血液より目視でいっそう脂ぎっていることを観察した。血漿脂質のアッセイ（図２）は、未処置糖尿病動物における脂血症での実質的増大、そしてＰＭおよびＡＧの両方による高脂血症の実質的修正を示した。トリグリセリド（図２Ａ）は、非糖尿病対照における１００ｍｇ／ｄＬに比較して、糖尿病ラットで〜７００ｍｇ／ｄＬの平均まで増大し、そしてそれぞれ、ＰＭおよびＡＧによって２２０と３５０ｍｇ／ｄＬの平均まで減少された。血漿コレステロール（図２Ｂ）は、〜５０％まで増大され、そしてＰＭによって正常化され、そしてＡＧで部分的に修正された。脂血症における増大は、糖尿病における脂質タンパク質リパーゼ活性のため、末梢組織で低密度脂質タンパク質の減少した取込に寄与され得るが、血漿中の遊離脂肪酸およびグリセロールの両方における増大に基づいて、増大した脂肪分解をも示す。図２および図２Ｄに示されるとおり、血漿遊離脂肪酸およびグリセロール濃度は、糖尿病ラットで２−３倍まで増大され、そしておよそ５０％がＰＭまたはＡＧのいずれかでの処置によって正常化された。
【００４７】
酸化還元不均等
脂質代謝における選択は、糖尿病でグルコースで誘導された酸化還元不均衡（偽低酸素症）（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２：８０１−８１３、１９９３年）または減少した組織酸化（ＭａｙｒｏｖｉｔｚおよびＬａｒｓｅｎ、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５２：１１５−１２６、１９９６年；Ｔｅｓｆａｙｅら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３７：８４７−８５４、１９９４年）（真性低酸素症）から生じ得る。こららの変化は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ^＋の細胞質ゾル比における変化まで影響され、そしてそれは、血漿中の乳酸塩対ピルビン酸塩の比を測定することによって間接的に評価され得る。図３に示されるとおり、糖尿病動物は、増大した乳酸塩／ピルビン酸塩比と同様に、血漿中の乳酸塩およびピルビン酸塩の両方の明らかに高い濃度を示した。ＰＭおよびより少ない範囲のＡＧは、炭化水素の酸化的代謝でのこれらの欠乏を部分的に修正した。我々は、血漿β−ヒドロキシブチラートおよびアセトアセテート濃度も測定し、しばしば、ミトコンドリアの状態の指標として使用された。これらの代謝産物の濃度は、動物の間で大いに変化した。糖尿病動物におけるβ−ヒドロキシブチラートおよびアセトアセテートにおける増加に対する明確な傾向があり、そしてＰＭおよびＡＧの両方がこれらの変化を修正したという指示である一方で、差異は、統計的有為性に達しなかった。
【００４８】
解剖学的観察
表１に示されるとおり、平均腎臓および肝臓重量は、絶対的語句で、および総体重マスの画分としての両方で、糖尿病ラットで増大した。組織重量におけるこれらの変化は、ＰＭおよびＡＧによって部分的に逆転された。糖尿病動物の腎臓に、偶発的な嚢胞が観察されたが、しかし、薬剤処置群では増大されなかった。主要臓器での腫瘍における増加も、ＰＭまたはＡＧ療法のいずれかに関連した他の通常でない病理学の証拠もなかった。腎臓形態学における顕著な変化は、糸球体の基底膜（ＧＢＭ）厚みにおける30％増加、糸球体の容積における６０％増加、糸球体間質の容積画分での２５％増加、そして糸球体間質の容積における１００％増加（表２）を含め、ラットで糖尿病の７ヶ月の期間内に観察可能であった。ＰＭは、糸球体容積ので明らかであるが、しかし増加の部分的修正を引き起こし、そしてＧＢＭ厚みおよびＰＭによる糸球体間質の容積における減少に向けた傾向があった。ＰＭ処置ラット中の糸球体間質の容積画分における増加は、ＰＭ処置動物における糸球体の容積で不均衡な減少から生じ得た。これらのパラメータにおけるＡＧの効果は、評価されなかった。
【００４９】
【表１】

【００５０】
【表２】

【００５１】
生化学的パラメータおよびＡＧＥの間の関係
脂質は、糖尿病ラットにおいて明らかに増大された、そしてＰＭおよびＡＧによって低下させられたので、そして脂質は、ＣＭＬ（１３）、ＣＥＬ（１４）および蛍光産物、例えばリポフュズシン、そして組織タンパク質中の架橋構造（ペントシジンを除いて）の起源として認識されるので、我々は、糖尿病ラット中の血漿脂質、糖尿病性ネフロパシーおよびタンパク質の化学的修飾の間の関係を試験した。図４に示されるとおり、皮膚コラーゲン中のＣＭＬおよび血漿トリグリセリドの間に強力な相互関係があり、そしてＣＭＬおよびトリグリセリドも、微細アルブミン尿症に相互関係した。他の相互関係は、表３で要約される。これらのパラメータが、影響を及ぼされないか、またはコラーゲンのグリケーションの場合には、薬剤療法によってわずかに影響されるので、これらの測定で、脂血症またはタンパク質グリケーションと相互関係したものはなかった。
【００５２】
【表３】

【００５３】
検討
糖尿病ネフロパシーにおけるピリドキサミンの効果
これらの研究は、ＡＧＥの形成におけるＰＭの有効性およびＳＴＺ−糖尿病ラットにおけるネフロパシーの発生を評価するために設計した。本報告では、尿中アルブミンおよび血漿クレアチニン濃度の両方での減少によって測定されるとおり、我々は、ＰＭが、糖尿病ラットでのネフロパシーの発生を阻止したことを示す。研究の終わりに測定された蛋白尿も、ＰＭ処置ラットで明らかに減少された。ＰＭが、糖尿病ラットで、微細アルブミン尿症およびクレアチニン血症における増大を阻止する上で、そして異脂血症および酸化還元不均衡を修正する上で明らかにいっそう有効であったが、ＰＭおよびＡＧの両方につての類似の効果が観察された。こららの治療効果は、糖尿病ラットの血糖症またはグリケート化ヘモグロビンにおける明らかな変化なしに達成された。
【００５４】
全ての糖尿病動物は、腎臓肥大（表１）を含めた腎臓構造での特徴的な変化を示し、糸球体の基底膜（ＧＢＭ）の厚くなることを促進し、糸球体の容積および糸球体間質の拡張を増大した（表２）。ＰＭ（およびＡＧ）は、腎臓の重さにおける増加を部分的に阻害したが、ＰＭは、腎臓における超構造的変化における効果を制限した（表２）。腎臓形態学におけるＡＧの効果は、この研究で測定されなかったが、ＳＴＺ−糖尿病ラットのＡＧ処置における他の研究は、固定した結果を生じた。１つの研究では、ルイスラットでのＧＢＭ厚みづけの阻害が報告された（ＥｌｌｉｓおよびＧｏｏｄ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ４０：１０１６−１０１９、１９９１年）一方で、ＡＧが、スプレーグ−ドーリーラットでのＧＢＭ厚みづけにおける効果を示さない２つの報告がある（Ｏｔｕｒａｉら、ＡＰＭＩＳ １０４：２５９−２６４、１９９６年；Ｓｏｕｌｉｓ−Ｌｉｐａｒｏｔａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０：１３２８−１３３４、１９９１年）。
【００５５】
しかし、後者の研究の内の１つで、ＡＧは、糸球体間質拡張を部分的に阻害した（Ｓｏｕｌｉｓ−Ｌｉｐａｒｏｔａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０：１３２８−１３３４、１９９１年）。関連報告では、ＡＧは、２型糖尿病のモデル（Ｙａｍａｕｃｈｉら、Ｄｉａｂ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ． ３４：１２７−１３３、１９９７年）であるオーツカロング−エバンストクシマ脂肪ラットにおける糸球体の基底膜厚みづけおよび画分の糸球体間質容積における増大を阻害した。腎臓の形態学における可変の効果以外に糖尿病ネフロパシーにおけるＡＧＥ阻害剤の強力な効果は、腎臓の形態学的変化が、高濾過または高血圧（測定されず）またはこれらの実験で測定されなかった腎臓の血流力学の他の態様によって起動され得ることを示唆する。糖尿病腎臓での細胞の変化、例えば、有足突起および糸球体間質の細胞数における変化における将来の研究は、糖尿病腎臓での構造および機能的変化の間の関係によい徴候を提供し得る。
【００５６】
ＡＧＥ阻害剤の代謝的効果
糖尿病ヒトにおけるＡＧの脂質低下効果が、先に報告（Ｂｕｃａｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９４４１−９４４５、１９９４年）されているが、ＳＴＺ−糖尿病ラットでの血漿コレステロールおよびトリグリセリドにおけるＰＭおよびＡＧの効果の規模は驚くべきことである。血漿遊離脂肪酸およびグリセロールにおける効果と一緒に、これらの変化は、それらのＡＧＥ−阻害活性に加えて、ＡＧおよびＰＭは、脂質代謝の中枢経路に影響を及ぼすことを示す。ＡＧとＰＭの間に構造的類似性がほとんどないので、ＰＭの効果は、リン酸ピリドキサルまたは他のＢ_６ビタマーへのその変換から誘導されそうにない。
【００５７】
高血糖症は、インビトロおよびインビボでの酸化還元補酵素の細胞内比にシフトを誘導することが知られており、それにより偽低酸素症の状態に至る（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２：８０１−８１３、１９９３年）。糖尿病ラットでの血漿乳酸塩での増加および乳酸塩：ピルビン酸塩比の規模は、体の中の主要な組織、例えば筋肉または神経での酸化還元シフトまたは真性低酸素症を示唆する。これらの変化は、末梢組織の減少した灌流および酸素付加から生じ、そしてヒトおよび動物モデルの両方で糖尿病性微細血管症およびネフロパシーの発生に重要な役割を果し得る（ＭａｙｒｏｖｉｔｚおよびＬａｒｓｅｎ、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５２：１１５−１２６、１９９６年；Ｔｅｓｆａｙｅら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３７：８４７−８５４、１９９４年；ＣａｍｅｒｏｎおよびＣｏｔｔｅｒ、Ｄｉａｂ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．１０：１８９−２２４、１９９４年；ＢｏｕｌｔｏｎおよびＭａｌｉｋ、臓器特異的血管変化、Ｄｉａｂｅｔｉｃ ＡｎｇｉｏｐａｔｈｙにおけるＴｏｏｋｅ，Ｊ．Ｅ．編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２６７−２７５頁）。
【００５８】
糖尿病の腎臓が、低酸素症でもあるという最近の報告（Ｐｙｋｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８（補追１）、５９３（要旨）、１９９９年）は、低酸素症が、糖尿病での改変代謝および病理学の発生に寄与する一般的機構であり得ることを示唆する。炭化水素の嫌気的代謝における結果の増加は、脂質の好気性代謝も損傷され得ることを示唆し、それにより、糖尿病ラットでの高脂血症に部分的に寄与する。これらの効果の全てが、血管系におけるＡＧＥ形成の阻害に対して二次的であることは起こる得るが、しかし、我々は、その薬剤の作用の多重機構を排除できない。糖尿病ラットの血漿中の組織酸素圧、末梢血管耐性、脂質濃度および乳酸塩：ピルビン酸塩比におけるＰＭの効果の速度論の評価は、薬剤作用の機構への重要な徴候およびＳＴＺ−糖尿病ラット中の代謝および機能的変化の発生における低酸素症の役割を得た。
【００５９】
ＰＭの作用の機構
ＰＭおよびＡＧの効果は、糖尿病合併症でのＡＧＥ仮説と一致する。両方の薬剤は、論理的には、ＡＧＥ形成に関与した反応性カルボキシル中間体を捕捉することによって、ＣＭＬおよびＣＥＬの形成を阻害し、そして、それらは、糖尿病ネフロパシーの発生を阻止もする。しかし、トリグリセリドおよびＣＭＬの間、そしてトリグリセリドとアルブミン尿またはクレアチニン血症との間の強力な相互関係と合せて、ペントシジン形成に影響するＰＭまたはＡＧのいずれかの不全は、脂質が、ＡＧＥの形成およびネフロパシーの発生の両方で重要であり得ることを示唆する。実際に、ＣＭＬおよびＣＥＬの両方が、脂質過酸化反応の間に形成され（未公表の結果、およびＦｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９９８２−９９８６、１９９６年）、そしてコラーゲン中のそれらの濃度における減少が、ＡＧＥ阻害剤によって影響された血漿トリグリセリドでの減少の直接的結果であり得ることが主張された。しかし、炭化水素（Ｐｙｋｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８（補追１）、５９３（要旨）、１９９９年）から占有的に誘導された産物であるペントシジンが、糖尿病ラットの皮膚および腎臓のコラーゲンの両方で増加されるという事実は、炭化水素自動酸化およびグリコシド化が、ＡＧＥ形成に寄与することを示す。ＰＭまたはＡＧも、皮膚コラーゲンでのペントシジンにおける増加を防止したが、これは、インビトロでのＣＭＬと比較して、ペントシジンの形成を阻害することがいっそう困難であるという事実に反映し得る（Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６５４−１１６６０、１９９１年；Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．出版中、１９９９年）。ＣＭＬ、ＣＥＬおよびペントシジンでの相対的増加も、対照ラットに比較して糖尿病でも類似であり、ペントシジンの場合に自然で炭化水素でなければならない共通の前駆体からそれらの起点と一致する。皮膚中のＣＭＬおよびペントシジン（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら、出版中）および腎臓のコラーゲンの相対的濃度も、インビトロでのグルコースによるコラーゲンの修飾の間のこれらの化合物の相対的収量（Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６５４−１１６６０、１９９１年；Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．出版中、１９９９年）、すなわち、ペントシジンと比較して、５０−１００倍高い濃度のＣＭＬとも一致する。したがって、これらの産物の内の３つ全ては、糖尿病コラーゲンの蛍光および架橋と同様に、グリコキシル化反応から誘導されることが最もありそうに見える。
【００６０】
異脂血症および糖尿病合併症
異脂血症は、糖尿病ネフロパシーの発生についての危険因子として認識される（ＯｄａおよびＫｅａｎｅ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔ．５２、補追２：Ｓ３６−Ｓ３８、１９９７年；Ｓｍｕｌｄｅｒｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２７：９９７−１００２、１９９７年）が、しかし糖尿病と関係なくネフロパシーと共通に関連もしている（ＧｕｉｊａｒｒｏおよびＫｅａｎｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２：３７２−３７９、１９９３年；Ｓａｉｔｏ，Ｔ．、Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：３２１−３３７、１９９７年）。脂質代謝における異常性が、高血糖症の発生に関して、糖尿病で最初に発生されたことは、さらにあり得ると思われる。この場合に、異脂血症は、おそらく、腎臓（または血管系）に捕捉された脂質タンパク質の局在酸化、および高次的脂質化最終産物（ＡＬＥ）の連続形成を通して、ネフロパシーの発生を促進し得た。ＡＧ（Ｐｉｃａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６８７６−６８８０、１９９２年；Ｇｉａｒｄｉｎｏら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７：１１１４−１１２０、１９９８年）およびＰＭ（未公開結果）は、脂質過酸化の間タンパク質の修飾を阻害することが知られており、それによりこれらの薬剤が、糖尿病性ネフロパシーの対する保護を提供し得るグリコキシ化反応の阻害に加えて、機構が示唆される。ＡＧＥおよびＡＬＥの両方の形成における修正された効果は、血管コラーゲンの修飾（付着、硬化）が減少すること、改善された末梢灌流および酸素付加、脂質代謝の正常化および異脂血症の修正に至り得る。これらの病理学の間の原因−効果の関係は、本発明の実験および利用可能なデータによって測定できず、しかし、対照、糖尿病およびＰＭ処置糖尿病動物の組織中のＡＬＥの測定が、タンパク質の化学的修飾および糖尿病での合併症の発生におけるＡＧＥ−阻害剤の効果の後半な範囲を剥き出し得る。
【００６１】
異脂血症の遺伝、食物因子、および疾病、並びに主主の原因の間の複合相互作用を含めた異脂血症の複数の原因がある。その後、異脂血症を防止および／または治療する方法は、病因因子に依存し得る。ラットモデルでの過剰脂質摂取（すなわち、高カロリー食）によって引き越こされる上昇した血清脂質濃度を部分的に減少させるピリドキサミンが、先に報告された（Ｓｐｅｃｋ、米国特許番号第５，２８８，７１６号）。Ｓｐｅｃｋは、腎不全または脂質代謝における遺伝的欠如のような高脂血症の他の原因を開示していない。本出願に存在するデータより前に、欠陥のある脂質代謝によって引き起こされる高脂血症を治療または防止するピリドキサミンの使用についてのデータは存在しなかった。特に、Ｓｐｅｃｋらは、おびただしい代謝経路を劇的に影響し、そして広範な範囲の生理学的影響を示すことが知られた症状である糖尿病に関連した高脂血症を治療または防止する上でピリドキサミンの効果に関して何ら指針を示さなかった。
【００６２】
要約すると、我々は、ＡＧＥ阻害剤ＰＭおよびＡＧが、組織タンパク質の化学的修飾を阻害し、ネフロパシーの発生を阻止し、そして実質的に、ＳＴＺ糖尿病ラット中で異脂血症を逆転させることを示す。我々は、ＰＭおよびＡＧが、ＳＴＺ糖尿病ラットでの酸化還元不均衡を実質的に逆転することも示した。全身性酸化還元不均衡は、偽低酸素症、低酸素症、および組織中の虚血を示し、そしてその症状は、多くの疾病の状態に重要な役割を果すが、それに限定されないが、糖尿病合併症、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症；発作、炎症性外傷および疾病、加齢および組織虚血のような神経変性疾病が挙げられる。（例えば、Ａｎｄｒｕｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：２−４１−２０４８（１９９８年）；Ｈａｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５３：６６−７７（１９９８年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４６：７３１−７３５（１９９８年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７０：２２１２−２２１５（１９９８年）；Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７０：２３６−２３９（１９９９年）；ＦｌｏｗｅｒｓおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｎｅｗ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ６：１６９−１８０（１９９８年）；Ｐｉｅｄｉｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ １７６：６５５−６６４（１９９７年）参照）。したがって、酸化還元不均衡を治療および防止する方法は、これらの症状を治療する上で有用である。
【００６３】
一般に、ＰＭは、コラーゲンの非酵素的修飾の阻害でのＡＧに匹敵するようであったが、糖尿病ラットにおける生化学的および生理学的変化を阻害する上で明らかにいっそう有効である。我々の結果は、糖尿病における炭化水素および脂質の両方の改変した化学および生化学の間の相互作用の複合体ウェブを示唆する。動物の毒性学研究は、ＰＭが、低い毒性および優れた安全性プロファイルを示すことを示し、そしてＩ相臨床治験は、現在、糖尿病合併症の治療のためのＰＭの有効性を評価する試みで進行中である。
【００６４】
コレステロールおよびトリグリセリドの血漿濃度は、糖尿病ラット研究でのＰＭによっても低下された。ＰＭがコレステロールおよびトリグリセリドを低下させる機構は、知られていないが、しかしＰＭは、コレステロール合成および分解のある種の酵素的経路に影響し得ることを示唆する。例えば、ＰＭは、ヒドロキシメチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）リダクターゼまたはアンギオテンション変換酵素（ＡＣＥ）を阻害し得る。皮膚におけるＡＧＥ形成の血漿クレアチニンおよび尿中アルブミン、そして糖尿病動物モデルので総コレステロールおよびトリグリセリドの低下は、ＰＭが、糖尿病および異脂血症の両方から生じる合併症の発生に関連した幾つかの改変された代謝過程およびタンパク質損傷を阻害する能力のある多目的薬剤であるという仮定を支持する。
【００６５】
我々は、ＰＭの投与が、糖尿病でのネフロパシー、網膜症、および炎症治癒欠損を含めた血管機能障害と関連した糖尿病の合併症の防止のためと同様に、そして糖尿病なしの患者における血管疾病、組織低酸素症、および虚血の治療と同様に、血管疾病の治療に有用であることを立証し得ることを示唆する証拠をも提供する。
【００６６】
実施例２
酸化的タンパク質修飾を阻害するための化合物
本発明は、化合物、および一般式：
【化９】

（式中、Ｒ_１は、ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＨ、またはＣＨ_２ＣＯＯＨである；
Ｒ_２は、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ_２である；
Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ_３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ_３はＮＯ_２または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである）
を示す化合物およびその塩を含有する医薬組成物を包含する。
【００６７】
本発明は、化合物、および一般式：
【化１０】

（式中、Ｒ_１は、ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＨ、またはＣＨ_２ＣＯＯＨである；
Ｒ_２は、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ_２である；
Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ_３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ_３はＮＯ_２または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである；
Ｒ_４は、Ｈ、またはＣ１−１８アルキルである；
Ｒ_５およびＲ_６は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルカンである）
を示す化合物およびその塩を含有する医薬組成物をも包含する。
【００６８】
さらに、本発明は、式
【化１１】

の化合物をも予想する。
【００６９】
本発明の化合物は、それに限定されないが−ＮＨ_２、−ＮＨＲ、−ＮＲ_２、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、−ＯＣＲ、および−ＮＨ−ＣＯＣＨ_３（式中、Ｒは、Ｃ１−１８アルキルである）のような１つまたはそれ以上の電子抜取基を具体化できる。
【００７０】
本発明で「アルキル」および「低級アルキル」では、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、２−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、および３−メチルペンチルのような１−１８炭素原子を示す直鎖または分岐鎖アルキル基が意味される。特に示されない限り、ここでアルキル基置換基は、ヒドロキシ、モノ−またはジアルキルアミノ、フェニルまたはピリジルから独立に選択される少なくとも１つの基に都合により置換される。
【００７１】
本発明の「アルコキシ」および「低級アルコキシ」は、例えば、メトキシル、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペンチル、イソペントキシ、ネオペントキシ、ヘキソキシ、２−ヘキソキシ、３−ヘキソキシ、および３−メチルペントキシのような１−１８炭素原子を示す直鎖または分岐鎖アルコシキ基が意味される。
【００７２】
本発明の「アルケン」および「低級アルケン」は、例えば、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン、シスおよびトランス２−ブテン、または２−ペンテン、イソブチレン、３−メチル−１−ブテン、２−メチル−２−ブテン、および２，３−ジメチル−2−ブテンのような１−１８炭素原子を示す直鎖または分岐鎖アルケン基が意味される。
【００７３】
本発明の「その塩」によって、それに限定されないが、Ａｌ、Ｚｎ、Ｍｇ、ＣｕおよびＦｅのような上記化合物との塩および金属複合体として本発明の化合物が意味される。
【００７４】
当業者は、標準法および技術を用いて本発明の化合物を作製し得る。
【００７５】
本発明は、適切な担体中に１つまたはそれ以上の本発明の化合物、またはその塩を含むことを特徴とする、医薬組成物を包含する。本発明は、インビボでＡＧＥ形成に関連する病理学の治療的介在のために本発明の医薬品を投与する方法を包含する。本発明の１つの好ましい実施形態で、治療すべきＡＧＥ関連病理学は、糖尿病性ネフロパシーに関連する。
【００７６】
本発明は、その概念または基本的特徴から逸脱することなしに、他の形態で具体化されるか、または他の方法で行い得る。したがって、本開示および膨大な実施例は、全ての点で、例示的であって、限定的であるとして意図されるべきでなく、そして本発明の範囲は、付随の請求項に示され、そして全て等価性は、そこに受け入れられることが意図される。当業者は、本発明の等価な実施形態を認識でき、そして本開示の教示および日常的実験のみを用いてそのような実施形態を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＴＺ−糖尿病性ラットでのネフロパシーの発生におけるＡＧおよびＰＭの影響である。尿（２４時間サンプル）および血液を、蛋白尿（Ａ）および血漿クレアチニン（Ｂ）の測定のために４週間隔で収集した。非糖尿病性対照（●）、非糖尿病性対照＋ＰＭ（■）、未治療糖尿病（○）、糖尿病＋ＰＭ（□）、および糖尿病＋ＡＧ（△）群についてのデータは、平均±ＳＥＭとして表される。蛋白尿（Ｃ）を、実験の終わり（２８週の糖尿病）に２４時間収集で測定した。マン−ホワイトニーの等級総計試験によって測定された統計的要約は、Ａ、ＢおよびＣでの全糖尿病群対、非糖尿病性対照、ｐ≦０．００１である。（Ａ、蛋白尿）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．０００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＝０．０５であり、Ｄ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＜０．０１である。（Ｂ、クレアチニン尿）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．０００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＝０．０５、そしてＤ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＝０．０２である。（Ｃ、蛋白尿）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．０１、そしてＤ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ＮＳである。
【図２】 ＳＴＺ−糖尿病性ラットにおけるＡＧおよびＰＭの影響である。実験の終わり（２８週）に得られた血漿を、トリグリセリド（Ａ）、総コレステロール（Ｂ）、遊離脂肪酸（Ｃ）およびグリセロール（Ｄ）について分析した。非糖尿病性対照（●）、非糖尿病性対照＋ＰＭ（■）、未治療糖尿病群（○）、糖尿病＋ＰＭ群（□）、および糖尿病＋ＡＧ群（△）についてのデータは、平均±ＳＤである。統計的分析は、マン−ホワイトニーの等級総計試験によって行われた。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤでの全糖尿病群対、非糖尿病性対照、ｐ＜０．００１である。（Ａ）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＝０．０００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．０５、そしてＤ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＜０．０１である。（Ｂ）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ＮＳであり、Ｄ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＜０．０１である。（Ｃ）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＝０．００２であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．００１、そしてＤ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ＮＳである。（Ｄ）は、Ｄ対Ｃ、ｐ＜０．０００１であり、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．０００１、そしてＤ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．０００１、Ｄ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ＮＳである。
【図３】 ＳＴＺ−糖尿病性ラットでの酸化還元不均衡におけるＡＧおよびＰＭの影響である。実験の終わり（２８週）に得られた血漿を、乳酸塩（Ａ）およびピルビン酸塩（Ｂ）濃度について分析した。酸化還元状態の指数である乳酸塩／ピルビン酸塩のそれらの比は、フレーム（Ｃ）に示される。記号は、図２に凡例で定義される。統計的分析は、マン−ホワイトニーの等級総計試験によって行われた。（Ｃ、乳酸塩／ピルビン酸塩）は、Ｄ対Ｃ、ｐ＜０．０００１であり、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．００１、そしてＤ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＝０．００２；Ｄ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＜０．０１である。
【図４】 皮膚コラーゲン中のＡＧＥと、生化学および生理学上のパラメータとの間の相互関係である。相互関係は、ＣＭＬと血漿トリグリセリド（Ａ）との間、尿中アルブミンと血漿トリグリセリド濃度（Ｂ）との間、およびＣＭＬと尿中アルブミン濃度（Ｃ）との間で示される。パーソンの産物モーメント計算によって統計的分析が行われた。記号は、図２に凡例で定義される。相互関係の係数およびｐ値は、表３で要約される。

Claims (6)

1. ピリドキサミンを含むことを特徴とする、糖尿病哺乳類での高脂血症を治療または予防するための医薬組成物。
2. ピリドキサミンを含むことを特徴とする、糖尿病哺乳類での低酸素症または偽低酸素症を治療または予防するための医薬組成物。
3. 低酸素症または偽低酸素症が、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の増加を生じる請求項２に記載の医薬組成物。
4. ピリドキサミンを含むことを特徴とする、糖尿病哺乳類での高コレステロール血症を治療または予防するための医薬組成物。
5. ピリドキサミンを含むことを特徴とする、糖尿病哺乳類での高トリグリセリド血症を治療または予防するための医薬組成物。
6. ピリドキサミンを含むことを特徴とする、糖尿病哺乳類でのアテローム性硬化症を治療または予防するための医薬組成物。

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