JP4976851B2 - 脂質レベルを哺乳動物において低下させる方法 - Google Patents

Description

[0001] 本出願は、先行出願中の米国仮特許出願番号６０／５１４，４７６の利益を特許請求し、その開示はそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
背景技術
１．技術分野
[0002] 本出願は、生物医科学の分野に関し、そして特に、脂質レベルを哺乳動物において低下させる方法に関する。ある態様は、４−（２−ナフチルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸；２−（８−キノリノキシ）プロピオン酸；及びメチレンビス（４，４’−（２−クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸））のような化合物を投与することを含んでなる阻害へ向けられる。

２．背景技術
[0003] 糖尿病の制御及び合併症試験（The Diabetic Control and Complications Trial）（ＤＣＣＴ）とＵＫＰＤＳ研究により、高血糖症は、糖尿病性合併症の発症の主たる危険因子として同定された。糖尿病の制御及び合併症試験研究グループ（The Diabetes Control and Complications Trial Research Group）N. Engl. J. Med. 329: 977-986, 1993; 英国後向き糖尿病研究グループ（UK Prospective Diabetes Study Group）Lancet 352: 837-853, 1998。糖化最終産物（ＡＧＥ）の生成は、高血糖症と糖尿病の長期合併症の間の重要な病原性のつながりとして同定された。Makita et al., N. Eng. J. Med. 325: 836-842, 1993; Bucala and Cerami, Adv. Pharmacol 23: 1-33, 1992; Browlee, Nature 414: 813-820, 2001; Sheetz and King, J. A. M. A. 288: 2579-2588, 2002; Stith et al., Expert Opin. Invest. Drugs 11: 1205-1223, 2002。

[0004] 非酵素的な糖化（メイラード反応としても知られている）は、還元糖とタンパク質、脂質、及びＤＮＡのアミノ基との間の複雑な一連の反応であり、褐色化、蛍光、及び架橋結合をもたらす。Bucala et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6434-6438, 1993; Bucala et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 105-109, 1984; Singh et al., Diabetologia 44: 129-146, 2001。この複雑な縮合、転位、及び酸化のカスケードより、糖化最終産物（ＡＧＥ）として知られる、不均質、不可逆、タンパク分解抵抗性、抗原性の産物が産生される。Singh et al., Diabetologia 44: 129-146, 2001; Ulrich and Cerami, Rec. Prog. Hormone Res. 56: 1-2, 2001。これらＡＧＥの例は、Ｎ^ε−（カルボキシメチル）リジン（ＣＭＬ）、Ｎ^ε−（カルボキシエチル）リジン（ＣＥＬ）、Ｎ^ε−（カルボキシメチル）システイン（ＣＭＣ）、ａｒｇ−ピリミジン、ペントシジン、及びイミダゾリウム架橋のメチル−グロキサール−リジン二量体（ＭＯＬＤ）及びグリオキサール−リジン二量体（ＧＯＬＤ）である。Thorpe and Baynes, Amino Acids 25: 275-281, 2002; Chellan and Nagaraj, Arch. Biochem. Biophys. 368: 98-104, 1999。この種の糖化は、シッフ塩基の可逆的な生成より始まり、これが転位を受けて、安定したアマドリ生成物を生成する。

[0005] シッフ塩基とアマドリ生成物は、ともにジカルボニル中間体を介した一連の反応をさらに受けて、ＡＧＥを生成する。アラキドン酸やリノール酸のような多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の脂質過酸化もカルボニル化合物を生じる。この中には、ＭＧ及びＧＯのように、炭水化物より生成するものと同一であるものもあれば、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）、及び２−ヒドロキシヘプタナール（２ＨＨ）のように、脂質を特徴的とするものもある。Baynes and Thorpe, Free Rad. Biol. Med. 28: 1708-1716, 2000; Fu et al., J. Biol. Chem. 271: 9982-9986, 1996; Miyata et al., FEBS Lett. 437: 24-28, 1998; Miyata et al., J. Am. Soc. Nephrol. 11: 1744-1752, 2000; Requena et al., Nephrol. Dial. Transplant. 11 (supp. 5): 48-53, 1996; Esterbauer et al., Free Radic. Biol. Med. 11: 81-128, 1991; Requenta et al., J. Biol. Chem. 272: 17473-17479, 1997; Slatter et al., Diabetologia 43: 550-557, 2000 を参照のこと。これらの反応性カルボニル種（ＲＣＳ）は、タンパク質のリジン及びアルギニン残基と速やかに反応して、Ｎ^ε−カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、Ｎ^ε−カルボキシエチルリジン（ＣＥＬ）、ＧＯＬＤ、ＭＯＬＤ、マロンジアルデヒド−リジン（ＭＤＡ−リジン）、４−ヒドロキシノネナール−リジン（４−ＨＮＥ−リジン）、ヘキサノイル−リジン（Ｈｅｘ−リジン）、及び２−ヒドロキシヘプタノイル−リジン（２ＨＨ−リジン）のような、脂質過酸化最終産物（ＡＬＥ）の生成をもたらす。図１を参照のこと。Thorpe and Baynes, Amino Acids 25: 275-281, 2002; Miyata et al., FEBS Lett. 437: 24-28, 1998; Miyata et al., J. Am. Soc. Nephrol. 11: 1744-1752, 2000; Uchida et al., Arch. Biochem. Biophys. 346: 45-52, 1997; Baynes and Thorpe, Free Rad. Biol. Med. 28: 1708-1716, 2000。ＣＭＬ、ＣＥＬ、ＧＯＬＤ、及びＭＯＬＤは、脂質及び炭水化物の代謝より生じ得るので、組織タンパク質に対するこれらの化学修飾は、糖及び脂質の酸化より生じる酸化ストレスのバイオマーカーとして役立つ場合がある。Fu et al., J. Biol. Chem. 271: 9982-9986, 1996; Requena et al., Nephrol. Dial. Transplant. 11 (supp. 5): 48-53, 1996。しかしながら、この化学修飾と糖尿病性合併症の病理発生における「高血糖症」対「高脂血症」の相対的な役割については依然としてはっきりしない。追加的に、ＣＭＬ及びＣＥＬのようなタンパク修飾のいくつかのバイオマーカーは、糖又は脂質の供給源のどちらからも誘導される場合があり、実験データの解釈及び解析をさらに複雑にする。

[0006] ヒト糖尿病患者と糖尿病の動物モデルでは、上記の非酵素的な反応が促進されて、ヘモグロビン、アルブミン、ＬＤＬ関連タンパク質、及びアポプロテインに加えて、コラーゲン、フィブロネクチン、チューブリン、水晶体クリスタリン、ミエリン、ラミニン、及びアクチンのような長寿命の構造タンパク質上でのＡＧＥの蓄積を引き起こす。細胞の機能において重要な役割をしばしば有する、影響を受ける分子の構造及び機能上の完全性は、これらの修飾により混乱されて、腎臓、眼、神経、及び微小血管のような臓器の機能に対して重篤な結果を伴い、これにより腎症、アテローム性動脈硬化症、微小血管症、神経障害、及び網膜症のような様々な糖尿病性合併症が必然的にもたらされる。Boel et al., J. Diabetes Complications 9: 104-129, 1995; Hendrick et al., Diabetologia 43: 312-320, 2000; Vlassara and Palace, J. Intern. Med. 251: 87-101, 2002。

[0007] 現行の研究は、ＭＧＯ、ＧＯ、ＧＬＡ、デヒドロアスコルビン酸塩、３−デオキシグルコゾン、及びマロンジアルデヒドのような反応性カルボニル種がＡＧＥ／ＡＬＥ生成とタンパク架橋結合の強力な前駆体であることを示している。Lyons and Jenkins, Diabetes Rev. 5: 365-391, 1997; Baynes and Thorpe, Diabetes 48: 1-9, 1999; Miyata et al., J. Am. Soc. Nephrol. 11: 1744-1752, 2000; Thornalley et al., Biochem. J. 344: 109-116, 1999。in vitro 研究は、これらのカルボニルが主にアスコルビン酸塩及び多価不飽和脂肪酸を起源として、グルコースそれ自身を起源としないことをさらに示唆する。Miyata et al., FEBS Lett. 437: 24-28, 1993。

[0008] 直接の証拠は、腎臓、ラット水晶体の異なる病巣とアテローム性動脈硬化症における糖尿病性合併症の進行におけるＡＧＥ／ＡＬＥの寄与を示唆している。Horie et al., J. Clin. Invest. 100: 2995-3004, 1997; Matsumoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 241: 352-354, 1997; Bucala and Vlassara, Exper. Physiol. 82: 327-337, 1997;「心臓血管系機能の内分泌学（Endocrinology of Cardiovascular Function）」E. R. Levin and J. L. Nadler（監修）1998. Kluwer Acad. Publishers 中、Bucala and Rahbar, 159-180頁; Horie et al., J. Clin. Invest. 100: 2995-3004, 1997; Friedman, Nephrol. Dial. Transplant. 14(supp. 3): 1-9, 1999; Kushiro et al., Nephron 79: 458-468, 1998。いくつかの一連の証拠は、糖尿病における高血糖症が、メチルグリオキサール、グリコールアルデヒド、グリオキサール、３−デオキシグルコゾン、マロンジアルデヒド、及びヒドロキシノネナールのような反応性カルボニル種（ＲＣＳ）の増加を引き起こすことを示す。「カルボニルストレス」は、反応性カルボニル中間体がタンパク質のリジン残基と付加物を生成することを介した、タンパク質及び脂質の修飾の増加をもたらし、酸化ストレスと組織損傷がこれに続く。Lyons and Jenkins, Diabetes Rev. 5: 365-391, 1997; Baynes and Thorpe, Diabetes 48: 1-9, 1999; Miyata et al., J. Am. Soc. Nephrol. 11: 1744-1752, 2000。図１を参照のこと。

[0009] ＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ、ＥＵＲＯＤＩＡＢ後向き合併症研究グループ、Ｈｏｏｒｎ研究及びＵＫＰＤＳのようないくつかの最近の臨床試験は、一致して、糖尿病の人々と非糖尿病集団における、糖尿病性合併症（網膜症、腎症、心臓血管系疾患）の発症の独立した危険因子として血漿トリグリセリド濃度を同定している。Jenkins et al., Kidney Int. 64: 817-828, 2003; Chaturvedi et al., Kidney Int. 60: 219-227, 2001; van Leiden et al., Diabetes Care 25: 1320-1325, 2002; 英国後向き糖尿病研究（ＵＫＰＤＳ：１０）Diabetologia. 36: 1021-1029, 1993。これらの研究により、微小アルブミン尿症と血漿トリグリセリド及びコレステロールのレベルの間の強い相関性が確認された。さらに、ピリドキサミン（ＰＭ）及びアミノグアニジン（ＡＧ）（糖尿病及び高脂血症ラットにおいて知られる２つのＡＧＥ阻害剤）の脂質低下効果に関する最近の研究（Degenhardt et al., Kidney Int. 61: 939-950, 2002; Alderson et al., Kidney Int. 63: 2123-2133, 2003）は、これらの動物において増加した脂質過酸化が存在すること、そしてＰＭとＡＧが実際に脂質低下効果を有することを示唆した。さらに、ＰＭの脂質低下効果と、皮膚コラーゲン中のＡＧＥと血漿トリグリセリド及びコレステロールとの相関性は、糖尿病ラットにおいて脂質がＡＧＥの重要な供給源であり得ることを示唆した。ＰＭで処置した糖尿病及び高脂血症ラットの尿には、アラキドン酸及びリノール酸の脂質酸化中間体のいくつかのＰＭ付加物が実質的により高い濃度で排出され、これらの動物における脂質酸化の増加を示唆した。Metz et al., J. Biol. Chem. [Aug 15, 公表予定], 2003。これらの結果に基づいて、著者は、糖尿病及び肥満において、特に高脂血症又は脂質異常症の存在時には、たとえ高血糖症の非存在時でも、脂質がタンパク質の化学修飾の主要な供給源であり得ると結論した。Alderson et al., Kidney Int. 63: 2123-2133, 2003; Metz et al., J. Biol. Chem. [Aug 15, 公表予定], 2003。

[0010] ここ数年にわたり、いくつかの天然及び合成の化合物が潜在的なＡＧＥ／ＡＬＥ阻害剤として提唱されて、推進されてきた。これらには、アミノグアニジン、ピリドキサミン、ＯＰＢ−９１９５、カルノシン、メトホルミン、並びに、いくつかのアンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）とアンジオテンシンＩＩの１型受容体ブロッカー（ＡＲＢ）、アリール（及び複素環式）ウレイド及びアリール（及び複素環式）カルボキサミドフェノキシイソ酪酸の誘導体が含まれる。Rahbar et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 262: 651-656, 1999; Rahbar et al., Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 3: 360-366, 2000; Rahbar and Figarola, Curr. Med. Chem. (Immunol. Endocr. Metabol. Agents) 2: 135-161, 2002; Rahbar and Figarola, Curr. Med. Chem. (Immunol. Endocr. Metabol.) 2: 174-186, 2002; Forbes et al., Diabetes 51: 3274-3282, 2002; Metz et al., Arch. Biochem. Biophys. 419: 41-49; Nangaku et al., J. Am. Soc. Nephrol. 14: 1212-1222, 2003; Rahbar and Figarola, Arch. Biochem. Biophys. 419: 63-79, 2003。最近、これらの化合物の中に、in vivo で有効なＡＧＥ阻害剤であり、ストレプトゾトシン誘発性糖尿病において糖尿病性腎症の発症を妨げるものがあることが見出された。

[0011] この１０年間にわたり、糖尿病性腎症と他の糖尿病の合併症の病理発生の主要因子としてＡＧＥ／ＡＬＥを示唆する証拠が蓄積されてきた。非糖尿病ラットへＡＧＥを投与すると、糸球体硬化症及びアルブミン尿症をもたらし、糖尿病において腎損傷を引き起こすのにＡＧＥ単独で十分であり得ることを示している。Vlassara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11704-11708, 1994。糖酸化生成物の少ない食餌で飼育した糖尿病動物は、糖酸化生成物が多い食餌で飼育した動物と比較して、糖尿病性腎症の症状をさほど発現しなかった。Zheng et al., Diabetes Metab. Res. Rev. 18: 224-237, 2002。ＡＧＥ／ＡＬＥが少なくとも２つの主要な機序によって糖尿病の組織損傷の原因になることは広く受け入れられている。Browlee, Nature 414: 813-820, 2001; Stith et al., Expert Opin. Invest. Drugs 11: 1205-1223, 2002; Vlassara and Palace, J. Intern. Med. 251: 87-101, 2002。第一は、細胞外マトリックス構造と細胞内タンパク質の機能のＡＧＥ／ＡＬＥ生成及びＡＧＥ／ＡＬＥ−タンパク質架橋結合による、受容体非依存性の改変である。他は、様々な細胞表面受容体、特にＲＡＧＥとＡＧＥの相互作用を介した細胞機能の受容体依存性の変調である。Wendt et al., Am. J. Pathol. 162: 1123-1137, 2003; Vlassara, Diabetes Metab. Res. Rev. 17: 436-443, 2001; Kislinger et al., J. Biol. Chem. 274: 3170-3174, 1999。

[0012] 糖化／脂質過酸化最終産物（ＡＧＥ／ＡＬＥ）は、正常な老化プロセスだけでなく、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、及び慢性関節リウマチのような多様な衰弱化疾患の病理発生にも関連があるとされてきた。この病原性プロセスは、上昇した濃度の還元糖又は脂質過酸化産物が血中に、そして糖尿病で生じるような細胞内環境に存在するときに促進される。影響を受ける分子の構造及び機能の両方の完全性は、これらの修飾により混乱されて、短期及び長期において重篤な結果を生じる場合がある。高脂血症、高血糖症、糖尿病、及び「メタボリックシンドローム（代謝性症候群）」のような症候群は一般的であり、罹病及び死亡の一般的な原因であるので、これらの代謝状態の症状及び結果に対抗する方法が当該技術分野で求められている。

発明の要約
[0013] 故に、１つの態様において、本発明は、脂質レベルを哺乳動物において低下させる方法を提供し、該方法は、以下の化合物又はその医薬的に許容される塩：ＬＲ−９［４−（２−ナフチルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸］；ＬＲ−７４［２−（８−キノリノキシ）プロピオン酸］；及びＬＲ−９０［メチレンビス（４，４’−（２−クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸））］のいずれかの有効量を哺乳動物へ投与することを含んでなる。

[0014] 別の態様において、本発明は、脂質の上昇レベルより生じる、糖尿病より生じる合併症を治療する方法を提供し、該方法は、以下の化合物又はその医薬的に許容される塩：ＬＲ−９［４−（２−ナフチルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸］；ＬＲ−７４［２−（８−キノリノキシ）プロピオン酸］；及びＬＲ−９０［メチレンビス（４，４’−（２−クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸））］のいずれかの有効量を投与することを含んでなる。

[0015] なお別の態様において、本発明は、メンケス病、ウィルソン病、又はＸ染色体連鎖型弛緩性皮膚のある患者を治療する方法を提供し、該方法は、以下の化合物又はその医薬的に許容される塩：ＬＲ−９［４−（２−ナフチルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸］；ＬＲ−７４［２−（８−キノリノキシ）プロピオン酸］；及びＬＲ−９０［メチレンビス（４，４’−（２−クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸））］のいずれかの有効量を投与することを含む。

[0016] ３種の化合物（ＬＲ−９、ＬＲ−７４、及びＬＲ−９０）のストレプトゾトシン誘発性糖尿病ラットにおける効果を検討した in vivo 試験において、本発明の化合物は、ＡＧＥ生成のプロセスを阻害して、初期の腎疾患を予防することができただけでなく、脂質酸化反応の間に脂質過酸化最終産物（ＡＬＥ）の生成を阻害して、トリグリセリド及びコレステロールの糖尿病ラットにおいて増加した濃度を５０％より多く効率的に低下させて、糖尿病及び老化で通常認められる合併症を予防した。

好ましい態様の詳細な説明
[0017] 本明細書に考察するＬＲ化合物（図２を参照のこと）は、ＬＲ−１６より誘導される一群の新規芳香族化合物に属する。ＬＲ−１６は、ヘモグロビン分子の酸素アフィニティーを高めることにおいて２，３−ビスホスホグリセリン酸塩と相乗的なアロステリックエフェクターとして作用して、そしてそれは、コレステロールの豊富な食餌で飼育したラットにおいて血清コレステロールと低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を低下させることが示された。Lalezari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6117-6121, 1988。

[0018] 本明細書に提示する研究は、この新しいＬＲ化合物のいずれでも処置した糖尿病ラットがタンパク尿の発症とクレアチニン排出の低下に関する腎機能において統計的に有意な改善をもたらすことを示した。さらに、組織化学的な観察は、これらＬＲ化合物での処置により、未処置糖尿病ラットと比較した腎臓における糸球体硬化症、皮質尿細管変性、及びコラーゲン沈積の出現率の低下により示されるように、腎臓の構造傷害が最小化されることを示した。追加的に、本化合物は、糖尿病ラットの腎臓の間質拡張及び基底膜肥厚化を妨げた。上記の化合物は、高血糖症に対する効果を伴わずに、糖尿病ラットのコラーゲン組織及び腎臓における血清ＡＧＥの増加と免疫反応性ＡＧＥの in situ 蓄積を有効に阻害した。ＬＲ化合物は、糖尿病ラットの高脂血症に見出されるコレステロール及びトリグリセリド濃度を低下させたが、対照の非糖尿病ラットの脂質レベルは有意に変化させなかった。

[0019] 理論により束縛されることを望まなければ、糖尿病性腎症を予防することにおけるＬＲ化合物の有益な効果について提唱される２つの機序は、その脂質低下活性そのもの、又はそのＡＧＥ阻害剤及び抗酸化特性である。スタチンのような脂質低下化合物での処置による血漿脂質の低下は、非糖尿病性肥満ラットにおいて腎症に抗する防護をもたらすことが示されている。O'Donnell et al., Am. J. Kidney Dis. 22: 83-89, 1993; Oda and Keane, Kidney Int. Suppl. 71: S2-S5, 1999。一方、ＡＧＥ／ＡＬＥ阻害剤のピリドキサミンも、おそらくは脂質酸化からのＡＧＥ／ＡＬＥ生成の様々な反応性カルボニル中間体に干渉することによって、糖尿病ラットと非糖尿病性肥満ラットの両方で高脂血症及び腎症を矯正することが示されている。Degenhardt et al., Kidney Int. 61: 939-950, 2002; Alderson et al., Kidney Int. 63: 2123-2133, 2003。脂質過酸化に対してほとんど効果がないピリドキサミンと違って、３つのＬＲ化合物は、いずれも in vitro でＬＤＬ酸化の強力な阻害剤であった。

[0020] 従って、糖尿病ラットでの腎臓に対するその保護効果に加えて、上記の新規化合物は、アテローム性動脈硬化症と糖尿病の他の血管合併症の治療に使用することができる。そのような追加の有益な効果は、予想外であった。糖尿病ラットで見られる脂質過酸化の増加は、非糖尿病ラットに比べてこれらの動物では基質レベルがより高い（血漿脂質レベルが増加している）ことに相関しているという可能性があったが、非糖尿病と糖尿病対照ラットの両方において、血漿コレステロール又はトリグリセリド濃度と血漿脂質ヒドロペルオキシドのレベルとの間に有意な相関性はなかった。これらの結果は、脂質過酸化が血漿中の利用可能な全脂質とは無関係であり得ることを示唆し、このことは、ヒトや動物の研究における初期の観察事実と一致している。Griesmacher et al., Am. J. Med. 98: 469-475, 1995; Ihm et al., Metabolism 48: 1141-1145, 1999。より重要にも、上記の知見は、脂質過酸化産物の上昇が糖尿病ラットでの増加したＡＧＥ／ＡＬＥ生成の結果としての酸化ストレスの増加と関連し得ることを示している。

[0021] アミノグアニジン、ピリドキサミン、及びＯＰＢ−９１９５のような腎保護効果のある既知のＡＧＥ阻害剤は、高反応性ＲＣＳと相互作用してカルボニルトラップとして作用して、ＡＧＥ／ＡＬＥ生成を妨げることによってＡＧＥ／ＡＬＥ蓄積を防ぐと考えられている。しかしながら、これらＡＧＥ阻害剤の金属キレート化特性は、ＡＧＥ生成を in vivo で妨げることでその有効性に貢献する可能性がある。上記ＬＲ化合物の作用機序は依然として不明であるが、このＬＲ化合物は、Ｃｕ^２＋の強力な（ＡＧ及びＰＭより強力な）キレート化剤であり、アスコルビン酸の酸化の効果的な阻害剤である。さらに、上記の化合物は、ヒドロキシルラジカル生成を強く阻害して、ＬＲ−９０は、スーパーオキシド産生も妨げる可能性がある。あるＡＧＥ及びＡＬＥの生成に重要なタンパク質カルボニル及びアマドリ生成物の生成及び産生に関与する様々な経路では、フリーラジカル、遷移金属、又はその両方が必要とされる場合がある。Miyata et al., J. Am. So. Nephrol. 13: 2478-2487, 2002; Voziyan et al., J. Biol. Chem. (2003 Sep 15)[掲載予定]。しかしながら、主にＲＣＳを捕捉することによって作用するアミノグアニジン及びピリドキサミンと違って、上記の新規ＬＲ化合物は、酸化代謝に干渉することによって、例えば、ヒドロキシラジカルの生成を低下させて、糖／脂質酸化反応をさらに促進し得る金属イオンと相互作用することによって、ＲＣＳの生成も抑制する。

[0022] 注目すべきことに、化合物ＬＲ−９、−７４、及び−９０は、アスコルビン酸の銅触媒酸化の強力な阻害剤である。この観察事実より、ＬＲ−９、−７４、又は−９０のいくつかの追加の使用が指摘され、銅が関与する状態、症候群、又は疾患における治療薬としての使用が含まれる。体内で、銅イオンは、第一銅（Ｃｕ^＋）又は第二銅（Ｃｕ^＋＋）の状態で見出し得る。一般に、銅が関与する疾患は、２つの主要なカテゴリー：（１）過剰レベルの銅が含まれる、銅への環境曝露に関連した疾患、及び（２）酵素又は生物学的プロセスにおける銅の関与が含まれる、銅代謝、銅の体内分布、及び生物学的プロセスにおける銅の役割に関連した疾患へ分類される。疾患における関連が示唆される銅関連酵素には、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ）（筋萎縮性側索硬化症に関連する）；ドパミン及びノルエピネフリンのようないくつかの脳神経伝達物質を生成又は異化する、チロシンヒドロキシラーゼ及びドパミン−β−ヒドロキシラーゼ；神経伝達物質のノルエピネフリン、エピネフリン、及びドパミンの代謝においてある役割を担い、神経伝達物質のセロトニンの分解にも機能するモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）；コラーゲン及びエラスチンの架橋結合に必要とされるリジルオキシダーゼ；及び、ニューロンのミエリン鞘のような構造を含むリン脂質の合成に関与するチトクロムｃオキシダーゼが含まれる。

[0023] 銅結合タンパク質であるセルロプラスミンは、フリーの銅イオンが酸化傷害を触媒することを妨げると考えられている。セルロプラスミンはフェロキシダーゼ活性（第一鉄の酸化）を有し、これにより鉄をその輸送タンパク質上へロードすることが促進される。この移送により、フリー第一鉄イオン（Ｆｅ^２＋）がフリーラジカルの産生を促進することが妨げられる可能性がある。このように、血清銅のレベル、及び／又はセルロプラスミンの銅ローディング状況は、鉄代謝を変調させる可能性がある。銅依存型転写因子は、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ、カタラーゼ（別の抗酸化酵素）、及び銅の細胞保存に関連するタンパク質の遺伝子が含まれる、特定の遺伝子の転写に影響を及ぼす可能性がある。銅代謝が関与するさらに特定の疾患状態には、それぞれＯＭＩＮ参照番号＃３０９４００、＃２７７９００、及び＃３０４１５０により収載される、メンケス病（メンケスよじれ毛症候群としても知られる）、ウィルソン病、及びＸ染色体連鎖型弛緩性皮膚（ＩＸ型エーラース・ダンロス症候群又は後角症候群としても知られる）が含まれる。これらの病態で見られる特別の症状（例えば、骨粗鬆症、メンケス患者において血管の破裂又は閉塞をもたらす、脳損傷した脳動脈の灰色物質における神経変性）は、脳血管梗塞、血管破裂、等のような症状又は疾患プロセスにおける銅のより一般的な役割を示す可能性がある。

[0024] このように、銅は、正常又は疾患状態に存在するいくつかの生物学的経路において広汎な役割を担うので、ここでは、銅を変調させる化合物を使用する治療介入が有利であろう。そのような化合物の望ましい活性には、限定されないが、溶液中フリーな銅のキレート化、担体タンパク質からの銅の可動化、好ましい生物学的コンパートメントへの銅の最適な分配、生物学的コンパートメントへの銅の最適な封鎖、及び／又は銅排出の促進が含まれる場合がある。

[0025] 投与の有効な投与量及び形式は、個々の被検者の臨床状態（例えば、疾患の重症度及び経過）、投与の部位及び方法、投与のスケジューリング、患者の年齢、性別、体重、並びに医療従事者に知られている他の要因を考慮に容れる、受容された医療実践に従ってなされる。故に、被検者の治療用の本発明の組成物の投与量は、個々の被検者で増減すべきである。例えば、ｍｇ／ｍ^２（体表面積）に基づいた、様々な大きさ及び種の動物とヒトへの投与量の相互関係については、Freireich et al., Cancer Chemother. Rep. 50(4): 219-244 (1966) により記載されている。「有効量」は、当該技術分野で知られた手順により決定することができて、疾患状態における識別可能な変化を達成するようなものでなければならない。

[0026] ＡＧＥ生成と脂質代謝に対するその効果に加えて、ＬＲ治療は、組織損傷をもたらす炎症経路中のいくつかの工程にも影響を及ぼす可能性がある。ＬＲ−９０はまた、糖尿病ラットの腎間質組織において細胞浸潤を妨げた。実際、未処置の糖尿病ラットに数多くあって密集した集合体になっている好中球が、ＬＲ−９０処置した糖尿病ラットでは検出されなかったが、このことは、組織損傷の部位でのＣＭＬ生成が好中球による酵素的触媒作用により促進されるので、重要である。活性化された好中球は、ミエロペルオキシダーゼ−過酸化水素−塩化物系を使用して、ヒドロキシ−アミノ酸を、ＣＭＬの前駆体であるＧＬＡや他の反応性アルデヒドへ変換する。Anderson et al., J. Clin. Invest. 104: 103-113, 1999。そのようなＣＭＬ前駆体の in vivo 産生は、タンパク質のＣＭＬ付加物がＡＧＥのリガンドであり、細胞シグナル伝達経路を活性化して遺伝子発現を変調させるので、損傷の部位での追加のＡＧＥ産生を生じることによって、ここで観察される腎臓病理に主要な役割を担う可能性がある。in vitro 及び in vivo の研究は、ＣＭＬや他のＡＧＥが反応性酸素種の生成を亢進し、近位内皮細胞においてＮＦ−κＢ活性化を誘導して、いずれも腎傷害へ貢献し得る好炎症性遺伝子産物、サイトカイン、付着分子、及びＲＯＳの増加を存続させ得ることを示す。Morcos et al., Diabetes 51: 3532-3544, 2002; Boulanger et al., Kidney Int. 61: 148-156, 2002; Basta et al., Circulation 105: 816-822, 2002。

[0027] ＬＲ−９０処置は、腎皮質におけるニトロチロシン生成により示されるように、腎組織への全体的な酸化傷害を減らした。最近の研究は、ニトロチロシン濃度の増加が初期の糖尿病性尿細管傷害と腎疾患の進行に重要な役割を担うことを示している。Thuraisingham et al., Kidney Int. 57: 968-972, 2002。近位尿細管細胞は、一酸化窒素（ＮＯ）を産生して、これがスーパーオキシドと反応すると、強力な酸化体であるペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ⁻）を生成し得る。ペルオキシナイトライトは、タンパク質のチロシン部分をニトロシル化して、ニトロチロシンを産生する。Beckman and Koppenol, Am. J. Physiol. 271 (5 Pt 1): C1424-C1437, 1996; Reiter et al., J. Biol. Chem. 275: 32460-32466, 2000。in vitro 研究は、糖化それ自体が遷移金属を介したスーパーオキシド及びヒドロキシルラジカルの産生をもたらし得ることを示唆した。Sakurai et al., FEBS Lett. 236: 406-410, 1988; Yim et al., J. Biol. Chem. 270: 28228-28233, 1995; Ortwerth et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 245: 161-165, 1998。糖尿病性腎症のラットでのＣＭＬ−ＡＧＥ及びニトロチロシン染色の増加は、ラミプリルとアミノグアニジンにより弱めることができて、ＡＣＥ阻害とＡＧＥ生成の遮断がＲＯＳ生成のような共通の経路に関与する可能性があることを示している。Forbes et al., Diabetes 51: 3274-3282, 2002。

[0028] ＡＧＥ／ＡＬＥ生成は、触媒として作用する微量の鉄又は銅の存在下に、フリーラジカルが含まれる酸化中間体の産生による脂質の酸化を促進する場合がある。フリーラジカルの生成は、糖尿病では、グルコース酸化（糖酸化）、タンパク質の非酵素的糖化、糖化タンパク質の酸化的分解、及びＡＧＥ／ＡＬＥのＲＡＧＥとの相互作用により亢進される。異常に高いレベルのフリーラジカルと、同時の抗酸化防御機構の低落は、酸化ストレスの増加と後続の脂質過酸化をもたらす場合がある。今回の研究に示すように、糖尿病動物は、腎臓の尿細管及び糸球体において亢進したニトロチロシン染色と、血漿において増加した脂質ヒドロペルオキシドにより示されるように、腎臓と血漿の両方でより高いレベルの酸化ストレスを明示した。実験研究と臨床試験の両方での証拠は、高血糖症誘発性の酸化ストレスが糖尿病の脂質代謝において重要な役割を担う可能性があることを示唆する。

[0029] グルコース酸化と糖化は、ともに細胞膜のＰＵＦＡ過酸化を触媒する可能性がある。高グルコース環境において、組織内で捕捉されたタンパク質及びリポタンパク質は、糖化を受けて、ＲＯＳと脂質過酸化産物を産生する場合がある。しかしながら、今回の研究の結果に基づけば、未処置及びＬＲ処置の糖尿病ラットは、グルコース及びＨｂＡ１ｃの濃度において差異を示さず、高血糖症単独では、脂質過酸化のレベルに対して限定された影響しか及ぼさないことを示唆した。対照的に、未処置及びＬＲ処置の糖尿病動物のコラーゲンと腎臓では、ＡＧＥ／ＡＬＥのレベルに有意差があり、ＬＲ処置後に脂質及び脂質過酸化産物の濃度の減少が付随した。まとめると、上記のデータは、ＡＧＥ／ＡＬＥ生成の阻害により、糖尿病動物において酸化ストレスと後続の傷害を防ぎ得ることを示唆する。

[0030] 正常血糖性Ｚｕｃｋｅｒ肥満及び高脂血症ラットにおいてＡＧＥ／ＡＬＥ阻害剤のＰＭを用いた最近の研究は、炭水化物とＡＧＥではなく、脂質とＡＬＥが、糖尿病におけるほとんどの化学修飾と組織傷害の原因であるかどうかについていくつかの興味深い疑問を提起した。Mert et al., J. Biol. Chem. 278: 42012-42019, 2003; Januszewski et al., Biochem. Soc. Trans. B1: 1413-1415, 2003; Alderson et al., Kidney Int. 63: 2123-2133, 2003。これらラットにおける酸化ストレスは、脂質過酸化産物の最初の出現と抗酸化酵素活性の低下と同時に、腎臓病変及び腎機能不全の発症の引き金になり得る。Poirier et al., Nephrol. Dial. Transplant. 15: 467-476, 2000 を参照のこと。全体的に、上記の研究は、高脂血症と脂質過酸化が、高血糖症の非存在下に腎障害を独立的に引き起こす場合があることを示唆する。追加的に、高コレステロール血症と高トリグリセリド血症は、いずれも、腎疾患の発現の独立した危険因子として認知され、糖尿病と無関係なネフローゼ症候群とも関連がある。脂質低下薬（例えば、スタチン）による血漿脂質のさらなる低下は、糖尿病性腎症に抗する腎保護を成功裏にもたらした。本研究に記載されるように、ＬＲ−９とＬＲ−７４は、脂質過酸化反応を阻害し、それ故に全般的な抗酸化特性を保有する。これらの化合物は、いずれも、ＡＧ、ＰＭ、及びＬＲ−９０と比較してより弱いカルボニル捕捉活性を有するが、ヒドロキシルラジカル生成の強い阻害剤であり、必然的に、これら原型のＡＧＥ阻害剤と比較して、異なるＡＧＥ／ＡＬＥ阻害機序で作用している可能性がある。

[0031] 酸素、レドックス活性遷移金属、及びＲＯＳは、ＡＧＥ及びＡＬＥ生成の触媒である。従って、ある種のＡＧＥ及びＡＬＥの生成に重要な、ＲＣＳ及びアマドリ生成物の生成及び産生に関与する様々な経路には、フリーラジカル、遷移金属、又はその両方が必要とされる可能性がある。しかしながら、主にＲＣＳを捕捉することによって作用するＡＧ及びＰＭと異なり、本明細書で論じるＬＲ化合物には、おそらくはフリーラジカルの生成を阻害して、糖／脂質酸化反応をさらに促進し得る金属イオンと相互作用することにより酸化代謝に干渉することによってＲＣＳの産物を低下させる可能性もある。今回、ＬＲ化合物は、ＣＭＬ及びＣＥＬのようなＡＧＥ／ＡＬＥのレベルを低下させ、コラーゲンの化学修飾を阻害して、糖尿病動物の血漿及び腎臓における全体的な酸化ストレスを減少させた。すべてのこれらの効果は、血管壁の肥厚化と弾性の消失、膜透過性、及び炎症プロセス（ＲＡＧＥ相互作用を介した）に影響を及ぼす場合があり、これは、脂質異常症の予防をもたらす可能性がある。

[0032] ＬＲ化合物が血漿脂質を低下させて脂質過酸化反応を in vivo で阻害する方法がどうであれ、そのような効果は、これら化合物のあり得る治療適用を広げるものである。脂質過酸化物の分解は、ＡＧＥ及びＡＬＥを産生し得る様々なＲＣＳと、血管壁の形態（form）細胞における脂質及びリポタンパク質の蓄積をもたらし得る様々な脂質付加物を産生する一連の反応を始動させる。ＬＤＬは、血漿中の脂質ヒドロペルオキシドの主要な担体として同定されて、ＬＤＬの酸化修飾は、アテローム性動脈硬化症の発現における原因の工程として示唆されている。レドックス活性の遷移金属及びフリーラジカルは、ＡＧＥ生成及び糖酸化と同様に、このプロセスとの関連が示唆されてきた。ＬＤＬを in vivo で修飾することにおける遷移金属の実際の関与については相反する証拠があるが、ヒトのアテローム性動脈硬化巣は、上昇レベルのレドックス活性の銅及び鉄を含有して、ヒト及び動物のモデルでは、様々な抗酸化薬がＬＤＬ酸化を阻害して、アテローム性動脈硬化症の発現を遅延させることが示されている。金属キレート化療法は、冠動脈疾患のある患者の内皮機能を改善するのに有効である。このように、ＡＧＥ／ＡＬＥ生成を阻害して酸化ストレスを抑えることができる薬剤は、糖尿病被検者においてアテローム性動脈硬化症の発現を妨げることができる。本研究におけるＬＲ化合物の銅をキレート化する能力は、in vitro 及び in vivo で観察される脂質過酸化反応の阻害についての機序の１つになり得る。なぜなら、脂肪酸（リノール酸）と本化合物との間で形成される付加物がＲＰ−ＨＰＬＣを使用しても検出されず、上記の化合物は脂質酸化反応において消費されなかったからである。さらに、どの化合物にもリポソームキシゲナーゼ仲介性ＬＤＬ酸化の効果はなかった。これらの知見は、上記ＬＲ化合物が、主としてその抗酸化／金属キレート化特性により、ＡＧＥ／ＡＬＥ生成と、少なくともある程度は脂質過酸化反応を阻害するという主張をさらに強める。今回の研究におけるＬＲ−７４の、ＬＲ−９に比べて全体的に優れた腎保護、脂質低下、及び抗脂質過酸化効果は、前者の化合物のより優れた抗酸化及びヒドロキシルラジカル捕集特性を反映するものであり得る。Figarola et al., Diabetologia 46: 1140-1152。しかしながら、両薬物を５０ｍｇ／Ｌで与えた場合、ＬＲ−７４はＬＲ−９用量の約１．５倍で投与された（ＬＲ−９の約０．１５ミリモル／Ｌに対してＬＲ−７４は０．２３ミリモル／Ｌ）。バイオアベイラビリティと薬物動態が同様であると仮定すると、動物に投与した投与量にこれだけの違いがあるにもかかわらず、ＬＲ−９の効果は、ＬＲ−７４と同じくらい印象的である。

[0033] 要約すると、我々は、ＡＧＥ／ＡＬＥ生成を in vivo で阻害して、糖尿病動物における初期の腎機能不全の進行を遅延又は阻害することもできる化合物を同定した。上記の化合物はまた、上記の動物において高脂血症を防いで、酸化ストレス全般を阻害する。本明細書に記載するＬＲ化合物は、ＡＧＥ／ＡＬＥと中間化合物の蓄積が主要な貢献因子である初期の腎疾患と他の糖尿病性合併症に有効な治療モダリティになり得る。そのＡＧＥ阻害特性とは別に、上記の化合物は、糖尿病性腎疾患とアテローム性動脈硬化症のいずれの発現にも影響し得る脂質低下特性を保有する。遷移金属をキレート化する本化合物の能力、ＲＣＳとの相互作用、及び／又はＲＣＳ生成への介入は、フリーラジカル産生を阻害することとともに、上記化合物の腎保護及び脂質低下効果に仲介する可能性がある。

実施例
実施例１．糖尿病及び対照ラットの処置
[0034] 雄性スプリーグ・ドーリーラット（約１７５〜２００ｇ）を処置前の１週間馴化してから、一晩絶食の後でＳＴＺ（クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中６５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により糖尿病にした。対照（非糖尿病）動物には緩衝液だけを注射した。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）注射から７日後に血漿グルコース濃度を測定することによって糖尿病を確認した。２０ミリモルより高い血漿グルコース濃度のある動物だけを糖尿病として分類して、本試験に使用した。これらの糖尿病ラットを未処置糖尿病対照群と糖尿病処置群へ無作為に分けた。処置群には、本試験の期間（ＬＲ−９０では３２週；ＬＲ−９及びＬＲ−７４では３０週）を通して、ＬＲ化合物をその飲料水中５０ｍｇ／ｌで与えた。すべての動物を個別に収容して、食餌と水を自由に摂取させた。

[0035] ラットより血液（尾静脈より）と尿の試料を血糖対照分析とアルブミン尿測定用に採取した。血漿グルコースと糖化ヘモグロビンを測定することによって、血糖を８週ごとにモニタリングした。血漿又は血清についても、全コレステロール及び全トリグリセリドを検査した。尿アルブミン対クレアチニン比（ＵＡ／Ｃｒ）と血清又は血漿クレアチニンを測定することによって、腎機能不全の進行を評価した。尿アルブミン及びクレアチニン濃度の測定には、ラットを代謝ケージに２４時間収容して、尿を採取ビーカーに採取して、細菌の増殖を阻害するために数滴のトルエンを加えた。

[0036] 本試験の最後に、ラットを秤量して、イソフルレンで麻酔し、心臓穿刺により血液を吸引して、氷上のヘパリン添加及び非ヘパリン添加した Vaculainer 管へ移した。次いで、これらの血液試料を血漿及び血清採取のためにそれぞれ遠心分離して、分析のときまで−７０℃で保存した。ラットを過剰麻酔と心臓穿刺により殺して、すぐに腎臓を取り出し、秤量し、被膜剥離して、ＰＢＳ緩衝液に濯いだ。この腎臓の切片を後続の顕微鏡検査と免疫組織化学のために１０％ ＮＢＦに保存した。各個別ラットの尾を切断し、除去して、５０ｍＬコニカル管に−７０℃で保存した。

[0037] 糖尿病ラットは、対照ラットと比較して、有意に増加した血漿グルコース及び糖化ヘモグロビン濃度を有した（ｐ＜０．０１）。表Ｉ及びＩＩを参照のこと。糖尿病は、体重増加の抑制にも関連した。化合物ＬＲ−９、ＬＲ−７４、及びＬＲ−９０での糖尿病ラットの処置は、血漿グルコースと糖化ヘモグロビンに影響を及ぼさなかったが、糖尿病対照ラットに比較して、体重の適度な増加をもたらした（ＬＲ−９０処置だけが統計学的有意差を示した）。ＬＲ化合物で処置した数匹の糖尿病ラットが試験期間の最後に達しなかったが、その発生率は、糖尿病対照と比較して増加しなかった。追加的に、非糖尿病対照ラットとすべてのＬＲ化合物で処置した非糖尿病ラットより死亡は記録されなかった。

[0038] 本実施例と以下の実施例に提示するデータの統計解析は、はじめにＡＮＯＶＡにより解析して、不対Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、群平均値間の事後比較を解析した。０．０５未満のｐ値を統計学的に有意とみなした。データは、平均±ＳＤとして提示する。

表Ｉ．ＳＴＺ糖尿病ラットの体重及び血糖に対するＬＲ−９０の効果（３２週の処置）

ａ ＮＤ＝非糖尿病；Ｄ＝糖尿病
ｂ 非糖尿病対照ラットに対してｐ＜０．０５
ｃ 糖尿病ラットに対してｐ＜０．０５
表ＩＩ．ＳＴＺ糖尿病ラットの体重及び血糖に対するＬＲ−９及びＬＲ−７４の効果（３０週の処置）

ａ ＮＤ＝非糖尿病；Ｄ＝糖尿病
ｂ 非糖尿病対照ラットに対してｐ＜０．０５
ｃ 糖尿病ラットに対してｐ＜０．０５
実施例２．脂質代謝に対する効果
[0039] 糖尿病ラットは、非糖尿病ラットと比較して、全血漿／血清トリグリセリドとコレステロールの両方の上昇レベルを示した（ｐ＜０．００１）。図３を参照のこと。ＬＲ化合物のいずれかで処置した糖尿病ラットは、トリグリセリド及びコレステロールの両方の濃度において有意な低下を示した。ＬＲ−９０は、血清トリグリセリドと血清コレステロールを非糖尿病動物のレベルの方へ５０％低下させた（図３）。同様に、糖尿病ラットの血漿トリグリセリド及びコレステロールのレベルも、ＬＲ−９とＬＲ−７４の両方によりそれぞれ６０％及び５０％より多く低下した（図４）。

実施例３．腎機能に対する効果
[0040] 腎機能の指標として、尿アルブミン、血漿クレアチニン濃度、及び尿アルブミン／クレアチニン比を使用した。非糖尿病対照ラットと比べて、尿アルブミン排出、血漿クレアチニン濃度、及びＵＡ／Ｃｒは、糖尿病動物において有意に増加した。表ＩＩＩ及びＩＶを参照のこと。糖尿病ラットのＬＲ化合物での処置は、尿アルブミン排出及びＵＡ／Ｃｒの上昇を阻害して、未処置糖尿病ラットに比較して約５０％の濃度の低下を伴った。さらに、糖尿病動物において観察される血漿クレアチニン濃度の上昇は、ＬＲ−９、ＬＲ−７４、又はＬＲ−９０のいずれの処置でも５０％ほど有意に減少した。

表ＩＩＩ．ＳＴＺ糖尿病ラットの腎機能パラメータに対するＬＲ−９０の効果

ａ ＮＤ＝非糖尿病；Ｄ＝糖尿病
ｂ 非糖尿病対照ラットに対してｐ＜０．０５
ｃ 糖尿病ラットに対してｐ＜０．０５
表ＩＶ．ＳＴＺ糖尿病ラットの腎機能パラメータに対するＬＲ−９及びＬＲ−７４の効果

ａ ＮＤ＝非糖尿病；Ｄ＝糖尿病
ｂ 非糖尿病対照ラットに対してｐ＜０．０５
ｃ 糖尿病ラットに対してｐ＜０．０５
実施例４．血清ＡＧＥに対する効果
[0041] Al-Abed et al., Meth. Enzymol 309: 152-172, 1999 の方法に従って血清ＡＧＥを測定して、Rahbar et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 262: 651-656, 1999 の方法を使用して、ポリクローナルＲ６／９抗ＡＧＥ ＲＮＡアーゼ抗体で定量した。１ＡＵを１μｇ／ｍｌ ＡＧＥ−ＢＳＡに等しいと仮定した。

[0042] 糖尿病ラットは、非糖尿病ラットに比較して、血清ＡＧＥのレベルの約５倍増加を有した（ｐ＜０．０５）。図５及び６を参照のこと。ＬＲ化合物で処置した糖尿病ラットでは、ＡＧＥ濃度が５０％も顕著に低下した。

実施例５．コラーゲン架橋結合、蛍光、及び酸溶解性
[0043] Kochakian et al., Diabetes 45: 1694-1700, 1996 に従って、尾腱コラーゲンの単離及び調製を実施した。コラーゲン中の架橋結合及びＡＧＥ生成の相対度をペプシン消化と酸溶解性により評価した。ペプシン消化は、Stefek et al., Biochim. Biophys. Acta 1502: 398-404, 2000 により既報のように実施した。簡潔に言えば、個々のラットからの１０ｍｇのコラーゲン試料を３７℃で２４時間、ペプシン（酢酸０．５モル／Ｌ中５０μｇ／ｍＬ）で消化した。消化後、試料を４℃で３０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離して、消化されたコラーゲンを含有する澄明な上清を採取した。上清の１００マイクロリットルのアリコートを、３６５ｎｍ励起と４１８ｎｍ放射での試料の蛍光の測定のために、９００μＬ ＰＢＳ緩衝液と混合した。酸加水分解に続いて既知の方法（Creemers et al., Biotechniques 22: 656-658, 1997）によるマイクロアッセイ法を使用して、上清のヒドロキシプロリン含量を算出した。

[0044] 尾腱コラーゲンの酸溶解性は、Yang et al., Arch. Biochem. Biphys. 412: 42-46, 2003 に概説される方法の変法により測定した。簡潔に言えば、約２ｍｇのコラーゲンの試料を秤量して、０．０５Ｍ酢酸に４℃で一晩可溶化した。この懸濁液を４℃で６０分間、２０，０００ｇで遠心分離して、上清とペレットを、酸加水分解に続くヒドロキシ含量の分析のために分離した。酸溶解性は、上清中のヒドロキシプロリンをペレット及び上清中の全ヒドロキシプロリン含量で割った百分率として算出した。

[0045] 尾コラーゲン中の蛍光ＡＧＥのレベルは、非糖尿病動物に比較して、糖尿病ラットで約４倍増加した。ＬＲ処置した糖尿病ラットは、未処置糖尿病ラットと比較して、蛍光及び架橋結合の有意な低下を示した（図７Ａ：ＬＲ−９０；図７Ｂ：ＬＲ−９及びＬＲ−７４）。同様に、尾腱コラーゲンを弱酢酸に可溶化するとき、糖尿病ラットのコラーゲンは、この酸溶液においてごく低い溶解性を示した。ＬＲ化合物を受けた糖尿病ラットは、尾腱コラーゲンの酸溶解性を有意に増加させた（図８）。

実施例６．腎臓の解剖学及び組織病理学に対するＬＲ化合物の効果
[0046] 糸球体硬化症（糸球体基底膜の肥厚化、糸球体間質肥大、及び毛細管閉塞として定義される）を定量するために、腎臓切片を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）試薬で染色した。各ラット腎臓（各処置につき４つの異なる腎臓）より全部で１５０の糸球体を無作為に選択して、盲検の評価者により、硬化症を慎重に等級付けた。各糸球体における硬化症の度合いは、以下のように、１〜４のスケールで主観的に等級付けた：等級１、硬化症領域が２５％未満；等級２、硬化症領域が２５〜５０％；等級３、硬化症領域が５１〜７５％；及び、等級４、硬化症領域が７５％より多い。次いで、以下の式を使用して、糸球体硬化症指標（ＧＳＩ）を算出した：ＧＳＩ＝Σ^４ _ｉ＝１Ｆｉ（ｉ）（ここでＦｉは、（Ｉ）のスコアを与えられたラットにおける糸球体の百分率である）。Wilkinson-Berka et al., Diabetes 51: 3283-3289, 2002 を参照のこと。糸球体硬化症を定量するために、腎臓切片を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）試薬で染色した。

[0047] ＰＡＳで染色した５μｍ厚の腎臓切片由来の腎間質において細胞浸潤を認めた。各腎臓試料中の浸潤を、やはり盲検のやり方で以下のように等級付けた：＋（斑点状で希薄）、＋＋（斑点状で濃厚）、＋＋＋（広汎性で、好中球の凝集物が尿細管又は間質に密集している）。腎臓中のコラーゲン沈積染色では、各処置群由来の腎臓よりパラフィン切片を無作為に選択して、マッソン・トリクロームで染色した。簡潔に言えば、この切片を脱パラフィン化し、水で水和させて、Ｂｏｉｕｉｎ溶液中のＭｏｒｄａｎｔに１０分間浸した。次いで、切片を水で濯ぎ、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで６分間染色した。水中で濯いだ後で、ビーブリッヒ赤−酸性フクシンを２分間加え、濯ぎ、リンモリブデン−リンタングステン溶液を１５分間加えた後で、アニリンブルー溶液を１０分間加えた。切片を水で濯いだ後で、氷酢酸を２０秒間加えてから、スライドを９５％エタノールで脱水した。この方法で、青色と赤色は、コラーゲンと細胞質の染色をそれぞれ示す。変性した尿細管は、細胞質の非存在により同定した。ピクロシリウスレッド染色を使用して、糸球体中のコラーゲン線維沈積についての追加染色を実施した。

[0048] 腎形態計測の検査では、各群からの腎臓試料をカコジル酸塩緩衝液中２％グルタルアルデヒドで一晩後固定した。切片を１μ厚へ切って、トルイジンブルーで染色した。次いで、８０ｎｍ切片をダイアモンドナイフで切断し、Ｆｏｒｍｖａｒコート、カーボンコートしたスロット銅グリッドに拾い上げて、５％酢酸ウラニル水溶液で１５分間染色した後で、１滴のクエン酸鉛を加えて２分間インキュベートした。このグリッドを観察し、高解像の透過型電子顕微鏡で撮影した。この映像を使用して、糸球体の基底膜及び間質の拡大の幅を決定した。

[0049] 平均の腎臓重量は、絶対重量においても、全体重の分数としても、非糖尿病動物に比較して、糖尿病ラットで有意に増加したが、ＬＲ処置と未処置糖尿病対照ラットの腎臓重量の間で統計学的有意差は検出されなかった。糖尿病対照動物の腎臓に偶然の嚢胞が観察されたが、これらは、ＬＲ処置ラットにおいてさほど頻繁ではなかった。さらに、未処置とＬＲ処置糖尿病動物の両方からの他の主要臓器（心臓、肝臓、腸）において腫瘍増殖の証拠はなかった。

[0050] 非糖尿病ラットでは、ほとんど肥厚化していない基底膜と少数例の糸球体硬化症を除けば、考慮すべき超微細構造の異常を腎臓に検出しなかった（図９）。ほとんどの糸球体は、ＴＥＭにより明らかにされるような正常な細胞充実性、正常な糸球体間質、及び約１５０ｎｍの基底膜がある正常な超微細構造の外観を示した（図１０）。上記の動物では、腎間質において細胞浸潤を検出しなかった。未処置糖尿病ラットでは、多くの糸球体が顕著に増加した細胞充実性と増加した糸球体間質細胞及びマトリックスのある肥厚化した基底膜（約２７０ｎｍ）を示すことをＴＥＭデータが示し（図１０）、このことは、ＧＳＩの増加に反映された（図９）。また、リンパ球及び好中球の濃密な凝集体が含まれる、数多くの細胞浸潤も観察された（データ示さず）。

[0051] ＬＲ化合物で処置した糖尿病ラットも細胞充実性の増加を示したが、未処置糖尿病動物のそれほど顕著ではなかった。腎間質にはリンパ球だけが観察された。さらに、未処置糖尿病ラットより少ない糸球体傷害、より薄い基底膜（約２２０ｎｍ）、そして有意に低いＧＳＩがあった（ｐ＜０．０５，図９及び１０）。さらに、尿細管間質及び糸球体におけるコラーゲン沈積（青色）と変性尿細管（細胞質の非存在又は赤みがかった色により同定される）の数は、非糖尿病対照ラットと比較して糖尿病ラットでいずれも増加し、ＬＲ処置は、コラーゲン染色の量と変性尿細管の頻度を非糖尿病対照ラットのそれとほとんど同様の程度まで低下した（図１１）。腎臓をピクロシリウスレッドで染色したとき、同様の結果を観察した：ＬＲ−９０処置は、糸球体及び尿細管間質の内部に沈積するコラーゲンの量を低下させた（図１２）。

実施例７．ＡＧＥ免疫組織化学
[0052] 免疫組織化学的なＡＧＥ染色のために、ホルマリン固定したパラフィルム埋込み切片（厚さ２μｍ）を、２−アミノプロピルトリエトキシシランでコートしたスライドに載せて、５８℃で３時間焼き、脱パラフィン化し、３％過酸化水素水で濯いで、プロテイナーゼＫ（０．５ｍｇ／ｍＬ）とともに室温で５分間インキュベートした。上記の切片をリンス緩衝液で洗浄し、タンパク遮断剤で５分間遮断して、引き続き、ＣＭＬに特異的な６Ｄ１２抗ＡＧＥマウスモノクローナル抗体とともに室温で３０分間インキュベートした。リンス緩衝液で洗浄後、この切片を標識ポリマーペルオキシダーゼ共役マウス抗ＩｇＧのあるＥｎＶｉｓｉｏｎ^ＴＭとともに室温で３０分間インキュベートし、続いて色素原としての３，３’−ジアミノベンチジン四塩酸塩溶液と対比染色としての５０％ヘマトキシリンで検出した。

ラット腎臓におけるＡＧＥの免疫組織化学染色は、非糖尿病対照ラットと比較して、糖尿病ラットでは腎臓糸球体と皮質尿細管にＡＧＥの広汎な染色があることを示した。ＬＲ−９０処置は、ＡＧＥがこれらの領域に沈積することを明瞭に抑制した（図１３）。ＬＲ−９又はＬＲ−７４で処置したラットの腎臓でも、ＡＧＥ染色の同様の低下を観察した。

実施例８．ニトロチロシン染色
[0053] タンパク酸化のマーカーであるニトロチロシンを、反応性窒素種により引き起こされる酸化的組織傷害の指標として使用した。ニトロチロシンの免疫組織化学的な検出は、既報（Forbes et al., Diabetes 51: 3274-3282, 2002）のように実施して、本研究では、ほとんど変更を加えずに従った。簡潔に言えば、各処置群からの代表的なラットより３２週で採取した、ホルマリン固定した腎臓切片（厚さ５μｍ）をスライドに載せて、脱ワックスして、水和させた。プロテイナーゼＫと１０分間のインキュベーション後、切片を３％過酸化水素水において２０分間インキュベートし、ブタ正常血清で２０分間遮断してから、市販のウサギポリクローナル抗ニトロチロシン抗体で１時間染色した。ＤＡＫＯリンス緩衝液で濯いだ後で、切片をビオチニル化抗ウサギＩｇＧとともに２５分間インキュベートし、アビジン−ビオチン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体との２５分間のインキュベーションを続けた。ペルオキシダーゼコンジュゲートの位置決定は、ジアミノベンチジン四塩酸塩（ＤＡＢ）溶液を色素原として、５０％ヘマトキシリンを対比染色として使用して明らかにした。

[0054] ニトロチロシンは、腎尿細管に主に検出され、糸球体にはほとんど染色が見えなかった。図１４を参照のこと。糖尿病ラットの腎尿細管では、非糖尿病動物と比較して増加したニトロチロシン染色を観察し、ＬＲ−化合物のいずれかで処置したラットは、皮質尿細管において、顕著に低下したニトロチロシン染色を示した。図１４を参照のこと。

実施例９．in vitro 試験
[0055] アスコルビン酸の銅触媒酸化の阻害の動態の in vitro 測定を、Price et al. J. Biol. Chem. 276: 48967-48972, 2001 の方法に従って実施した。簡潔に言えば、ＣｕＣｌ_２と様々な濃度の阻害化合物を、Ｃｈｅｌｅｘ処理した２０ミリモル／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）において５分間プレインキュベートした。次いで、アスコルビン酸（水中１０ミリモル／Ｌの５０μＬ）を加えて、反応を開始させた（全体の反応量：１ｍＬ）。ＣｕＣｌ_２とアスコルビン酸の反応物中での最終濃度は、それぞれ５００ナノモル／Ｌと５００マイクロモル／Ｌであった。アリコート（１３５μＬ）を０及び６０分で取り出して、１５μＬの１０ミリモル／ｌ ＤＴＰＡを含有する自動注入バイアルへ移した。自動注入器とＭｉｌｌｅｎｉｕｍ（登録商標）３２ソフトウェアが装備したＷａｔｅｒｓ（登録商標）２６９０ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｍｏｄｕｌｅを使用して、ＸＴｅｒｒａ^ＴＭ ＲＰ１８ ５μｍガードカラム付きＸＴｅｒｒａ^ＴＭ ＲＰ１８カラム（２５０ｍｍ ｘ ４．６ｍｍ，５μｍ）での逆相ＨＰＬＣにより試料を分析した。溶媒と勾配液は、いずれも Dillon et al., Life Sci. 72: 1583-1594, 2003 に記載のように使用した。アスコルビン酸の吸光度を２４４ｎｍで測定し、ピーク面積を得て、時間に対して残存するアスコルビン酸の百分率を推定した。それぞれの阻害化合物について、ＡＡ酸化の速度を５０％阻害する濃度（ＩＣ_５０）を、Ｐｒｉｓｍ^ＴＭソフトウェアを使用して、対照に関連して計算した。

[0056] ３種のＬＲ化合物、アミノグアニジン（ＡＧ）、及びピリドキサミン（ＰＭ）のＣｕ^２＋キレート化活性を図１５に示す。このアッセイにおいて、ＬＲ−９、ＬＲ−７４、ＬＲ−９０、ＰＭ、及びＡＧのＩＣ_５０値は、それぞれ２００、５０、２７５、１２５０、及び２７５０μＭであった。上記の結果は、in vitro ではＬＲ−７４がＬＲ化合物の中で最も強力な金属キレート化剤であり、上記のすべての新規化合物が既知のＡＧＥ阻害剤、ＡＧ及びＰＭのいずれよりも優れた金属キレート化剤であったことを示す。

[0057] 脂質過酸化を阻害するＬＲ化合物の能力について、タンパク質の脂質酸化修飾に関する研究の一般的な in vitro モデルである、Ｃｕ^＋＋仲介性脂質酸化を使用して試験した。ＬＤＬのＣｕ^＋＋仲介性酸化を使用して、脂質過酸化に対するＬＲ化合物の効果を試験した。Ｃｈｅｌｅｘ処理ＰＢＳ緩衝液単独、又は５μＭ ＣｕＣｌ_２、又は５μＭ ＣｕＣｌ_２＋様々な濃度の阻害化合物（１０〜２５０μＭ）の存在下にヒトＬＤＬ（５０μｇのタンパク質／ｍＬ）を３７℃でインキュベートした。５時間のインキュベーション後、反応混合物に産生されるチオバルビツール酸反応性物質の量（マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）当量として表す）を、Dillon et al., Life Sci. 72: 1583-1594, 2003 に記載の方法に従って計算した。簡潔に言えば、各試料からのアリコートを２０％トリクロロ酢酸で沈殿させ、遠心分離し、上清へ等量の１％チオバルビツール酸を加えた。次いで、この試料を９５℃まで１０分間加熱し、冷却後、吸光度を５３２ｎｍで読み取った。加水分解したテトラエトキシプロパンをＭＤＡ当量計算用の標準品として使用した。

[0058] 図１６に示すように、ＬＲ化合物は、いずれも濃度依存的なやり方でＬＤＬ酸かを阻害した。ＬＲ−７４及びＬＲ−９０の阻害活性は、ＡＧより優れていた。ＰＭには、脂質過酸化に対する効果がなかった。

[0059] フリーラジカル産生に対する上記化合物の効果を無細胞系で評価した。Giardino et al., Diabetes 47: 1114-1120, 1998 に記載のように、Ｈ_２Ｏ_２による安息香酸塩のヒドロキシル化によって、in vitro ヒドロキシルラジカル産生を定量した。簡潔には、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中３０ミリモル／Ｌの安息香酸ナトリウムを１０ミリモル／ＬのＨ_２Ｏ_２と、単独で、そして様々な量の阻害化合物の存在下に３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、各試料からのアリコートについて蛍光（３０５ｎｍ励起、４０８ｎｍ放射）を分析した。安息香酸塩のヒドロキシル化により産生されるサリチル酸当量の量（μＭ）として結果を表した。既知のヒドロキシルラジカル捕集剤であるマンニトールを対照としてこの実験に含めた。

[0060] 化合物のスーパーオキシドラジカル捕集活性は、Ukeda et al., Anal. Sci. 18: 1151-1154, 2002 に記載のＷＳＴ−１法を使用して評価した。簡潔に言えば、０．０５Ｍ Ｃｈｅｌｅｘ処理リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）において、様々な濃度の阻害化合物の存在下に、Ｎ−α−アセチル−リジンの有無でメチルグリオキサールをインキュベートした。スーパーオキシドの産生を４３８ｎｍで分光光度法によりモニタリングして、２つの既知のスーパーオキシドラジカル捕集剤であるスーパーオキシドジスムターゼ及びＴｉｒｏｎと比較した。

[0061] ３つのＬＲ化合物は、いずれも安息香酸ナトリウムと過酸化水素の反応より生成する⁻ＯＨラジカルを濃度依存的なやり方で阻害し、既知の⁻ＯＨラジカル捕集剤であるマンニトールより高い阻害活性であった。図１７Ａを参照のこと。ＷＳＴ−１アッセイを使用して、実際の糖化反応より産生されるスーパーオキシドをモニタリングすると、＞１ｍＭでのＬＲ−９０だけが、この反応より産生されるスーパーオキシドに対して有意な効果を示した。図１７Ｂを参照のこと。ＬＲ−７４は、ＡＧＥ阻害剤のアミノグアニジンと同様に、スーパーオキシド産生に対してほとんど、又は全く効果がなかった。

実施例１０．糖尿病ラットのＬＲ化合物処置
[0062] 雄性スプリーグ・ドーリーラットにおいて、一晩絶食後のＳＴＺ（６５ｍｇ／ｋｇ，クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中）の単回ｉ．ｐ．注射により、糖尿病を誘導した。非糖尿病動物には、クエン酸緩衝液だけを注射した。ＳＴＺ注射の１週後、＞２０ミリモル／Ｌの血漿グルコースを有する動物だけを糖尿病として分類して、本試験に含めた。糖尿病ラットを以下の処置群：糖尿病未処置（Ｄ）；及び、ＬＲ−９（Ｄ＋ＬＲ−９）又はＬＲ−７４（Ｄ＋ＬＲ−７４）のいずれかを飲料水中５０ｍｇ／Ｌで摂取する２つの糖尿病処置群へ無作為に分けた。３つの非糖尿病群：１つの未処置非糖尿病群（ＮＤ）と、飲料水中５０ｍｇ／ＬのＬＲ−９（ＮＤ＋ＬＲ−９）又はＬＲ−７４（ＮＤ＋ＬＲ−７４）のいずれかで処置する２つの非糖尿病群も同時に試験した。

[0063] 薬物の投与前に血漿グルコースと体重をともに検査したが、３つの糖尿病処置群の間にも、３つの非糖尿病群の間にも差を検出しなかった。動物はすべて個別に収容して、食餌と水を自由に摂らせた。血糖コントロールと体重を定期的にモニタリングした。高血糖症を制限して、動物が体重を維持することを確実にするために、糖尿病動物には、３ＩＵのＵｌｔｒａｌｅｎｔｅ（持続型）テインスリンを週２〜３回与えた。本試験は、３２週にわたって行った。腎機能不全の進行は、既知の方法に従って、尿アルブミン及び血漿クレアチニンの濃度を測定することによって評価した。Figarola et al., Diabetologia 46; 1140-1152, 2003。

[0064] 糖尿病動物は、非糖尿病ラットより高いグルコース及びＨｂＡ１ｃ濃度と、より低い体重を有した（Ｐ＜０．００１）。ＬＲ−９又はＬＲ−７４のいずれかでの処置は、ＮＤ又はＤラットのいずれでも、高血糖症及び体重増加に対して効果を及ぼさなかった。すべての糖尿病動物は、はじめは、各群で９匹の動物を含んだ。この試験の終了時に、この数は、糖尿病対照（ｎ＝５）、ＬＲ−９（ｎ＝６）、及びＬＲ−７４（ｎ＝６）処置糖尿病ラットにおいて低下した。非糖尿病群では死亡が観察されなかった。

[0065] 糖尿病は、尿アルブミン排出と血漿クレアチニン濃度の増加と関連した（非糖尿病対照に対してＰ＜０．００１）。表Ｖを参照のこと。糖尿病ラットをいずれかのＬＲ化合物で処置すると尿アルブミン排出の上昇が阻害され、未処置糖尿病ラットに比較して濃度の約５０％の低下を伴った。糖尿病動物で観察される血漿クレアチニン濃度の上昇も、ＬＲ−９又はＬＲ−７４のいずれかの処置でほぼ５０％有意に減少した。追加的に、糖尿病ラットは、非糖尿病動物と比較してより高い腎臓重量を有し（Ｐ＜０．０５）、腎肥大症を示唆した。いずれかのＬＲ化合物での処置は、これらの変化をやや減弱させた。表Ｖを参照のこと。

表Ｖ．ラットの身体及び代謝パラメータ

^ａ左及び右腎臓重量の体重に対する比
^＊ＮＤに対してＰ＜０．０５；^＊＊Ｄに対してＰ＜０．０５；^＊＊＊Ｄに対してＰ＜０．０１。

実施例１１．ＡＧＥ免疫組織化学染色
[0066] 本試験の３２週目に、イソフルレンでの過剰麻酔と心臓穿刺によりラットを殺した。各動物より血液試料を採取し、ヘパリン添加した Vaculainer 管へ移してから、血漿単離のために遠心分離した。これら血漿試料のアリコートを分析のときまで−７０℃で保存した。すぐに腎臓を取り出し、被膜剥離して、ＰＢＳ緩衝液中で濯いだ。左腎臓の切片を後続の顕微鏡検査とＡＧＥ免疫組織化学のために１０％中性緩衝化ホルマリンに保存した。各個別ラットの腹皮及び尾の切片を取り出し、ＰＢＳ緩衝液中で濯ぎ、後続のＡＧＥ定量と架橋結合分析のために−７０℃で保存した。

[0067] ラット腎臓中のＡＧＥについての免疫組織化学染色は、非糖尿病対照ラットと比較して、糖尿病ラットの腎臓糸球体及び皮質尿細管にＣＭＬ−ＡＧＥの広汎な染色があることを証明した。いずれかのＬＲ化合物での処置は、明らかに、上記の領域において、特に糸球体において沈積するＣＭＬ−ＡＧＥの増加を妨げた。図１８を参照のこと。

実施例１２．コラーゲン中のＡＧＥ生成
[0068] 実施例１１の各ラットより尾腱コラーゲンを単離して、コラーゲン中のＡＧＥ生成の度合いを、酵素消化後の蛍光ＡＧＥの測定により評価した。Figarola et al., Diabetologia 46: 1140-1152。皮膚コラーゲンの単離及び還元は、Shaw et al., Methods Mol. Biol. 186: 129-137, 2002 に記載のように実施した。ＡＧＥ／ＡＬＥのレベルをコラーゲン試料のリジン含量に対して正規化した。

[0069] 尾コラーゲン中の蛍光ＡＧＥのレベルは、未処置非糖尿病動物に比較して、未処置糖尿病ラットにおいて約５倍増加した。図１９を参照のこと。
[0070] Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｒｏ^ＴＭ Ｕｌｔｉｍａ三重四重極（Triple Quadripole）質量分析計へインターフェース連結したＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^ＴＭ ＬＣ１１００シリーズシステムを使用して、イオン対逆相液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法の分析を実施した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８ガードカラムを先付けしたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ^ＴＭ Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ ４μｍ ８０Ａ １５０ｘ２．０ｍｍカラムを使用して、ＨＰＬＣ分離を行った。カラム温度を２５℃に維持して、流速は、０．２ｍＬ／分であった。一定比の移動相は、水中１０％アセトニトリル及び０．１％ヘプタフルオロ酪酸からなった。全ランタイムは、１２分であり；注入量は、２０μＬであった。自動注入器の温度は、５℃であった。質量分光光度計のエレクトロスプレーイオン化源は、１９０Ｌ／時間のコーンガス流速と５５０Ｌ／時間の脱溶媒和ガス流速の陽イオンモードで操作した。毛管電圧は２．７ｋＶへ設定した。コーン電圧及び衝突槽電圧は、それぞれ、ＣＭＬについて２５Ｖ及び１３ｅＶ、ｄ_４ＣＭＬについて３３Ｖ及び１２ｅＶ、ＣＥＬについて２４Ｖ及び１４ｅＶ、ｄ_８ＣＥＬについて２９ｋＶ及び１４ｅＶ、そしてリジンについて２９ｋＶ及び１６ｅＶへ最適化した。電源温度は、１２５℃であった。脱溶媒和温度を３００℃へ高めて、溶媒遅延プログラムを０〜３分と１０〜２０分に使用した。上記化合物の断片化は、衝突解離条件下の酸性移動相で誘導することができる。前駆体→生成物イオンのｍ／ｚでの組合せ（ＣＭＬについて２０５．１→１３０．１１、ｄ_４ＣＭＬについて２０９．１２→１３４．１２、ＣＥＬについて２１９．１１→１３０．１１、ｄ_８ＣＥＬについて２２７．１８→１３８．１６、リジンについて１４７．１５→８４．２１、そしてＤＬ−ｄ_４リジンについて１５１．２７→８８．２３）を多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで使用して、上記の化合物を定量した。データの獲得及び処理には、ＭａｓｓＬｙｎｘ^ＴＭバージョン３．５ソフトウェアを使用した。

[0071] 標準品及び内部標準のすべての溶液を水で調製した。ＣＭＬとＣＥＬの両方を含有する標準溶液は、６つの濃度（ＣＭＬについては４、１０、２０、４０、１００、及び２００ピコモル／ｍＬ、ＣＥＬについては２、５、１０、２０、５０、及び１００ピコモル／ｍＬ）で調製した。品質保証（Quality Control）溶液は、２つの濃度（ＣＭＬについては７．５及び１５０ピコモル／ｍＬ、ＣＥＬについては３．７５及び７５ピコモル／Ｌ）で調製した。重標識内部標準（ｄ_４ＣＭＬ及びｄ_８ＣＥＬ）のストック溶液は、８００ピコモル／ｍＬで調製した。標準曲線の作成には、１３０μＬの標準溶液を１０μＬ ０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、１０μＬ ０．０５％ ＨＦＢＡ、及び１０μＬ内部標準ストック溶液と用時混合して、較正液（a caliber）を得た。次いで、このキャリブレータを同一２検体で検定して、ＣＭＬ及びＣＥＬの標準曲線を確定した。較正曲線は、標準品の濃度（Ｘ）に対して、標準ピーク面積の内部標準ピーク面積に対する比（Ｙ）でプロットした。標準曲線は、線形回帰により決定されるように、試験する範囲にわたって良好な直線性を表示した（ｒ^２＞０．９９）。処置試料については、各試料を水で１：１６にさらに希釈した後で、内部標準溶液と混合した。次いで、この希釈した試料の１３０μＬを１０μＬ ０．１Ｍ重炭酸アンモニウム、１０μＬ ０．０５％ ＨＦＢＡ、及び１０μＬ内部標準ストック溶液と用時混合した。

[0072] リジン含量の定量では、Ｌ−リジンの標準溶液を５つの濃度（０．４、０．８、１．６、３．２、及び６．４ナノモル／ｍＬ）で調製した。品質保証溶液は、２つの濃度（０．６及び５ｎｍ）で調製した。内部標準（ＤＬ−ｄ_４リジン）のストック溶液を１μｇ／ｍＬで調製し、標準曲線の作成のために、１００μＬの標準溶液を１０μＬ ０．０５％ ＨＦＢＡ及び２０μＬ内部標準ストック溶液と用時混合して、キャリブレータを得た。次いで、このキャリブレータを同一２検体で検定して、標準曲線を確定した。較正曲線は、標準品の濃度（Ｘ）に対して、標準ピーク面積の内部標準ピーク面積に対する比（Ｙ）でプロットした。標準曲線は、線形回帰により決定されるように、試験する範囲にわたって良好な直線性を表示した（ｒ^２＞０．９９）。それぞれの再水和コラーゲン試料を水で１：３０００にさらに希釈した後で、内部標準溶液と混合した。次いで、この希釈した試料の１００μＬを１０μＬ ０．０５％ ＨＦＢＡ及び２０μＬ内部標準ストック溶液と用時混合した。

[0073] 全体のＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ技術を使用すると、１日内の変動係数（ＣＶ）は、ＣＭＬとＣＥＬでそれぞれ４．１％未満と５．９％未満であった。日間のＣＶは、ＣＭＬで８．３％未満であり、ＣＥＬで５．６％未満であった。皮膚コラーゲンのＡＧＥ／ＡＬＥ含量の分析は、未処置非糖尿病動物に対して未処置糖尿病動物において、ＣＭＬ及びＣＥＬの両方の濃度で有意な増加を示した。ＬＲ−９及びＬＲ−７４処置は、ＣＭＬ及びＣＥＬの両方の濃度の増加を有意に制限した。図２０を参照のこと。

実施例１３．血漿脂質
[0074] 糖尿病ラットは、非糖尿病ラットと比較して、上昇レベルの血漿脂質を示した。図２１を参照のこと。血漿トリグリセリドは、未処置非糖尿病対照の８６±１４ｍｇ／ｄＬに比較して、糖尿病ラットでは５９８±１１０ｍｇ／ｄＬへ増加した（Ｐ＜０．００１）。血漿コレステロール濃度は、糖尿病動物において同様の増加を示した（非糖尿病の６１±７ｍｇ／ｄＬに対して、糖尿病ラットでは１３６±１３ｍｇ／ｄＬ）（Ｐ＜０．００１）。非糖尿病動物の脂質代謝には、いずれの化合物も効果がなかった。しかしながら、いずれかのＬＲ化合物で処置した糖尿病ラットは、トリグリセリド及びコレステロールの両方の濃度で有意な低下を示した。ＬＲ−９は、血漿トリグリセリド及びコレステロールをそれぞれ６０％及び３０％ほど低下させた（それぞれ、２３９±５０及び９６±５ｍｇ／ｄＬの平均／ＳＥＭ）。ＬＲ−７４処置は、未処置糖尿病動物と比較して、血漿グリセリドのほとんど７０％の低下（１６１±２９ｍｇ／ｄＬ）とコレステロールレベルのほぼ３０％の減少（９３±２ｍｇ／ｄＬ）をもたらした。血漿脂質ヒドロペルオキシド濃度は、非糖尿病動物と比較して、糖尿病対照ラットでほぼ５倍高かった（５．６±０．５μＭに対して２６．３±２．７μＭ）。図２１を参照のこと。ＬＲ−９又はＬＲ−７４での処置は、糖尿病動物の血漿脂質ヒドロペルオキシドをそれぞれ３５％と４５％実質的に低下させた。図２１を参照のこと。

実施例１４．ＳＴＺ糖尿病ラットの体重及び血糖に対するＬＲ−９及びＬＲ−７４の効果
[0075] 実施例１０に記載のようにラットを処置して、処置群へ分けた。薬物の投与前に血漿グルコースと体重をともに検査したが、３つの糖尿病処置群の間にも、３つの非糖尿病群の間にも差を検出しなかった。動物はすべて個別に収容して、食餌と水を自由に摂らせた。血糖コントロールと体重を定期的にモニタリングした。高血糖症を制限して、動物が体重を維持することを確実にするために、糖尿病動物には、３ＩＵのＵｌｔｒａｌｅｎｔｅインスリンを週２〜３回与えた。本試験は、３２週にわたって行った。

[0076] 上記の記載のように、糖尿病動物は、非糖尿病ラットより高いグルコース及びＨｂＡ１ｃ濃度と、より低い体重を有した（Ｐ＜０．００１）。ＬＲ−９又はＬＲ−７４のいずれかでの処置は、ＮＤ又はＤラットのいずれでも、高血糖症及び体重増加に対して効果を及ぼさなかった。すべての糖尿病動物は、はじめは、各群で９匹の動物を含んだ。この試験の終了時に、この数は、糖尿病対照（ｎ＝５）、ＬＲ−９（ｎ＝６）、及びＬＲ−７４（ｎ＝６）処置糖尿病ラットにおいて低下した。表ＶＩを参照のこと。非糖尿病群では死亡が観察されなかった。実施例１及び１０を参照のこと。

表ＶＩ．ＳＴＺ糖尿病ラットの体重及び血糖

ａ ＮＤ＝非糖尿病；Ｄ＝糖尿病
^＊ ＮＤラットに対してＰ＜０．０５を示す
実施例１５．糖尿病ラットでは、ニトロチロシン生成が増加する
[0077] ホルマリン固定したパラフィルム埋込み腎臓切片（厚さ２μｍ）をスライドに載せて、既知の方法に従って、ポリクローナル抗ニトロチロシン抗体で染色した。Figarola et al., Diabetologia 46; 1140-1152, 2003 を参照のこと。ニトロチロシン生成は、反応性窒素種より生じるタンパク質の酸化傷害の指標であり、糖尿病動物において、具体的には近位尿細管細胞において亢進していた。図２２を参照のこと。この増加した染色は、いずれかのＬＲ化合物の処置によって減弱した。

実施例１６．ヒト試料に対する in vitro 脂質過酸化の効果
[0078] 健常ドナーの血漿より、１回の垂直スピン遠心分離によりヒトＬＤＬを単離し（Chung et al., Methods Enzymol. 128: 181-209, 1986 を参照のこと）、調製の２４〜４８時間以内に使用した。５０ｍＭ Ｃｈｅｌｅｘ処理リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）単独、又は５μＭ ＣｕＣｌ_２、又は５μＭ ＣｕＣｌ_２＋様々な濃度のＬＲ化合物の存在下にＬＤＬ（５０μｇ／ｍＬ）を３７℃でインキュベートした。５時間のインキュベーション後、各反応混合物からのアリコートを、Satoh, Clin. Chim. Acta 90: 37-43, 1978 に記載のようなチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）の測定のために取り出した。簡潔に言えば、５００μＬの試料アリコートへ２５０μＬの２０％トリクロロ酢酸に続いて、７５０μＬの１％ ＴＢＡＲＳを加えた。次いで、この試料を激しく撹拌し、沸騰水浴において１０分間インキュベートした。冷却後、試料を５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清の吸光度を５３２ｎｍで読み取り、１，１，３，３−テトラメトキシプロパンを標準品として使用して、ＭＤＡ当量として表した。脂肪酸酸化の試験では、リノール酸（５ｍＭ）を２００ｎＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）において単独で、又は１ｍＭ ＬＲ化合物の存在下に３７℃で７日間インキュベートした。上記のようなＴＢＡＲＳの測定のために、各反応混合物よりアリコートを定期的に吸引した。アミノグアニジン（ＡＧ）とピリドキサミン（ＰＭ）を比較対照として２５０μＭで使用した。

[0079] 結果を図２３Ａに示すが、ここでは、２回の独立した実験（各処置につきｎ＝４）の平均±ＳＤとして数値を提供する。別の実験で、２５０μＭ化合物の存在時のＣｕ^＋＋によるＬＤＬの酸化的修飾の時間経過を５時間追跡して、各時間間隔のアリコートについてＴＢＡＲＳをアッセイした。図２３Ｂを参照のこと。図２３Ｂの数値は、２回の独立した実験（各処置につきｎ＝４）の平均±ＳＤである。

[0080] 図２３Ａに示すように、ＬＲ化合物は、ヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化を濃度依存的なやり方でＡＧ及びＰＭより多く阻害した。ＬＤＬのＣｕ^＋＋仲介性酸化動態は、約２時間のラグ相と進行相の２相を特徴とする。ＬＲ−７４又はＬＲ−９０のいずれかの存在は、観察し得る進行相がないような度合いまでラグ相を引き伸ばした。図２３Ｂを参照のこと。金属に触媒されるＬＤＬ酸化に対してＰＭが無効である一方で、ＬＲ−９は、対照に比較して、２時間後の酸化速度を有意に阻害した。

[0081] ＬＤＬの主要な脂肪酸であるリノール酸（ＬＡ）の酸化の動態試験において、ＬＲ化合物は、脂質過酸化産物、特にＭＤＡと関連アルデヒドの生成を妨げた。図２４を参照のこと。リノール酸（５ｍＭ）を上記のように単独で、又は１ｍＭ ＬＲ化合物又はピリドキサミン（ＰＭ）の存在下に、２００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）において３７℃で７日間インキュベートした。アリコートを定期的に吸引して、上記のＴＢＡＲＳ法によりアッセイした。標準品に基づいて、ＭＤＡ当量を評価した。

[0082] ＬＡ酸化は、インキュベーションの３日以内に増加してそのピークに達してから、その期間の後で徐々に低下した。ＬＲ−９とＬＲ−９０は、７日のインキュベーション期間を通してＬＡ酸化を完全に妨げた。ＬＲ−７４は、この酸化を完全には妨げなかったが、それは、３日目に観察される最大酸化を阻害した。一方、ＬＤＬ酸化での観察と同様に、ＡＧＥ／ＡＬＥ阻害剤のＰＭは、ＬＡ酸化に対して効果がなかった。図２４を参照のこと。

[0083]
図１は、反応性カルボニル種及びカルボニルストレスの代謝供給源を示す図解である。図中の星印は、ＬＲ化合物がその効果を発揮する仮説の経路を表す。 [0084] 図２は、化合物、ＬＲ−９［４−（２−ナフチルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸］；ＬＲ−７４［２−（８−キノリノキシ）プロピオン酸］；及びＬＲ−９０［メチレンビス（４，４’−（２−クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸））］の化学構造を示す。

[0085]
図３は、非糖尿病動物（ＮＤ）、糖尿病動物（Ｄ）、及びＬＲ−９０で３２週間処置した糖尿病動物において測定した、全血清トリグリセリド（３Ｂ）及びコレステロール（３Ａ）を示す（^★は、非糖尿病対照に対してｐ＜０．０５を示し；^★★＝糖尿病対照に対してｐ＜０．０５）。

[0086]
図４は、非糖尿病動物（ＮＤ）、糖尿病動物（Ｄ）、及びＬＲ−９又はＬＲ−７４で３０週間処置した糖尿病動物において測定した、全血漿トリグリセリド（４Ａ）及びコレステロール（４Ｂ）を示す（^★は、非糖尿病対照に対してｐ＜０．０５を示し；^★★＝糖尿病対照に対してｐ＜０．０５）。

[0087]
図５は、３２週間のＬＲ−９０処置後の血清ＡＧＥに対するＬＲ化合物の効果を示す。抗ＡＧＥ ＲＮＡアーゼポリクローナル抗体を使用して、血清ＡＧＥ濃度を免疫学的に測定した。^★は、非糖尿病対照に対してｐ＜０．０５であり；^★★＝糖尿病対照に対してｐ＜０．０５。

[0088]
図６は、３０週間のＬＲ−９又はＬＡ−７４処置後の血清ＡＧＥに対するＬＲ化合物の効果を示す。抗ＡＧＥ ＲＮＡアーゼポリクローナル抗体を使用して、血清ＡＧＥ濃度を免疫学的に測定した。^★＝非糖尿病対照に対してｐ＜０．０５；^★★＝糖尿病対照に対してｐ＜０．０５。

[0089]
図７は、ペプシン消化により（蛍光）測定した、ラット尾腱架橋結合に対するＬＲ化合物の効果を示す。^★は、非糖尿病対照に対してｐ＜０．０５を示し；^★★は、糖尿病対照に対してｐ＜０．０５を示す。

[0090]
図８は、弱酸中の溶解性により測定した、ラット尾腱架橋結合に対するＬＲ化合物の効果を示す。^★は、非糖尿病対照に対してｐ＜０．０５を示し；^★★は、糖尿病対照に対してｐ＜０．０５を示す。

[0091]
図９は、糖尿病ラットにおける糸球体硬化症の度合いに対するＬＲ−９０の効果を示す。糸球体硬化症指標（ＧＳＩ）は、各ラット中１５０の糸球体より計算した。^★は、非糖尿病対照に対してｐ＜０．０５を示し；^★★は、糖尿病対照に対してｐ＜０．０５を示す。

[0092]
図１０は、ＬＲ−９０が基底膜肥厚化を抑えたことを示す一連の写真である。腎臓切片を切断し、高解像ＴＥＭを使用して写真撮影して、基底膜の拡張及び肥厚化を示した。

[0093]
図１１は、非糖尿病ラット、糖尿病ラット、及びＬＲ−９０で処置した糖尿病ラット由来の腎臓におけるコラーゲン沈積及び皮質尿細管変性を示す、トリクローム染色した腎臓切片の一連の写真である。３２週での各処置群由来ラットのホルマリン固定腎臓切片をスライドに載せて、トリクロームで染色した。（Ａ）非糖尿病；（Ｂ）糖尿病；（Ｃ）糖尿病＋ＬＲ−９０。

[0094]
図１２は、腎臓におけるコラーゲン沈積を示す、ピクロシリウスレッド染色した腎臓切片の一連の写真である。３２週での各処置群由来ラットのホルマリン固定腎臓切片をスライドに載せて、ピクロシリウスレッドで染色した。（Ａ）非糖尿病；（Ｂ）糖尿病；（Ｃ）糖尿病＋ＬＲ−９０。

[0095]
図１３は、ＡＧＥの免疫組織化学染色を示す。３２週での各処置群由来ラットのホルマリン固定腎臓切片をスライドに載せて、ＣＭＬに特異的な６Ｄ１２モノクローナル抗ＡＧＥ抗体で染色した。（Ａ）非糖尿病；（Ｂ）糖尿病；（Ｃ）糖尿病＋ＬＲ−９０。

[0096]
図１４は、ニトロチロシンの免疫組織化学染色を示す。３２週での各処置群由来ラットのホルマリン固定腎臓切片をスライドに載せて、抗ニトロチロシンポリクローナル抗体で染色した。（Ａ）非糖尿病；（Ｂ）糖尿病；（Ｃ）糖尿病＋ＬＲ−９０。

[0097]
図１５は、アスコルビン酸のＣｕ^＋＋触媒酸化のＬＲ化合物による阻害に関するデータを既知のＡＧＥ阻害剤と比較して提供する。点線の水平線は、ＡＡの５０％損失を示す。

[0098]
図１６は、Ｃｕ^＋＋仲介性脂質過酸化のＬＲ化合物による阻害についてのデータを提供する。 [0099] 図１７は、フリーラジカル産生に対するＬＲ化合物の効果を示す。安息香酸塩のＨ_２Ｏ_２によるヒドロキシル化よりヒドロキシルラジカルを測定して、サリチル酸標準品より得られるサリチル酸塩当量として表した（１７Ａ）。メチルグロキサールとＮ−α−アセチル−Ｌ−リジンとの反応よりスーパーオキシド産生をモニタリングして、ＷＳＴ−１アッセイにより検出した（１７Ｂ）。

[0100]
図１８は、腎臓のＣＭＬ−ＡＧＥ蓄積に対する糖尿病とＬＲ処置の効果を示す。倍率 ２００ｘ。１８Ａ：ＮＤ；１８Ｂ：Ｄ；１８Ｃ：Ｄ＋ＬＲ−９；１８Ｄ：Ｄ＋ＬＲ−７４。

[0101]
図１９は、尾腱コラーゲン中の蛍光ＡＧＥのレベルに対する糖尿病とＬＲ処置の効果を示す。（Ａ）尾腱コラーゲンをペプシンで消化して、上清について蛍光ＡＧＥとＯＨ−プロリン含量を分析した（^★は、ＮＤに対してｐ＜０．０１を示し、^★★は、Ｄに対してｐ＜０．０５を示す）。

[0102]
図２０は、皮膚コラーゲン中のＡＧＥ／ＡＬＥのレベルに対する糖尿病とＬＲ処置の効果を示す。皮膚コラーゲンについて、ＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳを使用して、ＣＭＬ（２０Ａ）及びＣＥＬ（２０Ｂ）の濃度を分析した。^★は、ＮＤに対してｐ＜０．０１を示し；^★★は、Ｄに対してｐ＜０．０５を示す。

[0103]
図２１は、ＳＴＺ糖尿病ラットにおける（Ａ）血漿脂質及び（Ｂ）血漿脂質ヒドロペルオキシドの濃度に対する糖尿病とＬＲ処置の効果を示す。^★は、ＮＤに対してｐ＜０．０１を示し；^★★は、Ｄに対してｐ＜０．０５を示し；^★★★は、Ｄに対してｐ＜０．０１を示す。

[0104]
図２２は、腎臓のタンパク質酸化に対する糖尿病とＬＲ化合物の効果を示す一連の写真である。２２Ａ：非糖尿病対照；２２Ｂ：糖尿病対照；２２Ｃ：糖尿病＋ＬＲ−９；２２Ｄ：糖尿病＋ＬＲ−７４。倍率は２００ｘである。

[0105]
図２３は、Ｃｕ^＋＋仲介性ＬＤＬ酸化のＬＲ化合物による阻害を示す。 [0106] 図２４は、リノール酸酸化の動態に対するＬＲ化合物の効果を示す。標準品に基づいて、ＭＤＡ当量を評価した。数値は、各処置につきｎ＝４である２回の独立した実験の平均±ＳＤである。

Claims (8)

1. 哺乳動物において脂質レベルを低下させる化合物又は前記化合物の医薬的に許容される塩の有効量を含む医薬組成物であって、前記化合物が：
   LR-9［4-（2-ナフチルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸］；
   LR-74［2-（8-キノリノキシ）プロピオン酸］；及び
   LR-90［メチレンビス（4,4'-（2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸））］からなる群より選択される、前記医薬組成物。
2. 前記化合物がLR-9［4-（2-ナフチルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸］である、請求項1の医薬組成物。
3. 前記化合物がLR-74［2-（8-キノリノキシ）プロピオン酸］である、請求項1の医薬組成物。
4. 前記化合物がLR-90［メチレンビス（4,4'-（2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸））］である、請求項1の医薬組成物。
5. 哺乳動物の糖尿病より生じる合併症を治療するための化合物又は前記化合物の医薬的に許容される塩の有効量を含む医薬組成物であって、ここで前記合併症は、脂質の上昇レベルより生じ、前記化合物は：
   LR-9［4-（2-ナフチルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸］；
   LR-74［2-（8-キノリノキシ）プロピオン酸］；及び
   LR-90［メチレンビス（4,4'-（2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸））］からなる群より選択される、前記医薬組成物。
6. 前記化合物がLR-9［4-（2-ナフチルカルボキサミド）フェノキシイソ酪酸］である、請求項5の医薬組成物。
7. 前記化合物がLR-74［2-（8-キノリノキシ）プロピオン酸］である、請求項5の医薬組成物。
8. 前記化合物がLR-90［メチレンビス（4,4'-（2-クロロフェニルウレイドフェノキシイソ酪酸））］である、請求項5の医薬組成物。

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