JP2002527471A - 糖尿病合併症を阻害する方法 - Google Patents
糖尿病合併症を阻害する方法Info
- Publication number
- JP2002527471A JP2002527471A JP2000576838A JP2000576838A JP2002527471A JP 2002527471 A JP2002527471 A JP 2002527471A JP 2000576838 A JP2000576838 A JP 2000576838A JP 2000576838 A JP2000576838 A JP 2000576838A JP 2002527471 A JP2002527471 A JP 2002527471A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- diabetic
- age
- diabetes
- ribose
- mammal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/13—Amines
- A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
- A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
- A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
- A61K31/4415—Pyridoxine, i.e. Vitamin B6
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、後期アマドリＡＧＥ形成、および後期アマドリＡＧＥ形成の有効な阻害剤の同定および特徴付けをモデル化する組成物および方法、およびそのような同定した阻害剤組成物を提供する。本発明は、それを必要とする哺乳類に、本発明の組成物を投与することを特徴とする、糖尿病関連高脂血症、細胞酸化還元不均衡、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症およびアテローム性動脈硬化を治療または防止する方法をも教示する。
Description
【０００１】 発明の背景 本発明は、高次的グリケーション最終産物（ＡＧＥ）、それらの形成、検出、
同定、阻害およびその阻害剤の分野にある。
同定、阻害およびその阻害剤の分野にある。
【０００２】 タンパク質加齢および高次的グリコシル化最終産物 グルコースおよび他の還元糖による非酵素的グリケーションは、多様な病理学
に徐々に影響を及ぼしたタンパク質の重要な後期翻訳修飾である。ゆっくりした
グルコース誘導過程を通して不可逆な非酵素的グリケーションおよび架橋は、糖
尿病と関連した多くの合併症をもたらし得る。糖尿病と関連した慢性高血糖症は
、網膜症、ネフロパシー、およびアテローム性動脈硬化疾病のような合併症に至
る可能性のある慢性の組織損傷を引き起こし得る。（ＣｏｈｅｎおよびＺｉｙａ
ｄｅｈ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：１８３−１９０、１９９
６年）。長期真性糖尿病に関連して生じる慢性組織損傷は、非酵素的グリコシル
化を介した高次的グリコシル化最終産物（ＡＧＥ）形成を受けた持続する構造タ
ンパク質に結合して蓄積した免疫グロブリンおよび／または抗原による原位置免
疫複合体形成からある程度生じることが示された（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１７３９−１７４４、１９８３年）。一次タンパク質標
的は、コラーゲンに関連した細胞外マトリクスであると考えられている。タンパ
ク質、脂質、および核酸の非酵素的グリケーションは、自然の加齢の過程で重要
な役割を果し得る。最近、タンパク質高次的グリケーションは、アルツハイマー
病におけるβ−アミロイドの沈着および神経細線維の混乱の形成に、そしておそ
らくアミロイドーシスに関与する他の神経変性疾病に関連している（Ｃｏｌａｃ
ｏおよびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ５：８５９−８６１
、１９９４年）。グリケート化タンパク質は、毒性で、抗原性で、そして特定の
細胞レセプターによる取込の後、細胞の損傷応答を誘発する能力があることも示
された（例えば、Ｖｌａｓｓａｒａ、ＢｕｃａｌａおよびＳｔｒｉｋｅｒ、Ｌａ
ｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０：１３８−１５１、１９９４年；Ｖｌａｓｓａｒａら、
ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：１１７０４−１１７０８、１９９４年；Ｄａｎｉｅｌ
ｓおよびＨａｕｓｅｒ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４１：１４１５−１４２１、１９９
２年；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４３：８３６−８４１、１９９４
年；Ｃｏｈｅｎら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４５：１６７３−１６７９、１９９
４年；Ｂｒｅｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４３：１６９９−１７１２、１９
９３年；およびＹａｎら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：７７８７−７７９１、１９
９４年参照）。
に徐々に影響を及ぼしたタンパク質の重要な後期翻訳修飾である。ゆっくりした
グルコース誘導過程を通して不可逆な非酵素的グリケーションおよび架橋は、糖
尿病と関連した多くの合併症をもたらし得る。糖尿病と関連した慢性高血糖症は
、網膜症、ネフロパシー、およびアテローム性動脈硬化疾病のような合併症に至
る可能性のある慢性の組織損傷を引き起こし得る。（ＣｏｈｅｎおよびＺｉｙａ
ｄｅｈ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：１８３−１９０、１９９
６年）。長期真性糖尿病に関連して生じる慢性組織損傷は、非酵素的グリコシル
化を介した高次的グリコシル化最終産物（ＡＧＥ）形成を受けた持続する構造タ
ンパク質に結合して蓄積した免疫グロブリンおよび／または抗原による原位置免
疫複合体形成からある程度生じることが示された（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１７３９−１７４４、１９８３年）。一次タンパク質標
的は、コラーゲンに関連した細胞外マトリクスであると考えられている。タンパ
ク質、脂質、および核酸の非酵素的グリケーションは、自然の加齢の過程で重要
な役割を果し得る。最近、タンパク質高次的グリケーションは、アルツハイマー
病におけるβ−アミロイドの沈着および神経細線維の混乱の形成に、そしておそ
らくアミロイドーシスに関与する他の神経変性疾病に関連している（Ｃｏｌａｃ
ｏおよびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ ５：８５９−８６１
、１９９４年）。グリケート化タンパク質は、毒性で、抗原性で、そして特定の
細胞レセプターによる取込の後、細胞の損傷応答を誘発する能力があることも示
された（例えば、Ｖｌａｓｓａｒａ、ＢｕｃａｌａおよびＳｔｒｉｋｅｒ、Ｌａ
ｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０：１３８−１５１、１９９４年；Ｖｌａｓｓａｒａら、
ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：１１７０４−１１７０８、１９９４年；Ｄａｎｉｅｌ
ｓおよびＨａｕｓｅｒ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４１：１４１５−１４２１、１９９
２年；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４３：８３６−８４１、１９９４
年；Ｃｏｈｅｎら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４５：１６７３−１６７９、１９９
４年；Ｂｒｅｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４３：１６９９−１７１２、１９
９３年；およびＹａｎら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：７７８７−７７９１、１９
９４年参照）。
【０００３】 食品の調理の間の茶色色素の出現は、世界的に認識された現象であり、その化
学は、１９１２年にＭａｉｌｌａｒｄによって最初に記述され、そしてそれは、
タンパク質加齢の概念まで続いて研究に導いた。保存され、そして加熱処理した
食品が、それらの生物利用性を減少させる架橋タンパク質によって特徴付けられ
る非酵素的褐色化を受けることが知られている。このメイラード反応は、グルコ
ースが、ヘモグロビンのα鎖のアミノ末端へのアマドリ転位を介して付着するこ
とが分かったときと同様にインビボで生じることが分かった。
学は、１９１２年にＭａｉｌｌａｒｄによって最初に記述され、そしてそれは、
タンパク質加齢の概念まで続いて研究に導いた。保存され、そして加熱処理した
食品が、それらの生物利用性を減少させる架橋タンパク質によって特徴付けられ
る非酵素的褐色化を受けることが知られている。このメイラード反応は、グルコ
ースが、ヘモグロビンのα鎖のアミノ末端へのアマドリ転位を介して付着するこ
とが分かったときと同様にインビボで生じることが分かった。
【０００４】 本開示は、後期アマドリ高次的グリケーション最終産物（メイラード産物；Ａ
ＧＥ）の形成の先に未知であり、そして推定できない機構、および後期アマドリ
ＡＧＥ形成の有効な阻害剤を同定および特徴付けする方法を教示する。本開示は
、後期アマドリＡＧＥを形成する上で反応性タンパク質中間体成分の特徴的な単
離および速度論的態特徴付けを例示し、そして初めて、タンパク質グリケーショ
ン反応の「後期」段階の特定の解明および高速定量的速度論の研究に対処する方
法が教示される。
ＧＥ）の形成の先に未知であり、そして推定できない機構、および後期アマドリ
ＡＧＥ形成の有効な阻害剤を同定および特徴付けする方法を教示する。本開示は
、後期アマドリＡＧＥを形成する上で反応性タンパク質中間体成分の特徴的な単
離および速度論的態特徴付けを例示し、そして初めて、タンパク質グリケーショ
ン反応の「後期」段階の特定の解明および高速定量的速度論の研究に対処する方
法が教示される。
【０００５】 このような「後期」ＡＧＥ形成と対照的に、グリケーション反応の「初期」段
階は、数種のタンパク質について比較的よく特徴付けられ、そして同定された（
Ｈａｒｄｉｎｇ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３７：２４８−３３４、
１９８５年；ＭｏｎｎｉｅｒおよびＢａｙｎｅｓ編、Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｇｉｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｔｒ
ｉｒｉｏｎ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８９年；Ｆｉ
ｎｏｔら、１９９０年編、Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ
Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｈｕｍａｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂａｓｅｌ）
）。グリケーション反応は、リシン側鎖ε−アミノおよび末端α−アミノ基との
可逆性シッフ塩基（アルジミンまたはケチミン）付加反応、続いて基本的に不可
逆性アマドリ転位によって開始されて、ケトアミド産物、例えばアルドースの反
応から１−アミノ−１−デオキシケトースを生じることが知られている（Ｔｈｅ
Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｇｉｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ
，ａｎｄ ＮｕｔｒｉｔｉｏｎにおけるＢａｙｎｅｓら、Ｍｏｎｎｉｅｒおよび
Ｂａｙｎｅｓ編（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、４３−６７）、
１９８９年）。典型的には、糖は、それらの開放鎖（優勢なピラノースおよびフ
ラノース構造ではない）アルデヒドまたはケト形態で、可逆性シッフ塩基縮合を
通してリシン側鎖ε−アミノおよび末端α−アミノ基と最初に反応する（模式図
Ｉ）。その後、生じたアルジミンまたはケチミン産物が、アマドリ転位を受けて
、ケトアミンアマドリ産物、すなわち、アルドースの反応からの１−アミノ−１
−デオキシケトースを得る（ＭｅａｎｓおよびＣｈａｎｇ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ
３１：補追３：１−４、１９８２年；Ｈａｒｄｉｎｇ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃｈｅｍ．３７：２４８−３３４、１９８５年）。その後、これらのアマドリ
産物は、週および月の期間中、遅くて、そして不可逆性メイラード「褐色化」反
応を受け、それにより転位、脱水、酸化的切断、および架橋反応を介して蛍光お
よび他の産物を形成する。これらの後期アマドリ反応（低速メイラード「褐色化
」反応）は、重症に特徴付けられた高次的グリケーション最終産物（ＡＧＥ）に
なる。
階は、数種のタンパク質について比較的よく特徴付けられ、そして同定された（
Ｈａｒｄｉｎｇ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３７：２４８−３３４、
１９８５年；ＭｏｎｎｉｅｒおよびＢａｙｎｅｓ編、Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｇｉｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ａｎｄ Ｎｕｔｒ
ｉｒｉｏｎ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８９年；Ｆｉ
ｎｏｔら、１９９０年編、Ｔｈｅ Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ
Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｈｕｍａｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂａｓｅｌ）
）。グリケーション反応は、リシン側鎖ε−アミノおよび末端α−アミノ基との
可逆性シッフ塩基（アルジミンまたはケチミン）付加反応、続いて基本的に不可
逆性アマドリ転位によって開始されて、ケトアミド産物、例えばアルドースの反
応から１−アミノ−１−デオキシケトースを生じることが知られている（Ｔｈｅ
Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｇｉｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ
，ａｎｄ ＮｕｔｒｉｔｉｏｎにおけるＢａｙｎｅｓら、Ｍｏｎｎｉｅｒおよび
Ｂａｙｎｅｓ編（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、４３−６７）、
１９８９年）。典型的には、糖は、それらの開放鎖（優勢なピラノースおよびフ
ラノース構造ではない）アルデヒドまたはケト形態で、可逆性シッフ塩基縮合を
通してリシン側鎖ε−アミノおよび末端α−アミノ基と最初に反応する（模式図
Ｉ）。その後、生じたアルジミンまたはケチミン産物が、アマドリ転位を受けて
、ケトアミンアマドリ産物、すなわち、アルドースの反応からの１−アミノ−１
−デオキシケトースを得る（ＭｅａｎｓおよびＣｈａｎｇ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ
３１：補追３：１−４、１９８２年；Ｈａｒｄｉｎｇ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃｈｅｍ．３７：２４８−３３４、１９８５年）。その後、これらのアマドリ
産物は、週および月の期間中、遅くて、そして不可逆性メイラード「褐色化」反
応を受け、それにより転位、脱水、酸化的切断、および架橋反応を介して蛍光お
よび他の産物を形成する。これらの後期アマドリ反応（低速メイラード「褐色化
」反応）は、重症に特徴付けられた高次的グリケーション最終産物（ＡＧＥ）に
なる。
【０００６】 アマドリおよび他のグリケーション中間体とのように、遊離グルコースそれ自
身は、ジカルボニルグリオキサルおよびグリコアルデヒドのような過酸化の産物
および非常に反応性の断片に至る酸化的反応を受ける可能性がある。したがって
、多様なＡＧＥの形成の機構の解明は、ほとんどのインビトロでの研究が、極端
に高い糖濃度で行われたので、極端に複雑であった。
身は、ジカルボニルグリオキサルおよびグリコアルデヒドのような過酸化の産物
および非常に反応性の断片に至る酸化的反応を受ける可能性がある。したがって
、多様なＡＧＥの形成の機構の解明は、ほとんどのインビトロでの研究が、極端
に高い糖濃度で行われたので、極端に複雑であった。
【０００７】 これらの「初期」産物の比較的十分に特徴付けられた形成と対照的に、それら
の異種遺伝性、反応時間が長いこと、および複雑さのため、後期アマドリ反応で
生じた「後期」メイラード産物を形成する機構の理解につい明らかに欠如してい
た。「後期」メイラード反応の化学についての詳細な情報の欠如は、ポリペプチ
ドのアミノ基とグルコースとの反応から誘導される蛍光ＡＧＥ発色団を同定する
研究を刺激した。このような発色団の１つである、２−（２−フロイル）−４（
５）−（２−フラニル）−１Ｈ−イミダゾール（ＦＦＩ）は、ウシ血清アルブミ
ン、およびグルコースを伴うポリリシンの非酵素的褐色化の後に同定され、そし
て無傷のポリペプチドに存在する発色団の代表であることが仮定された（Ｐｏｎ
ｇｏｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８１：２６８４−２６８８、１９８４）。後の研
究は、ＦＦＩが、分析のための酸加水分解の間に形成された人工産物であること
を確立した。
の異種遺伝性、反応時間が長いこと、および複雑さのため、後期アマドリ反応で
生じた「後期」メイラード産物を形成する機構の理解につい明らかに欠如してい
た。「後期」メイラード反応の化学についての詳細な情報の欠如は、ポリペプチ
ドのアミノ基とグルコースとの反応から誘導される蛍光ＡＧＥ発色団を同定する
研究を刺激した。このような発色団の１つである、２−（２−フロイル）−４（
５）−（２−フラニル）−１Ｈ−イミダゾール（ＦＦＩ）は、ウシ血清アルブミ
ン、およびグルコースを伴うポリリシンの非酵素的褐色化の後に同定され、そし
て無傷のポリペプチドに存在する発色団の代表であることが仮定された（Ｐｏｎ
ｇｏｒら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８１：２６８４−２６８８、１９８４）。後の研
究は、ＦＦＩが、分析のための酸加水分解の間に形成された人工産物であること
を確立した。
【０００８】 一連の米国特許は、このようなグリコシル化および架橋の機構が、飽和グリコ
シル化および単一の塩基を介した糖タンパク質アミンの連続架橋、および反復反
応を介して生じるという前提に基づいて、タンパク質グリコシル化の阻害および
糖タンパク質アミンの架橋の領域で公告された。これらの特許としては、米国特
許番号第４，６６５，１９２号；第５，０１７，６９６号；第４，７５８，８５
３号；第４，９０８，４４６号；第４，９８３，６０４号；第５，１４０，０４
８号；第５，１３０，３３７号；第５，２６２，１５２号；第５，１３０，３２
４号；第５，２７２，１６５号；第５，２２１，６８３号；第５，２５８，３８
１号；第５，１０６，８７７号；第５，１２８，３６０号；第５，１００，９１
９号；第５，２５４，５９３号；第５，１３７，９１６号；第５，２７２，１７
６号；第５，１７５，１９２号；第５，２１８，００１号；第５，２３８，９６
３号；第５，３５８，９６０号；第５，３１８，９８２号；および第５，３３４
，６１７号が挙げられる。（引用される全ての米国特許は、全体的に参照してこ
こに組込まれる）。
シル化および単一の塩基を介した糖タンパク質アミンの連続架橋、および反復反
応を介して生じるという前提に基づいて、タンパク質グリコシル化の阻害および
糖タンパク質アミンの架橋の領域で公告された。これらの特許としては、米国特
許番号第４，６６５，１９２号；第５，０１７，６９６号；第４，７５８，８５
３号；第４，９０８，４４６号；第４，９８３，６０４号；第５，１４０，０４
８号；第５，１３０，３３７号；第５，２６２，１５２号；第５，１３０，３２
４号；第５，２７２，１６５号；第５，２２１，６８３号；第５，２５８，３８
１号；第５，１０６，８７７号；第５，１２８，３６０号；第５，１００，９１
９号；第５，２５４，５９３号；第５，１３７，９１６号；第５，２７２，１７
６号；第５，１７５，１９２号；第５，２１８，００１号；第５，２３８，９６
３号；第５，３５８，９６０号；第５，３１８，９８２号；および第５，３３４
，６１７号が挙げられる。（引用される全ての米国特許は、全体的に参照してこ
こに組込まれる）。
【０００９】 これらの米国特許の焦点は、初期グリコシル化アマドリ産物のカルボニル部分
に焦点を置いてＡＧＥ形成を阻害する方法であり、そして特に、例示された最も
効果的な阻害は、外因で投与されたアミノグアニジンの使用を教示する。最近、
ＡＧＥ形成の阻害剤としてのアミノグアニジンの効力は、治験で試験される予定
である。
に焦点を置いてＡＧＥ形成を阻害する方法であり、そして特に、例示された最も
効果的な阻害は、外因で投与されたアミノグアニジンの使用を教示する。最近、
ＡＧＥ形成の阻害剤としてのアミノグアニジンの効力は、治験で試験される予定
である。
【００１０】 ＡＧＥ形成の阻害は、例えば、食品腐敗、動物タンパク質加齢、および歯の褐
色化と戦うことのような個人的衛生の領域で有用性を示す。定量的に僅かではあ
るが、ある程度際立った高次的グリケーション最終産物は、ペントシジンおよび
Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＳｅｌｌおよびＭｏｎｎｉｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６４：２１５９７−２１６０２、１９８９年；Ａｈｍｅｄら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４８８９−４８９４、１９８６年） 本発明によって教示されたとおり、アマドリ中間産物および連続後期アマドリ
ＡＧＥ形成は、アミノグアニジンとの反応によって完全には阻害されない。した
がって、本開示によって教示されるとおり、後期アマドリＡＧＥの形成は、先に
示されなかったか、または先に隔離して例示する可能性がある重要でそして特徴
的な反応経路を介して起こる。この「後期」反応の有効な後期アマドリＡＧＥ阻
害剤を同定および特徴付けする十分でそして効果的な方法を示すことが、非常に
所望される到達点である。十分なスクリーニング法およびモデル系を提供するこ
とによって、コンビナトリアル化学を用いて、有効に、候補化合物をスクリーニ
ングし、そしてそれにより、阻害剤化合物の最終認定における時間、経費および
努力を大いに減じることができる。その後、有効な阻害剤の十分な特徴付けに対
処する後期アマドリＡＧＥ形成の効果をモデル化および研究するインビボでの方
法を示すことは、非常に有用である。
色化と戦うことのような個人的衛生の領域で有用性を示す。定量的に僅かではあ
るが、ある程度際立った高次的グリケーション最終産物は、ペントシジンおよび
Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＳｅｌｌおよびＭｏｎｎｉｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６４：２１５９７−２１６０２、１９８９年；Ａｈｍｅｄら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４８８９−４８９４、１９８６年） 本発明によって教示されたとおり、アマドリ中間産物および連続後期アマドリ
ＡＧＥ形成は、アミノグアニジンとの反応によって完全には阻害されない。した
がって、本開示によって教示されるとおり、後期アマドリＡＧＥの形成は、先に
示されなかったか、または先に隔離して例示する可能性がある重要でそして特徴
的な反応経路を介して起こる。この「後期」反応の有効な後期アマドリＡＧＥ阻
害剤を同定および特徴付けする十分でそして効果的な方法を示すことが、非常に
所望される到達点である。十分なスクリーニング法およびモデル系を提供するこ
とによって、コンビナトリアル化学を用いて、有効に、候補化合物をスクリーニ
ングし、そしてそれにより、阻害剤化合物の最終認定における時間、経費および
努力を大いに減じることができる。その後、有効な阻害剤の十分な特徴付けに対
処する後期アマドリＡＧＥ形成の効果をモデル化および研究するインビボでの方
法を示すことは、非常に有用である。
【００１１】 生物分解性および／または自然に代謝される阻害性化合物は、アミノグアニジ
ンのような毒性のある副作用を示し得る非常に反応性のある化合物より治療剤と
して使用するのにいっそう望ましい。
ンのような毒性のある副作用を示し得る非常に反応性のある化合物より治療剤と
して使用するのにいっそう望ましい。
【００１２】 発明の概要 本発明によって、その後、後期アマドリＡＧＥへの後期アマドリ変換を迅速に
完了するのに使用され得る安定な後期アマドリ高次的グリケーション最終産物（
ＡＧＥ）前駆体が同定された。この安定な産物は、より多くの糖との初期段階の
タンパク質／糖アマドリ産物の別の反応によって生成された推定糖飽和アマドリ
／シッフ塩基産物である。好ましい実施形態では、この後期アマドリ／シッフ中
間性塩基は、標的タンパク質とリボース糖との反応によって発生された。
完了するのに使用され得る安定な後期アマドリ高次的グリケーション最終産物（
ＡＧＥ）前駆体が同定された。この安定な産物は、より多くの糖との初期段階の
タンパク質／糖アマドリ産物の別の反応によって生成された推定糖飽和アマドリ
／シッフ塩基産物である。好ましい実施形態では、この後期アマドリ／シッフ中
間性塩基は、標的タンパク質とリボース糖との反応によって発生された。
【００１３】 本発明は、糖阻害の高い新規方法を介して安定なタンパク質−糖ＡＧＥ形成中
間前駆体を発生する方法を提供する。好ましい実施形態では、使用される糖は、
リボースである。
間前駆体を発生する方法を提供する。好ましい実施形態では、使用される糖は、
リボースである。
【００１４】 本発明は、安定な後期アマドリＡＧＥ中間体を生成するのに十分な濃度で、そ
して十分な長さの時間、タンパク質を糖とインキュベートすることによって、安
定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体を発生し
；上記安定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体
を、阻害剤候補と接触させ；糖誘導平衡からの安定なタンパク質−糖後期アマド
リ高次的グリケーション最終産物中間体の放出後に、後期アマドリＡＧＥの形成
を監視することによって、有効な阻害を同定することを特徴とする、後期メイラ
ード産物の形成についての有効な阻害剤を同定する方法を提供する。適切な糖と
しては、それに限定されないが、リボース、リキソース、キシロースおよびアラ
ビノースが挙げられる。特定の条件は、グルコースおよび他の糖の使用に対処も
すると思われる。好ましい実施形態では、使用される糖は、リボースである。
して十分な長さの時間、タンパク質を糖とインキュベートすることによって、安
定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体を発生し
；上記安定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体
を、阻害剤候補と接触させ；糖誘導平衡からの安定なタンパク質−糖後期アマド
リ高次的グリケーション最終産物中間体の放出後に、後期アマドリＡＧＥの形成
を監視することによって、有効な阻害を同定することを特徴とする、後期メイラ
ード産物の形成についての有効な阻害剤を同定する方法を提供する。適切な糖と
しては、それに限定されないが、リボース、リキソース、キシロースおよびアラ
ビノースが挙げられる。特定の条件は、グルコースおよび他の糖の使用に対処も
すると思われる。好ましい実施形態では、使用される糖は、リボースである。
【００１５】 本発明は、「後期」反応を介した後期アマドリＡＧＥ形成の有効な阻害剤が、
安定な後期アマドリＡＧＥ中間体を生成するのに十分な濃度で、そして十分な長
さの時間、タンパク質を糖とインキュベートすることによって、安定なタンパク
質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体を発生し；上記安定な
タンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体を、阻害剤候
補と接触させ；糖誘導平衡からの安定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリ
ケーション最終産物中間体の放出後に、後期アマドリＡＧＥの形成を監視するこ
とによって、有効な阻害を同定することを特徴とする、アッセイ中で後期アマド
リＡＧＥ最終産物の形成を阻害する能力によって同定および特徴付けされ得るこ
とを教示する。好ましい実施形態では、使用される糖は、リボースである。
安定な後期アマドリＡＧＥ中間体を生成するのに十分な濃度で、そして十分な長
さの時間、タンパク質を糖とインキュベートすることによって、安定なタンパク
質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体を発生し；上記安定な
タンパク質−糖後期アマドリ高次的グリケーション最終産物中間体を、阻害剤候
補と接触させ；糖誘導平衡からの安定なタンパク質−糖後期アマドリ高次的グリ
ケーション最終産物中間体の放出後に、後期アマドリＡＧＥの形成を監視するこ
とによって、有効な阻害を同定することを特徴とする、アッセイ中で後期アマド
リＡＧＥ最終産物の形成を阻害する能力によって同定および特徴付けされ得るこ
とを教示する。好ましい実施形態では、使用される糖は、リボースである。
【００１６】 したがって、本発明の方法は、効力についての候補後期アマドリＡＧＥ形成阻
害剤の高速スクリーニングに対処し、それにより後期アマドリＡＧＥ形成の有効
な小型分子阻害剤の開発に必要とされる仕事の経費と量を大いに減じられる。本
発明は、ＡＧＥ形成の後期アマドリ「後期」反応の有効な阻害剤として、ビタミ
ンＢ６、およびビタミンＢ１の誘導体が挙げられることを教示し、そして好まし
い実施形態では、特定の種は、ピリドキサミンおよびピロリン酸チアミンである
。
害剤の高速スクリーニングに対処し、それにより後期アマドリＡＧＥ形成の有効
な小型分子阻害剤の開発に必要とされる仕事の経費と量を大いに減じられる。本
発明は、ＡＧＥ形成の後期アマドリ「後期」反応の有効な阻害剤として、ビタミ
ンＢ６、およびビタミンＢ１の誘導体が挙げられることを教示し、そして好まし
い実施形態では、特定の種は、ピリドキサミンおよびピロリン酸チアミンである
。
【００１７】 本発明は、対象動物にリボースを投与することを特徴とする、ラットでの糖尿
病様病理学を迅速に誘導する新たな方法を教示する。さらに、提供されるのは、
インビボで同定阻害剤ピリドキサミンおよびピロリン酸チアミンを使用して、後
期アマドリＡＧＥ誘導病理学を阻害することである。
病様病理学を迅速に誘導する新たな方法を教示する。さらに、提供されるのは、
インビボで同定阻害剤ピリドキサミンおよびピロリン酸チアミンを使用して、後
期アマドリＡＧＥ誘導病理学を阻害することである。
【００１８】 本発明は、ＡＧＥ形成および後期アマドリＡＧＥ病理学の阻害で使用するため
の化合物、および一般式：
の化合物、および一般式：
【化１１】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２である； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） を示すこのような化合物、およびその塩を含有する医薬組成物を包含する。
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨ２である； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） を示すこのような化合物、およびその塩を含有する医薬組成物を包含する。
【００１９】 本発明は、一般式
【化１２】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） を示す化合物、およびその塩も包含する。
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） を示す化合物、およびその塩も包含する。
【００２０】 好ましい実施形態では、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも１つは、Ｈ
である。
である。
【００２１】 さらに、本発明は、式
【化１３】 を示す化合物も予想される。
【００２２】 本発明の化合物は、それに限定されないが、ＲがＣ１−６アルキルである場合
、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＲ、および−Ｎ
Ｈ−ＣＯＣＨ３のような１つまたはそれ以上の電子抜取基を例示できる。
、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＲ、および−Ｎ
Ｈ−ＣＯＣＨ３のような１つまたはそれ以上の電子抜取基を例示できる。
【００２３】 本発明は、適切な担体中の本発明の化合物のうちの１つまたはそれ以上、また
はその塩を含む医薬組成物を包含する。本発明は、インビボでのＡＧＥ形成に関
連する病理学の治療的介在のための本発明の治療剤を投与する方法を包含する。
本発明の１つの好ましい実施形態では、治療されるべきＡＧＥ関連病理学は、糖
尿病神経傷害に関する。
はその塩を含む医薬組成物を包含する。本発明は、インビボでのＡＧＥ形成に関
連する病理学の治療的介在のための本発明の治療剤を投与する方法を包含する。
本発明の１つの好ましい実施形態では、治療されるべきＡＧＥ関連病理学は、糖
尿病神経傷害に関する。
【００２４】 本発明は、それを必要とする哺乳類に、本発明の化合物を投与することを特徴
とする、高脂血症、細胞酸化還元不均衡、高コレステロール血症、高トリグリセ
リド血症およびアテローム性動脈硬化を治療または防止する方法をも教示する。
とする、高脂血症、細胞酸化還元不均衡、高コレステロール血症、高トリグリセ
リド血症およびアテローム性動脈硬化を治療または防止する方法をも教示する。
【００２５】 詳細な説明 タンパク質加齢についての動物モデル アロキサンで誘導される糖尿病ルイスラットを、タンパク質加齢についてのモ
デルとして使用して、ＡＧＥ形成の阻害剤のインビボでの効力を例示した。例示
されるべき相互関係は、後期糖尿病関連病理学の阻害と、ＡＧＥ形成の有効な阻
害との間にある（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、ＣｅｒａｍｉおよびＶｌａｓｓａｒａ、Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８（２０）：１３１５−１３２１、１９８８年
）。ルイスラット、誘発糖尿病に罹ったニュージーランドの白ウサギ、および遺
伝的に糖尿病のＢＢ／ウスターラットでの糖尿病のストレプトゾトシン誘発も、
例えば、米国特許番号第５，３３４，６１７号で記述されるとおり利用された（
参照して組込まれた）。これらのモデル系に伴う主要な問題は、ＡＧＥ関連損傷
を示し、したがってＡＧＥ阻害について化合物を試験するために必要とされる長
い期間である。例えば、１６週の治療が、米国特許番号第５，３３４，６１７号
で記述されるラット研究に、そして１２週がウサギの研究に必要とされた。した
がって、短い期間で現れるＡＧＥ関連糖尿病病理学についてのモデル系を有する
ことは、非常に望ましく、そして有用であり、それにより、ＡＧＥ関連損傷およ
び後期アマドリＡＧＥ形成の阻害剤の効力のより十分に、そして迅速な測定に対
処する。
デルとして使用して、ＡＧＥ形成の阻害剤のインビボでの効力を例示した。例示
されるべき相互関係は、後期糖尿病関連病理学の阻害と、ＡＧＥ形成の有効な阻
害との間にある（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、ＣｅｒａｍｉおよびＶｌａｓｓａｒａ、Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８（２０）：１３１５−１３２１、１９８８年
）。ルイスラット、誘発糖尿病に罹ったニュージーランドの白ウサギ、および遺
伝的に糖尿病のＢＢ／ウスターラットでの糖尿病のストレプトゾトシン誘発も、
例えば、米国特許番号第５，３３４，６１７号で記述されるとおり利用された（
参照して組込まれた）。これらのモデル系に伴う主要な問題は、ＡＧＥ関連損傷
を示し、したがってＡＧＥ阻害について化合物を試験するために必要とされる長
い期間である。例えば、１６週の治療が、米国特許番号第５，３３４，６１７号
で記述されるラット研究に、そして１２週がウサギの研究に必要とされた。した
がって、短い期間で現れるＡＧＥ関連糖尿病病理学についてのモデル系を有する
ことは、非常に望ましく、そして有用であり、それにより、ＡＧＥ関連損傷およ
び後期アマドリＡＧＥ形成の阻害剤の効力のより十分に、そして迅速な測定に対
処する。
【００２６】 ＡＧＥに対する抗体 ＡＧＥ形成を研究するための重要な道具は、多様な標的タンパク質との数種の
糖の反応によって引出されたＡＧＥに特異的であるポリクローナルおよびモノク
ローナル抗体の使用である。ＡＧＥのタンパク質成分の特性とは関係ないＡＧＥ
についての結果物である特異性について、抗体をスクリーニングする（Ｎａｋａ
ｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６２：７
４０−７４５、１９８９年；Ｎａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ １４０：１１９−１２５、１９９１年；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：７３２９−７３３２、１９９１年；Ａｒａｋｉら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０２１１−１０２１４、１９９２年；Ｍａ
ｋｉｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５１３３−５１３８、１９９２
年）。このような抗体は、インビボで、そしてインビトロでＡＧＥ形成を監視す
るのに使用されてきた。
糖の反応によって引出されたＡＧＥに特異的であるポリクローナルおよびモノク
ローナル抗体の使用である。ＡＧＥのタンパク質成分の特性とは関係ないＡＧＥ
についての結果物である特異性について、抗体をスクリーニングする（Ｎａｋａ
ｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６２：７
４０−７４５、１９８９年；Ｎａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ １４０：１１９−１２５、１９９１年；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：７３２９−７３３２、１９９１年；Ａｒａｋｉら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０２１１−１０２１４、１９９２年；Ｍａ
ｋｉｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５１３３−５１３８、１９９２
年）。このような抗体は、インビボで、そしてインビトロでＡＧＥ形成を監視す
るのに使用されてきた。
【００２７】 チアミン−ビタミンＢ１ 同定されるべきビタミンＢ複合体の最初の構成員であるチアミンは、通常の治
療用量で与えられる場合、薬物動態作用を実質的に欠いている。そして多量の用
量でさえ、何ら効果を示すことが知られていなかった。ピロリン酸チアミンは、
チアミンの生理学的に活性な形態であり、そしてそれは、α−ケト酸の脱カルボ
キシル化において補酵素として主に炭化水素代謝で機能する。塩酸チアミンの錠
剤は、各々、５から５００ｍｇの範囲にある量で利用できる。１００から２００
ｍｇ／ｍｌまで含有する塩酸チアミン注射溶液を利用できる。
療用量で与えられる場合、薬物動態作用を実質的に欠いている。そして多量の用
量でさえ、何ら効果を示すことが知られていなかった。ピロリン酸チアミンは、
チアミンの生理学的に活性な形態であり、そしてそれは、α−ケト酸の脱カルボ
キシル化において補酵素として主に炭化水素代謝で機能する。塩酸チアミンの錠
剤は、各々、５から５００ｍｇの範囲にある量で利用できる。１００から２００
ｍｇ／ｍｌまで含有する塩酸チアミン注射溶液を利用できる。
【００２８】 チアミン欠乏を治療するために、１００ｍｇ／Ｌと同じくらい高い非経口液の
静脈用量が、一般に使用され、そして５０から１００ｍｇまでの局所用量が投与
される。チアミンの胃腸管吸収は、日当たり８から１５ｍｇまでに限定されると
思われるが、食品との分割用量で経口投与によって越えられ得る。
静脈用量が、一般に使用され、そして５０から１００ｍｇまでの局所用量が投与
される。チアミンの胃腸管吸収は、日当たり８から１５ｍｇまでに限定されると
思われるが、食品との分割用量で経口投与によって越えられ得る。
【００２９】 グルコースの繰返投与は、栄養補強下の患者の下で、チアミン欠乏を促進でき
、そしてこれは、高血糖症の修正の間中注目された。
、そしてこれは、高血糖症の修正の間中注目された。
【００３０】 驚くべきことに、本発明では、インビトロでの試験によって示されるとおり、
人体で正常に見られるか、食事療養のために投与されるものより上の濃度でピロ
リン酸チアミンの投与は、後期アマドリ抗原性ＡＧＥ形成の有効な阻害剤である
こと、およびこの阻害が、アミノグアニジンの投与により可能なものよりいっそ
う完全であることが知見された。
人体で正常に見られるか、食事療養のために投与されるものより上の濃度でピロ
リン酸チアミンの投与は、後期アマドリ抗原性ＡＧＥ形成の有効な阻害剤である
こと、およびこの阻害が、アミノグアニジンの投与により可能なものよりいっそ
う完全であることが知見された。
【００３１】 ピリドキシン−ビタミンＢ６ ビタミンＢ６は、典型的に、多くの起源から入手可能な一般市販薬製品で塩酸
ピリドキシンの形態で利用できる。例えば、ビーチ製薬（Ｂｅａｃｈ ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のビーリス錠剤（Ｂｅｅｌｉｔｈ Ｔａｂｌｅｔｓ）
は、２０ｍｇのＢ６に等価である２５ｍｇの塩酸ピリドキシンを含有し、他の製
品としては、１ｍｇのピリドキシＨＣｌを含有するマーリンヘルスケア（Ｍａｒ
ｌｙｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）のマーリンフォーミュラ５０（Ｍａｒｌｙｎ
Ｆｏｒｍｕｌａ ５０）、および６ｍｇのピリドキシンＨＣｌを含有するマー
リンフォーミュラ５０メガフォルテ（Ｍａｒｌｙｎ Ｆｏｒｍｕｌａ ５０ Ｍ
ｅｇａ Ｆｏｒｔｅ）、２．６ｍｇピリドキシンＨＣｌを含有するワイエス−ア
イエルスト（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）のスチュアートプレナタル（Ｓｔｕａ
ｒｔ Ｐｒｅｎａｔａｌ登録商標）錠剤、２ｍｇのピリドキシＨＣｌを含有する
ジェイアンドジェイ（Ｊ＆Ｊ−Ｍｅｒｋ Ｃｏｒｐ）のスチュアートフォーミュ
ラ（Ｓｔｕａｒｔ Ｆｏｒｍｕｌａ登録商標）錠剤、および１．０５ｍｇのピリ
ドキシＨＣｌ、１５０％の２−４歳の子供用の米国ＲＤＡ、および５３％の４歳
以上の子供および成人用の米国ＲＤＡを含有するチバ（ＣＩＢＡ）のコンシュー
マーサンキスト（Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｓｕｎｋｉｓｔ）子供用チュアブル複合ビ
タミンが挙げられる（非処方箋薬についてのＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１４版（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｄａ
ｔａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏ．，Ｍｏｎｔｖａｌ，Ｎ．Ｊ．，１９９３年
）。
ピリドキシンの形態で利用できる。例えば、ビーチ製薬（Ｂｅａｃｈ ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のビーリス錠剤（Ｂｅｅｌｉｔｈ Ｔａｂｌｅｔｓ）
は、２０ｍｇのＢ６に等価である２５ｍｇの塩酸ピリドキシンを含有し、他の製
品としては、１ｍｇのピリドキシＨＣｌを含有するマーリンヘルスケア（Ｍａｒ
ｌｙｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）のマーリンフォーミュラ５０（Ｍａｒｌｙｎ
Ｆｏｒｍｕｌａ ５０）、および６ｍｇのピリドキシンＨＣｌを含有するマー
リンフォーミュラ５０メガフォルテ（Ｍａｒｌｙｎ Ｆｏｒｍｕｌａ ５０ Ｍ
ｅｇａ Ｆｏｒｔｅ）、２．６ｍｇピリドキシンＨＣｌを含有するワイエス−ア
イエルスト（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）のスチュアートプレナタル（Ｓｔｕａ
ｒｔ Ｐｒｅｎａｔａｌ登録商標）錠剤、２ｍｇのピリドキシＨＣｌを含有する
ジェイアンドジェイ（Ｊ＆Ｊ−Ｍｅｒｋ Ｃｏｒｐ）のスチュアートフォーミュ
ラ（Ｓｔｕａｒｔ Ｆｏｒｍｕｌａ登録商標）錠剤、および１．０５ｍｇのピリ
ドキシＨＣｌ、１５０％の２−４歳の子供用の米国ＲＤＡ、および５３％の４歳
以上の子供および成人用の米国ＲＤＡを含有するチバ（ＣＩＢＡ）のコンシュー
マーサンキスト（Ｃｏｎｓｕｍｅｒ Ｓｕｎｋｉｓｔ）子供用チュアブル複合ビ
タミンが挙げられる（非処方箋薬についてのＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１４版（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｄａ
ｔａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏ．，Ｍｏｎｔｖａｌ，Ｎ．Ｊ．，１９９３年
）。
【００３２】 ピリジン核の位置４にある炭素原子における置換の特性に違いがある３つの関
連形態のピリドキシンがある。ピリドキシンは、一次アルコールであり、ピリド
キサルは、対応のアルデヒドであり、そしてピリドキサミンは、この位置にアミ
ノメチル基を含む。これらの３つの形態の各々は、肝臓により、活性形態のビタ
ミンであるピリドキサル−５’−リン酸塩への変換の後に哺乳類によって利用さ
れ得る。これらの３つの形態が、生物学上の特性で等価であることが長年信じら
れ、そして当分野によってビタミンＢ６の等価形態として処置されてきた。薬学
および化学における審議会は、そのビタミンに名称ピリドキシンを付与した。
連形態のピリドキシンがある。ピリドキシンは、一次アルコールであり、ピリド
キサルは、対応のアルデヒドであり、そしてピリドキサミンは、この位置にアミ
ノメチル基を含む。これらの３つの形態の各々は、肝臓により、活性形態のビタ
ミンであるピリドキサル−５’−リン酸塩への変換の後に哺乳類によって利用さ
れ得る。これらの３つの形態が、生物学上の特性で等価であることが長年信じら
れ、そして当分野によってビタミンＢ６の等価形態として処置されてきた。薬学
および化学における審議会は、そのビタミンに名称ピリドキシンを付与した。
【００３３】 ピリドキシンに対する最も活性な抗代謝産物は、４−デオキシピリドキシンで
あり、それについて、抗代謝産物活性は、数種のリン酸ピリドキサル依存性酵素
の競合阻害剤である４−デオキシピリドキシン−５−リン酸塩のインビボでの形
成に起因した。ピリドキシンの薬理学作用は、それが、経口または静脈投与のい
ずれかの後に何ら顕著な薬力学作用を引き起こさない場合、限定され、そして水
溶性でありながら、低い急性毒性を示す。神経毒性は、日当たり２００ｍｇと同
じ程度に少ないピリドキシンの長期摂取の後に発生し得ることが示唆された。生
理学的には、補酵素として、リン酸ピリドキシンは、脱カルボキシル化、アミノ
転移、およびラセミ化を含めたアミノ酸のいくつかの代謝性形質転換に、並びに
硫黄含有およびヒドロキシ−アミノ酸の代謝での酵素的段階に関与する。アミノ
転移の場合に、リン酸ピリドキサルを、ドナーアミノ酸によってリン酸ピリドキ
サミンにアミノ化し、そしてその後、結合リン酸ピロドキサミンを、受容体α−
ケト酸によってリン酸ピリドキサルに脱アミノ化する。したがって、ビタミンＢ
複合体は、アミノ酸の特定の分解に関与した必須補助食品であることが知られて
いる。ビタミンＢ複合体の一般の検討については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｇｉｌ
ｍａｎ、Ｒａｌｌ、ＮｉｅｓおよびＴａｙｌｏｒ編（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０年、１２９３−４；１５２３−１５４０）参
照。
あり、それについて、抗代謝産物活性は、数種のリン酸ピリドキサル依存性酵素
の競合阻害剤である４−デオキシピリドキシン−５−リン酸塩のインビボでの形
成に起因した。ピリドキシンの薬理学作用は、それが、経口または静脈投与のい
ずれかの後に何ら顕著な薬力学作用を引き起こさない場合、限定され、そして水
溶性でありながら、低い急性毒性を示す。神経毒性は、日当たり２００ｍｇと同
じ程度に少ないピリドキシンの長期摂取の後に発生し得ることが示唆された。生
理学的には、補酵素として、リン酸ピリドキシンは、脱カルボキシル化、アミノ
転移、およびラセミ化を含めたアミノ酸のいくつかの代謝性形質転換に、並びに
硫黄含有およびヒドロキシ−アミノ酸の代謝での酵素的段階に関与する。アミノ
転移の場合に、リン酸ピリドキサルを、ドナーアミノ酸によってリン酸ピリドキ
サミンにアミノ化し、そしてその後、結合リン酸ピロドキサミンを、受容体α−
ケト酸によってリン酸ピリドキサルに脱アミノ化する。したがって、ビタミンＢ
複合体は、アミノ酸の特定の分解に関与した必須補助食品であることが知られて
いる。ビタミンＢ複合体の一般の検討については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｇｉｌ
ｍａｎ、Ｒａｌｌ、ＮｉｅｓおよびＴａｙｌｏｒ編（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０年、１２９３−４；１５２３−１５４０）参
照。
【００３４】 驚くべきことに、本発明では、人体で通常に見られるものより上の濃度でのビ
タミンＢ６の代謝的に一時的なピリドキサルアミン形態（ピリドキサミン）の有
効な投与が、後期アマドリ抗原性ＡＧＥ形成の有効な阻害剤であること、および
この阻害が、アミノグアニジンの投与により可能なものよりいっそう完全であり
得ることが知見された。
タミンＢ６の代謝的に一時的なピリドキサルアミン形態（ピリドキサミン）の有
効な投与が、後期アマドリ抗原性ＡＧＥ形成の有効な阻害剤であること、および
この阻害が、アミノグアニジンの投与により可能なものよりいっそう完全であり
得ることが知見された。
【００３５】 安定な中間のアマドリ／シッフ塩基の形成 ＡＧＥを形成するタンパク質とグルコースとの反応の典型的な研究は、抗原性
ＡＧＥに誘導される抗体を用いてＥＬＩＳＡによって行われ、そして酸安定性蛍
光ＡＧＥの生成物ペントシジンの検出は、酸加水分解に続くＨＰＬＣによって行
われた。グルコースおよびリボースとの標的タンパク質のグリケーション（すな
わち、ＢＳＡまたはＲＮアーゼＡ）を、ポリクローナルのウサギ抗−グルコース
−ＡＧＥ−ＲＮアーゼおよび抗−グルコース−ＡＧＥ−ＢＳＡ抗体のＥＬＩＳＡ
活性を監視することによって比較した。１Ｍグルコースを、６０日間ＲＮアーゼ
と、そして９０日間ＢＳＡと反応させることによって、抗原を生成した。抗体（
Ｒ６１８およびＲ４７９）をスクリーニングし、そしてＡＧＥのみと反応性を示
し、担体免疫原ＢＳＡ以外のタンパク質と反応性を示さなかった。
ＡＧＥに誘導される抗体を用いてＥＬＩＳＡによって行われ、そして酸安定性蛍
光ＡＧＥの生成物ペントシジンの検出は、酸加水分解に続くＨＰＬＣによって行
われた。グルコースおよびリボースとの標的タンパク質のグリケーション（すな
わち、ＢＳＡまたはＲＮアーゼＡ）を、ポリクローナルのウサギ抗−グルコース
−ＡＧＥ−ＲＮアーゼおよび抗−グルコース−ＡＧＥ−ＢＳＡ抗体のＥＬＩＳＡ
活性を監視することによって比較した。１Ｍグルコースを、６０日間ＲＮアーゼ
と、そして９０日間ＢＳＡと反応させることによって、抗原を生成した。抗体（
Ｒ６１８およびＲ４７９）をスクリーニングし、そしてＡＧＥのみと反応性を示
し、担体免疫原ＢＳＡ以外のタンパク質と反応性を示さなかった。
【００３６】 実施例１ ピロリン酸チアミンおよびピリドキサミンは、グルコースからの抗原性高次的
グリケーション最終産物の形成を阻害する：アミノグアニジンとの比較 ある種のビタミンＢ６、特にリン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）は、アルデヒトと
してそれら自身が、タンパク質アミノ酸と共にシッフ塩基付加物を形成でき（Ｋ
ｈａｔａｍｉら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４３：１７２５−１７３１、１
９８８年）、したがって、グルコース付着に利用できるアミンの量を限定するの
で、初期グリケーションの「競合阻害剤」として作用することが先に提案された
。しかし、当初の糖付着を制限する上での有効性は、ＡＧＥに形成される任意の
アマドリ産物の変換の阻害のプレディクタではない。本発明では、抗原性ＡＧＥ
のインビトロでの形成におけるそれらの影響によって示されるとおり「後期」グ
リケーション反応の阻害剤が記述される（Ｂｏｏｔｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２２０：１１３−１１９、１９９６年）。
グリケーション最終産物の形成を阻害する：アミノグアニジンとの比較 ある種のビタミンＢ６、特にリン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）は、アルデヒトと
してそれら自身が、タンパク質アミノ酸と共にシッフ塩基付加物を形成でき（Ｋ
ｈａｔａｍｉら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４３：１７２５−１７３１、１
９８８年）、したがって、グルコース付着に利用できるアミンの量を限定するの
で、初期グリケーションの「競合阻害剤」として作用することが先に提案された
。しかし、当初の糖付着を制限する上での有効性は、ＡＧＥに形成される任意の
アマドリ産物の変換の阻害のプレディクタではない。本発明では、抗原性ＡＧＥ
のインビトロでの形成におけるそれらの影響によって示されるとおり「後期」グ
リケーション反応の阻害剤が記述される（Ｂｏｏｔｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２２０：１１３−１１９、１９９６年）。
【００３７】 化合物 ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼ）は、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから得られるクロマトグラフィで純粋で、凝集不含のグ
レードである。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；画分Ｖ、脂肪酸不含）、ヒトメト
ヘモグロビン（Ｈｂ）、Ｄ−グルコース、ピリドキシン、ピロキサル、ピリドキ
サル５’リン酸塩、ピリドキサミン、チアミン、モノリン酸チアミン、ピロリン
酸チアミン、およびヤギのアルカリ性ホスファターゼ接合抗−ウサギＩｇＧは、
すべてシグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から得た。塩酸ア
ミノグアニジンは、アルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）から購入された。
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから得られるクロマトグラフィで純粋で、凝集不含のグ
レードである。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；画分Ｖ、脂肪酸不含）、ヒトメト
ヘモグロビン（Ｈｂ）、Ｄ−グルコース、ピリドキシン、ピロキサル、ピリドキ
サル５’リン酸塩、ピリドキサミン、チアミン、モノリン酸チアミン、ピロリン
酸チアミン、およびヤギのアルカリ性ホスファターゼ接合抗−ウサギＩｇＧは、
すべてシグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から得た。塩酸ア
ミノグアニジンは、アルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）から購入された。
【００３８】 グルコースとの非中断グリケーション ウシ血清アルブミン、リボヌクレアーゼＡ、およびヒトヘモグロビンを、０．
０２％ナトリウムアジ化合物を含有するｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液中で３７℃で、グルコースと共にインキュベートした。タンパク質、グル
コース（１．０Ｍで）、および予期される阻害剤（０．５、３、１５および５０
ｍＭで）を、同時にインキュベーション混合液に導入した。溶液を、栓をした管
で暗所に保持した。アリコート量を取り、そして反応の集結にＥＬＩＳＡによっ
て分析されるまで直ぐに凍結させた。インキュベーションは、３週間（Ｈｂ）ま
たは６週間（ＲＮアーゼ、ＢＳＡ）であった。
０２％ナトリウムアジ化合物を含有するｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液中で３７℃で、グルコースと共にインキュベートした。タンパク質、グル
コース（１．０Ｍで）、および予期される阻害剤（０．５、３、１５および５０
ｍＭで）を、同時にインキュベーション混合液に導入した。溶液を、栓をした管
で暗所に保持した。アリコート量を取り、そして反応の集結にＥＬＩＳＡによっ
て分析されるまで直ぐに凍結させた。インキュベーションは、３週間（Ｈｂ）ま
たは６週間（ＲＮアーゼ、ＢＳＡ）であった。
【００３９】 ＡＧＥタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製 免疫原作製は、初期プロトコルに続いた（Ｎａｋａｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６２：７４０−７４５、１９８９年
；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：７３２９−７３３２
、１９９１年；Ｍａｋｉｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５１３３−
５１３８、１９９２年）。簡潔には、ｐＨ７．４および３７℃で０．０５％ナト
リウムアジ化合物を含有するｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の
１．５Ｍグルコースを用いて、６０−９０日間、１５ｍｌ中の１．６ｇタンパク
質でＢＳＡ（Ｒ４７９抗体）またはＲＮアーゼ（Ｒ６１８抗体）のグリケーショ
ンによって免疫原を作製した。フロイントアジュバント中の１ｍｇ／ｍｌのグリ
ケート化タンパク質を含有する１ｍｌ溶液の皮下投与によって、８−１２週の雄
のニュージーランド白色ウサギを免疫した。一次注射は、完全アジュバントを使
用し、そして３週の間隔で、フロイント不完全アジュバントを用いて、３回の追
加免疫投与を行った。ウサギを、最後の追加免疫投与の３週間後に放血させた。
凝固全血の遠心分離によって、血清を収集した。抗体は、ＡＧＥ特異的であり、
それにより生来のタンパク質（担体を除き）またはアマドリ中間体のいずれかに
反応性がない。ポリクローナル抗−ＡＧＥ抗体は、感受性があり、そしてインビ
トロおよびインビボでの「後期」ＡＧＥ形成の研究についての価値のある分析道
具であることが立証された。最近、タンパク質グリコキシド化産物カルボキシメ
チルリシン（ＣＭＬ）が、ある種の抗体の優勢な抗原であり得ることが提案され
たが、優勢な抗原性ＡＧＥエピトープまたはハプテンの特性は、不確かさが残る
（Ｒｅｄｄｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１０８７２−１０８７８、１９９５年
）。初期研究は、モデルＣｍＬ化合物とのＥＬＩＳＡ反応性を示すのに失敗した
（Ｍａｋｉｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５１３３−５１３８、１
９９２年）。
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６２：７４０−７４５、１９８９年
；Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：７３２９−７３３２
、１９９１年；Ｍａｋｉｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５１３３−
５１３８、１９９２年）。簡潔には、ｐＨ７．４および３７℃で０．０５％ナト
リウムアジ化合物を含有するｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の
１．５Ｍグルコースを用いて、６０−９０日間、１５ｍｌ中の１．６ｇタンパク
質でＢＳＡ（Ｒ４７９抗体）またはＲＮアーゼ（Ｒ６１８抗体）のグリケーショ
ンによって免疫原を作製した。フロイントアジュバント中の１ｍｇ／ｍｌのグリ
ケート化タンパク質を含有する１ｍｌ溶液の皮下投与によって、８−１２週の雄
のニュージーランド白色ウサギを免疫した。一次注射は、完全アジュバントを使
用し、そして３週の間隔で、フロイント不完全アジュバントを用いて、３回の追
加免疫投与を行った。ウサギを、最後の追加免疫投与の３週間後に放血させた。
凝固全血の遠心分離によって、血清を収集した。抗体は、ＡＧＥ特異的であり、
それにより生来のタンパク質（担体を除き）またはアマドリ中間体のいずれかに
反応性がない。ポリクローナル抗−ＡＧＥ抗体は、感受性があり、そしてインビ
トロおよびインビボでの「後期」ＡＧＥ形成の研究についての価値のある分析道
具であることが立証された。最近、タンパク質グリコキシド化産物カルボキシメ
チルリシン（ＣＭＬ）が、ある種の抗体の優勢な抗原であり得ることが提案され
たが、優勢な抗原性ＡＧＥエピトープまたはハプテンの特性は、不確かさが残る
（Ｒｅｄｄｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１０８７２−１０８７８、１９９５年
）。初期研究は、モデルＣｍＬ化合物とのＥＬＩＳＡ反応性を示すのに失敗した
（Ｍａｋｉｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５１３３−５１３８、１
９９２年）。
【００４０】 ＡＧＥ産物のＥＬＩＳＡ検出 Ｅｎｇｖａｌｌの一般法（１９８１年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７
０：４１９−４３９）は、ＥＬＩＳＡを行うのに使用された。典型的には、グリ
ケート化タンパク質サンプルを、ｐＨ９．５から９．７までの０．１Ｍ炭酸ナト
リウム緩衝液中でおよそ１．５ｕｇ／ｍｌまで希釈した。各ウェルに２００ｕｌ
のタンパク質溶液（０．３ｕｇ／ウェル）をピペットで取分けることによって、
室温で一夜、９６穴ポリスチレンプレート上にタンパク質を被覆させた。被覆後
、タンパク質を、０．０５％ツイーン−２０を含有する生理食塩水溶液でウェル
から洗浄した。その後、２時間、３７℃で、ウェルを、炭酸緩衝液中の２００ｕ
ｌの１％カゼインで遮断し、続いて洗浄した。ウサギ抗−ＡＧＥ抗体を、インキ
ュベーション緩衝液中で約１：３５０の力価に希釈し、そして１時間、３７℃で
インキュベートし、続いて洗浄した。バックグランド読み取りを最小限にするた
めに、グリケート化ＲＮアーゼを検出するのに使用される抗体Ｒ４７９は、グリ
ケート化ＢＳＡに対して生じ、そしてグリケート化ＢＳＡを検出するのに使用さ
れる抗体Ｒ６１８は、グリケート化ＲＮアーゼに対して生じた。その後、ウサギ
ＩｇＧに対するアルカリ性ホスファターゼ接合抗体を、１：２０００または１：
２５００（ロットによって）の力価で二次抗体として添加し、そして１時間、３
７℃でインキュベートし、続いて洗浄した。その後、ｐ−リン酸ニトロフェニル
基質溶液を、そのプレートに添加し、放出ｐ−ニトロフェノレートの吸光度を、
ダイナテックＭＲ４０００ミクロプレート読み取り装置を用いて４１０ｎｍで監
視した。
０：４１９−４３９）は、ＥＬＩＳＡを行うのに使用された。典型的には、グリ
ケート化タンパク質サンプルを、ｐＨ９．５から９．７までの０．１Ｍ炭酸ナト
リウム緩衝液中でおよそ１．５ｕｇ／ｍｌまで希釈した。各ウェルに２００ｕｌ
のタンパク質溶液（０．３ｕｇ／ウェル）をピペットで取分けることによって、
室温で一夜、９６穴ポリスチレンプレート上にタンパク質を被覆させた。被覆後
、タンパク質を、０．０５％ツイーン−２０を含有する生理食塩水溶液でウェル
から洗浄した。その後、２時間、３７℃で、ウェルを、炭酸緩衝液中の２００ｕ
ｌの１％カゼインで遮断し、続いて洗浄した。ウサギ抗−ＡＧＥ抗体を、インキ
ュベーション緩衝液中で約１：３５０の力価に希釈し、そして１時間、３７℃で
インキュベートし、続いて洗浄した。バックグランド読み取りを最小限にするた
めに、グリケート化ＲＮアーゼを検出するのに使用される抗体Ｒ４７９は、グリ
ケート化ＢＳＡに対して生じ、そしてグリケート化ＢＳＡを検出するのに使用さ
れる抗体Ｒ６１８は、グリケート化ＲＮアーゼに対して生じた。その後、ウサギ
ＩｇＧに対するアルカリ性ホスファターゼ接合抗体を、１：２０００または１：
２５００（ロットによって）の力価で二次抗体として添加し、そして１時間、３
７℃でインキュベートし、続いて洗浄した。その後、ｐ−リン酸ニトロフェニル
基質溶液を、そのプレートに添加し、放出ｐ−ニトロフェノレートの吸光度を、
ダイナテックＭＲ４０００ミクロプレート読み取り装置を用いて４１０ｎｍで監
視した。
【００４１】 未修飾タンパク質を含有する対照は、日常的に含まれ、そしてそれらの読み取
りを減じ、修正は、通常に無視してよい。ＡＧＥ形成の動態を定量的に調べる上
でＥＬＩＳＡ法を使用することの妥当性は、アッセイの線状性に依存する（Ｋｅ
ｍｅｎｙおよびＣｈａｌｌａｃｏｍｂｅ、ＥＬＩＳＡ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓ
ｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓ
ｏｎｓ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ、１９８８年）。対照実験を行い、例えば
、ＲＮアーゼについての線状範囲が、約０．２−０．３ｍｇ／ウェルの被覆濃度
より低いことが示された。
りを減じ、修正は、通常に無視してよい。ＡＧＥ形成の動態を定量的に調べる上
でＥＬＩＳＡ法を使用することの妥当性は、アッセイの線状性に依存する（Ｋｅ
ｍｅｎｙおよびＣｈａｌｌａｃｏｍｂｅ、ＥＬＩＳＡ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓ
ｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓ
ｏｎｓ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ、１９８８年）。対照実験を行い、例えば
、ＲＮアーゼについての線状範囲が、約０．２−０．３ｍｇ／ウェルの被覆濃度
より低いことが示された。
【００４２】 結果 図１Ａ−Ｄは、グルコースでグリケート化されたウシ血清アルブミンでの後期
アマドリＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導体の効果を示すグラフである。Ｂ
ＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃で、６週間、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液中の種々の指示誘導体の存在および不在下で１．０Ｍグルコース
とインキュベートした。Ｒ６１８抗−ＡＧＥ抗体を使用したＥＬＩＳＡによって
アリコート量を分析した。阻害剤の濃度は、３、１５および５０ｍＭであった。
使用された阻害剤は、図（１Ａ）におけるピリドキサミン（ＰＭ）、（１Ｂ）に
おけるリン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）、（１Ｃ）におけるピリドキサル（ＰＬ）
、（１Ｄ）におけるピリドキシン（ＰＮ）である。
アマドリＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導体の効果を示すグラフである。Ｂ
ＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃で、６週間、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液中の種々の指示誘導体の存在および不在下で１．０Ｍグルコース
とインキュベートした。Ｒ６１８抗−ＡＧＥ抗体を使用したＥＬＩＳＡによって
アリコート量を分析した。阻害剤の濃度は、３、１５および５０ｍＭであった。
使用された阻害剤は、図（１Ａ）におけるピリドキサミン（ＰＭ）、（１Ｂ）に
おけるリン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）、（１Ｃ）におけるピリドキサル（ＰＬ）
、（１Ｄ）におけるピリドキシン（ＰＮ）である。
【００４３】 図１（対照曲線）は、１．０ＭグルコースとのＢＳＡの反応は、反応を促進す
るのに使用される高い糖濃度でさえ遅く、そして４０日後完了しないことを示す
。異なる濃度の種々のＢ６ビタマーの同時封入は、明らかに、抗原性ＡＧＥの形
成に影響を及ぼす。（図１Ａ−Ｄ）ピリドキサミンおよびリン酸ピリドキサルは
、試験された最低濃度でさえ抗原性ＡＧＥ形成を強力に抑制した一方で、ピリド
キサルは、１５ｍＭより上で有効であった。ピリドキシンは、試験された最高濃
度でわずかに有効であった。
るのに使用される高い糖濃度でさえ遅く、そして４０日後完了しないことを示す
。異なる濃度の種々のＢ６ビタマーの同時封入は、明らかに、抗原性ＡＧＥの形
成に影響を及ぼす。（図１Ａ−Ｄ）ピリドキサミンおよびリン酸ピリドキサルは
、試験された最低濃度でさえ抗原性ＡＧＥ形成を強力に抑制した一方で、ピリド
キサルは、１５ｍＭより上で有効であった。ピリドキシンは、試験された最高濃
度でわずかに有効であった。
【００４４】 図２Ａ−Ｄは、ウシ血清アルブミンでのＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導
体およびアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示すグラフである。ＢＳＡ（１０ｍ
ｇ／ｍｌ）を、３７℃で、６週間、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液中の種々の指示誘導体の存在および不在下で１．０Ｍグルコースとインキュベ
ートした。Ｒ６１８抗−ＡＧＥ抗体を使用したＥＬＩＳＡによってアリコート量
を分析した。阻害剤の濃度は、３、１５および５０ｍＭであった。使用された阻
害剤は、図（２Ａ）におけるピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）、（２Ｂ）における
モノリン酸チアミン（ＴＰ）、（２Ｃ）におけるチアミン（Ｔ）、（２Ｄ）にお
けるアミノグアニジン（ＡＧ）である。
体およびアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示すグラフである。ＢＳＡ（１０ｍ
ｇ／ｍｌ）を、３７℃で、６週間、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液中の種々の指示誘導体の存在および不在下で１．０Ｍグルコースとインキュベ
ートした。Ｒ６１８抗−ＡＧＥ抗体を使用したＥＬＩＳＡによってアリコート量
を分析した。阻害剤の濃度は、３、１５および５０ｍＭであった。使用された阻
害剤は、図（２Ａ）におけるピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）、（２Ｂ）における
モノリン酸チアミン（ＴＰ）、（２Ｃ）におけるチアミン（Ｔ）、（２Ｄ）にお
けるアミノグアニジン（ＡＧ）である。
【００４５】 同様に試験された種々のＢ１ビタマー（図２Ａ−Ｄ）のうち、ピロリン酸チア
ミンは、試験された全ての濃度で有効であった（図２Ｃ）のに対して、チアミン
およびモノリン酸チアミンは、阻害性がなかった。最も明らかには、ピロリン酸
チアミン、リン酸ピリドキサルおよびピリドキサミンで観察された形成されたＡ
ＧＥの最終レベルでの減少に注目することは例外的である。アミノグアニジン（
図２Ｄ）は、ＢＳＡでＡＧＥ形成のある程度の阻害を生じたが、しかし上記化合
物ほどでなかった。ヒトメトヘモグロビンおよびウシリボヌクレアーゼＡを用い
た類似の研究が行われた。
ミンは、試験された全ての濃度で有効であった（図２Ｃ）のに対して、チアミン
およびモノリン酸チアミンは、阻害性がなかった。最も明らかには、ピロリン酸
チアミン、リン酸ピリドキサルおよびピリドキサミンで観察された形成されたＡ
ＧＥの最終レベルでの減少に注目することは例外的である。アミノグアニジン（
図２Ｄ）は、ＢＳＡでＡＧＥ形成のある程度の阻害を生じたが、しかし上記化合
物ほどでなかった。ヒトメトヘモグロビンおよびウシリボヌクレアーゼＡを用い
た類似の研究が行われた。
【００４６】 図３Ａ−Ｄは、ヒトメトヘモグロビンでのＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘
導体の効果を示すグラフである。Ｈｂ（１ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃で、３週間、
ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の種々の指示誘導体の存在およ
び不在下で１．０Ｍグルコースとインキュベートした。Ｒ６１８抗−ＡＧＥ抗体
を使用したＥＬＩＳＡによってアリコート量を分析した。阻害剤の濃度は、０．
５、３、１５および５０ｍＭであった。使用された阻害剤は、図（３Ａ）におけ
るピリドキサミン（ＰＭ）、（３Ｂ）におけるリン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）、
（３Ｃ）におけるピリドキサル（ＰＬ）、（３Ｄ）におけるピリドキシン（ＰＮ
）である。
導体の効果を示すグラフである。Ｈｂ（１ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃で、３週間、
ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の種々の指示誘導体の存在およ
び不在下で１．０Ｍグルコースとインキュベートした。Ｒ６１８抗−ＡＧＥ抗体
を使用したＥＬＩＳＡによってアリコート量を分析した。阻害剤の濃度は、０．
５、３、１５および５０ｍＭであった。使用された阻害剤は、図（３Ａ）におけ
るピリドキサミン（ＰＭ）、（３Ｂ）におけるリン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）、
（３Ｃ）におけるピリドキサル（ＰＬ）、（３Ｄ）におけるピリドキシン（ＰＮ
）である。
【００４７】 糖尿病患者のＨｂは、抗−ＡＧＥ抗体に結合する成分を含有することが、先に
報告され、そして、このグリケート化Ｈｂ（Ｈｂ−ＡＧＥと称される、ＨｂＡｌ ｃ と混同すべきでない）は、グルコースに対する長期露出を測定する上で有用で
ありえることが提案された。グルコースとのＨｂのインビトロでのインキュベー
ションは、ＢＳＡで観察されたより明らかに早い速度で抗原性ＡＧＥを生じる。
それにもかかわらず、異なるＢ６（図３Ａ−Ｄ）およびＢ１（図４Ａ−Ｃ）ビタ
マーは、Ｈｂで同じ阻害傾向を示し、そしてピリドキサミンおよびピロリン酸チ
アミンは、それらの個々のファミリーのうちの各々で最も有効な阻害剤であった
。明らかに、Ｈｂでは、アミノグアニジンのみが、ＡＧＥ形成の速度を阻害し、
そして形成されたＡＧＥの最終濃度ではなかった（図４Ｄ）。
報告され、そして、このグリケート化Ｈｂ（Ｈｂ−ＡＧＥと称される、ＨｂＡｌ ｃ と混同すべきでない）は、グルコースに対する長期露出を測定する上で有用で
ありえることが提案された。グルコースとのＨｂのインビトロでのインキュベー
ションは、ＢＳＡで観察されたより明らかに早い速度で抗原性ＡＧＥを生じる。
それにもかかわらず、異なるＢ６（図３Ａ−Ｄ）およびＢ１（図４Ａ−Ｃ）ビタ
マーは、Ｈｂで同じ阻害傾向を示し、そしてピリドキサミンおよびピロリン酸チ
アミンは、それらの個々のファミリーのうちの各々で最も有効な阻害剤であった
。明らかに、Ｈｂでは、アミノグアニジンのみが、ＡＧＥ形成の速度を阻害し、
そして形成されたＡＧＥの最終濃度ではなかった（図４Ｄ）。
【００４８】 ＲＮアーゼと共に、グルコースによる抗原性ＡＧＥ形成の速度は、Ｈｂおよび
ＢＳＡのものの間の中間体であったが、しかし各ビタマーシリーズ内の阻害の範
囲は維持された。さらに、ピリドキサミンおよびピロリン酸チアミンは、そのア
ミノグアニジンにいっそう有効であった（図５）。
ＢＳＡのものの間の中間体であったが、しかし各ビタマーシリーズ内の阻害の範
囲は維持された。さらに、ピリドキサミンおよびピロリン酸チアミンは、そのア
ミノグアニジンにいっそう有効であった（図５）。
【００４９】 図４Ａ−Ｄは、ヒトメトヘモグロビンでのＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘
導体およびアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示すグラフである。Ｈｂ（１ｍｇ
／ｍｌ）を、３７℃で、３週間、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
中の種々の指示誘導体の存在および不在下で１．０Ｍグルコースとインキュベー
トした。Ｒ６１８抗−ＡＧＥ抗体を使用したＥＬＩＳＡによってアリコート量を
分析した。阻害剤の濃度は、０．５、３、１５および５０ｍＭであった。使用さ
れた阻害剤は、図（４Ａ）におけるピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）、（４Ｂ）に
おけるモノリン酸チアミン（ＴＰ）、（４Ｃ）におけるチアミン（Ｔ）、（４Ｄ
）におけるアミノグアニジン（ＡＧ）である。
導体およびアミノグアニジン（ＡＧ）の効果を示すグラフである。Ｈｂ（１ｍｇ
／ｍｌ）を、３７℃で、３週間、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
中の種々の指示誘導体の存在および不在下で１．０Ｍグルコースとインキュベー
トした。Ｒ６１８抗−ＡＧＥ抗体を使用したＥＬＩＳＡによってアリコート量を
分析した。阻害剤の濃度は、０．５、３、１５および５０ｍＭであった。使用さ
れた阻害剤は、図（４Ａ）におけるピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）、（４Ｂ）に
おけるモノリン酸チアミン（ＴＰ）、（４Ｃ）におけるチアミン（Ｔ）、（４Ｄ
）におけるアミノグアニジン（ＡＧ）である。
【００５０】 図５は、ピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）、ピリドキサミン（ＰＭ）およびアミ
ノグアニジン（ＡＧ）によるリボヌクレアーゼＡのグリケーションの阻害の比較
を示す棒グラフである。ＲＮアーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃で、６週間、ｐ
Ｈ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の種々の指示誘導体の存在および
不在下で１．０Ｍグルコース（ｇｌｃ）とインキュベートした。Ｒ４７９抗−Ａ
ＧＥ抗体を使用したＥＬＩＳＡによってアリコート量を分析した。指示阻害率は
、６週間の時点での阻害剤の不在および存在下でのＥＬＩＳＡ読み取りからコン
ピュータ入力した。阻害剤の濃度は、０．５、３、１５および５０ｍＭであった
。
ノグアニジン（ＡＧ）によるリボヌクレアーゼＡのグリケーションの阻害の比較
を示す棒グラフである。ＲＮアーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃で、６週間、ｐ
Ｈ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の種々の指示誘導体の存在および
不在下で１．０Ｍグルコース（ｇｌｃ）とインキュベートした。Ｒ４７９抗−Ａ
ＧＥ抗体を使用したＥＬＩＳＡによってアリコート量を分析した。指示阻害率は
、６週間の時点での阻害剤の不在および存在下でのＥＬＩＳＡ読み取りからコン
ピュータ入力した。阻害剤の濃度は、０．５、３、１５および５０ｍＭであった
。
【００５１】 検討 これらの結果は、Ｂ１およびＢ６ビタミンの特定の誘導体は、「後期」ＡＧＥ
形成を阻害する能力があることを示す。いくつかのこれらのビタマーは、産生さ
れたＡＧＥの最終濃度を首尾よく阻害し、アミノグアニジンと対照的に、それら
が、抗原性ＡＧＥに対するアマドリまたは後期アマドリ前駆体とより大きな相互
作用を示すことが示唆された。アマドリまたは後期アマドリ中間体は、非酵素的
グリケーションの「典型的な」経路が、基本的に不可逆性になり始める重要な転
機を表す（模式図１）。初期の阻害研究では、「グリケーション」は、通常、形
成されたシッフ塩基（標識シアノボロヒドリドとの還元の後）として、または形
成されたアマドリ産物（標識糖を用いた酸沈殿の後）としてのいずれかで測定さ
れた。このようなアッセイは、そのような段階が、そのタンパク質に付着する標
識糖の量における変化を何ら導かないので、「後期」ＡＧＥ産物に対する後期ア
マドリ変換段階の阻害における情報を生じない。他の「グリケーション」アッセ
イは、非特異的タンパク質蛍光の糖で誘導された増加に依ったが、これは、アマ
ドリ産物フォーメーションに関係なく、グリコアルデヒドまたはグリオキサル（
Ｈｕｎｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：２０５−２１２、１９８８年）のような
遊離糖のジカルボキシル酸化的断片によっても導入され得る。
形成を阻害する能力があることを示す。いくつかのこれらのビタマーは、産生さ
れたＡＧＥの最終濃度を首尾よく阻害し、アミノグアニジンと対照的に、それら
が、抗原性ＡＧＥに対するアマドリまたは後期アマドリ前駆体とより大きな相互
作用を示すことが示唆された。アマドリまたは後期アマドリ中間体は、非酵素的
グリケーションの「典型的な」経路が、基本的に不可逆性になり始める重要な転
機を表す（模式図１）。初期の阻害研究では、「グリケーション」は、通常、形
成されたシッフ塩基（標識シアノボロヒドリドとの還元の後）として、または形
成されたアマドリ産物（標識糖を用いた酸沈殿の後）としてのいずれかで測定さ
れた。このようなアッセイは、そのような段階が、そのタンパク質に付着する標
識糖の量における変化を何ら導かないので、「後期」ＡＧＥ産物に対する後期ア
マドリ変換段階の阻害における情報を生じない。他の「グリケーション」アッセ
イは、非特異的タンパク質蛍光の糖で誘導された増加に依ったが、これは、アマ
ドリ産物フォーメーションに関係なく、グリコアルデヒドまたはグリオキサル（
Ｈｕｎｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：２０５−２１２、１９８８年）のような
遊離糖のジカルボキシル酸化的断片によっても導入され得る。
【００５２】 ピリドキサル（ＰＬ）およびリン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）の場合に、データ
は、グリケーション部位にタンパク質アミノ基を有するこれらのアルデヒドの競
合的シッフ塩基縮合に関与する阻害の簡単な機構を支持する。リン酸ピリドキサ
ルでなくピリドキサル中の内部ヘミアセタール形成のため、ＰＬＰによる後期ア
マドリＡＧＥ形成の強力な阻害が、この競合機構によって予測される。実際に、
これは、データ（図１Ｂ、１Ｃ、図３Ｂ、３Ｃ）で観察される。ピリドキサミン
による阻害は、ピリドキサミンがアルデヒド基を欠く場合に必然的に異なる。し
かし、ピリドキサミンは、開放鎖糖のカルボニルとの、ジカルボニル断片との、
アマドリ産物との、または後期アマドリ中間体とのシッフ塩基結合を潜在的に形
成する能力のある候補アミンである。Ｂ１化合物の阻害の機構は明らかでない。
全ての形態は、アミノ官能性を含み、その結果、ただピロリン酸塩形態の際立っ
た効率は、強力な負の負荷についての重要な要件を示唆する。
は、グリケーション部位にタンパク質アミノ基を有するこれらのアルデヒドの競
合的シッフ塩基縮合に関与する阻害の簡単な機構を支持する。リン酸ピリドキサ
ルでなくピリドキサル中の内部ヘミアセタール形成のため、ＰＬＰによる後期ア
マドリＡＧＥ形成の強力な阻害が、この競合機構によって予測される。実際に、
これは、データ（図１Ｂ、１Ｃ、図３Ｂ、３Ｃ）で観察される。ピリドキサミン
による阻害は、ピリドキサミンがアルデヒド基を欠く場合に必然的に異なる。し
かし、ピリドキサミンは、開放鎖糖のカルボニルとの、ジカルボニル断片との、
アマドリ産物との、または後期アマドリ中間体とのシッフ塩基結合を潜在的に形
成する能力のある候補アミンである。Ｂ１化合物の阻害の機構は明らかでない。
全ての形態は、アミノ官能性を含み、その結果、ただピロリン酸塩形態の際立っ
た効率は、強力な負の負荷についての重要な要件を示唆する。
【００５３】 明らかに予測されない観察は、アミノグアニジン、および他の化合物のいくつ
かによる阻害の範囲は、反応の後期段階で、当初の相の間より相当に低い。これ
は、ピリドキサミンおよびピロリン酸チアミンのものより作用の異なる機構を示
唆し、それにより、これらの化合物の治療剤能力は、アミノグアニジンとの同時
投与によって増強されることが示唆される。
かによる阻害の範囲は、反応の後期段階で、当初の相の間より相当に低い。これ
は、ピリドキサミンおよびピロリン酸チアミンのものより作用の異なる機構を示
唆し、それにより、これらの化合物の治療剤能力は、アミノグアニジンとの同時
投与によって増強されることが示唆される。
【００５４】 実施例２ 非酵素的グリケーションの速度論：リボースによる自己矛盾した阻害および高
次的後期アマドリＡＧＥ形成についてのタンパク質中間体の容易な単離 高濃度のグルコースを使用して、自己矛盾でタンパク質の非酵素的グリケーシ
ョンを引き起こす場合、高濃度でのリボースは、グリケーション反応の後期アマ
ドリ「後半」段階における作用によってリボヌクレアーゼでの後期アマドリＡＧ
Ｅ形成に阻害的であることが分かった。この予測されない阻害的効果は、「初期
」反応性中間体、おそらくアマドリ産物が、「後半」後期アマドリＡＧＥ産物（
ＡＧＥ；メイラード産物）の形成をほどんど伴わずに蓄積され得ることを示唆す
る。この減少に対する調査は、（１）アマドリ（または後期アマドリ）グリケー
ト化中間体（類）のキネティック単離についての条件を定義する能力、（２）こ
のような中間体の構築の高速速度論を研究する能力、（３）遊離または可逆的に
結合した糖の不在下でのＡＧＥ産物へのこのような中間体の変換の驚くべき高速
速度論を研究する能力、（４）これらの中間体を使用して、ＡＧＥ形成の後期ア
マドリ段階の阻害を研究および特徴づけする能力を示し、したがって反応の機構
およびＡＧＥ形成を遮断する強力な剤の効力を調べる新規系が提供され；そして
（５）この知識で、反応性中間体を研究し、そしてそれらの変換を監視するため
に１３Ｃ ＮＭＲを使用することもさらに可能である（Ｋｈａｌｉｆａｈら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５（１５）：４６４５−４６５４、１９９６年）。
次的後期アマドリＡＧＥ形成についてのタンパク質中間体の容易な単離 高濃度のグルコースを使用して、自己矛盾でタンパク質の非酵素的グリケーシ
ョンを引き起こす場合、高濃度でのリボースは、グリケーション反応の後期アマ
ドリ「後半」段階における作用によってリボヌクレアーゼでの後期アマドリＡＧ
Ｅ形成に阻害的であることが分かった。この予測されない阻害的効果は、「初期
」反応性中間体、おそらくアマドリ産物が、「後半」後期アマドリＡＧＥ産物（
ＡＧＥ；メイラード産物）の形成をほどんど伴わずに蓄積され得ることを示唆す
る。この減少に対する調査は、（１）アマドリ（または後期アマドリ）グリケー
ト化中間体（類）のキネティック単離についての条件を定義する能力、（２）こ
のような中間体の構築の高速速度論を研究する能力、（３）遊離または可逆的に
結合した糖の不在下でのＡＧＥ産物へのこのような中間体の変換の驚くべき高速
速度論を研究する能力、（４）これらの中間体を使用して、ＡＧＥ形成の後期ア
マドリ段階の阻害を研究および特徴づけする能力を示し、したがって反応の機構
およびＡＧＥ形成を遮断する強力な剤の効力を調べる新規系が提供され；そして
（５）この知識で、反応性中間体を研究し、そしてそれらの変換を監視するため
に１３Ｃ ＮＭＲを使用することもさらに可能である（Ｋｈａｌｉｆａｈら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５（１５）：４６４５−４６５４、１９９６年）。
【００５５】 化合物および材料 上の実施例１と同様。
【００５６】 ＡＧＥに対するポリクローナル抗体の作製 上の実施例１と同様。
【００５７】 ＡＧＥ産物のＥＬＩＳＡ検出 上の実施例１と同様。
【００５８】 アミノ酸分析 カンザス大学医療センターのバイオテクノロジー支援施設でアミノ酸分析を行
った。１１０℃で、１８−２４時間、６Ｎ ＨＣｌを用いたグリケート化タンパ
ク質（ナトリウムシアノボロヒドリドで還元した）の加水分解の後、分析を行っ
た。フェニルイソチオシアネートを、誘導のために使用し、そしてＰＴＨ誘導体
を、アプライドバイオシステムズのアミノ酸分析装置（４２０Ａデリバタイゼー
、１３０Ａ分離システム、９２０Ａデータ分析システム）上の逆相ＨＰＬＣによ
って分析した。
った。１１０℃で、１８−２４時間、６Ｎ ＨＣｌを用いたグリケート化タンパ
ク質（ナトリウムシアノボロヒドリドで還元した）の加水分解の後、分析を行っ
た。フェニルイソチオシアネートを、誘導のために使用し、そしてＰＴＨ誘導体
を、アプライドバイオシステムズのアミノ酸分析装置（４２０Ａデリバタイゼー
、１３０Ａ分離システム、９２０Ａデータ分析システム）上の逆相ＨＰＬＣによ
って分析した。
【００５９】 ペントシジン逆相ＨＰＬＣ分析 ＲＮアーゼ中のペントシジン産生を、ＨＰＬＣによって定量した（Ｓｅｌｌお
よびＭｏｎｎｉｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１５９７−２１６０
２、１９８９年；Ｏｄｅｔｔｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４１：１５３−１５９、
１９９２年）。１８時間、１００℃で、６Ｎ ＨＣｌ中でリボース修飾タンパク
質サンプルを加水分解し、そしてその後、スピードバックで乾燥させた。その後
、サンプルを再溶解させ、そしてアリコート量を０．１％トリフルオロ酢酸に取
り、そして０．１％ＴＦＡで平衡にしたビダックＣ−１８カラムを用いたシマズ
システム上のＨＰＬＣによって分析した。０−６％アセトニトリル（ＴＦＡ中０
．１％）の勾配を、３０分間、約１ｍｌ／分の流速で行った。ペントシジンは、
３３５ｎｍ励起／３８５ｎｍ排出蛍光によって検出され、そしてその溶出時間は
、合成標準を起動することによって測定された。予測される極端に小さなレベル
のペントシジン（ＧｒａｎｄｈｅｅおよびＭｏｎｎｉｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６６：１１６４９−１１６５３、１９９１年；Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６５４−１１６６０、１９９１年）のため、絶対濃
度を定量する努力は払われなかった。相対的濃度のみが、頂上領域から測定され
た。
よびＭｏｎｎｉｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２１５９７−２１６０
２、１９８９年；Ｏｄｅｔｔｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４１：１５３−１５９、
１９９２年）。１８時間、１００℃で、６Ｎ ＨＣｌ中でリボース修飾タンパク
質サンプルを加水分解し、そしてその後、スピードバックで乾燥させた。その後
、サンプルを再溶解させ、そしてアリコート量を０．１％トリフルオロ酢酸に取
り、そして０．１％ＴＦＡで平衡にしたビダックＣ−１８カラムを用いたシマズ
システム上のＨＰＬＣによって分析した。０−６％アセトニトリル（ＴＦＡ中０
．１％）の勾配を、３０分間、約１ｍｌ／分の流速で行った。ペントシジンは、
３３５ｎｍ励起／３８５ｎｍ排出蛍光によって検出され、そしてその溶出時間は
、合成標準を起動することによって測定された。予測される極端に小さなレベル
のペントシジン（ＧｒａｎｄｈｅｅおよびＭｏｎｎｉｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６６：１１６４９−１１６５３、１９９１年；Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６５４−１１６６０、１９９１年）のため、絶対濃
度を定量する努力は払われなかった。相対的濃度のみが、頂上領域から測定され
た。
【００６０】 グリケーション修飾 リボースまたはグリケーションを用いた修飾は、一般に３７℃で、０．０２％
ナトリウムアジ化合物を含有するｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸緩衝液で行った。
高い緩衝液濃度は、０．５Ｍリボース修飾でいつも使用される。溶液を栓付き試
験管に保持し、そして後に種々の分析を行うために直ぐに凍結した定期のアリコ
ート量を取り出すためにのみ開けた。「中断グリケーション」実験が、最初にタ
ンパク質を、３７℃で、８または２４時間、リボースと共にインキュベートし、
続いて直ぐにそして集約的に、４℃で頻繁な冷緩衝液交換に対して透析すること
によって行われた。その後、サンプルを、外部リボースの不在下で迅速に３７℃
に加温することによって再インキュベートした。アリコート量を取り、そして後
の分析のために種々の間隔で凍結した。低分子量のＲＮアーゼのため、タンパク
質濃度を、低分子量排除透析管が使用されるときでさえ、透析の後に再測定した
。中断が、０．５Ｍリボースを含有する反応混合液からの簡単な１００倍希釈に
よって達成される選択手段も、創案された（下記参照）。タンパク質濃度は、Ｕ
Ｖスペクトルから概算された。ピーク（２７８ｎｍ）と最低値（２５０ｎｍ）と
の間のモル吸光度における差異は、グリケーションを付随するＵＶ吸光度におけ
る全般的増加について補償するために、ＲＮアーゼ濃度測定のために使用した。
時間依存性ＵＶ差スペクトル研究を行って、ＵＶスペクトルのグリケーション寄
与を特徴づけた。
ナトリウムアジ化合物を含有するｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸緩衝液で行った。
高い緩衝液濃度は、０．５Ｍリボース修飾でいつも使用される。溶液を栓付き試
験管に保持し、そして後に種々の分析を行うために直ぐに凍結した定期のアリコ
ート量を取り出すためにのみ開けた。「中断グリケーション」実験が、最初にタ
ンパク質を、３７℃で、８または２４時間、リボースと共にインキュベートし、
続いて直ぐにそして集約的に、４℃で頻繁な冷緩衝液交換に対して透析すること
によって行われた。その後、サンプルを、外部リボースの不在下で迅速に３７℃
に加温することによって再インキュベートした。アリコート量を取り、そして後
の分析のために種々の間隔で凍結した。低分子量のＲＮアーゼのため、タンパク
質濃度を、低分子量排除透析管が使用されるときでさえ、透析の後に再測定した
。中断が、０．５Ｍリボースを含有する反応混合液からの簡単な１００倍希釈に
よって達成される選択手段も、創案された（下記参照）。タンパク質濃度は、Ｕ
Ｖスペクトルから概算された。ピーク（２７８ｎｍ）と最低値（２５０ｎｍ）と
の間のモル吸光度における差異は、グリケーションを付随するＵＶ吸光度におけ
る全般的増加について補償するために、ＲＮアーゼ濃度測定のために使用した。
時間依存性ＵＶ差スペクトル研究を行って、ＵＶスペクトルのグリケーション寄
与を特徴づけた。
【００６１】 速度論のデータ分析および数値シュミレーション 速度論データは、非線形最小自乗法を用いた一次指数または二次指数関数に日
常的に適合した。模式図５−６の速度論機構は、反応の微分方程式の数値シュミ
レーションによって試験された。観察された速度論データに対するシュミレーシ
ョンと適合の両方は、サイエンティスト（ＳＣＩＥＮＴＩＳＴ）２．０ソフトウ
エアーパッケージ（Ｍｉｃｒｏｍａｔｈ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。二次指数
関数（図６Ａ）に適した速度論データからの見かけの半減期（図６Ｂ）の測定は
、マスＣＡＤ４．０ソフトウエアー（ＭａｔｈＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．）の「解決」
関数を用いて行われた。
常的に適合した。模式図５−６の速度論機構は、反応の微分方程式の数値シュミ
レーションによって試験された。観察された速度論データに対するシュミレーシ
ョンと適合の両方は、サイエンティスト（ＳＣＩＥＮＴＩＳＴ）２．０ソフトウ
エアーパッケージ（Ｍｉｃｒｏｍａｔｈ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。二次指数
関数（図６Ａ）に適した速度論データからの見かけの半減期（図６Ｂ）の測定は
、マスＣＡＤ４．０ソフトウエアー（ＭａｔｈＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．）の「解決」
関数を用いて行われた。
【００６２】 結果 グルコースおよびリボースによるグリケーションの比較 リボースおよびグルコースとのＲＮアーゼＡの反応は、グルコース修飾ＢＳＡ
に対して発生したＲ４７９ウサギＡＧＥ特異的抗体を用いて、最初にＥＬＩＳＡ
アッセイで行われた。少ない範囲まで、唯一知られた酸安定性蛍光ＡＧＥである
ペントシジンの産生は、酸加水分解に続くＨＰＬＣによって定量された。３７℃
で０．０５Ｍリボースを用いた予備研究では、ｐＨが、５．０から７．５まで増
大されるので、抗原性ＡＧＥ形成の速度が、全ての場合に速度論の始まりで見か
けの小さな誘導期間で控えめに増加（見かけの半減期によって測定される場合に
およそ２−３倍）しているようであることが示された。ｐＨ７．５での０．０５
ＭリボースとのＲＮアーゼのグリケーション（６．５日に近い半減期）は、１．
０Ｍグルコースとのグリケーション（３０日を越えた半減期は、図７Ｂ参照、実
線）のものより早いほとんど規模の桁であるようである。後者の速度論は、６０
日後でさえ不完全な均一化を除いて、小さな誘導期間をも表し、それにより、真
の半減期を概算するのを困難にした。
に対して発生したＲ４７９ウサギＡＧＥ特異的抗体を用いて、最初にＥＬＩＳＡ
アッセイで行われた。少ない範囲まで、唯一知られた酸安定性蛍光ＡＧＥである
ペントシジンの産生は、酸加水分解に続くＨＰＬＣによって定量された。３７℃
で０．０５Ｍリボースを用いた予備研究では、ｐＨが、５．０から７．５まで増
大されるので、抗原性ＡＧＥ形成の速度が、全ての場合に速度論の始まりで見か
けの小さな誘導期間で控えめに増加（見かけの半減期によって測定される場合に
およそ２−３倍）しているようであることが示された。ｐＨ７．５での０．０５
ＭリボースとのＲＮアーゼのグリケーション（６．５日に近い半減期）は、１．
０Ｍグルコースとのグリケーション（３０日を越えた半減期は、図７Ｂ参照、実
線）のものより早いほとんど規模の桁であるようである。後者の速度論は、６０
日後でさえ不完全な均一化を除いて、小さな誘導期間をも表し、それにより、真
の半減期を概算するのを困難にした。
【００６３】 リボース濃度での速度論の依存性が、ｐＨ７．５で試験された場合、ほとんど
の予測されない結果が得られた。反応の速度は、当初、リボース濃度の増加に伴
って増大したが、０．１５Ｍより上の濃度では、反応の速度は、均一化し、そし
てその後、明らかに減少した（図６Ａ）。リボース（図６Ｂ）の濃度における逆
数的半減期の依存性のプロットは、高いリボース濃度が、後期アマドリ抗原性Ａ
ＧＥ形成に自己矛盾的に阻害性があることを示す。この通常でないが、一定の効
果は、緩衝液（２倍）またはＲＮアーゼ（１０倍）のいずれかの濃度における変
化に関係ないことが分かり、そしてそれは、固定化したＡＧＥ−ＲＮアーゼのカ
ラムにおけるＲ４７９抗体のアフィニティ精製によって変化しなかった。それは
、ＥＬＩＳＡアッセイ自身におけるリボースの影響にもよらない。後期アマドリ
ＡＧＥ形成におけるリボースによる測定された阻害効果は、ＥＬＩＳＡアッセイ
でのタンパク質上のＡＧＥ抗原性部位の抗体認識とのリボースの干渉によりそう
にない。ＥＬＩＳＡプレート上での一次抗−ＡＧＥ抗体との最初の接触の前に、
グリケート化タンパク質を、１００倍以上に希釈し、吸着の後、ツイーン−２０
で集約的に洗浄し、そして１％カセインコーティング剤で遮断し、続いてさらに
ツイーン−２０で洗浄した。
の予測されない結果が得られた。反応の速度は、当初、リボース濃度の増加に伴
って増大したが、０．１５Ｍより上の濃度では、反応の速度は、均一化し、そし
てその後、明らかに減少した（図６Ａ）。リボース（図６Ｂ）の濃度における逆
数的半減期の依存性のプロットは、高いリボース濃度が、後期アマドリ抗原性Ａ
ＧＥ形成に自己矛盾的に阻害性があることを示す。この通常でないが、一定の効
果は、緩衝液（２倍）またはＲＮアーゼ（１０倍）のいずれかの濃度における変
化に関係ないことが分かり、そしてそれは、固定化したＡＧＥ−ＲＮアーゼのカ
ラムにおけるＲ４７９抗体のアフィニティ精製によって変化しなかった。それは
、ＥＬＩＳＡアッセイ自身におけるリボースの影響にもよらない。後期アマドリ
ＡＧＥ形成におけるリボースによる測定された阻害効果は、ＥＬＩＳＡアッセイ
でのタンパク質上のＡＧＥ抗原性部位の抗体認識とのリボースの干渉によりそう
にない。ＥＬＩＳＡプレート上での一次抗−ＡＧＥ抗体との最初の接触の前に、
グリケート化タンパク質を、１００倍以上に希釈し、吸着の後、ツイーン−２０
で集約的に洗浄し、そして１％カセインコーティング剤で遮断し、続いてさらに
ツイーン−２０で洗浄した。
【００６４】 「中断グリケーション」による後期アマドリ抗原性ＡＧＥの形成の速度論 見られる小さな誘導期の観点で、ＥＬＩＳＡ検出性後期アマドリ抗原性ＡＧＥ
を生じる能力のある、アマドリ中間体のような初期前駆体の反応の間のある程度
の蓄積があるかどうかを測定する試みがなされた。ＲＮアーゼは、０．５Ｍの高
いリボース濃度で、ｐＨ７．５および３７℃でグリケート化し、そしてその反応
は、４℃までの即時冷却による２４時間後に中断させ、そして２４時間の期間か
けて冷緩衝液の数回の交換に対して透析して、遊離および可逆的に結合した（シ
ッフ塩基）リボースを取り出した。その後、このようなリボース不含サンプルを
、何らリボースを再添加せずに、迅速に２７℃に加温し、そして数日間かけて後
期アマドリＡＧＥ形成のためにサンプル取りした。この２４時間「中断グリケー
ション」サンプルのＡＧＥ抗原産生は、図７Ａで破線および白抜き三角によって
示されたが、冷透析で費やした時間は、含まれない。非中断対照（実線および黒
塗り円形）も、比較のために示された。後期アマドリ抗原性ＡＧＥ形成の劇的に
異なる速度論は、２つのサンプルで明らかである。リボース不含の中断サンプル
のＡＧＥ抗原産生の速度論は、ここで、（１）誘導期間を伴わない一次指数的速
度論、（２）１０時間の桁の際立った半減期を伴う抗原性ＡＧＥ形成の大いに増
強された速度、および（３）リボースの継続存在下での長期インキュベーション
で見られるものに匹敵する抗原の濃度の産生を示す（図６Ａ参照）。等しく明ら
かに、データは、図７Ａで時間１日で白抜き三角および黒抜き円形の間の小さな
差によって示されるとおり、冷透析期間中に無視し得るＡＧＥ抗原が形成される
ことも表す。ある場合でも非常に僅かのＡＧＥが、「中断」手段それ自身によっ
て形成された。これらの観察は、抗原性ＡＧＥに対して十分に競合性のある単離
性中間体または前駆体が、遊離および可逆に結合した糖を除去する前にリボース
との２４時間接触の間に作製されたことを示す。
を生じる能力のある、アマドリ中間体のような初期前駆体の反応の間のある程度
の蓄積があるかどうかを測定する試みがなされた。ＲＮアーゼは、０．５Ｍの高
いリボース濃度で、ｐＨ７．５および３７℃でグリケート化し、そしてその反応
は、４℃までの即時冷却による２４時間後に中断させ、そして２４時間の期間か
けて冷緩衝液の数回の交換に対して透析して、遊離および可逆的に結合した（シ
ッフ塩基）リボースを取り出した。その後、このようなリボース不含サンプルを
、何らリボースを再添加せずに、迅速に２７℃に加温し、そして数日間かけて後
期アマドリＡＧＥ形成のためにサンプル取りした。この２４時間「中断グリケー
ション」サンプルのＡＧＥ抗原産生は、図７Ａで破線および白抜き三角によって
示されたが、冷透析で費やした時間は、含まれない。非中断対照（実線および黒
塗り円形）も、比較のために示された。後期アマドリ抗原性ＡＧＥ形成の劇的に
異なる速度論は、２つのサンプルで明らかである。リボース不含の中断サンプル
のＡＧＥ抗原産生の速度論は、ここで、（１）誘導期間を伴わない一次指数的速
度論、（２）１０時間の桁の際立った半減期を伴う抗原性ＡＧＥ形成の大いに増
強された速度、および（３）リボースの継続存在下での長期インキュベーション
で見られるものに匹敵する抗原の濃度の産生を示す（図６Ａ参照）。等しく明ら
かに、データは、図７Ａで時間１日で白抜き三角および黒抜き円形の間の小さな
差によって示されるとおり、冷透析期間中に無視し得るＡＧＥ抗原が形成される
ことも表す。ある場合でも非常に僅かのＡＧＥが、「中断」手段それ自身によっ
て形成された。これらの観察は、抗原性ＡＧＥに対して十分に競合性のある単離
性中間体または前駆体が、遊離および可逆に結合した糖を除去する前にリボース
との２４時間接触の間に作製されたことを示す。
【００６５】 ただ８時間後に中断されたサンプルが、２４時間中断サンプルの約７２％であ
る最終量のＡＧＥ抗原を生成した。ほんの０．０５％Ｍリボースでグリケート化
し、そして３７℃で冷透析および再インキュベーションにより８時間で中断させ
たＲＮアーゼのサンプルは、９日後にＥＬＩＳＡ反応性抗原の５％より少ない産
生を示した。しかし、２４時間での中断は、０．０５Ｍリボースの非中断存在下
で生じたもののおよそ５０％のレベルまでのＥＬＩＳＡ抗原の迅速な上昇を生じ
た。
る最終量のＡＧＥ抗原を生成した。ほんの０．０５％Ｍリボースでグリケート化
し、そして３７℃で冷透析および再インキュベーションにより８時間で中断させ
たＲＮアーゼのサンプルは、９日後にＥＬＩＳＡ反応性抗原の５％より少ない産
生を示した。しかし、２４時間での中断は、０．０５Ｍリボースの非中断存在下
で生じたもののおよそ５０％のレベルまでのＥＬＩＳＡ抗原の迅速な上昇を生じ
た。
【００６６】 同じ全般的中断効果も、他のタンパク質（ＢＳＡおよびヘモグロビン）と共に
見られた。速度定数のある程度異なる絶対値、そして２４時間の０．５Ｍリボー
スインキュベーション中形成された抗原性ＡＧＥの量以外に、ＡＧＥ抗原形成の
速度における同じ劇的増大が、０．５Ｍリボースを除去した後に観察された。
見られた。速度定数のある程度異なる絶対値、そして２４時間の０．５Ｍリボー
スインキュベーション中形成された抗原性ＡＧＥの量以外に、ＡＧＥ抗原形成の
速度における同じ劇的増大が、０．５Ｍリボースを除去した後に観察された。
【００６７】 グリケーションは、リボースとより、グルコースでいっそう遅い（図７Ａおよ
び図７Ｂの間の時間規模での差に注目すること）。しかし、リボースを用いた場
合と違い、１．０Ｍグルコースによる３日のグリケーションの後の中断は、無視
してよい蓄積を生じた（図７Ｂ、破線曲線）。
び図７Ｂの間の時間規模での差に注目すること）。しかし、リボースを用いた場
合と違い、１．０Ｍグルコースによる３日のグリケーションの後の中断は、無視
してよい蓄積を生じた（図７Ｂ、破線曲線）。
【００６８】 ペントシジン形成の速度論 ＥＬＩＳＡ試験にかけたサンプルも、酸安定性ＡＧＥであるペントシジンの産
生について分析した。ペントシジンの含有量は、ＥＬＩＳＡによる抗体反応性に
ついて分析した同じＲＮアーゼサンプルについて測定した。ｐH７．５での０．
４Ｍリン酸緩衝液中のリボースによるグリケーションは、酸加水分解後の蛍光に
より定量したＲＮアーゼＡ中にペントシジンを生じた。図８Ａは、非中断条件下
で、０．０５Ｍリボースが、ペントシジンにおける進行性の増加を生じたことを
示す。しかし、グリケーションが「中断」条件下で行われるときに、ペントシジ
ン形成の速度における劇的な増大が、過剰リボースの除去の後に直ちに見られ（
図８Ｂ）、そしてそれは、抗原性ＡＧＥの外観の速度論（図７Ａ）に類似するが
、しかしわずかにより迅速である。より多くの量のペントシジンが、８時間と比
較したときに２４時間中断でも生じた。ペントシジンと抗原性ＡＧＥとの形成の
速度論の間の再現性の差も、注目され得る。顕著な量のペントシジンが、２４時
間インキュベーションの間に、そして冷透析の間にも形成され、それにより、図
８Ｂ中の破線の垂直線の飛躍を生じる。したがって、我々の観察では、ペントシ
ジン前駆体が、リボース除去の後にペントシジンを迅速に生じ得るリボースグリ
ケーションの間に蓄積することが示される（参照：Ｏｄｅｔｔｉら、Ｄｉａｂｅ
ｔｅｓ ４１：１５３−１５９、１９９２年）。
生について分析した。ペントシジンの含有量は、ＥＬＩＳＡによる抗体反応性に
ついて分析した同じＲＮアーゼサンプルについて測定した。ｐH７．５での０．
４Ｍリン酸緩衝液中のリボースによるグリケーションは、酸加水分解後の蛍光に
より定量したＲＮアーゼＡ中にペントシジンを生じた。図８Ａは、非中断条件下
で、０．０５Ｍリボースが、ペントシジンにおける進行性の増加を生じたことを
示す。しかし、グリケーションが「中断」条件下で行われるときに、ペントシジ
ン形成の速度における劇的な増大が、過剰リボースの除去の後に直ちに見られ（
図８Ｂ）、そしてそれは、抗原性ＡＧＥの外観の速度論（図７Ａ）に類似するが
、しかしわずかにより迅速である。より多くの量のペントシジンが、８時間と比
較したときに２４時間中断でも生じた。ペントシジンと抗原性ＡＧＥとの形成の
速度論の間の再現性の差も、注目され得る。顕著な量のペントシジンが、２４時
間インキュベーションの間に、そして冷透析の間にも形成され、それにより、図
８Ｂ中の破線の垂直線の飛躍を生じる。したがって、我々の観察では、ペントシ
ジン前駆体が、リボース除去の後にペントシジンを迅速に生じ得るリボースグリ
ケーションの間に蓄積することが示される（参照：Ｏｄｅｔｔｉら、Ｄｉａｂｅ
ｔｅｓ ４１：１５３−１５９、１９９２年）。
【００６９】 反応性中間体（類）の蓄積の速度 上に記述された「中断グリケーション」実験は、後期アマドリ抗原性ＡＧＥと
ペントシジンとの両方に対する先駆体または先駆体類が、リボースとのグリケー
ションの間に蓄積され得ることを示す。この中間体の形成の速度論は、独立に行
われ、そして上に記述される多様な実験によって定量され得る。リボースと異な
る一定時間でＲＮアーゼに発生した中間体の量は、中断後にそれが抗原性ＡＧＥ
を生じ得る最大範囲まで分析され得る。グリケーションを開始した後の可変時間
で、遊離および可逆的に結合したリボースは、冷所での透析により、または高速
希釈（以下参照）によって除去される。３７℃まで加温した後、十分な時間（５
日、それは、図７Ａによって幾つかの半減期を表す）を、後期アマドリ抗原性Ａ
ＧＥの最大発生のために対処させた。その後、最大ＡＧＥ発生を表す、各中断点
の５日後のＥＬＩＳＡ読み取りは、中断の時期に存在する中間体濃度に比例する
。
ペントシジンとの両方に対する先駆体または先駆体類が、リボースとのグリケー
ションの間に蓄積され得ることを示す。この中間体の形成の速度論は、独立に行
われ、そして上に記述される多様な実験によって定量され得る。リボースと異な
る一定時間でＲＮアーゼに発生した中間体の量は、中断後にそれが抗原性ＡＧＥ
を生じ得る最大範囲まで分析され得る。グリケーションを開始した後の可変時間
で、遊離および可逆的に結合したリボースは、冷所での透析により、または高速
希釈（以下参照）によって除去される。３７℃まで加温した後、十分な時間（５
日、それは、図７Ａによって幾つかの半減期を表す）を、後期アマドリ抗原性Ａ
ＧＥの最大発生のために対処させた。その後、最大ＡＧＥ発生を表す、各中断点
の５日後のＥＬＩＳＡ読み取りは、中断の時期に存在する中間体濃度に比例する
。
【００７０】 図９は、中間体蓄積の速度論が、０．５Ｍリボースの存在下でＲＮアーゼにつ
いて測定されるこのような実験を示す（塗潰し記号および曲線）。比較のために
、各中断店でのリボース除去の前に存在するＡＧＥの量も示される（白抜き記号
および破線）。予測されるとおり（図７Ａ参照）、リボースの除去（または希釈
）の前に、ほとんどＡＧＥは形成されず、その結果、５日の二次インキュベーシ
ョン期間の後のＥＬＩＳＡ読み取りは、おおむね、リボース除去後に形成された
ＡＧＥの測定値である。図９での結果では、０．５Ｍリボース中の中間体の蓄積
の速度は、約３．３時間の半減期を示し、指数的で、そして非常に早いことが示
される。これは、中断の後に中間体から抗原性ＡＧＥへの変換で観察される速度
より約3倍早い（図７Ａで白抜き記号および破線曲線）。
いて測定されるこのような実験を示す（塗潰し記号および曲線）。比較のために
、各中断店でのリボース除去の前に存在するＡＧＥの量も示される（白抜き記号
および破線）。予測されるとおり（図７Ａ参照）、リボースの除去（または希釈
）の前に、ほとんどＡＧＥは形成されず、その結果、５日の二次インキュベーシ
ョン期間の後のＥＬＩＳＡ読み取りは、おおむね、リボース除去後に形成された
ＡＧＥの測定値である。図９での結果では、０．５Ｍリボース中の中間体の蓄積
の速度は、約３．３時間の半減期を示し、指数的で、そして非常に早いことが示
される。これは、中断の後に中間体から抗原性ＡＧＥへの変換で観察される速度
より約3倍早い（図７Ａで白抜き記号および破線曲線）。
【００７１】 これらの実験で、各中断時間でのリボースの除去は、１００倍希釈により達成
され、そして透析によっては達成されなかった。サンプル希釈は、リボースの濃
度を０．０５Ｍから０．００５Ｍに減少させた。それは、ほとんどＡＧＥが、残
りの５ｍＭリボースで、この時間規模で生成されないことが独立に測定された（
図６Ａ）。この希釈アプローチ法は、定量的点から点への精度についての必要に
より最初に指令された。このような精度は、各中断点で、各サンプルについて独
立に行われる透析手段によっては達成されないであろう。我々の結果は、希釈が
透析に等価であることを示す。
され、そして透析によっては達成されなかった。サンプル希釈は、リボースの濃
度を０．０５Ｍから０．００５Ｍに減少させた。それは、ほとんどＡＧＥが、残
りの５ｍＭリボースで、この時間規模で生成されないことが独立に測定された（
図６Ａ）。この希釈アプローチ法は、定量的点から点への精度についての必要に
より最初に指令された。このような精度は、各中断点で、各サンプルについて独
立に行われる透析手段によっては達成されないであろう。我々の結果は、希釈が
透析に等価であることを示す。
【００７２】 別個の対照実験（下で図１０参照）は、即時の１００倍希釈は、透析手段とひ
ぼ同一の結果を付与することを示した。これらの対照実験は、可逆性リボース−
タンパク質結合（シッフ塩基）均衡が、この時点の規模で極めて迅速であること
を示す。これは、０．５Ｍリボースを用いたシッフ塩基形成の半分の時間は、数
分の桁にあるべきであることを示したＢｕｎｎおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９８１
年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１３：２２２−２２４）のデータと一致する。リボース
を減少させる１００倍の高速希釈法は、定量的精度が必須であり、そして多くの
サンプルの複合透析によって達成できない正当な方法である。
ぼ同一の結果を付与することを示した。これらの対照実験は、可逆性リボース−
タンパク質結合（シッフ塩基）均衡が、この時点の規模で極めて迅速であること
を示す。これは、０．５Ｍリボースを用いたシッフ塩基形成の半分の時間は、数
分の桁にあるべきであることを示したＢｕｎｎおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９８１
年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１３：２２２−２２４）のデータと一致する。リボース
を減少させる１００倍の高速希釈法は、定量的精度が必須であり、そして多くの
サンプルの複合透析によって達成できない正当な方法である。
【００７３】 リボースおよびグルコースによる、中間体から得られる後期アマドリＡＧＥ形
成の直接阻害 中断および糖希釈の後のＡＧＥ形成の速度における増大は、立証されていない
が、高濃度のリボースが、最初の「安定な」中間体、おそらくアマドリ誘導体（
模式図Ｉ中で囲まれた）で、またはそれによって反応を阻害していることを示唆
する。その後、後期アマドリ反応でリボースを直接的に添加する効果を研究する
ことによって、この試験を行った。中間体を製造するために、ＲＮアーゼを、最
初に、２４時間、０．５Ｍリボース中でインキュベートした。２つのプロトコル
を行って、様々な濃度のリボースによる抗原性ＡＧＥの後期アマドリ形成の可能
な阻害を測定した。最初の実験で、２４時間リベイテッドサンプル（ｒｉｂａｔ
ｅｄ ｓａｍｐｌｅ）を、簡単に、０．００５Ｍから０．５０５Ｍまでの範囲に
ある可変の最終濃度のリボースを含有する溶液で１００倍に希釈した（図１０Ａ
）。ＡＧＥ形成の速度および範囲は、リボース濃度を増加することによって減じ
られることが明らかに分かる。際立って、０．５Ｍリボースの最大の濃度まで、
速度論は、対数を表し、そして高いリボース濃度で非中断グリケーション（図６
Ａおよび７Ａ）に起こる誘導期間を示さない。
成の直接阻害 中断および糖希釈の後のＡＧＥ形成の速度における増大は、立証されていない
が、高濃度のリボースが、最初の「安定な」中間体、おそらくアマドリ誘導体（
模式図Ｉ中で囲まれた）で、またはそれによって反応を阻害していることを示唆
する。その後、後期アマドリ反応でリボースを直接的に添加する効果を研究する
ことによって、この試験を行った。中間体を製造するために、ＲＮアーゼを、最
初に、２４時間、０．５Ｍリボース中でインキュベートした。２つのプロトコル
を行って、様々な濃度のリボースによる抗原性ＡＧＥの後期アマドリ形成の可能
な阻害を測定した。最初の実験で、２４時間リベイテッドサンプル（ｒｉｂａｔ
ｅｄ ｓａｍｐｌｅ）を、簡単に、０．００５Ｍから０．５０５Ｍまでの範囲に
ある可変の最終濃度のリボースを含有する溶液で１００倍に希釈した（図１０Ａ
）。ＡＧＥ形成の速度および範囲は、リボース濃度を増加することによって減じ
られることが明らかに分かる。際立って、０．５Ｍリボースの最大の濃度まで、
速度論は、対数を表し、そして高いリボース濃度で非中断グリケーション（図６
Ａおよび７Ａ）に起こる誘導期間を示さない。
【００７４】 ２４時間中断サンプルを、冷所で専有的に透析して、遊離および可逆的に結合
したリボース並びにリボースとの２４時間インキュベーションの間に形成され得
る任意の阻害産物を放出する第二の実験（図１０Ｂ）も行った。これに続いて、
アリコート量を、可変の濃度の新たに作製したリボースで１００倍に希釈し、そ
して抗原性ＡＧＥ産物の形成が、上のとおり監視された。結果は、透析段階が除
外された図１０Ａの実験にほぼ一致した。両方の場合に、ＡＧＥ形成の速度およ
び範囲は、リボースの濃度を増加させることによって減じられ、そして速度論は
、誘導期なしと指数のようだ。
したリボース並びにリボースとの２４時間インキュベーションの間に形成され得
る任意の阻害産物を放出する第二の実験（図１０Ｂ）も行った。これに続いて、
アリコート量を、可変の濃度の新たに作製したリボースで１００倍に希釈し、そ
して抗原性ＡＧＥ産物の形成が、上のとおり監視された。結果は、透析段階が除
外された図１０Ａの実験にほぼ一致した。両方の場合に、ＡＧＥ形成の速度およ
び範囲は、リボースの濃度を増加させることによって減じられ、そして速度論は
、誘導期なしと指数のようだ。
【００７５】 グルコースまたは他の糖も、０．５Ｍリボースでの中断グリケーションによっ
て得られた反応性中間体からＡＧＥを形成することを阻害できるかどうかの問題
も調査された。１．０−２．０Ｍの濃度でのグルコースの効果が試験された（デ
ータは示されなかった）。グルコースは、明らかに、リボースと同じ阻害性でな
ｋった。２４時間リボース中断サンプルが、これらのグルコース溶液で１００倍
に希釈したとき、形成された抗原性ＡＧＥの量は、約３０％まで減じられたが、
見かけの速度定数でほとんど減少はなかった。さらに速度論は、指数のようであ
った。
て得られた反応性中間体からＡＧＥを形成することを阻害できるかどうかの問題
も調査された。１．０−２．０Ｍの濃度でのグルコースの効果が試験された（デ
ータは示されなかった）。グルコースは、明らかに、リボースと同じ阻害性でな
ｋった。２４時間リボース中断サンプルが、これらのグルコース溶液で１００倍
に希釈したとき、形成された抗原性ＡＧＥの量は、約３０％まで減じられたが、
見かけの速度定数でほとんど減少はなかった。さらに速度論は、指数のようであ
った。
【００７６】 ＡＧＥ形成の後期アマドリ速度論におけるｐＨの効果 中断グリケーション法は、反応性中間体からＡＧＥ形成の後期アマドリ速度論
のｐＨ依存を調べるのに使用した。これらの実験で、ＲＮアーゼＡを、最初にｐ
Ｈ７．５で２４時間、０．５Ｍリボースと反応させて、反応性中間体を発生した
。その後、ＡＧＥの中間体の崩壊の速度論をＥＬＩＳＡによって測定した。図１
１は、速度論が当初速度によって測定されたときに、５．０−９．５の極端に広
いｐＨ範囲が達成可能であったことを示す。際立ったベル型依存性が観察され、
それにより、抗原性ＡＧＥ形成の速度論が、ｐＨ８付近で最適ありながら、酸性
およびアルカリ性ｐＨ範囲の領域で減じられることが示された。
のｐＨ依存を調べるのに使用した。これらの実験で、ＲＮアーゼＡを、最初にｐ
Ｈ７．５で２４時間、０．５Ｍリボースと反応させて、反応性中間体を発生した
。その後、ＡＧＥの中間体の崩壊の速度論をＥＬＩＳＡによって測定した。図１
１は、速度論が当初速度によって測定されたときに、５．０−９．５の極端に広
いｐＨ範囲が達成可能であったことを示す。際立ったベル型依存性が観察され、
それにより、抗原性ＡＧＥ形成の速度論が、ｐＨ８付近で最適ありながら、酸性
およびアルカリ性ｐＨ範囲の領域で減じられることが示された。
【００７７】 最低速度の抗原性ＡＧＥ形成を示した上で染色されたｐＨ０．５サンプルで単
独の「ｐＨ飛躍」実験も行った。ｐＨ５．０緩衝液中で３７℃で１２日後、ｐＨ
を、迅速に７．５に調節し、そして抗原性ＡＧＥ形成を、ＥＬＩＳＡによって監
視した。実験誤差内で、サンプルは、ｐＨ７．５で直接的に研究された中断グリ
ケーションサンプルに一致する速度論（同じ最初の桁の速度定数）のＡＧＥ形成
を示した（図１２）。これらの実験で、相対的量の抗原性ＡＧＥが、同じＥＬＩ
ＳＡプレートで直接的に比較されなかったが、ｐH飛躍サンプルは、抗原性ＡＧ
Ｅの濃度をある程度減じたことを通して実質的に形成されたようであった。これ
らの結果は、中間体がＡＧＥ不含で製造され得ることを示し、ＡＧＥへの変換に
ついての後の研究のためにｐＨ５で保存された。
独の「ｐＨ飛躍」実験も行った。ｐＨ５．０緩衝液中で３７℃で１２日後、ｐＨ
を、迅速に７．５に調節し、そして抗原性ＡＧＥ形成を、ＥＬＩＳＡによって監
視した。実験誤差内で、サンプルは、ｐＨ７．５で直接的に研究された中断グリ
ケーションサンプルに一致する速度論（同じ最初の桁の速度定数）のＡＧＥ形成
を示した（図１２）。これらの実験で、相対的量の抗原性ＡＧＥが、同じＥＬＩ
ＳＡプレートで直接的に比較されなかったが、ｐH飛躍サンプルは、抗原性ＡＧ
Ｅの濃度をある程度減じたことを通して実質的に形成されたようであった。これ
らの結果は、中間体がＡＧＥ不含で製造され得ることを示し、ＡＧＥへの変換に
ついての後の研究のためにｐＨ５で保存された。
【００７８】 アミノグアニジンによる後期アマドリＡＧＥ形成の阻害 アミノグアニジンの有効性を、この中断グリケーション法によって、すなわち
、過剰で、可逆的に結合したリボースの除去の後に抗原性ＡＧＥの後期アマドリ
形成におけるその効果を試験することによって試験した。図２０Ａは、アミノグ
アニジンが、５０ｍＭより下でほとんど阻害を示さずに、これらの条件下でＲＮ
アーゼ中の抗原性ＡＧＥの形態を遮断する上で適度の効果を示すことを示す。お
よそ５０％阻害が、１００ｍＭで、またはそれより上でのみ達成される。さらに
、これらの実験で、タンパク質を、中断し、そして遊離および可逆的に結合した
リボースを除去した後のみに、アミノグアニジンに露出したことに注目すべきで
ある。ＢＳＡの中断グリケーションと比較し得る結果も得られた（図２０Ｂ）。
、過剰で、可逆的に結合したリボースの除去の後に抗原性ＡＧＥの後期アマドリ
形成におけるその効果を試験することによって試験した。図２０Ａは、アミノグ
アニジンが、５０ｍＭより下でほとんど阻害を示さずに、これらの条件下でＲＮ
アーゼ中の抗原性ＡＧＥの形態を遮断する上で適度の効果を示すことを示す。お
よそ５０％阻害が、１００ｍＭで、またはそれより上でのみ達成される。さらに
、これらの実験で、タンパク質を、中断し、そして遊離および可逆的に結合した
リボースを除去した後のみに、アミノグアニジンに露出したことに注目すべきで
ある。ＢＳＡの中断グリケーションと比較し得る結果も得られた（図２０Ｂ）。
【００７９】 中断グリケーションサンプルのアミノ酸分析 ０．５Ｍリボースとの２４時間接触（未透析）の後に、２４時間グリケーショ
ンサンプルの集約的透析の後、そして３７℃で後者のサンプルのインキュベーシ
ョンの５日後に、ＲＮアーゼでアミノ酸分析を行った。これらの測定は、リシン
または末端アミノ基上に存在するシッフ塩基を還元するナトリウムシアノボロヒ
ドリド還元の後に行った。アラニン（１２残基）まで正常化された３つのサンプ
ル全ては、同じ残基リシン定数（ＲＮアーゼ中の当初の１０個以外４．０±０．
５）を示した。これは、０．５リボースとの２４時間接触の後に、形成されたシ
ッフ塩基付加物のほとんどが、アマドリまたは連続産物に変換された。アルギニ
ンまたはヒスチジン残基で、修飾によって失われたものはない。
ンサンプルの集約的透析の後、そして３７℃で後者のサンプルのインキュベーシ
ョンの５日後に、ＲＮアーゼでアミノ酸分析を行った。これらの測定は、リシン
または末端アミノ基上に存在するシッフ塩基を還元するナトリウムシアノボロヒ
ドリド還元の後に行った。アラニン（１２残基）まで正常化された３つのサンプ
ル全ては、同じ残基リシン定数（ＲＮアーゼ中の当初の１０個以外４．０±０．
５）を示した。これは、０．５リボースとの２４時間接触の後に、形成されたシ
ッフ塩基付加物のほとんどが、アマドリまたは連続産物に変換された。アルギニ
ンまたはヒスチジン残基で、修飾によって失われたものはない。
【００８０】 検討 迅速に反応するリボースの使用および後期アマドリ段階のその可逆性阻害の知
見は、ＲＮアーゼでの異なる段階のタンパク質グリケーションの速度論の詳細な
分析および測定を可能にした。タンパク質「グリケーション」のほとんどの先の
速度論的研究は、実際に、シッフ塩基形成および連続アマドリ転位の「初期」段
階に限定された。合成フルクトシルアミン、すなわち、グルコースの小型モデル
のアマドリ化合物で出発するいくつかの速度論的研究が行われた（Ｓｍｉｔｈお
よびＴｈｏｒｎａｌｌｅｙ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０：７２９−７
３９、１９９２年、そしてここに引用された文献）が、少数の例外を伴いこのよ
うな研究は、これまで、タンパク質とは可能でなかった。１つの注目すべき例外
は、リボースと部分的にグリケート化したＢＳＡが、リボース除去の後に、迅速
にペントシジンを生じ得るというＭｏｎｎｉｅｒ（Ｏｄｅｔｔｉら、１９９２年
、上記）による例示である。リボースの大きな反応性は、ＡＧＥ形成の時間経過
を定量的に定義する上で際立った利点をも立証した。グルコースおよびリボース
が、ペントシジン（ＣｒａｎｄｈｅｅおよびＭｏｎｎｉｅｒ、上記、１９９１年
；Ｄｙｅｒら、上記、１９９１年）のような類似のＡＧＥ産物を生じる能力があ
り、そしていくつかの１３Ｃ ＮＭＲモデル化合物研究が、ＡＤＰ−リボースを
用いて行われた（Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｌａｕｒｅａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ３２：１５２８−１５３４）ことの両方が注目された。本研究は、リボ
ースの抗原性ＡＧＥ産物が、グルコース−修飾タンパク質に対して影響された抗
−ＡＧＥ抗体と十分に架橋反応することを示し、それにより、リボースおよびグ
ルコースが、類似の抗原性ＡＧＥを生じることが示される。これらの２つの糖の
間に観察あれる一次的速度論差異は、おそらく、その機構でよりむしろ後期アマ
ドリＡＧＥ形成に至る段階の速度定数での相対的差異による。
見は、ＲＮアーゼでの異なる段階のタンパク質グリケーションの速度論の詳細な
分析および測定を可能にした。タンパク質「グリケーション」のほとんどの先の
速度論的研究は、実際に、シッフ塩基形成および連続アマドリ転位の「初期」段
階に限定された。合成フルクトシルアミン、すなわち、グルコースの小型モデル
のアマドリ化合物で出発するいくつかの速度論的研究が行われた（Ｓｍｉｔｈお
よびＴｈｏｒｎａｌｌｅｙ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０：７２９−７
３９、１９９２年、そしてここに引用された文献）が、少数の例外を伴いこのよ
うな研究は、これまで、タンパク質とは可能でなかった。１つの注目すべき例外
は、リボースと部分的にグリケート化したＢＳＡが、リボース除去の後に、迅速
にペントシジンを生じ得るというＭｏｎｎｉｅｒ（Ｏｄｅｔｔｉら、１９９２年
、上記）による例示である。リボースの大きな反応性は、ＡＧＥ形成の時間経過
を定量的に定義する上で際立った利点をも立証した。グルコースおよびリボース
が、ペントシジン（ＣｒａｎｄｈｅｅおよびＭｏｎｎｉｅｒ、上記、１９９１年
；Ｄｙｅｒら、上記、１９９１年）のような類似のＡＧＥ産物を生じる能力があ
り、そしていくつかの１３Ｃ ＮＭＲモデル化合物研究が、ＡＤＰ−リボースを
用いて行われた（Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｌａｕｒｅａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ３２：１５２８−１５３４）ことの両方が注目された。本研究は、リボ
ースの抗原性ＡＧＥ産物が、グルコース−修飾タンパク質に対して影響された抗
−ＡＧＥ抗体と十分に架橋反応することを示し、それにより、リボースおよびグ
ルコースが、類似の抗原性ＡＧＥを生じることが示される。これらの２つの糖の
間に観察あれる一次的速度論差異は、おそらく、その機構でよりむしろ後期アマ
ドリＡＧＥ形成に至る段階の速度定数での相対的差異による。
【００８１】 現れた結果は、初期の研究によって予想されなかった高い濃度のリボース（図
６）による全体的ＡＧＥ形成の際立った、そして逆説的な阻害を示す。この阻害
は、それが、最初に修飾されたタンパク質の透析（図７Ａ）によって、または簡
単な１００倍希釈（図１１に使用されるとおり）により除去されるという観点で
急に可逆性である。図１０の実験は、２４時間修飾タンパク質の透析、続いて異
なる濃度の新たなリボースの添加は、同じ阻害を誘導するので、当初のグリケー
ションの間の透析し得る阻害性中間体の蓄積によらないことを示す。図１０Ａ、
Ｂのデータは、反応性アマドリ産物を含有するタンパク質中間体との可逆性で、
そして迅速なリボースの相互作用により、阻害が起こることを示す。阻害は、図
０の実験で測定された推定アマドリ中間体の形成の迅速な速度により、アマドリ
産物の形成の初期段階に使用されそうにない。アマドリ産物としての反応性中間
体の同定は、２４時間中断時点での透析の前後に行われるアミノ酸分析によって
十分に支持される。未変化残基リシン定数は、放出可能なシッフ塩基が、２４時
間までに（おそらくアマドリ転位によって）すでに不可逆的に変換されたことを
示す。
６）による全体的ＡＧＥ形成の際立った、そして逆説的な阻害を示す。この阻害
は、それが、最初に修飾されたタンパク質の透析（図７Ａ）によって、または簡
単な１００倍希釈（図１１に使用されるとおり）により除去されるという観点で
急に可逆性である。図１０の実験は、２４時間修飾タンパク質の透析、続いて異
なる濃度の新たなリボースの添加は、同じ阻害を誘導するので、当初のグリケー
ションの間の透析し得る阻害性中間体の蓄積によらないことを示す。図１０Ａ、
Ｂのデータは、反応性アマドリ産物を含有するタンパク質中間体との可逆性で、
そして迅速なリボースの相互作用により、阻害が起こることを示す。阻害は、図
０の実験で測定された推定アマドリ中間体の形成の迅速な速度により、アマドリ
産物の形成の初期段階に使用されそうにない。アマドリ産物としての反応性中間
体の同定は、２４時間中断時点での透析の前後に行われるアミノ酸分析によって
十分に支持される。未変化残基リシン定数は、放出可能なシッフ塩基が、２４時
間までに（おそらくアマドリ転位によって）すでに不可逆的に変換されたことを
示す。
【００８２】 「初期」でなく「後期」のグリケーション段階の二次リボース抑制は、ほとん
どＡＧＥを含有しない十分に競合な反応性アマドリ中間体の蓄積を明らかに増強
する。それが、遊離またはシッフ塩基結合糖およびそれらの付随の反応および合
併症の不在下で研究を行うことを可能にするので、中断手段によるその単離は、
速度論および構造研究のために重要である。例えば、抗原性ＡＧＥおよびペント
シジンＡＧＥ産物への後期アマドリ変換速度が測定され（図７Ａ、白抜き記号、
および図８Ｂ）、そして非中断条件下で全体的速度論で反映されたのよりいっそ
う早い（ｔ１／２〜１０時間）ことが示された（図６Ａおよび図８Ａ）。測定さ
れたペントシジンの迅速な形成は、Ｏｄｅｔｔｉら（１９９２年、上記）による
ＢＳＡでの初期中断リボース実験と一致するようである。ＡＤＰ−リボースのよ
うなリボースおよび誘導体は、正常な代謝産物であるので、それらの濃度が、反
応性の低いグルコースのものより十分に低い場合でさえ、ここに見られる非常に
高い速度のＡＧＥ形成は、種々の細胞の区分中の強力なグリケーションの起源（
Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｌａｕｒｅａｎら、上記、１９９３年）としていっそう深
刻に考慮されるべきであることを示唆する。
どＡＧＥを含有しない十分に競合な反応性アマドリ中間体の蓄積を明らかに増強
する。それが、遊離またはシッフ塩基結合糖およびそれらの付随の反応および合
併症の不在下で研究を行うことを可能にするので、中断手段によるその単離は、
速度論および構造研究のために重要である。例えば、抗原性ＡＧＥおよびペント
シジンＡＧＥ産物への後期アマドリ変換速度が測定され（図７Ａ、白抜き記号、
および図８Ｂ）、そして非中断条件下で全体的速度論で反映されたのよりいっそ
う早い（ｔ１／２〜１０時間）ことが示された（図６Ａおよび図８Ａ）。測定さ
れたペントシジンの迅速な形成は、Ｏｄｅｔｔｉら（１９９２年、上記）による
ＢＳＡでの初期中断リボース実験と一致するようである。ＡＤＰ−リボースのよ
うなリボースおよび誘導体は、正常な代謝産物であるので、それらの濃度が、反
応性の低いグルコースのものより十分に低い場合でさえ、ここに見られる非常に
高い速度のＡＧＥ形成は、種々の細胞の区分中の強力なグリケーションの起源（
Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｌａｕｒｅａｎら、上記、１９９３年）としていっそう深
刻に考慮されるべきであることを示唆する。
【００８３】 中間体の単離の別の新たな使用は、この複雑な反応のｐＨ依存を研究中である
。後期アマドリＡＧＥ形成について見られる通常でないベル型ｐＨプロファイル
（図１１）は、全体的反応の温和なｐＨ依存との対比を加ているところである。
後者の速度論は、シッフ塩基およびアマドリ産物形成を含めた反応にいける全段
階でのｐＨの複合の効果に反映し、そしてそれは、特徴的なｐＨ依存性を示し得
る。この複雑さは、ヘモグロビングリケーションの研究（Ｌｏｗｅｒｙら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１１６１１−１１６１８、１９８５年）によって
特によく例示される。立証しないが、ベル型ｐＨプロファイルは、２つのイオン
化基の関与を示唆する。正しければ、データは、優勢な抗原性ＡＧＥの形成で、
隣接するリシンを形成するような第二のアミノ基の関与を暗示する。観察された
ｐＨプロファイルおよびｐＨ飛躍の観察は、反応性中間体を単離および維持する
有用な経路が、２４時間中断後にほぼ５．０までのｐＨを迅速に低下させること
によることを示唆する。
。後期アマドリＡＧＥ形成について見られる通常でないベル型ｐＨプロファイル
（図１１）は、全体的反応の温和なｐＨ依存との対比を加ているところである。
後者の速度論は、シッフ塩基およびアマドリ産物形成を含めた反応にいける全段
階でのｐＨの複合の効果に反映し、そしてそれは、特徴的なｐＨ依存性を示し得
る。この複雑さは、ヘモグロビングリケーションの研究（Ｌｏｗｅｒｙら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１１６１１−１１６１８、１９８５年）によって
特によく例示される。立証しないが、ベル型ｐＨプロファイルは、２つのイオン
化基の関与を示唆する。正しければ、データは、優勢な抗原性ＡＧＥの形成で、
隣接するリシンを形成するような第二のアミノ基の関与を暗示する。観察された
ｐＨプロファイルおよびｐＨ飛躍の観察は、反応性中間体を単離および維持する
有用な経路が、２４時間中断後にほぼ５．０までのｐＨを迅速に低下させること
によることを示唆する。
【００８４】 速度論研究は、アマドリ中間体と組合せて、Ｃｅｒａｍｉおよび共同研究者に
よって提案されたＡＧＥ阻害剤（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら、上記、１９８６年）であ
るアミノグアニジン（グアニルヒドラジン）の作用の機構への新たな洞察を提供
する。この提案された薬理学上の剤は、現在、糖尿病を治療する上で可能な治療
剤についてＩＩＩ相治験にある（Ｖｌａｓｓａｒａら、上記、１９９４年）。し
かし、それが多機能性であるので、ＡＧＥ阻害のその機構は、全く複雑であるよ
うである。求核性ヒドラジンとして、それは、開放鎖グルコースおよびリボース
のアルデヒドアルボニル、並びにアマドリ化合物のケトカルボニルを含めた活性
なカルボニルに可逆的に添加できる（Ｋｈａｔａｍｉら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．４
３：１７２５−１７３１、１９８８年；Ｈｉｒｓｃｈら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒ
ｅｓ．２６７：１７−２５、１９９５年）。それは、グリオキサルおよびグルコ
ソンのような非常に反応性なるジアルボニルグリケーション中間体を掃除できる
グアニジニウム化合物でもある（ＣｈｅｎおよびＣｅｒａｍｉ、Ｊ．Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄ．Ｃｈｅｍ．１２：７３１−７４２、１９９３年；Ｈｉｒｓｃｈら、Ｃａ
ｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．２３２：１２５−１３０、１９９２年；ＯｕおよびＷｏ
ｌｆｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：１１３９−１１４４、１
９９３年）。中断グリケーション法は、ＡＧＥ形成の唯一の後期アマドリ段階で
のアミノグアニジン有効性の試験を可能にする。アミノグアニジンと混合できる
遊離糖またはジカルボニル反応性断片の不在下での研究（ＷｏｌｆｆおよびＤｅ
ａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４５：２４３−２５０、１９８７年；Ｗｅｌｌｓ
−Ｋｎｅｃｈｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：３７０２−３７０９、１
９９５年）を等しく重要にさせた。図２０の結果は、アミノグアニジンが、せい
ぜい、後期アマドリＡＧＥ形成反応における控えめな効果のみを示すことを例示
し、それにより１００−２５０ｍＭより上の濃度で５０％阻害が達成される。し
たがって、アミノグアニジンの有効性は、グリケーション（シッフ塩基形成）の
初期段階を阻害することから、またはグリケーション中に生じた非常に反応性の
ジカルボキシを掃除することからのいずれかから優勢に上昇する。元の請求項に
対照的に、アマドリ中間体を複合体化することによってＡＧＥ形成を阻害しない
ようである。
よって提案されたＡＧＥ阻害剤（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら、上記、１９８６年）であ
るアミノグアニジン（グアニルヒドラジン）の作用の機構への新たな洞察を提供
する。この提案された薬理学上の剤は、現在、糖尿病を治療する上で可能な治療
剤についてＩＩＩ相治験にある（Ｖｌａｓｓａｒａら、上記、１９９４年）。し
かし、それが多機能性であるので、ＡＧＥ阻害のその機構は、全く複雑であるよ
うである。求核性ヒドラジンとして、それは、開放鎖グルコースおよびリボース
のアルデヒドアルボニル、並びにアマドリ化合物のケトカルボニルを含めた活性
なカルボニルに可逆的に添加できる（Ｋｈａｔａｍｉら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．４
３：１７２５−１７３１、１９８８年；Ｈｉｒｓｃｈら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒ
ｅｓ．２６７：１７−２５、１９９５年）。それは、グリオキサルおよびグルコ
ソンのような非常に反応性なるジアルボニルグリケーション中間体を掃除できる
グアニジニウム化合物でもある（ＣｈｅｎおよびＣｅｒａｍｉ、Ｊ．Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄ．Ｃｈｅｍ．１２：７３１−７４２、１９９３年；Ｈｉｒｓｃｈら、Ｃａ
ｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．２３２：１２５−１３０、１９９２年；ＯｕおよびＷｏ
ｌｆｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：１１３９−１１４４、１
９９３年）。中断グリケーション法は、ＡＧＥ形成の唯一の後期アマドリ段階で
のアミノグアニジン有効性の試験を可能にする。アミノグアニジンと混合できる
遊離糖またはジカルボニル反応性断片の不在下での研究（ＷｏｌｆｆおよびＤｅ
ａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４５：２４３−２５０、１９８７年；Ｗｅｌｌｓ
−Ｋｎｅｃｈｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：３７０２−３７０９、１
９９５年）を等しく重要にさせた。図２０の結果は、アミノグアニジンが、せい
ぜい、後期アマドリＡＧＥ形成反応における控えめな効果のみを示すことを例示
し、それにより１００−２５０ｍＭより上の濃度で５０％阻害が達成される。し
たがって、アミノグアニジンの有効性は、グリケーション（シッフ塩基形成）の
初期段階を阻害することから、またはグリケーション中に生じた非常に反応性の
ジカルボキシを掃除することからのいずれかから優勢に上昇する。元の請求項に
対照的に、アマドリ中間体を複合体化することによってＡＧＥ形成を阻害しない
ようである。
【００８５】 中断グリケーションの使用は、速度論研究について限定されない。中断グリケ
ーションは、グリケート化タンパク質の構造研究を簡便にでき、ＲＮアーゼのア
マドリ付加物を検出するのに使用された１３Ｃ ＮＭＲのような技術を用いた未
知ＡＧＥを同定できる（Ｎｅｇｌｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１
４２７９−１４２８３、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：５４０
６−５４１０、１９８５年）。構造および速度論的アプローチ法の組合せ使用は
、特別の目的のものであるべきである。例えば、ポリクローナル抗体と反応する
優勢な抗原性ＡＧＥの同定が、不確かなままであるが、最近提案された（カルボ
キシメチル）リシンのような候補ＡＧＥ（Ｒｅｄｄｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ３４：１０８７２−１０８７８、１９９５年；参照、Ｍａｋｉｔａら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５１３３−５１３８、１９９２年）は、我々が
観察した反応性中間体から形成の同じ速度論を示すべきである。中断速度論的ア
プローチ法の利用性も、このＡＧＥの形成までのアマドリ経路の重要さを決定す
る助けをする。同様に、１３Ｃ ＮＭＲのような技術による中断グリケーション
反応を監視することは、類似の速度論的外観を示すものであるときに他の候補で
ある抗原性ＡＧＥの共鳴を同定すべきである。表Ｉは、Ｃ−２富化リボースとの
反応によって製造されたＲＮアーゼのアマドリ中間体の１３Ｃ ＮＭＲピークを
列記する。２０５ｐｐｍ付近のダウンフィールドのピークは、おそらくアマドリ
産物のカルボニルによる。全ての場合に、中断グリケーションを通した過剰の遊
離およびシッフ塩基糖を除去する能力は、単離、同定および構造的特徴付けを非
常に簡便にする。
ーションは、グリケート化タンパク質の構造研究を簡便にでき、ＲＮアーゼのア
マドリ付加物を検出するのに使用された１３Ｃ ＮＭＲのような技術を用いた未
知ＡＧＥを同定できる（Ｎｅｇｌｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１
４２７９−１４２８３、１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：５４０
６−５４１０、１９８５年）。構造および速度論的アプローチ法の組合せ使用は
、特別の目的のものであるべきである。例えば、ポリクローナル抗体と反応する
優勢な抗原性ＡＧＥの同定が、不確かなままであるが、最近提案された（カルボ
キシメチル）リシンのような候補ＡＧＥ（Ｒｅｄｄｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ３４：１０８７２−１０８７８、１９９５年；参照、Ｍａｋｉｔａら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５１３３−５１３８、１９９２年）は、我々が
観察した反応性中間体から形成の同じ速度論を示すべきである。中断速度論的ア
プローチ法の利用性も、このＡＧＥの形成までのアマドリ経路の重要さを決定す
る助けをする。同様に、１３Ｃ ＮＭＲのような技術による中断グリケーション
反応を監視することは、類似の速度論的外観を示すものであるときに他の候補で
ある抗原性ＡＧＥの共鳴を同定すべきである。表Ｉは、Ｃ−２富化リボースとの
反応によって製造されたＲＮアーゼのアマドリ中間体の１３Ｃ ＮＭＲピークを
列記する。２０５ｐｐｍ付近のダウンフィールドのピークは、おそらくアマドリ
産物のカルボニルによる。全ての場合に、中断グリケーションを通した過剰の遊
離およびシッフ塩基糖を除去する能力は、単離、同定および構造的特徴付けを非
常に簡便にする。
【００８６】 表Ｉは、それらの不変の、または時間で減少する強度により後期アマドリ中間
体に付与されるピークを列記する。ピーク位置は、ＴＭＳからｐｐｍダウンフィ
ールドで列記される。
体に付与されるピークを列記する。ピーク位置は、ＴＭＳからｐｐｍダウンフィ
ールドで列記される。
【００８７】 表Ｉ ９９％［２−Ｃ１３］リボースとの２４時間反応によって作製されたリボヌクレ
アーゼアマドリ中間体の１２５ＭＨｚＣ−１３ＮＭＲ共鳴 ２１６．５ｐｐｍ １０８．５ｐｐｍ ２１１．７ １０５．９ ２０８ １０３．９ １０３ １７２ ９５．８ １６５ １６３．９ ７３．６５ １６２．１ ７０．２ ６９．７ リボヌクレアーゼＡを、２４時間、Ｃ−２で９９％富化した０．５Ｍリボース
と反応させ、それにより、過剰およびシッフ塩基結合リボースが、冷所での集約
的透析によって除去された。その後、２時間ＮＭＲスキャンを行う直前に、サン
プルを、３７℃まで加温し戻した。その後、同一条件下での生来の優勢なリボー
スと反応したＲＮアーゼから得られる信号を、ＮＭＲスペクトルから取除いた。
したがって、示された全てのピークは、Ｃ−２位置で生じた富化Ｃ−１３による
。ある種のピークは、中間体の分解産物から生じ、そしてこれらは、時間につい
てのピーク強度における増大によって同定され得る。図３１は、得られたＮＭＲ
スペクトルを示す。
アーゼアマドリ中間体の１２５ＭＨｚＣ−１３ＮＭＲ共鳴 ２１６．５ｐｐｍ １０８．５ｐｐｍ ２１１．７ １０５．９ ２０８ １０３．９ １０３ １７２ ９５．８ １６５ １６３．９ ７３．６５ １６２．１ ７０．２ ６９．７ リボヌクレアーゼＡを、２４時間、Ｃ−２で９９％富化した０．５Ｍリボース
と反応させ、それにより、過剰およびシッフ塩基結合リボースが、冷所での集約
的透析によって除去された。その後、２時間ＮＭＲスキャンを行う直前に、サン
プルを、３７℃まで加温し戻した。その後、同一条件下での生来の優勢なリボー
スと反応したＲＮアーゼから得られる信号を、ＮＭＲスペクトルから取除いた。
したがって、示された全てのピークは、Ｃ−２位置で生じた富化Ｃ−１３による
。ある種のピークは、中間体の分解産物から生じ、そしてこれらは、時間につい
てのピーク強度における増大によって同定され得る。図３１は、得られたＮＭＲ
スペクトルを示す。
【００８８】 実施例３ ビタミンＢ１およびＢ６の誘導体およびアミノグアニジンによる抗原性高次的
グリケーション最終産物（ＡＧＥ）の形成のインビトロでの阻害。後期アマドリ
速度論の阻害は、全体的グリケーションのものと異なる ＡＧＥ形成の後期アマドリ速度論に続く中断グリケーション法は、グリケーシ
ョン反応の「後期」段階の高速定量的研究に対処する。重要に、この方法は、模
式図Ｉで例示されるとおり遊離糖またはシッフ塩基（ナミキ経路）のグリコシド
性産物から生じるＡＧＥ形成の経路を含まない阻害研究に対処する。したがって
、中断グリケーション法は、抗原性ＡＧＥ形成に至るグリケーションの「後期」
段階の阻害剤の迅速で特徴的な同定および特徴付けに対処する。
グリケーション最終産物（ＡＧＥ）の形成のインビトロでの阻害。後期アマドリ
速度論の阻害は、全体的グリケーションのものと異なる ＡＧＥ形成の後期アマドリ速度論に続く中断グリケーション法は、グリケーシ
ョン反応の「後期」段階の高速定量的研究に対処する。重要に、この方法は、模
式図Ｉで例示されるとおり遊離糖またはシッフ塩基（ナミキ経路）のグリコシド
性産物から生じるＡＧＥ形成の経路を含まない阻害研究に対処する。したがって
、中断グリケーション法は、抗原性ＡＧＥ形成に至るグリケーションの「後期」
段階の阻害剤の迅速で特徴的な同定および特徴付けに対処する。
【００８９】 試験したビタミンＢ１およびＢ６誘導体の中で、ピリドキサミンおよびピロリ
ン酸チアミンは、ＡＧＥ形成の後期アマドリ経路の特徴的阻害剤である。重要に
、高濃度の糖の存在下でのタンパク質の全体的グリケーションの阻害の有効性が
、遊離糖が除去されるＡＧＥ形成の後期アマドリ段階を阻害する能力を推定しな
いことが分かった。したがって、ピリドキサミン、ピロリン酸チアミンおよびア
ミノグアニジンが、グルコースによるタンパク質の全体的グリケーションにおけ
るＡＧＥ形成の強力な阻害剤である一方で、アミノグアニジンは、後期アマドリ
ＡＧＥ形成の有効な阻害剤でない点で、他の２つから異なる。アミノグアニジン
は、非中断条件下でリボースによるＡＧＥ形成の当初の速度を明らかに減じるが
、生じた抗原性ＡＧＥの最終濃度に何ら効果を示さない。異なるタンパク質（Ｒ
Ｎアーゼ、ＢＳＡおよびヘモグロビン）の実験は、ＡＧＥ形成および阻害の速度
における個々の多様性があることを通してさえ、阻害結果が、使用されたタンパ
ク質として一般的に非特異的であることを確認した。
ン酸チアミンは、ＡＧＥ形成の後期アマドリ経路の特徴的阻害剤である。重要に
、高濃度の糖の存在下でのタンパク質の全体的グリケーションの阻害の有効性が
、遊離糖が除去されるＡＧＥ形成の後期アマドリ段階を阻害する能力を推定しな
いことが分かった。したがって、ピリドキサミン、ピロリン酸チアミンおよびア
ミノグアニジンが、グルコースによるタンパク質の全体的グリケーションにおけ
るＡＧＥ形成の強力な阻害剤である一方で、アミノグアニジンは、後期アマドリ
ＡＧＥ形成の有効な阻害剤でない点で、他の２つから異なる。アミノグアニジン
は、非中断条件下でリボースによるＡＧＥ形成の当初の速度を明らかに減じるが
、生じた抗原性ＡＧＥの最終濃度に何ら効果を示さない。異なるタンパク質（Ｒ
Ｎアーゼ、ＢＳＡおよびヘモグロビン）の実験は、ＡＧＥ形成および阻害の速度
における個々の多様性があることを通してさえ、阻害結果が、使用されたタンパ
ク質として一般的に非特異的であることを確認した。
【００９０】 化合物および材料 上の実施例１でのとおり。
【００９１】 ＡＧＥに対するポリクローナル抗体の作製 上の実施例１でのとおり。
【００９２】 ＡＧＥ産物のＥＬＩＳＡ検出 上の実施例１でのとおり。
【００９３】 非中断リボースグリケーションアッセイ ウシ血清アルブミン、リボヌクレアーゼＡ、およびヒトヘモグロビンを、０．
０２％ナトリウムアジ化合物を含有する、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液中で、３７℃でリボースとインキュベートした。タンパク質（１０ｍｇ
／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌ）、０．０５Ｍリボース、および期待される阻害剤（
０．５、３、１５および５０ｍＭで）を、同時にインキュベーション混合液に導
入した。溶液を栓付き試験管中で暗所に保持し、アリコート量を取り、そして反
応の終結でＥＬＩＳＡによって分析されるまで直ぐに凍結した。インキュベーシ
ョンは、３週（Ｈｂ）または６週（ＲＮアーゼ、ＢＳＡ）間であった。実験の期
間中一定のｐＨについてグリケーション反応を監視した。
０２％ナトリウムアジ化合物を含有する、ｐＨ７．５の０．４Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液中で、３７℃でリボースとインキュベートした。タンパク質（１０ｍｇ
／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌ）、０．０５Ｍリボース、および期待される阻害剤（
０．５、３、１５および５０ｍＭで）を、同時にインキュベーション混合液に導
入した。溶液を栓付き試験管中で暗所に保持し、アリコート量を取り、そして反
応の終結でＥＬＩＳＡによって分析されるまで直ぐに凍結した。インキュベーシ
ョンは、３週（Ｈｂ）または６週（ＲＮアーゼ、ＢＳＡ）間であった。実験の期
間中一定のｐＨについてグリケーション反応を監視した。
【００９４】 中断（後期アマドリ）リボースグリケーションアッセイ ２４時間、阻害剤の不在下で０．２％ナトリウムアジ化合物を含有する、ｐＨ
７．５で０．４Ｍリン酸緩衝液中で、３７℃で、タンパク質（１０ｍｇ／ｍｌ）
を０．５Ｍリボースと共にインキュベートすることによって、グリケーションを
、最初に行った。その後、４℃での頻繁な冷緩衝液の交換に対して集約的透析に
より過剰および可逆的に結合した（シッフ塩基）糖を除去するためにグリケーシ
ョンを中断した。その後、最大量のアマドリ産物を含みＡＧＥ（タンパク質によ
って）をほどんど含まないグリケート化中間体サンプルを、リボースの再添加な
しに３７℃まで迅速に加温した。これは、種々の濃度（典型的には３、１５およ
び５０ｎＭ）の期待される阻害剤の不在または存在下でのＡＧＥ産物へのアマド
リ中間体の変換を開始させた。アリコート量を取り、そして後の分析のために種
々の間隔で凍結した。溶液を栓付き試験管中で保持し、そして種々の分析を後に
行うために直ぐに凍結した。
７．５で０．４Ｍリン酸緩衝液中で、３７℃で、タンパク質（１０ｍｇ／ｍｌ）
を０．５Ｍリボースと共にインキュベートすることによって、グリケーションを
、最初に行った。その後、４℃での頻繁な冷緩衝液の交換に対して集約的透析に
より過剰および可逆的に結合した（シッフ塩基）糖を除去するためにグリケーシ
ョンを中断した。その後、最大量のアマドリ産物を含みＡＧＥ（タンパク質によ
って）をほどんど含まないグリケート化中間体サンプルを、リボースの再添加な
しに３７℃まで迅速に加温した。これは、種々の濃度（典型的には３、１５およ
び５０ｎＭ）の期待される阻害剤の不在または存在下でのＡＧＥ産物へのアマド
リ中間体の変換を開始させた。アリコート量を取り、そして後の分析のために種
々の間隔で凍結した。溶液を栓付き試験管中で保持し、そして種々の分析を後に
行うために直ぐに凍結した。
【００９５】 速度論データの数値分析 速度論データ（時間進行曲線）は、使用者が定義した関数およびパラメータの
対照を反復させることを許すサイエンティスト（ＳＣＩＥＮＴＩＳＴ）２．０（
ＭｉｃｒｏＭａｔｈ，Ｉｎｃ．）またはオリジン（ＯＲＩＧＩＮ）（Ｍｉｃｒｏ
ｃａｌ，Ｉｎｃ．）ソフトウエアのいずれかを利用する非線形自乗法を用いた一
次または二次指数関数に日常的に適合された。適合した関数のパラメータの標準
偏差（当初のおよび最終の序数値および速度定数）を、適合の正確さの測定のと
きに戻した。二次指数の速度論適合についての外見の半減期を、マスキャドソフ
トウエア（Ｍａｔｈｃａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｍａｔｈｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．
）の「解決」関数で測定した。
対照を反復させることを許すサイエンティスト（ＳＣＩＥＮＴＩＳＴ）２．０（
ＭｉｃｒｏＭａｔｈ，Ｉｎｃ．）またはオリジン（ＯＲＩＧＩＮ）（Ｍｉｃｒｏ
ｃａｌ，Ｉｎｃ．）ソフトウエアのいずれかを利用する非線形自乗法を用いた一
次または二次指数関数に日常的に適合された。適合した関数のパラメータの標準
偏差（当初のおよび最終の序数値および速度定数）を、適合の正確さの測定のと
きに戻した。二次指数の速度論適合についての外見の半減期を、マスキャドソフ
トウエア（Ｍａｔｈｃａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｍａｔｈｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．
）の「解決」関数で測定した。
【００９６】 結果 リボースからのＡＧＥ形成の全体的速度論のビタミンＢ６誘導体による阻害 抗原性ＡＧＥ形成の速度論でのビタミンＢ１およびＢ６の阻害効果を、ＡＧＥ
に特異的なポリクローナル抗体によって評価した。ＡＧＥ形成の速度がほぼ最大
である場合のリボースの濃度である０．０５Ｍリボースの継続的存在下でウシリ
ボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼ）のグリケーションにおける阻害研究を行った。
図１３（対照曲線、黒塗り長方形）は、０．０５Ｍリボースとインキュベートし
たときのＲＮアーゼにおける抗原性ＡＧＥの形成が、比較的迅速であり、そして
これらの条件下でおよそ６日の半減期を伴うことを示す。ピリドキサル−５’−
リン酸塩（図１３）およびピリドキサル（図１３Ｃ）は、５０ｍＭおよび１５ｍ
Ｍの濃度でＲＮアーゼにおけるＡＧＥ形成の速度を明らかに阻害した。驚くべき
ことに、ビタミンＢ６のアルコール形態であるピリドキシンも、ＲＮアーゼにお
けるＡＧＥ形成を中程度に阻害した（図１３Ｄ）。試験されたＢ６誘導体の内、
５０ｍＭでのピリドキサミンは、監視された６週の期間をかけてＲＮアーゼで形
成されたＡＧＥの「最終」濃度の最高の阻害剤であった（図１３Ａ）。
に特異的なポリクローナル抗体によって評価した。ＡＧＥ形成の速度がほぼ最大
である場合のリボースの濃度である０．０５Ｍリボースの継続的存在下でウシリ
ボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼ）のグリケーションにおける阻害研究を行った。
図１３（対照曲線、黒塗り長方形）は、０．０５Ｍリボースとインキュベートし
たときのＲＮアーゼにおける抗原性ＡＧＥの形成が、比較的迅速であり、そして
これらの条件下でおよそ６日の半減期を伴うことを示す。ピリドキサル−５’−
リン酸塩（図１３）およびピリドキサル（図１３Ｃ）は、５０ｍＭおよび１５ｍ
Ｍの濃度でＲＮアーゼにおけるＡＧＥ形成の速度を明らかに阻害した。驚くべき
ことに、ビタミンＢ６のアルコール形態であるピリドキシンも、ＲＮアーゼにお
けるＡＧＥ形成を中程度に阻害した（図１３Ｄ）。試験されたＢ６誘導体の内、
５０ｍＭでのピリドキサミンは、監視された６週の期間をかけてＲＮアーゼで形
成されたＡＧＥの「最終」濃度の最高の阻害剤であった（図１３Ａ）。
【００９７】 リボースからのＡＧＥ形成の全体的速度論のビタミンＢ１誘導体の阻害 Ｂ１ビタマーの全ては、高濃度でのＲＮアーゼにおける抗原性ＡＧＥ形成を阻
害したが、阻害は、Ｂ１誘導体についてよりいっそう複雑に思われた（図１４Ａ
−Ｃ）。阻害剤としてピロリン酸チアミン（図１４Ａ）の場合に、プラトーで生
じたＡＧＥ形成の速度およびＡＧＥの最終濃度は、減じられると思われた。阻害
剤としてリン酸チアミン（図１４Ｂ）およびチアミン（図１４Ｃ）の場合に、Ａ
ＧＥ形成の速度における効果はほとんどないと思われたが、ＡＧＥの最終濃度に
おける実質的減少は、最高濃度の阻害剤の存在下で形成した。一般に、ピロリン
酸チアミンは、試験された最低濃度での他の２つの化合物より大きな阻害を示し
た。
害したが、阻害は、Ｂ１誘導体についてよりいっそう複雑に思われた（図１４Ａ
−Ｃ）。阻害剤としてピロリン酸チアミン（図１４Ａ）の場合に、プラトーで生
じたＡＧＥ形成の速度およびＡＧＥの最終濃度は、減じられると思われた。阻害
剤としてリン酸チアミン（図１４Ｂ）およびチアミン（図１４Ｃ）の場合に、Ａ
ＧＥ形成の速度における効果はほとんどないと思われたが、ＡＧＥの最終濃度に
おける実質的減少は、最高濃度の阻害剤の存在下で形成した。一般に、ピロリン
酸チアミンは、試験された最低濃度での他の２つの化合物より大きな阻害を示し
た。
【００９８】 リボースからのＡＧＥ形成の全体的速度論のアミノグアニジンによる阻害 アミノグアニジンによるＡＧＥ形成の阻害（図１４Ｄ）は、Ｂ１およびＢ１実
験に見られる明らかに異なる形態であった。アミノグアニジンの濃度が増大する
ことは、ＲＮアーゼにおけるＡＧＥ形成の速度を減少したが、形成されたＡＧＥ
の最終濃度を減じなかった。６週後に形成された最終濃度のＡＧＥは、全ての試
験濃度のアミノグアニジンについての対照のものとほぼ一致した。
験に見られる明らかに異なる形態であった。アミノグアニジンの濃度が増大する
ことは、ＲＮアーゼにおけるＡＧＥ形成の速度を減少したが、形成されたＡＧＥ
の最終濃度を減じなかった。６週後に形成された最終濃度のＡＧＥは、全ての試
験濃度のアミノグアニジンについての対照のものとほぼ一致した。
【００９９】 リボースからの血清アルブミンおよびヘモグロビン中のＡＧＥ形成の全体的速
度論の阻害 比較研究を、ＢＳＡおよびヒトメトヘモグロビン（Ｈｂ）で行って、観察され
る阻害が、タンパク質特異的であるかどうかを決定した。ビタミンＢ６（図１５
Ａ−Ｄ）およびビタミンＢ１（図１６Ａ−Ｃ）の異なる誘導体は、ＢＳＡとイン
キュベートした時に、類似の阻害傾向を示し、そしてピロドキサミンおよびピロ
リン酸チアミンは、最も有効な阻害剤または各ファミリーであった。ピリドキサ
ミンは、ＢＳＡにおけるＡＧＥ形成を阻害し損なった（図１５Ｄ）。リン酸ピリ
ドキサルおよびピリドキサル（図１５Ｂ−Ｃ）は、たいていＡＧＥ形成の速度を
阻害したが、形成したＡＧＥの最終濃度では阻害しない。ピリドキサミン（図１
５Ａ）は、低濃度である程度の阻害を示し、そして試験された最高の濃度は、他
のＢ６誘導体のいずれかよりいっそう有効に形成された最終濃度のＡＧＥを阻害
するようであった。Ｂ１誘導体の場合に、ＢＳＡとのＡＧＥ形成の阻害の全体的
範囲（図１６Ａ−Ｃ）は、ＲＮアーゼで観察されたもの（図１４Ａ−Ｃ）より低
かった。高濃度のチアミンおよびピロリン酸チアミンは、ＡＧＥ形成の速度に大
いに影響することなし（図１６Ｃ）に、形成された最終濃度のＡＧＥを阻害した
。さらに、アミノグアニジンは、ＲＮアーゼ（図１６Ｄ）で見られるのと同じ阻
害効果を示し、それにより形成された最終濃度のＡＧＥに明らかな影響を及ぼす
ことなく、ＡＧＥ形成の速度を遅くするようであった。
度論の阻害 比較研究を、ＢＳＡおよびヒトメトヘモグロビン（Ｈｂ）で行って、観察され
る阻害が、タンパク質特異的であるかどうかを決定した。ビタミンＢ６（図１５
Ａ−Ｄ）およびビタミンＢ１（図１６Ａ−Ｃ）の異なる誘導体は、ＢＳＡとイン
キュベートした時に、類似の阻害傾向を示し、そしてピロドキサミンおよびピロ
リン酸チアミンは、最も有効な阻害剤または各ファミリーであった。ピリドキサ
ミンは、ＢＳＡにおけるＡＧＥ形成を阻害し損なった（図１５Ｄ）。リン酸ピリ
ドキサルおよびピリドキサル（図１５Ｂ−Ｃ）は、たいていＡＧＥ形成の速度を
阻害したが、形成したＡＧＥの最終濃度では阻害しない。ピリドキサミン（図１
５Ａ）は、低濃度である程度の阻害を示し、そして試験された最高の濃度は、他
のＢ６誘導体のいずれかよりいっそう有効に形成された最終濃度のＡＧＥを阻害
するようであった。Ｂ１誘導体の場合に、ＢＳＡとのＡＧＥ形成の阻害の全体的
範囲（図１６Ａ−Ｃ）は、ＲＮアーゼで観察されたもの（図１４Ａ−Ｃ）より低
かった。高濃度のチアミンおよびピロリン酸チアミンは、ＡＧＥ形成の速度に大
いに影響することなし（図１６Ｃ）に、形成された最終濃度のＡＧＥを阻害した
。さらに、アミノグアニジンは、ＲＮアーゼ（図１６Ｄ）で見られるのと同じ阻
害効果を示し、それにより形成された最終濃度のＡＧＥに明らかな影響を及ぼす
ことなく、ＡＧＥ形成の速度を遅くするようであった。
【０１００】 Ｂ６およびＢ１ビタミン誘導体、およびアミノグアニジンの存在下でＨｂを使
用して、ＡＧＥ形成の速度論も試験された。ＡＧＥ形成の見かけの絶対速度は、
ＲＮアーゼまたはＢＳＡのいずれかとより、Ｈｂで明らかに高かった。しかし、
試験した阻害剤は、基本的に類似の作用を示した。ビタミンＢ６誘導体の効果は
、図１７に示される。ピリドキサミンは、３ｍＭおよびそれ以上の濃度で最大の
阻害を示し（図１７Ａ）、そしてリン酸ピリドキサル（図１７Ｂ）、ピリドキサ
ル（図１７Ｃ）、およびピリドキシン（図１７Ｄ）と比較したときに最高の有効
性であった。Ｂ１ビタミン誘導体（データは示されず）の場合には、阻害効果は
、ＲＮアーゼに対してより、ＢＳＡ阻害傾向にいっそう類似であった。阻害は、
試験した最高濃度（５０ｍＭ）でのみ控えめであり、３つのＢ１誘導体全てより
およそ３０−５０％であった。阻害の一次明示は、形成されたＡＧＥの最終濃度
の減少にあった。
用して、ＡＧＥ形成の速度論も試験された。ＡＧＥ形成の見かけの絶対速度は、
ＲＮアーゼまたはＢＳＡのいずれかとより、Ｈｂで明らかに高かった。しかし、
試験した阻害剤は、基本的に類似の作用を示した。ビタミンＢ６誘導体の効果は
、図１７に示される。ピリドキサミンは、３ｍＭおよびそれ以上の濃度で最大の
阻害を示し（図１７Ａ）、そしてリン酸ピリドキサル（図１７Ｂ）、ピリドキサ
ル（図１７Ｃ）、およびピリドキシン（図１７Ｄ）と比較したときに最高の有効
性であった。Ｂ１ビタミン誘導体（データは示されず）の場合には、阻害効果は
、ＲＮアーゼに対してより、ＢＳＡ阻害傾向にいっそう類似であった。阻害は、
試験した最高濃度（５０ｍＭ）でのみ控えめであり、３つのＢ１誘導体全てより
およそ３０−５０％であった。阻害の一次明示は、形成されたＡＧＥの最終濃度
の減少にあった。
【０１０１】 後期アマドリリボースＡＧＥ形成の速度論のビタミンＢ６誘導体による阻害 「後半」の後期アマドリＡＧＥ形成の阻害について分析する中断グリケーショ
ンモデルを用いて、３７℃で、遊離または可逆的に結合したリボースの不在下で
ＲＮアーゼまたはＢＳＡのいずれかの単離したアマドリ中間体をインキュベート
することによって速度論を試験した。中間体を製造するのに最初に使用されたリ
ボース糖を、２４時間の当初のグリケーション反応期間の後に冷透析によって除
去した。ＡＧＥ形成が再開させられた後に、ＡＧＥの形成は、任意の阻害剤の不
在下でまったく迅速である（約１０時間の半減期）。図１８は、ＢＳＡの後期ア
マドリ速度論におけるピリドキサミン（図１８Ａ）、リン酸ピロドキサル（図１
８Ｂ）、およびピリドキサル（図１８Ｃ）の効果を示す。ピリドキシンは、何ら
阻害を示さなかった（データは示されず）。ＲＮアーゼでの類似の実験を行った
。ピリドキサミンは、１５ｍＭおよび５０ｍＭ（図１８Ｄ）でのＲＮアーゼとの
ＡＧＥ形成のほとんど完全な阻害を引き起こした。ピリドキサルは、１５ｍＭ（
試験された最高値）で何ら明らかな阻害を示さなかったが、リン酸ピリドキサル
は、１５ｍＭで明らかな阻害を示した。リン酸ピリドキサルは、ＲＮアーゼの活
性部位をアフィニュティー標識できることが知られている（ＲａｅｔｚおよびＡ
ｕｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：２２２９−２２３６、１９７２年）
。
ンモデルを用いて、３７℃で、遊離または可逆的に結合したリボースの不在下で
ＲＮアーゼまたはＢＳＡのいずれかの単離したアマドリ中間体をインキュベート
することによって速度論を試験した。中間体を製造するのに最初に使用されたリ
ボース糖を、２４時間の当初のグリケーション反応期間の後に冷透析によって除
去した。ＡＧＥ形成が再開させられた後に、ＡＧＥの形成は、任意の阻害剤の不
在下でまったく迅速である（約１０時間の半減期）。図１８は、ＢＳＡの後期ア
マドリ速度論におけるピリドキサミン（図１８Ａ）、リン酸ピロドキサル（図１
８Ｂ）、およびピリドキサル（図１８Ｃ）の効果を示す。ピリドキシンは、何ら
阻害を示さなかった（データは示されず）。ＲＮアーゼでの類似の実験を行った
。ピリドキサミンは、１５ｍＭおよび５０ｍＭ（図１８Ｄ）でのＲＮアーゼとの
ＡＧＥ形成のほとんど完全な阻害を引き起こした。ピリドキサルは、１５ｍＭ（
試験された最高値）で何ら明らかな阻害を示さなかったが、リン酸ピリドキサル
は、１５ｍＭで明らかな阻害を示した。リン酸ピリドキサルは、ＲＮアーゼの活
性部位をアフィニュティー標識できることが知られている（ＲａｅｔｚおよびＡ
ｕｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１：２２２９−２２３６、１９７２年）
。
【０１０２】 ＲＮアーゼと異なりＢＳＡを用いて、相当の量の抗原性ＡＧＥが、図１８Ａ−
Ｃについて時間ゼロでリボースを除去した後のＥＬＩＳＡ読み取りが高いことに
よって立証されたとおり、ＲＮアーゼとの２４時間の最初のインキュベーション
の間に形成された。ＢＳＡおよびＲＮアーゼの両方について、見られる場合には
、阻害は、ＡＧＥの形成の速度における減少としてよりむしろ形成された最終濃
度のＡＧＥにおける減少として明示するようである。
Ｃについて時間ゼロでリボースを除去した後のＥＬＩＳＡ読み取りが高いことに
よって立証されたとおり、ＲＮアーゼとの２４時間の最初のインキュベーション
の間に形成された。ＢＳＡおよびＲＮアーゼの両方について、見られる場合には
、阻害は、ＡＧＥの形成の速度における減少としてよりむしろ形成された最終濃
度のＡＧＥにおける減少として明示するようである。
【０１０３】 後期アマドリリボースＡＧＥ形成の速度論のビタミンＢ１誘導体による阻害 チアミンリポリン酸塩は、ＲＮアーゼおよびＢＳＡの両方との他のＢ１誘導体
よりいっそう有効にＡＧＥ形成を阻害した（図１９）。チアミンは、効果を示さ
なかった一方で、リン酸チアミンは、ある程度の中間体効果を示した。Ｂ６アッ
セイとの場合、後期アマドリ阻害は、形成された最終濃度のＡＧＥでの減少とし
て最も明らかに明示された。
よりいっそう有効にＡＧＥ形成を阻害した（図１９）。チアミンは、効果を示さ
なかった一方で、リン酸チアミンは、ある程度の中間体効果を示した。Ｂ６アッ
セイとの場合、後期アマドリ阻害は、形成された最終濃度のＡＧＥでの減少とし
て最も明らかに明示された。
【０１０４】 後期アマドリリボースＡＧＥ形成の速度論におけるアミノグアニジンおよびＮ α −アセチル−Ｌ−リシンの効果 図２０は、ＢＳＡおよびＲＮアーゼの両方での後期アマドリＡＧＥ形成速度論
の阻害についてのアミノグアニジンを試験した結果を示す。５０ｍＭで、阻害は
、ＢＳＡ（図２０Ｂ）の場合の約２０％であり、そしてＲＮアーゼ（図２０Ａ）
を用いたのより１５％低かった。遊離Ｎε−アミノ基のみを含むＮα−アセチル
−Ｌ−リシン（図２１）を用いて、簡単なアミノ含有官能性による阻害の可能性
も試験した。５０ｍＭまでのＮα−アセチル−Ｌ−リシンは、ＡＧＥ形成の任意
の明らかな阻害を示しそこなった。
の阻害についてのアミノグアニジンを試験した結果を示す。５０ｍＭで、阻害は
、ＢＳＡ（図２０Ｂ）の場合の約２０％であり、そしてＲＮアーゼ（図２０Ａ）
を用いたのより１５％低かった。遊離Ｎε−アミノ基のみを含むＮα−アセチル
−Ｌ−リシン（図２１）を用いて、簡単なアミノ含有官能性による阻害の可能性
も試験した。５０ｍＭまでのＮα−アセチル−Ｌ−リシンは、ＡＧＥ形成の任意
の明らかな阻害を示しそこなった。
【０１０５】 検討 おびただしい研究では、アミノグアニジンが、非酵素的グリケーションの多く
の徴候の明らかに強力な阻害剤であることを示した（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら、１９
８６年；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、１９９２年、１９９４年、１９９５年）。糖を還元
することによって誘導される種々の現象におけるアミノグアニジンの阻害効果は
、多くのこのような現象におけるグリケーションの関与の証明として広く考えら
れる。アミノグアニジンは、最近、高濃度の糖のために結合性組織タンパク質の
グリケーションによって引き起こされると考えられる糖尿病の合併症を改善する
ことについてのＩＩＩ相の治験の2回目に入った。
の徴候の明らかに強力な阻害剤であることを示した（Ｂｒｏｗｎｌｅｅら、１９
８６年；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、１９９２年、１９９４年、１９９５年）。糖を還元
することによって誘導される種々の現象におけるアミノグアニジンの阻害効果は
、多くのこのような現象におけるグリケーションの関与の証明として広く考えら
れる。アミノグアニジンは、最近、高濃度の糖のために結合性組織タンパク質の
グリケーションによって引き起こされると考えられる糖尿病の合併症を改善する
ことについてのＩＩＩ相の治験の2回目に入った。
【０１０６】 グルコース（実施例１）によって誘導されるＲＮアーゼとの非中断「遅い」Ａ
ＧＥ形成の速度論研究から得られるデータは、アミノグアニジンが有効な阻害剤
であることを示し、そしてさらに、ビタミンＢ１およびＢ６の多数の誘導体を、
等しくまたは僅かにいっそう有効な阻害剤として同定した。しかし、アミノグア
ニジンによる阻害は、予想外に、ＡＧＥ形成反応の後半の段階での効果で減少す
るようであった。グルコースとのタンパク質のグリケーションの遅さのため、こ
の驚くべき観察は、十分に試験されなかった。さらに、アミノグアニジンの長期
安定性のついての疑問があり得ることが示唆された（ＯｕおよびＷｏｌｆｆ、上
記、１９９３年）。
ＧＥ形成の速度論研究から得られるデータは、アミノグアニジンが有効な阻害剤
であることを示し、そしてさらに、ビタミンＢ１およびＢ６の多数の誘導体を、
等しくまたは僅かにいっそう有効な阻害剤として同定した。しかし、アミノグア
ニジンによる阻害は、予想外に、ＡＧＥ形成反応の後半の段階での効果で減少す
るようであった。グルコースとのタンパク質のグリケーションの遅さのため、こ
の驚くべき観察は、十分に試験されなかった。さらに、アミノグアニジンの長期
安定性のついての疑問があり得ることが示唆された（ＯｕおよびＷｏｌｆｆ、上
記、１９９３年）。
【０１０７】 リボースによるさらにいっそう迅速なグリケーションを用いた分析は、タンパ
ク質の非中断グリケーションの間に完全に観察および定量されるべき全時間経過
に対処した。中断グリケーションの使用は、特徴的に、遊離および可逆的に結合
した（シッフ塩基）リボースの不在下で唯一後期アマドリ抗原性ＡＧＥ形成の別
の単離および試験を可能にした。初期グルコースグリケーション速度論を用いた
これらの２つのアプローチ法からのデータの比較は、種々の阻害剤の機構および
有効性への新規洞察を提供した。図２２は、種々の濃度の阻害剤を用いた定義さ
れた時点での阻害率の要約した比較データを表す棒グラフである。図２２Ａは、
リボース中のＲＮアーゼ形成の中断グリケーションの後の阻害についてのデータ
をグラフで表す。図２２Ｂは、リボースによるＢＳＡのＡＧＥ形成の中断グリケ
ーションの後の阻害についてのデータをグラフで表す。
ク質の非中断グリケーションの間に完全に観察および定量されるべき全時間経過
に対処した。中断グリケーションの使用は、特徴的に、遊離および可逆的に結合
した（シッフ塩基）リボースの不在下で唯一後期アマドリ抗原性ＡＧＥ形成の別
の単離および試験を可能にした。初期グルコースグリケーション速度論を用いた
これらの２つのアプローチ法からのデータの比較は、種々の阻害剤の機構および
有効性への新規洞察を提供した。図２２は、種々の濃度の阻害剤を用いた定義さ
れた時点での阻害率の要約した比較データを表す棒グラフである。図２２Ａは、
リボース中のＲＮアーゼ形成の中断グリケーションの後の阻害についてのデータ
をグラフで表す。図２２Ｂは、リボースによるＢＳＡのＡＧＥ形成の中断グリケ
ーションの後の阻害についてのデータをグラフで表す。
【０１０８】 全体的結果は、アミノグアニジンが、糖の存在下で抗原性ＡＧＥ形成の速度を
遅くするが、形成される後期アマドリＡＧＥの最終量にはほとんど影響を示さな
いことを明白に示す。したがって、阻害剤として有効性を示すＡＧＥ形成の最初
の「初期」段階のみに限定される観察は、事実、後期アマドリ形成の阻害の真の
有効性により誤解させている可能性がある。したがって、リボースおよび中断グ
リケーションを用いた反応の完全な経過を観察する能力は、後期アマドリＡＧＥ
形成の阻害の有効性のいっそう完全な図を付与する。
遅くするが、形成される後期アマドリＡＧＥの最終量にはほとんど影響を示さな
いことを明白に示す。したがって、阻害剤として有効性を示すＡＧＥ形成の最初
の「初期」段階のみに限定される観察は、事実、後期アマドリ形成の阻害の真の
有効性により誤解させている可能性がある。したがって、リボースおよび中断グ
リケーションを用いた反応の完全な経過を観察する能力は、後期アマドリＡＧＥ
形成の阻害の有効性のいっそう完全な図を付与する。
【０１０９】 実施例４ ＡＧＥ形成／阻害のインビボでの効果の動物モデルおよび試験 高血糖症は、ストレプトゾシン（ａｋａ．ストレプトシン、ＳＴＺ）またはア
ロキサンの投与によりラットで迅速に誘導（１または２日以内）され得る。これ
は、真性糖尿病についての一般モデルになる。しかし、これらのラットは、数ヶ
月の高血糖症の後、および通常、最終段階の腎臓疾病（ＥＳＲＤ）から死亡の直
前のみにネフロパシーを明示する。この病理学は、基底膜のコラーゲンのような
長生きのタンパク質の不可逆性グルコースの化学的修飾によって引き起こされる
と思われる。ＳＴＺ−糖尿病ラットは、高血糖の誘導の後非常に遅く、死亡の通
常にほんの直前に約４０週で、蛋白尿を示す。
ロキサンの投与によりラットで迅速に誘導（１または２日以内）され得る。これ
は、真性糖尿病についての一般モデルになる。しかし、これらのラットは、数ヶ
月の高血糖症の後、および通常、最終段階の腎臓疾病（ＥＳＲＤ）から死亡の直
前のみにネフロパシーを明示する。この病理学は、基底膜のコラーゲンのような
長生きのタンパク質の不可逆性グルコースの化学的修飾によって引き起こされる
と思われる。ＳＴＺ−糖尿病ラットは、高血糖の誘導の後非常に遅く、死亡の通
常にほんの直前に約４０週で、蛋白尿を示す。
【０１１０】 上の実施例でインビトロに示されるリボースの劇的な迅速効果のため、ラット
へのリボース投与の効果を、そして迅速なリボースグリケーションによるＡＧＥ
の可能な誘導を試験することが保証された。この研究から、促進されたリボース
誘導病理学のためのラットのモデルが開発された。
へのリボース投与の効果を、そして迅速なリボースグリケーションによるＡＧＥ
の可能な誘導を試験することが保証された。この研究から、促進されたリボース
誘導病理学のためのラットのモデルが開発された。
【０１１１】 インビボでの非常に短期間のリボース投与の効果 Ｉ相プロトコル ６匹のラットの２つの群は、各々、１日に、 ａ．３００ｍＭリボース（６−８時間個々に、２回の腹腔内注入、各々、ｍｌ
として体重の５％）、または ｂ．５０ｍＭリボース（１回注入） のいずれかで付与された。
として体重の５％）、または ｂ．５０ｍＭリボース（１回注入） のいずれかで付与された。
【０１１２】 その後、ラットを、さらにリボース投与することなしに、４日間維持し、その
時に、それらを、犠牲にし、そして以下の生理学的測定を測定した。（ｉ）当初
および最終体重、（ｉｉ）最終段階の腎臓の重さ、（ｉｉｉ）当初および最終尾
部カフ血圧、（ｉｖ）体重１００ｇ当たりのクレアチニンのクリアランス。
時に、それらを、犠牲にし、そして以下の生理学的測定を測定した。（ｉ）当初
および最終体重、（ｉｉ）最終段階の腎臓の重さ、（ｉｉｉ）当初および最終尾
部カフ血圧、（ｉｖ）体重１００ｇ当たりのクレアチニンのクリアランス。
【０１１３】 迅速な変化が、最初に予想されなかったので、アルブミン濾過速度は測定され
なかった。ＳＴＺ−糖尿病ラットを用いた過去の経験は、蛋白尿が、高血糖症の
誘導の後、非常に遅く（おそらく４０週）に、そして動物が息絶える直前に発生
することを示す。
なかった。ＳＴＺ−糖尿病ラットを用いた過去の経験は、蛋白尿が、高血糖症の
誘導の後、非常に遅く（おそらく４０週）に、そして動物が息絶える直前に発生
することを示す。
【０１１４】 腎臓の生理学の結果 ａ．最終体重および最終の単独腎臓の重さは、低いおよび高いリボース処置群
と同じであった。
と同じであった。
【０１１５】 ｂ．尾部カフ血圧は、低いリボース（１×５０ｍＭ）で処置した６６±４から
８３±３まで増加し、そして高いリボース（２×３００ｍＭ）で処置した６６±
４から１０６±５まで増加した。これらの結果は、図２３の棒グラフに示される
。
８３±３まで増加し、そして高いリボース（２×３００ｍＭ）で処置した６６±
４から１０６±５まで増加した。これらの結果は、図２３の棒グラフに示される
。
【０１１６】 ｃ．体重１００ｇ当たりのｃｃとしてのクレアチニンのクリアランスが、低い
リボース群については０．８７±０．１５まで用量依存形態で減少（約１．０−
１．２の予測される正常な範囲）され、そして高いリボース群でも０．６２±０
．１３までさらに３０％に減少した。これらの結果は、図２４の棒グラフで示さ
れる。
リボース群については０．８７±０．１５まで用量依存形態で減少（約１．０−
１．２の予測される正常な範囲）され、そして高いリボース群でも０．６２±０
．１３までさらに３０％に減少した。これらの結果は、図２４の棒グラフで示さ
れる。
【０１１７】 Ｉ相の結論 単日のリボース処置は、用量依存の高血圧および糸球体のクリアランスにおけ
る用量依存の減少が、４日後に現れさせた。これらは、これらのＳＴＺ−糖尿病
ラットでいっそう後にのみ見られる糖尿病の明らかな代謝変化である。これらの
現象は、インビボでのタンパク質のリボース不可逆性化学的修飾（グリケーショ
ン）によると仮定され得る。
る用量依存の減少が、４日後に現れさせた。これらは、これらのＳＴＺ−糖尿病
ラットでいっそう後にのみ見られる糖尿病の明らかな代謝変化である。これらの
現象は、インビボでのタンパク質のリボース不可逆性化学的修飾（グリケーショ
ン）によると仮定され得る。
【０１１８】 長期間の高いリボース濃度に露出する効果 ＩＩ相プロトコル ラット（３−６）の群に、（ｉ）１日、（ｉｉ）４日の「短期間」（Ｓ）、ま
たは（ｉｉｉ）８日の「長期間」（Ｌ）のいずれかの間、日に二回注射まで、腹
腔内に０．３Ｍ「低リボース用量」（ＬＲ）または１．０Ｍ「高リボース用量」
（ＨＲ）が付与された。さらに、これらの濃度のリボースは、飲み水に含まれた
。
たは（ｉｉｉ）８日の「長期間」（Ｌ）のいずれかの間、日に二回注射まで、腹
腔内に０．３Ｍ「低リボース用量」（ＬＲ）または１．０Ｍ「高リボース用量」
（ＨＲ）が付与された。さらに、これらの濃度のリボースは、飲み水に含まれた
。
【０１１９】 腎臓の生理学の結果 ａ．尾部カフ血圧は、リボース処置したラットの全ての群で増加し、Ｉ相の結
果が確認された。（図２３）。
果が確認された。（図２３）。
【０１２０】 ｂ．クレアチニンのクリアランスは、リボース用量依存および時間依存手段の
全ての群で減少した（図２４）。
全ての群で減少した（図２４）。
【０１２１】 ｃ．アルブミン滲出速度（ＡＥＲ）は、１日および４日の露出で、リボース依
存性手段で明らかに増大した。しかし、高用量群中で４日に対応する８日である
程度回収を示したが、低用量群では示さなかった。これらの結果は、図２５の棒
グラフで示される。
存性手段で明らかに増大した。しかし、高用量群中で４日に対応する８日である
程度回収を示したが、低用量群では示さなかった。これらの結果は、図２５の棒
グラフで示される。
【０１２２】 ｄ．体重１００ｇ当たりのクレアチニンのクリアランスは、時間依存手段でお
よそ同じ範囲にまで低および高リボース群の両方について減少した（図２４）。
よそ同じ範囲にまで低および高リボース群の両方について減少した（図２４）。
【０１２３】 ＩＩ相の結論 ４日と同じくらい少ない日数の間のリボースへの露出は、クレアチニンのクリ
アランスが減少したこと、およびアルブミン濾過が増加したことの両方による徴
候として、高血圧および腎臓機能不全に至った。これらの変化は、典型的な糖尿
病であり、そしてＳＴＺ糖尿病ラットでより遅い時期で見られる。
アランスが減少したこと、およびアルブミン濾過が増加したことの両方による徴
候として、高血圧および腎臓機能不全に至った。これらの変化は、典型的な糖尿
病であり、そしてＳＴＺ糖尿病ラットでより遅い時期で見られる。
【０１２４】 ２つの新たな治療化合物およびアミノグアニジンによる介在 ＩＩＩ相プロトコル ６０匹のラットを、９つの異なる群に任意抽出され、それにより以下のとおり
アミノグアニジン、ピリドキサミン、およびピロリン酸チアミンの存在および不
在下で、８日間、１Ｍリボースに露出したものが挙げられた。
アミノグアニジン、ピリドキサミン、およびピロリン酸チアミンの存在および不
在下で、８日間、１Ｍリボースに露出したものが挙げられた。
【０１２５】 対照群： （ｉ）処置なし、 （ｉｉ）高用量（２５０ｍｇ／ｋｇ体重）のピリドキサミン（「化合物−Ｐ」）
、 （ｉｉｉ）高用量（２５０ｍｇ／ｋｇ体重）のピロリン酸チアミン（「化合物−
Ｔ」または「ＴＰＰ」）、および （ｉｖ）低用量（２５ｍｇ／ｋｇ体重）のアミノグアニジン（「ＡＧ」）。
、 （ｉｉｉ）高用量（２５０ｍｇ／ｋｇ体重）のピロリン酸チアミン（「化合物−
Ｔ」または「ＴＰＰ」）、および （ｉｖ）低用量（２５ｍｇ／ｋｇ体重）のアミノグアニジン（「ＡＧ」）。
【０１２６】 試験群： （ｉ）ただ１Ｍリボース−生理食塩水（８日間、毎日ＩＰ２×９ｃｃ）、 （ｉｉ）リボース足す低用量（「ＬP」）のピリドキサミン（９ｃｃリボースと
共に０．５ｍｌとして注入される２５ｍｇ／ｋｇ体重）、 （ｉｉｉ）リボース足す高用量（「HP」）のピリドキサミン（９ｃｃリボースと
共に０．５ｍｌとして注入される２５０ｍｇ／ｋｇ体重）、 （ｉｖ）リボース足す高用量（「ＨP」）のピロリン酸チアミン（９ｃｃリボー
スと共に０．５ｍｌとして注入される２５０ｍｇ／ｋｇ体重）、および （ｖ）リボース足す低用量のアミノグアニジン（９ｃｃリボースと共に０．５ｍ
ｌとして注入される２５ｍｇ／ｋｇ体重）。
共に０．５ｍｌとして注入される２５ｍｇ／ｋｇ体重）、 （ｉｉｉ）リボース足す高用量（「HP」）のピリドキサミン（９ｃｃリボースと
共に０．５ｍｌとして注入される２５０ｍｇ／ｋｇ体重）、 （ｉｖ）リボース足す高用量（「ＨP」）のピロリン酸チアミン（９ｃｃリボー
スと共に０．５ｍｌとして注入される２５０ｍｇ／ｋｇ体重）、および （ｖ）リボース足す低用量のアミノグアニジン（９ｃｃリボースと共に０．５ｍ
ｌとして注入される２５ｍｇ／ｋｇ体重）。
【０１２７】 腎臓の生理学結果 ａ．血圧は、３つの化合物単独（対照群）によって非常に僅かに増大された；
リボースが上昇したＢＰは、化合物の同時投与によって改善されなかった。これ
らの結果は、図２６の棒グラフで示される。
リボースが上昇したＢＰは、化合物の同時投与によって改善されなかった。これ
らの結果は、図２６の棒グラフで示される。
【０１２８】 ｂ．対照におけるクレアチニンのクリアランスは、それを減じるＴＰＰ以外は
変換されなかった。
変換されなかった。
【０１２９】 ｃ．クレアチニンのクリアランスは、リボースが低用量（２５ｍｇ／ｋｇ）の
アミノグアニジンまたはピリドキサミンのいずれかとの同時投与されたときに正
常化された。これらの結果は、図２７の棒グラフに示される。
アミノグアニジンまたはピリドキサミンのいずれかとの同時投与されたときに正
常化された。これらの結果は、図２７の棒グラフに示される。
【０１３０】 ｄ．高濃度（２５０ｍｇ／ｋｇ）またはピリドキサミンおよびＴＰＰは、クレ
アチニンのクリアランスにおけるリボース誘導減少に対しての部分的保護のみを
示した（図２７）。
アチニンのクリアランスにおけるリボース誘導減少に対しての部分的保護のみを
示した（図２７）。
【０１３１】 ｅ．アルブミン滲出速度（ＡＥＲ）は、リボースによって、並びに高用量のピ
リドキサミンおよびＴＰＰ、そしてリボースの不在下で低用量のアミノグアニジ
ンによって上昇された。これらの結果は、図２８の棒グラフに示される。
リドキサミンおよびＴＰＰ、そしてリボースの不在下で低用量のアミノグアニジ
ンによって上昇された。これらの結果は、図２８の棒グラフに示される。
【０１３２】 ｆ．アルブミン滲出速度は、低用量のアミノグアニジンおよびピリドキサミン
の両方の同時投与によって正常に保持された。これらの結果は、図２９の棒グラ
フに示される。
の両方の同時投与によって正常に保持された。これらの結果は、図２９の棒グラ
フに示される。
【０１３３】 ＩＩＩ相の結論 腎臓機能の２つの指数によって測定されるとおり、ピリドキサミンおよびアミ
ノグアニジンは、両方とも２５ｍｇ／ｋｇで、明らかに有効であり、そしてクレ
アチニンのクリアランスにおけるリボースで誘導した減少、および蛋白尿におけ
るリボースで誘導した増大を防止する上で、等しく有効であった。
ノグアニジンは、両方とも２５ｍｇ／ｋｇで、明らかに有効であり、そしてクレ
アチニンのクリアランスにおけるリボースで誘導した減少、および蛋白尿におけ
るリボースで誘導した増大を防止する上で、等しく有効であった。
【０１３４】 （ｉ）ピロリン酸チアミンを、２５ｍｇ／ｋｇで試験されなかった；（ｉｉ）
２５０ｍｇ／ｋｇでピロリン酸チアミンおよびピリドキサミンは、クレアチニン
のクリアランスが減少するのを防止する上で部分的に有効であったが、しかし温
和なアルブミン尿症を防止する上でおそらく有効でなかった；（ｉｉｉ）これら
の非常に高い濃度で、そしてリボースの不在下で、ピロリン酸チアミン単独は、
クレアチニンのクリアランスにおける減少を生じ、そして両方がアルブミン尿症
における温和な増大を生じた。
２５０ｍｇ／ｋｇでピロリン酸チアミンおよびピリドキサミンは、クレアチニン
のクリアランスが減少するのを防止する上で部分的に有効であったが、しかし温
和なアルブミン尿症を防止する上でおそらく有効でなかった；（ｉｉｉ）これら
の非常に高い濃度で、そしてリボースの不在下で、ピロリン酸チアミン単独は、
クレアチニンのクリアランスにおける減少を生じ、そして両方がアルブミン尿症
における温和な増大を生じた。
【０１３５】 概要 腎臓機能および糖尿病 真性糖尿病における存続高血糖症は、ヒト患者のおそらく3分の１で糖尿病性
ネフロパシーに至る。医療的に、糖尿病性ネフロパシーは、 １．腎臓機能における減少（損傷を受けた糸球体のグレアランス） ２．尿中タンパク質における増大（損傷を受けた濾過） ３．高血圧の同時存在 の存在によって定義される。
ネフロパシーに至る。医療的に、糖尿病性ネフロパシーは、 １．腎臓機能における減少（損傷を受けた糸球体のグレアランス） ２．尿中タンパク質における増大（損傷を受けた濾過） ３．高血圧の同時存在 の存在によって定義される。
【０１３６】 腎臓機能は、血流（測定されず）および糸球体のクリアランスにより、そして
それは、イヌリンのグレアランス（測定されず）またはクレアチニンのクリアラ
ンスのいずれかによって測定され得る。糸球体透過性は、アルブミン濾過速度に
よって測定されるが、このパラメータは、まったく可変性がある。それは、対数
分布関数でもある。アルブミン排出における百倍増大は、濾過許容量における２
倍減少のみを表す。
それは、イヌリンのグレアランス（測定されず）またはクレアチニンのクリアラ
ンスのいずれかによって測定され得る。糸球体透過性は、アルブミン濾過速度に
よって測定されるが、このパラメータは、まったく可変性がある。それは、対数
分布関数でもある。アルブミン排出における百倍増大は、濾過許容量における２
倍減少のみを表す。
【０１３７】 リボース糖尿病性ラットモデル 上の条件によって、リボースは、高血圧で反映されるときに、糖尿病性ネフロ
パシーの兆候、クレアチニンのクリアランスおよびアルブミン尿症を、後者が大
きくない場合でさえ、非常に迅速に誘導するようである。樹立されたＳＴＺ糖尿
病ラットで、高血糖症は、１−２日で迅速に樹立されたが、しかし糖尿病性ネフ
ロパシーの臨床的徴候は、おそらくアルブミン尿症の４０週と同じくらい多い非
常に後に、生じる。一般にアルブミン尿症は、ヒトとは異なり、ほとんどのＳＴ
Ｚラットが、最終的にネフロパシーを発生するが、日毎、そして動物から動物ま
で非常に可変である。
パシーの兆候、クレアチニンのクリアランスおよびアルブミン尿症を、後者が大
きくない場合でさえ、非常に迅速に誘導するようである。樹立されたＳＴＺ糖尿
病ラットで、高血糖症は、１−２日で迅速に樹立されたが、しかし糖尿病性ネフ
ロパシーの臨床的徴候は、おそらくアルブミン尿症の４０週と同じくらい多い非
常に後に、生じる。一般にアルブミン尿症は、ヒトとは異なり、ほとんどのＳＴ
Ｚラットが、最終的にネフロパシーを発生するが、日毎、そして動物から動物ま
で非常に可変である。
【０１３８】 化合物による介在 リボース処置動物を用いて、２５ｍｇ／ｋｇ体重でのピリドキサミンは、通常
に糖尿病に起因した３つの徴候中２つ、主に、クレアチニンクリアランスとアル
ブミン濾過の損傷を有効に防止するようである。それは、アミノグアニジンと同
様に有効に防止した。ピロリン酸チアミンの有効性は、徴候ではなかったが、し
かし、それは、２５０ｍｇ／ｋｇ体重の上昇した濃度での使用による可能性があ
ることが主張されるべきである。ピリドキサミンは、２５０ｍｇ／ｋｇ体重での
結果のみが、考慮される場合にいっそう有効性が低いようであった。
に糖尿病に起因した３つの徴候中２つ、主に、クレアチニンクリアランスとアル
ブミン濾過の損傷を有効に防止するようである。それは、アミノグアニジンと同
様に有効に防止した。ピロリン酸チアミンの有効性は、徴候ではなかったが、し
かし、それは、２５０ｍｇ／ｋｇ体重の上昇した濃度での使用による可能性があ
ることが主張されるべきである。ピリドキサミンは、２５０ｍｇ／ｋｇ体重での
結果のみが、考慮される場合にいっそう有効性が低いようであった。
【０１３９】 化合物単独の効果 全体的に、ラットは、化合物に十分に耐性があるようであった。腎臓の重さは
、顕著でなく、ほとんど高血圧を発生しなかった。化合物の生理学的効果は、２
５０ｍｇ／ｋｇでのみ試験した。ピリドキサミンでなくて、チアミンリポリン酸
塩は、この濃度でクレアチンのクリアランスを減少させるようであった。両方は
、アルブミン尿症をわずかに増大するようであったが、しかし、これらの測定は
、おそらく最小の信頼性であった。
、顕著でなく、ほとんど高血圧を発生しなかった。化合物の生理学的効果は、２
５０ｍｇ／ｋｇでのみ試験した。ピリドキサミンでなくて、チアミンリポリン酸
塩は、この濃度でクレアチンのクリアランスを減少させるようであった。両方は
、アルブミン尿症をわずかに増大するようであったが、しかし、これらの測定は
、おそらく最小の信頼性であった。
【０１４０】 ヒト投与 典型的な成人ヒトは、６６−７７Ｋｇの間の平均重量サイズである。典型的に
は、糖尿病患者は、体重オーバーの傾向にありえて、そして１１２Ｋｇを超え得
る。１９８９年に修正されたとおり、６６−７７Ｋｇの間の成人男性についての
推奨食事支給量は、日当たり１．５ｍｇのチアミン、そして日当たり２．０ｍｇ
のビタミンＢ６（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎ
ｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、１６版（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｒａｔｈｗａｙ、Ｎ．
Ｊ、１９９２年）９３８−９３９頁が求められた。
は、糖尿病患者は、体重オーバーの傾向にありえて、そして１１２Ｋｇを超え得
る。１９８９年に修正されたとおり、６６−７７Ｋｇの間の成人男性についての
推奨食事支給量は、日当たり１．５ｍｇのチアミン、そして日当たり２．０ｍｇ
のビタミンＢ６（Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎ
ｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、１６版（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｒａｔｈｗａｙ、Ｎ．
Ｊ、１９９２年）９３８−９３９頁が求められた。
【０１４１】 ラットモデルのアプローチ法に基づいて、後期アマドリＡＧＥ形成を阻害する
のに有効であり、したがって、関連病理学を阻害するのに有効であると推定され
るピリドキサミンまたはピロリン酸チアミンの投与についての用量の範囲は、１
ｍｇ／１００ｇ体重から２００ｍｇ／１００ｇ体重までの範囲に入る。アミノグ
アニジンと同時投与した場合の適切な範囲は、類似する。７５Ｋｇの平均成人に
ついて計算すると、範囲（１０ｍｇ／１Ｋｇ体重で）は、１５０ｇより上におよ
そ７５０ｍｇ（２ｇ／１Ｋｇ体重で）であり得る。これは、特定の患者によって
自然に変化する。
のに有効であり、したがって、関連病理学を阻害するのに有効であると推定され
るピリドキサミンまたはピロリン酸チアミンの投与についての用量の範囲は、１
ｍｇ／１００ｇ体重から２００ｍｇ／１００ｇ体重までの範囲に入る。アミノグ
アニジンと同時投与した場合の適切な範囲は、類似する。７５Ｋｇの平均成人に
ついて計算すると、範囲（１０ｍｇ／１Ｋｇ体重で）は、１５０ｇより上におよ
そ７５０ｍｇ（２ｇ／１Ｋｇ体重で）であり得る。これは、特定の患者によって
自然に変化する。
【０１４２】 実施例５ ビタミンＢ１およびＢ６の誘導体およびアミノグアニジンによる高次的グリケ
ーション最終産物（ＡＧＥ）の形成のインビボでの阻害。糖尿病性ネフロパシー
の阻害 上の実施例で記述されるとおり、中断グリケーション法は、インビボでの研究
に使用するためのリボースおよび他のペントース糖からの安定な十分に定義され
たタンパク質アマドリ中間体の迅速な発生に対処する。
ーション最終産物（ＡＧＥ）の形成のインビボでの阻害。糖尿病性ネフロパシー
の阻害 上の実施例で記述されるとおり、中断グリケーション法は、インビボでの研究
に使用するためのリボースおよび他のペントース糖からの安定な十分に定義され
たタンパク質アマドリ中間体の迅速な発生に対処する。
【０１４３】 腎臓の病理学における２５ｍｇ／ｋｇ／日ピリドキサミン（ＰＭ）およびアミ
ノグアニジン（ＡＧ）の効果は、６週間、スプレーグ−ドーリーラットに、毎日
５０ｍｇ／ｋｇ／日のリボース−グリケート化アマドリ−ラット血清アルブミン
（ＲＳＡ）、ＡＧＥ−ＲＳＡ、および未修飾ＲＳＡを注入することによって誘導
した。高濾過（増大したクレアチニンクリアランス）が、ＰＭおよびＡＧの存在
に関係なく、アマドリ−ＲＳＡおよびＡＧＥ−ＲＳＡを受けているラットで一過
的に見られた。
ノグアニジン（ＡＧ）の効果は、６週間、スプレーグ−ドーリーラットに、毎日
５０ｍｇ／ｋｇ／日のリボース−グリケート化アマドリ−ラット血清アルブミン
（ＲＳＡ）、ＡＧＥ−ＲＳＡ、および未修飾ＲＳＡを注入することによって誘導
した。高濾過（増大したクレアチニンクリアランス）が、ＰＭおよびＡＧの存在
に関係なく、アマドリ−ＲＳＡおよびＡＧＥ−ＲＳＡを受けているラットで一過
的に見られた。
【０１４４】 アマドリ−ＲＳＡおよびＡＧＥ−ＲＳＡを受けている各群から得られる個体は
、微小アルブミン尿症を示したが、そかし、ＰＭが同時投与される場合に見られ
るものはなかった。抗−ＲＳＡを用いた免疫染色は、ＡＧＥ−ＲＳＡで、そして
アマドリＲＳＡで処置したラットにおける糸球体染色を表した。そしてこの染色
は、ＰＭでの処置によって減少されたが、ＡＧ処置によっては減少されなかった
。糸球体の硫酸化グリコサミノグリカン（ｐＨ１．０アルシアンブルー染色）に
おける減少は、グリケート化（アマドリおよびＡＧＥ）ＲＳＡで処置したラット
でも見られた。これは、ＨＳＰＧ側鎖に特異的であるｍＡｂＪＭ−４０３での染
色が減少したことによって立証されるとおり、ヘパランスルフェートプロテオグ
リカン（ＨＳＰＧ）が減少したことによるようである。これらのＨＳＰＧ変化は
、ＰＭを用いた処置によって促進されたが、ＡＧ処置によっては促進されなかっ
た。
、微小アルブミン尿症を示したが、そかし、ＰＭが同時投与される場合に見られ
るものはなかった。抗−ＲＳＡを用いた免疫染色は、ＡＧＥ−ＲＳＡで、そして
アマドリＲＳＡで処置したラットにおける糸球体染色を表した。そしてこの染色
は、ＰＭでの処置によって減少されたが、ＡＧ処置によっては減少されなかった
。糸球体の硫酸化グリコサミノグリカン（ｐＨ１．０アルシアンブルー染色）に
おける減少は、グリケート化（アマドリおよびＡＧＥ）ＲＳＡで処置したラット
でも見られた。これは、ＨＳＰＧ側鎖に特異的であるｍＡｂＪＭ−４０３での染
色が減少したことによって立証されるとおり、ヘパランスルフェートプロテオグ
リカン（ＨＳＰＧ）が減少したことによるようである。これらのＨＳＰＧ変化は
、ＰＭを用いた処置によって促進されたが、ＡＧ処置によっては促進されなかっ
た。
【０１４５】 しがたって、我々は、ピリドキサミンは、ヘパランスルフェートの糖尿病様糸
球体の損失、およびリボースグリケート化アルブミンで慢性的に治療されたＳＤ
ラットにおけるグリケート化アルブミンの糸球体沈着の両方を防止できる。
球体の損失、およびリボースグリケート化アルブミンで慢性的に治療されたＳＤ
ラットにおけるグリケート化アルブミンの糸球体沈着の両方を防止できる。
【０１４６】 材料および方法 化合物 ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）（画分Ｖ、基本的に脂肪酸不含０．００５％
；Ａ２０１８）、Ｄ−リボース、ピリドキサミン、およびヤギのアルカリ性ホス
ファターゼ接合抗−ウサギＩｇＧは、すべてシグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）から得られた。アミノグアニジンヒドロクロリドは、アルド
リッチケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入された。
；Ａ２０１８）、Ｄ−リボース、ピリドキサミン、およびヤギのアルカリ性ホス
ファターゼ接合抗−ウサギＩｇＧは、すべてシグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）から得られた。アミノグアニジンヒドロクロリドは、アルド
リッチケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入された。
【０１４７】 リベイテッドＲＳＡの作製 ラット血清アルブミンに、あらゆる可能な混入物を除去するためにアフィ−ゲ
ルブルーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ペパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および内毒素結合アフィニティカラム（デトキシゲル、
Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通過させた。その後、精製ラット血清
アルブミン（ＲＳＡ）を、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析した。
その後、ＲＳＡの一部（２０ｍｇ／ｍｌ）を、暗所で、３７℃で、１２時間、０
．５Ｍリボースでインキュベートした。１２時間インキュベーション後、反応混
合液を、４℃で３６時間の期間かけて冷０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で透
析した（この透析は、遊離リボースのみならず、シッフ塩基中間体をも除去する
）。グリケーション工程のこの時点で、リベイテッドタンパク質を、アマドリ−
ＲＳＡとして区別し、そしてＡＧＥタンパク質と反応性のある抗体によって測定
される場合、抗原性ＡＧＥに対して陰性である（先に記述されるとおり、Ｒ６１
８、抗原は、グルコース修飾ＡＧＥ−ＲＮアーゼである）。その後、リベイテッ
ドタンパク質を、ａ）アマドリ−ＲＳＡ、ｂ）ＮａＢＨ４還元アマドリ−ＲＳＡ
、ｃ）ＡＧＥ−ＲＳＡのいずれかとして注入される部分に分割される。
ルブルーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ペパリン−セファロースＣＬ−６Ｂカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および内毒素結合アフィニティカラム（デトキシゲル、
Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通過させた。その後、精製ラット血清
アルブミン（ＲＳＡ）を、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析した。
その後、ＲＳＡの一部（２０ｍｇ／ｍｌ）を、暗所で、３７℃で、１２時間、０
．５Ｍリボースでインキュベートした。１２時間インキュベーション後、反応混
合液を、４℃で３６時間の期間かけて冷０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で透
析した（この透析は、遊離リボースのみならず、シッフ塩基中間体をも除去する
）。グリケーション工程のこの時点で、リベイテッドタンパク質を、アマドリ−
ＲＳＡとして区別し、そしてＡＧＥタンパク質と反応性のある抗体によって測定
される場合、抗原性ＡＧＥに対して陰性である（先に記述されるとおり、Ｒ６１
８、抗原は、グルコース修飾ＡＧＥ−ＲＮアーゼである）。その後、リベイテッ
ドタンパク質を、ａ）アマドリ−ＲＳＡ、ｂ）ＮａＢＨ４還元アマドリ−ＲＳＡ
、ｃ）ＡＧＥ−ＲＳＡのいずれかとして注入される部分に分割される。
【０１４８】 アマドリ−ＲＳＡとして注入されるべきリベイテッドタンパク質を、２４時間
、４℃で、冷ＰＢＳに簡単に透析する。０．２Ｍリン酸ナトリウム中のアマドリ
−ＲＳＡの一部を、ＮａＢＨ４で還元して、ＮａＢＨ４還元アマドリ−ＲＳＡを
形成する。簡便に、ｍｇのタンパク質当たり５ｕＬのＮａＢＨ４保存液（０．１
ＭのＮａＯＨ中の１００ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、アリコート量を
還元し、３７℃で１時間インキュベートし、ＨＣｌで処置して、過剰のＮａＢＨ ４ を放出し、そしてその後、３６時間、４℃で、冷ＰＢＳ中で集約的に透析した
。３日間、糖の不在下でアマドリ−ＲＳＡを再インキュベートすることによって
、ＡＧＥ−ＲＳＡを形成した。その後、反応混合液を、２４時間４℃で、冷ＰＢ
Ｓで透析した。全ての溶液を濾過（２２ｕｍフィルタ）し、滅菌し、そしてカブ
トガニのアメーバ細胞溶解物アッセイ（Ｅ−トキセート、シグマケミカルズ（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））によって内毒素について監視し、そして注入
の時まで個々のアリコート量に分けて凍結（−７０℃）される前に、＜０．２ｎ
ｇ／ｍｌを含んだ。
、４℃で、冷ＰＢＳに簡単に透析する。０．２Ｍリン酸ナトリウム中のアマドリ
−ＲＳＡの一部を、ＮａＢＨ４で還元して、ＮａＢＨ４還元アマドリ−ＲＳＡを
形成する。簡便に、ｍｇのタンパク質当たり５ｕＬのＮａＢＨ４保存液（０．１
ＭのＮａＯＨ中の１００ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、アリコート量を
還元し、３７℃で１時間インキュベートし、ＨＣｌで処置して、過剰のＮａＢＨ ４ を放出し、そしてその後、３６時間、４℃で、冷ＰＢＳ中で集約的に透析した
。３日間、糖の不在下でアマドリ−ＲＳＡを再インキュベートすることによって
、ＡＧＥ−ＲＳＡを形成した。その後、反応混合液を、２４時間４℃で、冷ＰＢ
Ｓで透析した。全ての溶液を濾過（２２ｕｍフィルタ）し、滅菌し、そしてカブ
トガニのアメーバ細胞溶解物アッセイ（Ｅ−トキセート、シグマケミカルズ（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））によって内毒素について監視し、そして注入
の時まで個々のアリコート量に分けて凍結（−７０℃）される前に、＜０．２ｎ
ｇ／ｍｌを含んだ。
【０１４９】 動物研究 雄のスプレーグ−ドーリーラット（Ｓａｓｃｏ、１００ｇ）を使用した。１週
の適合期間の後、ラットを、代謝ゲージに入れて、注射の投与の前に、２日間、
２４時間尿標本を得た。その後、ラットを、実験および対照群に分け、そして生
理食塩水、修飾ＲＳＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）、アマドリ−ＲＳＡ（５０ｍｇ／ｋｇ
）、ＮａＢＨ４還元アマドリ−ＲＳＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）、またはＡＧＥ−ＲＳ
Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかと共に尾部静脈注射を付与した。
の適合期間の後、ラットを、代謝ゲージに入れて、注射の投与の前に、２日間、
２４時間尿標本を得た。その後、ラットを、実験および対照群に分け、そして生
理食塩水、修飾ＲＳＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）、アマドリ−ＲＳＡ（５０ｍｇ／ｋｇ
）、ＮａＢＨ４還元アマドリ−ＲＳＡ（５０ｍｇ／ｋｇ）、またはＡＧＥ−ＲＳ
Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかと共に尾部静脈注射を付与した。
【０１５０】 その後、アマドリ−ＲＳＡおよびＡＧＥ−ＲＳＡと共に注射したラットを、未
処置のまま、またはさらにアミノグアニジン（ＡＧ；２５ｍｇ／ｋｇ）、ピリド
キサミン（ＰＭ；２５ｍｇ／ｋｇ）、または飲料水を通してＡＧおよびＰＭ（各
々、１０ｍｇ／ｋｇ）の組合せのいずれかの投与によって処置した。ラットの体
重および水摂取を、投与量を調整するために毎週監視した。実験的研究の終結時
に、ラットを、代謝ゲージに入れて、動物を犠牲にする前に、２日間、２４時間
尿標本を得た。
処置のまま、またはさらにアミノグアニジン（ＡＧ；２５ｍｇ／ｋｇ）、ピリド
キサミン（ＰＭ；２５ｍｇ／ｋｇ）、または飲料水を通してＡＧおよびＰＭ（各
々、１０ｍｇ／ｋｇ）の組合せのいずれかの投与によって処置した。ラットの体
重および水摂取を、投与量を調整するために毎週監視した。実験的研究の終結時
に、ラットを、代謝ゲージに入れて、動物を犠牲にする前に、２日間、２４時間
尿標本を得た。
【０１５１】 尿サンプル中の総タンパク質を、バイオ−ラッドアッセイによって測定した。
尿中のアルブミンを、一次抗体（１／２０００）としてウサギ抗−ラット血清ア
ルブミン（カペル）を、そして二次抗体（１／２０００）としてヤギ抗−ラット
ＩｇＧ（シグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））使用する競合
的ＥＬＩＳＡによって測定した。グルコース、ケトン、比重、遮断、ｐＨ、タン
パク質、硝酸塩、および白血球についてマルチスティックス（Ｍｕｌｔｉｓｔｉ
ｘ）８ＳＧ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で尿を試験した。ある種
のタンパク質以外に際立ったものは検出されなかった。
尿中のアルブミンを、一次抗体（１／２０００）としてウサギ抗−ラット血清ア
ルブミン（カペル）を、そして二次抗体（１／２０００）としてヤギ抗−ラット
ＩｇＧ（シグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））使用する競合
的ＥＬＩＳＡによって測定した。グルコース、ケトン、比重、遮断、ｐＨ、タン
パク質、硝酸塩、および白血球についてマルチスティックス（Ｍｕｌｔｉｓｔｉ
ｘ）８ＳＧ（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で尿を試験した。ある種
のタンパク質以外に際立ったものは検出されなかった。
【０１５２】 ベックマンのクレアチニン分析装置ＩＩを用いて、クレアチミン測定を行った
。終結の前の心臓穿刺によって、血液サンプルを収集し、そしてクレアチニンク
リアランス、血中グルコース（グルコースオキシダーゼ、シグマケミカルズ（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、フルクトサミン（ニトロブルーテトラゾリ
ウム、シグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、およびグリケ
ート化Ｈｂ（カラム、ピアースケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
））の測定に使用した。動脈、心臓、両方の腎臓およびラットの尾部を、目視で
調べ、その後、心臓の右心室を通して生理食塩水で灌流した後にすばやく除去し
た。１つの腎臓、動脈、ラット尾部、および心臓の下の２／３を、すばやく凍結
し、そしてその後、−７０℃で恒久的に保存した。すばやく凍結されるべき両方
の末端（皮質）を除去することによって、他方の腎臓を切断し、そして腎臓の残
りの部分を、３つに切断し、そして２つの部分を、中性の緩衝ホルマリンに入れ
、そして残りの第三の部分を刻み、そして２．５％グルタルアルデヒド／２％パ
ラホルムアルデヒドに入れた。
。終結の前の心臓穿刺によって、血液サンプルを収集し、そしてクレアチニンク
リアランス、血中グルコース（グルコースオキシダーゼ、シグマケミカルズ（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、フルクトサミン（ニトロブルーテトラゾリ
ウム、シグマケミカルズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、およびグリケ
ート化Ｈｂ（カラム、ピアースケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
））の測定に使用した。動脈、心臓、両方の腎臓およびラットの尾部を、目視で
調べ、その後、心臓の右心室を通して生理食塩水で灌流した後にすばやく除去し
た。１つの腎臓、動脈、ラット尾部、および心臓の下の２／３を、すばやく凍結
し、そしてその後、−７０℃で恒久的に保存した。すばやく凍結されるべき両方
の末端（皮質）を除去することによって、他方の腎臓を切断し、そして腎臓の残
りの部分を、３つに切断し、そして２つの部分を、中性の緩衝ホルマリンに入れ
、そして残りの第三の部分を刻み、そして２．５％グルタルアルデヒド／２％パ
ラホルムアルデヒドに入れた。
【０１５３】 光学顕微鏡 生理食塩水で灌流した後、腎臓切片を、氷冷１０％中性緩衝ホルマリンで固定
した。すべてのラット群（群当たりｎ＝４）から得られるパラフィン埋設組織切
片を、ハリーのアルミヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ペロン酸／シ
ッフ試薬（ＰＡＳ）、および組織学的実験のためのアルシアンブルー（ｐＨ１．
０およびｐＨ２．５）染料を用いて染色するために加工した。アルシアンブルー
切片を、盲形態で、２名の研究者によって等級分けした。
した。すべてのラット群（群当たりｎ＝４）から得られるパラフィン埋設組織切
片を、ハリーのアルミヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ペロン酸／シ
ッフ試薬（ＰＡＳ）、および組織学的実験のためのアルシアンブルー（ｐＨ１．
０およびｐＨ２．５）染料を用いて染色するために加工した。アルシアンブルー
切片を、盲形態で、２名の研究者によって等級分けした。
【０１５４】 電子顕微鏡 ２．５％グルタルアルデヒド／２％パラホルムアルデヒド（０．１Ｍナトリウ
ムカコジル酸塩、ｐＨ７．４）で組織を固定し、緩衝オズミウムテトラオキシド
（１．０％）中で1時間、後固定し、1時間、０．５％酢酸ウラニルで予備染色し
、そしてエファポキシ樹脂で埋設させた。電子顕微鏡によって、超薄切片を試験
した。
ムカコジル酸塩、ｐＨ７．４）で組織を固定し、緩衝オズミウムテトラオキシド
（１．０％）中で1時間、後固定し、1時間、０．５％酢酸ウラニルで予備染色し
、そしてエファポキシ樹脂で埋設させた。電子顕微鏡によって、超薄切片を試験
した。
【０１５５】 免疫蛍光 パラフィン埋設切片を脱パラフィン化し、そしてその後、３０分間、室温でＰ
ＢＳ中の１０％ヤギ血清で遮断した。その後、切片を、2時間、３７℃で、アフ
ィニティ精製したポリクローナルラット抗−ＡＧＥ抗体またはポリクローナルヒ
ツジ抗−ラット血清アルブミン抗体（カペル）のいずれかである一次抗体でイン
キュベートした。その後、切片を、３０分間、ＰＢＳで洗浄し、そして３７℃で
、１時間、アフィニティ精製したＦＩＴＣ−ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二
重染色グレード（ジメド）またはローダミン−ウサギ抗−ヒツジＩｇＧ（全）（
カペル）のいずれかである二次抗体でインキュベートした。その後、切片を、３
０分間、暗所でＰＢＳで洗浄し、免疫細胞化学のための水性積層媒体（バイオメ
ダ）に乗せ、スライドカバーをかけた。切片を、盲形態で等級分けした。腎臓切
片を、腎臓の末端の周囲の５つの領域における糸球体染色の数および強度によっ
て評価した。０−３の等級付けシステムで、１００個の糸球体当たりの免疫蛍光
スコアについてのスコアを正常化させた。
ＢＳ中の１０％ヤギ血清で遮断した。その後、切片を、2時間、３７℃で、アフ
ィニティ精製したポリクローナルラット抗−ＡＧＥ抗体またはポリクローナルヒ
ツジ抗−ラット血清アルブミン抗体（カペル）のいずれかである一次抗体でイン
キュベートした。その後、切片を、３０分間、ＰＢＳで洗浄し、そして３７℃で
、１時間、アフィニティ精製したＦＩＴＣ−ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二
重染色グレード（ジメド）またはローダミン−ウサギ抗−ヒツジＩｇＧ（全）（
カペル）のいずれかである二次抗体でインキュベートした。その後、切片を、３
０分間、暗所でＰＢＳで洗浄し、免疫細胞化学のための水性積層媒体（バイオメ
ダ）に乗せ、スライドカバーをかけた。切片を、盲形態で等級分けした。腎臓切
片を、腎臓の末端の周囲の５つの領域における糸球体染色の数および強度によっ
て評価した。０−３の等級付けシステムで、１００個の糸球体当たりの免疫蛍光
スコアについてのスコアを正常化させた。
【０１５６】 ＡＧＥタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製 ｐＨ７．４および３７℃で０．０５％ナトリウムアジ化合物を含有する０．４
Ｍリン酸中の１．５Ｍグルコースを使用して、６０−９０日間、１５ｍｌ中の１
．６ｇタンパク質でのＢＳＡ（Ｒ４７９抗体）またはＲｎアーゼ（Ｒ６１８抗体
）のグリケーションによって免疫原を作製した。フロイントのアジュバント中の
１ｍｇ／ｍｌのグリケート化タンパク質を含有する１ｍｌ溶液の皮下投与によっ
て、８−１２週の雄のニュージーランド白色ウサギを免疫化した。一次注入は、
完全アジュバントを使用し、そして三回の追加免疫投与を、不完全アジュバント
を用いて、３週間の間隔で行った。ウサギを、最後の追加免疫投与の後に三週間
放血させた。凝固全血の遠心分離によって、血清を収集した。抗体は、ＡＧＥ特
異的であり、生来のタンパク質と、またはアマドリ中間体と反応性がなかった。
Ｍリン酸中の１．５Ｍグルコースを使用して、６０−９０日間、１５ｍｌ中の１
．６ｇタンパク質でのＢＳＡ（Ｒ４７９抗体）またはＲｎアーゼ（Ｒ６１８抗体
）のグリケーションによって免疫原を作製した。フロイントのアジュバント中の
１ｍｇ／ｍｌのグリケート化タンパク質を含有する１ｍｌ溶液の皮下投与によっ
て、８−１２週の雄のニュージーランド白色ウサギを免疫化した。一次注入は、
完全アジュバントを使用し、そして三回の追加免疫投与を、不完全アジュバント
を用いて、３週間の間隔で行った。ウサギを、最後の追加免疫投与の後に三週間
放血させた。凝固全血の遠心分離によって、血清を収集した。抗体は、ＡＧＥ特
異的であり、生来のタンパク質と、またはアマドリ中間体と反応性がなかった。
【０１５７】 ＡＧＥ産物のＥＬＩＳＡ検出 Ｅｎｇｖａｌｌ（２１）の一般法を、ＥＬＩＳＡを行うのに使用した。グリケー
ト化タンパク質サンプルを、ｐＨ９．５から９．７までの０．１Ｍ炭酸ナトリウ
ム緩衝液中のおよそ１．５ｕｇ／ｍｌに希釈した。タンパク質を一夜、室温で、
２００ｕｌのタンパク質溶液をピペットで各ウェルに分ける（約．３ｕｇ／ウェ
ル）ことによって、９６穴ポリスチレンプレートに被覆した。被覆後、過剰のタ
ンパク質を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する生理食塩溶液を用いてウェ
ルから洗い流した。その後、ウェルを、２時間、３７℃で、炭酸緩衝液中の２０
０ｕｌの１％カゼインで遮断し、続いて洗浄した。ウサギ抗−ＡＧＥ抗体を、イ
ンキュベーション緩衝液中の１：３５０の力価で希釈し、そして１時間、３７℃
でインキュベートし、そして続いて洗浄した。バックグランドの読み取りを最小
限にするために、グリケート化ＲＳＡを検出するのに使用された抗体Ｒ６１８は
、グリケート化Ｒｎアーゼに対する免疫化によって発生された。ウサギＩｇＧに
対するアルカリ性ホスファターゼ接合抗体を、１：２０００の力価で二次抗体と
して添加し、そして１時間、３７℃でインキュベートし、続いて洗浄した。ｐ−
ニトロフェノレートを、ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ＭＲ４０００マイク
ロプレート読み取り装置で４１０ｎｍで監視する。
ト化タンパク質サンプルを、ｐＨ９．５から９．７までの０．１Ｍ炭酸ナトリウ
ム緩衝液中のおよそ１．５ｕｇ／ｍｌに希釈した。タンパク質を一夜、室温で、
２００ｕｌのタンパク質溶液をピペットで各ウェルに分ける（約．３ｕｇ／ウェ
ル）ことによって、９６穴ポリスチレンプレートに被覆した。被覆後、過剰のタ
ンパク質を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する生理食塩溶液を用いてウェ
ルから洗い流した。その後、ウェルを、２時間、３７℃で、炭酸緩衝液中の２０
０ｕｌの１％カゼインで遮断し、続いて洗浄した。ウサギ抗−ＡＧＥ抗体を、イ
ンキュベーション緩衝液中の１：３５０の力価で希釈し、そして１時間、３７℃
でインキュベートし、そして続いて洗浄した。バックグランドの読み取りを最小
限にするために、グリケート化ＲＳＡを検出するのに使用された抗体Ｒ６１８は
、グリケート化Ｒｎアーゼに対する免疫化によって発生された。ウサギＩｇＧに
対するアルカリ性ホスファターゼ接合抗体を、１：２０００の力価で二次抗体と
して添加し、そして１時間、３７℃でインキュベートし、続いて洗浄した。ｐ−
ニトロフェノレートを、ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ＭＲ４０００マイク
ロプレート読み取り装置で４１０ｎｍで監視する。
【０１５８】 結果 この研究におけるラットは、処置で生き残り、そして任意の総計病理学の外の
徴候は示さなかった。ラットの内の数匹は、ある程度の小さな体重変化および尾
部かさぶたを示した。
徴候は示さなかった。ラットの内の数匹は、ある程度の小さな体重変化および尾
部かさぶたを示した。
【０１５９】 ＰＡＳおよびＨ＆Ｅ染料との腎臓切片の当初のスクリーニングは、任意の明ら
かな変化を示さず、そしていくつかのＥＭ切片は、糸球体の基底膜（ＧＢＭ）に
おける任意の総計変化を示さなかった。しかし、アルシアンブルー染色により、
差異を加えることが知見された。アルシアンブルー染色は、組織中の負に負荷さ
れた基に向けられ、そして染色のｐＨにおける変化を介して選択的にできる。ｐ
Ｈ１．０で、アルシアンブルーは、ムコ多糖類について選択性であり、そしてｐ
Ｈ２．５で、グルコロン基を検出する。したがって、負の負荷は、染色のｐＨに
よって検出される。
かな変化を示さず、そしていくつかのＥＭ切片は、糸球体の基底膜（ＧＢＭ）に
おける任意の総計変化を示さなかった。しかし、アルシアンブルー染色により、
差異を加えることが知見された。アルシアンブルー染色は、組織中の負に負荷さ
れた基に向けられ、そして染色のｐＨにおける変化を介して選択的にできる。ｐ
Ｈ１．０で、アルシアンブルーは、ムコ多糖類について選択性であり、そしてｐ
Ｈ２．５で、グルコロン基を検出する。したがって、負の負荷は、染色のｐＨに
よって検出される。
【０１６０】 ｐＨ２．５で、アルシアンブルー染色は、アマドリ−ＲＳＡ（ｐ＜０．０５＞
およびＡＧＥ−ＲＳＡ（ｐ＞０．０１）が、対照レベルを越える酸性グリコサミ
ノグリカン（ＧＡＧ）についての染色が増大したことを誘導した（図３３）。Ａ
ＧＥ−ＲＳＡおよびアマドリ−ＲＳＡの両方について、ピリドキサミン（ＰＭ）
を用いた処置は、染色における増加を防止した（対照と比較したときｐ＜０．０
５）。対照的に、各々、１０ｍｇ／ｋｇでアミノグアニジン（ＡＧ）または組合
せたＰＭおよびＡＧを用いた処置は、増加を防止しなかった。
およびＡＧＥ−ＲＳＡ（ｐ＞０．０１）が、対照レベルを越える酸性グリコサミ
ノグリカン（ＧＡＧ）についての染色が増大したことを誘導した（図３３）。Ａ
ＧＥ−ＲＳＡおよびアマドリ−ＲＳＡの両方について、ピリドキサミン（ＰＭ）
を用いた処置は、染色における増加を防止した（対照と比較したときｐ＜０．０
５）。対照的に、各々、１０ｍｇ／ｋｇでアミノグアニジン（ＡＧ）または組合
せたＰＭおよびＡＧを用いた処置は、増加を防止しなかった。
【０１６１】 ｐＨ１．０で、アルシアンブルー染色は、ＡＧＥ−ＲＳＡによって明らかに減
少された（ｐ＜０．００１）（図３４）。しかし、アマドリ−ＲＳＡに明らかな
差異は見られなかった。微弱な染色のため、ＰＭ、ＡＧおよび組合わせたを用い
た処置は、定量され得なかった。
少された（ｐ＜０．００１）（図３４）。しかし、アマドリ−ＲＳＡに明らかな
差異は見られなかった。微弱な染色のため、ＰＭ、ＡＧおよび組合わせたを用い
た処置は、定量され得なかった。
【０１６２】 ＲＳＡについての免疫蛍光の糸球体染色は、アマドリ−ＲＳＡおよびＡＧＥ−
ＲＳＡ注入した動物との上昇した染色を示した（図３５）。この影響における明
らかな減少は、ＰＭで処置されたラットで見られ、そしてＡＧまたは組合わせた
ＡＧおよびＰＭでは見られなかった。
ＲＳＡ注入した動物との上昇した染色を示した（図３５）。この影響における明
らかな減少は、ＰＭで処置されたラットで見られ、そしてＡＧまたは組合わせた
ＡＧおよびＰＭでは見られなかった。
【０１６３】 硫酸ヘパリンプロテオグリカンコアタンパク質についての免疫蛍光の糸球体染
色は、アマドリ−ＲＳＡおよびＡＧＥ−ＲＳＡを注射した動物とわずかに減少し
た染色を示したが、実質的には明らかでなかった（図３６）。この影響の減少は
、ＰＭで処置されたラットで見られ、そしてＡＧまたは組合せたＡＧおよびＰＭ
では見られなかった。しかし、硫酸ヘパリンプロテオグリカン側鎖についての免
疫蛍光の糸球体染色は、アマドリ−ＲＳＡおよびＡＧＥ−ＲＳＡを注射した動物
（図３７）と非常に減少した染色を示した。この影響の明らかな減少は、ＰＭで
処置したラットで見られ、そしてＡＧまたは組合されたＡＧおよびＰＭで見られ
なかった。
色は、アマドリ−ＲＳＡおよびＡＧＥ−ＲＳＡを注射した動物とわずかに減少し
た染色を示したが、実質的には明らかでなかった（図３６）。この影響の減少は
、ＰＭで処置されたラットで見られ、そしてＡＧまたは組合せたＡＧおよびＰＭ
では見られなかった。しかし、硫酸ヘパリンプロテオグリカン側鎖についての免
疫蛍光の糸球体染色は、アマドリ−ＲＳＡおよびＡＧＥ−ＲＳＡを注射した動物
（図３７）と非常に減少した染色を示した。この影響の明らかな減少は、ＰＭで
処置したラットで見られ、そしてＡＧまたは組合されたＡＧおよびＰＭで見られ
なかった。
【０１６４】 盲等級分けによる平均糸球体容積の分析は、アマドリ−ＲＳＡおよびＡＧＥ−
ＲＳＡが、平均糸球体容積における明らかな増大を引き起こすことを示した（図
３８）。この影響の明らかな減少は、ＰＭとのラットの処置で見られた。各々１
０ｍｇ／ｋｇで、ＡＧまたは組合せたＰＭでの処置で影響は見られなかった。
ＲＳＡが、平均糸球体容積における明らかな増大を引き起こすことを示した（図
３８）。この影響の明らかな減少は、ＰＭとのラットの処置で見られた。各々１
０ｍｇ／ｋｇで、ＡＧまたは組合せたＰＭでの処置で影響は見られなかった。
【０１６５】 実施例６ 高血糖症に関連した高脂血症の阻害 ＡＧＥの形成および糖尿病性ネフロパシーの発生を阻害する努力で、我々は、
ストレプトゾトシンで誘導した糖尿病ラットをピリドキサミンで処置した。我々
は、ここで、アルブミン尿症、蛋白尿症、および血漿クレアチニンにおけるそれ
の影響によって測定されるときに、ピリドキサミンが、糖尿病性ラットにおける
ネフロパシーの発生を阻害し、血漿コレステロールおよびトリグリセリドにおけ
る増大の阻害によって測定するときに、糖尿病性ラットでの異脂血症を修正し、
そして血漿乳酸塩対ピルビン酸塩比における変化によって測定されるとおり、低
酸素症または偽低酸素症のいずれかから生じる酸化還元不均衡を補正することを
報告する。比較できる用量で、ピリドキサミンは、糖尿病性ネフロパシーに対す
る保護の上でプロトタイプのＡＧＥ−阻害剤アミノグアニジンよりいっそう有効
であり、糖尿病の異脂血症および代謝の異常性の逆転であった。ここに使用され
る場合、「糖尿病性哺乳類」は、現に糖尿病である哺乳類、およびグルコースに
寛容でないものおよび／またはそれらの血中糖濃度に関係なく、膵臓の不十分さ
を示すものを包含する。我々は、ＡＧＥ阻害剤が両方とも、糖尿病性ネフロパシ
ーに対して保護し、そして脂質および炭化水素化学および代謝における広範な効
果を発揮すると結論づける。
ストレプトゾトシンで誘導した糖尿病ラットをピリドキサミンで処置した。我々
は、ここで、アルブミン尿症、蛋白尿症、および血漿クレアチニンにおけるそれ
の影響によって測定されるときに、ピリドキサミンが、糖尿病性ラットにおける
ネフロパシーの発生を阻害し、血漿コレステロールおよびトリグリセリドにおけ
る増大の阻害によって測定するときに、糖尿病性ラットでの異脂血症を修正し、
そして血漿乳酸塩対ピルビン酸塩比における変化によって測定されるとおり、低
酸素症または偽低酸素症のいずれかから生じる酸化還元不均衡を補正することを
報告する。比較できる用量で、ピリドキサミンは、糖尿病性ネフロパシーに対す
る保護の上でプロトタイプのＡＧＥ−阻害剤アミノグアニジンよりいっそう有効
であり、糖尿病の異脂血症および代謝の異常性の逆転であった。ここに使用され
る場合、「糖尿病性哺乳類」は、現に糖尿病である哺乳類、およびグルコースに
寛容でないものおよび／またはそれらの血中糖濃度に関係なく、膵臓の不十分さ
を示すものを包含する。我々は、ＡＧＥ阻害剤が両方とも、糖尿病性ネフロパシ
ーに対して保護し、そして脂質および炭化水素化学および代謝における広範な効
果を発揮すると結論づける。
【０１６６】 導入 この研究の目的は、ＡＧＥの形成におけるＰＭおよびＡＧの効果および糖尿病
性ラットにおけるネフロパシーの発生を評価することである。３０週の実験の終
わりに、我々は、糖尿病性ラットから得た血漿が、対照ラットからのものより目
視でいっそう脂ぎっていること、そしてＰＭ−およびＡＧ−処置糖尿病性動物の
両方で脂血症における減少があるようであることを観察した。我々は、ＰＭおよ
びＡＧの両方が、ＳＴＺ−糖尿病性ラットにおけるネフロパシーの発生を阻止し
たのみならず、糖尿病性ラットにおける血漿コレステロールおよびトリグリセリ
ドにおける増大をも阻害し、そして糖尿病での改変された状態の指標である血漿
ラクトースおよびラクトース／ピルビン酸塩比における増加を逆転させたことを
報告する。我々は、ＡＧＥの形成における、糖尿病性動物でのコラーゲンの増加
した化学的修飾の起点および基質および酸化的ストレスの相対的重要さ、そして
脂質対炭化水素についても検討した。我々の結果は、ＰＭが、糖尿病におけるネ
フロパシーおよび血管疾病の両方の発生を阻害する有効な治療剤であり得ること
を示唆する。
性ラットにおけるネフロパシーの発生を評価することである。３０週の実験の終
わりに、我々は、糖尿病性ラットから得た血漿が、対照ラットからのものより目
視でいっそう脂ぎっていること、そしてＰＭ−およびＡＧ−処置糖尿病性動物の
両方で脂血症における減少があるようであることを観察した。我々は、ＰＭおよ
びＡＧの両方が、ＳＴＺ−糖尿病性ラットにおけるネフロパシーの発生を阻止し
たのみならず、糖尿病性ラットにおける血漿コレステロールおよびトリグリセリ
ドにおける増大をも阻害し、そして糖尿病での改変された状態の指標である血漿
ラクトースおよびラクトース／ピルビン酸塩比における増加を逆転させたことを
報告する。我々は、ＡＧＥの形成における、糖尿病性動物でのコラーゲンの増加
した化学的修飾の起点および基質および酸化的ストレスの相対的重要さ、そして
脂質対炭化水素についても検討した。我々の結果は、ＰＭが、糖尿病におけるネ
フロパシーおよび血管疾病の両方の発生を阻害する有効な治療剤であり得ること
を示唆する。
【０１６７】 材料および方法 特に指示されない限り、試薬および酵素は、セントルイスのシグマケミカル（
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，）から購入した。
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，）から購入した。
【０１６８】 実験の設計 ＳＴＺの注入により糖尿病になった雌のスプレーグ−ドーリーラットでこれら
の実験を行った。糖尿病は、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中の４５ｍ
ｇ／ｋｇのＳＴＺの単回の尾部静脈注射によって誘導された。対照動物は、緩衝
液のみで偽注射した。糖尿病は、ＳＴＺ注射の後、２および３日で、血中グルコ
ース濃度を測定することによって確認された。１６ｍＭより高い血漿グルコース
を示す動物は、糖尿病と分類された。糖尿病性ラットを、未処置糖尿病群（ｎ＝
１２）および飲料水中に１ｇ／ＬでＰＭ（ｎ＝１３）またはＡＧ（ｎ＝１２）の
いずれかを受ける２つの糖尿病処置群に任意に分けた。２つの非糖尿病対照群が
含まれ、一方は、処置を受けず（ｎ＝１３）、他方は、飲料水中に２ｇ／ＬでＰ
Ｍ（ＨＣｌ）２を受ける（ｎ＝１２）；ＰＭ処置対照群におけるＰＭの用量が高
いほど、糖尿病動物に比較して、非糖尿病の水摂取が低いことを部分的に補償す
るように設計した。全ての動物を、各々１２時間の明暗サイクルで個々に収容し
、そして食物および水に自由に接触させた。体重を維持するため、および高血糖
症を制限するために、糖尿病動物は、３ＩＵのウルトラレンテインスリン（Ｈｕ
ｍｕｌｉｎ Ｕ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）を週当たり三回受けた。これは、体重に
おける増加のために調整する１５週の後に５ＩＵに増加された。
の実験を行った。糖尿病は、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中の４５ｍ
ｇ／ｋｇのＳＴＺの単回の尾部静脈注射によって誘導された。対照動物は、緩衝
液のみで偽注射した。糖尿病は、ＳＴＺ注射の後、２および３日で、血中グルコ
ース濃度を測定することによって確認された。１６ｍＭより高い血漿グルコース
を示す動物は、糖尿病と分類された。糖尿病性ラットを、未処置糖尿病群（ｎ＝
１２）および飲料水中に１ｇ／ＬでＰＭ（ｎ＝１３）またはＡＧ（ｎ＝１２）の
いずれかを受ける２つの糖尿病処置群に任意に分けた。２つの非糖尿病対照群が
含まれ、一方は、処置を受けず（ｎ＝１３）、他方は、飲料水中に２ｇ／ＬでＰ
Ｍ（ＨＣｌ）２を受ける（ｎ＝１２）；ＰＭ処置対照群におけるＰＭの用量が高
いほど、糖尿病動物に比較して、非糖尿病の水摂取が低いことを部分的に補償す
るように設計した。全ての動物を、各々１２時間の明暗サイクルで個々に収容し
、そして食物および水に自由に接触させた。体重を維持するため、および高血糖
症を制限するために、糖尿病動物は、３ＩＵのウルトラレンテインスリン（Ｈｕ
ｍｕｌｉｎ Ｕ、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）を週当たり三回受けた。これは、体重に
おける増加のために調整する１５週の後に５ＩＵに増加された。
【０１６９】 ネフロパシー ネフロパシーの進行は、尿中のアルブミンおよび総タンパク質の、そして血漿
中のクレアチニンの月毎の測定によって評価された。尿測定のために、ラットを
、代謝ラットケージ（Ｎｅｌｇｅｎｅ、Ｎｅｌｇｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｈ
ｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に２４時間収容した。数滴のトルエンを尿収集ビーカーに添
加して、微生物の成長を防止した。ウォラックビクターモデル（Ｗａｌｌａｃ
Ｖｉｃｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ）１４２０多標識プレート読み取り装置（Ｗａｌｌａ
ｃ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ．）を用いた最近の方法のマイ
クロプレート適用によって、血漿および尿中のタンパク質および代謝産物につい
ての全アッセイを行った。対照実験は、ＰＭもＡＧもいずれも、血漿または尿中
に存在する濃度で、尿タンパク質を除いて、アッセイのいずれかに干渉を引き起
こさないことを示した（下記参照）。
中のクレアチニンの月毎の測定によって評価された。尿測定のために、ラットを
、代謝ラットケージ（Ｎｅｌｇｅｎｅ、Ｎｅｌｇｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｈ
ｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に２４時間収容した。数滴のトルエンを尿収集ビーカーに添
加して、微生物の成長を防止した。ウォラックビクターモデル（Ｗａｌｌａｃ
Ｖｉｃｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ）１４２０多標識プレート読み取り装置（Ｗａｌｌａ
ｃ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ．）を用いた最近の方法のマイ
クロプレート適用によって、血漿および尿中のタンパク質および代謝産物につい
ての全アッセイを行った。対照実験は、ＰＭもＡＧもいずれも、血漿または尿中
に存在する濃度で、尿タンパク質を除いて、アッセイのいずれかに干渉を引き起
こさないことを示した（下記参照）。
【０１７０】 尿アルブミンは、ＥＬＩＳＡアッセイによって定量された。ラットアルブミン
およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗−ウサギＩｇ
Ｅに対するウサギ抗血清を、カリフォルニア州コスタメサのアＩＣＮ Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入した。簡潔には、ウ
ェルを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．４）中の５０ｎｇのラット
アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で、一夜、４℃で被覆した。競合
段階で、１００μＬの標準または希釈尿サンプルを、マイクロプレート振蘯装置
上で、室温で３時間、１００μＬのウサギ抗−ラットアルブミン抗血清とインキ
ュベートした。洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合ヤギ抗−ウサ
ギＩｇＧ（２００μＬ）を、振蘯させながら、２５℃で1時間使用し、そしてプ
レートを、室温で４５分間、２００μＬのＡＢＴＳ−試薬（２，２’−アジノ−
ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）で展開させ、そして４０
５ｎｍで吸光度を測定した。
およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗−ウサギＩｇ
Ｅに対するウサギ抗血清を、カリフォルニア州コスタメサのアＩＣＮ Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入した。簡潔には、ウ
ェルを、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．４）中の５０ｎｇのラット
アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で、一夜、４℃で被覆した。競合
段階で、１００μＬの標準または希釈尿サンプルを、マイクロプレート振蘯装置
上で、室温で３時間、１００μＬのウサギ抗−ラットアルブミン抗血清とインキ
ュベートした。洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合ヤギ抗−ウサ
ギＩｇＧ（２００μＬ）を、振蘯させながら、２５℃で1時間使用し、そしてプ
レートを、室温で４５分間、２００μＬのＡＢＴＳ−試薬（２，２’−アジノ−
ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）で展開させ、そして４０
５ｎｍで吸光度を測定した。
【０１７１】 総尿タンパク質を、シグママイクロプロテイン（Ｓｉｇｍａ Ｍｉｃｒｏｐｒ
ｏｔｅｉｎ）−ＰＲキットを用いた実験の終わりに測定した。簡潔には、サンプ
ルおよび標準のアリコート量を、ピロガロールレッドおよびナトリウムモリブデ
ートを含有する試薬溶液に添加し、３７℃で３分間インキュベートし、そして５
７０ｎｍで吸光度を測定した。サンプルのＰＭまたはＡＧ定数についての修正（
＜１０％）を行った。シグマキット番号５５５−Ａを用い、ジャフェのピクリン
酸手段によって、血漿クレアチニン濃度を測定した。簡潔には、２０μｌのサン
プルまたは標準を、２００μＬのピクリン酸と混合した。４９０ｎｍでの吸光度
を、酸試薬を添加する前後に読み取った。
ｏｔｅｉｎ）−ＰＲキットを用いた実験の終わりに測定した。簡潔には、サンプ
ルおよび標準のアリコート量を、ピロガロールレッドおよびナトリウムモリブデ
ートを含有する試薬溶液に添加し、３７℃で３分間インキュベートし、そして５
７０ｎｍで吸光度を測定した。サンプルのＰＭまたはＡＧ定数についての修正（
＜１０％）を行った。シグマキット番号５５５−Ａを用い、ジャフェのピクリン
酸手段によって、血漿クレアチニン濃度を測定した。簡潔には、２０μｌのサン
プルまたは標準を、２００μＬのピクリン酸と混合した。４９０ｎｍでの吸光度
を、酸試薬を添加する前後に読み取った。
【０１７２】 血漿中のコレステロール、ゴリグリセリド遊離脂肪酸およびグリセロール 両方のアッセイのためのカリブレーターを含めて総コレステロール（番号３５
２）および総トリグリセリド（番号３７、ＧＰＯ帯）のためのシグマキットを用
いた酵素的、色測定最終点アッセイによって、総コレステロールおよびグリセリ
ドを測定した。Ｎｏｍａら（１９７３年）により記述されるとおり、有機溶解性
銅複合体として遊離脂肪酸を測定した（Ｎｏｍａら、１９９３年、Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ ４３：３１７−３２０）。Ｂｅｒｇｍａｎによって記述され
るとおり、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３−リン酸デヒドロゲナー
ゼを用いた分光測定酵素的アッセイによって、グリセロールを測定した（Ｂｅｒ
ｇｍａｎ、１９７４年、グリセロール−リン酸デヒドロゲナーゼのアッセイ。Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｏｌ．３におけ
るＢｅｒｇｍａｎ，Ｈ．Ｖ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ。１４
０４−１４０８）。
２）および総トリグリセリド（番号３７、ＧＰＯ帯）のためのシグマキットを用
いた酵素的、色測定最終点アッセイによって、総コレステロールおよびグリセリ
ドを測定した。Ｎｏｍａら（１９７３年）により記述されるとおり、有機溶解性
銅複合体として遊離脂肪酸を測定した（Ｎｏｍａら、１９９３年、Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ ４３：３１７−３２０）。Ｂｅｒｇｍａｎによって記述され
るとおり、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３−リン酸デヒドロゲナー
ゼを用いた分光測定酵素的アッセイによって、グリセロールを測定した（Ｂｅｒ
ｇｍａｎ、１９７４年、グリセロール−リン酸デヒドロゲナーゼのアッセイ。Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｖｏｌ．３におけ
るＢｅｒｇｍａｎ，Ｈ．Ｖ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ。１４
０４−１４０８）。
【０１７３】 乳酸塩、ピルビン酸塩、およびケトン体 ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋結合アッセイ（それぞれ、シグマキット番号８２６、７２
６および３１０）を用いて、乳酸塩、ピルビン酸塩およびβ−ヒドロキシブチラ
ートを、分光光学的に測定した。ＬＩらにより記述されるとおり、アセト酢酸リ
チウム塩、β−ヒドロキシブチラートデヒドロゲナーゼＩＩ型およびＮＡＤＨを
用いたβ−ヒドロキシブチラートアッセイの逆転によって、アセト酢酸を測定し
た（Ｌｉら、１９８０年、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：１７１３−１７１７）。
６および３１０）を用いて、乳酸塩、ピルビン酸塩およびβ−ヒドロキシブチラ
ートを、分光光学的に測定した。ＬＩらにより記述されるとおり、アセト酢酸リ
チウム塩、β−ヒドロキシブチラートデヒドロゲナーゼＩＩ型およびＮＡＤＨを
用いたβ−ヒドロキシブチラートアッセイの逆転によって、アセト酢酸を測定し
た（Ｌｉら、１９８０年、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：１７１３−１７１７）。
【０１７４】 腎臓の形態測定 右腎臓の１側面を、一組の平行カミソリ板を使用して、２ミリメートル厚のス
ライスに切った。そのスライスの一方の半分を、先入観なしに全身で選択し、ホ
ルマリンに入れた。これらのスライスを、一連のアルコールを通して脱水し、そ
してＪＢ−４ＴＭ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏ
ｎ．ＰＡ）に埋設した。各ＪＢ−４ＴＭブロックから、５マイクロメートル厚の
切片を切取り、トルイジンブルーで染色し、そして糸球体容積の測定のために使
用した。非選択スライスから、皮質の小さなブロックを、ミロニグ緩衝液中の２
．５％グルタルデヒド中で固定し、一連のアルコールを通して、ポリベッド（Ｐ
ｏｌｙＢｅｄ）８１２登録商標（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｒ
ｒｉｎｇｔｏｎ．ＰＡ）に埋設した。先入観なしに糸球体を選択するために、１
マイクロメートル厚の切片を、ポリベッド（ＰｏｌｙＢｅｄ）８１２登録商標ブ
ロックから切取り、そしてトルイジンブルーで染色した。真中の糸球体を、電子
顕微鏡のために選択した。レイチャートウルトラカット（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕ
ｌｔｒａｃｕｔ）Ｅウルトラマイクロトムを用いて銀−金切片を切取り、スロッ
ト格子に載せ、そして酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。ＪＥＯＬ１０
０ＣＬ電子顕微鏡を用いて、画像を得た。各動物から得られる３つの糸球体を、
電子顕微鏡パラメータを測定するために使用した。
ライスに切った。そのスライスの一方の半分を、先入観なしに全身で選択し、ホ
ルマリンに入れた。これらのスライスを、一連のアルコールを通して脱水し、そ
してＪＢ−４ＴＭ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏ
ｎ．ＰＡ）に埋設した。各ＪＢ−４ＴＭブロックから、５マイクロメートル厚の
切片を切取り、トルイジンブルーで染色し、そして糸球体容積の測定のために使
用した。非選択スライスから、皮質の小さなブロックを、ミロニグ緩衝液中の２
．５％グルタルデヒド中で固定し、一連のアルコールを通して、ポリベッド（Ｐ
ｏｌｙＢｅｄ）８１２登録商標（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｒ
ｒｉｎｇｔｏｎ．ＰＡ）に埋設した。先入観なしに糸球体を選択するために、１
マイクロメートル厚の切片を、ポリベッド（ＰｏｌｙＢｅｄ）８１２登録商標ブ
ロックから切取り、そしてトルイジンブルーで染色した。真中の糸球体を、電子
顕微鏡のために選択した。レイチャートウルトラカット（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕ
ｌｔｒａｃｕｔ）Ｅウルトラマイクロトムを用いて銀−金切片を切取り、スロッ
ト格子に載せ、そして酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。ＪＥＯＬ１０
０ＣＬ電子顕微鏡を用いて、画像を得た。各動物から得られる３つの糸球体を、
電子顕微鏡パラメータを測定するために使用した。
【０１７５】 糸球体の容積を測定するために、単眼鏡に付着した小型鏡を具備したオリンパ
スＢＨ−２顕微鏡を、画像をベンチトップに投影するために使用した。２．５ｍ
ｍ増加で顕微鏡ステージを移動することによって、各ＪＢ−４ＴＭ切片から得た
フィールドを、先入観なしに全身で選択した。投影した画像の上にグリッドの点
を重ね合せることによって、各フィールド内の全糸球体のプロファイルの領域を
測定した。各糸球体プロファイルに当たる点の数を計測した。方程式、領域＝（
ΣＰ／ΣＧ）×（５０００／１５０）２（式中、ΣＰは、糸球体プロファイルを
当てる点の総計であり、そしてΣＧは、測定されたプロファイルの数であった）
によって平均糸球体領域を計算し、５００は、マイクロメートルでグリッド点の
間の距離であり、１５０は、投影された画像の倍率であった。方程式、容積＝領
域３／２×１．３８／１．０１（式中、１．３８は、球形粒子についての修正因
子であり、そして１．０１は、糸球体の中の多様な容積についての修正因子であ
る）を用いて、ＷｅｉｂｅｌおよびＧｏｍｅｚの方法によって容積を計算した（
ＷｅｉｂｅｌおよびＧｏｍｅｚ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７：３４３
−３４８、１９６２年）。糸球体の容積測定のために、６５プロファイルの平均
を測定した。目盛スライスを、投影画像の倍率が１５０×であることを確認する
ために使用した。
スＢＨ−２顕微鏡を、画像をベンチトップに投影するために使用した。２．５ｍ
ｍ増加で顕微鏡ステージを移動することによって、各ＪＢ−４ＴＭ切片から得た
フィールドを、先入観なしに全身で選択した。投影した画像の上にグリッドの点
を重ね合せることによって、各フィールド内の全糸球体のプロファイルの領域を
測定した。各糸球体プロファイルに当たる点の数を計測した。方程式、領域＝（
ΣＰ／ΣＧ）×（５０００／１５０）２（式中、ΣＰは、糸球体プロファイルを
当てる点の総計であり、そしてΣＧは、測定されたプロファイルの数であった）
によって平均糸球体領域を計算し、５００は、マイクロメートルでグリッド点の
間の距離であり、１５０は、投影された画像の倍率であった。方程式、容積＝領
域３／２×１．３８／１．０１（式中、１．３８は、球形粒子についての修正因
子であり、そして１．０１は、糸球体の中の多様な容積についての修正因子であ
る）を用いて、ＷｅｉｂｅｌおよびＧｏｍｅｚの方法によって容積を計算した（
ＷｅｉｂｅｌおよびＧｏｍｅｚ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７：３４３
−３４８、１９６２年）。糸球体の容積測定のために、６５プロファイルの平均
を測定した。目盛スライスを、投影画像の倍率が１５０×であることを確認する
ために使用した。
【０１７６】 糸球体の基底膜（ＧＢＭ）の幅を測定するために、顕微鏡ステージコントロー
ルの現在位置を用いて、先入観なしに画像を全身的に得た。およそ２５パーセン
トの各糸球体プロファイルが、１５，０００×の最終倍率で作画された。オルト
ゴナル切片法（Ｊｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ １１５：１９−３
３、１９７９年）を用いて、糸球体基底膜幅を測定した。糸球体の基底膜の１６
９測定の平均を、動物当たりで行った。糸球体当たりの糸球体間質の容積密度［
Ｖｖ（糸球体間質／糸球体）］の測定のために、画像を得て、そして一緒に合せ
て、３９００×の最終倍率で、全糸球体プロファイルのモンタージュを形成した
。粗大な、および微細な点のグリッドを、モンタージュの上に載せた。糸球体間
質に入る微細な点の数および糸球体に入る粗大な点の数を計測した（Ｗｅｉｂｅ
ｌ，Ｅ．Ｒ．、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ，Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ，Ｖｏｌ．１、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、３３２、
１９７９年）。Ｖｖ（糸球体間質／糸球体）＝ΣＦＰ／（ΣＣＰ×４）（式中、
ΣＦＰは、糸球体間質に入る微細な点の数であり、そしてΣＣＰは、全ての３つ
の糸球体に入る粗大な点の数である）。各粗大な点について４つの微細な点があ
るように、グリッドを行った。１７４の粗大な点の平均は、糸球体を当て、そし
て１６４の微細な点は、動物当たり糸球体間質を当てた。目盛グリッドを、高お
よび低倍率で、フィルムの各ロールについて写真に撮り、各測定画像の正確な倍
率を測定した。Ｖｖ（糸球体間質／糸球体）により糸球体の容積を増大させるこ
とによって、総糸球体間質の容積を計算した。
ルの現在位置を用いて、先入観なしに画像を全身的に得た。およそ２５パーセン
トの各糸球体プロファイルが、１５，０００×の最終倍率で作画された。オルト
ゴナル切片法（Ｊｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ １１５：１９−３
３、１９７９年）を用いて、糸球体基底膜幅を測定した。糸球体の基底膜の１６
９測定の平均を、動物当たりで行った。糸球体当たりの糸球体間質の容積密度［
Ｖｖ（糸球体間質／糸球体）］の測定のために、画像を得て、そして一緒に合せ
て、３９００×の最終倍率で、全糸球体プロファイルのモンタージュを形成した
。粗大な、および微細な点のグリッドを、モンタージュの上に載せた。糸球体間
質に入る微細な点の数および糸球体に入る粗大な点の数を計測した（Ｗｅｉｂｅ
ｌ，Ｅ．Ｒ．、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ，Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ，Ｖｏｌ．１、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、３３２、
１９７９年）。Ｖｖ（糸球体間質／糸球体）＝ΣＦＰ／（ΣＣＰ×４）（式中、
ΣＦＰは、糸球体間質に入る微細な点の数であり、そしてΣＣＰは、全ての３つ
の糸球体に入る粗大な点の数である）。各粗大な点について４つの微細な点があ
るように、グリッドを行った。１７４の粗大な点の平均は、糸球体を当て、そし
て１６４の微細な点は、動物当たり糸球体間質を当てた。目盛グリッドを、高お
よび低倍率で、フィルムの各ロールについて写真に撮り、各測定画像の正確な倍
率を測定した。Ｖｖ（糸球体間質／糸球体）により糸球体の容積を増大させるこ
とによって、総糸球体間質の容積を計算した。
【０１７７】 統計的分析 ウインドウズ（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標））Ｖ１．００のためのシグマスタ ット（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ）を用いて、統計的分析を行 った。非パラメータ性マン−ホワイトニーランク総計分析によって、Ｐ値を計算 した。パーソンの産物モーメント法によって、修正分析を行った。
【０１７８】 結果 ネフロパシーの進行 尿中アルブミンおよびタンパク質分泌、および血漿クレアチニン濃度を、糖尿
病性ネフロパシーの測定として使用した（図３９）。ＰＭ−処置非糖尿病対照は
、実施例を通して、非処置の非糖尿病対照と区別できなかったが、しかし、アル
ブミン尿症は、全糖尿病群で時間と共に増加し、そして未処置糖尿病動物は、ア
ルブミン尿症で最大の増加を示す。糖尿病の２３週で、全３つの糖尿病群は、互
いに、そしてアルブミン尿症に関しては、非糖尿病対照と明らかに異なっていた
（図３９Ａ）。ＰＭは、ＡＧより、アルブミン尿症に対する明らかに大きな保護
を提供した。図３９Ｂに示されるとおり、血漿クレアチニン値も、約第１７週で
正常より上昇し始めた。アルブミン尿症および蛋白尿症で観察されるとき、ＰＭ
は、ＡＧより明らかにいっそう有効であるが、ＰＭおよびＡＧの両方とも、血漿
クレアチニンでの上昇を鈍らせた。アルブミン尿症での効果は、蛋白尿症での差
異によって監視され、アルブミン尿症は、ネフロパシーのいっそう感受性のある
指標であるようだが、実験の終わりに測定された（図３９Ｃ）。
病性ネフロパシーの測定として使用した（図３９）。ＰＭ−処置非糖尿病対照は
、実施例を通して、非処置の非糖尿病対照と区別できなかったが、しかし、アル
ブミン尿症は、全糖尿病群で時間と共に増加し、そして未処置糖尿病動物は、ア
ルブミン尿症で最大の増加を示す。糖尿病の２３週で、全３つの糖尿病群は、互
いに、そしてアルブミン尿症に関しては、非糖尿病対照と明らかに異なっていた
（図３９Ａ）。ＰＭは、ＡＧより、アルブミン尿症に対する明らかに大きな保護
を提供した。図３９Ｂに示されるとおり、血漿クレアチニン値も、約第１７週で
正常より上昇し始めた。アルブミン尿症および蛋白尿症で観察されるとき、ＰＭ
は、ＡＧより明らかにいっそう有効であるが、ＰＭおよびＡＧの両方とも、血漿
クレアチニンでの上昇を鈍らせた。アルブミン尿症での効果は、蛋白尿症での差
異によって監視され、アルブミン尿症は、ネフロパシーのいっそう感受性のある
指標であるようだが、実験の終わりに測定された（図３９Ｃ）。
【０１７９】 異脂血症 ネフロパシーで、我々は、未処置糖尿病動物の血液が、対照およびＰＭ−また
はＡＧ−処置動物から得られる血液より目視でいっそう脂ぎっていることを観察
した。血漿脂質のアッセイ（図４０）は、未処置糖尿病動物における脂血症での
実質的増大、そしてＰＭおよびＡＧの両方による高脂血症の実質的修正を示した
。トリグリセリド（図４０Ａ）は、非糖尿病対照における１００ｍｇ／ｄＬに比
較して、糖尿病ラットで〜７００ｍｇ／ｄＬの平均まで増大し、そしてそれぞれ
、ＰＭおよびＡＧによって２２０と３５０ｍｇ／ｄＬの平均まで減少された。血
漿コレステロール（図４０Ｂ）は、〜５０％まで増大され、そしてＰＭによって
正常化され、そしてＡＧで部分的に修正された。脂血症における増大は、糖尿病
における脂質タンパク質リパーゼ活性のため、末梢組織で低密度脂質タンパク質
の減少した取込に寄与され得るが、血漿中の遊離脂肪酸およびグリセロールの両
方における増大に基づいて、増大した脂肪分解をも示す。図４０および４０Ｄに
示されるとおり、血漿遊離脂肪酸およびグリセロール濃度は、糖尿病ラットで２
−３倍まで増大され、そしておよそ５０％がＰＭまたはＡＧのいずれかでの処置
によって正常化された。
はＡＧ−処置動物から得られる血液より目視でいっそう脂ぎっていることを観察
した。血漿脂質のアッセイ（図４０）は、未処置糖尿病動物における脂血症での
実質的増大、そしてＰＭおよびＡＧの両方による高脂血症の実質的修正を示した
。トリグリセリド（図４０Ａ）は、非糖尿病対照における１００ｍｇ／ｄＬに比
較して、糖尿病ラットで〜７００ｍｇ／ｄＬの平均まで増大し、そしてそれぞれ
、ＰＭおよびＡＧによって２２０と３５０ｍｇ／ｄＬの平均まで減少された。血
漿コレステロール（図４０Ｂ）は、〜５０％まで増大され、そしてＰＭによって
正常化され、そしてＡＧで部分的に修正された。脂血症における増大は、糖尿病
における脂質タンパク質リパーゼ活性のため、末梢組織で低密度脂質タンパク質
の減少した取込に寄与され得るが、血漿中の遊離脂肪酸およびグリセロールの両
方における増大に基づいて、増大した脂肪分解をも示す。図４０および４０Ｄに
示されるとおり、血漿遊離脂肪酸およびグリセロール濃度は、糖尿病ラットで２
−３倍まで増大され、そしておよそ５０％がＰＭまたはＡＧのいずれかでの処置
によって正常化された。
【０１８０】 酸化還元不均等 脂質代謝における選択は、糖尿病でグルコースで誘導された酸化還元不均衡（
偽低酸素症）（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２：８０１−８
１３、１９９３年）または減少した組織酸化（ＭａｙｒｏｖｉｔｚおよびＬａｒ
ｓｅｎ、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５２：１１５−１２６、１９９６年；Ｔ
ｅｓｆａｙｅら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３７：８４７−８５４、１９９４
年）（真性低酸素症）から生じ得る。こららの変化は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋の細
胞質ゾル比における変化まで影響され、そしてそれは、血漿中の乳酸塩対ピルビ
ン酸塩の比を測定することによって間接的に評価され得る。図４１に示されると
おり、糖尿病動物は、増大した乳酸塩／ピルビン酸塩比と同様に、血漿中の乳酸
塩およびピルビン酸塩の両方の明らかに高い濃度を示した。ＰＭおよびより少な
い範囲のＡＧは、炭化水素の酸化的代謝でのこれらの欠乏を部分的に修正した。
我々は、血漿β−ヒドロキシブチラートおよびアセトアセテート濃度も測定し、
しばしば、ミトコンドリアの状態の指標として使用された。これらの代謝産物の
濃度は、動物の間で大いに変化した。糖尿病動物におけるβ−ヒドロキシブチラ
ートおよびアセトアセテートにおける増加に対する明確な傾向があり、そしてＰ
ＭおよびＡＧの両方がこれらの変化を修正したという指示である一方で、差異は
、統計的有為性に達しなかった。
偽低酸素症）（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２：８０１−８
１３、１９９３年）または減少した組織酸化（ＭａｙｒｏｖｉｔｚおよびＬａｒ
ｓｅｎ、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５２：１１５−１２６、１９９６年；Ｔ
ｅｓｆａｙｅら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３７：８４７−８５４、１９９４
年）（真性低酸素症）から生じ得る。こららの変化は、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋の細
胞質ゾル比における変化まで影響され、そしてそれは、血漿中の乳酸塩対ピルビ
ン酸塩の比を測定することによって間接的に評価され得る。図４１に示されると
おり、糖尿病動物は、増大した乳酸塩／ピルビン酸塩比と同様に、血漿中の乳酸
塩およびピルビン酸塩の両方の明らかに高い濃度を示した。ＰＭおよびより少な
い範囲のＡＧは、炭化水素の酸化的代謝でのこれらの欠乏を部分的に修正した。
我々は、血漿β−ヒドロキシブチラートおよびアセトアセテート濃度も測定し、
しばしば、ミトコンドリアの状態の指標として使用された。これらの代謝産物の
濃度は、動物の間で大いに変化した。糖尿病動物におけるβ−ヒドロキシブチラ
ートおよびアセトアセテートにおける増加に対する明確な傾向があり、そしてＰ
ＭおよびＡＧの両方がこれらの変化を修正したという指示である一方で、差異は
、統計的有為性に達しなかった。
【０１８１】 解剖学的観察 表１に示されるとおり、平均腎臓および肝臓重量は、絶対的語句で、および総
体重マスの画分としての両方で、糖尿病ラットで増大した。組織重量におけるこ
れらの変化は、ＰＭおよびＡＧによって部分的に逆転された。糖尿病動物の腎臓
に、偶発的な嚢胞が観察されたが、しかし、薬剤処置群では増大されなかった。
主要臓器での腫瘍における増加も、ＰＭまたはＡＧ療法のいずれかに関連した他
の通常でない病理学の証拠もなかった。腎臓形態学における顕著な変化は、糸球
体の基底膜（ＧＢＭ）厚みにおける30％増加、糸球体の容積における６０％増加
、糸球体間質の容積画分での２５％増加、そして糸球体間質の容積における１０
０％増加（表２）を含め、ラットで糖尿病の７ヶ月の期間内に観察可能であった
。ＰＭは、糸球体容積ので明らかであるが、しかし増加の部分的修正を引き起こ
し、そしてＧＢＭ厚みおよびＰＭによる糸球体間質の容積における減少に向けた
傾向があった。ＰＭ処置ラット中の糸球体間質の容積画分における増加は、ＰＭ
処置動物における糸球体の容積で不均衡な減少から生じ得た。これらのパラメー
タにおけるＡＧの効果は、評価されなかった。
体重マスの画分としての両方で、糖尿病ラットで増大した。組織重量におけるこ
れらの変化は、ＰＭおよびＡＧによって部分的に逆転された。糖尿病動物の腎臓
に、偶発的な嚢胞が観察されたが、しかし、薬剤処置群では増大されなかった。
主要臓器での腫瘍における増加も、ＰＭまたはＡＧ療法のいずれかに関連した他
の通常でない病理学の証拠もなかった。腎臓形態学における顕著な変化は、糸球
体の基底膜（ＧＢＭ）厚みにおける30％増加、糸球体の容積における６０％増加
、糸球体間質の容積画分での２５％増加、そして糸球体間質の容積における１０
０％増加（表２）を含め、ラットで糖尿病の７ヶ月の期間内に観察可能であった
。ＰＭは、糸球体容積ので明らかであるが、しかし増加の部分的修正を引き起こ
し、そしてＧＢＭ厚みおよびＰＭによる糸球体間質の容積における減少に向けた
傾向があった。ＰＭ処置ラット中の糸球体間質の容積画分における増加は、ＰＭ
処置動物における糸球体の容積で不均衡な減少から生じ得た。これらのパラメー
タにおけるＡＧの効果は、評価されなかった。
【０１８２】
【表１】
【０１８３】
【表２】 生化学的パラメータおよびＡＧＥの間の関係 脂質は、糖尿病ラットにおいて明らかに増大された、そしてＰＭおよびＡＧに
よって低下させられたので、そして脂質は、ＣＭＬ（１３）、ＣＥＬ（１４）お
よび蛍光産物、例えばリポフュズシン、そして組織タンパク質中の架橋構造（ペ
ントシジンを除いて）の起源として認識されるので、我々は、糖尿病ラット中の
血漿脂質、糖尿病性ネフロパシーおよびタンパク質の化学的修飾の間の関係を試
験した。図４２に示されるとおり、皮膚コラーゲン中のＣＭＬおよび血漿トリグ
リセリドの間に強力な相互関係があり、そしてＣＭＬおよびトリグリセリドも、
微細アルブミン尿症に相互関係した。他の相互関係は、表３で要約される。これ
らのパラメータが、影響を及ぼされないか、またはコラーゲンのグリケーション
の場合には、薬剤療法によってわずかに影響されるので、これらの測定で、脂血
症またはタンパク質グリケーションと相互関係したものはなかった。
よって低下させられたので、そして脂質は、ＣＭＬ（１３）、ＣＥＬ（１４）お
よび蛍光産物、例えばリポフュズシン、そして組織タンパク質中の架橋構造（ペ
ントシジンを除いて）の起源として認識されるので、我々は、糖尿病ラット中の
血漿脂質、糖尿病性ネフロパシーおよびタンパク質の化学的修飾の間の関係を試
験した。図４２に示されるとおり、皮膚コラーゲン中のＣＭＬおよび血漿トリグ
リセリドの間に強力な相互関係があり、そしてＣＭＬおよびトリグリセリドも、
微細アルブミン尿症に相互関係した。他の相互関係は、表３で要約される。これ
らのパラメータが、影響を及ぼされないか、またはコラーゲンのグリケーション
の場合には、薬剤療法によってわずかに影響されるので、これらの測定で、脂血
症またはタンパク質グリケーションと相互関係したものはなかった。
【０１８４】
【表３】 検討 糖尿病ネフロパシーにおけるピリドキサミンの効果 これらの研究は、ＡＧＥの形成におけるＰＭの有効性およびＳＴＺ−糖尿病ラ
ットにおけるネフロパシーの発生を評価するために設計した。本報告では、尿中
アルブミンおよび血漿クレアチニン濃度の両方での減少によって測定されるとお
り、我々は、ＰＭが、糖尿病ラットでのネフロパシーの発生を阻止したことを示
す。研究の終わりに測定された蛋白尿も、ＰＭ処置ラットで明らかに減少された
。ＰＭが、糖尿病ラットで、微細アルブミン尿症およびクレアチニン血症におけ
る増大を阻止する上で、そして異脂血症および酸化還元不均衡を修正する上で明
らかにいっそう有効であったが、ＰＭおよびＡＧの両方につての類似の効果が観
察された。こららの治療効果は、糖尿病ラットの血糖症またはグリケート化ヘモ
グロビンにおける明らかな変化なしに達成された。
ットにおけるネフロパシーの発生を評価するために設計した。本報告では、尿中
アルブミンおよび血漿クレアチニン濃度の両方での減少によって測定されるとお
り、我々は、ＰＭが、糖尿病ラットでのネフロパシーの発生を阻止したことを示
す。研究の終わりに測定された蛋白尿も、ＰＭ処置ラットで明らかに減少された
。ＰＭが、糖尿病ラットで、微細アルブミン尿症およびクレアチニン血症におけ
る増大を阻止する上で、そして異脂血症および酸化還元不均衡を修正する上で明
らかにいっそう有効であったが、ＰＭおよびＡＧの両方につての類似の効果が観
察された。こららの治療効果は、糖尿病ラットの血糖症またはグリケート化ヘモ
グロビンにおける明らかな変化なしに達成された。
【０１８５】 全ての糖尿病動物は、腎臓肥大（表１）を含めた腎臓構造での特徴的な変化を
示し、糸球体の基底膜（ＧＢＭ）の厚くなることを促進し、糸球体の容積および
糸球体間質の拡張を増大した（表２）。ＰＭ（およびＡＧ）は、腎臓の重さにお
ける増加を部分的に阻害したが、ＰＭは、腎臓における超構造的変化における効
果を制限した（表２）。腎臓形態学におけるＡＧの効果は、この研究で測定され
なかったが、ＳＴＺ−糖尿病ラットのＡＧ処置における他の研究は、固定した結
果を生じた。１つの研究では、ルイスラットでのＧＢＭ厚みづけの阻害が報告さ
れた（ＥｌｌｉｓおよびＧｏｏｄ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ４０：１０１６−１
０１９、１９９１年）一方で、ＡＧが、スプレーグ−ドーリーラットでのＧＢＭ
厚みづけにおける効果を示さない２つの報告がある（Ｏｔｕｒａｉら、ＡＰＭＩ
Ｓ １０４：２５９−２６４、１９９６年；Ｓｏｕｌｉｓ−Ｌｉｐａｒｏｔａら
、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０：１３２８−１３３４、１９９１年）。
示し、糸球体の基底膜（ＧＢＭ）の厚くなることを促進し、糸球体の容積および
糸球体間質の拡張を増大した（表２）。ＰＭ（およびＡＧ）は、腎臓の重さにお
ける増加を部分的に阻害したが、ＰＭは、腎臓における超構造的変化における効
果を制限した（表２）。腎臓形態学におけるＡＧの効果は、この研究で測定され
なかったが、ＳＴＺ−糖尿病ラットのＡＧ処置における他の研究は、固定した結
果を生じた。１つの研究では、ルイスラットでのＧＢＭ厚みづけの阻害が報告さ
れた（ＥｌｌｉｓおよびＧｏｏｄ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ４０：１０１６−１
０１９、１９９１年）一方で、ＡＧが、スプレーグ−ドーリーラットでのＧＢＭ
厚みづけにおける効果を示さない２つの報告がある（Ｏｔｕｒａｉら、ＡＰＭＩ
Ｓ １０４：２５９−２６４、１９９６年；Ｓｏｕｌｉｓ−Ｌｉｐａｒｏｔａら
、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０：１３２８−１３３４、１９９１年）。
【０１８６】 しかし、後者の研究の内の１つで、ＡＧは、糸球体間質拡張を部分的に阻害し
た（Ｓｏｕｌｉｓ−Ｌｉｐａｒｏｔａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０：１３２８−
１３３４、１９９１年）。関連報告では、ＡＧは、２型糖尿病のモデル（Ｙａｍ
ａｕｃｈｉら、Ｄｉａｂ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ． ３４：１２７−１
３３、１９９７年）であるオーツカロング−エバンストクシマ脂肪ラットにおけ
る糸球体の基底膜厚みづけおよび画分の糸球体間質容積における増大を阻害した
。腎臓の形態学における可変の効果以外に糖尿病ネフロパシーにおけるＡＧＥ阻
害剤の強力な効果は、腎臓の形態学的変化が、高濾過または高血圧（測定されず
）またはこれらの実験で測定されなかった腎臓の血流力学の他の態様によって起
動され得ることを示唆する。糖尿病腎臓での細胞の変化、例えば、有足突起およ
び糸球体間質の細胞数における変化における将来の研究は、糖尿病腎臓での構造
および機能的変化の間の関係によい徴候を提供し得る。
た（Ｓｏｕｌｉｓ−Ｌｉｐａｒｏｔａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４０：１３２８−
１３３４、１９９１年）。関連報告では、ＡＧは、２型糖尿病のモデル（Ｙａｍ
ａｕｃｈｉら、Ｄｉａｂ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ． ３４：１２７−１
３３、１９９７年）であるオーツカロング−エバンストクシマ脂肪ラットにおけ
る糸球体の基底膜厚みづけおよび画分の糸球体間質容積における増大を阻害した
。腎臓の形態学における可変の効果以外に糖尿病ネフロパシーにおけるＡＧＥ阻
害剤の強力な効果は、腎臓の形態学的変化が、高濾過または高血圧（測定されず
）またはこれらの実験で測定されなかった腎臓の血流力学の他の態様によって起
動され得ることを示唆する。糖尿病腎臓での細胞の変化、例えば、有足突起およ
び糸球体間質の細胞数における変化における将来の研究は、糖尿病腎臓での構造
および機能的変化の間の関係によい徴候を提供し得る。
【０１８７】 ＡＧＥ阻害剤の代謝的効果 糖尿病ヒトにおけるＡＧの脂質低下効果が、先に報告（Ｂｕｃａｌａら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９４４１−９４４５、１９９４年）
されているが、ＳＴＺ−糖尿病ラットでの血漿コレステロールおよびトリグリセ
リドにおけるＰＭおよびＡＧの効果の規模は驚くべきことである。血漿遊離脂肪
酸およびグリセロールにおける効果と一緒に、これらの変化は、それらのＡＧＥ
−阻害活性に加えて、ＡＧおよびＰＭは、脂質代謝の中枢経路に影響を及ぼすこ
とを示す。ＡＧとＰＭの間に構造的類似性がほとんどないので、ＰＭの効果は、
リン酸ピリドキサルまたは他のＢ６ビタマーへのその変換から誘導されそうにな
い。
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９４４１−９４４５、１９９４年）
されているが、ＳＴＺ−糖尿病ラットでの血漿コレステロールおよびトリグリセ
リドにおけるＰＭおよびＡＧの効果の規模は驚くべきことである。血漿遊離脂肪
酸およびグリセロールにおける効果と一緒に、これらの変化は、それらのＡＧＥ
−阻害活性に加えて、ＡＧおよびＰＭは、脂質代謝の中枢経路に影響を及ぼすこ
とを示す。ＡＧとＰＭの間に構造的類似性がほとんどないので、ＰＭの効果は、
リン酸ピリドキサルまたは他のＢ６ビタマーへのその変換から誘導されそうにな
い。
【０１８８】 高血糖症は、インビトロおよびインビボでの酸化還元補酵素の細胞内比にシフ
トを誘導することが知られており、それにより偽低酸素症の状態に至る（Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２：８０１−８１３、１９９３年）。
糖尿病ラットでの血漿乳酸塩での増加および乳酸塩：ピルビン酸塩比の規模は、
体の中の主要な組織、例えば筋肉または神経での酸化還元シフトまたは真性低酸
素症を示唆する。これらの変化は、末梢組織の減少した灌流および酸素付加から
生じ、そしてヒトおよび動物モデルの両方で糖尿病性微細血管症およびネフロパ
シーの発生に重要な役割を果し得る（ＭａｙｒｏｖｉｔｚおよびＬａｒｓｅｎ、
Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５２：１１５−１２６、１９９６年；Ｔｅｓｆａ
ｙｅら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３７：８４７−８５４、１９９４年；Ｃａ
ｍｅｒｏｎおよびＣｏｔｔｅｒ、Ｄｉａｂ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．１０：１８９
−２２４、１９９４年；ＢｏｕｌｔｏｎおよびＭａｌｉｋ、臓器特異的血管変化
、Ｄｉａｂｅｔｉｃ ＡｎｇｉｏｐａｔｈｙにおけるＴｏｏｋｅ，Ｊ．Ｅ．編、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２６７
−２７５頁）。
トを誘導することが知られており、それにより偽低酸素症の状態に至る（Ｗｉｌ
ｌｉａｍｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２：８０１−８１３、１９９３年）。
糖尿病ラットでの血漿乳酸塩での増加および乳酸塩：ピルビン酸塩比の規模は、
体の中の主要な組織、例えば筋肉または神経での酸化還元シフトまたは真性低酸
素症を示唆する。これらの変化は、末梢組織の減少した灌流および酸素付加から
生じ、そしてヒトおよび動物モデルの両方で糖尿病性微細血管症およびネフロパ
シーの発生に重要な役割を果し得る（ＭａｙｒｏｖｉｔｚおよびＬａｒｓｅｎ、
Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５２：１１５−１２６、１９９６年；Ｔｅｓｆａ
ｙｅら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ３７：８４７−８５４、１９９４年；Ｃａ
ｍｅｒｏｎおよびＣｏｔｔｅｒ、Ｄｉａｂ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．１０：１８９
−２２４、１９９４年；ＢｏｕｌｔｏｎおよびＭａｌｉｋ、臓器特異的血管変化
、Ｄｉａｂｅｔｉｃ ＡｎｇｉｏｐａｔｈｙにおけるＴｏｏｋｅ，Ｊ．Ｅ．編、
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２６７
−２７５頁）。
【０１８９】 糖尿病の腎臓が、低酸素症でもあるという最近の報告（Ｐｙｋｅら、Ｄｉａｂ
ｅｔｅｓ ４８（補追１）、５９３（要旨）、１９９９年）は、低酸素症が、糖
尿病での改変代謝および病理学の発生に寄与する一般的機構であり得ることを示
唆する。炭化水素の嫌気的代謝における結果の増加は、脂質の好気性代謝も損傷
され得ることを示唆し、それにより、糖尿病ラットでの高脂血症に部分的に寄与
する。これらの効果の全てが、血管系におけるＡＧＥ形成の阻害に対して二次的
であることは起こる得るが、しかし、我々は、その薬剤の作用の多重機構を排除
できない。糖尿病ラットの血漿中の組織酸素圧、末梢血管耐性、脂質濃度および
乳酸塩：ピルビン酸塩比におけるＰＭの効果の速度論の評価は、薬剤作用の機構
への重要な徴候およびＳＴＺ−糖尿病ラット中の代謝および機能的変化の発生に
おける低酸素症の役割を得た。
ｅｔｅｓ ４８（補追１）、５９３（要旨）、１９９９年）は、低酸素症が、糖
尿病での改変代謝および病理学の発生に寄与する一般的機構であり得ることを示
唆する。炭化水素の嫌気的代謝における結果の増加は、脂質の好気性代謝も損傷
され得ることを示唆し、それにより、糖尿病ラットでの高脂血症に部分的に寄与
する。これらの効果の全てが、血管系におけるＡＧＥ形成の阻害に対して二次的
であることは起こる得るが、しかし、我々は、その薬剤の作用の多重機構を排除
できない。糖尿病ラットの血漿中の組織酸素圧、末梢血管耐性、脂質濃度および
乳酸塩：ピルビン酸塩比におけるＰＭの効果の速度論の評価は、薬剤作用の機構
への重要な徴候およびＳＴＺ−糖尿病ラット中の代謝および機能的変化の発生に
おける低酸素症の役割を得た。
【０１９０】 ＰＭの作用の機構 ＰＭおよびＡＧの効果は、糖尿病合併症でのＡＧＥ仮説と一致する。両方の薬
剤は、論理的には、ＡＧＥ形成に関与した反応性カルボキシル中間体を捕捉する
ことによって、ＣＭＬおよびＣＥＬの形成を阻害し、そして、それらは、糖尿病
ネフロパシーの発生を阻止もする。しかし、トリグリセリドおよびＣＭＬの間、
そしてトリグリセリドとアルブミン尿またはクレアチニン血症との間の強力な相
互関係と合せて、ペントシジン形成に影響するＰＭまたはＡＧのいずれかの不全
は、脂質が、ＡＧＥの形成およびネフロパシーの発生の両方で重要であり得るこ
とを示唆する。実際に、ＣＭＬおよびＣＥＬの両方が、脂質過酸化反応の間に形
成され（未公表の結果、およびＦｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９９
８２−９９８６、１９９６年）、そしてコラーゲン中のそれらの濃度における減
少が、ＡＧＥ阻害剤によって影響された血漿トリグリセリドでの減少の直接的結
果であり得ることが主張された。しかし、炭化水素（Ｐｙｋｅら、Ｄｉａｂｅｔ
ｅｓ ４８（補追１）、５９３（要旨）、１９９９年）から占有的に誘導された
産物であるペントシジンが、糖尿病ラットの皮膚および腎臓のコラーゲンの両方
で増加されるという事実は、炭化水素自動酸化およびグリコシド化が、ＡＧＥ形
成に寄与することを示す。ＰＭまたはＡＧも、皮膚コラーゲンでのペントシジン
における増加を防止したが、これは、インビトロでのＣＭＬと比較して、ペント
シジンの形成を阻害することがいっそう困難であるという事実に反映し得る（Ｄ
ｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６５４−１１６６０、１９９
１年；Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．出版中、１９９
９年）。ＣＭＬ、ＣＥＬおよびペントシジンでの相対的増加も、対照ラットに比
較して糖尿病でも類似であり、ペントシジンの場合に自然で炭化水素でなければ
ならない共通の前駆体からそれらの起点と一致する。皮膚中のＣＭＬおよびペン
トシジン（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら、出版中）および腎臓のコラーゲンの相対的
濃度も、インビトロでのグルコースによるコラーゲンの修飾の間のこれらの化合
物の相対的収量（Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６５４−
１１６６０、１９９１年；Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．出版中、１９９９年）、すなわち、ペントシジンと比較して、５０−１００
倍高い濃度のＣＭＬとも一致する。したがって、これらの産物の内の３つ全ては
、糖尿病コラーゲンの蛍光および架橋と同様に、グリコキシル化反応から誘導さ
れることが最もありそうに見える。
剤は、論理的には、ＡＧＥ形成に関与した反応性カルボキシル中間体を捕捉する
ことによって、ＣＭＬおよびＣＥＬの形成を阻害し、そして、それらは、糖尿病
ネフロパシーの発生を阻止もする。しかし、トリグリセリドおよびＣＭＬの間、
そしてトリグリセリドとアルブミン尿またはクレアチニン血症との間の強力な相
互関係と合せて、ペントシジン形成に影響するＰＭまたはＡＧのいずれかの不全
は、脂質が、ＡＧＥの形成およびネフロパシーの発生の両方で重要であり得るこ
とを示唆する。実際に、ＣＭＬおよびＣＥＬの両方が、脂質過酸化反応の間に形
成され（未公表の結果、およびＦｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９９
８２−９９８６、１９９６年）、そしてコラーゲン中のそれらの濃度における減
少が、ＡＧＥ阻害剤によって影響された血漿トリグリセリドでの減少の直接的結
果であり得ることが主張された。しかし、炭化水素（Ｐｙｋｅら、Ｄｉａｂｅｔ
ｅｓ ４８（補追１）、５９３（要旨）、１９９９年）から占有的に誘導された
産物であるペントシジンが、糖尿病ラットの皮膚および腎臓のコラーゲンの両方
で増加されるという事実は、炭化水素自動酸化およびグリコシド化が、ＡＧＥ形
成に寄与することを示す。ＰＭまたはＡＧも、皮膚コラーゲンでのペントシジン
における増加を防止したが、これは、インビトロでのＣＭＬと比較して、ペント
シジンの形成を阻害することがいっそう困難であるという事実に反映し得る（Ｄ
ｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６５４−１１６６０、１９９
１年；Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．出版中、１９９
９年）。ＣＭＬ、ＣＥＬおよびペントシジンでの相対的増加も、対照ラットに比
較して糖尿病でも類似であり、ペントシジンの場合に自然で炭化水素でなければ
ならない共通の前駆体からそれらの起点と一致する。皮膚中のＣＭＬおよびペン
トシジン（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔら、出版中）および腎臓のコラーゲンの相対的
濃度も、インビトロでのグルコースによるコラーゲンの修飾の間のこれらの化合
物の相対的収量（Ｄｙｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１６５４−
１１６６０、１９９１年；Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．出版中、１９９９年）、すなわち、ペントシジンと比較して、５０−１００
倍高い濃度のＣＭＬとも一致する。したがって、これらの産物の内の３つ全ては
、糖尿病コラーゲンの蛍光および架橋と同様に、グリコキシル化反応から誘導さ
れることが最もありそうに見える。
【０１９１】 異脂血症および糖尿病合併症 異脂血症は、糖尿病ネフロパシーの発生についての危険因子として認識される
（ＯｄａおよびＫｅａｎｅ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔ．５２、補追２：
Ｓ３６−Ｓ３８、１９９７年；Ｓｍｕｌｄｅｒｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．２７：９９７−１００２、１９９７年）が、しかし糖尿病と関係な
くネフロパシーと共通に関連もしている（ＧｕｉｊａｒｒｏおよびＫｅａｎｅ、
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２：３７２−３７
９、１９９３年；Ｓａｉｔｏ，Ｔ．、Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
１：３２１−３３７、１９９７年）。脂質代謝における異常性が、高血糖症の発
生に関して、糖尿病で最初に発生されたことは、さらにあり得ると思われる。こ
の場合に、異脂血症は、おそらく、腎臓（または血管系）に捕捉された脂質タン
パク質の局在酸化、および高次的脂質化最終産物（ＡＬＥ）の連続形成を通して
、ネフロパシーの発生を促進し得た。ＡＧ（Ｐｉｃａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６８７６−６８８０、１９９２年；Ｇｉ
ａｒｄｉｎｏら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７：１１１４−１１２０、１９９８年）
およびＰＭ（未公開結果）は、脂質過酸化の間タンパク質の修飾を阻害すること
が知られており、それによりこれらの薬剤が、糖尿病性ネフロパシーの対する保
護を提供し得るグリコキシ化反応の阻害に加えて、機構が示唆される。ＡＧＥお
よびＡＬＥの両方の形成における修正された効果は、血管コラーゲンの修飾（付
着、硬化）が減少すること、改善された末梢灌流および酸素付加、脂質代謝の正
常化および異脂血症の修正に至り得る。これらの病理学の間の原因−効果の関係
は、本発明の実験および利用可能なデータによって測定できず、しかし、対照、
糖尿病およびＰＭ処置糖尿病動物の組織中のＡＬＥの測定が、タンパク質の化学
的修飾および糖尿病での合併症の発生におけるＡＧＥ−阻害剤の効果の後半な範
囲を剥き出し得る。
（ＯｄａおよびＫｅａｎｅ、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔ．５２、補追２：
Ｓ３６−Ｓ３８、１９９７年；Ｓｍｕｌｄｅｒｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．２７：９９７−１００２、１９９７年）が、しかし糖尿病と関係な
くネフロパシーと共通に関連もしている（ＧｕｉｊａｒｒｏおよびＫｅａｎｅ、
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２：３７２−３７
９、１９９３年；Ｓａｉｔｏ，Ｔ．、Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８
１：３２１−３３７、１９９７年）。脂質代謝における異常性が、高血糖症の発
生に関して、糖尿病で最初に発生されたことは、さらにあり得ると思われる。こ
の場合に、異脂血症は、おそらく、腎臓（または血管系）に捕捉された脂質タン
パク質の局在酸化、および高次的脂質化最終産物（ＡＬＥ）の連続形成を通して
、ネフロパシーの発生を促進し得た。ＡＧ（Ｐｉｃａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６８７６−６８８０、１９９２年；Ｇｉ
ａｒｄｉｎｏら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４７：１１１４−１１２０、１９９８年）
およびＰＭ（未公開結果）は、脂質過酸化の間タンパク質の修飾を阻害すること
が知られており、それによりこれらの薬剤が、糖尿病性ネフロパシーの対する保
護を提供し得るグリコキシ化反応の阻害に加えて、機構が示唆される。ＡＧＥお
よびＡＬＥの両方の形成における修正された効果は、血管コラーゲンの修飾（付
着、硬化）が減少すること、改善された末梢灌流および酸素付加、脂質代謝の正
常化および異脂血症の修正に至り得る。これらの病理学の間の原因−効果の関係
は、本発明の実験および利用可能なデータによって測定できず、しかし、対照、
糖尿病およびＰＭ処置糖尿病動物の組織中のＡＬＥの測定が、タンパク質の化学
的修飾および糖尿病での合併症の発生におけるＡＧＥ−阻害剤の効果の後半な範
囲を剥き出し得る。
【０１９２】 異脂血症の遺伝、食物因子、および疾病、並びに主主の原因の間の複合相互作
用を含めた異脂血症の複数の原因がある。その後、異脂血症を防止および／また
は治療する方法は、病因因子に依存し得る。ラットモデルでの過剰脂質摂取（す
なわち、高カロリー食）によって引き越こされる上昇した血清脂質濃度を部分的
に減少させるピリドキサミンが、先に報告された（Ｓｐｅｃｋ、米国特許番号第
５，２８８，７１６号）。Ｓｐｅｃｋは、腎不全または脂質代謝における遺伝的
欠如のような高脂血症の他の原因を開示していない。本出願に存在するデータよ
り前に、欠陥のある脂質代謝によって引き起こされる高脂血症を治療または防止
するピリドキサミンの使用についてのデータは存在しなかった。特に、Ｓｐｅｃ
ｋらは、おびただしい代謝経路を劇的に影響し、そして広範な範囲の生理学的影
響を示すことが知られた症状である糖尿病に関連した高脂血症を治療または防止
する上でピリドキサミンの効果に関して何ら指針を示さなかった。
用を含めた異脂血症の複数の原因がある。その後、異脂血症を防止および／また
は治療する方法は、病因因子に依存し得る。ラットモデルでの過剰脂質摂取（す
なわち、高カロリー食）によって引き越こされる上昇した血清脂質濃度を部分的
に減少させるピリドキサミンが、先に報告された（Ｓｐｅｃｋ、米国特許番号第
５，２８８，７１６号）。Ｓｐｅｃｋは、腎不全または脂質代謝における遺伝的
欠如のような高脂血症の他の原因を開示していない。本出願に存在するデータよ
り前に、欠陥のある脂質代謝によって引き起こされる高脂血症を治療または防止
するピリドキサミンの使用についてのデータは存在しなかった。特に、Ｓｐｅｃ
ｋらは、おびただしい代謝経路を劇的に影響し、そして広範な範囲の生理学的影
響を示すことが知られた症状である糖尿病に関連した高脂血症を治療または防止
する上でピリドキサミンの効果に関して何ら指針を示さなかった。
【０１９３】 要約すると、我々は、ＡＧＥ阻害剤ＰＭおよびＡＧが、組織タンパク質の化学
的修飾を阻害し、ネフロパシーの発生を阻止し、そして実質的に、ＳＴＺ糖尿病
ラット中で異脂血症を逆転させることを示す。我々は、ＰＭおよびＡＧが、ＳＴ
Ｚ糖尿病ラットでの酸化還元不均衡を実質的に逆転することも示した。全身性酸
化還元不均衡は、偽低酸素症、低酸素症、および組織中の虚血を示し、そしてそ
の症状は、多くの疾病の状態に重要な役割を果すが、それに限定されないが、糖
尿病合併症、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症；発作、炎症性外傷お
よび疾病、加齢および組織虚血のような神経変性疾病が挙げられる。（例えば、
Ａｎｄｒｕｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：２−４１−２０４８（１９９
８年）；Ｈａｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５３：６６−７７（１９
９８年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４６：
７３１−７３５（１９９８年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７０
：２２１２−２２１５（１９９８年）；Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７０：２３６−２３９（１９９９年）；Ｆｌｏｗｅ
ｒｓおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｎｅｗ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ６：１６９−１８
０（１９９８年）；Ｐｉｅｄｉｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓ
ｅ １７６：６５５−６６４（１９９７年）参照）。したがって、酸化還元不均
衡を治療および防止する方法は、これらの症状を治療する上で有用である。
的修飾を阻害し、ネフロパシーの発生を阻止し、そして実質的に、ＳＴＺ糖尿病
ラット中で異脂血症を逆転させることを示す。我々は、ＰＭおよびＡＧが、ＳＴ
Ｚ糖尿病ラットでの酸化還元不均衡を実質的に逆転することも示した。全身性酸
化還元不均衡は、偽低酸素症、低酸素症、および組織中の虚血を示し、そしてそ
の症状は、多くの疾病の状態に重要な役割を果すが、それに限定されないが、糖
尿病合併症、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症；発作、炎症性外傷お
よび疾病、加齢および組織虚血のような神経変性疾病が挙げられる。（例えば、
Ａｎｄｒｕｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１：２−４１−２０４８（１９９
８年）；Ｈａｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５３：６６−７７（１９
９８年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４６：
７３１−７３５（１９９８年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７０
：２２１２−２２１５（１９９８年）；Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７０：２３６−２３９（１９９９年）；Ｆｌｏｗｅ
ｒｓおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｎｅｗ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ６：１６９−１８
０（１９９８年）；Ｐｉｅｄｉｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓ
ｅ １７６：６５５−６６４（１９９７年）参照）。したがって、酸化還元不均
衡を治療および防止する方法は、これらの症状を治療する上で有用である。
【０１９４】 一般に、ＰＭは、コラーゲンの非酵素的修飾の阻害でのＡＧに匹敵するようで
あったが、糖尿病ラットにおける生化学的および生理学的変化を阻害する上で明
らかにいっそう有効である。我々の結果は、糖尿病における炭化水素および脂質
の両方の改変した化学および生化学の間の相互作用の複合体ウェブを示唆する。
動物の毒性学研究は、ＰＭが、低い毒性および優れた安全性プロファイルを示す
ことを示し、そしてＩ相臨床治験は、現在、糖尿病合併症の治療のためのＰＭの
有効性を評価する試みで進行中である。
あったが、糖尿病ラットにおける生化学的および生理学的変化を阻害する上で明
らかにいっそう有効である。我々の結果は、糖尿病における炭化水素および脂質
の両方の改変した化学および生化学の間の相互作用の複合体ウェブを示唆する。
動物の毒性学研究は、ＰＭが、低い毒性および優れた安全性プロファイルを示す
ことを示し、そしてＩ相臨床治験は、現在、糖尿病合併症の治療のためのＰＭの
有効性を評価する試みで進行中である。
【０１９５】 コレステロールおよびトリグリセリドの血漿濃度は、糖尿病ラット研究でのＰ
Ｍによっても低下された。ＰＭがコレステロールおよびトリグリセリドを低下さ
せる機構は、知られていないが、しかしＰＭは、コレステロール合成および分解
のある種の酵素的経路に影響し得ることを示唆する。例えば、ＰＭは、ヒドロキ
シメチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）リダクターゼまたはアンギオ
テンション変換酵素（ＡＣＥ）を阻害し得る。皮膚におけるＡＧＥ形成の血漿ク
レアチニンおよび尿中アルブミン、そして糖尿病動物モデルので総コレステロー
ルおよびトリグリセリドの低下は、ＰＭが、糖尿病および異脂血症の両方から生
じる合併症の発生に関連した幾つかの改変された代謝過程およびタンパク質損傷
を阻害する能力のある多目的薬剤であるという仮定を支持する。
Ｍによっても低下された。ＰＭがコレステロールおよびトリグリセリドを低下さ
せる機構は、知られていないが、しかしＰＭは、コレステロール合成および分解
のある種の酵素的経路に影響し得ることを示唆する。例えば、ＰＭは、ヒドロキ
シメチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）リダクターゼまたはアンギオ
テンション変換酵素（ＡＣＥ）を阻害し得る。皮膚におけるＡＧＥ形成の血漿ク
レアチニンおよび尿中アルブミン、そして糖尿病動物モデルので総コレステロー
ルおよびトリグリセリドの低下は、ＰＭが、糖尿病および異脂血症の両方から生
じる合併症の発生に関連した幾つかの改変された代謝過程およびタンパク質損傷
を阻害する能力のある多目的薬剤であるという仮定を支持する。
【０１９６】 我々は、ＰＭの投与が、糖尿病でのネフロパシー、網膜症、および炎症治癒欠
損を含めた血管機能障害と関連した糖尿病の合併症の防止のためと同様に、そし
て糖尿病なしの患者における血管疾病、組織低酸素症、および虚血の治療と同様
に、血管疾病の治療に有用であることを立証し得ることを示唆する証拠をも提供
する。
損を含めた血管機能障害と関連した糖尿病の合併症の防止のためと同様に、そし
て糖尿病なしの患者における血管疾病、組織低酸素症、および虚血の治療と同様
に、血管疾病の治療に有用であることを立証し得ることを示唆する証拠をも提供
する。
【０１９７】 実施例７ 酸化的タンパク質修飾を阻害するための化合物 本発明は、化合物、および一般式：
【化１４】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ２である； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） を示す化合物およびその塩を含有する医薬組成物を包含する。
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ２である； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） を示す化合物およびその塩を含有する医薬組成物を包含する。
【０１９８】 本発明は、化合物、および一般式：
【化１５】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ２である； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである； Ｒ４は、Ｈ、またはＣ１−１８アルキルである； Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルカンである
） を示す化合物およびその塩を含有する医薬組成物をも包含する。
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２は、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨ２である； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである； Ｒ４は、Ｈ、またはＣ１−１８アルキルである； Ｒ５およびＲ６は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルカンである
） を示す化合物およびその塩を含有する医薬組成物をも包含する。
【０１９９】 さらに、本発明は、式
【化１６】 の化合物をも予想する。
【０２００】 本発明の化合物は、それに限定されないが−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−
ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＲ、および−ＮＨ−ＣＯＣＨ３（式中、Ｒは、Ｃ１−
１８アルキルである）のような１つまたはそれ以上の電子抜取基を具体化できる
。
ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＲ、および−ＮＨ−ＣＯＣＨ３（式中、Ｒは、Ｃ１−
１８アルキルである）のような１つまたはそれ以上の電子抜取基を具体化できる
。
【０２０１】 本発明で「アルキル」および「低級アルキル」では、例えば、メチル、エチル
、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、
ペンチル、２−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−ヘキシ
ル、３−ヘキシル、および３−メチルペンチルのような１−１８炭素原子を示す
直鎖または分岐鎖アルキル基が意味される。特に示されない限り、ここでアルキ
ル基置換基は、ヒドロキシ、モノ−またはジアルキルアミノ、フェニルまたはピ
リジルから独立に選択される少なくとも１つの基に都合により置換される。
、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、
ペンチル、２−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−ヘキシ
ル、３−ヘキシル、および３−メチルペンチルのような１−１８炭素原子を示す
直鎖または分岐鎖アルキル基が意味される。特に示されない限り、ここでアルキ
ル基置換基は、ヒドロキシ、モノ−またはジアルキルアミノ、フェニルまたはピ
リジルから独立に選択される少なくとも１つの基に都合により置換される。
【０２０２】 本発明の「アルコキシ」および「低級アルコキシ」は、例えば、メトキシル、
エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ
ｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペンチル、イソペントキシ、ネオペントキ
シ、ヘキソキシ、２−ヘキソキシ、３−ヘキソキシ、および３−メチルペントキ
シのような１−１８炭素原子を示す直鎖または分岐鎖アルコシキ基が意味される
。
エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ
ｅｒｔ−ブトキシ、ペントキシ、２−ペンチル、イソペントキシ、ネオペントキ
シ、ヘキソキシ、２−ヘキソキシ、３−ヘキソキシ、および３−メチルペントキ
シのような１−１８炭素原子を示す直鎖または分岐鎖アルコシキ基が意味される
。
【０２０３】 本発明の「アルケン」および「低級アルケン」は、例えば、エチレン、プロピ
レン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン、シスおよびトランス２−ブテ
ン、または２−ペンテン、イソブチレン、３−メチル−１−ブテン、２−メチル
−２−ブテン、および２，３−ジメチル−2−ブテンのような１−１８炭素原子
を示す直鎖または分岐鎖アルケン基が意味される。
レン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン、シスおよびトランス２−ブテ
ン、または２−ペンテン、イソブチレン、３−メチル−１−ブテン、２−メチル
−２−ブテン、および２，３−ジメチル−2−ブテンのような１−１８炭素原子
を示す直鎖または分岐鎖アルケン基が意味される。
【０２０４】 本発明の「その塩」によって、それに限定されないが、Ａｌ、Ｚｎ、Ｍｇ、Ｃ
ｕおよびＦｅのような上記化合物との塩および金属複合体として本発明の化合物
が意味される。
ｕおよびＦｅのような上記化合物との塩および金属複合体として本発明の化合物
が意味される。
【０２０５】 当業者は、標準法および技術を用いて本発明の化合物を作製し得る。
【０２０６】 本発明は、適切な担体中に１つまたはそれ以上の本発明の化合物、またはその
塩を含むことを特徴とする、医薬組成物を包含する。本発明は、インビボでＡＧ
Ｅ形成に関連する病理学の治療的介在のために本発明の医薬品を投与する方法を
包含する。本発明の１つの好ましい実施形態で、治療すべきＡＧＥ関連病理学は
、糖尿病性ネフロパシーに関連する。
塩を含むことを特徴とする、医薬組成物を包含する。本発明は、インビボでＡＧ
Ｅ形成に関連する病理学の治療的介在のために本発明の医薬品を投与する方法を
包含する。本発明の１つの好ましい実施形態で、治療すべきＡＧＥ関連病理学は
、糖尿病性ネフロパシーに関連する。
【０２０７】 本発明は、その概念または基本的特徴から逸脱することなしに、他の形態で具
体化されるか、または他の方法で行い得る。したがって、本開示および膨大な実
施例は、全ての点で、例示的であって、限定的であるとして意図されるべきでな
く、そして本発明の範囲は、付随の請求項に示され、そして全て等価性は、そこ
に受け入れられることが意図される。当業者は、本発明の等価な実施形態を認識
でき、そして本開示の教示および日常的実験のみを用いてそのような実施形態を
実施できる。
体化されるか、または他の方法で行い得る。したがって、本開示および膨大な実
施例は、全ての点で、例示的であって、限定的であるとして意図されるべきでな
く、そして本発明の範囲は、付随の請求項に示され、そして全て等価性は、そこ
に受け入れられることが意図される。当業者は、本発明の等価な実施形態を認識
でき、そして本開示の教示および日常的実験のみを用いてそのような実施形態を
実施できる。
【図１】 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導体の
効果を描く一連のグラフである。図１Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１Ｂはリ
ン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）、図１Ｃはピリドキサル（ＰＬ）、図１Ｄはピリド
キシン（ＰＮ）である。
効果を描く一連のグラフである。図１Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１Ｂはリ
ン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）、図１Ｃはピリドキサル（ＰＬ）、図１Ｄはピリド
キシン（ＰＮ）である。
【図２】 ウシ血清アルブミン中のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ１誘導体およびアミノ
グアニジン（ＡＧ）の効果を描く一連のグラフである。図２Ａはピロリン酸チア
ミン（ＴＰＰ）、図２Ｂはモノリン酸チアミン（ＴＰ）、図２Ｃはチアミン（Ｔ
）、図２Ｄはアミノグアニジン（ＡＧ）である。
グアニジン（ＡＧ）の効果を描く一連のグラフである。図２Ａはピロリン酸チア
ミン（ＴＰＰ）、図２Ｂはモノリン酸チアミン（ＴＰ）、図２Ｃはチアミン（Ｔ
）、図２Ｄはアミノグアニジン（ＡＧ）である。
【図３】 ヒトメトヘモグロビン（Ｈｂ）中のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導体の
効果を描く一連のグラフである。図３Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図３Ｂはリ
ン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）、図３Ｃはピリドキサル（ＰＬ）、図３Ｄはピリド
キシン（ＰＮ）である。
効果を描く一連のグラフである。図３Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図３Ｂはリ
ン酸ピリドキサル（ＰＬＰ）、図３Ｃはピリドキサル（ＰＬ）、図３Ｄはピリド
キシン（ＰＮ）である。
【図４】 ヒトメトヘモグロビン中のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ１誘導体およびアミ
ノグアニジン（ＡＧ）の効果を描く一連のグラフである。図４Ａはピロリン酸チ
アミン（ＴＰＰ）、図４Ｂはモノリン酸チアミン（ＰＬＰ）、図４Ｃはチアミン
（Ｔ）、図４Ｄはアミノグアニジン（ＡＧ）である。
ノグアニジン（ＡＧ）の効果を描く一連のグラフである。図４Ａはピロリン酸チ
アミン（ＴＰＰ）、図４Ｂはモノリン酸チアミン（ＰＬＰ）、図４Ｃはチアミン
（Ｔ）、図４Ｄはアミノグアニジン（ＡＧ）である。
【図５】 ピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）、ピリドキサミン（ＰＭ）およびアミノグアニ
ジン（ＡＧ）によるリボヌクレアーゼＡのグリケーションの阻害の棒グラフ比較
である。
ジン（ＡＧ）によるリボヌクレアーゼＡのグリケーションの阻害の棒グラフ比較
である。
【図６】 図６Ａは、ＥＬＩＳＡによって監視されるときのリボースによるＲＮアーゼ（
１０ｍｇ／ｍＬ）のグリケーションの速度論のグラフである。図６Ｂは、ｐＨ７
．５でのリボース濃度における逆数半減期の依存性を示すグラフである。
１０ｍｇ／ｍＬ）のグリケーションの速度論のグラフである。図６Ｂは、ｐＨ７
．５でのリボース濃度における逆数半減期の依存性を示すグラフである。
【図７】 ＥＬＩＳＡによって監視されるときのグルコース（７Ｂ）およびリボース（７
Ａ）によるＲＮアーゼの非中断および中断グリケーションの比較を示す２つのグ
ラフである。
Ａ）によるＲＮアーゼの非中断および中断グリケーションの比較を示す２つのグ
ラフである。
【図８】 ＲＮアーゼの非中断および中断リボースグリケーションの間中のペントシジン
蛍光（任意の単位）増加の速度論を示す２つのグラフである。図８Ａは、０．０
５Ｍリボースの存在下での非中断グリケーションであり、図８Ｂは、インキュベ
ーションの８および２４時間後の中断グリケーションである。
蛍光（任意の単位）増加の速度論を示す２つのグラフである。図８Ａは、０．０
５Ｍリボースの存在下での非中断グリケーションであり、図８Ｂは、インキュベ
ーションの８および２４時間後の中断グリケーションである。
【図９】 反応性中間体構築の速度論を示すグラフである。
【図１０】 リボースによるＡＧＥ形成の後期アマドリ阻害のグラフである。図１０Ａは、
時間０の時点で緩衝液を含有する阻害剤に、アリコート量を希釈した場合のデー
タをグラフで表す。図１０Ｂは、２４時間でサンプルが中断され、そしてその後
、緩衝液を含有する阻害剤に希釈される場合のデータをグラフで表す。
時間０の時点で緩衝液を含有する阻害剤に、アリコート量を希釈した場合のデー
タをグラフで表す。図１０Ｂは、２４時間でサンプルが中断され、そしてその後
、緩衝液を含有する阻害剤に希釈される場合のデータをグラフで表す。
【図１１】 グリケーションの中断に続くｐＨにおける抗原性ＡＧＥの形成の当初速度の依
存性を示すグラフである。
存性を示すグラフである。
【図１２】 中断グリケーションの後のＥＬＩＳＡで検出されたＡＧＥ形成におけるｐＨ飛
躍の効果を示す２つのグラフである。ｐＨ５．０緩衝液中で３７℃で１２日間残
された中断サンプルは、低ｐＨ（図１２Ａ）にさらされていない正常な対照サン
プルに比較したとき、実質的ＡＧＥ（３３％、図１２Ｂ）を生成した。
躍の効果を示す２つのグラフである。ｐＨ５．０緩衝液中で３７℃で１２日間残
された中断サンプルは、低ｐＨ（図１２Ａ）にさらされていない正常な対照サン
プルに比較したとき、実質的ＡＧＥ（３３％、図１２Ｂ）を生成した。
【図１３】 リボースによるリボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ）の非中断グリケーション
の間中のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導体の効果を描く一連のグラフであ
る。図１３Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１３Ｂはピリドキサル−５’−リン
酸塩（ＰＬＰ）、図１３Ｃはピリドキサル（ＰＬ）、図１３Ｄはピリドキシン（
ＰＮ）である。
の間中のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導体の効果を描く一連のグラフであ
る。図１３Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１３Ｂはピリドキサル−５’−リン
酸塩（ＰＬＰ）、図１３Ｃはピリドキサル（ＰＬ）、図１３Ｄはピリドキシン（
ＰＮ）である。
【図１４】 リボースによるリボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ）の非中断グリケーション
の間中のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ１誘導体およびアミノグアニジン（ＡＧ
）の効果を描く一連のグラフである。図１４Ａはピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）
、図１４Ｂはモノリン酸チアミン（ＴＰ）、図１４Ｃはチアミン（Ｔ）、図１４
Ｄはアミノグアニジン（ＡＧ）である。
の間中のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ１誘導体およびアミノグアニジン（ＡＧ
）の効果を描く一連のグラフである。図１４Ａはピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）
、図１４Ｂはモノリン酸チアミン（ＴＰ）、図１４Ｃはチアミン（Ｔ）、図１４
Ｄはアミノグアニジン（ＡＧ）である。
【図１５】 リボースによるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の非中断グリケーションの間中
のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導体の効果を描く一連のグラフである。図
１５Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１５Ｂはピリドキサル−５’−リン酸塩（
ＰＬＰ）、図１５Ｃはピリドキサル（ＰＬ）、図１５Ｄはピリドキシン（ＰＮ）
である。
のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導体の効果を描く一連のグラフである。図
１５Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１５Ｂはピリドキサル−５’−リン酸塩（
ＰＬＰ）、図１５Ｃはピリドキサル（ＰＬ）、図１５Ｄはピリドキシン（ＰＮ）
である。
【図１６】 リボースによるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の非中断グリケーションの間中
のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ１誘導体およびアミノグアニジン（ＡＧ）の効
果を描く一連のグラフである。図１６Ａはピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）、図１
６Ｂはモノリン酸チアミン（ＴＰ）、図１６Ｃはチアミン（Ｔ）、図１６Ｄはア
ミノグアニジン（ＡＧ）である。
のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ１誘導体およびアミノグアニジン（ＡＧ）の効
果を描く一連のグラフである。図１６Ａはピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）、図１
６Ｂはモノリン酸チアミン（ＴＰ）、図１６Ｃはチアミン（Ｔ）、図１６Ｄはア
ミノグアニジン（ＡＧ）である。
【図１７】 リボースによるヒトメトヘモグロビン（Ｈｂ）の非中断グリケーションの間中
のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導体の効果を描く一連のグラフである。図
１７Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１７Ｂはピリドキサル−５’−リン酸塩（
ＰＬＰ）、図１７Ｃはピリドキサル（ＰＬ）、図１７Ｄはピリドキシン（ＰＮ）
である。
のＡＧＥ形成におけるビタミンＢ６誘導体の効果を描く一連のグラフである。図
１７Ａはピリドキサミン（ＰＭ）、図１７Ｂはピリドキサル−５’−リン酸塩（
ＰＬＰ）、図１７Ｃはピリドキサル（ＰＬ）、図１７Ｄはピリドキシン（ＰＮ）
である。
【図１８】 リボースによる中断グリケーションの後の後期アマドリＡＧＥ形成におけるビ
タミンＢ６誘導体の効果を描く一連のグラフである。図１８ＡはＢＳＡおよびピ
リドキサミン（ＰＭ）、図１８ＢはＢＳＡおよびピリドキサル−５’−リン酸塩
（ＰＬＰ）、図１８ＣはＢＳＡおよびピリドキサル（ＰＬ）、図１８ＤはＲＮア
ーゼおよびピリドキサミン（ＰＭ）である。
タミンＢ６誘導体の効果を描く一連のグラフである。図１８ＡはＢＳＡおよびピ
リドキサミン（ＰＭ）、図１８ＢはＢＳＡおよびピリドキサル−５’−リン酸塩
（ＰＬＰ）、図１８ＣはＢＳＡおよびピリドキサル（ＰＬ）、図１８ＤはＲＮア
ーゼおよびピリドキサミン（ＰＭ）である。
【図１９】 リボースによる中断グリケーションの後の後期アマドリＡＧＥ形成におけるピ
ロリン酸チアミンの効果を描くグラフである。図１９ＡはＲＮアーゼ、図１９Ｂ
はＢＳＡである。
ロリン酸チアミンの効果を描くグラフである。図１９ＡはＲＮアーゼ、図１９Ｂ
はＢＳＡである。
【図２０】 リボースによる中断グリケーションの後の後期アマドリＡＧＥ形成におけるア
ミノグアニジンの効果を描くグラフである。図２０ＡはＲＮアーゼ、図２０Ｂは
ＢＳＡである。
ミノグアニジンの効果を描くグラフである。図２０ＡはＲＮアーゼ、図２０Ｂは
ＢＳＡである。
【図２１】 リボースによる中断グリケーションの後の後期アマドリＡＧＥ形成におけるＮ
−アセチル−Ｌ−リシンの効果を描くグラフである。
−アセチル−Ｌ−リシンの効果を描くグラフである。
【図２２】 リボソームによるＲＮアーゼ（図２２Ａ）およびＢＳＡ（図２２Ｂ）の中断グ
リケーションの後のピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）、ピリドキサミン（ＰＭ）お
よびアミノグアニジン（ＡＧ）によるＡＧＥ形成の後期アマドリ阻害の比較を示
す棒グラフである。
リケーションの後のピロリン酸チアミン（ＴＰＰ）、ピリドキサミン（ＰＭ）お
よびアミノグアニジン（ＡＧ）によるＡＧＥ形成の後期アマドリ阻害の比較を示
す棒グラフである。
【図２３】 ラット尾部カフ血圧でのインビボでのリボース処置単独の効果を示す棒グラフ
である。処置は、１、２または８日間（日）注射された０．０５Ｍ、０．３０Ｍ
および１Ｍリボース（Ｒ）を用いた。
である。処置は、１、２または８日間（日）注射された０．０５Ｍ、０．３０Ｍ
および１Ｍリボース（Ｒ）を用いた。
【図２４】 ラットのクレアチニンのクリアランス（１００ｇ体重当たりのクリアランス）
でのインビボでのリボース処置単独の効果を示す棒グラフである。処置は、１、
２または８日間（日）注射された０．０５Ｍ、０．３０Ｍおよび１Ｍリボース（
Ｒ）を用いた。
でのインビボでのリボース処置単独の効果を示す棒グラフである。処置は、１、
２または８日間（日）注射された０．０５Ｍ、０．３０Ｍおよび１Ｍリボース（
Ｒ）を用いた。
【図２５】 ラットの蛋白尿症（アルブミン滲出速度）でのインビボでのリボース処置単独
の効果を示す棒グラフである。処置は、１、２または８日間（日）注射された０
．３０Ｍおよび１Ｍリボース（Ｒ）を用いた。
の効果を示す棒グラフである。処置は、１、２または８日間（日）注射された０
．３０Ｍおよび１Ｍリボース（Ｒ）を用いた。
【図２６】 ラット尾部カフ血圧でのインビボでのリボースを用いた、またはなしの阻害剤
処置の効果を示す棒グラフである。処置群は、２５ｍｇ／体重ｋｇのアミノグア
ニジン（ＡＧ）、２５または２５０ｍｇ／体重ｋｇのピリドキサミン（Ｐ）、２
５０ｍｇ／体重ｋｇのピロリン酸チアミン（Ｔ）、または１Ｍリボース（Ｒ）を
用いた。
処置の効果を示す棒グラフである。処置群は、２５ｍｇ／体重ｋｇのアミノグア
ニジン（ＡＧ）、２５または２５０ｍｇ／体重ｋｇのピリドキサミン（Ｐ）、２
５０ｍｇ／体重ｋｇのピロリン酸チアミン（Ｔ）、または１Ｍリボース（Ｒ）を
用いた。
【図２７】 ラットのクレアチニンのクリアランス（体重１００ｇ当たりのクリアランス）
でのインビボでのリボースを用いた、またはなしの阻害剤処置の効果を示す棒グ
ラフである。処置群は、２５ｍｇ／体重ｋｇのアミノグアニジン（ＡＧ）、２５
または２５０ｍｇ／体重ｋｇのピリドキサミン（Ｐ）、２５０ｍｇ／体重ｋｇの
ピロリン酸チアミン（Ｔ）、または１Ｍリボース（Ｒ）を用いた。
でのインビボでのリボースを用いた、またはなしの阻害剤処置の効果を示す棒グ
ラフである。処置群は、２５ｍｇ／体重ｋｇのアミノグアニジン（ＡＧ）、２５
または２５０ｍｇ／体重ｋｇのピリドキサミン（Ｐ）、２５０ｍｇ／体重ｋｇの
ピロリン酸チアミン（Ｔ）、または１Ｍリボース（Ｒ）を用いた。
【図２８】 ラットの蛋白尿症（アルブミン滲出速度）でのインビボでのリボースなし、ま
たはリボース単独の阻害剤処置の効果を示す棒グラフである。処置群は、８日間
（日）、２５ｍｇ／体重ｋｇのアミノグアニジン（ＡＧ）、２５０ｍｇ／体重ｋ
ｇのピリドキサミン（Ｐ）、２５０ｍｇ／体重ｋｇのピロリン酸チアミン（Ｔ）
であるか、または１Ｍリボース（Ｒ）を用いた。対照群は、処置なしであった。
たはリボース単独の阻害剤処置の効果を示す棒グラフである。処置群は、８日間
（日）、２５ｍｇ／体重ｋｇのアミノグアニジン（ＡＧ）、２５０ｍｇ／体重ｋ
ｇのピリドキサミン（Ｐ）、２５０ｍｇ／体重ｋｇのピロリン酸チアミン（Ｔ）
であるか、または１Ｍリボース（Ｒ）を用いた。対照群は、処置なしであった。
【図２９】 ラットの蛋白尿症（アルブミン滲出速度）でのインビボでの１Ｍリボースを用
いた阻害剤処置の効果を示す棒グラフである。処置群は、８日間（日）単独で、
２５ｍｇ／体重ｋｇのアミノグアニジン（ＡＧ）、２５および２５０ｍｇ／体重
ｋｇのピリドキサミン（Ｐ）、２５０ｍｇ／体重ｋｇのピロリン酸チアミン（Ｔ
）であるか、または１Ｍリボース（Ｒ）を用いた。対照群は、処置なしであった
。
いた阻害剤処置の効果を示す棒グラフである。処置群は、８日間（日）単独で、
２５ｍｇ／体重ｋｇのアミノグアニジン（ＡＧ）、２５および２５０ｍｇ／体重
ｋｇのピリドキサミン（Ｐ）、２５０ｍｇ／体重ｋｇのピロリン酸チアミン（Ｔ
）であるか、または１Ｍリボース（Ｒ）を用いた。対照群は、処置なしであった
。
【図３０】 図３０Ａは、タンパク質からのＡＧＥ形成のダイアグラムを示す模式図１を描く
。図３０Ｂは、アミノグアニジンの化学的構造である模式図２を描く。図３０Ｃ
は、チアミン、チアミン−５’−リン酸塩、およびピロリン酸チアミンの化学的
構造である模式図３を描く。図３０Ｄは、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリ
ドキサル−５’−リン酸塩、およびピリドキサルの化学的構造である模式図４を
描く。図３０Ｅは、ＡＧＥ形成の速度論の代表例である模式図５を描く。図３０
Ｆは、ＡＧＥ形成および中間体形成の速度論の代表例である模式図６を描く。
。図３０Ｂは、アミノグアニジンの化学的構造である模式図２を描く。図３０Ｃ
は、チアミン、チアミン−５’−リン酸塩、およびピロリン酸チアミンの化学的
構造である模式図３を描く。図３０Ｄは、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリ
ドキサル−５’−リン酸塩、およびピリドキサルの化学的構造である模式図４を
描く。図３０Ｅは、ＡＧＥ形成の速度論の代表例である模式図５を描く。図３０
Ｆは、ＡＧＥ形成および中間体形成の速度論の代表例である模式図６を描く。
【図３１】 ９９％［２−Ｃ１３］リボースとの２４時間反応によって製造されたリオボヌ
クレアーゼアマドリ中間体の１２５ＭＨｚＣ−１３ＮＭＲ共鳴スペクトラムを示
す。
クレアーゼアマドリ中間体の１２５ＭＨｚＣ−１３ＮＭＲ共鳴スペクトラムを示
す。
【図３２】 ペントースであるキシロース、リキソース、アラビノースおよびリボースを用
いたＡＧＥ中間形成を示すグラフである。
いたＡＧＥ中間形成を示すグラフである。
【図３３】 アルシアンブルーを用いたｐＨ２．５での糸球体染色の結果を示すグラフであ
る。
る。
【図３４】 アルシアンブルーを用いたｐＨ１．０での糸球体染色の結果を示すグラフであ
る。
る。
【図３５】 ＲＳＡについての免疫蛍光性糸球体染色の結果を示すグラフである。
【図３６】 ヘパランスルフェートプロテオグリカンコアタンパク質についての免疫蛍光性
糸球体染色の結果を示すグラフである。
糸球体染色の結果を示すグラフである。
【図３７】 ヘパランスルフェートプロテオグリカン側鎖についての免疫蛍光性糸球体染色
の結果を示すグラフである。
の結果を示すグラフである。
【図３８】 平均糸球体容積についての糸球体切片の分析の結果を示すグラフである。
【図３９】 ＳＴＺ−糖尿病性ラットでのネフロパシーの発生におけるＡＧおよびＰＭの影響
である。尿（２４時間サンプル）および血液を、蛋白尿（Ａ）および血漿クレア
チニン（Ｂ）の測定のために４週間隔で収集した。非糖尿病性対照（●）、非糖
尿病性対照＋ＰＭ（■）、未治療糖尿病（○）、糖尿病＋ＰＭ（□）、および糖
尿病＋ＡＧ（△）群についてのデータは、平均±ＳＥＭとして表される。蛋白尿
（Ｃ）を、実験の終わり（２８週の糖尿病）に２４時間収集で測定した。マン−
ホワイトニーの等級総計試験によって測定された統計的要約は、Ａ、ＢおよびＣ
での全糖尿病群対、非糖尿病性対照、ｐ≦０．００１である。（Ａ、蛋白尿）は
、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．０００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＝０．０５であり
、Ｄ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＜０．０１である。（Ｂ、クレアチニン尿）は、Ｄ−
ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．０００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＝０．０５、そしてＤ−
ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＝０．０２である。（Ｃ、蛋白尿）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜
０．００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．０１、そしてＤ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、
ＮＳである。
である。尿（２４時間サンプル）および血液を、蛋白尿（Ａ）および血漿クレア
チニン（Ｂ）の測定のために４週間隔で収集した。非糖尿病性対照（●）、非糖
尿病性対照＋ＰＭ（■）、未治療糖尿病（○）、糖尿病＋ＰＭ（□）、および糖
尿病＋ＡＧ（△）群についてのデータは、平均±ＳＥＭとして表される。蛋白尿
（Ｃ）を、実験の終わり（２８週の糖尿病）に２４時間収集で測定した。マン−
ホワイトニーの等級総計試験によって測定された統計的要約は、Ａ、ＢおよびＣ
での全糖尿病群対、非糖尿病性対照、ｐ≦０．００１である。（Ａ、蛋白尿）は
、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．０００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＝０．０５であり
、Ｄ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＜０．０１である。（Ｂ、クレアチニン尿）は、Ｄ−
ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．０００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＝０．０５、そしてＤ−
ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＝０．０２である。（Ｃ、蛋白尿）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜
０．００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．０１、そしてＤ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、
ＮＳである。
【図４０】 ＳＴＺ−糖尿病性ラットにおけるＡＧおよびＰＭの影響である。実験の終わり
（２８週）に得られた血漿を、トリグリセリド（Ａ）、総コレステロール（Ｂ）
、遊離脂肪酸（Ｃ）およびグリセロール（Ｄ）について分析した。非糖尿病性対
照（●）、非糖尿病性対照＋ＰＭ（■）、未治療糖尿病群（○）、糖尿病＋ＰＭ
群（□）、および糖尿病＋ＡＧ群（△）についてのデータは、平均±ＳＤである
。統計的分析は、マン−ホワイトニーの等級総計試験によって行われた。Ａ、Ｂ
、ＣおよびＤでの全糖尿病群対、非糖尿病性対照、ｐ＜０．００１である。（Ａ
）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＝０．０００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．０５、
そしてＤ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＜０．０１である。（Ｂ）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、Ｄ
−ＡＧ対Ｄ、ＮＳであり、Ｄ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＜０．０１である。（Ｃ）は
、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＝０．００２であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．００１、そし
てＤ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ＮＳである。（Ｄ）は、Ｄ対Ｃ、ｐ＜０．０００１であ
り、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．０００１、そしてＤ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．０００１
、Ｄ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ＮＳである。
（２８週）に得られた血漿を、トリグリセリド（Ａ）、総コレステロール（Ｂ）
、遊離脂肪酸（Ｃ）およびグリセロール（Ｄ）について分析した。非糖尿病性対
照（●）、非糖尿病性対照＋ＰＭ（■）、未治療糖尿病群（○）、糖尿病＋ＰＭ
群（□）、および糖尿病＋ＡＧ群（△）についてのデータは、平均±ＳＤである
。統計的分析は、マン−ホワイトニーの等級総計試験によって行われた。Ａ、Ｂ
、ＣおよびＤでの全糖尿病群対、非糖尿病性対照、ｐ＜０．００１である。（Ａ
）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＝０．０００１であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．０５、
そしてＤ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＜０．０１である。（Ｂ）は、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、Ｄ
−ＡＧ対Ｄ、ＮＳであり、Ｄ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ｐ＜０．０１である。（Ｃ）は
、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＝０．００２であり、Ｄ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．００１、そし
てＤ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ＮＳである。（Ｄ）は、Ｄ対Ｃ、ｐ＜０．０００１であ
り、Ｄ−ＰＭ対Ｄ、ｐ＜０．０００１、そしてＤ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＜０．０００１
、Ｄ−ＰＭ対Ｄ−ＡＧ、ＮＳである。
【図４１】 ＳＴＺ−糖尿病性ラットでの酸化還元不均衡におけるＡＧおよびＰＭの影響で
ある。実験の終わり（２８週）に得られた血漿を、乳酸塩（Ａ）およびピルビン
酸塩（Ｂ）濃度について分析した。酸化還元状態の指数である乳酸塩／ピルビン
酸塩のそれらの比は、フレーム（Ｃ）に示される。記号は、図２に凡例で定義さ
れる。統計的分析は、マン−ホワイトニーの等級総計試験によって行われた。（
Ｃ、乳酸塩／ピルビン酸塩）は、Ｄ対Ｃ、ｐ＜０．０００１であり、Ｄ−ＰＭ対
Ｄ、ｐ＜０．００１、そしてＤ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＝０．００２；Ｄ−ＰＭ対Ｄ−Ａ
Ｇ、ｐ＜０．０１である。
ある。実験の終わり（２８週）に得られた血漿を、乳酸塩（Ａ）およびピルビン
酸塩（Ｂ）濃度について分析した。酸化還元状態の指数である乳酸塩／ピルビン
酸塩のそれらの比は、フレーム（Ｃ）に示される。記号は、図２に凡例で定義さ
れる。統計的分析は、マン−ホワイトニーの等級総計試験によって行われた。（
Ｃ、乳酸塩／ピルビン酸塩）は、Ｄ対Ｃ、ｐ＜０．０００１であり、Ｄ−ＰＭ対
Ｄ、ｐ＜０．００１、そしてＤ−ＡＧ対Ｄ、ｐ＝０．００２；Ｄ−ＰＭ対Ｄ−Ａ
Ｇ、ｐ＜０．０１である。
【図４２】 皮膚コラーゲン中のＡＧＥと、生化学および生理学上のパラメータとの間の相
互関係である。相互関係は、ＣＭＬと血漿トリグリセリド（Ａ）との間、尿中ア
ルブミンと血漿トリグリセリド濃度（Ｂ）との間、およびＣＭＬと尿中アルブミ
ン濃度（Ｃ）との間で示される。パーソンの産物モーメント計算によって統計的
分析が行われた。記号は、図２に凡例で定義される。相互関係の係数およびｐ値
は、表３で要約される。
互関係である。相互関係は、ＣＭＬと血漿トリグリセリド（Ａ）との間、尿中ア
ルブミンと血漿トリグリセリド濃度（Ｂ）との間、およびＣＭＬと尿中アルブミ
ン濃度（Ｃ）との間で示される。パーソンの産物モーメント計算によって統計的
分析が行われた。記号は、図２に凡例で定義される。相互関係の係数およびｐ値
は、表３で要約される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｄ 213/66 Ｃ０７Ｄ 213/66 213/69 213/69 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベインズ、 ジョン ダブリュー． アメリカ合衆国 29205 サウスカロライ ナ州 コロンビア サルダ アヴェニュー 206 (72)発明者 ソープ、 スザンヌ アール． アメリカ合衆国 29205 サウスカロライ ナ州 コロンビア サルダ アヴェニュー 206 (72)発明者 デゲンハルト、 トルステン ピー． アメリカ合衆国 27713 ノースカロライ ナ州 ダーラム スウィート 120 メリ ディアン パークウェイ 2605 (72)発明者 カーリファー、 ラジャ ガブリエル アメリカ合衆国 66207 カンザス州 オ ヴァーランド パーク ウエスト ナイン ティエイス テラス 5701 (72)発明者 ハドスン、 ビリー アメリカ合衆国 66219 カンザス州 レ ネクサ ウエスト ナインティフォース ストリート 15414 (72)発明者 アルダースン、 ネイサン アメリカ合衆国 29710 サウスカロライ ナ州 ダブリュー． コロンビア シェイ ドランド サークル 106 Ｆターム(参考） 4C055 AA01 BA02 BA03 BA05 BA06 BA27 CA03 CA06 CA16 CA42 DA06 DA16 DA27 4C086 AA01 AA02 BC17 BC18 MA01 MA04 NA14 ZA45 ZB21 ZC33 ZC35 4C206 AA01 AA02 FA11 KA01 MA01 MA04 NA14 ZA45 ZB21 ZC33 ZC35
Claims (28)
- 【請求項１】 糖尿病哺乳類に、糖尿病関連高脂血症を治療するのに有効な
量の一般式： 【化１】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） で表される化合物、およびその塩を投与することを特徴とする哺乳類での糖尿病
関連高脂血症を治療する方法。 - 【請求項２】 糖尿病哺乳類に、糖尿病関連高脂血症を予防するのに有効な
量の一般式： 【化２】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） で表される化合物、およびその塩を投与することを特徴とする哺乳類での糖尿病
関連高脂血症を予防する方法。 - 【請求項３】 糖尿病哺乳類に、細胞の酸化還元不均衡を治療するのに有効
な量の一般式： 【化３】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） で表される化合物、およびその塩を投与することを特徴とする糖尿病哺乳類での
細胞の酸化還元不均衡を治療する方法。 - 【請求項４】 細胞の酸化還元不均衡が、低酸素症または偽低酸素症によっ
て引き起こされる請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 低酸素症または偽低酸素症が、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の増加を
生じる請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 糖尿病哺乳類に、細胞の酸化還元不均衡を予防するのに有効
な量の一般式： 【化４】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） で表される化合物、およびその塩を投与することを特徴とする糖尿病哺乳類での
細胞の酸化還元不均衡を予防する方法。 - 【請求項７】 細胞の酸化還元不均衡が、低酸素症または偽低酸素症によっ
て引き起こされる請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 低酸素症または偽低酸素症が、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の増加を
生じる請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 糖尿病哺乳類に、糖尿病関連高コレステロール血症を治療す
るのに有効な量の一般式： 【化５】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） で表される化合物、およびその塩を投与することを特徴とする哺乳類での糖尿病
関連高コレステロール血症を治療する方法。 - 【請求項１０】 糖尿病哺乳類に、血清コレステロール濃度における糖尿病
に関連した増加を予防するのに有効な量の一般式： 【化６】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） で表される化合物、およびその塩を投与することを特徴とする哺乳類での糖尿病
に関連した高コレステロール血症を予防する方法。 - 【請求項１１】 糖尿病哺乳類に、糖尿病関連高トリグリセリド血症を治療
するのに有効な量の一般式： 【化７】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） で表される化合物、およびその塩を投与することを特徴とする哺乳類での糖尿病
関連高トリグリセリド血濃度を治療する方法。 - 【請求項１２】 糖尿病哺乳類に、糖尿病関連高トリグリセリド血症を予防
するのに有効な量の一般式： 【化８】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） で表される化合物、およびその塩を投与することを特徴とする哺乳類での高トリ
グリセリド血症における糖尿病に関連した増加を予防する方法。 - 【請求項１３】 糖尿病哺乳類に、アテローム性硬化症を治療するのに有効
な量の一般式： 【化９】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） で表される化合物、およびその塩を投与することを特徴とする糖尿病哺乳類での
アテローム性硬化症を治療する方法。 - 【請求項１４】 糖尿病哺乳類に、アテローム性硬化症を予防するのに有効
な量の一般式： 【化１０】 （式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＮＨ２、ＣＨ２ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、
ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ、またはＣＨ２ＣＯＯＨである； Ｒ２およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシ
またはアルケンである； Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−１８アルキル、アルコキシまたはアルケンである
； Ｙは、ＹがＮである場合Ｒ３は何もなく、そしてＹがＣである場合Ｒ３はＮＯ２ または他の電子抜取基であるようにＮまたはＣである） で表される化合物、およびその塩を投与することを特徴とする糖尿病哺乳類での
アテローム性硬化症を予防する方法。 - 【請求項１５】 糖尿病哺乳類に、糖尿病関連高脂血症を治療するのに有効
な量のピリドキサミンを投与することを特徴とする哺乳類での糖尿病関連高脂血
症を治療する方法。 - 【請求項１６】 糖尿病哺乳類に、糖尿病関連高脂血症を予防するのに有効
な量のピリドキサミンを投与することを特徴とする哺乳類での糖尿病関連高脂血
症を予防する方法。 - 【請求項１７】 糖尿病哺乳類に、細胞の酸化還元不均衡を治療するのに有
効な量のピリドキサミンを投与することを特徴とする糖尿病哺乳類での細胞の酸
化還元不均衡を治療する方法。 - 【請求項１８】 細胞の酸化還元不均衡が、低酸素症または偽低酸素症によ
って引き起こされる請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 低酸素症または偽低酸素症が、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の増加
を生じる請求項４に記載の方法。 - 【請求項２０】 糖尿病哺乳類に、細胞の酸化還元不均衡を予防するのに有
効な量のピリドキサミンを投与することを特徴とする糖尿病哺乳類での細胞の酸
化還元不均衡を予防する方法。 - 【請求項２１】 細胞の酸化還元不均衡が、低酸素症または偽低酸素症によ
って引き起こされる請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 低酸素症または偽低酸素症が、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ比の増加
を生じる請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 糖尿病哺乳類に、糖尿病関連高コレステロール血症を治療
するのに有効な量のピリドキサミンを投与することを特徴とする糖尿病哺乳類で
の糖尿病関連高コレステロール血症を治療する方法。 - 【請求項２４】 糖尿病哺乳類に、糖尿病関連高コレステロール血症を予防
するのに有効な量のピリドキサミンを投与することを特徴とする糖尿病哺乳類で
の糖尿病関連高コレステロール血症を予防する方法。 - 【請求項２５】 糖尿病哺乳類に、高トリグリセリド血症における糖尿病に
関連した増加を治療するのに有効な量のピリドキサミンを投与することを特徴と
する哺乳類での高トリグリセリド血症における糖尿病に関連した増加を治療する
方法。 - 【請求項２６】 糖尿病哺乳類に、高トリグリセリド血症における糖尿病に
関連した増加を予防するのに有効な量のピリドキサミンを投与することを特徴と
する哺乳類での高トリグリセリド血症における糖尿病に関連した増加を予防する
方法。 - 【請求項２７】 糖尿病哺乳類に、アテローム性硬化症を治療するのに有効
な量のピリドキサミンを投与することを特徴とする糖尿病哺乳類でのアテローム
性硬化症を治療する方法。 - 【請求項２８】 糖尿病哺乳類に、アテローム性硬化症を予防するのに有効
な量のピリドキサミンを投与することを特徴とする糖尿病哺乳類でのアテローム
性硬化症を予防する方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10518298P | 1998-10-22 | 1998-10-22 | |
| US60/105,182 | 1998-10-22 | ||
| PCT/US1999/024611 WO2000023063A2 (en) | 1998-10-22 | 1999-10-21 | Methods for inhibiting diabetic complications |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002527471A true JP2002527471A (ja) | 2002-08-27 |
| JP3864050B2 JP3864050B2 (ja) | 2006-12-27 |
Family
ID=22304498
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000576838A Expired - Fee Related JP3864050B2 (ja) | 1998-10-22 | 1999-10-21 | 糖尿病合併症を治療または予防するための医薬組成物 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1121121B1 (ja) |
| JP (1) | JP3864050B2 (ja) |
| AT (1) | ATE241982T1 (ja) |
| AU (2) | AU762030B2 (ja) |
| CA (1) | CA2347117C (ja) |
| DE (1) | DE69908630T2 (ja) |
| ES (1) | ES2197689T3 (ja) |
| WO (1) | WO2000023063A2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006126523A1 (ja) * | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Tokai University Educational System | 腹膜保護剤 |
| WO2012011588A1 (ja) * | 2010-07-23 | 2012-01-26 | 学校法人東海大学 | 腹膜透析患者用の経口医薬組成物及びその用法 |
| JP2015051956A (ja) * | 2013-09-09 | 2015-03-19 | 株式会社パーマケム・アジア | ピリドキサール・アミノグアニジン誘導体またはそれらの塩、及び、その製造方法 |
| WO2016031839A1 (ja) * | 2014-08-29 | 2016-03-03 | 株式会社プロジェクトＰｍ | ピリドキサミン化合物及びチアミン化合物を組み合わせてなる医薬組成物 |
| US11253519B2 (en) | 2016-03-02 | 2022-02-22 | Renascience Co., Ltd. | Composition used to improve symptoms of autism spectrum disorder, and method using same for improving symptoms of autism spectrum disorder |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE333868T1 (de) * | 2000-11-02 | 2006-08-15 | Univ South Carolina | Verwendung von pyridoxamin für die behandlung und unterdrückung von komplikationen im zusammenhang mit adipositas |
| AU2002237667A1 (en) | 2000-11-20 | 2002-05-27 | University Of Kansas Medical Center | Methods for the treatment and prevention of urinary stone disease |
| PL1643999T3 (pl) * | 2003-06-20 | 2012-02-29 | Nephrogenex Inc | Pirydoksamina do zastosowania w leczeniu nefropatii cukrzycowej w cukrzycy typu II |
| JP4976851B2 (ja) | 2003-10-27 | 2012-07-18 | シティ・オブ・ホープ | 脂質レベルを哺乳動物において低下させる方法 |
| WO2006019851A1 (en) * | 2004-07-23 | 2006-02-23 | Eli Lilly And Company | Methods for diagnosing and treating diabetic microvascular complications |
| WO2008013660A2 (en) * | 2006-07-07 | 2008-01-31 | Biostratum, Inc. | Inhibitors of advanced glycation end products |
| US20180153827A1 (en) * | 2016-09-06 | 2018-06-07 | Metabolic Technologies, Inc. | Compositions and methods of use of gamma-ketoaldehyde scavengers for treating, preventing or improving nonalcoholic fatty liver disease (nafld), nash, ald or conditions related to the liver |
| WO2021022215A1 (en) | 2019-08-01 | 2021-02-04 | Khalifah Raja G | Inhibitors of advanced glycation end products |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH607773A5 (en) * | 1974-12-24 | 1978-10-31 | Steigerwald Arzneimittelwerk | Process for the preparation of novel pyridoxine derivatives |
| FR2349330A1 (fr) * | 1976-04-29 | 1977-11-25 | Savini Emile | Composition destinee au traitement des hyperlipidemies |
| US5288716A (en) * | 1987-02-18 | 1994-02-22 | Ulrich Speck | Use of pyridoxine derivatives in the prevention and treatment of hyperlipidaemia and atherosclerosis |
| WO1991011997A1 (fr) * | 1990-02-19 | 1991-08-22 | Senju Pharmaceutical Co., Ltd. | Inhibiteur de la reaction de maillard |
| US6228858B1 (en) * | 1995-09-12 | 2001-05-08 | University Of Kansas Medical Center | Advanced glycation end-product intermediaries and post-amadori inhibition |
| US5744451A (en) * | 1995-09-12 | 1998-04-28 | Warner-Lambert Company | N-substituted glutamic acid derivatives with interleukin-1 β converting enzyme inhibitory activity |
| JPH10158244A (ja) * | 1996-12-02 | 1998-06-16 | Kissei Pharmaceut Co Ltd | ５−アミノアルキル−４−アミノメチル−３−ヒドロキシピリジン誘導体およびそれらを含有するメイラード反応阻害剤 |
| JPH10175954A (ja) * | 1996-12-12 | 1998-06-30 | Kissei Pharmaceut Co Ltd | ４−アミノメチル−３−ヒドロキシピリジン誘導体およびそれらを含有するメイラード反応阻害剤 |
-
1999
- 1999-10-21 AU AU11274/00A patent/AU762030B2/en not_active Ceased
- 1999-10-21 WO PCT/US1999/024611 patent/WO2000023063A2/en active IP Right Grant
- 1999-10-21 JP JP2000576838A patent/JP3864050B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-21 ES ES99955093T patent/ES2197689T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-21 AT AT99955093T patent/ATE241982T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-10-21 EP EP99955093A patent/EP1121121B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-21 CA CA002347117A patent/CA2347117C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-21 DE DE69908630T patent/DE69908630T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-09-19 AU AU2003248205A patent/AU2003248205A1/en not_active Abandoned
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006126523A1 (ja) * | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Tokai University Educational System | 腹膜保護剤 |
| JPWO2006126523A1 (ja) * | 2005-05-24 | 2008-12-25 | 学校法人東海大学 | 腹膜保護剤 |
| WO2012011588A1 (ja) * | 2010-07-23 | 2012-01-26 | 学校法人東海大学 | 腹膜透析患者用の経口医薬組成物及びその用法 |
| JP5128003B2 (ja) * | 2010-07-23 | 2013-01-23 | 学校法人東海大学 | 腹膜透析患者用の経口医薬組成物及びその用法 |
| JP2015051956A (ja) * | 2013-09-09 | 2015-03-19 | 株式会社パーマケム・アジア | ピリドキサール・アミノグアニジン誘導体またはそれらの塩、及び、その製造方法 |
| WO2016031839A1 (ja) * | 2014-08-29 | 2016-03-03 | 株式会社プロジェクトＰｍ | ピリドキサミン化合物及びチアミン化合物を組み合わせてなる医薬組成物 |
| US11564924B2 (en) | 2014-08-29 | 2023-01-31 | Renascience Co., Ltd. | Pharmaceutical composition formed by combining pyridoxamine compound and thiamine compound |
| US11253519B2 (en) | 2016-03-02 | 2022-02-22 | Renascience Co., Ltd. | Composition used to improve symptoms of autism spectrum disorder, and method using same for improving symptoms of autism spectrum disorder |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2347117C (en) | 2006-01-24 |
| AU762030B2 (en) | 2003-06-19 |
| WO2000023063A3 (en) | 2000-07-13 |
| CA2347117A1 (en) | 2000-04-27 |
| AU1127400A (en) | 2000-05-08 |
| JP3864050B2 (ja) | 2006-12-27 |
| EP1121121A2 (en) | 2001-08-08 |
| DE69908630T2 (de) | 2004-04-29 |
| WO2000023063A2 (en) | 2000-04-27 |
| AU2003248205A1 (en) | 2003-10-30 |
| ATE241982T1 (de) | 2003-06-15 |
| EP1121121B1 (en) | 2003-06-04 |
| ES2197689T3 (es) | 2004-01-01 |
| DE69908630D1 (de) | 2003-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7030146B2 (en) | Methods for treating diabetic neuropathy | |
| US6472411B1 (en) | Advanced glycation end-product intermediaries and post-amadori inhibition | |
| US6436969B1 (en) | Dialysis solutions and methods | |
| US5985857A (en) | Advanced glycation end-product intermediaries and post-amadori inhibition | |
| AU684258B2 (en) | Glycosylation of lipids and lipid-containing particles, and diagnostic and therapeutic methods and materials derived therefrom | |
| JP2002527471A (ja) | 糖尿病合併症を阻害する方法 | |
| US6750209B1 (en) | Advanced glycation end-product intermediaries and post-amadori inhibition | |
| US6730686B1 (en) | Methods for inhibiting oxidative modification of proteins | |
| US6740668B1 (en) | Methods for inhibiting diabetic complications | |
| US6716858B1 (en) | Methods for inhibiting diabetic complications | |
| US20030013746A1 (en) | Advanced glycation end-product intermediaries and post-amadori inhibition | |
| WO2000021516A2 (en) | Methods for inhibiting diabetic complications | |
| CA2360311C (en) | Improved dialysis solutions and methods | |
| EP1190713B1 (en) | Advanced glycation end-product intermediaries and post-amadori inhibition | |
| WO2000022094A2 (en) | Methods for inhibiting oxidative modification of proteins | |
| MXPA00004785A (en) | Advanced glycation end-product intermediaries and post-amadori inhibition |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040115 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060523 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060821 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060912 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20061002 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091006 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101006 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111006 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121006 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |