WO2006126523A1 - 腹膜保護剤 - Google Patents

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peritoneal
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pyridoxamine
peritoneum
pyridoxine
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PCT/JP2006/310220
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English (en)
French (fr)
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Toshio Miyata
Takatoshi Kakuta
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Tokai University Educational System
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    • A61M1/28—Peritoneal dialysis ; Other peritoneal treatment, e.g. oxygenation
    • A61M1/287—Dialysates therefor

Definitions

  • the present invention relates to a peritoneal protective agent containing pyridoxine such as pyridoxamine as an active ingredient.
  • Non-patent Documents 1 and 5 The molecular mechanism underlying peritoneal dysfunction has not yet been elucidated. Recurrence of peritonitis accompanied by inflammatory changes damages the peritoneum for a long time [Non-patent Documents 1 and 5], but is not a condition for the onset of ultrafiltration failure [Non-patent Documents 4 and 6]. Recent studies have inferred and elucidated the mechanism of peritoneal decline in long-term PD patients [7–14]. Chronic uremia itself changes the peritoneum and increases EPSA [Non-Patent Document 8].
  • Peritoneal biochemical changes are due, at least in part, to the overload of highly reactive carbo-Rich compounds (RCO) by both uremic circulation and PD fluid (“peritoneal carbonyl stress”). ) Seems to be the cause [Non-Patent Documents 9-14].
  • Plasma RCO accumulates in the uremic circulation, gradually diffuses into the peritoneal cavity, and initiates modification of the late glycation end product (AGE) [Non-patent Documents 15 to 21].
  • AGE late glycation end product
  • RCO resulting from heat sterilization of glucose PD solution enters the peritoneum. These are supplemented by an increase in mass transfer of serum RCO by the dialysis treatment itself.
  • This peritoneal carbonyl stress force structurally promotes irreversible AGE modification of peritoneal proteins.
  • This RCO further stimulates the production of cytoforce-ins and growth factors (such as VEGF), and nitric oxide synthase (NO) in peritoneal cells. It appears to regulate the expression of S) [Non-Patent Documents 22 to 25].
  • VEGF and nitric oxide (NO) work together to stimulate angiogenesis and increase permeability! To expand the peritoneal capillaries [Non-patent Documents 23 to 25]. These combined changes will increase EPSA, which will cause the osmotic pressure to disappear earlier than normal and ultimately prevent ultrafiltration. Up-regulation of FGF-2 and TGF-
  • Non-patent literature l Davies SJ, et al., Kidney Int 54: 2207-2217, 1998
  • Non-Patent Document 2 Krediet RT, etc., Perit Dial Bull 6: 61-65, 1986
  • Non-Patent Document 4 Krediet RT, etc., Kidney Int 55: 341-356, 1999
  • Non-Patent Document 5 Krediet RT, etc., Ave Ren Replace Ther 5: 212-217, 1994
  • Non-Patent Document 6 Struijk SG, et al., Kidney Int 45: 1739-1744, 1994
  • Non-Patent Document 7 Davies SJ, et al., Nephrol Dial Transplant 11: 448-506, 1996
  • Non-Patent Document 8 Combet S, et al., J Am Soc Nephrol 12: 2146-2157, 2001
  • Non-Patent Document 9 Korbet SM, etc., Am J Kidney Dis 22: 588-591, 1993
  • Non-Patent Document 10 Miyata T, et al., Kidney Int 2002; 61: 375-386
  • Non-patent literature ll Nakayama M, et al., Kidney Int 51: 182-186, 1997
  • Non-Patent Document 12 Miyata T, et al., Kidney Int 58: 425-435, 2000
  • Non-Patent Document 13 Witowski J, et al., J Am Soc Nephrol 11: 729-739, 2000
  • Non-Patent Document 14 Wieslander A, etc., Adv Perit Dial 12: 57-60, 1996
  • Non-Patent Document 15 Garcia-Lopez E, et al., Perit Dial Int 20 (Suppl 5): S48-S56, 2000
  • Non-patent Document 16 Krediet RT, et al., Perit Dial Int 17: 35-41, 1997
  • Non-Patent Document 17 Faller B, et al., Kidney Int (Supple 56): S81-S85, 1996
  • Non-Patent Document 18 Rippe B, et al., Kidney Int 59: 348-357, 2001
  • Non-Patent Document 19 Topley N, Perit Dial Int 17: 42-47, 1997
  • Non-Patent Document 20 Feriani M, et al., Kidney Int 54: 1731-1738, 1998
  • Non-patent document 21 Rhein C, et al., Perit Dial Int 20 (Suppl 5): S28-S32, 2000
  • Non-patent document 22 Papapetropoulos A, et al., J Clin Invest 100: 3131-3139, 1997
  • Non-patent document 23 Vriese AS, et al., J Am Soc Nephrol 12: 2029-2039, 2001
  • Non-Patent Document 24 Margetts PJ, et al., J Am Soc Nephrol 12: 2029-39, 2001
  • Non-Patent Document 25 Combet S, et al., J Am Soc Nephrol 11: 717-728, 2000
  • Non-Patent Document 26 Ogata S, et al., J Am Soc Nephrol 12: 2787-2796, 2001
  • An object of the present invention is to provide a novel peritoneal protective agent capable of effectively suppressing a decrease in peritoneal function in a long-term peritoneal dialysis (PD) patient or the like.
  • peritoneal dysfunction and ultrafiltration failure in patients with long-term peritoneal dialysis are reactive carboxylic compounds (both by uremic circulation and heat sterilization of glucose PD solution).
  • RCO peritoneal carbo-stress
  • a subtotal nephrectomy uremic rat model This was followed by PD using a common glucose-based dialysate, and pyridoxamine (the recently developed late glycation end product (AGE) and carbonyl stress on peritoneal structural, functional and biochemical changes.
  • pyridoxamine the recently developed late glycation end product (AGE) and carbonyl stress on peritoneal structural, functional and biochemical changes.
  • the protective effect of (a potent inhibitor) was evaluated. As a result, it was confirmed that pyridoxamine exhibited a peritoneal protective action, and the present invention was completed.
  • a peritoneal protective agent comprising pyridoxine or a salt thereof as an active ingredient is provided.
  • the pyridoxine is pyridoxamine.
  • the peritoneal protective agent of the present invention is used to treat and Z or prevent peritoneal dysfunction or ultrafiltration failure in peritoneal dialysis patients.
  • a method for protecting the peritoneum comprising the step of administering an effective amount of pyridoxine or a salt thereof to a mammal including a human.
  • pyridoxines for the manufacture of a peritoneal protective agent or Use of the salt is provided.
  • a uremia rat model of subtotal nephrectomy is used, and PD is performed using a common glucose-based dialysis solution, and pyridoxamine for structural, functional and biochemical changes of the peritoneum is performed.
  • AGEs recently developed late glycation end products
  • potent inhibitors of carbonyl stress were evaluated.
  • the peritoneum increases the functional exchange area of small molecule solutes between blood and dialysate, increases vascular proliferation, increases AGF production, and induces cytodynamic force (ie VEGF And characterized by upregulation of FGF-2) expression.
  • the functional, structural, and biochemical changes of the peritoneum associated with PD are similar, but more severe than in patients with chronic uremia who have not received PD.
  • Pyridoxamine administered to uremic rats undergoing PD significantly reduced the transport rate and vascular density of small molecule solutes, a result indicating the beneficial role of pyridoxamine for ultrafiltration failure. This improvement was accompanied by a decrease in the expression of site force-inducing AGE accumulation and angiogenesis.
  • the uremia environment and peritoneal carbo-stress caused by PD treatment contribute to the increase in the functional exchange area of vascular proliferation and small molecule solutes induced by bioactive molecules, and ultimately Leads to ultrafiltration failure.
  • treatment with pyridoxamine significantly reduced the transport rate of small molecule solutes from plasma and the rate of glucose absorption as much as dialysate.
  • treatment with pyridoxamine almost completely abolished the effect of uremia on membrane permeability.
  • This improvement in peritoneal function was accompanied by an increase in angiogenesis induced by uremia and PD, and a suppression of the expression of site force-in that induces angiogenesis.
  • intervention with pyridoxamine significantly reduced the tissue pentosidine content.
  • pyridoxamine can protect the peritoneum of uremic patients undergoing PD by improving the functional, structural and molecular biochemical changes of the peritoneum.
  • the present invention relates to a peritoneal protective agent containing pyridoxine or a salt thereof as an active ingredient.
  • pyridoxines used as active ingredients in the present invention include pyridoxine, pyridoxal, pyridoxamine, and salts thereof.
  • the aforementioned pyridoxine, pyridoxal and pyridoxamine are compounds represented by the following formulae.
  • R is CH OH (for pyridoxine), CHO (for pyridoxal) or C
  • H represents NH (in the case of pyridoxamine).
  • Pyridoxine salts include inorganic acid salts such as pyridoxine hydrochlorides, sulfates, nitrates, and phosphates, or organic acid salts such as maleates, fumarate, kenates, and acetates. can give.
  • pyridoxine phosphate, pyridoxal phosphate, or pyridoxamine phosphate is particularly preferable.
  • Pyridoxine or a salt thereof may exist in the form of a hydrate or a solvate. Pyridoxine or a salt thereof can be synthesized by a known method, or can be purchased as a commercial product.
  • the peritoneal protective agent of the present invention can be provided in the form of a pharmaceutical composition containing pyridoxine as an active ingredient and optionally containing additives for formulation.
  • the pharmaceutical composition can be prepared by blending the active ingredient pyridoxine in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable carrier include physiological saline, Ringer's solution, phosphate buffered physiological saline, and other carriers known to those skilled in the art, but are not limited thereto.
  • Pharmaceutical compositions include, for example, stabilizers, antioxidants, colorants, excipients, binders, thickeners, dispersants, resorption enhancers, buffers, surfactants, preservatives, emulsifiers, etc.
  • One or more additives such as tonicity agents and diluents may be included.
  • the above pharmaceutically acceptable carriers and additives are pyridoxines which are active ingredients It is desirable to select such that the side effects of pyridoxines are minimized and the inhibition of the efficacy of pyridoxines is reduced.
  • a method for preparing a pharmaceutical composition containing a combination of pyridoxine and a pharmaceutically acceptable carrier and Z or a carotenant is known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition when the peritoneal protective agent of the present invention is orally administered as a suspension, the pharmaceutical composition includes microcrystalline cellulose, alginic acid or sodium alginate as a suspension, methylcellulose as a thickener. , And fragrances can be blended.
  • the pharmaceutical composition when preparing immediate release tablets, the pharmaceutical composition includes microcrystalline cellulose, starch, magnesium stearate and lactose or other excipients, binders, extenders, disintegrants, diluents and A lubricant or the like can be blended.
  • a suitable oil such as an oil containing a sterilized synthetic mono- or diglyceride and a fatty acid containing oleic acid is used.
  • injectable solutions or suspensions may be prepared using dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • peritoneal protective agent of the present invention When the peritoneal protective agent of the present invention is administered rectally as a suppository, an appropriate dosage such as cocoa butter, a synthetic glyceride ester or polyethylene glycol which is solid at room temperature but dissolves in the rectal cavity to release the drug is used. Suppositories can be prepared by mixing the form with pyridoxines.
  • the administration route of the peritoneal protective agent of the present invention is not particularly limited, and is orally or parenterally administered.
  • subcutaneous administration intramuscular administration, intradermal administration, intravenous administration, etc.
  • intramuscular administration intramuscular administration, intradermal administration, intravenous administration, etc.
  • the peritoneal protective agent of the present invention is a solid preparation
  • the content of pyridoxine contained in the solid preparation is usually 0.01 to 30% by weight, preferably 0.1 to 20% by weight.
  • the peritoneal protective agent of the present invention is a liquid
  • the content of pyridoxine contained in the liquid is usually 0.1 to 20 mg / mL, preferably 1 to LOmg / mL.
  • the dose and frequency of administration of the peritoneal protective agent of the present invention should be appropriately set depending on various factors including the purpose of administration, dosage form, dosage form, age, weight, sex, etc. of the recipient. Can do. In general, the dose is in the range of about 0.1 to LOOmgZkg, preferably about 0.5 to 50 mgZkg, per dose as the dose of the active ingredient pyridoxine. It is preferable to administer the above-mentioned dosage in about 1 to 4 times a day. Of the present invention
  • the administration period of the peritoneal protective agent is not limited sometimes, and may be administered for a short period (for example, 1 day to several weeks) or for a long period (for several weeks to one month or more).
  • the peritoneal protective agent of the present invention can be used to treat and Z or prevent peritoneal dysfunction or ultrafiltration failure in peritoneal dialysis patients.
  • treatment includes healing, improving peritoneal dysfunction or ultrafiltration insufficiency, or suppressing progression to alleviate bad habits.
  • prevention in this specification includes preventing the occurrence of peritoneal dysfunction or ultrafiltration failure, or preventing the deterioration of the condition.
  • the peritoneum is treated by administering to a patient (for example, a peritoneal dialysis patient) an effective amount of pyridoxine for the treatment or prevention of peritoneal dysfunction or ultrafiltration failure.
  • a patient for example, a peritoneal dialysis patient
  • an effective amount of pyridoxine for the treatment or prevention of peritoneal dysfunction or ultrafiltration failure.
  • Rat-o-ports were implanted subcutaneously in the cervix, and after 1 week, peritoneal dialysis was started twice a day with 30 ml of dialysate and continued for 6 weeks thereafter [Zweers MM, et al., Nephrol Dial Transplant 16 : 651-654, 2001]. Before the start of peritoneal permeation, 4, 5 and 2 rats died in Group 2, Group 3 and Group 4, respectively.
  • Dianil registered trademark
  • a peritoneal equilibrium test 60 minutes was performed. Thereafter, the rats were euthanized by anesthesia. Heparin blood plasma collected in the 2nd week was separated. The mesentery was removed and evaluated by light microscopy or immunohistochemistry.
  • the concentrations of glucose, creatine, urea, total cholesterol and triglyceride in plasma and peritoneal dialysate were measured with an automatic analyzer (HitacW model 736-60, Hitachi Electronics Co., Ltd.).
  • pentosidine in the rat peritoneum was evaluated using HPLC according to a previously reported method [Miyata T, et al., J. Am. So Nephrol 7: 1198-1206, 1996].
  • Peritoneal tissue 100 mg was homogenized with 1.5 ml of chloroform / methanol (2: 1) followed by 1.0 ml of methanol to remove the lipids, dried under vacuum, 500 ⁇ l of 6 ⁇ HC1 Hydrolyzed at 110 ° C for 16 hours.
  • the acid hydrolyzate was dried in vacuo, reconstituted with 400 1 10 mM HC1, filtered through a 0.5 ⁇ m pore size filter and diluted with PBS.
  • the diluted sample was injected into the HPLC apparatus and separated on a C18 reverse phase column (5 / ⁇ ⁇ , 4.6 X 250 mm: Waters, Tokyo).
  • the eluate was monitored using a fluorescence detector (RF-10A: Shimadzu Corporation, Tokyo) and an excitation / emission wavelength of 335/385 nm.
  • Synthetic pentosidine [Miyata T, et al., J. Am. So Nephrol 7: 1198-1206, 1996 ] was used to create a standard curve.
  • Immunohistochemical analysis was performed using formalin-fixed and paraffin-embedded sections. 4 ⁇ slices were prepared from paraffin blocks, deparaffinized and dehydrated by immersion in graded concentrations of ethanol. As primary antibodies, anti-TGF-jS 1 antibody (1:40, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-von'Villebrand factor antibody (1: 400, Daco, Denmark, Gullstrap), anti-VEGF antibody ( 1: 100, Santa Cruz Biotechnology) ⁇ Anti-FGF-2 antibody (1: 400, Santa Cruz Biotechnology) and anti-AGE antibody (1: 200, Transgenic, Kumamoto) were used. The sections were deparaffinized with xylene and dehydrated with ethanol. The sections are soaked in methanol containing 0.3% H0 for 10 minutes at room temperature.
  • Inhibited oxidase activity Antigenic activation by heating was performed. After washing with phosphate buffered saline (pH 7.4), the sections (anti-TGF-jS 1, von Willebrand factor, FGF2, VEG F antibody) were electronized in 0.01M citrate buffer (pH 6.0). Heated in the range (500W) at 100 ° C for 10 minutes. The primary antibody was collected and incubated at room temperature for 1 hour. Thereafter, the sections were rinsed, incubated with a secondary antibody (Nichirei, Tokyo) for 45 minutes, immersed in 0.2% 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), and then counterstained with hematoxylin. The specificity of the immunolabeling was examined using non-immune rabbit or goat IgG.
  • DAB 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride
  • the number of blood vessels was evaluated by image analysis using WinROOF software (Mitani Corporation, Tokyo) on sections stained for von Willebrand factor.
  • the average number of capillaries was estimated using a 40x objective lens in 20 fields randomly selected for each cortical region. Results were expressed as the number of healthy control animals.
  • RNA expression of VEGF or FGF2 was quantified by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
  • RT-PCR semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
  • Total length of amplified fragment is 310bp
  • the total length of the amplified fragment is 276 bp
  • 8-actin was used as an internal standard to allow comparison of RNA levels in different samples.
  • Samples were DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn.), 94 ° C for 1 minute for VEGF or FGF2, 58 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute for j8-actin, 72 ° C for 1 minute Amplified with the appropriate cycle.
  • reverse transcription and PCR amplification were performed for 18, 21, 25, 28, 31, 34, 36 cycles with varying amounts of RNA.
  • Table 1 shows the biochemical data and body weight of uremic rats with subtotal nephrectomy.
  • uremic rats Groups 2-4
  • plasma creatinine, urea, and total cholesterol were significantly increased and body weight decreased compared to non-uremic rats (Group 1).
  • Statistical analysis between PD and Z or pyridoxamine treatment in the uremia group showed no significant difference in these values.
  • Plasma concentrations of glucose and triglycerides were not statistically different between all groups.
  • Peritoneal permeability gradually changes during PD. Using normal glucose-based dialysate V, 6-week PD, small molecule solute transport rate from plasma (Group 2 in Figures 2A and B) and glucose absorption rate of dialysate force (Figure 2C) ) Increased significantly.
  • pyridoxamine dramatically reduced the slope of the regression line between increased permeability of small molecule solutes (creature and glucose) and the extent of renal failure. Pyridoxamine treatment almost completely abolished the effect of uremia on membrane permeability.
  • Increased EPSA is known to be closely related to increased angiogenesis. Therefore, the number of blood vessels in the peritoneal tissue after von Willebrand factor staining was measured (Fig. 4A). Uremia itself increased the number of blood vessels by 1.87 times, and PD treatment increased its value by 5.83 times. This enhanced angiogenesis was significantly improved up to 2.68 times by pyridoxamine treatment. There was a significant correlation between increased permeability of creatun (Fig. 4B) or glucose (Fig. 4C) and the number of blood vessels. This result implies that increased EPSA during peritoneal function is associated with uremia and PD treatment.
  • pentosidine a well-known surrogate marker for AGE and carbo-stress
  • HPLC assay of mesenteric tissue Pentosidine content is increased by uremia (group 2 in Fig. 5A), and there is a correlation between the content of pentosidine in the tissue and the degree of renal failure (black circle in Fig. 5B).
  • pentosidine was promoted (Group 3 in Figure 5A), and PD increased the slope of the regression line between pentosidine content and renal failure (Figure 4B). Corner).
  • the intervention with pyridoxamine significantly reduced the pentosidine content in the tissue (Group 4 in Fig. 5A) and the slope of the regression line (white triangle in Fig. 5B).
  • VEGF and FGF-2 were analyzed by semiquantitative PCR.
  • Expression of VEGF (Fig. 7B) and FGF-2 (Fig. 7C) in uremic rats was significantly increased by higher PD treatment than in control rats.
  • Pyridoxamine reduced the expression of both VEGF and FGF-2 to levels similar to uremic rats without PD.
  • 81 in mesenteric tissue sections Fig. 8
  • VEGF, FGF-2, vWF, AGE, and TGF-jS 1 staining could not be detected visually in the endothelium of the mesenteric blood vessels of control rats. Slightly present in the peritoneum, it was prominent in uremic rats treated with PD. On the other hand, only weak staining was detected in the capillaries of the mesentery of rats treated with pyridoxamine.
  • Pyridoxine such as pyridoxamine used as an active ingredient in the present invention is a safe substance with few side effects. According to the present invention, it has become possible to provide a safe peritoneal protective agent capable of effectively suppressing the decrease in peritoneal function in a long-term peritoneal dialysis (PD) patient or the like.
  • PD peritoneal dialysis
  • FIG. 1 shows the protocol for animal experiments. Six-week-old rats were assigned to the uremic sham operation group. Five weeks after subtotal nephrectomy, surgical implantation with an intraperitoneal catheter and subcutaneous access port was performed. PD continued until 21 weeks after birth.
  • FIG. 2 shows an analysis of peritoneal function by PET.
  • Dialysate / plasma ratio (D / P) of Cr (A) and urea (B) during 60 min exchange with 20 ml glucose dialysate, and glucose absorption from dialysate (D / D0) ( C) control rats (Group 1), uremic rats without PD ( (Group 2), uremic rats that received PD without pyridoxamine (Group 3), and uremic rats that received PD with 5 mg / L pyridoxamine (Group 4).
  • a p 0.01 for the first group.
  • b p ⁇ 0.01 for the second group.
  • f p ⁇ 0.05 for group 4.
  • FIG. 3 shows a correlation between an increase in the permeability of Creathun (A) or glucose (B) and the degree of renal failure.
  • FIG. 4 shows the peritoneal structure analysis by immunohistochemical analysis of von Willebrand factor.
  • A Rat mesenteric blood vessel count.
  • a p ⁇ 0.01 for the first group.
  • b p ⁇ 0.01 for the second group.
  • P ⁇ 0.01 for the third group.
  • FIG. 5 shows peritoneal AGE content by HPLC assay.
  • A Pentosidine content in rat mesentery. a: p ⁇ 0.01 for the first group. b: p ⁇ 0.05 for the fourth group. P 0.05 for the third group.
  • B There is a significant correlation between the mesenteric pentosidine content and the degree of creatine permeability due to renal failure.
  • Fig. 7 shows detection of expression of cytoforce-in that induces angiogenesis.
  • VEGF or FGF2 mRNA expression in the mesentery was analyzed by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) (A).
  • A reverse transcription polymerase chain reaction
  • B FGF2
  • C FGF2
  • a p ⁇ 0.05 for the first group. 1>: ⁇ 0.05 for the second group.
  • d p 0.05 for the fourth group.
  • e p 0.01 for the first group.
  • f p ⁇ 0.01 for the second group.
  • g p ⁇ 0.01 for the third group. ⁇ 0.01 for the fourth group.
  • FIG. 8 shows immunohistochemical detection of VEGF, FGF2, vWF, AGE, and TGF j81 in the mesentery.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FGF2 FGF2
  • vWF vWF
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Abstract

　本発明の目的は、長期腹膜透析（PD）患者などにおける腹膜の機能低下を効果的に抑制することができるような新規な腹膜保護剤を提供することである。本発明によれば、ピリドキシン類又はその塩を有効成分として含む、腹膜保護剤が提供される。

Description

明 細 書
腹膜保護剤
技術分野
[0001] 本発明は、ピリドキサミン等のピリドキシン類を有効成分として含む腹膜保護剤に関 する。
背景技術
[0002] 長期腹膜透析 (PD)患者では、腹膜を横断するグルコース依存性の浸透圧勾配の 消失の亢進および限外濾過能力の喪失を特徴とする腹膜機能の低下が徐々に起こ る [非特許文献 1及び 2]。このような不全腹膜の機能の特徴の変化を最もよく表すも のは、血液と透析液の間での小分子溶質 (尿素、クレアチュン、グルコース）の交換 の機能的面積 ( 、わゆる「有効腹膜表面積 (EPSA)」）の増大である [非特許文献 3]。 こうした変化は血管新生の亢進、およびおそらく腹膜血管の拡張によるものである [ 非特許文献 4]。
[0003] 腹膜機能不全の基礎となる分子メカニズムはまだ解明されて 、な 、。炎症性変化を 伴う腹膜炎の再発は、長期間に渡って腹膜に損傷を与えるが [非特許文献 1及び 5] 、限外濾過不全発症の条件ではない [非特許文献 4及び 6]。最近の研究により、長 期 PD患者における腹膜機能低下についてメカニズムが推定され明らかになりつつあ る [非特許文献 7〜14]。慢性尿毒症はそれ自体が腹膜を変化させ、 EPSAを増大さ せる [非特許文献 8]。腹膜の生化学的変化は、少なくとも部分的には、尿毒症性循 環および PD液の双方による非常に反応性の高いカルボ二ルイヒ合物（RCO)の過負 荷（「腹膜のカルボニルストレス」）が原因であると思われる [非特許文献 9〜14]。血 漿 RCOが尿毒症性循環中に蓄積され、腹腔内に徐々に拡散し、後期糖化最終産物 (AGE)の修飾を開始する [非特許文献 15〜21]。 PD中は、グルコース PD液の加熱 滅菌から生じた RCOが腹膜内に進入する。これらは、透析処置自体による血清 RCO の物質移動の増加により補充される。この腹膜のカルボニルストレス力 腹膜タンパク 質の不可逆的な AGE修飾を構造的に促進する。この RCOは、サイト力インおよび増 殖因子 (VEGFなど)の産生をさらに刺激し、腹膜細胞中の一酸化窒素合成酵素 (NO S)の発現を調節するとみられる [非特許文献 22から 25]。 VEGFと一酸化窒素 (NO) が共同して血管新生を刺激し、透過性を増力！]させ、腹膜毛細血管を拡張させる [非 特許文献 23〜25]。これらの複合的変化により EPSAが増大し、これにより浸透圧が 正常よりも早く消失して、最終的に限外濾過が行われなくなると思われる。 FGF-2お よび TGF-|8のアップレギュレーションも、腹膜の間質の線維化を刺激する [非特許 文献 24及び 26]。
非特許文献 l:Davies SJ,他、 Kidney Int 54: 2207-2217, 1998
非特許文献 2:Krediet RT,他、 Perit Dial Bull 6:61-65, 1986
特 §午文献 3:Rippr B,他、 Peritoneal pnysiology: Transport of solutions. In: The Te xtbook of Peritoneal Dialysis, edited by Gokal R, Nolf KD, Dordrecht, The Netherla nds, Kluwer Academic Publishers, 1994, 69 - 113
非特許文献 4:Krediet RT,他、 Kidney Int 55: 341-356, 1999
非特許文献 5:Krediet RT,他、 Ave Ren Replace Ther 5: 212-217, 1994
非特許文献 6:Struijk SG,他、 Kidney Int 45: 1739-1744, 1994
非特許文献 7:Davies SJ,他、 Nephrol Dial Transplant 11: 448-506, 1996
非特許文献 8:Combet S,他、 J Am Soc Nephrol 12: 2146-2157, 2001
非特許文献 9:Korbet SM,他、 Am J Kidney Dis 22: 588-591, 1993
非特許文献 10:Miyata T,他、 Kidney Int 2002; 61: 375-386
非特許文献 ll:Nakayama M,他、 Kidney Int 51: 182-186, 1997
非特許文献 12:Miyata T,他、 Kidney Int 58: 425-435, 2000
非特許文献 13:Witowski J,他、 J Am Soc Nephrol 11: 729-739, 2000
非特許文献 14:Wieslander A,他、 Adv Perit Dial 12:57-60, 1996
非特許文献 15: Garcia- Lopez E,他、 Perit Dial Int 20(Suppl 5): S48- S56, 2000 非特許文献 16:Krediet RT,他、 Perit Dial Int 17:35-41, 1997
非特許文献 17:Faller B,他、 Kidney Int (Supple 56): S81- S85, 1996
非特許文献 18:Rippe B,他、 Kidney Int 59:348-357, 2001
非特許文献 19:Topley N、 Perit Dial Int 17:42-47, 1997
非特許文献 20:Feriani M,他、 Kidney Int 54: 1731-1738, 1998 非特許文献 21 : Lage C,他、 Perit Dial Int 20(Suppl 5): S28-S32, 2000 非特許文献 22 : Papapetropoulos A,他、 J Clin Invest 100: 3131-3139, 1997 非特許文献 23 :Vriese AS,他、 J Am Soc Nephrol 12: 2029-2039, 2001
非特許文献 24 : Margetts PJ,他、 J Am Soc Nephrol 12: 2029-39, 2001
非特許文献 25 : Combet S,他、 J Am Soc Nephrol 11: 717-728, 2000
非特許文献 26 : Ogata S,他、 J Am Soc Nephrol 12: 2787-2796, 2001
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、長期腹膜透析 (PD)患者などにおける腹膜の機能低下を効果的に抑制 することができるような新規な腹膜保護剤を提供することを解決すべき課題とした。 課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、長期腹膜透析 (PD)患者における腹膜の機能不全および限外濾過 不全は、尿毒症性循環とグルコース PD液の加熱滅菌の双方による反応性のカルボ -ル化合物（RCO)の過負荷（「腹膜のカルボ-ルストレス」 )が少なくとも部分的に誘 発させる、腹膜の生化学的変化と関連付けられる、という仮説を検証するべぐ腎亜 全摘の尿毒症ラットモデルを用い、これにグルコースベースの一般的な透析液を用 いて PDを行い、腹膜の構造的、機能的及び生化学的変化に対するピリドキサミン (最 近開発された後期糖化最終産物 (AGE)およびカルボニルストレスの強力な阻害薬） の保護的効果を評価した。その結果、ピリドキサミンが腹膜保護作用を示すことを確 認し、本発明を完成するに至った。
[0007] 即ち、本発明によれば、ピリドキシン類又はその塩を有効成分として含む、腹膜保 護剤が提供される。
[0008] 好ましくは、ピリドキシン類はピリドキサミンである。
好ましくは、本発明の腹膜保護剤は、腹膜透析患者における腹膜の機能不全又は 限外濾過不全を治療及び Z又は予防するために使用する。
[0009] 本発明の別の側面によれば、ピリドキシン類又はその塩の有効量をヒトを含む哺乳 動物に投与する工程を含む、腹膜を保護する方法が提供される。
[0010] 本発明のさらに別の側面によれば、腹膜保護剤の製造のためのピリドキシン類又は その塩の使用が提供される。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明の実施に形態について詳細に説明する。
本発明では、腎亜全摘の尿毒症ラットモデルを用い、これにグルコースベースの一 般的な透析液を用いて PDを行い、腹膜の構造的、機能的及び生化学的変化に対す るピリドキサミン (最近開発された後期糖化最終産物 (AGE)およびカルボニルストレス の強力な阻害薬)の保護的効果を評価した。
[0012] 尿毒症時の腹膜は、血液と透析液との間での小分子溶質の機能的交換面積の増 大、血管増殖、 AGF産生の増加、血管新生を誘導するサイト力イン (すなわち VEGF および FGF-2)発現のアップレギュレーションを特徴として 、た。 PDと関連する腹膜の 機能的、構造的及び生化学的変化も同様であるが、 PDを受けていない慢性尿毒症 患者の場合よりも重症である。 PDを行っている尿毒症ラットに投与したピリドキサミン は、小分子溶質の輸送速度および血管密度を有意に低下させたが、この結果は限 外濾過不全に対するピリドキサミンの有益な役割を示している。この改善は、 AGE蓄 積および血管新生を誘導するサイト力イン発現の低下を伴っていた。
[0013] このように、尿毒症の環境ならびに PD処置により生じる腹膜のカルボ-ルストレスは 、生物活性分子の誘導による血管増殖および小分子溶質の機能的交換面積の増大 の一因となり、最終的には限外濾過不全に至る。
[0014] 本発明では、ピリドキサミンを用いる処置により、血漿からの小分子溶質の輸送速度 および透析液力ものグルコースの吸収速度が有意に低下した。驚くべきことに、ピリド キサミンを用いる処置により、膜透過性に対する尿毒症の影響がほぼ完全に消失し た。この腹膜機能の改善は、尿毒症および PDにより誘導される血管新生の亢進およ び血管新生を誘導するサイト力イン発現の抑制を伴っていた。実際、ピリドキサミンを 用いる介入により組織のペントシジン含量は有意に低下した。したがって、ピリドキサ ミンは、腹膜の機能的、構造的及び分子生化学的変化を改善することにより、 PDを 受ける尿毒症患者の腹膜を保護することができる。
[0015] 即ち、本発明は、ピリドキシン類又はその塩を有効成分として含む腹膜保護剤に関 するものである。 本発明において有効成分として用いるピリドキシン類としては、ピリドキシン、ピリドキ サール、ピリドキサミン又はそれらの塩などが挙げられる。上記の中でも、ピリドキサミ ン又はその塩を使用することが特に好ましい。上記したピリドキシン、ピリドキサール およびピリドキサミンは、下記式で表される化合物である。
[0016] [化 1]
Figure imgf000006_0001
[0017] 式中、 Rは、 CH OH (ピリドキシンの場合）、 CHO (ピリドキサールの場合）または C
2
H NH (ピリドキサミンの場合）を表す。
2 2
[0018] ピリドキシン類の塩としては、ピリドキシン類の塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等 の無機酸塩またはマレイン酸塩、フマル酸塩、クェン酸塩、酢酸塩等の有機酸塩が あげられる。塩としては、リン酸ピリドキシン、リン酸ピリドキサール、又はリン酸ピリドキ サミンなどが特に好ましい。
[0019] また、ピリドキシン類又はその塩は、水和物もしくは溶媒和物の形で存在することも ある。ピリドキシン類又はその塩は、公知の方法により合成することも可能であり、ある いは市販品として購入することもできる。
[0020] 本発明の腹膜保護剤は、ピリドキシン類を有効成分として含有し、所望により、製剤 化のための添加物を含有する医薬組成物の形態で提供することができる。医薬組成 物は、有効成分であるピリドキシン類を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて 配合することによって調製することができる。
[0021] 薬学的に許容可能な担体としては、生理食塩水、リンゲル液、リン酸緩衝生理食塩 水、その他の当業者に既知の担体などを挙げることができるが、これらに限定される ものではない。医薬組成物には、例えば安定化剤、酸化防止剤、着色剤、賦形剤、 結合剤、増粘剤、分散剤、再吸着増進剤、緩衝液、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、 等張化剤、及び希釈剤などカゝら選択される 1種以上の添加剤を含めることができる。 上記した薬学的に許容可能な担体および添加剤は、有効成分であるピリドキシン類 の副作用を最小限にし、かつピリドキシン類の薬効の阻害を小さくなるように選択する ことが望ましい。なお、ピリドキシン類と薬学的に許容可能な担体および Z又は添カロ 剤とを組み合わせて含む医薬組成物の調製法は、当業者に既知である。
[0022] 例えば、本発明の腹膜保護剤を懸濁物として経口投与する場合には、医薬組成物 には、微結晶性セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、 増粘剤としてのメチルセルロース、および香料などを配合することができる。即放性の 錠剤を調製する場合には、医薬組成物には、微結晶性セルロース、でんぷん、ステ アリン酸マグネシウムおよび乳糖またはその他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、 希釈剤および潤滑剤などを配合することができる。
[0023] 本発明の腹膜保護剤を、注射用の溶液または懸濁液として投与する場合には、滅 菌済みの合成モノまたはジグリセリドを含む油、並びにォレイン酸を含む脂肪酸のよ うな、適当な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、注射用の溶液または懸濁 液を調製することができる。
[0024] 本発明の腹膜保護剤を座剤として直腸投与する場合には、常温で固体だが直腸 腔で溶解して薬剤を放出するココアバター、合成グリセリドエステルまたはポリエチレ ングリコールのような適当な賦形剤をピリドキシン類と混合することによって座剤を調 製することができる。
[0025] 本発明の腹膜保護剤の投与経路は特に限定されず、経口投与、又は非経口投与
(例えば、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、静脈内投与など)の何れでもよい。
[0026] 本発明の腹膜保護剤が固形製剤の場合、該固形製剤に含有されるピリドキシン類 の含有量は通常 0. 01〜30重量％であり、好ましくは 0. 1〜20重量％である。本発 明の腹膜保護剤が液剤の場合、該液剤に含有されるピリドキシン類の含有量は通常 、 0. l〜20mg/mLであり、好適には 1〜： LOmg/mLである。
[0027] 本発明の腹膜保護剤の投与量及び投与回数は、投与の目的、投与形態、剤型、 摂取者の年齢、体重又は性別などの条件などを含む種々の要因により適宜設定す ることができる。一般的には、投与量は、有効成分であるピリドキシン類の投与量とし て一曰当り、約 0. 1〜： LOOmgZkg、好ましくは約 0. 5〜50mgZkgの範囲である。 上記投与量の製剤を一日 1〜4回程度に分けて投与することが好ましい。本発明の 腹膜保護剤の投与期間は時に限定されず、短期間 (例えば、 1日〜数週間)の投与 でもよいし、長期間 (数週間〜 1ヶ月以上)の投与でもよい。
[0028] 本発明の腹膜保護剤は、腹膜透析患者における腹膜の機能不全又は限外濾過不 全を治療及び Z又は予防するために使用することができる。本明細書において治療 とは、腹膜の機能不全又は限外濾過不全を治癒すること、改善すること、又は進行を 抑制して悪ィ匕を緩和することなどを含む。また、本明細書において予防とは、腹膜の 機能不全又は限外濾過不全の発生を未然に防止すること、又はその状態の悪ィ匕を 防止することなどを含む。
[0029] 本発明にお 、ては、腹膜の機能不全又は限外濾過不全の治療又は予防のために 有効な量のピリドキシン類を患者 (例えば、腹膜透析患者）に投与することによって、 腹膜を保護することができ、これによつて腹膜の機能不全又は限外濾過不全を治療 及び Z又は予防することができる。
[0030] 以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する力 本発明は実施例によって 限定されるものではない。
実施例
[0031] (A)方法
(1)実験動物
動物実験のプロトコルを図 1に示す。 6週齢で体重 200 ±3 gの Sprague-Dawley雄性 ラット (CLER Japan, Inc.,東京)を、疑似手術した対照ラット (第 1群: n = 6)、腹膜透 析を行わない尿毒症ラット (第 2群: n = 12)および腹膜透析を行う尿毒症ラッ Hn = 24 )に無作為に割り当てた。腹膜透析を行う尿毒症ラットをさらに、 4.25%ダイァニール（ 登録商標）（3.86%グルコース、 2.5 mEq/CAPD液。 Baxter Health care Corp.ゝィリノ ィ州ラウンドレイク)で透析した群 (第 3群: n = 12)および 1Lの 4.25%ダイァニール (登 録商標）中ピリドキサミン 5 mg (Pridorine、 Biostratum Inc.,ノースカロライナ州）含有 液で腹膜透析した群 (第 4群: n = 12)の 2群に分割した。
[0032] 尿毒症モデルは、既報のとおり [Lameire N,他、 Kidney Int 54: 2194-2206, 1998 ; 及び Kleinknecht C,他、 Kidney Int 47: S51-S54, 1995] 5/6腎摘により作製した。屠 殺前夜まで、 1.06%カルシウム、 0.9%リン酸塩、 21%タンパク質を含有する実験ラット 標準餌（CE2 : CLER Japan, Inc.,東京）および水道水を自由に摂取させた。 13週目 に、 13.5 cm力テーテノレを接続した Rat— ports (Access Technologies, Norefolk Medi cal、イリノイ州スコキー）をイソフラン麻酔下で全ラットに埋植した。 Rat-o-portsは頸部 皮下に埋植し、 1週間後に 30 mlの透析液で 1日 2回の腹膜透析を開始し、その後 6週 間継続した [Zweers MM,他、 Nephrol Dial Transplant 16: 651-654, 2001]。腹膜透 析開始前に、第 2群、第 3群、第 4群でそれぞれ 4匹、 5匹、 2匹のラットが死亡した。最 終的に、疑似手術対照群 (第 1群: n = 6)、腹膜透析を行わない尿毒症群 (第 2群: n = 8)、腹膜透析を行う尿毒症群 (第 3群: n = 7)、ピリドキサミン 5 mgを用いて腹膜透析 を行う尿毒症群 (第 4群: n = 10)を得た。
[0033] (2)組織採取
PDを 6週間行った後、アクセスポートから 4.25%ダイァニール（登録商標）を注入し、 腹膜平衡ィ匕試験 (60分)を施行した。その後過、麻酔によりラットを安楽死させた。第 2 1週に採取したへパリン血力 血漿を分離した。腸間膜を摘出して、光学顕微鏡検査 または免疫組織ィ匕学検査により評価した。
[0034] (3)血漿および腹膜透析液の解析
血漿および腹膜透析液におけるグルコース、クレアチュン、尿素、総コレステロール 及びトリグリセリドの濃度は、自動分析機 (HitacW型式 736-60、 日立電子株式会社） で測定した。
[0035] (4) HPLCによるペントシジン測定
ラット腹膜中のペントシジン含量は HPLCを用いて既報の方法 [Miyata T,他、 J.Am .So Nephrol 7: 1198-1206, 1996]に従い、下記の通り評価した。腹膜組織（100 mg) を 1.5 mlのクロ口ホルム/メタノール（2:1)、その後メタノール 1.0 mlを用いてホモジェ ナイズして脂質を除去し、真空下で乾燥し、 500 μ 1の 6Ν HC1で 110°Cで 16時間加水 分解した。酸加水分解物を真空中で乾燥し、 400 1の 10 mM HC1で再構成し、孔径 0 .5 μ mのフィルターでろ過し、 PBSで希釈した。希釈したサンプルを HPLC装置に注入 し、 C18逆相カラム（5 /ζ πι、 4.6 X 250 mm : Waters,東京）で分離した。溶出液を蛍光 検出器 (RF-10A :島津製作所、東京）および励起/発光波長 335/385 nmを用いてモ -ターした。合成ペントシジン [Miyata T,他、 J.Am. So Nephrol 7: 1198-1206, 1996 ]を用いて標準曲線を作成した。
[0036] (5)免疫組織化学分析
ホルマリン固定しパラフィン包埋した切片を用いて免疫組織ィ匕学分析を行った。パ ラフィンブロックから 4 πιの切片を調製し、脱パラフィンして、段階的な濃度のェタノ ールに浸して脱水した。一次抗体として、抗 TGF- jS 1抗体（1:40、 Santa Cruz Biotech nology、カリフォルニア州サンタクルズ）、抗フォン'ビルブラント因子抗体（1:400、 Dac o、デンマーク、グルストラップ）、抗 VEGF抗体（1:100、 Santa Cruz Biotechnology)ゝ 抗 FGF- 2抗体（1:400、 Santa Cruz Biotechnology)、抗 AGE抗体（1:200、株式会社ト ランスジェニック、熊本)を使用した。切片をキシレンで脱パラフィンし、エタノールによ り脱水した。切片を 0.3%H 0を含むメタノール中に室温で 10分間漬し、内因性ペル
2 2
ォキシダーゼ活性を阻害した。加熱による抗原性賦活化を行った。リン酸緩衝生理 食塩水（pH7.4)で洗浄後、切片（抗 TGF- jS 1、フォン.ビルブラント因子、 FGF2、 VEG F抗体）を 0.01Mクェン酸緩衝液（pH6.0)中で電子レンジ（500W)中 100°Cで 10分間 加熱した。一次抗体をカ卩えて室温で 1時間インキュベートした。その後、切片をリンス し、二次抗体 (二チレイ、東京）とともに 45分間インキュベートし、 0.2% 3,3-ジァミノべ ンジジン四塩酸塩 (DAB)に浸漬した後、へマトキシリンで対比染色した。免疫標識の 特異性を、非免疫ゥサギまたはャギ IgGを用いて検討した。
[0037] (6)血管数の評価
血管数は、フォン'ビルブラント因子について染色した切片において、 WinROOFソ フトウエア (三谷商事、東京)を用いた画像解析により評価した。皮質領域ごとに無作 為に選択した 20視野中で、 40倍の対物レンズを用いて毛細血管数の平均を概算し た。結果は、健常な対照動物の何倍になったかで表した。
[0038] (7)VEGFおよび FGF-2発現の検出
VEGFまたは FGF2 (腸間膜)の mRNA発現を半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)により定量した。全 RNAを ISOGEN (二ツボンジーン、東京）を用いて腸間 膜から抽出した。ランダムプライマー（LIFE TECHNOLOGIES)を用いて、 200単位の MMLV逆転写酵素（BioLabs.Inc)〖こより 2 μ gの RNAを逆転写した。 PCR増幅は既報 [ Inagi R,他、 FEBS Letters 463: 260-264, 1999]のとおり行った。オリゴヌクレオチドプ ライマーの配列は以下の通りである。
[0039] VEGFのプライマー：
5 ' -ACT GGA CCC TGG CTT TAC TGC- 3' (配列番号 1)
5，- TTG GTG AGG TTT GAT CCG CAT G- 3' (配列番号 2)
増幅断片の全長は 310bp
[0040] FGF2のプライマー
5，- CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT- 3' (配列番号 3)
5，- TCA AGC TCT TAG CAG ACA TTG- 3， （配列番号 4)
増幅断片の全長は 276bp
[0041] ラット β -ァクチンのプライマー
5， - GTG TGA TGG TGG GTA TGG GTC AGA AGG ACT- 3' (配列番号 5)
5，- ATG GCA TGA GGG AGC GCG TAA CCC TCA TAG- 3， （配列番号 6) 増幅断片は 402 bp
[0042] 異なる試料中の RNA量の比較を可能にする内部標準として |8—ァクチンを用いた 。試料は DNAサーマルサイクラ一（Perkin Elmer Cetus、コネチカット州ノーウォーク） を用い、 VEGFまたは FGF2の場合は 94°C1分間、 58°C1分間、 j8—ァクチンの場合は 60°C1分間、 72°C1分間の適切なサイクルで増幅した。予備実験では、 RNAの量を様 々に変えて、逆転写および PCR増幅を 18、 21、 25、 28、 31、 34、 36サイクル行った。こ の実験から、 VEGFまたは FGF2の mRNA増幅では 35サイクル、 13—ァクチンの mRNA 増幅では 16または 21サイクルで増幅させると、 PCR産物シグナルの差は、用いた RNA と定量的な関係が保たれることが明らかになった。 2%ァガロース電気泳動で分離し、 ェチジゥムブロマイドで染色した PCR産物を、定量プログラム（NIH imageソフトウェア） を用いたシグナル強度測定により定量ィ匕した。 mRNAは 3検体測定し、実験ごとに結 果を平均した。各実験条件について、合計 3〜4回の独立した実験を行った。結果を 平均し、平均士 SDで表した。
[0043] (8)統計学的解析
結果はすべて平均士 SDで表した。群間の差異の統計学的有意性を、ウィルコクソ ンのノンパラメトリック検定 (平均値力^個の場合)またはクラスカル ·ウォリス検定 (平均 値が 3個以上の場合)で評価した。本実施例の統計学的解析では、有意差の検出に SPSSソフトウェア（SPSS Inc、イリノイ州シカゴ）を利用した。 0.05未満の P値を有意とみ なした。
[0044] (B)結果
(1)機能解析
腎亜全摘した尿毒症ラットの生化学的データおよび体重を表 1に示す。尿毒症ラッ ト (第 2〜4群)では、非尿毒症ラット (第 1群）と比較して、血漿クレアチニン、尿素、総 コレステロール量が有意に増加し、体重は減少していた。尿毒症群の PD及び Z又 はピリドキサミン処置の有無間の統計学的解析を行ったところ、これらの値に有意差 はみとめられな力つた。グルコースおよびトリグリセリドの血漿濃度は、全群間で統計 学的差はなかった。
[0045] [表 1]
表 1 ：生化学的データ及び体重 （21週）
群 血漿クレアチニン 血漿尿素 血漿 Γルコ ス トリク"リセ!)ド 総コレステ P ル 体重
(mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (g)
1 (n=6) 0.3±0.0 16.0±2.4 185.5±64.9 141.7± 13.5 71.0±13.5 530±37
2 (n=8) 1.3±0·6* 68·0±35.7 137.5±31.9 146.6±46.9 117.3±25.6* 416±56*
3 (n=7) 1.6±0.3* 62.8±13.0* 121.1±36.5 157.1±58.4 143.1±33.9* 435±1CH=
4 (IF10)1.3 ±0.6* 70.1±23.4* 155.2±20.5 122.5±50.2 125.4±31.8* 419±29* * ：第 1群に対して p< 0. 0 1
[0046] 腎亜全摘後 13週に評価した腹膜 (PM)の機能パラメータを評価したところ、血漿か らの小分子溶質 (すなわちクレアチュン、尿素）の輸送速度（図 2A及び B)および透 析液からのグルコースの吸収速度（図 2C)が、対照ラット (第 1群)よりも尿毒症ラット（ 第 2群）で有意に高力つた。クレアチュン（図 3Aの黒丸）またはグルコース（図 3B)の 透過性増加と腎不全の程度との間に有意の相関が認められた。これらのデータは、 慢性尿毒症自体が腹膜を変化させかつ EPSAを増大させると 、う Kombetらによる最 近の観察結果と一致している [Korbet SM,他、 Am J Kidney Dis 22: 588-591, 1993] [0047] 腹膜の透過性は PD中に徐々に変化する。通常のグルコースベースの透析液を用 V、た 6週間の PDにより、血漿からの小分子溶質の輸送速度（図 2A及び Bの第 3群）お よび透析液力 のグルコースの吸収速度（図 2C)は有意に増加した。
[0048] 尿毒症および PD処置による腹膜機能の変化は、少なくとも部分的には、尿毒症性 循環および PD液の双方に由来する腹膜のカルボ-ルストレスが原因であるとされて いる。そこで、尿毒症ラットに、ピリドキサミン (AGEおよびカルボ-ルストレスの強力な 阻害薬として臨床で使用されている）を用いて PDを腹腔内に行った。ピリドキサミン (5 mg/L)による 6週間の処置により、血漿力 の小分子溶質の輸送速度（図 2A及び B の第 4群）、および透析液からのグルコースの吸収速度（図 2C)は有意に低下した。 図 3Aおよび B (白三角）で示すように、ピリドキサミンは、小分子溶質 (クレアチュンお よびグルコース）の透過性増加と腎不全の程度の間の回帰直線の傾きを劇的に減少 させた。ピリドキサミン処置により、膜透過性に対する尿毒症の影響はほぼ完全に消 失した。
[0049] (2)組織学的分析
EPSAの増大は血管新生の亢進と密接に関係することが知られている。そこで、フォ ン ·ビルブラント因子染色後の腹膜組織中の血管数を測定した (図 4A)。尿毒症自体 により血管数が 1.87倍増加し、 PD処置はその値を 5.83倍増大させた。この血管新生 の亢進は、ピリドキサミン処置により 2.68倍まで有意に改善した。クレアチュン（図 4B) またはグルコース（図 4C)の透過性増加と血管数との間に有意の相関が認められた 。この結果は、腹膜機能低下時の EPSA増大が尿毒症および PD処置と関連している ことを意味している。
[0050] (3)分子生物学的分析
腹膜の機能および構造の変化と関連する分子事象にっ ヽて検討した。 AGEおよび カルボ-ルストレスの周知の代用のマーカーであるペントシジンの含量を、腸間膜組 織の HPLCアツセィにより測定した。ペントシジン含量は尿毒症により増加し（図 5 Aの 第 2群)、組織中のペントシジン含量と腎不全の程度との間に相関関係が存在する（ 図 5Bの黒丸)。 PD処置中に、ペントシジンの形成は促進され（図 5Aの第 3群）、 PD は、ペントシジン含量と腎不全との間の回帰直線の傾きを増加させた（図 5Bの白四 角）。対照的に、ピリドキサミンの介入により組織中のペントシジン含量は有意に低下 し（図 5Aの第 4群）、回帰直線の傾きは減少した（図 5Bの白三角）。組織中のベント シジン含量と、クレアチュンの透過性（図 6A)および血管数（図 6B)の増加との間に 有意の相関が認められた。
[0051] 次に、血管新生を誘導するサイト力インの役割を明らかにするため、腹膜組織中の VEGFおよび FGF-2の遺伝子発現を半定量的 PCRにより分析した。尿毒症ラットにお ける VEGF (図 7B)および FGF- 2 (図 7C)の発現は、対照ラットの場合よりも高ぐ PD 処置により顕著に増加した。一方、ピリドキサミンは、 VEGFおよび FGF-2の両方の発 現を、 PDを行わな 、尿毒症ラットと同様のレベルまで低下させた。
[0052] 腹膜の分子生物学的変化は、腸間膜組織切片中の VEGF、 FGF-2, vWF、 AGE, T GF- |8 1についての免疫組織ィ匕学分析によりさらに裏付けられた（図 8)。すなわち、 対照ラットの腸間膜血管の内皮では、 VEGF、 FGF-2, vWF、 AGE, TGF- jS 1の染色 を視覚的に検出できな力つたが、これらのバイオマーカーは、尿毒症ラットの腹膜に はわずかに存在し、 PD処置を行った尿毒症ラットでは顕著に認められた。一方、ピリ ドキサミン処置を行ったラットの腸間膜の毛細血管では、わず力な染色が検出された のみであった。
産業上の利用可能性
[0053] 本発明において有効成分として用いるピリドキサミン等のピリドキシン類は副作用の 少ない安全な物質である。本発明によれば、長期腹膜透析 (PD)患者などにおける 腹膜の機能低下を効果的に抑制することができる安全な腹膜保護剤を提供すること が可會 になった。
図面の簡単な説明
[0054] [図 1]図 1は、動物実験のプロトコルを示す。 6週齢のラットを尿毒症の疑似手術群に 割付けた。腎亜全摘 5週後に、腹腔内カテーテルおよび皮下アクセスポートを配置す る外科的埋植を行った。 PDは出生後 21週まで継続した。
[図 2]図 2は、 PETによる腹膜機能の解析を示す。 3.85%グルコース透析液 20 mlでの 60分の交換中の Cr (A)および尿素（B)の透析液/血漿比（D/P)、ならびに透析液か らのグルコース吸収 (D/D0) (C)を、対照ラット (第 1群）、 PDを行わない尿毒症ラット（ 第 2群）、ピリドキサミンなしで PDを受けた尿毒症ラット (第 3群）、 5 mg/Lピリドキサミン ありで PDを受けた尿毒症ラット (第 4群）において検討した。 a :第 1群に対して pく 0.01 。 b :第 2群に対して p〈0.01。 第 3群に対して p〈0.01。（1:第4群に対して〈0.01。 e:第 3群に対して p〈0.05。 f:第 4群に対して p〈0.05。
[図 3]図 3は、クレアチュン（A)またはグルコース（B)の透過性の増加と腎不全の程 度との相関を示す。黒丸：第 1群および第 2群 (A、 y = 0.20x + 0.26、 n = 14、 r = 0.87 、 p〈0.001。 B、 y = 0.0538x + 0.49、 n = 14、 r = 0.63、 p〈0.05)白四角：第 3群（A、 y = 0 .22x + 0.39、 n = 7、 r = 0.76、 p〉0.01。 B、 y = 0.1350x + 0.45、 n = 7、 r = 0.93、 p〈0.05 )白三角：第 4群（A、 y = 0.02x + 0.63、 n = 10、 r = 0.24、 p〉0.1。 B、 y = 0.0015x + 0.2 9、 n = 10、 r = 0.025、 p〉0.1)慢性尿毒症により小分子脂質の透過性が増大する。こ の増大は通常のグルコースベースの透析液を用いる PDによりさらに増大する。対照 的に、ピリドキサミン処置は尿毒症による膜透過性の低下を是正する。
[図 4]図 4は、フォン'ビルブラント因子についての免疫組織ィ匕学分析による腹膜の構 造解析を示す。 A:ラット腸間膜の血管数。 a:第 1群に対して pく 0.01。 b :第 2群に対し て p〈0.01。 第 3群に対して p〈0.01。（1:第4群に対して〈0.01。クレアチュン（B、 y = 0 .052x + 0.434、 n = 31、 r = 0.65、 p〈0.001)またはグルコース（C、 y = - 0.029x + 0.43、 n = 31、 r = -0.64、 pく 0.001)の透過性の増大と血管数ととの間に有意の相関が存在 した。慢性尿毒症により血管数が増加し、この増加は通常のグルコースベースの透 析液を用 、る PDでさらに増大するが、ピリドキサミン処置により減少する。
[図 5]図 5は、 HPLCアツセィによる腹膜の AGE含量を示す。 A:ラット腸間膜中のペン トシジン含量。 a:第 1群に対して pく 0.01。 b :第 4群に対して pく 0.05。 第 3群に対して pく 0.05。 B：腸間膜のペントシジン含量と腎不全によるクレアチュン透過性の程度との 間に有意の相関が存在する。黒丸:第 1群および第 2群 (y = 0.0.24x - 0.005、 n = 14 、 r = 0.91、 p〈0.001。白四角：第 3群（y = 0.80x + 0.091、 n = 7、 r = 0.82、 p〈0.01)。白 三角：第 4群 (y = 0.006x + 0.0135、 n = 10、 r = 0.35、 p〉0.1)。慢性尿毒症により腸間 膜のペントシジン含量は増加し、通常のグルコースベースの透析液を用いた PDでさ らに増加するが、ピリドキサミン投与により低下する。
圆 6]図 6は、腸間膜ペントシジン含量とクレアチュン透過性または血管数との相関を 示す。腸間膜中のペントシジン含量は、クレアチュン透過性 (A、 y = 0.066x - 0.018 、 n = 31、 r = 0.65、 p〈0.001)または血管数（B、 y = 0.004x + 0.001、 n = 31、 r = 0.46、 p〈0.01)と相関する。
[図 7]図 7は、血管新生を誘導するサイト力インの発現の検出を示す。腸間膜での VE GFまたは FGF2の mRNA発現を半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)に より分析した（A)。実験ごとに、 β—ァクチンに対する VEGFまたは FGF2の mRNAの 比の平均を計算した。 VEGF (B)または FGF2 (C)についての 2回の実験の平均を示 す。 a:第 1群に対して p〈0.05。 1> :第2群に対して 〈0.05。 第 3群に対して p〈0.05。 d: 第 4群に対して pく 0.05。 e :第 1群に対して pく 0.01。 f:第 2群に対して pく 0.01。 g:第 3群 に対して p〈0.01。 第4群に対して 〈0.01。
[図 8]図 8は、腸間膜の VEGF、 FGF2、 vWF、 AGE、 TGF j8 1の免疫組織化学的検出 を示す。対照ラットの腹膜では、 VEGF (A)、 FGF2 (B)、 vWF (C)、 AGE (D)、 TGF- β 1 (D)の染色は視覚的に検出できな力つた力 尿毒症ラットにはこれらのバイオマー カーがわずかに存在し、 PD処置を受けた尿毒症ラットでは顕著であった。対照的に、 ピリドキサミンを投与したラットの腸間膜の毛細血管ではわず力な染色のみが検出さ れた。倍率 X 400。

Claims

請求の範囲
[1] ピリドキシン類又はその塩を有効成分として含む、腹膜保護剤。
[2] ピリドキシン類がピリドキサミンである、請求項 1に記載の腹膜保護剤。
[3] 腹膜透析患者における腹膜の機能不全又は限外濾過不全を治療及び Z又は予防 するために使用する、請求項 1又は 2に記載の腹膜保護剤。
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