CN1205480C - 蛋白质高级糖化终产物(蛋白质－age)形成的调节物的鉴定方法 - Google Patents

蛋白质高级糖化终产物(蛋白质－age)形成的调节物的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鉴定影响细胞胁迫的化合物的方法。具体是，该方法涉及鉴定抑制蛋白质高级糖化终产物形成的化合物，其中化合物是抑制所述形成的羰基清除剂。该分析方法涉及将目的物质与组蛋白H1和ADP-核糖结合，然后测量荧光和蛋白质交联。利用该分析方法已鉴定了各种蛋白质AGE糖化的抑制物。

Description

蛋白质高级糖化终产物(蛋白质-AGE)形成的调节物的鉴定方法
                      政府资助声明
本发明研究部分得到NIH授予的CA43894和NS538496的支持。
相关申请
本申请要求2000年4月14日提交的临时申请60/197,829的优先权，在此引入作为参考。
发明领域
本发明涉及鉴定蛋白质-高级糖化终产物(protein-advancedglycation end product)(后面表示为“蛋白质-AGE”)形成的抑制剂的方法。所述方法用于测定影响与蛋白质-AGE形成相关的病理状态的目的物质，例如糖尿病，粥样硬化，慢性神经变性疾病，如阿尔茨海默氏病，皮肤光老化(skin photoaging)及其它衰老进程的退化性疾病特征。
背景技术
本文所用糖化是通过还原糖和其它反应性羰基种类(reactivecarbonyl species)进行蛋白质非酶的，翻译后修饰，这会对蛋白质功能产生不利影响。组织退化和老化与来自由糖化以及氧化胁迫和UV放射诱导的化学方法造成的损伤的积累密切相关，源于糖化的糖化产物和AGE产物的长寿命蛋白质(long lived protein)的积累涉及许多与老化相关的疾病包括慢性糖尿病并发症(Thorpe，et al.，Drugs Aging 9：69-77(1996))，粥样硬化(Ruderman，et al.，FASEB J 6：2905-2914(1993))，阿尔茨海默氏病(Vitek，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：4766-4770(1994))，皮肤光老化(Mizutani，et al.，J.Invest.Dermatol 797-802(1997))以及老化进程的一般疾病(Frye，et al.，J.Biol Chem273：18714-18719(1998))。高血糖引起的慢性糖尿病并发症最终导致诸如晚期肾脏疾病这些严重的和威胁生命的疾病(Baynes，et al.，Diabetes40：405-412(1991))。包括视网膜病，神经病，肾病，动脉硬化症和脑血管疾病这些不可逆转的微血管和macrovascular并发症均机械地与结缔组织中蛋白质-AGE的形成有关，尤其是胶原和基质蛋白成分。而且，对于正常老化过程中较低比率的相似情况的发生似乎与之有相同的关联(Thorpe，etal.，出处同上)。
糖化和后来的蛋白质-AGE的形成在细胞羰基胁迫和葡萄糖毒性中起着关键作用。给药糖化抑制物氨基胍有效地抑制有试验糖尿病的啮齿动物次级并发症(Edelstein，et al.，Diabetologica 35：96-97(1992))；然而由于氨基胍是过氧化氢酶(Ou，et al.，Biochem Phamacol46：1139-1144(1993))和诱导型氧化氮合酶(Okuda，et al.，J.Neuroimmunol 81：201-210(1998))的强力抑制剂，所以氨基胍是长期给药显示全身毒性的肼的衍生物。氨基胍的毒性模式使其不能在临床上应用。因此，临床上急需鉴定出有效地抑制糖化和其相关病理结果的新化合物并鉴定其特征。能应用到大的组合(combinatorial)化合物库的高生产率的筛选分析方法可能导致鉴定出新的糖化抑制剂。
活性氧种类(“ROS”)和活性羰基种类(“RCS”)，尤其是二羰基化合物(dicarbonyl compounds)是氧化胁迫，糖化和UV辐射引起的细胞损伤的关键中介体。糖化，脂质过氧化，糖自氧化和代谢引起的细胞羰基胁迫的起源在例如图1中显示。氧依赖型和不依赖型途径导致各种活性羰基种类的形成，包括象甲基乙二醛和乙二醛这些2-二羰基，作为由AGE形成引起的蛋白质损伤积累的关键中间体。羰基胁迫还源于甲基乙二醛代谢的产生。简而言之，早期的糖化产物源于还原糖与蛋白质氨基基团(赖氨酸和精氨酸)的反应以产生可进行阿马多里(Amadori)重排形成酮胺加合物的醛亚胺(希夫碱加合物)(Hodge，et al.，J.Am.Chem Soc.75：316-322(1953))。蛋白质-AGE既可通过氧化途径又可通过非氧化途径由早期的糖化产物产生，这些途径中许多反应性二羰基化合物例如乙二醛，甲基乙二醛和3-deoxyosone被认为是中间体(Thornalley，et al.，BiochemJ.344：109-116(1999))。
蛋白质-AGE包括蛋白质Nε-(羧甲基)赖氨酸残基(CML)(Ahmed，et al.，J.Biol.Chem 261：4889-4894(1986))，和诸如pentosidine的复杂修饰的异源基团(Sell，et al.，J.Biol.Chem 264：21597-21602(1989))，可通过其高荧光和导致蛋白质-蛋白质交联的能力来特征鉴定。AGE-特异性荧光的累积(ex.370nm；em 440nm)为总蛋白损伤的一般测量，并且是体内和体外糖化研究的广泛应用的工具。某些情况下，反应性二羰基化合物不需要糖化可通过糖自身的自氧化而形成，并且在二羰基化合物和活性氧种类例如过氧化氢的形成中提示有痕量过渡金属离子(Fe，Cu)的存在(Elgawish，etal.，J.Biol.Chem 261：12964-12971(1996))。除了赖氨酸和精氨酸外的氨基酸也可通过糖氧化(glycoxidation)修饰。例如，蛋白质表面暴露的甲硫氨酸残基对蛋白质氧化非常敏感(Hall，et al.，Biochem.Biophys.Acta1121：325-330(1992))。
由于葡萄糖的充裕，所以它被推测是体内胞外蛋白中糖化和蛋白质-AGE形成的主要来源；然而葡萄糖仅是弱糖化试剂，并且生理条件下与蛋白质的化学反应只有在成年累月下才能发生(Higgins，et al.，J.Biol.Chem 256：5204-5208(1981))。与糖相对比，胞内蛋白的糖氧化较多的是以反应性戊糖作为糖源，因为它们是形成荧光AGE诸如pentosidine更高效率的前体(Sell，et al.，同上)。大量细胞戊糖为ADP-核糖，通过许多代谢途径自NAD产生(Cervantes-Laurean，et al.，bioche-mistry32：1528-1534(1993)；Jacobson，etal.，Mol.cell Biochem.138：207-212(1994))。较早的研究集中在涉及ADP-核糖(ADPR)胞内生成的途径上。研究证实细胞核可能是体内通过ADP-核糖糖化的位置。氧化胁迫和其它可导致DNA链断裂的条件刺激ADP-核糖核聚体的合成，很快地在与富集赖氨酸和精氨酸残基的长寿命(long lived)组蛋白密切相关地产生ADP-核糖(Cervantes-Laurean，et al.，同上)。
除上述参考文献外，组织退化和老化与来源于糖化，氧化胁迫和UV放射诱导的化学方法的损伤积累密切相关。Halliwell，et al.，FreeRadicals in Biology and Medicine(Clarendon Press，Oxford，1989).Berlett，et al.，J.Biol.Chem 272：20313-20316(1997)。所有这些是活性氧种类(“ROS”)和活性羰基种类(“RCS”)强力诱导物(Andersonet al.，J.Chem，Invest.104：103-113(1999))，是在一般老化和几种病理状态累积蛋白损伤的关键中间体，例如慢性炎症疾病(Dimon-Gadal，et al.，J.Invest.Dermatol 114：984-989(2000))；牛皮癣和糖尿病。Brownlee，etal.，Ann.Rev.Med 46：223-234(1995)；Brinkmann，et al.，J.Biol.Chem273：18714-18719(1998))。作为细胞羰基胁迫反应性的中间体的RCS源于许多机械地相关的途径，象糖化(Thornalley，et al.，BioChemJ344：109-116(1999)，糖自氧化(Wolffi，et al.，Prog.Clin.Biol.Res304：259-75(1989))，脂质过氧化(Fu，et al.，J.Biol.Chem271：9982-64996(1998)，和UV-光损伤(Mizutani，et al.，J.Invest.Dermatol 108：797-802(1997))。糖化，在还原糖和长寿命蛋白间的自发的氨基-羰基反应是导致细胞羰基胁迫RCS产生的主要源。反应性α-二羰基中间体，例如乙二醛，甲基乙二醛和3-deoxyosone既可通过糖化的氧化(糖氧化)又可通过非氧化反应途径产生。复杂的反应顺序由希夫碱的可逆形成启动，在早期的糖化期间经阿马多里重排以形成相对稳定酮胺产物。涉及糖断裂和作为关键反应性中间体的α-二羰基化合物形成的一系列进一步的反应产生稳定蛋白质结合高级糖化终产物(AGEs)(Thornalley，et al.，同上；Glomb，et al.，J.Biol.Chem 270：10017-10026(1995)；Wondrak，et al.，Free Radical Biol.Chem 272：17810-14(1997)。有趣地是通过ROS产物的增加，由此形成ROS和RCS产物的有害循环，RCS和AGEs可行使其有害的细胞影响。AGE-形成伴随有AGE-特异性荧光(λex-370nm；λem-440nm)的累积和蛋白质交联，是组织中总蛋白损伤的测量方法。Brownlee，et al.，同上。精氨酸衍生的咪唑鎓盐AGE产物(Westwood，etal.，J.protein Chem14：359-72(1995)；乙二醛-赖氨酸二聚物(GOLD)和甲基乙二醛-赖氨酸二聚物(MOLD)(Brinkmann，et al.，J.BiolChem273：18714-18719(1998))，它们在老化的人晶状体(lens crystallin)和皮肤胶原中已被鉴定，提示了组织老化中的α-二羰基胁迫。此外，RCS如乙二醛，AGE Nε-羧甲基-L-赖氨酸(CML)的直接前体，在细胞膜中通过自由基对多不饱和脂肪酸的损伤而得以产生。Fu，et al.，同上，UV-辐射是组织羰基胁迫的另一来源，通过在光化性弹性纤维病日光暴露损伤中CML的累积而得以证实。Mizutani，et al.，同上。因此，AGE-产物如CML和GOLD被认为是组织羰基胁迫的生物标记。
甲基乙二醛是重要的糖化中间体(Thornalley，et al.，同上)，也是通过糖酵解丙糖磷酸途径中间体的非酶的和酶的降解产生的生物代谢物，来源于苏氨酸分解代谢(Thornalley，et al.，Gen.Pharmac27：565-573(1996))。发现糖尿病病人的血液中以及链脲菌素诱导的糖尿病大鼠的晶状体中甲基乙二醛的水平升高(Beisswenger，et al.，Diabetes48：198-202(1999))，对高血糖条件下培养的内皮细胞中AGE形成的最近研究表明甲基乙二醛是AGE的主要前体(Shinohara，et al.，J.Clina.Invest.101：1142-7(1998))。在人组织中各种甲基乙二醛衍生的AGEs已被鉴定，例如荧光5-甲基咪唑啉酮(imidazolone)衍生物，在大动脉的动脉粥样斑块中(Uchida，et al.，FEBS Lett 410：313-318(1997))，或老化的皮肤胶原中的MOLD和Nε-羧甲基-L-赖氨酸残基(Brinkmann，et al.，同上)。最近，糖化中间体甲基乙二醛和3-脱氧葡糖醛酮的细胞毒素对神经细胞例如PC12细胞(Suzuki，et ai.，J.Bioche)和培养的皮层神经元(Kikuchi，et al.，J.Neurosci Res 57：280-289(1999))的影响已经引起了很大关注，这是因为猜测它们涉及神经变性疾病例如阿尔茨海默氏病(Vitek，et al.，Proc.Natl.Acad Sci USA 91：4766-70(1994))和肌萎缩性侧索硬化(Shinpo，et al.，Brain Res.861：151-9(2000))病理形成。
作为氧化和羰基胁迫(carbonyl stress)的另一个结果，羰基化引起的蛋白质损伤与老化及许多疾病，例如早老化疾病，早老和Werner综合症有关(Berlett，et al.，J.Biol Chem 272：20313-20316(1997))。人皮肤成纤维细胞蛋白中的羰基基团的数量与供试体的年龄密切相关(Oliver，etal.，J.Biol Chem 262：5488-5491(1987))。最近，报道了体内组蛋白H1羰基化水平升高可作为核氧化和糖氧化胁迫(glycoxidative stress)的指示(Wondrak，et al Biochem J 351：769-777(2000))。
与它们治疗的潜力相比，目前仅很有限量的细胞羰基胁迫的生物抑制物已经被鉴定，象亲核羰基清除剂(nucleophilic carbonyl scavenger)谷胱甘肽。然而，一些糖化的抑制物通过捕获中间体α-二羰基干扰反应，而其它抑制物仅起到了抗氧化剂和过渡金属螯合物的功能，由此抑制高级糖氧化，而不是糖化(Elgwash，et al.，J.Biochem.271：12964-71(1996))。全身给药肼的衍生物和羰基试剂氨基胍，糖化抑制物第一级别的成员，有效的抑制患有试验糖尿病的糖尿病啮齿动物次级并发症，并且抑制皮肤胶原蛋白交联(Edelstein，et al.，Diabetes 41：26-9(1992))；Fu，et al.，Diabetes 43：676-683(1994)。最近，亲核二配位基的，苯酰噻唑(phenylacylthiazolium)溴化物显示出保护大肠杆菌抗甲基乙二醛毒性(Ferguson，et al.，Chem.Res.Tox 12：617-622(1999))。评估充当羰基捕获的其它亲核化合物(nucleophilic compound)象tenilsetam(Shoda，etal.，Endocrinol 138：1886-92(1997)，吡哆胺(Onorato，et al.，J.Biol.Chem 275：21177-21184(2000))和metformin(Ruggiero-Lopez，etal.，Biochem)预防次级糖尿病并发症的作用。
通过大多数目前应用的糖氧化反应系统(glycoxidative reactionsystem)的性质，测量如通过特异AGEs象CML的AGE-荧光或免疫定量评估的依赖氧的AGE-形成的抑制来体外筛选潜在的α-二羰基清除剂是复杂的(Elgawish，et al.，同上；Shoda，et al.，同上，Ruggiero-Lopez，et al.，同上)。因此，在这些糖氧化系统中AGE-形成通过具有抗氧化剂和金属螯合活性的化合物被有效的抑制。最近，不依赖氧的高级糖化通过具有AGE-荧光和蛋白质交联形成的戊糖得以证实，并且机械性与作为反应性α-二羰基中间体的脱氧戊糖的非氧化形成相连(Litchfield，et al.，Int.J.BiochemCell Biol 31：12978-1305(1999))。
前面所要显示的是急需鉴定出有效地抑制糖化和其相关病理结果的新化合物并鉴定其特征。所述分析方法用在例如，分析大的组合库以鉴定相关化合物。所述分析方法在引用的临时申请，出处同上，中已有描述并在此处也描述。也可见引入作为参考的Wondrak，et al.，BiochemJ.351：769-777(2000)。其中所描述的工作得以进一步的研究，以研发出更高产量的筛选分析方法以鉴定充当羰基清除剂的糖化抑制物。在进行这些研究之前，已经研究出一些用于研究目的的鉴定糖化抑制物的分析方法(Khalifah，et al.，Biochem Biophys Res Commun 257：251-258(1999))；Rahbar，et al.，Clin.Chem.Acta 287：123-130(1999)；Ruggiero-Lopez，et al.，Biochem.Pharmacol 58：1765-1773(1999)。要测参数通常是AGE-特异性荧光，蛋白质交联和蛋白质-AGE免疫测定。大多数糖化分析方法应用葡萄糖或戊糖作为糖化试剂导致缓慢的需要几周进行的反应。通常这些分析方法中使用非生理条件的糖的浓度或磷酸缓冲液来增加反应速率。通过AGE-形成检测水平测得的灵敏度低，试验的精确度也受到低信噪比的限制。最高灵敏度分析依赖于由ELISA的AGE-形成免疫学评估。这些试验中使用的针对AGE抗体或者是特别昂贵，或者就是商业途径不能购得。因此，急需获得不昂贵的，迅速的，容易实施的分析方法来鉴定蛋白质糖化抑制物，例如，非氧化蛋白糖化的抑制物。也急需获得机械地，不鉴定抗氧化剂而是象羰基清除剂的材料的分析方法。所述分析方法已被本发明人研究得出，在下面描述：
附图说明
图1为蛋白质糖化的概览。
图2显示的是产生ADPR的途径。
图3为通过ADP-核糖的糖化反应化学。
图4为显示ADP-核糖和组蛋白H1间在类似生理条件下快速进行反应的数据。
图5为在本发明方法中比较葡萄糖，核糖和ADP-核糖。
图6为比较作为糖化靶的牛血清白蛋白和组蛋白H1。
图7显示通过ADP-核糖氨基胍抑制组蛋白H1的糖化。
图8在组蛋白H1/ADP-核糖反应中蛋白质交联形成的测量。
图9为测量蛋白质羰基试验的结果。
图10为用于抑制物初级和次级筛选的详细设计。
图11为鉴定潜在抑制物试验数据。
图12显示两个负面化合物，即不是糖化抑制物的化合物的数据。
图13描述设计为鉴定假阳性的试验结果。
图14显示测定糖化和由此的蛋白质损伤的证实交联检测的结果。
图15显示各种化合物抑制糖化诱导的组蛋白H1交联的能力的试验之结果。
图161H-NMR光谱分析鉴定的各种反应物结构。
图17和18描述设计为测定D-青霉胺对细胞保护效果的试验结果。
图19A-D为各种糖(A和B)和抑制物(C和D)影响的研究。
发明内容
发现ADP-核糖和组蛋白H1进行快速和强力的糖化反应，并且该反应是本发明所述的关键特征。通过ADP-核糖的糖化反应化学是独一无二的。如图3所示得以详细说明，而且，反应在模拟生理条件(如图4所示50mM磷酸缓冲液，pH7.4)下足以迅速进行，确保分析在筛选目的化合物中有用，如下文所述。酮胺和其它相似AGE产物既可通过ADP-核糖又可通过葡萄糖形成。然而，由ADP-核糖的产物形成速率至少比由葡萄糖形成快一千倍(Cervantes-Laurean，et al.，J.Biol.Chem.271：10461-10469(1996))。涉及ADP-核糖的反应非常快，然而这也是本发明的关键。涉及ADP-核糖和组蛋白H1的反应途径相似，但是比由其它糖启动的反应快得多，这提示在ADP-核糖和组蛋白H1间的快速反应的抑制物一般抑制糖化反应。例如在比较葡萄糖，核糖，ADP-葡萄糖，ADP-核糖与组蛋白H1间反应的一系列试验中，自ADP-核糖产生的荧光AGE的量大大超过其它的。参见在同上的条件下描述该试验的图5。相似地，组蛋白H1是很好的糖化靶。图6为组蛋白H1与作为糖化靶牛血清白蛋白的比较的试验结果。ADP-核糖作为糖化试剂的潜力是已知的。碱，富含赖氨酸和精氨酸的组蛋白H1是极好的底物。因此，在弱碱条件下(即约pH9.0)已观察到在ADP-核糖与组蛋白H1间体外反应在几分钟内完成，由此产生AGE-荧光(Jacobson，et al.，“ADP-hribose InGlycation and Glycoxidation Reactions”in Koch-Nolte，ed.，ADP-Ribosylation In Animal Tissues，Plenum Press，1997，pages371-379)和蛋白质交联。
对于筛选抑制和/或促进糖化的化合物中有效的分析，考虑利用对研究中的方法有已知效果的试剂进行检测。图7数据显示当再次在同上的生理条件下检测已知糖化抑制物氨基胍时，其抑制效果得以很快检测。因此，本文所描述的分析方法可按照所要求的使用。
本文提供的额外数据显示测量蛋白质糖化的标准方法表明所测得的AGE-型荧光事实上测量的是蛋白质损伤。无论是蛋白质交联还是蛋白质羰基化都被确定为蛋白质糖化的标记。见引入作为参考的Schacter，et al.，Free Radic Bio Med.17：429-437(1994)。简而言之，下面所要描述的试验，蛋白质交联的形成在12％SDS-PAGE上测量，接着进行考马斯染色和银染。在图8中显示结果。当ADP-核糖和组蛋白H1间的反应在pH9.0进行时，交联得以高灵敏地检测。图8中泳道1显示时间(后面用t表示)＝0，而泳道2和3分别为t＝2和24小时。图8中缩写“M”“D”和“0”分别表示“单体”，“二聚体”和“寡聚体”。银染是测定交联的优选方式。蛋白质羰基化通过Westernblotting测定。特别是，当用特异于蛋白质结合抗体，DNP表位检测时，在用2.4二硝基苯肼(“DNP”)衍生后，通过在pH7.4，于37℃温育有1.66M的葡萄糖的BSA90天制备的AGE-BSA被识别。在泳道2中可以看到，而泳道1显示的是未处理的BSA，作为对照。图9中A图为考马斯染色，B图为羰基免疫染色。
实施例
下述实施例中，本领域的技术人员理解本发明所提出的各种实施方案和特征。
实施例1
该实施例描述的各组试验重复进行一次。然而，应理解为这不是必需的，在96孔微量滴定板鉴定已鉴定(48)的样品数也不是必需的。它和所有其它的样品在图10中概括。
用96孔微量滴定板重复实施48个反应。第一对孔含有反应物ADP-核糖和组蛋白H1而没有任何潜在的抑制物。第二对孔含该反应物和已知的糖化抑制物氨基胍，作为阳性对照。组蛋白H1可商业购得，并且可按照下面在此引入作为参考的Johns，et al.，Biochem J.92：55-59(1964)中所述方法制备。
将在5mM水平的或如果低于5mM则在溶解度所限的测试化合物加入孔中。反应系统为加入了1.5mg/ml组蛋白H1和1.0mM ADP-核糖的pH7.4，50mM磷酸钾缓冲液。反应体积为300ul。于37℃温育在355nm(ex)和405nm(em)随时间测量AGE-荧光。与对照相比，如果AGE-荧光被抑制，则检测的化合被认为是潜在阳性。
图11显示鉴定潜在抑制物即半胱氨酸和半胱氨酸甲酯的试验结果。如果检测化合物不抑制荧光，就可将其分类归为真阴性，不在进行进一步处理。图12中所示发现β丙氨酸和精氨酸均为真阴性。
通过0天测量荧光可容易的测定假阴性以测定自身荧光。任何这样的化合物在次级筛选中检测，下面描述。
实施例2
前面的实施例讨论了真阳性，真阴性和假阴性。假阳性也有可能。这些通过物理干扰荧光的测量而抑制AGE-荧光的形成。为了消除这样的化合物，在下面的试验中对于猝灭牛血清白蛋白AGE形式(“AGE-BSA”)的能力进行检测。
根据引入的参考文献Ikeda，etal.，Biochemistry 35：8075-8083(1996)制备AGE-BSA。然后将AGE-BSA加入到含测试化合物ADP-核糖和组蛋白H1的孔中测定荧光。将获得的数值与当将AGE-BSA加入到含抑制物氨基胍的孔中获得的数值进行比较。在潜在化合物存在下AGE-BSA荧光的降低导致分类归为阴性，并且不在进一步的筛选。在这些实施例中详细描述的筛选方法的一般概括在图10中显示。
实施例3
描述次级筛选以近一步评估下面的实施例1和2中认为阳性的化合物。特别是，应予以提醒的是要每个样品检测两个孔，其中之一在实施例2，同上，检测。通过12％SDS-PAGE分析没有用到的样品，接着进行银染以使蛋白质交联可视。这为蛋白质损伤导致的糖化的独立测量。没有蛋白质损伤表明该检测的化合物实际上抑制糖化。
利用荧光证实阳性的所述试验的结果在图13中显示，利用交联的检测在图14中显示。
实施例4
这些试验描述上面所讨论的分析方法的进一步研究。
为了详述，自新鲜小牛胸腺分离组蛋白H1。首先通过用0.14M NaCl和0.05M Na2S2O5，pH5提取，根据引入作为参考的Wondrak，et al.，Biochem J.351：769-777(2000)从新鲜的小牛胸腺样品提取染色质。在用5％HClO4重复提取，并1500xg离心，加入TCA(终浓度20％v/v)组蛋白H1自上清中沉淀。组蛋白H1沉淀经12000xg离心和去离子水收集。将样品进行进一步的水透析(MW(分子量)截留：12000-14000)48小时，接着冷冻干燥。用SDS-PAGE(12％)分析样品的纯度。将这种方式收集的任何蛋白储存在4℃下。
在50mMKH2PO4缓冲液中(pH7.4，37℃，将0.015％NaN3加入以抑制微生物生长)，组蛋白H1(1.5mg/ml)与1mM ADP-核糖结合。该反应混合物加入到96孔微量滴定板中。将测试化合物以1-10mM浓度范围加入到反应混合物中，反应体积300ul，检测重复进行一次。
通过在波长(λex：355nm，λem：405nm)测量AGE-荧光测定累积的蛋白损伤。在具有抑制活性的化合物存在下荧光被抑制。采用具有接近上述条件(λex：355nm，λem：405nm)的滤器设定(filter setting)，在常规的微量滴定板上读出鉴定结果，这是在AGE化合物广泛刺激/发射最大量(excitation/emission maxima)的范围里。
在开始和温育5天后测量荧光。本身发荧光的任何化合物通过最初的测量得以鉴定，被认为是假阳性；然而事实上由于它们具有抑制的性质，所以在试验的第二阶段得以检测，下面描述。
已知的糖化抑制物氨基胍用作对照。此外，组蛋白H1和ADP-核糖在没有潜在抑制物下进行鉴定，并且组蛋白H1也在没有ADP-核糖下温育。
5天温育后，组蛋白H1/ADP-核糖混合物产生的AGE-荧光约比单独的组蛋白H1产生的背景荧光约大20倍。没有组蛋白H1温育的ADP-核糖不产生荧光。
试验的第一阶段鉴定潜在的抑制剂；然而，可能该化合物是荧光猝灭剂而不是糖化抑制剂。由此，它们在另外的试验中得以鉴定，如下所述。
为了概括，筛选试验的该步骤鉴定真阴性，这不需要进一步考虑。还鉴定出可能是糖化抑制剂的化合物，和不确定活性的化合物。后两类化合物在现在描述的试验中得以检测。
实施例5
这些试验描述了假阳性即荧光猝灭剂如何得以鉴定和如何从实施例1中鉴定的潜在阳性中排除。必要的是，在上述测试化合物和其它材料混合物中使用具有已知荧光活性的AGE修饰的蛋白。
“AGE-BSA”或AGE修饰的牛血清白蛋白具有已知的荧光活性。根据引入作为参考的Takata，et al.，J.Biol.Chem.263：14819-14825(1988)进行制备。简而言之，在 同上描述的试验中的荧光发生(development)后5天，将1.6g牛血清白蛋白(“BSA”)和3.0g D-葡萄糖稀释到10ml，pH7.4，含0.05％NaN3的0.5M磷酸钠缓冲液中。将该溶液通过0.45um过滤器过滤灭菌，在黑暗中于37℃温育90天。将样品水透析，接着冷冻干燥。
通过将1mg/ml的AGE/BSA加入到反应混合物中，同上所述进行检测。猝灭AGE-BSA分子固有荧光性的任何化合物被认为是假阳性，不在进行进一步的研究。
实施例6
筛选方法的下一步涉及鉴定抑制物以测定抑制蛋白交联的能力。为了此检测，实施例1中描述的，同上，5天温育混合物的反应等分试样在12％SDS-PAGE上检测。无论未处理的组蛋白H1还是含有阳性对照的氨基胍都以相同方式检测。均通过银染观察。
实施例1-5所述的试验结果在下表中显示。在0天NADH的荧光测量显示它为强的荧光物质，即具有未知活性的化合物。然而，当在交联试验中检测时，它没有显示出抑制活性。因此，试验的结合显示该化合物为“真”阳性。由于猝灭AGE-BSA荧光，但不抑制组蛋白H1交联，芸香苷被鉴定为假阳性。
表1.非氧化高级糖化抑制物的筛选：96孔微量滴定板上AGE-荧光性
样品                              AGE-荧光              AGE-荧光        ％抑制      AGE-BSA
                                  (0天)                 (5天)                       检测
组蛋白H1空白                      1.1(0.)               1.5(0.2)
完成反应
-氩下         (+5mM               1.1(0.1)              23(1.1)                     32
               DPTA)
-空气下                           1.1(0.1)              21(0.9)                     30
+化合物
氨基胍         1mM                1.2(0.1)              4.3(0.2)        84
               5mM                1.2(0.1)              2.2(0.0)        96
              10mM                1.3(0.1)              1.8(0.0)        97          10
芸香苷      200μM                1.1(0.0)              3.0(0.1)        90          5.7
          NADH 5mM                52(0.3)               31(0.0)
L-Cys-Gly      1mM                1.3(0.3)              17(0.0          20
               5mM                1.2(0.2)              26(0.4)         0
              10mM                1.2(0.1)              40(0.0)         0
           GSH 1mM                1.3(0.0)              19(0.3)         10
               5mM                1.1(0.3)              17(0.3)         20
              10mM                1.1(0.0)              14(0.5)         35
         L-Cys 1mM                1.2(0.1)              14(0.3)         36
               5mM                1.1(0.1)              11(0.2)         50
              10mM                1.2(0.1)              9.0(0.2)        61
L-Cys-OMe      1mM                1.2(0.1)              15(0.1)         31
               5mM                1.3(0.1)              12(0.8)         46
              10mM                1.2(0.1)              9.0(0.2)        61
        NAC    1mM                1.2(0.2)              11(0.6)         51
               5mM                1.0(0.1)              10(0.4)         55
              10mM                1.1(0.1)              9.4(0.6)        58
D，L-高半胱氨酸1mM  1.3(0.0)      16(1.1)                               26
               5mM                1.2(0.2)              22(0.1)         0
              10mM                1.1(0.1)              27(1.7)         0
       半胱胺  1mM                1.0(0.1)              10(0.6)         55
               5mM                1.1(0.1)              9.0(0.7)        60
              10mM                1.2(0.2)              6.0(0.3)        76
D，L-青霉胺    1mM                1.1(0.2)              13(0.0)         40
               5mM                1.1(0.1)              2.7(0.0)        92
              10mM                1.1(0.1)              1.7(0.0)        97          15
D-青霉胺       1mM                1.2(0.0)              11(0.6)         51
               5mM                1.1(0.1)              2.9(0.3)        91
              10mM                1.1(0.0)              1.4(0.1)        99          12
2-硫代巴比妥酸   1                1.1(0.1)              12(0.4)         45
                mM
               5mM                1.2(0.1)              5.5(0.4)        78
              10mM                1.3(0.1)              2.3(0.0)        95          12
L-麦角硫因     1mM                1.0(0.1)              13(0.0)         40
               5mM                1.2(0.0)              9.3(0.2)        59
              10mM                1.2(0.1)              7.4(0.1)        69
       硫脲    1mM                1.1(0.1)              18(0.1)         15
               5mM                1.1(0.1)              15(0.0)         30
              10mM                1.1(0.2)              11(0.3)         50
实施例7
亲核化合物具有清除亲电性的，α-二羰基中间体化合物的潜力。例如见Ferguson，etal.，Chem.Res.Tox12：617-622(1999)。如此，这些化合物显示出高级糖化抑制物的预示。一些测试的硫醇化合物显示抑制活性，包括L-半胱氨酸甲酯(“L-cys-OMe”)L-半胱氨酸(L-Cys)，和Nα-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)；然而，它们在检测的最高浓度，10mM，仅显示61％抑制。硫醇半胱胺和mercaptomidazole衍生物L-麦角硫因显示有稍微较好的抑制，而D，L-高半胱氨酸和NH2-L-cys-gly-COOH增加AGE荧光性，表明它们自身可能经历糖化反应。D-青霉胺和外消旋混合物D，L-青霉胺是最好的测试化合物。该化合物当用AGE-BSA检测时，发现不是假阳性。因此，可检测它们的抑制潜力，即它们的抑制组蛋白H1交联诱导的糖化的能力。实际上，发现它们的抑制效果比氨基胍更有力。在图15中显示结果，其中显示了与用氨基胍的荧光相比的荧光，还显示了交联分析的结果。这些数据显示1-氨基-2-巯基-2，2二甲基乙烷是phamacaphor，即涉及抑制AGE-蛋白形成的分子活性部分。
实施例8
D-青霉胺显示的抑制活性提示其起到了针对反应性羰基种类作为消除试剂的作用。为了证实这一点，在生理pH和温度下实施试验以评估针对α-二羰基化合物化学反应。
在50ml 0.2M水性磷酸缓冲液(pH7.4)中制备D-青霉胺溶液(350mg，2.3mmol)并将甲基乙二醛(40％于水中/620ul，3.45mmol)加入。混合物于37℃搅拌24小时，减压下溶剂浓缩为一半体积。接着柱中除去盐分，柱用水处理，合并UV吸收峰，减压下蒸发水。粗产物经1.5×45cmQAE Sephadex柱上进行阴离子交换层析，这是通过在200ml蒸馏水和200ml 0.2M NH4HCO3间形成的线性梯度的应用来处理的。收集级分并于254nm测量吸光度。
1H-NMR光谱显示下面的信号：[δH(D2O)in ppm]：1.03(3H，s，CH3)；1.05(3H，s，CH3)；1.90(3H，s，CO-CH3)；3.96和3.98(非对映异构的，1H，s，CH-COOH)。经“MALD-TOF-MS”质谱分析仪显示为226Da的[M+Na]+。这可与相加的质量为203.26Da的C8H13NO3S进行比较。推测在最初形成的希夫碱，亲核环闭合后，醛噻唑烷加合物形成，反应物的结构见图16。
所有的1H-NMR信号能指定2-乙酰-5，5二甲基-噻唑烷-4-羧酸为反应产物的结构。唯一的例外是噻唑烷环上2位的非常酸性蛋白质缺失信号，其可能与D2O发生交换。排除甲基乙二醛在C-2的异构体噻唑烷的形成，其没有检测到醛质子。此外，化合物的C-NMR分析清楚地指示两个羰基基团，在δ＝199ppm(CH3C＝O)和δ＝209(COOH)。
为进一步的研究该反应，将D-青霉胺与苯甲酰甲醛反应。以同上描述方式，在终浓度为10mM苯甲酰甲醛与终浓度为20mM的青霉胺于室温，50mMKH2PO4缓冲液，pH7.4中反应。通过在254nm反应等分试样的HPLC分析监测反应进展。40分钟后，观察到高于90％的苯甲酰甲醛峰转化为单峰。通过制备型的HPLC获得的产物冷冻干燥并用H-NMR光谱分析。
光谱显示下面的信号：[δH(D2O)in ppm]：1.38(3H5，CH3)；1.45(3H，s，CH3)；4.12(1H，s，CH-COOH)，7.42-7.82(5H，m，CH-ArH)。由于预期的与D2O发生交换，相应于噻唑烷环上2位的酸性质子信号再次未检测到，并且未观察到醛质子。因此，苯甲酰甲醛-D-青霉胺加合物的结构定为2-苯甲酰-5，5二甲基-噻唑烷-4-羧酸。
所观察到的结构表明通过2-酰基-5，5-二烷基噻唑烷形成的α-二羰基捕获作为非氧化高级糖化抑制机制可以解释D-青霉胺抑制的效力。该5，5-二烷基取代空间上利于噻唑烷环的闭合，阻止通过水解的逆反应。
实施例9
利用苯甲酰甲醛为模型，将该实施例中描述的试验设计为通过D-青霉胺和氨基胍以评估α-二羰基捕获相对比率。
在10mM磷酸缓冲液中，pH7.4，于37℃实施该反应，接着进行HPLC分析。所用苯甲酰甲醛的浓度为50mM，而D-青霉胺和氨基胍的浓度为250mM和500mM。用苯甲酰甲醛作为UV活性α-氧代醛(oxoaldehyde)的化合物，反应过程中，通过HPLC分析等分试样。对于涉及D-青霉胺的反应，20秒的间隔取出等分试样，并以干冰保持以进行分析。苯甲酰甲醛的最初反应速率和测试化合物通过下面苯甲酰甲醛随时间的消失来监测。
苯甲酰甲醛和测试化合物间的反应为二级反应，速率方程为：
-dc/dt＝(k2nd)[苯甲酰甲醛][二羰基清除剂]
正如我们从反应物的浓度所看到的，由于反应速度常数(k1st)明显依赖于测试化合物的浓度，为了转化成准一级反应动力学，在所有的反应中测试化合物的浓度要过量(1∶5或1∶10)。
苯甲酰甲醛对时间的对数AUC得到斜率为k1st/2.303。所测的一级速度常数(k1st)用来计算二级速度常数(k2nd)：
k2nd＝k1st[α-二羰基清除剂]
计算的二级速度常数在两反应物比例(5∶1和10∶1)时测定，并且非常一致。
D-青霉胺捕获苯甲酰甲醛比氨基胍快60多倍。为了测定是否α-氧取代对醛捕获反应有影响，相应于苯甲酰甲醛即苯乙醛，D-青霉胺与醛的反应以本文所述的相同方式得以进行。
发现D-青霉胺捕获苯乙醛比苯甲酰甲醛约低14倍的效率，导致的结论是D-青霉胺捕获α-氧代羰基化合物的效率比醛高。
实施例10
诸如乙二醛和甲基乙二醛的化合物已被确定对细胞如神经细胞(Kikuchi，et al.，J.Neurosci Res.57：280-289(1999)；Shinpo，et al.，Brain Res.861：151-159(2000)，巨噬细胞衍生的细胞系(Okada，etal.，Biophys.Res.Commun.225：219-229(1996))有毒性。如此，α-二羰基化清除剂保护抵抗D-青霉胺毒性的能力得以检测。
连续地培养的细胞系“He-Cat”(人表皮角质细胞)和“CF-3”(人皮肤成纤维细胞)在标准条件下培养，每两周分入含10％胎牛血清的DMEM中，于含5％CO2的湿润的空气中37℃保存。为分开细胞，在角质细胞上使用5％胰蛋白酶，成纤维细胞上使用1％胰蛋白酶。
使用6孔盘以2×104细胞/孔接种角质细胞，以4×104细胞/孔接种成纤维细胞。使细胞附着在盘上过夜。在加入乙二醛或甲基乙二醛之前15分钟将D-青霉胺或者是氨基胍(各1mM)加入到盘中。α-二羰基静置72小时。使用的是不同浓度的α-二羰基。72小时胁迫后用Coulter计数器计数细胞数。使用没有去除剂的乙二醛或甲基乙二醛的也进行培养。用预计没有保护效果的L-丙氨酸为阴性对照。
结果显示甲基乙二醛浓度的升高导致具有对两细胞系完全抑制的600uM浓度的剂量依赖型生长抑制。乙二醛对两细胞类型的影响相同，而成纤维细胞对乙二醛的敏感性较低。L-丙氨酸没有显示保护效果。氨基胍部分拯救自甲基乙二醛诱导的生长抑制的两细胞系。而D-青霉胺作用更强，几乎完全阻断甲基乙二醛的毒性。两化合物显示出保护角质细胞抗由乙二醛引起的生长抑制作用。保护效果见图17。推测毒性直接的清除，反应性羰基试剂是原因，因为用保护性化合物预温育细胞24小时接着接触α-二羰基没有显示任何保护性效果。
测定D-青霉胺是否显示剂量范围，细胞保护效果是有意义的。升高D-青霉胺的浓度导致保护作用增加。事实上观察到成纤维细胞对甲基乙二醛要比角质细胞更灵敏，与角质细胞100％存活相比，采用D-青霉胺在用6004M甲基乙二醛处理的成纤维细胞中显示47％存活，在图18中显示。
实施例11
该实施例还在引入参考的Wondrak，etal.，BiochemJ.351：768-777(2000)中报道。
所述实施例显示在导致组蛋白H1羰基化中的ADP-核糖潜力。也作了报道， 同上，葡萄糖反应微弱。
实施一系列试验以比较作为糖化试剂的不同还原糖。除ADP-核糖外，还检测ADP-葡萄糖，D-核糖，D-葡萄糖。简而言之，组蛋白H1与1mM各糖结合，并且混合物于pH7.4温育。温育7天后，反应的各等分试样在12％SDS-PAGE上分析，进行银染。结果显示在图19A和B中。其中，泳道1是不加糖的对照，而泳道2-5分别显示使用D-核糖，D-葡萄糖，ADP-葡萄糖，ADP-核糖的结果。ADP-核糖导致广泛的羰基化，而D-核糖导致较少量羰基化。无论是D-葡萄糖还是ADP-葡萄糖均不导致显著羰基化。由ADP-核糖(0.82mole/mole组蛋白H1)和D-核糖(0.06mole/mole组蛋白H1)导致的羰基化量与免疫染色相关。
为了测定通过ADP-核糖的组蛋白H1的羰基化是否涉及氧化途径，通过D-葡萄糖的干扰蛋白质糖氧化的一些已知化合物被检测以测定它们是否通过ADP-核糖干扰这种作用。所测试化合物包括在氩下的5mM DTPA，5mM氨基胍，5mM Nα乙酰L-半胱氨酸，5mM甘露糖醇和100单位/ml过氧化氢酶。这些结果显示在图19C和D中，并且表明除了氨基胍外显示轻微的影响外，均没有干扰羰基化。然而，蛋白质交联完全被阻断，表明通过ADP-核糖的组蛋白H1的羰基化是早期糖化的结果而不是糖氧化。
本发明涉及鉴定影响细胞胁迫物质的方法的各方面在前面已公开。本文所用“细胞胁迫”指的是由例如氧化胁迫，糖化，UV辐射等诱导的胁迫。反过来，这会导致组织衰退和老化。优选的是，该方法涉及鉴定充当羰基化清除剂的物质，例如二羰基清除剂，由此抑制蛋白质-AGE的形成。类似地，由于试验在缺氧的情况进行，这些试验允许本领域的技术人员在筛选试验中消除抗氧化剂。因此，应用该方法可鉴定二羰基消除剂，还筛选化合物以鉴定其是否有抗氧化剂的作用。
如所示， 同上，该方法本质上涉及将所研究的化合物或物质与蛋白质组蛋白H1和ADP-核糖混合。已知组蛋白H1和ADP-核糖互相影响，导致荧光产物的形成。当目的化合物与组蛋白H1和ADP-核糖混合，导致荧光降低，该物质可能是蛋白质-AGE形成的抑制物。反过来，蛋白质-AGE形成的拮抗剂可以以同样方式得以鉴定。
如实施例所示的，目的化合物至少可在两个不同其它试验中进行检测。其中包括之一为将该物质与AGE-BSA以及组蛋白H1和ADP-核糖混合，以及在这些与ADP-核糖和目的物质结合时，测定组蛋白H1分子是否交联的试验。
特定感兴趣的化合物认为是亲核的，含硫醇的化合物。如实施例所示，具有所需性质的化合物以该种方式鉴定。
值得注意的是可利用许多方式测定化合物糖化。例如，本领域所熟悉的测定分子果糖含量的试验，事实上这是测定糖化的试验。这些实验以及其它试验可用于本发明中。
在优选的实施方案中，至少实施两个不同试验，以证实结果在第一个试验中得出的结果，但这并不是必需的。而且，该试验与阳性对照，阴性对照，或者最优选的是阳性和阴性对照串联一起进行。另外，所用对照分析的类型可变化，并且可由本领域的技术人员作处理。
除了本发明的分析方法外，试剂盒也是其一部分。这些试剂盒至少包括容器(container means)，例如盒子，还包含ADP-核糖和组蛋白H1每个独立的部分，可以是溶液的，冷冻干燥的，粉剂的，片的或其它对本领域技术人员方便的形式。这样的试剂盒优选包含实施分析方法的说明，和可任选地包含阳性或阴性对照试剂样品之一或两者均选，例如如上所述的。
本发明的其它方面对本领域的技术人员而言是清楚的。不需要进一步详述。
所使用的术语和表达如同说明书中的术语并不受限制，而且并不意欲排除使用其所示和所述特征的任何等同体或其中部分的术语和表达，认为在本发明范围的各种修改是可能的。

Claims (10)

1.一种测定调控蛋白质糖化的物质的方法，包括将(i)待测试物质，(ii)组蛋白H1和(iii)ADP-核糖混合，并且测定所述待测试物质对通过ADP-核糖进行的组蛋白H1的糖化是否产生影响，其中对所述糖化有影响表明所述物质调控糖化，其中所述物质是二羰基化清除剂。
2.权利要求1的方法，其中所述物质不是抗氧化剂。
3.权利要求1的方法，包括通过测量已糖化的组蛋白H1的荧光来测定糖化。
4.权利要求1的方法，进一步包括将所述影响与通过混合氨基胍，组蛋白H1和ADP-核糖产生的影响进行比较。
5.权利要求1的方法，包括将所述(i)待测试的二羰基化清除剂，(ii)组蛋白H1，(iii)ADP-核糖混合约5天后测定荧光。
6.权利要求1的方法，进一步包括在单独分析中将所述(i)待测试的二羰基化清除剂，(ii)组蛋白H1和(iii)ADP-核糖与AGE-BSA混合，并且测量所述(i)待测试的二羰基化清除剂对AGE-BSA荧光的影响。
7.权利要求1的方法，进一步包括测定组蛋白H1分子的交联。
8.权利要求1的方法，其中所述物质是亲核化合物。
9.权利要求8的方法，其中所述亲核化合物是包含硫醇的化合物。
10.一种可用于测定二羰基化清除剂能否调控蛋白质糖化的试剂盒，包括容器，单独分开的(i)组蛋白H1和(ii)ADP-核糖。
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