CN108776131B - 一种食品中AGEs含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品中AGEs含量的检测方法，包括以下步骤：调节待测食品的pH值，并对待测食品进行粉碎、振荡、离心，取其上清液并配置为系列浓度的待检测样品以及配置系列浓度的标准品并分别加入HRP进行标记得到HRP标记的标准品；采用BSA溶液对微孔板进行包被制得BSA修饰的微孔板；采用CML单克隆抗体对BSA修饰的微孔板进行包被制得特异性抗体包被的微孔板；将系列浓度HRP标记的标准品和系列浓度的待检测样品加入至特异性抗体包被的微孔板中并标记为A组，将系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中并标记为B组，分别进行发光处理，分别计算A组和B组底物降解量之差，获取待检测样品中AGEs含量数据。该方法具有高灵敏度、操作简便的优点。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测领域，更具体地说，涉及一种食品中AGEs含量的检测方法。
背景技术
晚期糖基化终末产物(advanced glycationendproducts AGEs)主要通过美拉德反应形成，是在非酶促条件下，蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一组稳定的不可逆的终末产物。研究表明，AGEs在体内的积聚与糖尿病、肾病、心(脑)血管疾病、心衰、动脉(粥样)硬化、衰老、猝死等多种疾病的发生、发展、预后都有密切的关系，已经成为公认的多种疾病、事件、死亡的独立强烈预测因子，也是“健康人”发生意外的强烈预测因子。AGEs包括羧甲基赖氨酸(CML)、羧乙基赖氨酸(CEL)、戊糖苷素(pentosidine)等。相比较而言，CML更加常见和稳定，也是AGEs的主要抗原表位，可作为免疫检测的指示。目前已经制定了CML的单克隆抗体，用于AGEs检测和定位等研究。
研究表明，日常膳食中含有大量的AGEs，是外源性AGEs主要来源。食品中的AGEs含量与食品的营养成分(高蛋白高脂肪食物中AGEs含量最高)和加工方式有密切关系，随着加热时间的延长和加热程度的增加，AGEs的形成急剧增加，并通过膳食摄入进入体内。已经证明控制膳食AGEs摄入和参加体育锻炼是安全地减少血液循环中AGEs的方法。我国人群膳食结构中存在大量油炸、烘烤食品，且消费人口多，消费量大，有必要对不同加工方式食品中的AGEs进行摸底，指导膳食。
研究表明，相比较其他种类的AGEs,CML更加常见和稳定，并检测方法也较成熟，常作为食品和生物体系中美拉德反应的指示。传统的AGEs检测方法主要有ELISA、质谱等方法，前者灵敏度存在一定的局限性，而后者需要繁琐的前处理过程。基于气相色谱-质谱连用，或者液相色谱-质谱连用。检测方法复杂，所需的仪器设备和实验室条件要求也较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供一种能够解决食品中AGEs含量检测存在灵敏度低，检测复杂，检测所需仪器设备和实验条件要求高等弊端的检测方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种食品中AGEs含量的检测方法，包括以下步骤：
调节待测食品的pH值，并对所述待测食品进行粉碎、振荡、离心，取其上清液并配置为系列浓度的待检测样品，以及配置系列浓度的标准品并分别加入HRP进行标记得到HRP标记的标准品；
采用BSA溶液对微孔板进行包被，制得BSA修饰的微孔板；
采用CML单克隆抗体对所述BSA修饰的微孔板进行包被，制得特异性抗体包被的微孔板；
将系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组，将将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，分别进行发光处理，计算A组和B组底物降解量之差，获取待检测样品中AGEs含量数据。
优选地，所述S1步骤包括以下步骤：
待测食品为固体食品，称取该待测的固体食品，将所述待测的固体食品剪碎并研磨至糊状或小颗粒状；
加入PBS缓冲溶液至研磨后的所述待测固体食品中制得样品混合液；
对所述样品混合液进行超声波粉碎，获得均匀且呈乳状的样品溶液；
对所述样品溶液进行振荡、离心、静置取上清液并配置为系列浓度的待检测样品。
优选地，所述S1步骤包括以下步骤：
待测食品为液态食品，量取待测的液体食品，加入PBS缓冲溶液至所述待测的液体食品中并搅拌至混合均匀制得样品混合液；
对所述样品混合液进行超声波粉碎，获得均匀且呈乳状的样品溶液；
对所述样品溶液进行振荡、离心、静置取上清液并配置为系列浓度的待检测样品。
优选地，所述步骤S2包括以下子步骤：
S2.1、采用等离子处理方法对微孔板进行表面处理；
S2.2、采用碳酸缓冲溶液溶解BSA，制得BSA溶液；
S2.3、将所述BSA溶液加入所述步骤S2.1经表面处理后的微孔板中，在低温条件下轻摇过夜，弃去孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，再使用蒸馏水洗涤，制得BSA修饰的微孔板。
优选地，在所述步骤S2.2中，所述BSA溶液的浓度为3-5mg/mL；
在S2.3步骤中，所述低温条件为0～4℃。
优选地，在所述步骤S2和步骤S3之间还包括对所述BSA修饰的微孔板进行溴乙酸羧基功能化处理步骤。
优选地，所述步骤S3包括以下子步骤：
S3.1、采用新配置的EDC/NHS对经所述溴乙酸羧基功能化后的所述BSA修饰的微孔板进行活化；
S3.2、制备CML单克隆抗体溶液，并将所述CML单克隆抗体溶液加入所述步骤S3.1活化后的微孔板中，并轻弹混匀，在35～40℃摇床中反应；
S3.3、弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤；
S3.4、使用乙醇胺溶液封闭剩余的活性位点，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，制得特异性抗体包被的微孔板。
优选地，在步骤S2.2中，所述CML单克隆抗体溶液的浓度为2-20μg/mL。
优选地，所述步骤S4包括以下子步骤：
S4.1、将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组；分别使用不干胶封片封盖A组和B组的微孔板，并置于35～40℃振荡孵育30～60min；
S4.2、分别弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤；
S4.3分别加入化学发光液进行发光显色，采用多功能酶标仪进行数据采集并绘制标准曲线，计算A组和B组底物降解量之差，获取待检测样品中AGEs含量数据。
优选地，所述化学发光液包括第一底物发光液和第二底物发光液；所述第一底物发光液包括鲁米诺、对碘苯酚、Tris-缓冲溶液；所述第二底物发光液包括双氧水、Tris-缓冲溶液。
实施本发明的食品中AGEs含量的检测方法，具有以下有益效果：该食品中AGEs含量的检测方法既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且检测过程中不使用有害的试剂，试剂保持期长，具有较好的市场前景。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明食品中AGEs含量的检测方法的流程图；
图2是本发明食品中AGEs含量的检测方法的对比例1的柱状图；
图3是本发明食品中AGEs含量的检测方法的对比例2的柱状图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。
该食品中AGEs含量的检测方法涉及一种微孔板表面的改性方法，以及基于修饰的孔板上建立一种食品中AGEs含量的化学发光免疫检测方法。其可用于固体食品、液体食品中AGEs含量进行检测，其主要通过检测食品中AGES中的CML的含量进而得到AGES含量，该检测方法既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且检测过程中不使用有害的试剂，试剂保持期长，具有较好的市场前景。
如图1所示，该食品中AGEs含量的检测方法包括以下步骤：
S1、调节待测食品的pH值，并对所述待测食品进行粉碎、振荡、离心，取其上清液并配置为系列浓度的待检测样品，以及配置系列浓度的标准品并分别加入HRP进行标记得到HRP标记的标准品。
其中，所述待测食品为固体食品、液体食品。则该检测方法可以用于检测固体食品中AGEs的含量，也可用于检测液体食品中AGEs含量。进一步地，该S1步骤包括以下子步骤：
待测食品为固体食品，称取该待测的固体食品，将所述待测的固体食品剪碎并研磨至糊状或小颗粒状；具体地，首先称取待测的固体食品，然后剪碎，其次采用食品粉碎机对已剪碎的样品进行研磨至无明显块状，呈糊状或者小颗粒状态，以便于待测的固体食品更好地溶解和粉碎。
加入PBS缓冲溶液至研磨后的所述待测的固体食品中制得样品混合液；本发明所述的PBS缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，通过加入PBS缓冲溶液以调节该固体食品的pH值，从而使得不同固体食品的pH值相近，避免影响后续检测，另外，其可提高AGES中CML的溶解性。
对所述样品混合液进行超声波粉碎，获得均匀且呈乳状的样品溶液；具体地，采用超声波粉碎仪，并设置超声时间以及间隔时间，对该样品混合液进行超声波粉碎。
对所述样品溶液进行振荡、离心、静置取上清液并配置为系列浓度的待检测样品；具体地，采用吸管吸取该样品溶液，并置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液备用。
在本实施例中，该S1步骤还包括以下子步骤：
待测食品为液态食品，量取待测的液体食品，加入PBS缓冲溶液至所述待测的液体食品中并搅拌至混合均匀制得样品混合液；本发明所述的PBS缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，通过加入PBS缓冲溶液以调节该液体食品的pH值，从而使得不同液体食品的pH值相近，避免影响后续检测，另外，其可提高AGES中CML的溶解性。
对所述样品混合液进行超声波粉碎，获得均匀且呈乳状的样品溶液；具体地，采用超声波粉碎仪，并设置超声时间以及间隔时间，对该样品混合液进行超声波粉碎。
对所述样品溶液进行振荡、离心、静置取上清液并配置为系列浓度的待检测样品；具体地，采用吸管吸取该样品溶液，并置于离心管中，并置于涡旋振荡器中振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液备用。
具体地，S1步骤还包括以下步骤，首先配置系列浓度的标准品，并置于玻璃试管中，分别加入HRP进行混合标记，其中，标准品为CML标准品，HRP为辣根过氧化物酶，HRP标记CML的浓度优选为1ng/mL。
S2、采用BSA溶液对微孔板进行包被，制得BSA修饰的微孔板；进一步地，其包括以下子步骤：
S2.1、采用等离子处理方法对微孔板进行表面处理；其中，微孔板可以为商用的384孔板、96孔酶标板、可拆卸的酶标板等，具体地，其可以采用等离子表面处理机轰击微孔板以进行表面处理5-10分钟，以除去表面有机污染物，同时提高表面的结合能力。
S2.2、采用碳酸缓冲溶液溶解BSA，制得BSA溶液；其中，碳酸缓冲溶液的浓度优选为0.05mol/L，且其pH值优选为9.6；具体地，在0～37℃范围内使用浓度0.05mol/L、pH值为9.6为的碳酸缓冲溶液将BSA溶解，得到浓度为3-5mg/mL的BSA溶液。本发明所述的BSA为牛血清白蛋白。
S2.3、将所述BSA溶液加入所述步骤S2.1经表面处理后的微孔板中，在低温条件下轻摇过夜，弃去孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，再使用蒸馏水洗涤，制得BSA修饰的微孔板。具体地，将步骤S2.2制得的BSA溶液，以每孔250～300μL的量，加入到经表面处理后的微孔板的孔中，并置于0～4℃的低温条件下，轻摇过夜，其可以在该微孔板上贴膜，防止液体挥发，弃去孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗2次，再用蒸馏水清洗至少2次，得到稳定的BSA修饰的微孔板。其中磷酸缓冲溶液的浓度优选为0.01mol/L、其pH值优选为7.2，其中BSA溶液具有两方面的功能：(1)防止蛋白质非特异性吸附，降低背景噪音；(2)提供位点应用固定捕获探针。
在步骤S2和步骤S3之间还包括对BSA修饰的微孔板进行溴乙酸羧基功能化处理步骤；通过采用溴乙酸羧基功能化，为共价键包被抗体提供的大量的活性位点,可以实现共价固定抗体，其有别于物理吸附，能提高固定抗体的稳定性,从而提高微孔板的信噪比。具体地，其包括以下步骤：称取溴乙酸溶于氢氧化钠溶液中，并将所得溶液加入至进BSA修饰的微孔板的孔中，室温反应15小时，然后用蒸馏水清洗至少三遍。
S3、采用CML单克隆抗体对所述BSA修饰的微孔板进行包被，制得特异性抗体包被的微孔板。进一步地，其包括以下子步骤：
S3.1、采用新配置的EDC/NHS对经所述溴乙酸羧基功能化后的所述BSA修饰的微孔板进行活化；其中，EDC是指1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS是指N-羟基琥珀酰亚胺；具体地，首先，配置EDC/NHS溶液，并将其加入至经溴乙酸羧基功能化后的BSA修饰的微孔板的孔中，进行活化30min,以提高其活性位点的活性，以便于更好地固定抗体。
S3.2、制备CML单克隆抗体溶液，并将所述CML单克隆抗体溶液加入所述步骤S3.1活化后的微孔板中，并轻弹混匀，在35～40℃摇床中反应；具体地，将CML单克隆抗体溶于磷酸缓冲溶液，配置成浓度为2-20μg/mL的CML单克隆抗体溶液，并将所得CML单克隆抗体溶液加入至经活化后的微孔板中，每孔加入量优选为100μL，加入后，在微孔板上贴膜防止液体挥发，并轻弹混匀，混匀后将其置于在35～40℃摇床中反应2小时，其中，磷酸缓冲溶液的浓度优选为0.01mol/L，其pH值优选为7.2；摇床反应的反应温度优选为37℃。
S3.3、弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤；具体地，将微孔板中的溶液弃去后使用磷酸缓冲溶液清洗三次，其中，磷酸缓冲溶液的浓度优选为0.01mol/L，其pH值优选为7.2。
S3.4、使用乙醇胺溶液封闭剩余的活性位点，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，制得特异性抗体包被的微孔板；向步骤3.3制得的微孔板中加入乙醇胺溶液，使其封闭未被CML单克隆抗体包被的活性位点，弃去该微孔板孔中的溶液后，使用磷酸缓冲溶液清洗三次。其中，，磷酸缓冲溶液的浓度优选为0.01mol/L，其pH值优选为7.2。
S4、将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组，将将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，分别进行发光处理，分别计算A组和B组底物降解量之差，获取待检测样品中AGEs含量数据，进一步地，其包括以下子步骤：
S4.1、将系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组；分别使用不干胶封片封盖A组和B组的微孔板，并置于35～40℃振荡孵育30～60min；其中，标准品和待检测样品的加入量优选为每孔100ul，振荡孵育的温度优选为37℃。
S4.2、分别弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤；具体地，将微孔板中的溶液弃去后使用磷酸缓冲溶液清洗三次，其中，磷酸缓冲溶液的浓度优选为0.01mol/L，其pH值优选为7.2。
S4.3、分别加入化学发光液进行发光显色，采用多功能酶标仪进行数据采集并绘制标准曲线，计算A组和B组底物降解量之差，获取待检测样品中AGEs含量数据；将配置好的化学发光液加入至步骤S4.2孵育后的微孔板的板孔中，并使其混合均匀以进行发光显示，在1～10min内采用多功能酶标仪采集数据，根据所采集到的OD值(被检测物吸收掉的光密度)和标准品浓度，绘制标准曲线。其中，化学发光液，包括第一底物发光液和第二底物发光液，则其为第一底物发光液和第二底物发光液混合制得；该第一底物发光液包括鲁米诺、对碘苯酚、Tris-缓冲溶液；其由鲁米诺、对碘苯酚、Tris-缓冲溶液混合制得，该第二底物发光液包括双氧水、Tris-缓冲溶液，其由双氧水、Tris-缓冲溶液混合制得。其中，多功能酶标仪的波长优选为425nm。
本发明采用的检测方法为竞争法，该方法可用于小分子抗原的检测，其采用标准品和待检测样品中的同样小分子进行竞争，对比混合物(待检测样品和标准品)和单纯标准品的差异，来推算样品中的待测物含量，本发明通过检测AGEs中CML来测得AGEs的含量，而CML分为游离态和结合态，游离态的分子量相对较小，因此竞争法相对于双抗夹心法，检测灵敏度高，检测结果准确。该竞争法的检测原理为：首先将特异性CML单克隆抗体包被于BSA改性的微孔板，经洗涤后分成两组：一组加HRP标记的标准品和待检测样品中的CML混合，另一组只加入HRP标记的CML，经孵育洗涤后加化学发光液显色，根据这两组化学发光液中底物降解量之差，推算所要测定的样品中CML的量。
采用本发明的检测方法可对加工工艺不同的系列食品进行AGEs含量检测，该系列食品可以是经过油炸、煎炒、烘烤和蒸煮的固体食品，以及经过处理得到液体食品，比如液态牛奶、液态的调味品(酱油)、果汁；以下结合具体实施例来详细阐述使用本发明的食品中AGEs含量的检测方法对系列食品中的AGEs含量进行检测。
材料及设备：
试剂：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购于上海共价化学科技公司；牛血清蛋白(BSA)购于Biosharp；化学发光底物(SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate)购于Pierce ProteinBiology Products。购买CML标准品、HRP,购自加拿大TRC。
设备：EnSpire多功能酶标仪(美国PerkinElmer)；Avanti J-E型高效冷冻离心机(美国Beckman Coulter)；电子天平(德国Sartorius)；祸旋振荡器：美国ThermoScientific公司产品；食品粉碎机、超声波振荡器、超声波粉碎仪、氮气吹干仪、烘箱均为实验室常用设备
实施例1：谷类及其制品中AGEs含量检测，具体以小麦为例。
样品前处理：
(1)、称取10g小麦，并进行烘烤，烘烤后将其平均分为12份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的小麦进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.008ng/mL、0.0172ng/mL、0.0256ng/mL 0.0384ng/mL、0.0576ng/mL、0.0832ng/mL、0.192ng/mL、0.96ng/mL、1.56ng/mL、2..98ng/mL、3.85ng/mL、4.8ng/mL的系列待检测样品。
(2)、称取10g小麦，并进行煎炒，烘烤后将其平均分为11份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的小麦进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.009ng/mL、0.0175ng/mL、0.0286ng/mL 0.0394ng/mL、0.0566ng/mL、0.0872ng/mL、0.182ng/mL、1.2ng/mL、1.76ng/mL、3.28ng/mL、4.92ng/mL的系列待检测样品。
(3)称取10g小麦，并进行油炸，烘烤后将其平均分为11份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的小麦进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液,并配置浓度为0.0092ng/mL、0.0165ng/mL、0.0283ng/mL 0.0354ng/mL、0.0668ng/mL、0.0832ng/mL、0.189ng/mL、1.35ng/mL、1.56ng/mL、3.24ng/mL、4.82ng/mL的系列待检测样品。
(4)称取10g小麦，并进行蒸煮，烘烤后将其平均分为8份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的小麦进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液,并配置浓度为0.0102ng/mL、0.0196ng/mL、0.0293ng/mL 0.0364ng/mL、0.0882ng/mL、0.199ng/mL、1.55ng/mL、4.82ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置：称取10g的标准品，平均分为5份，将其研磨至小颗粒状，分别加入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为：0、0.008ng/mL、0.0384ng/mL、0.192ng/mL、0.96ng/mL、4.8ng/mL的系列浓度的标准品，并向其分别加入HRP进行标记，制得系列浓度的HRP标记的标准品。
BSA修饰微孔板：采用等离子处理机分别轰击每块微孔板并进行表面处理5-10分钟；在0～37℃范围内使用浓度0.05mol/L、pH值为9.6为的碳酸缓冲溶液将BSA溶解，得到浓度为3-5mg/mL的BSA溶液，将制得的BSA溶液，以每孔250～300μl的量，加入到经表面处理后的微孔板的孔中，并置于4℃的低温条件下，轻摇过夜，其可以在该微孔板上贴膜，防止液体挥发，弃去孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗2次，再用蒸馏水清洗至少2次。称取2.76g(2mol)溴乙酸溶于20mL(2mol/L)的氢氧化钠溶液中，并将所得溶液加入至进BSA修饰的微孔板的孔中，室温反应15小时，然后用蒸馏水清洗至少三遍。
特异性抗体包被的微孔板：采用新配置的EDC/NHS对经溴乙酸羧基功能化后的BSA修饰的微孔板进行活化30分钟，将CML单克隆抗体溶于浓度为0.01mol/L、pH值为7.2的磷酸缓冲溶液，配置成浓度为15μg/mL的CML单克隆抗体溶液，并将所得CML单克隆抗体溶液加入至经活化后的微孔板中，每孔加入量优选为100μl，加入后，在微孔板上贴膜防止液体挥发，并轻弹混匀，混匀后将其置于在37℃摇床中反应2小时。将微孔板中的溶液弃去后使用磷酸缓冲溶液清洗三次。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μl，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据分别绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。
实施例2：肉类及其制品中AGEs含量检测，具体以鸡肉为例。
样品前处理：
(1)、称取10g鸡肉，并进行烘烤，烘烤后将其平均分为8份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的鸡肉进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.018ng/mL、0.0192ng/mL、0.0356ng/mL、0.0572ng/mL、0.0872ng/mL、0.95ng/mL、2..68ng/mL、4.9ng/mL的系列待检测样品。
(2)、称取10g鸡肉，并进行煎炒，烘烤后将其平均分为6份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的鸡肉进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.0135ng/mL、0.0394ng/mL、0.0872ng/mL、1.86ng/mL、3.24ng/mL、4.72ng/mL的系列待检测样品。
(3)称取10g鸡肉，并进行油炸，烘烤后将其平均分为6份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的鸡肉进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液,并配置浓度为0.0134ng/mL、0.0357ng/mL、0.0852ng/mL、1.54ng/mL、3.34ng/mL、4.72ng/mL的系列待检测样品。
(4)称取10g鸡肉，并进行蒸煮，烘烤后将其平均分为8份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的鸡肉进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液,并配置浓度为0.0112ng/mL、0.0186ng/mL、0.0298ng/mL 0.0394ng/mL、0.0887ng/mL、0.189ng/mL、1.58ng/mL、4.92ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置及浓度参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μl，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。其中特异性抗体包被的微孔板的制备参照实施例1，在此不再赘述。
实施例3：水产品中AGEs含量检测，具体以皖鱼为例。
样品前处理：
(1)、称取10g皖鱼，并进行烘烤，烘烤后将其平均分为8份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的皖鱼进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.008ng/mL、0.0196ng/mL、0.0386ng/mL、0.0592ng/mL、0.0878ng/mL、0.97ng/mL、2.66ng/mL、4.67ng/mL的系列待检测样品。
(2)、称取10g皖鱼，并进行煎炒，烘烤后将其平均分为7份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的皖鱼进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.0139ng/mL、0.0396ng/mL、0.0882ng/mL、1.87ng/mL、2.56ng/mL、3.74ng/mL、4.72ng/mL的系列待检测样品。
(3)称取10g皖鱼，并进行油炸，烘烤后将其平均分为7份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的皖鱼进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液,并配置浓度为0.0154ng/mL、0.0377ng/mL、0.0952ng/mL、1.64ng/mL、2.54ng/mL、3.84ng/mL、4.82ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置及浓度参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μl，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。其中特异性抗体包被的微孔板的制备参照实施例1，在此不再赘述。
实施例4：豆类、坚果及其制品中AGEs含量检测，具体以花生为例。
样品前处理：
(1)、称取10g花生，并进行烘烤，烘烤后将其平均分为4份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的花生进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.0083ng/mL、0.96ng/mL、2.76ng/mL、4.87ng/mL的系列待检测样品。
(2)、称取10g花生，并进行煎炒，烘烤后将其平均分为6份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的花生进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.0132ng/mL、0.0376ng/mL、0.0892ng/mL、1.83ng/mL、3.34ng/mL、4.62ng/mL的系列待检测样品。
(3)称取10g花生，并进行油炸，烘烤后将其平均分为6份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的花生进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液,并配置浓度为0.0164ng/mL、0.0367ng/mL、0.0942ng/mL、1.54ng/mL、3.74ng/mL、4.92ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置及浓度参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μl，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。其中特异性抗体包被的微孔板的制备参照实施例1，在此不再赘述。
实施例5：蛋及蛋制品中AGEs含量检测，具体以鸡蛋为例。
样品前处理：
(1)、称取10g鸡蛋，并进行煎炒，煎炒后将其平均分为5份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的鸡蛋进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.0078ng/mL、0.94ng/mL、1.84ng/mL、2.86ng/mL、4.89ng/mL的系列待检测样品。
(2)、称取10g鸡蛋，并进行蒸煮，蒸煮后将其平均分为5份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的鸡蛋进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.0152ng/mL、0.0375ng/mL、0.0862ng/mL、1.84ng/mL、4.9ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置及浓度参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μl，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。其中特异性抗体包被的微孔板的制备参照实施例1，在此不再赘述。
实施例7：乳及乳制品中AGEs含量检测，具体以牛奶为例。
样品前处理：
(1)、称取10g液体牛奶，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.009ng/mL、0.0175ng/mL、0.0386ng/mL、0.0575ng/mL、0.0872ng/mL、0.95ng/mL、2.68ng/mL、3.24ng/mL、4.93ng/mL的系列待检测样品。
(2)、称取10g奶粉，将其平均分为12份，进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.0082ng/mL、0.0162ng/mL、0.0257ng/mL、0.0394ng/mL、0.0578ng/mL、0.0882ng/mL、0.198ng/mL、0.97ng/mL、1.66ng/mL、2..88ng/mL、3.88ng/mL、4.93ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置及浓度参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μl，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。其中特异性抗体包被的微孔板的制备参照实施例1，在此不再赘述。
实施例8：薯类及其制品中AGEs含量检测，具体以番薯为例。
样品前处理：
称取10g番薯，并进行油炸，油炸后将其平均分为15份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的小麦进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.0072ng/mL、0.0132ng/mL、0.0192ng/mL、0.0287ng/mL、0.0384ng/mL、0.0486ng/mL、0.0576ng/mL、0.0892ng/mL、0.188ng/mL、0.87ng/mL、1.67ng/mL、2..88ng/mL、3.68ng/mL、4.28ng/mL、4.93ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置及浓度参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μl，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。其中特异性抗体包被的微孔板的制备参照实施例1，在此不再赘述。
实施例9：糖果蜜饯中AGEs含量检测，具体以糖果为例。
样品前处理：
称取10g糖果，将其平均分为8份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的小麦进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.0082ng/mL、0.0286ng/mL、0.0792ng/mL、0.198ng/mL、0.89ng/mL、1.69ng/mL、3.88ng/mL、4.83ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置及浓度参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μl，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。其中特异性抗体包被的微孔板的制备参照实施例1，在此不再赘述。
实施例10：调味品中AGEs含量检测，具体以酱油为例。
样品前处理：
称取10g酱油，将其平均分为6份，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.009ng/mL、0.0286ng/mL、0.0796ng/mL、0.99ng/mL、1.89ng/mL、4.8ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置及浓度参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μL，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。其中特异性抗体包被的微孔板的制备参照实施例1，在此不再赘述。
实施例11：饮料中AGEs含量检测，具体以橙汁为例。
样品前处理：
称取10g橙汁，将其平均分为10份，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.0085ng/mL、0.0285ng/mL、0.0584ng/mL、0.0796ng/mL、0.194ng/mL、0.89ng/mL、1.69ng/mL、2.36ng/mL、3.98ng/mL、4.86ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置及浓度参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μL，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。其中特异性抗体包被的微孔板的制备参照实施例1，在此不再赘述。
实施例12：水果蔬菜中AGEs含量检测，具体以菠菜为例。
样品前处理：
称取10g菠菜，将其平均分为18份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的菠菜进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为0.008ng/mL、0.0183ng/mL、0.0285ng/mL、0.0375ng/mL、0.0485ng/mL、0.0586ng/mL、0.0687ng/mL、0.0796ng/mL、0.0986ng/mL、0.194ng/mL、0.285ng/mL、0.68ng/mL、0.76ng/mL、0.89ng/mL、1.69ng/mL、2.36ng/mL、3.98ng/mL、4.86ng/mL的系列待检测样品。
标准品的配置及浓度参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μL，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。将所采集到的数据绘制标准曲线，计算得到CML的含量，进而计算得到AGEs的含量。其中特异性抗体包被的微孔板的制备参照实施例1，在此不再赘述。
通过将采集的数据绘制成标准曲线得上述实施例中AGEs的含量如下表所示：
表1：样品中AGEs含量
对比例：
对比例1：:采用常规的未经BSA修饰的96孔酶标板和与本发明的经BSA修饰后的特异性抗体包被的微孔板分别检测系列浓度的CML标准品；
配置标准品：称取10g的标准品，平均分为5份，将其研磨至小颗粒状，分别加入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液，并配置浓度为：0、0.008ng/mL、0.0384ng/mL、0.192ng/mL、0.96ng/mL、4.8ng/mL的系列浓度的标准品。
经BSA修饰的特异性抗体包被的微孔板的制作参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将所述系列浓度标准品分别加入至所述特异性抗体包被的微孔板和未经BSA修饰的96孔酶标板中，每孔分别加入100μl，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。
检测结果如图2所示，检测结果显示，经过经BSA修饰的特异性抗体包被的微孔板的背景值显著低于未经BSA修饰的96孔酶标板，得益于BSA的较好封闭作用。此外，经过经BSA修饰的微孔板其检测下限达到0.008ng/mL,显著提到了孔板的信噪比。
对比例2：采用常规的未经BSA修饰的96孔酶标板和与本发明的经BSA修饰后的特异性抗体包被的微孔板分别检测稀释成不同倍数的油炸鸡肉。
样品前处理：称取10g鸡肉，并进行油炸，烘烤后将其平均分为5份，分别将其剪碎并使用食品粉碎机对已剪碎的鸡肉进行研磨至小颗粒状，分别放入玻璃试管中，并对试管进行编号，加入10mL浓度为0.01mol/l、pH值为7.2的PBS缓冲溶液，制得混合液，并将其置于超声波粉碎仪进行粉碎，设置超声时间为5s,间隔时间为1s。采用吸管分别吸取该样品溶液，并分别置于离心管中，置于涡旋振荡器振荡30min后置于离心机中，进行离心，于4000r/m离心10min后取上清液,并分别稀释为100倍、500倍、2500倍、12500倍和62500倍的待检测样品。
经BSA修饰的特异性抗体包被的微孔板的制作参照实施例1，在此不再赘述。
检测：将HRP分别加入对比例1制得的标准品中，配置成系列浓度HRP标记的标准品，将系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，每孔分别加入100μl，加样完毕后分别使用不干胶封片封盖所述微孔，并置于37℃，于超声波振荡器振荡孵育30min，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液清洗三次，每孔分别加入100μl的化学发光液混合均匀，以进行发光显色，5分钟后，将EnSpire多功能酶标仪的波长调为425nm，并将其用于采集数据。
检测结果如图3所示，检测结果显示过经BSA修饰的特异性抗体包被的微孔板在样品稀释500倍仍然具有有效检测信号。
分析与结论：本发明建立一种基于微孔板的化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)方法，通过采用BSA对微孔板进行表面改性，一方面降低蛋白质的非特性吸附，降低背景噪音；另一方面利用羧基化方面将BSA的氨基酸残疾功能化，为共价键包被抗体提供的大量的活性位点，从而提高了微孔板的信噪比；该发明方法既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，具有较好的市场前景。
可以理解的，以上实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以对上述技术特点进行自由组合，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，凡跟本发明权利要求范围所做的等同变换与修饰，均应属于本发明权利要求的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、调节待测食品的pH值，并对所述待测食品进行粉碎、振荡、离心，取其上清液并配置为系列浓度的待检测样品；以及配置系列浓度的标准品并分别加入HRP进行标记得到HRP标记的标准品；
S2、采用浓度为3-5mg/mL的BSA溶液对微孔板进行包被，制得BSA修饰的微孔板；
S3、对所述BSA修饰的微孔板进行溴乙酸羧基功能化处理，再采用CML单克隆抗体对所述BSA修饰的微孔板进行包被，制得特异性抗体包被的微孔板；
S4、将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组；分别进行发光处理，分别计算A组和B组底物降解量之差，获取待检测样品中AGEs含量数据；
所述步骤S2包括以下子步骤：
S2.1、采用等离子处理方法对微孔板进行表面处理；
S2.2、采用碳酸缓冲溶液溶解BSA，制得BSA溶液；
S2.3、将所述BSA溶液加入所述步骤S2.1经表面处理后的微孔板中，在低温条件下轻摇过夜，弃去孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，再使用蒸馏水洗涤，制得BSA修饰的微孔板。
2.根据权利要求1所述的食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，所述S1步骤包括以下步骤：
待测食品为固体食品，称取该待测的固体食品，将所述待测的固体食品剪碎并研磨至糊状或小颗粒状；
加入PBS缓冲溶液至研磨后的所述待测固体食品中制得样品混合液；
对所述样品混合液进行超声波粉碎，获得均匀且呈乳状的样品溶液；
对所述样品溶液进行振荡、离心、静置取上清液并配置为系列浓度的待检测样品。
3.根据权利要求1所述的食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，所述S1步骤包括以下步骤：
待测食品为液体食品，量取待测的液体食品，加入PBS缓冲溶液至所述待测的液体食品中并搅拌至混合均匀制得样品混合液；
对所述样品混合液进行超声波粉碎，获得均匀且呈乳状的样品溶液；
对所述样品溶液进行振荡、离心、静置取上清液并配置为系列浓度的待检测样品。
4.根据权利要求1所述的食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，在S2.3步骤中，所述低温条件为0～4℃。
5.根据权利要求1所述的食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，所述步骤S3包括以下子步骤：
S3.1、采用新配置的EDC/NHS对经所述溴乙酸羧基功能化后的所述BSA修饰的微孔板进行活化；
S3.2、制备CML单克隆抗体溶液，并将所述CML单克隆抗体溶液加入所述步骤S3.1活化后的微孔板中，并轻弹混匀，在35～40℃摇床中反应；
S3.3、弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤；
S3.4、使用乙醇胺溶液封闭剩余的活性位点，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，制得特异性抗体包被的微孔板。
6.根据权利要求5所述的食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，在所述步骤S3.2中，所述CML单克隆抗体溶液的浓度为2-20μg/mL。
7.根据权利要求1所述的食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，所述步骤S4包括以下子步骤：
S4.1、将所述系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组；分别使用不干胶封片封盖A组和B组的微孔板，并置于35～40℃振荡孵育30～60min；
S4.2、分别弃去微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤；
S4.3、分别加入化学发光液进行发光显色，采用多功能酶标仪进行数据采集并绘制标准曲线，计算A组和B组底物降解量之差，获取待检测样品中AGEs含量数据。
8.根据权利要求7所述的食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，所述化学发光液包括第一底物发光液和第二底物发光液；所述第一底物发光液包括鲁米诺、对碘苯酚、Tris-缓冲溶液；所述第二底物发光液包括双氧水、Tris-缓冲溶液。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1079825A (zh) * | 1991-12-20 | 1993-12-22 | 洛克菲勒大学 | 体内高级糖基化终产物的免疫化学检测 |
| CN1451096A (zh) * | 2000-04-14 | 2003-10-22 | 尼亚戴恩公司 | 蛋白质高级糖化终产物(蛋白质－age)形成的调节物的鉴定方法 |
| CN103372024A (zh) * | 2012-04-25 | 2013-10-30 | 上野制药株式会社 | 晚期糖化终产物生成抑制剂 |
| CN104634897A (zh) * | 2015-02-14 | 2015-05-20 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE270434T1 (de) * | 2000-12-21 | 2004-07-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren zum nachweis von fortgeschrittenen glyzierungsendprodukte in zerebrospinalflüssigkeit |
| WO2010005531A2 (en) * | 2008-06-30 | 2010-01-14 | The Johns Hopkins University | Methods for the detection of advanced glycation endproducts and markers for disease |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1079825A (zh) * | 1991-12-20 | 1993-12-22 | 洛克菲勒大学 | 体内高级糖基化终产物的免疫化学检测 |
| CN1451096A (zh) * | 2000-04-14 | 2003-10-22 | 尼亚戴恩公司 | 蛋白质高级糖化终产物(蛋白质－age)形成的调节物的鉴定方法 |
| CN103372024A (zh) * | 2012-04-25 | 2013-10-30 | 上野制药株式会社 | 晚期糖化终产物生成抑制剂 |
| CN104634897A (zh) * | 2015-02-14 | 2015-05-20 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Identification of the major site of apolipoprotein B modification by advanced glycosylation end products blocking uptake by the low density lipoprotein receptor：谷歌学术，advanced glycosylation end products;Richard Bucala 等;《The Journal of Biological Chemistry》;19951231;第270卷(第18期);10828-10832 * |
| 食品中高级糖基化终产物的研究进展;蔡成岗等;《食品研究与开发》;20131231;第34卷(第24期);280-282 * |
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