DE60129008T2

DE60129008T2 - Methode zur identifizierung von regulatoren der bildung von protein-age-derivaten

Info

Publication number: DE60129008T2
Application number: DE60129008T
Authority: DE
Inventors: Elaine L. Tucson JACOBSON; Myron K. Tucson JACOBSON; Georg Thomas Tucson WONDRAK
Original assignee: NIADYNE CORP; Niadyne Corp Tucson; University of Kentucky
Current assignee: NIADYNE CORP; Niadyne Corp Tucson; University of Kentucky
Priority date: 2000-04-14
Filing date: 2001-04-16
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2021-04-17
Also published as: AU2001253555B2; ES2286117T3; ATE365319T1; HK1059117A1; US20020037496A1; JP3920641B2; AU5355501A; CN1451096A; PT1272843E; DE60129008D1; CN1205480C; EP1272843A2; WO2001079842A3; WO2001079842A2; US6716635B2; DK1272843T3; MXPA02010194A; CY1106852T1; JP2003531376A; EP1272843B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Hemmstoffen der Bildung von fortgeschrittenen Glycosylierungs-Proteinendprodukten („proteinadvanced glycation product) (nachfolgend „Protein-AGE"). Diese Methodik ist bei der Bestimmung von Substanzen von Interesse nützlich, welche pathologische Zustände beeinflussen, die mit Protein-AGE-Bildung assoziiert sind, wie beispielsweise Diabetes, Atherosklerose, chronische neurodegenerative Erkrankungen, wie beispielsweise Alzheimer Erkrankung, Lichtalterung und andere degenerative Erkrankungen, welche für den Alterungsprozess charakteristisch sind.
Hintergrund und Stand der Technik
Wie hierin verwendet, ist Glycosylierung eine nicht-enzymatische, posttranslationale Modifizierung von Proteinen durch reduzierende Zucker und andere reaktive Carbonylspezies, welche die Proteinfunktion nachteilig beeinflussen. Gewebeverfall und Alterung wurden in breitem Umfang mit Schadensakkumulierung sowohl aus chemischen Prozessen, welche durch Glycosylierung induziert werden, als auch mit oxidativem Stress und UV-Bestrahlung in Zusammenhang gebracht. Akkumulierung von langlebigen Glycosylierungsproteinprodukten und AGE-Produkten, welche aus Glycosylierung abgeleitet sind, wurden mit einer Reihe von altersbedingten Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, umfassend diabetische Dauerkomplikationen (Thorpe, et al., Drugs Aging 9:69–77 (1996)), Atherosklerose (Ruderman, et al., FASEB J 6:2905–2914 (1993); Berichtigung FASEB J 7(1):237 (1993)), Alzheimer Erkrankung (Vitek, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4766–4770 (1994)), Photoalterung der Haut (Mizutani, et al., J. Invest. Dermatol 797–802 (1997) und der allgemeinen Pathologie des Alterungsprozesses (Frye, et al., J. Biol. Chem 273:18714–18719 (1998)). Diabetische Dauerkomplikationen aus pathologischer Blutzuckererhöhung verursachen letztlich ernsthafte und lebensbedrohende Pathologien, wie beispielsweise terminale Niereninsuffizienz (Baynes, et al., Diabetes 40:405–412 (1991)). Irreversible mikrovaskuläre und makrovaskuläre Komplikationen umfassend Retinopathie, Neuropathie, Nephropathie, Atherosklerose und zerebrovaskuläre Verschlusskrankheit wurden alle mechanistisch mit der Bildung von Protein-AGE in Bindegewebe verknüpft, insbesondere auf Collagen und Matrix-Protein-Komponenten. Darüber hinaus scheinen ähnliche Ereignisse, welche mit einer langsameren Geschwindigkeit auftreten, für den normalen Alterungsprozess von gleicher Relevanz zu sein (Thorpe, et al., voraus stehend)
Glycosylierung und nachfolgende Protein-AGE-Bildung spielt bei zellulärem Carbonylstress und Glycosetoxizität eine zentrale Rolle. Die Verabreichung des Glycosylierungshemmstoffs Aminoguanidin unterdrückt effizient sekundäre Komplikationen in Nagetieren mit experimenteller Diabetes (Edelstein, et al., Diabetologica 35:96–97 (1992)); allerdings handelt es sich bei Aminoguanidin um ein Hydrazinderivat, welche infolge von Langzeitverabreichung systemische Toxizität zeigt, da es ein wirkungsvoller Hemmstoff von Katalase (Ou, et al., Biochem Pharmacol 46:1139–1144 (1993)) und induzierbarer Stickoxidsynthase (Okuda, et al., J. Neuroimmunol 81:201–210 (1998)) ist. Das Toxizitätsprofil von Aminoguanidin macht es unwahrscheinlich, dass es klinisch verwendet wird. Deshalb besteht ein dringendes klinisches Bedürfnis hinsichtlich der Identifizierung und Charakterisierung von neuen Verbindungen, welche Glycosylierung und die damit verbundenen pathologischen Folgen effektiv hemmen. Screening-Assays mit hohem Durchsatz, welche im Hinblick auf große kombinatorische Verbindungsbibliotheken eingesetzt werden können, würden wahrscheinlich zur Identifizierung von neuen Glycosylierungshemmstoffen führen.
Reaktive Sauerstoffspezies („ROS") und reaktive Carbonylspezies („RCS"), insbesondere Dicarbonylverbindungen, sind Schlüsselmediatoren für zellulären Schaden, welcher durch oxidativen Stress, Glycosylierung und UV-Strahlung verursacht wird. Der Ursprung von zellulärem Carbonylstress ist ein Ergebnis von Glycosylierung, Lipidperoxidation, Zuckerautooxidation und der Metabolismus kann beispielsweise 1 entnommen werden. Sauerstoffabhängige und -unabhängige Reaktionswege führen zur Bildung von verschiedenen reaktiven Carbonylspezies, umfassend 2-Dicarbonyle, wie Methylglyoxal und Glyoxal, als Schlüsselzwischenstufen zur Akkumulierung von Proteinschaden durch AGE-Bildung. Darüber hinaus findet Carbonylstress seinen Ursprung in der metabolischen Erzeugung von Methylglyoxal. In Kürze, frühe Glycosylierungsprodukte werden aus der Reaktion eines reduzierenden Zuckers mit Proteinaminogruppen (Lysin und Arginin) abgeleitet, um Aldimine (Schiffsche Basen Addukte) zu erzeugen, welche die Amadori-Umlagerung zur Bildung von Ketoaminaddukten (Hodge, et al., J. Am. Chem, Soc. 75:316–322 (1953)) durchlaufen können. Protein-AGE werden aus frühen Glycosylierungsprodukten sowohl durch oxidative als auch nicht-oxidative Reaktionswege erzeugt, in welchen eine Vielfalt an reaktiven Dicarbonylverbindungen, wie beispielsweise Glyoxal, Methylglyoxal und 3-Deoxyosone, als Zwischenstufen vorgeschlagen werden (Thornalley, et al., Biochem J. 344:109–166 (1999)). Es wurde gezeigt, dass ADP-Ribose in vitro ein wirksames Histon-Glycosylierungs- und Glycoxidierungsmittel ist (Cervantes-Laurzean, et al., J. Biol. Chem. 27:10461–10469 (1996)).
Protein-AGE umfasst Protein N^ε-(carboxymethyl)lysinreste (CML) (Ahmed, et al., J. Biol. Chem 261:4889–4894 (1986)) und eine heterogene Gruppe von Komplexmodifikationen, beispielsweise Pentosidin (Sell, et al., J. Biol. Chem. 264:21597–21602 (1989)), welche durch ihre starke Fluoreszenz und ihre Fähigkeit, Protein-Protein-Querverknüpfungen zu verursachen, gekennzeichnet sind. Eine Häufung von AGE-spezifischer Fluoreszenz (ex. 370 nm; em. 440 nm) ist ein allgemeines Maß für Gesamtproteinschaden und stellt ein weit verbreitetes Mittel der Glycosylierungsforschung in vitro und in vivo dar. In einigen Fällen können sich reaktive Dicarbonylverbindungen durch Autooxidation das Zuckers selbst bilden, ohne dass Glycosylierung erforderlich ist; das Vorliegen von Übergangsmetallionen (Fe, Cu) in Spurenmengen wurde mit der Bildung von Dicarbonylverbindungen und reaktiven Sauerstoffspezies, wie beispielsweise Wasserstoffperoxid, in Zusammenhang gebracht (Elgawish, et al., J. Biol. Chem 271:12964–12971 (1996)). Andere Aminosäuren als Lysin und Arginin werden ebenfalls durch Glycoxidierung modifiziert. Beispielsweise sind oberflächenausgesetzte Methioninreste in Proteinen hinsichtlich einer Proteinoxidation sehr sensitiv (Hall, et al., Biochem. Biophys. Acta 1121:325–330 (1992)).
Aufgrund ihrer Menge wird von Glucose angenommen, dass sie für Glycosylierung und Protein-AGE-Bildung in extrazellulären Proteinen in vivo eine Hauptquelle ist; jedoch stellt Glucose nur ein schwaches Glycosylierungsmittel dar und die chemische Reaktion mit Proteinen unter physiologischen Bedingungen vollzieht sich nur über Monate und Jahre hinweg (Higgins, et al., J. Biol. Chem 256:5204–5208 (1981)). Im Gegensatz zu Glucose wurden die reaktiveren Pentosen als Zuckerquellen mit der Glycoxidation von intrazellulären Proteinen in Verbindung gebracht, da sie sehr viel effizientere Vorstufen für die Bildung von fluoreszierendem AGE darstellen, wie beispielsweise Pentosidin (Sell, et al., voraus stehend). Eine reichlich verkommende zelluläre Pentose ist ADP-Ribose, welche aus NAD über mehrere Metabolismuswege erzeugt wird (Cervantes-Laurean, et al., Biochemistry 32:1528–1534 (1993); Jacobson, et al., Mol. Cell Biochem. 138:207–212 (1994)). Frühere Studien konzentrierten sich auf einen Reaktionsweg, welcher die intranukleäre Erzeugung von ADP-Ribose (ADPR) umfasst. Die Forschung hat gezeigt, dass der Zellkern für die Glycosylierung in vivo durch ADP-Ribose einen wahrscheinlichen Ort darstellt. Oxidativer Stress und andere Bedingungen, welche DNA-Brüche verursachen, stimulieren die Synthese von ADP-Ribose-Kernpolymeren, welche schnell umgewandelt werden, wobei ADP-Ribose in enger räumlicher Nähe zu langlebigen Histonen erzeugt wird, welche reich an Lysin- und Argininresten sind (Cervantes-Laurean, et al., voraus stehend).
Zusätzlich zu den Punkten, auf welche oben Bezug genommen wurde, sind Gewebeverfall und Alterung weitgehend mit einer Schadenshäufung aus chemischen Prozessen in Verbindung gebracht worden, welche induziert werden durch oxidativen Stress, Glycosylierung und UV-Bestrahlung. Halliwell et al., Free Radicals in Biology and Medicine (Clarendon Press, Oxford, 1989). Berlett, et al., J. Biol. Chem 272:20313–20316 (1997). Sie alle sind wirksame Induktoren reaktiver Sauerstoffspezies („ROS") und reaktiver Carbonylspezies („RCS") (Anderson et al., J. Chem. Invest. 104:103–113 (1999)), wobei es sich um Schlüsselzwischenstufen von akkumulativem Proteinschaden während allgemeiner Alterung und einigen pathologischen Zuständen handelt, z.B. chronischen Entzündungskrankheiten (Dimon-Gadal, et al., J. Invest. Dermatol 114:984–989 (2000)); Psoriasis und Diabetes. (Brownlee, et al., Ann. Rev. Med 46:223–234 (1995); Brinkmann, et al., J. Biol Chem 273:18714–18719 (1998)). RCS als reaktive Zwischenstufen von zellulärem Carbonylstress stammen aus einer Vielzahl von mechanistisch miteinander verwandten Reaktionswegen, wie Glycosylierung (Thornalley, et al., Biochem J 344:109–116 (1999), Zuckerautoxidation (Wolffi, et al., Prog. Clin. Biol. Res 304:259–75 (1989), Lipidperoxidation (Fu, et al., J. Biol Chem 271:9982–64996) und UV-Photoschaden (Mizutani, et al., J. Invest. Dermatol 108:797–802 (1997)). Glycosylierung, eine spontane Amino-Carbonylreaktion zwischen reduzierenden Zuckern und langlebigen Proteinen ist eine Hauptquelle für RCS-Produktion, wobei dies zu zellulärem Carbonylstress führt. Reaktive α-Dicarbonylzwischenstufen, wie beispielsweise Glyoxal, Methylglyoxal und 3-Deoxyosone, werden sowohl durch oxidative (glycoxidative) und nicht-oxidative Reaktionswege der Glycosylierung erzeugt. Die komplexe Reaktionssequenz wird durch die reversible Bildung einer Schiffschen Base initiiert, welche eine Amadori-Umlagerung zur Bildung eines relativ stabilen Ketoaminprodukts während der frühen Glycosylierung eingeht. Eine Serie weiterer Reaktionen, umfassend Zuckerfragmentierung und Bildung von α-Dicarbonylverbindungen als reaktive Schlüsselzwischenstufen ergeben stabile Protein-gebundene fortgeschrittene Glycosylierungsendprodukte (AGEs) (Thornalley, et al., voraus stehend; Glomb, et al., J. Biol. Chem 270:10017–10026 (1995); Wondrak, et al., Free Radical Biol. Med, 29:557–567 (2000). Lander et al., J. Biol Chem 272:17810–14 (1997)). Interessanterweise können RCS und AGEs ihre schädlichen zellulären Effekte durch Erhöhung der ROS-Produktion ausüben, wobei es zu einem teuflischen Kreislauf von ROS- und RCS-Produktion kommt. AGE-Bildung wird begleitet durch eine Häufung AGE-spezifischer Fluoreszenz (λex-370 nm, λem-440 nm) und Proteinquerverknüpfung, wobei es sich um Maßstäbe für den Gesamtproteinschaden im Gewebe handelt. Brownlee et al., voraus stehend. Die Arginin-abgeleiteten Imidazolium-AGE-Produkte (Westwood, et al., J. Protein Chem 14:359–72 (1995); das Glyoxal-Lysindimer (GOLD) und das Methylglyoxal-Lysindimer (MOLD) (Brinkmann, et al., J. Biol. Chem. 273:18714–18719 (1998)) wurden in gealterter humaner Augenlinse und Hautcollagen identifiziert, wodurch α-Dicarbonylstress bei Gewebealterung impliziert wird. Darüber hinaus wird RCS wie Glyoxal, der direkte Vorläufer des AGE N^ε-Carboxymethyl-L-Lysin (CML), durch Schaden mittels freier Radikale an mehrfach ungesättigten Fettsäuren in zellulären Membranen erzeugt. Fu, et al., voraus stehend. UV-Strahlung stellt eine andere Quelle für Gewebecarbonylstress dar, wie es durch die Anhäufung von CML in gegenüber der Sonne ausgesetzten Läsionen actinischer Elastose belegt wird. Mizutani, et al., voraus stehend. Deshalb können AGE-Produkte, wie CML und GOLD als Biomarker für Gewebecarbonylstress angesehen werden.
Methylglyoxal ist eine wichtige Glycosylierungszwischenstufe (Thornalley, et al., voraus stehend), welche auch als ein biologischer Metabolit durch nicht-enzymatischen und enzymatischen Abbau von glycolytischen Triosephosphatzwischenstufen und aus dem Threoninkatabolismus erzeugt wird (Thornalley, et al., Gen. Pharmac 27:565–573 (1996)). Erhöhte Methylglyoxalmengen werden im Blut von Diabetes-Patienten gefunden (Beisswenger, et al., Diabetes 48:198–202 (1999)) und in den Linsen von Streptozotocin-induzierten diabetischen Ratten. Eine neuere Studie hinsichtlich der Bildung von AGEs in endothelialen Zellen, welche unter hyperglykämischen Bedingungen kultiviert wurden, zeigte, dass Methylglyoxal die Hauptvorstufe von AGEs darstellte (Shinohara, et al., J. Clin. Invest. 101:1142–7 (1998)). Es wurden verschiedene Methylglyoxal-abgeleitete AGEs in menschlichen Geweben identifiziert, wie beispielsweise fluoreszierende 5-Methylimidazolon-Derivate in atherosklerotischen Läsionen der Aorta (Uchida, et al., FEBS Lett 410:313–318 (1997)) oder MOLD und N^ε-carboxymethyl-L-Lysin in gealtertem Hautcollagen (Brinkmann, et al., voraus stehend). Kürzlich wurde den cytotoxischen Effekten der Glycosylierungszwischenstufen Methylglyoxal und 3-Deoxyglucoson auf neuronale Zellen, wie beispielsweise PC12-Zellen (Suzuki, et al., J. Biochem (Tokio) 123:353–7 (1998)) und kultivierte Cortexneuronen (Kikuchi, et al., J. Neurosci Res 57:280–289 (1999) eine beachtenswerte Aufmerksamkeit zuteil, da ihre Mitwirkung an der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen, wie beispielsweise Alzheimer Erkrankung (Vitek, et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 91:4766–70 (1994)) und amyotrophische Lateralsklerose (Shinpo, et al., Brain Res. 861:151-9 (2000)), vermutet wurde.
Als ein anderes Ergebnis von oxidativem Stress und von Carbonylstress wurde Proteinschaden durch Carbonylierung mit Alterung und einer Anzahl von Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, wie zum Beispiel vorzeitige Alterungserkrankungen, Progerie und Werner's Syndrom (Berlett, et al., J. Biol Chem 272:20313–20316 (1997)). Die Menge an Carbonylgruppen in menschlichen Hautfibroblastenproteinen korreliert stark mit den Alter des Donors (Oliver, et al., J. Biol Chem 262:5488–5491 (1987)). Kürzlich wurde ein erhöhtes Maß an Histon H1-Carbonylierung in vivo als Indikator für nukleären oxidativen und glycoxidativen Stress beschrieben (Wondrak, et al Biochem J 351:769–777 (2000)).
Im Gegensatz zu ihrem therapeutischen Potenzial wurde nur eine sehr kleine Menge an biologischen Hemmstoffen für zellulären Carbonylstress bis heute identifiziert, wie beispielsweise der nukleophile Carbonylfänger Glutathion. Jedoch stehen einige der Hemmstoffe für Glycosylierung mit der Reaktion durch Abfangen von Zwischenstufen α-Dicarbonylen in Wechselwirkung, wohingegen andere hemmende Substanzen nur als Antioxidationsmittel und Übergangsmetallchelatoren wirken, wodurch eine fortgeschrittene Glycoxidation, jedoch keine Glycosylierung gehemmt wird (Elgwash, et al., J. Biochem. 271:12964–71 (1996)). Systemische Verabreichung des Hydrazinderivats und Carbonylreagenz Aminoguanidin, ein Mitglied der ersten Klasse von Glycosylierungshemmstoffen, unterdrückt effektiv sekundäre Komplikationen in diabetischen Ratten mit experimenteller Diabetes und hemmt Hautcollagenquerverknüpfung (Edelstein, et al., Diabetes 41:26–9 (1992); Fu, et al., Diabetes 43:676–683 (1994)). Kürzlich wurde für ein nukleophiles Bidentat, Phenylacylthiazoliumbromid, gezeigt, dass es E. coli gegenüber Methylglyoxaltoxizität schützt (Ferguson, et al., Chem. Res. Tox 12:617–622 (1999)). Andere nukleophile Verbindungen, welche als Carbonylfallen wirken, wie beispielsweise Tenilsetam (Schoda, et al., Endocrinol 138:1886–92 (1997)), Pyridoxamin (Onorato, et al., J. Biol. Chem 275:21177–21184 (2000)) und Metformin (Ruggiero-Lopez, et al., Biochem) werden hinsichtlich der Vorbeugung von sekundären diabetischen Komplikationen bewertet.
Ein in vitro-Screening hinsichtlich möglicher α-Dicarbonylfänger ist aufgrund der Art der meisten gegenwärtig verwendeten glycoxidativen Reaktionssysteme kompliziert, welche die Unterdrückung von sauerstoffabhängiger AGE-Bildung messen, wie sie durch AGE-Fluoreszenz oder immunologische Quantifizierung von spezifischen AGEs, wie beispielsweise CML, bewertet wird (Elgawish, et al., voraus stehend; Shoda, et al., oben, Ruggiero-Lopez, et al., voraus stehend). Entsprechend wird in diesen Glycoxidationssystemen AGE-Bildung effektiv gehemmt durch Verbindungen mit antioxidativer und metallchelatisierender Aktivität. Kürzlich wurde eine sauerstoffunabhängige fortgeschrittene Glycosylierung durch Pentosen mit Bildung von AGE-Fluoreszenz und Proteinquerverknüpfung gezeigt und mechanistisch mit der nicht-oxidativen Bildung von Deoxypentosonen als reaktiven α-Dicarbonylzwischenstufen verknüpft (Litchfield, et al., Int. J. Biochem Cell Biol 31:1297–1305 (1999)).
Die vorausgehenden Ausführungen zeigen, dass ein dringendes Bedürfnis zur Identifizierung und Charakterisierung von Verbindungen besteht, welche Glycosylierung und die damit assoziierten pathologischen Folgen effektiv hemmen. Ein derartiger Assay wäre beispielsweise bei der Analyse von großen kombinatorischen Bibliotheken zur Identifizierung von relevanten Verbindungen nützlich. Ein derartiger Assay wurde in der Provisional-Anmeldung, auf welche voraus stehend Bezug genommen wird und welche hierin auch beschrieben ist, beschrieben. Siehe auch Wondrak, et al., Biochem J. 351:769–777 (2000). Die dort beschriebene Arbeit wurde weiterverfolgt, um einen Hochdurchsatz-Screeningassay zu Identifizierung von Glycosylierungshemmstoffen zu entwickeln, welche als Carbonylfänger wirken. Vor diesen Entwicklungen sind mehrere Assayverfahren zur Identifizierung von Glycosylierungshemmstoffen für wissenschaftliche Zwecke entwickelt worden (Khalifah, et al., Biochem Biophys Res Commun 257:251–258 (1999); Rahbar, et al., Clin. Chem. Acta 287:123–130 (1999); Ruggiero-Lopez, et al., Biochem. Pharmacol 58:1765–1773 (1999)). Parameter, welche gemessen werden, sind üblicherweise AGE-spezifische Fluoreszenz, Proteinquerverknüpfung und immunologische Bestimmung von Protein-AGE. Die meisten Glycosylierungsassays verwenden Glucose oder eine Pentose als Glycosylierungsmittel, welche zu einer langsamen Reaktion führen, die zur Entwicklung mehrerer Wochen bedarf. Diese Assays verwenden typischerweise nicht-physiologische Zuckerkonzentrationen oder Phosphatpuffer, um die Geschwindigkeit der Reaktionen zu erhöhen. Die Sensitivität, wie sie durch das Maß an Detektion von AGE-Bildung gemessen wird, ist niedrig und die Genauigkeit der Assays ist auch durch die niedrigen Signal zu Hintergrundverhältnissen beschränkt. Die sensitivsten Assays basieren auf immunologischer Bewertung von AGE-Bildung durch ELISA. In diesen Assays verwendete Antikörper gegen AGE sind entweder sehr teuer oder nicht kommerziell erhältlich. Deshalb ist es extrem wünschenswert, einen kostengünstigen, schnellen, leicht auszuführenden Assay zur Identifizierung von Hemmstoffen für Proteinglycosylierung, wie beispielsweise Hemmstoffe für nicht-oxidative Proteinglycosylierung, zur Verfügung zu haben. Es ist auch wünschenswert, Assays zur Verfügung zu haben, welche mechanistisch keine Antioxidationsmittel, aber Materialien, wie beispielsweise Carbonylfänger, identifizieren. Derartige Assays sind durch die Erfinder entwickelt worden und können der nachfolgenden Beschreibung entnommen werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt eine Übersicht zur Proteinglycosylierung zur Verfügung.
2 zeigt den Reaktionsweg, auf welchem ADPR erzeugt wird.
3 stellt die Chemie von Glycosylierungsreaktionen mittels ADP-Ribose dar.
4 fegt Daten dar, welche zeigen, dass die Reaktion zwischen ADP-Ribose und Histon H1 bei Bedingungen, welche physiologischen Bedingungen ähneln, schnell abläuft.
5 vergleicht Glucose, Ribose, ADP-Glucose und ADP-Ribose im erfindungsgemäßen Verfahren.
6 vergleicht Rinderserumalbumin und Histon H1 als Ziele von Glycosylierung.
7 zeigt, dass Aminoguanidin die Glycosylierung von Histon H1 durch ADP-Ribose unterdrückt.
8 misst die Bildung von Proteinquerverknüpfung in der Histon H1/ADP-Ribosereaktion.
9 zeigt Ergebnisse aus Experimenten, welche Proteincarbonylierung messen.
10 führt einen Entwurf für ein primäres und sekundäres Screening von Hemmstoffen aus.
11 stellt Daten aus Experimenten dar, welche mögliche Hemmstoffe identifizierten.
12 stellt Daten für zwei negative Verbindungen dar, d.h. Verbindungen, welche keine Hemmstoffe für Glycosylierung waren.
13 schildert Ergebnisse aus einem Assay, welcher zur Identifizierung von falsch Positiven entwickelt wurde.
14 zeigt Ergebnisse aus einem bestätigenden Querverknüpfungstest zur Bestimmung von Glycosylierung und somit von Proteinschaden.
15 zeigt die Ergebnisse aus Experimenten, welche die Fähigkeit von verschiedenen Verbindungen zur Hemmung von Glycosylierung zeigten, welche durch Querverknüpfung von Histon H1 induziert wurde.
16 zeigt die Strukturen von verschiedenen Reaktanten, welche durch eine 1H-NMR-Spektralanalyse identifiziert wurden.
17 und 18 schildern Ergebnisse von Experimenten, welche zur Bestimmung der Schutzwirkung von D-Penicillamin auf Zellen entwickelt wurden.
19A–D zeigen Untersuchungen zur Wirkung von verschiedenen Zuckern (A und B) und Hemmstoffen (C und D).
Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Es wurde herausgefunden, dass ADP-Ribose und Histon H1 eine schnelle und wirksame Glycosylierungsreaktion eingehen und diese Reaktion ist ein Schlüsselmerkmal der hierin beschriebenen Erfindung. Die Chemie der Glycosylierungsreaktionen durch ADP-Ribose ist einzigartig. Diese wurden ausführlich erklärt, wie in 3 gezeigt. Darüber hinaus findet die Reaktion schnell genug unter Bedingungen statt, welche physiologische Bedingungen simulieren (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, wie in 4 gezeigt), um eine Berücksichtigung des Assays als nützlich zum Screening für Verbindungen von Interesse zu rechtfertigen, wie nachfolgend beschrieben. Ketoamine und andere ähnliche AGE-Produkte werden sowohl durch ADP-Ribose als auch Glucose gebildet; jedoch ist die Geschwindigkeit der Produktbildung durch ADP-Ribose wenigstens tausendfach schneller als die Bildung durch Glucose (Cervantes-Laurean, et al., J. Biol. Chem. 271:10461–10469 (1996)). Die Reaktionen, umfassend ADP-Ribose, sind sehr schnell; jedoch sind, und dies ist der Schlüssel der Erfindung, die Reaktionswege, welche ADP-Ribose und Histon H1 umfassen, ähnlich, aber sehr viel schneller als die, welche durch andere Zucker initiiert werden, wodurch nahe gelegt wird, dass Hemmstoffe für die schnelle Reaktion zwischen ADP-Ribose und Histon H1 Glycosylierungsreaktionen im Allgemeinen hemmen sollten. Beispielsweise überstieg in einem Satz an Experimenten, welcher die Reaktion von Glucose, Ribose, ADP-Glucose und ADP-Ribose mit Histon H1 verglich, die Menge an fluoreszierendem AGE, welches von der ADP-Ribose erzeugt wurde, alle anderen bei Weitem. Siehe 5, welche derartige Assays bei unter oben dargelegten Bedingungen zeigt. In ähnlicher Weise ist Histon H1 ein hervorragendes Glycosylierungsziel. 6 zeigt die Ergebnisse von Experimenten, in welchen Histon H1 mit Rinderserumalbumin als Glycosylierungsziel verglichen wurde. Die Wirksamkeit von ADP-Ribose als Glycosylierungsmittel ist bekannt. Das basische, lysin- und argininreiche Histon H1 ist ein hervorragendes Substrat. Daher wurde beobachtet, dass unter leicht alkalischen Bedingungen (d.h. bei pH 9,0) die in vitro-Reaktion zwischen ADP-Ribose und Histon H1 innerhalb von Minuten stattfindet, wobei AGE-Fluoreszenz (Jacobson, et al., „ADP-Ribose In Glycation and Glycoxidation Reactions", in Koch-Nolte, Hrsg., ADP-Ribosylation In Animal Tissues, Plenum Press, 1997. Seiten 371–379) und Proteinquerverknüpfung erzeugt wird.
Um in einem Screening nach Verbindungen, welche Glycosylierung entweder hemmen und/oder erhöhen, effektiv zu sein, sollte ein Assay mit einem Mittel mit bekanntem Effekt auf den zur Diskussion stehenden Prozess getestet werden. 7 präsentiert Daten, welche zeigen, dass, wenn der bekannte Glycosylierungshemmstoff Aminoguanidin verwendet wurde, bei den oben beschriebenen physiologischen Niveaus seine hemmende Wirkung wiederum sehr schnell detektiert wurde. Deshalb kann der hierin beschriebene Assay wie beansprucht verwendet werden.
Zusätzliche, hierin präesentierte Daten zeigen, dass Standardverfahren zum Messen von Proteinglycosylierung zeigten, dass gemessene Fluoreszenz vom AGE-Typ in der Tat ein Maß für Proteinschaden darstellt. Sowohl Proteinquerverknüpfung als auch Proteincarbonylierung stellen gut etablierte Indizien für Proteinglycosylierung dar. Siehe Schacter, et al., Free Radic Biol Med. 17:429–437 (1994). In Kürze, den nachstehend beschriebenen Assays folgend, wurde die Bildung von Proteinquerverknüpfung auf 12 % SDS-PAGE gemessen, wobei sich Coomassie- und Silberfärbung anschloss. Die Ergebnisse sind in 8 dargelegt. Querverknüpfung war mit einem hohen Maß an Sensitivität detektierbar, wenn die Reaktion zwischen ADP-Ribose und Histon H1 bei pH 9,0 ausgeführt wurde. In 8 zeigt Spur 1 die Zeit („t" danach) = 0, während die Spuren 2 und 3 t = 2 bzw. 24 Stunden zeigen. In 8 stehen die Abkürzungen „M", „D" und „0" für „Monomer", „Dimer" bzw. „Oligomer". Silberfärbung ist die bevorzugte Art und Weise zur Bestimmung der Querverknüpfung. Proteincarbonylierung wurde mittels Western Blotting bestimmt. Insbesondere AGE-BSA, welches durch Inkubieren von BSA mit 1,66 M Glucose bei pH 7,4 für 90 Tage bei 37 °C hergestellt wurde, wurde nach Derivatisierung mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin („DNP") erkannt, wenn es mit Antikörpern, welche für proteingebundene DNP-Epitope spezifisch waren, untersucht wurde. Dies kann Spur 2 entnommen werden, während Spur 1 unbehandeltes BSA zeigt, welches als Kontrolle diente. In 9 zeigt Panel A eine Commasie-Färbung, während Panel B eine Carbonylimmunofärbung zeigt.
In den im Folgenden beschriebenen Beispielen wird der Fachmann erkennen, dass verschiedene Ausführungsformen und Merkmale der Erfindung vorgestellt werden.
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt einen Satz von Experimenten, welche zweifach ausgeführt wurden; es ist jedoch selbstverständlich, dass dies weder erforderlich noch notwendig ist, um die Zahl der Proben, welche in einer 96-Well Mikrotiterplatte untersucht wurden (48) zu untersuchen. Dieses und alle anderen Beispiele sind in 10 zusammengefasst.
Es wurde eine 96-Well Mikrotiterplatte verwendet, um 48 Reaktionen zweifach durchzuführen. Das erste Paar Wells enthielt die Reaktanten ADP-Ribose und Histon H1 ohne mögliche Hemmstoffe. Ein zweites Paar Wells enthält die Reaktanten und den bekannten Glycosylierungshemmstoff Aminoguanidin und wirkt als Positivkontrolle. Histon H1 ist handelsüblich erhältlich und kann unter Befolgung der Arbeitsverfahren, welche in Johns, et al., Biochem J. 92:55–59 (1964) dargelegt sind, hergestellt werden.
Es wurden Testverbindungen in die Wells zugegeben in einer Menge von 5 mM oder bis zur Löslichkeitsgrenze falls diese unter 5 mM liegt. Das Reaktionssystem ist 50 mM Kaliumphosphatpuffer, bei pH 7,4, zu welchem 1,5 mg/ml Histon H1 und 1,0 mM ADP-Ribose zugegeben wurden. Das Reaktionsvolumen betrug 300 μl. Es wurde die AGE-Fluoreszenz über die Zeit gemessen, bei Inkubation bei 37 °C bei 355 nm (ex) und 405 nm (em). Nach Vergleich mit der Kontrolle wurde eine Testverbindung als möglicherweise positiv erachtet, wenn die AGE-Fluoreszenz unterdrückt wurde.
11 präsentiert Ergebnisse aus einem Assay, welcher einen möglichen Hemmstoff identifizierte, d.h. Cystein und Cysteinmethylester. Wenn eine Testverbindung die Fluoreszenz) nicht unterdrückte, wurde es sie als richtig-negativ eingestuft und nicht weiterverfolgt. Sowohl für beta-Alanin als auch für Arginin wurde herausgefunden, dass es sich richtig-Negative handelt, wie in 12 gezeigt.
Falsch-Negative können auf einfache Weise durch Messen der Fluoreszenz an Tag 0 zur Bestimmung von Autofluoreszenz bestimmt werden. Alle derartigen Verbindungen werden in einer zweiten Durchmusterung gemessen, welche nachfolgend beschrieben ist.
Beispiel 2
Das vorausgehend beschriebene Beispiel diskutierte richtig-Positive, richtig- Negative und falsch-Negative. Es sind jedoch aber auch falsch-Positive möglich. Diese unterdrücken die Bildung von AGE-Fluoreszenz durch physikalische Wechselwirkung mit Fluoreszenzmessungen. Um solche Verbindungen zu entfernen, werden sie hinsichtlich ihrer Fähigkeit AGE-Formen von Rinderserumalbumin („AGE-BSA") in dem im folgenden beschriebenen Assay abzufangen untersucht.
AGE-BSA wurde gemäß Ikeda, et al., Biochemistry 35:8075–8083 (1996) hergestellt. Das AGE-BSA wurde anschließend zu einem Well hinzugegeben, welches die Testverbindung, ADP-Ribose und Histon H1 enthielt und es wurde die Fluoreszenz gemessen. Der erhaltene Wert wurde mit einem Wert verglichen, welcher erhalten wurde, wenn AGE-BSA zu einem Well hinzugegeben wurde, welches den Hemmstoff Aminoguanidin enthielt. Eine Abnahme hinsichtlich der AGE-BSA-Fluoreszenz bei Vorliegen der potentiellen Verbindung führt zu einer Klassifizierung als negativ und zu einem Ausschluss vom weiteren Screening. Eine allgemeine Zusammenfassung der Durchmusterungsmethodik, welche in diesen Beispielen weiter ausgeführt wurde, ist in 10 dargelegt.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt ein zweites Screening, um Verbindungen, welche im Anschluss an die Assays gemäß Beispiel 1 und 2 als positiv erachtet wurden, weiter zu bewerten. Man wird sich insbesondere daran erinnern, dass jede Probe in zwei Wells untersucht wurde, von denen eine im voraus stehenden Beispiel 2 untersucht wurde. Die nicht verwendete Probe wurde mittels 12 % SDS-PAGE analysiert, woran sich Silberfärbung anschloss, um Proteinquerverknüpfung zu visualisieren. Dies dient als eine unabhängige Messung von Glycosylierung, welche durch Proteinschädigung verursacht wurde. Ein Fehlen von Proteinschädigung zeigt, dass die Testverbindung Glycosylierung tatsächlich hemmt.
Die Ergebnisse eines derartigen Assays, welcher eine positive Verbindung, unter Verwendung von Fluoreszenz bestätigt, sind in 13 gezeigt, sowie unter Verwendung des Querverknüpfungstests in 14.
Beispiel 4
Diese Experimente beschreiben die Weiterentwicklung des voraus stehend diskutierten Assays. Zur weiteren Ausführung wurde Histon H1 aus frischem Kalbsthymus isoliert. Zuerst wurde Chromatin aus den frischen Kalbsthymus-Proben extrahiert, mittels Extraktion mit 0,14 M NaCl und 0,05 M Na₂S₂O₅, pH 5, in Übereinstimmung mit Wondrak, et al., Biochem J. 351:769–777 (2000). Nach wiederholter Extraktion mit 5 % HClO₄ und Zentrifugation bei 15000 xg wurde das Histon H1 aus dem Überstand durch Zugabe von TCA (20 % Endkonzentration v/v) präzipitiert. Das Histon H1-Präzipitat wurde mittels Zentrifugation bei 12000 xg und deionisiertem Wasser gesammelt. Die Probe wurde einer intensiven Dialyse (MW Ausschluss: 12.000–14.000) gegen Wasser für 48 Stunden unterzogen und anschließend lyophilisiert. Es wurde SDS-PAGE (12 %) verwendet, um die Reinheit der Probe zu analysieren. Jedes Protein, welches auf diese Art und Weise gewonnen wurde, wurde bei 4 °C gelagert.
Das Histon H1 (1,5 mg/ml) wurde mit 1 mM ADP-Ribose in 50 mM KH₂PO₄-Puffer (pH 7,4, 37 °C, 0,015 % NaN₃ zugegeben, um bakterielles Wachstum zu hemmen) kombiniert. Dieses Reaktionsgemisch wurde zu 96-Well Mikrotiterplatten zugegeben. Die Testverbindungen wurden zu dem Reaktionsgemisch in Konzentrationen im Bereich von 1 bis 10 mM in Reaktionsvolumen von 300 μl zugegeben. Die Untersuchungen wurden zweifach durchgeführt.
Akkumulierter Proteinschaden wurde durch Messen von AGE-Fluoreszenz bei Wellenlängen von (λex = 370 nm; λem = 440 nm) bestimmt. Die Fluoreszenz wird in Gegenwart von Verbindungen mit Hemmungsaktivität unterdrückt. Die Assays wurden auf einer herkömmlichen Mikrotiterplatte ausgelesen mit einer Filtereinstellung, welche den oben beschriebenen Bedingungen gerecht wurde (λex: 355 nm, λex: 405 nm), wobei dies im Bereich der breiten Anregungs/Emissionsmaxima für AGE-Verbindungen liegt.
Die Fluoreszenz wurde am Beginn und nach 5 Tagen Inkubation gemessen. Jegliche Verbindungen, welche inhärent fluoreszierend sind, wurden durch die anfängliche Messung identifiziert und wurden als falsch-Negative angesehen; da sie jedoch tatsächlich hemmende Eigenschaften aufweisen können, wurden in sie in einer nachstehend beschriebenen zweiten Stufe des Assays untersucht.
Der bekannte Glycosylierungshemmstoff Aminoguanidin wurde als Kontrolle verwendet. Zusätzlich wurden Histon H1 und ADP-Ribose ohne einen möglichen Hemmstoff untersucht und Histon H1 wurde auch ohne ADP-Ribose inkubiert.
Nach 5 Tagen Inkubation erzeugte das Histon H1/ADP-Ribosegemisch AGE-Fluoreszenz, welche etwa 20 mal stärker war als die Hintergrundfluoreszenz, die durch Histon H1 allein erzeugt wurde. ADP-Ribose, welche ohne Histon H1 inkubiert wurde, erzeugte keine Fluoreszenz.
Die erste Phase des Assays identifizierte mögliche Hemmstoffe; es war jedoch möglich, dass derartige Verbindungen eher Fluoreszenzlöscher als Glycosylierungshemmstoffe waren. Deshalb wurden sie in einem zusätzlichen Assay, wie nachfolgend beschrieben, untersucht.
Zusammenfassend identifizierte dieser Schritt des Screeningassays richtig-Negative, welche nicht weiter beachtet werden mussten. Der Schritt identifizierte auch Verbindungen, welche Hemmstoffe von Glycosylierung sein können und Verbindungen mit unsicherer Aktivität. Die beiden letztgenannten Klassen an Verbindungen wurden in Assays untersucht, welche nun beschrieben werden.
Beispiel 5
Diese Experimente beschreiben, wie die falsch-Positiven, d.h. Fluoreszenzlöscher, identifiziert werden und von den möglichen Positiven, die in Beispiel 1 identifiziert werden, ausgeschlossen werden. Im Grunde wurde ein AGE-modifiziertes Protein mit bekannter Fluoreszenzaktivität in einem Gemisch der Testverbindung und anderer oben beschriebener Materialien verwendet.
„AGE-BSA" oder AGE-modifiziertes Rinderserumalbumin weist eine bekannte Fluoreszenzaktivität auf. Es wurde gemäß Takata, et al., J. Biol. Chem. 263:14819–14825 (1988) hergestellt. In Kürze, fünf Tage nach Entwicklung von Fluoreszenz in einem voraus stehend beschriebenen Assay wurden 1,6 g Rinderserumalbumin („BSA") und 3,0 g D-Glucose in 10 ml 0,5 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, gelöst, welcher 0,05 % NaN₃ enthielt. Die Lösung wurde filtersterilisiert durch einen 0,45 μm Filter und im Dunkeln für 90 Tage bei 37 °C inkubiert. Die Proben wurden gegen Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert.
Die Untersuchungen wurden durch Zugabe von 1 mg/ml des AGE/BSA zu den Reaktionsgemischen, wie voraus stehend beschrieben, durchgeführt. Jegliche Verbindungen, welche die inhärente Fluoreszenz des AGE-BSA-Moleküls löschen, werden als falsch-Positive erachtet und von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
Beispiel 6
Der nächste Schritt der Screeningmethodik umfasste Untersuchen möglicher Hemmstoffe, um deren Fähigkeit zur Hemmung von Proteinquerverknüpfung zu bestimmen. Um dies zu untersuchen, wurden Reaktionsaliquote der 5 Tage Inkubationsgemische, wie in Beispiel 1 voraus gehend beschrieben, auf 12 SDS-PAGE beurteilt. Sowohl unbehandeltes Histon H1 als auch die Aminoguanidin enthaltende Positivkontrolle wurden auf diese Art und Weise untersucht. Alle wurden durch Silberfärbung visualisiert.
Die Ergebnisse der in den Beispielen 1–5 beschriebenen Experimente sind in der nachfolgenden Tabelle dargelegt. Die Fluoreszenzmessung von NADH an Tag 0 zeigte, dass es sich dabei um eine stark fluoreszierende Substanz handelt, d.h. eine Verbindung mit unbekannter Aktivität. Wenn sie in Verknüpfungsexperimenten untersucht wurde, zeigte sie jedoch keine hemmende Aktivität. Deshalb zeigt die Kombination von Assays, dass die Verbindung „richtig" negativ ist. Rutin wurde als falsch-positiv identifiziert, da es die AGE-BSA-Fluoreszenz löschte, aber die Histon H1-Querverknüpfung nicht hemmte.
Tabelle 1. Screening von Inhibitoren nicht oxidativer fortgeschrittener Glycosylierung: AGE-Fluoreszenz auf 96-Well Mikrotiterplatten
Beispiel 7
Nukleophile Verbindungen verfügen über das Potenzial elektrophile α-Dicarbonyl-Zwischenverbindungen abzufangen. Siehe z.B. Ferguson, et al., Chem. Res. Tox 12:617–622 (1999). Als solche sollten derartige Verbindungen als Hemmstoffe fortgeschrittener Glycosylierung viel versprechend sein. Mehrere untersuchte Diolverbindungen zeigten hemmende Wirkung, umfassend L-Cysteinmethylester ("L-cys-OMe"), L-Cystein (L-Cys) und N α-Acetyl-L-Cystein (NAC); jedoch zeigten sie nur 61 % Hemmung bei der höchsten untersuchten Konzentration, 10 mM. Das Thiolcysteamin und das Mercaptoimidazolderivat L-Ergothionein zeigte eine etwas bessere Hemmung, während D, L-Homocystein und NH₂-L-cys-gly-COOH die AGE-Fluoreszenz erhöhten, wobei dies zeigt, dass diese Verbindungen wahrscheinlich selbst Glycosylierungsreaktionen unterzogen werden. D-Penicillamin und das racemische Gemisch D, L-Penicillamin waren die besten Verbindungen der untersuchten Verbindungen. Es wurde herausgefunden, dass die Verbindungen, wenn sie mit AGE-BSA getestet wurden, keine falsch-Positiven waren. Deshalb wurde ihr hemmendes Potenzial getestet, d.h. ihre Fähigkeit, durch Glycosylierung induzierte Querverknüpfung von Histon H1 zu hemmen. In der Tat wurde herausgefunden, dass ihre hemmenden Wirkungen stärker waren als die von Aminoguanidin. Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt, welche sowohl die Fluoreszenz im Vergleich zur Fluoreszenz mit Aminoguanidin als auch die Ergebnisse einer Querverknüpfungsanalyse zeigt. Diese Daten zeigen, dass 1-Amino-2-mercapto-2,2-dimethylethan der Pharmacophor ist, d.h. der aktive Teil des Moleküls, welcher bei der Hemmung von AGE-Proteinbildung eine Rolle spielt.
Beispiel 8
Die von D-Penicillamin gezeigte hemmende Wirkung legt nahe, dass es als Abfangmittel im Hinblick auf reaktive Carbonylspezies wirkt. Um dies zu untersuchen, wurden Experimente durchgeführt, um die chemische Reaktivität im Hinblick auf α-Dicarbonylverbindungen bei physiologischem pH-Wert und physiologischer Temperatur zu bewerten.
Es wurde eine Lösung von D-Penicillamin (350 mg, 2,3 mmol) in 50 ml wässrigem 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,4) hergestellt und Methylglyoxal (40 % in N₂O/620 μl. 3,45 mmol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde für 24 Stunden bei 37 °C gerührt, wonach das Lösungsmittel bei verringertem Druck auf die Hälfte des Volumens konzentriert wurde und sich Entsalzen auf einer Säule anschloss. Die Säule wurde mit Wasser entwickelt, UV-absorbierende Scheitelwerte wurden zusammengefasst und Wasser wurde bei verringertem Druck verdampft. Das Rohprodukt wurde mittels Anionenaustauschchromatographie auf einer 1,5 × 45 cm QAE Sephadex Säule gereinigt, welche durch Anlegen eines linearen Gradienten, welcher zwischen 200 ml destilliertem Wasser und 200 ml 0,2 M NH₄HCO₃ gebildet wurde, entwickelt wurde. Es wurde Fraktionen gesammelt und die Absorption bei 254 nm gemessen.
Das ¹H-NMR-Spektrum zeigte die folgenden Signale: [δ_H(D₂O) in ppm]: 1,03 (3H, s, CH₃); 1,05 (3H, s, CH₃); 1,90 (3H, s, CO-CH₃); 3,96 und 3,98 (Diatereoisomer, 1H, s, CH-COOH). Die massenspektroskopische Analyse mittels „MALD-TOF-MS" zeigte ein [M + Na]⁺ von 226 Da. Dies ist mit der berechneten Masse für C₈H₁₃NO₃S vergleichbar, welche 203,26 Da beträgt. Das Aldehyd-Thiazolidinaddukt bildete sich, mutmaßlich nach nukleophilem Ringschluss der anfänglich gebildeten Schiffschen Base. Siehe 16 zur der Struktur der Reaktanten.
Alle ¹H-NMR-Signale konnten 2-Acetyl-5,5-dimenthyl-thiazolidin-4-carboxylsäure als Struktur des Reaktionsprodukts zugeordnet werden. Die einzige Ausnahme ist das fehlende Signal des sehr sauren Proteins in Position 2 des Thiazolidinrings, welches wahrscheinlich mit D₂O austauscht. Es wurde kein Aldehydproton detektiert, wodurch die Bildung des isomeren Thiazolidins an C-2 von Methylglyoxal ausgeschlossen wurde. Darüber hinaus zeigte die C-NMR-Analyse der Verbindung deutlich zwei Carbonylgruppen bei δ = 199 ppm (CH₃C=O) und δ = 209 ppm (COOH).
Um mehr über diese Reaktion in Erfahrung zu bringen, wurde D-Penicillamin mit Phenylglyoxal umgesetzt. Auf die voraus gehend beschriebene Art und Weise wurde Phenylglyoxal mit einer Endkonzentration von 10 mM und D-Penicillamin mit einer Endkonzentration von 20 mM in 50 mM KH₂PO₄-Puffer, pH 7,4, bei Raumtemperatur umgesetzt. Der Reaktionsfortschritt wurde mittels HPLC-Analyse von Reaktionsaliquots bei 254 nm überwacht. Nach 40 Minuten wurde mehr als 90 % Umwandlung des Phenylglyoxalscheitelwerts in einen einzigen Scheitelwert beobachtet. Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC erhalten, es wurde lyophilisiert und durch H-NMR-Spektroskopie analysiert.
Das Spektrum zeigte die folgenden Signale: [δ_H(D₂O) in ppm]: 1,38 (3H₅, CH₃), 1,45 (3H, s, CH₃), 4,12 (1H, s, CH-COOH), 7,42–7,82 (5H, m ArH). Wiederum wurde aufgrund des erwarteten Austauschs mit D₂O kein Signal beobachtet, welches dem saurem Proton in Position 2 des Thiazolidinrings entsprach, und es wurde kein Aldehydproton beobachtet. Deshalb wurde die Struktur des Phenylglyoxal-D-Penicillaminaddukts 2-Benzoyl-5,5-dimethyl-thiazolidin-4-carbonsäure zugeordnet.
Die beobachteten Strukturen legen nahe, dass ein Abfangen von α-Dicarbonyl durch 2-Acyl-5,5-dialkyl-thiazolidin-Bildung als Mechanismus der Hemmung nicht-oxidativer fortgeschrittener Glycosylierung die Effizienz der Hemmung von D-Penicillamin erklären kann. Die 5,5-Dialkylsubstitution kann ein Schließen des Thiazolidinrings sterisch begünstigen, wodurch die Umkehrreaktion mittels Hydrolyse verhindert wird.
Beispiel 9
Die in diesem Beispiel beschriebenen Experimente wurden entwickelt, um die relativen Geschwindigkeiten des Abfangens von α-Dicarbonyl durch D-Penicillamin und Aminoguanidin zu bewerten, wobei Phenylglyoxal als Modell verwendet wurde.
Die Reaktionen wurden in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, bei 37 °C durchgeführt und wurden mittels HPLC-Analyse verfolgt. Phenylglyoxal wurde mit einer Konzentration von 50 mM verwendet, während D-Penicillamin und Aminoguanidin bei Konzentrationen von 250 mM und 500 mM verwendet wurden. Das Phenylglyoxal wurde als eine UV-aktive, α-Oxoaldehydverbindung verwendet. Im Verlauf der Reaktion wurden Aliquote mittels HPLC analysiert. Für Reaktionen, umfassend D-Penicillamin, wurden Aliquote in 20 Sekunden Intervallen entnommen und zur Analyse auf Trockeneis gehalten. Die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten von Phenylglyoxal und den Testverbindungen wurden durch Verfolgen des Verschwindens von Phenylglyoxal über die Zeit hinweg beobachtet.
Die Reaktion zwischen Phenylglyoxal und den Testverbindungen ist eine Reaktion zweiter Ordnung, wobei die Reaktionsgleichung gilt:
Wie aus den Konzentrationen der Reaktanten ersehen werden kann, lag in allen Reaktionen ein Überschuss an Testverbindung vor (1:5 oder 1:10), um die Reaktion zur Kinetik einer Pseudoreaktion erster Ordnung umzuwandeln, da die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante (k_1st) offenbar von der Konzentration der Testverbindung abhängig ist.
Die Auftragung von log AUC für Phenylglyoxal gegen die Zeit führte zu einem Anstieg von k_1st/2,303. Die gemessene Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung (k_1st) wurde verwendet, um die Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung (k_2st) gemäß: k2nd = k1st[α-Dicarbonylfänger]zu berechnen.
Die berechneten Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung wurden bei zwei Reaktionsgeschwindigkeiten (5:1 und 10:1) bestimmt und standen in guter Übereinstimmung zueinander.
D-Penicillamin fing Phenylglyoxal mehr als 60 mal schneller ein als Aminoguanidin. Um zu bestimmen, ob die α-Oxosubstitution irgendeinen Einfluss auf den Verlauf der Aldehydeinfangreaktion hatte, wurde die Reaktivität von D-Penicillamin mit dem Aldehyd entsprechend Phenylglyoxal, d.h. Phenylacetaldehyd, auf die gleiche Art und Weise wie hierin beschrieben durchgeführt.
Es wurde herausgefunden, dass D-Penicillamin Phenylacetaldehyd etwa 14 mal weniger effizient als Phenylglyoxal abfängt, was zur Schlussfolgerung führt, dass D-Penicillamin α-Oxocarbonylverbindungen effizienter abfängt als Aldehyde.
Beispiel 10
Für Verbindungen, wie beispielsweise Glyoxal und Methylglyoxal wurde festgestellt, dass sie gegenüber Zellen, wie beispielsweise neuronalen Zellen (Kikuchi, et al., J. Neurosci Res. 57:280–289 (1999); Shinpo, et al., Brain Res. 861:151–159 (2000), und aus Macrophagen abgeleiteten Zelllinien (Okada, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 225:219–229 (1996) toxisch sind. Deshalb wurde die Fähigkeit von α-Dicarbonylfängern gegenüber α-Diacarbonyltoxizität zu schützen untersucht.
Die kontinuierlich kultivierte Zelllinien „He-Cat" (humane epidermale Keratinozyten) und „CF-3" (humane dermale Fibroblasten) wurden unter Standardbedingungen kultiviert, vierzehntäglich in DMEM aufgeteilt, welches 10 fötales Rinderserum enthielt und sie wurden bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre, welche 5 % CO₂ enthielt, gehalten. Um die Zellen zu teilen, wurden 5 % Trypsin auf Keratinozyten und 1 % Trypsin auf Fibroblasten verwendet.
Die Keratinozyten wurden mit 2 × 10⁴ Zellen/Vertiefung und die Fibroblasten mit 4 × 10⁴ Zellen/Vertiefungen ausgesät, wobei Schalen mit 6 Vertiefungen verwendet wurden. Man lies die Zellen über Nacht auf der Platte anhaften. Es wurde entweder D-Penicillamin oder Aminoguanidin (jeweils 1 mM) zu den Platten 15 Minuten vor der Zugabe von Glyoxal oder Methylglyoxal zugegeben. Man beließ das α-Diacarbonyl für 72 Stunden. Es wurden variierende Konzentrationen des α-Dicarbonyls verwendet. Die Zellen wurden mit einer Coulter-Zellvorrichtung nach 72 Stunden Belastung ausgezählt. Es wurden auch Kulturen angelegt, in welchen das Glyoxal oder Methylglyoxal ohne den Fänger verwendet wurden. L-Alanin wurde als Negativkontrolle verwendet, da von ihm nicht erwartet wurde, dass es einen schützenden Effekt aufweist.
Die Ergebnisse zeigten, dass steigende Konzentrationen von Methylglyoxal zu einer dosisabhängigen Wachstumshemmung führten, wobei Konzentrationen von 600 μM beide Linien vollständig hemmten. Glyoxal beeinflusste beide Zelltypen in gleicher Art und Weise, wohingegen Fibroblasten im Hinblick auf Glyoxal weniger sensitiv waren. L-Alanin zeigte keinen schützenden Effekt. Aminoguanidin rettete beide Zelllinien teilweise vor Methylglyoxal-induzierter Wachstumshemmung, während sich D-Penicillamin überlegen zeigte und die Methylglyoxaltoxizität nahezu vollständig blockierte. Beide Verbindungen schienen Keratinozyten gegenüber Wachstumshemmung durch Glyoxal zu schützen. Der schützende Effekt kann 17 entnommen werden. Mutmaßlich ist ein direktes Abfangen von toxischen, reaktiven Carbonylmitteln der Grund, da eine Vorinkubation von Zellen mit den schützenden Verbindungen für 24 Stunden, woran sich eine Exposition gegenüber den α-Dicarbonylen anschloss, keinerlei schützenden Effekt zeigte.
Es war von Interesse zu bestimmen, ob D-Penicillamin einen dosisbereichabhängigen, cytoprotektiven Effekt zeigte. Eine erhöhte D-Penicillaminkonzentration führte zu erhöhtem Schutz. Es wurde beobachtet, dass Fibroblasten gegenüber Methylglyoxalaktivität in der Tat sensitiver waren als Keratinozyten, wobei D-Penicillamin 47 % Überleben bei Fibroblasten, welche mit 6004 M Methylglyoxal behandelt wurden im Vergleich zu 100 % Überleben von Keratinozyten zeigte. Dies zeigt 18.
Beispiel 11
Dieses Beispiel wird auch in Wondrak, et al., Biochem J. 351:769–777 (2000) beschrieben.
Die hierin beschriebenen Beispiele zeigen die Wirksamkeit von ADP-Ribose bei der Verursachung von Histon H1-Carbonylierung. Es wird voraus stehend auch beschrieben, dass Glucose schwach reagiert.
Es wurde eine Serie von Experimenten durchgeführt, um verschiedene reduzierende Zucker als Glycosylierungsmittel zu vergleichen. Zusätzlich zu ADP-Ribose wurden ADP-Glycose, D-Ribose und D-Glucose untersucht. In Kürze, Histon H1 wurde mit 1 mM eines jeden Zuckers kombiniert und das Gemisch wurde bei pH 7,4 inkubiert. Nach 7 Tagen Inkubation wurden Reaktionsaliquots auf 12 % SDS-PAGE-Gelen mit Silberfärbung untersucht. Die Ergebnisse sind in den 19A und B gezeigt. In jeder dieser Figuren stellt Spur 1 eine Kontrolle dar, welcher kein Zucker zugegeben wurde, während die Spuren 2-5 Ergebnisse unter Verwendung von D-Glucose, D-Ribose, ADP-Glucose bzw. ADP-Ribose zeigen. ADP-Ribose verursachte eine erhebliche Carbonylierung, wohingegen D-Ribose zu einer niedrigeren Menge führte. Weder D-Glucose noch ADP-Glucose verursachten eine signifikante Carbonylierung. Die Menge an Carbonylierung, welche durch ADP-Ribose (0,82 mol/mol Histon H1) und D-Ribose (0,06 mol/mol Histon H1) verursacht wurde, korrelierte mit Immunofärbung.
Um zu bestimmen, ob die Carbonylierung von Histon H1 durch ADP-Ribose einen oxidativen Reaktionsweg mit einbezieht, wurden mehrere Verbindungen, von welchen bekannt ist, dass sie mit der Glycoxidation von Proteinen durch D-Glucose wechselwirken, untersucht, um zu bestimmen, ob sie mit dieser Wirkung von ADP-Ribose wechselwirken. Die untersuchten Verbindungen umfassten 5 mM DTPA unter Argon, 5 mM Aminoguanidin, 5 mM N^α Acetyl-L-Cystein, 5 mM Mannitol und 100 Einheiten/ml Katalase. Die Ergebnisse sind in den 19C und D dargelegt und zeigen, dass keine dieser Verbindungen mit der Carbonylierung wechselwirkte mit Ausnahme von Aminoguanidin, welches einen leichten Effekt zeigte. Proteinquerverknüpfung war jedoch vollständig blockiert, wodurch nahe gelegt wird, dass die Carbonylierung von Histon H1 durch ADP-Ribose eher ein Ergebnis früher Glycosylierung als von Glycoxidation ist.
Die vorangehende Beschreibung legt verschiedene erfindungsgemäße Aspekte dar, welche ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen betreffen, die zellulären Stress beeinflussen. „Zellulärer Stress" wie hierin verwendet bezieht sich auf Stress, welcher induziert wird durch beispielsweise oxidativen Stress, Glycosylierung, UV-Bestrahlung und so weiter. Dies führt wiederum zu Gewebeverfall und Alterung. Das Verfahren betrifft vorzugsweise eine Identifizierung von Substanzen, welche als Carbonylfänger wirken, wie beispielsweise Dicarbonylfänger, und deshalb die Bildung von Protein-AGE-Produkten hemmen. Parallel erlauben diese Assays dem Fachmann, im Screening-Assay Antioxidationsmittel zu entfernen, da die Assays in Abwesenheit von Sauerstoff funktionieren. Deshalb können Dicarbonylfänger unter Verwendung dieses Verfahrens identifizieren werden und es kann auch nach Verbindungen durchmustert werden, um zu bestimmen, ob sie als Antioxidationsmittel funktionieren oder nicht.
Wie voraus stehend angezeigt, umfasst das Verfahren im Wesentlichen Mischen einer Verbindung oder einer zu untersuchenden Verbindung oder Substanz mit dem Protein-Histon H1 und ADP-Ribose. Histon H1 und ADP-Ribose sind dafür bekannt miteinander wechselzuwirken, was zur Bildung eines fluoreszierenden Produkts führt. Wenn die Verbindung von Interesse nach Vermischen mit dem Histon H1 und ADP-Ribose zu einer Verringerung von Fluoreszenz führt, kann die Substanz ein Hemmstoff für Protein-AGE-Bildung sein. Umkehrt können Agonisten von Protein-AGE-Bildung auf die gleiche Art und Weise identifiziert werden.
Wie die Beispiele zeigen, können Substanzen von Interesse in wenigstens zwei unterschiedlichen zusätzlichen Assays getestet werden, umfassend einen Assay, in welchem die Substanz sowohl mit AGE-BSA als auch mit Histon H1 und ADP-Ribose gemischt wird, und einen Assay zur Bestimmung, ob Histon H1-Moleküle quervernetzt wurden, wenn sie mit ADP-Ribose und der Substanz von Interesse kombiniert wurden.
Von besonderem Interesse sind Verbindungen, von denen angenommen wird, dass sie nukleophile Verbindungen sind, insbesondere thiolhaltige Verbindungen. Wie die Beispiele zeigen, wurde Verbindungen mit den gewünschten Eigenschaften auf diese Art und Weise identifiziert.
Es wird angemerkt, dass man die Glycosylierung von Verbindungen auf viele Arten messen kann. Beispielsweise sind im Fachbereich Assays zur Bestimmung des Fructosamingehalts von Molekülen bekannt und dabei handelt es sich tatsächlich um Assays zur Bestimmung von Glycosylierung. Sowohl diese als auch andere Assays können erfindungsgemäß verwendet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen werden wenigstens zwei verschiedene Assays durchgeführt, um die in einem ersten Assay entwickelten Ergebnisse zu bestätigen, aber dies ist nicht erforderlich. Ferner können die Assays hintereinander ausgeführt werden mit entweder einer Positivkontrolle, einer Negativkontrolle oder am stärksten bevorzugt mit beiden. Wiederum kann die Art des verwendeten Kontrollassays variieren und dies liegt im Ermessen des Fachmanns.
Zusätzlich zu den Assays der Erfindung sind auch Kits ein Bestandteil davon. Diese Kits umfassen mindestens ein Behältnismittel, wie beispielsweise eine Dose, welche anschließend getrennte Teile von jeweils ADP-Ribose und Histon H1 enthält, in Lösung, lyophilisiert, in Pulverform, in Tablettenform oder einer anderen Form, welche für den Fachmann passend scheint. Derartige Kits umfassen vorzugsweise Anleitungen zur Durchführung des Assays und können gegebenenfalls Proben von einem oder von beiden eines positiven und eines negativen Kontrollreagenzmittels enthalten, wie beispielsweise die voraus stehend beschriebenen.
Andere Aspekte der Erfindung sind für den Fachmann offensichtlich und brauchen nicht weiter ausgeführt zu werden.
Die Ausdrücke und Formulierungen, welche verwendet wurden, werden im Hinblick auf eine Beschreibung und nicht auf eine Beschränkung verwendet, und es liegt in der Verwendung derartiger Ausdrücke und Formulierungen keine Absicht vor, irgendwelche Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder von Teilen davon auszuschließen, wobei erkannt wird, dass verschiedene Abwandlungen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung möglich sind.

Claims

Verfahren zur Bestimmung einer Substanz, welche die Glycosylierung eines Proteins reguliert, umfassend Mischen (i) einer zu untersuchenden Substanz, wobei die Substanz ein Dicarbonylfänger ist, (ii) eines Histons H1 und von (iii) ADP-Ribose und Bestimmung, ob die zu untersuchende Substanz einen Effekt auf die Glycosylierung von Histon H1 durch ADP-Ribose aufweist, wobei ein Hinweis auf einen Effekt auf die Glycosylierung darauf hinweist, dass die Substanz Glycosylierung reguliert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Substanz kein Antioxidationsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend Bestimmung von Glycosylierung durch Messen der Fluoreszenz von glycosyliertem Histon H1.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend Vergleichen des Effekts mit dem Effekt, welcher durch Mischen von Aminoguanidin, Histon H1 und ADP-Ribose erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend Messen von Fluoreszenz etwa 5 Tage nach Mischen von (i), (ii) und (iii).
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend Kombinieren des Mischens von (i), (ii) und (iii) in einem getrennten Assay mit AGE-BSA und Messen des Effekts von (i) auf die Fluoreszenz von AGE-BSA.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend Bestimmen der Querverknüpfung von Histon H1-Molekülen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Substanz eine nukleophile Verbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die nukleophile Verbindung eine thiolhaltige Verbindung ist.