JPWO2005040798A1 - アルツハイマー病の診断方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする、神経系疾患の検出方法を提供する。
Description
本発明はアルツハイマー病の検出方法及び診断方法に関する。
アルツハイマー病（ＡＤ）及びアルツハイマー型老年痴呆症（ＳＤＡＴ）は５０歳台から発症し、加齢に従ってその発症頻度が増加する疾患である。特に本邦においては、２０１０年には全国民の１／４が７０歳以上の高齢化社会を迎えるため、ＡＤ／ＳＤＡＴの増加が予測され、病態の進行によって国民生産性の低下及び医療費負担の著しい増加を招来する。従って、早期診断によって病態の進行を阻止することが急務である。そのためには、血中又は脳脊髄液中にその病態特異的なマーカーを発見し、正確にそれを測定することが重要である。
病態特異的なマーカーの発見のために、すでに多くの試みが為されている。それらの物質としては、ニューロフィラメント重鎖、チューブリン、グリアルフィブリラリー酸性タンパク質、Ｓ１００タンパク質、タウタンパク質、ベーターアミロイドプレカーサーペプチド、ミエリン塩基性タンパク質、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどが挙げられ、さらにこれらの物質に対する自己抗体などの検索がなされてきた［Ｔｅｒｒｙｂｅｒｒｙ ＪＷ，Ｔｈｏｒ Ｇ，Ｐｅｔｅｒ ＪＢ．Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ １９９８；１９：２０５−２１６．］。これらの検索は無効ではないが、特異性に欠けるため、高感度に検出することが困難である。以上のことから、ＡＤ及びＳＤＡＴに対し、特異性に富んだ簡易診断法が切に望まれるところである。
病態特異的なマーカーの発見のために、すでに多くの試みが為されている。それらの物質としては、ニューロフィラメント重鎖、チューブリン、グリアルフィブリラリー酸性タンパク質、Ｓ１００タンパク質、タウタンパク質、ベーターアミロイドプレカーサーペプチド、ミエリン塩基性タンパク質、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどが挙げられ、さらにこれらの物質に対する自己抗体などの検索がなされてきた［Ｔｅｒｒｙｂｅｒｒｙ ＪＷ，Ｔｈｏｒ Ｇ，Ｐｅｔｅｒ ＪＢ．Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ １９９８；１９：２０５−２１６．］。これらの検索は無効ではないが、特異性に欠けるため、高感度に検出することが困難である。以上のことから、ＡＤ及びＳＤＡＴに対し、特異性に富んだ簡易診断法が切に望まれるところである。
本発明は、アルツハイマー病、アルツハイマー型老年痴呆症などの脳神経系疾患を特異的に検出する方法、及びこれらの疾患の診断法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、アルツハイマー病患者等の血中の抗ヒストンＨ１抗体及び抗ポリＡＤＰ−リボース抗体を測定することにより、上記疾患を検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする、神経系疾患の検出方法。
本発明においては、生体試料として血液、唾液、漿液、リンパ液、血清等の体液を使用することができる。また、神経系疾患としては、アルツハイマー病（ＡＤ）又はアルツハイマー型老年痴呆症（ＳＤＡＴ）が挙げられるが、これらの疾患に限定されるものではない。ＡＤ又はＳＤＡＴ患者の生体試料（例えば体液）中には、抗ポリＡＤＰ−リボース抗体（「抗ｐＡＤＰＲ抗体」ともいう）、抗ヒストンＨ１抗体（「抗Ｈ１抗体」ともいう）又はこれらの両者が含まれており、その自己抗体のサブクラスはＩｇＧ１及びＩｇＧ２のいずれも存在する。これに対し、代表的な自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の自己抗体のサブクラスは、ＩｇＧ２が主である。従って、ＩｇＧ１とＩｇＧ２との比（Ｇ１／Ｇ２比）を測定することにより、その値を指標として被験患者がＡＤ又はＳＤＡＴであるのかを判断することができる。また、それらの再分類（亜型）をも可能にする。また、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ、抗ヒストンＨ１ ＩｇＧのほか、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ、抗Ｈ１ ＩｇＡを測定することにより、その値を指標として被験患者がＡＤ又はＳＤＡＴであるのかを判断することができる。
（２）ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする、神経系疾患の診断方法。
生体試料、神経系疾患の具体的内容は上記（１）記載の発明と同様である。また、本発明の診断方法においても、ＩｇＧ１とＩｇＧ２との比を指標として診断することが可能である。また、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ、抗ヒストンＨ１ ＩｇＧのほか、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ、抗Ｈ１ ＩｇＡを測定することにより、その値を指標として被験患者がＡＤ又はＳＤＡＴであるのかを判断することもできる。
（３）ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１を含む、神経系疾患の診断又は検出用キット。
（４）ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１が固相に固定された、神経系疾患の診断又は検出用プレート。
上記キット及びプレートにおいて、神経系疾患は例えばアルツハイマー病又はアルツハイマー型老年痴呆症である。
（５）ヒストンＨ１を、０．２５Ｍ ＮａＣｌ及び２５ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液で希釈した後、固相に固定することを特徴とする、ヒストンＨ１の固相への固相化方法。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、アルツハイマー病患者等の血中の抗ヒストンＨ１抗体及び抗ポリＡＤＰ−リボース抗体を測定することにより、上記疾患を検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする、神経系疾患の検出方法。
本発明においては、生体試料として血液、唾液、漿液、リンパ液、血清等の体液を使用することができる。また、神経系疾患としては、アルツハイマー病（ＡＤ）又はアルツハイマー型老年痴呆症（ＳＤＡＴ）が挙げられるが、これらの疾患に限定されるものではない。ＡＤ又はＳＤＡＴ患者の生体試料（例えば体液）中には、抗ポリＡＤＰ−リボース抗体（「抗ｐＡＤＰＲ抗体」ともいう）、抗ヒストンＨ１抗体（「抗Ｈ１抗体」ともいう）又はこれらの両者が含まれており、その自己抗体のサブクラスはＩｇＧ１及びＩｇＧ２のいずれも存在する。これに対し、代表的な自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の自己抗体のサブクラスは、ＩｇＧ２が主である。従って、ＩｇＧ１とＩｇＧ２との比（Ｇ１／Ｇ２比）を測定することにより、その値を指標として被験患者がＡＤ又はＳＤＡＴであるのかを判断することができる。また、それらの再分類（亜型）をも可能にする。また、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ、抗ヒストンＨ１ ＩｇＧのほか、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ、抗Ｈ１ ＩｇＡを測定することにより、その値を指標として被験患者がＡＤ又はＳＤＡＴであるのかを判断することができる。
（２）ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする、神経系疾患の診断方法。
生体試料、神経系疾患の具体的内容は上記（１）記載の発明と同様である。また、本発明の診断方法においても、ＩｇＧ１とＩｇＧ２との比を指標として診断することが可能である。また、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ、抗ヒストンＨ１ ＩｇＧのほか、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ、抗Ｈ１ ＩｇＡを測定することにより、その値を指標として被験患者がＡＤ又はＳＤＡＴであるのかを判断することもできる。
（３）ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１を含む、神経系疾患の診断又は検出用キット。
（４）ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１が固相に固定された、神経系疾患の診断又は検出用プレート。
上記キット及びプレートにおいて、神経系疾患は例えばアルツハイマー病又はアルツハイマー型老年痴呆症である。
（５）ヒストンＨ１を、０．２５Ｍ ＮａＣｌ及び２５ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液で希釈した後、固相に固定することを特徴とする、ヒストンＨ１の固相への固相化方法。
図１は、ポリＡＤＰ−リボースの単位であるＡＤＰ−リボースの構造を示す図である。
図２は、ＡＤ患者及びＳＤＡＴ患者における抗ｐＡＤＰＲ抗体及び抗Ｈ１抗体の検出結果を示す図である。
図３は、ＳＬＥ患者における抗ｐＡＤＰＲ抗体及び抗Ｈ１抗体の検出結果を示す図である。
図４は、ＡＤ患者及びＳＤＡＴ患者における抗Ｈ１抗体と抗ｐＡＤＰＲ抗体との相関関係を示す図である。
図５は、ＳＬＥ患者における抗Ｈ１抗体と抗ｐＡＤＰＲ抗体との相関関係を示す図である。
図６は、ＡＤ患者及び健常人における抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ及び抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡの検出結果を示す図である。
図２は、ＡＤ患者及びＳＤＡＴ患者における抗ｐＡＤＰＲ抗体及び抗Ｈ１抗体の検出結果を示す図である。
図３は、ＳＬＥ患者における抗ｐＡＤＰＲ抗体及び抗Ｈ１抗体の検出結果を示す図である。
図４は、ＡＤ患者及びＳＤＡＴ患者における抗Ｈ１抗体と抗ｐＡＤＰＲ抗体との相関関係を示す図である。
図５は、ＳＬＥ患者における抗Ｈ１抗体と抗ｐＡＤＰＲ抗体との相関関係を示す図である。
図６は、ＡＤ患者及び健常人における抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ及び抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡの検出結果を示す図である。
１．概要
最近ＡＤ患者の脳神経細胞、とりわけ星膠細胞（アストロサイト）の細胞核におけるＡＤＰ−リボシル化活性の上昇［Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ）ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｒａｉｎ １９９９；１２２：２４７−２５３］、及び星膠細胞膜におけるヒストンＨ１の高発現［Ｂｏｌｔｏｎ ＳＪ，Ｒｕｓｓｅｌａｋｉｓ−Ｃａｒｎｅｉｒｏ Ｍ，Ｂｅｔｍｏｕｎｉ Ｓ，Ｐｅｒｒｙ，ＶＨ．Ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅａｒ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｉｓ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｐｒｉｏｎ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９９；２５：４２５−４３２．］に関して報告がされている。この二つの現象には密接な関係のあることが知られている。ＡＤＰ−リボシル化反応は、主にタンパク質に生じる現象であり［Ｈａｙａｉｓｈｉ Ｏ，Ｕｅｄａ Ｋ．Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ａｎｄ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７７；４６：９５−１１６］、タンパク質の修飾反応として知られている。修飾、つまりＡＤＰリボシル化される代表的なタンパク質がヒストンＨ１である。Ｈ１は、核クロマチン、及びその構成単位であるヌクレオソーム（ＮＳ）の凝縮のために重要な働きを演じている。そのＨ１がＡＤＰ−リボシル化されると、その度合いによってクロマチンがタイトになったり、ルーズになったりする［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｉｔｓｕ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８０；８８：９１７−９２０］。このことは、クロマチンのＡＤＰリボシル化反応が遺伝子発現の調節に深く関わり、また発ガン物質などでＤＮＡが切断された場合にそれを修復する作用を有することを意味する［Ｖｉｒａｇ Ｌ，Ｓｕｚａｂｏ Ｃ．Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｒｅｖ ２００２；５４：３７５−４２９］。さらに、近い将来において、ＡＤＰ−リボシル化反応は、加齢と細胞核クロマチンの機能的、形態的変化とも深く関わってくるものと考えられる。
本発明者は、ＡＤＰ−リボシル化の延長反応で合成されるポリＡＤＰ−リボース（「ｐＡＤＰＲ」という）が、塩基性タンパク質と荷電結合すると、マウスやウサギに抗ｐＡＤＰＲ抗体を産生させることを初めて報告した［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｍｉｗａ Ｍ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ｔ．Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｏｌｙ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｉｂｏｓｅ）ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９７４；５９：３００−３０６］。さらに、ＡＤＰ−リボシル化反応を受けたヒストンでウサギを免疫すると、抗ヒストン抗体と抗ｐＡＤＰＲ抗体が同時に産生され、未修飾ヒストンで免疫した場合と比べてはるかに強力な抗体が産生されることを見出した［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８１；４３：１０１−１１０．、Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｎ：ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｈａｙａｉｓｈｉ Ｏ，Ｕｅｄａ Ｋ ｅｄｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８２：ｐｐ．５３３−５４６］。
以上のような本発明者の研究実績から、本発明者はＡＤ患者アストロサイト膜表面に発現されているヒストンＨ１はＡＤＰ−リボシル化されている可能性が高いと想定し、ＡＤ患者血中の抗ヒストンＨ１抗体と抗ｐＡＤＰＲ抗体を測定するに至った。
一方、免疫学的な見地とは別に、脳の虚血などの血流障害後に生じる神経細胞の修復には、ポリＡＤＰ−リボシル化が深く関与することが知られている［Ｓｚａｂｏ Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ ＶＤ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １９９８；１９：２８７−２９８］。この場合は、ＤＮＡ障害の修復のためにＡＤＰ−リボシル化反応が過度に促進する結果、ＮＡＤが枯渇して細胞死を誘導し、脳の変性に加担することになる。このような脳の虚血・血流障害時にＰＡＲＰ（ｐＡＤＰＲ合成酵素）の阻害剤を投与すると神経細胞死や変性を抑制できることから、ＰＡＲＰの阻害剤の開発が積極的に行われている［Ｖｉｒａｇ Ｌ，Ｓｕｚａｂｏ Ｃ．Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｒｅｖ ２００２；５４：３７５−４２９］。これを裏付けるように、ＰＡＲＰのノックアウトマウスでは脳の血流障害に伴う神経細胞死が抑制されることが報告されている［Ｅｌｌａｓｓｏｎ ＭＪＬ，Ｓａｍｐｅｉ Ｋ，Ｍａｎｄｉｒ ＡＳ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｒｅｎｄｅｒｓ ｍｉｃｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １９９７；３：１０８９−１０９５］。
以上を総括すると、ＡＤでは脳でのＡＤＰ−リボシル化が促進し、ｐＡＤＰＲが脳に沈着することが予測される。なお、最近ではＡＤＰ−リボシル化のターゲット分子はＨ１よりもＰＡＲＰのほうが頻度が高いといわれている［Ｌｉｎｄｈａｌ Ｔ，Ｓａｔｏｈ Ｍ，Ｐｏｉｒｉｅｒ ＧＧ，Ｋｌｕｎｇｌａｎｄ Ａ．Ｐｏｓｔｔｒａｎｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １９９５；２０：４０４−４１１］。加齢にともなって予想される脳関門の緩和は、ｐＡＤＰＲの血中への漏洩をもたらし、ひいては免疫系に接触する機会を増加させることになり、ＡＤにおいてｐＡＤＰＲに対する免疫応答を調べる理論的根拠は極めて高い。
２．神経系疾患の検出方法
本発明は、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする神経系疾患の検出方法を提供する。つまり、本方法は、生体試料中の抗ポリＡＤＰ−リボース抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体の量を、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１を用いて検出することにより、神経系疾患を検出する方法である。
（１）神経系疾患
本発明において神経系疾患とは、ＡＤＰリボシル化が関与する神経系の疾患を広く含むものであり、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）及びアルツハイマー型老年痴呆症（ＳＤＡＴ）が含まれる。特に、本方法は疾患時に抗ポリＡＤＰ−リボース抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体の発現が確認される疾患において有用である。
（２）ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨＩと生体試料との反応と抗体の検出
本発明の方法は、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１が固相化されたプレートに、生体試料を添加して反応させ、試料中の抗ポリＡＤＰ−リボース抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体を検出するものである。
（ａ）ポリＡＤＰ−リボース（ｐＡＤＰＲ）
本発明において用いるポリＡＤＰ−リボースは、ＡＤＰ−リボース（図１）が複数（図１「ｎ」）結合したものである。図１中、「Ｒ」はリボース、「Ｐ」はリン酸基及び「Ａｄ」はアデニンを示す。ｐＡＤＰＲは、ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＮＡＤ）やＮＡＤ＋から合成することができる。例えば、ＮＡＤを基質として、仔牛胸腺核を酵素源として合成し、精製して得ることができる［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｉｔｓｕ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８０；８８：９１７−９２０］。本発明で用いられるポリＡＤＰ−リボースは抗ポリＡＤＰ−リボース抗体に認識される限りその長さは限定されないが、平均鎖長は１０〜５０、好ましくは２０〜４０、より好ましくは３０である。なお、本発明に用いるｐＡＤＰＲは高純度であることが好ましく、ｐＡＤＰＲに含まれるＤＮＡやヒストンの割合は１％以下であることが好ましい。
（ｂ）ヒストンＨ１
本発明において用いるヒストンＨ１は、ヒト由来の細胞などの試料から全ヒストンを精製した後、イオン濃度勾配により全ヒストンから分離精製することができる。例えば、ヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０細胞核より全ヒストンを単離し、０．２５Ｍ ＮａＣｌ＋２５ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（溶液Ａ）に対して透析し、可溶化する。さらに陽イオンカラムＨｉＴｒａｐ ＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、酸性（ｐＨ３．５）条件下で塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度勾配によって全ヒストンからＨ１のみを分離することができる［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８１；４３：１０１−１１０．］。
全ヒストンは、上記の溶液Ａに対して透析することで、可溶化に成功した。従来、ヒストンは通常希塩酸又は塩を含まない水溶液中でのみ溶解することが知られていたが、この状態では以下に述べるＥＬＩＳＡの系でヒストンを固相化する場合、付着率の低下をきたしていた。しかしながら、本発明において上記の溶液Ａを使用することにより、ヒストンＨ１の固相への付着効率を高めることに成功した。なお、本発明に用いるヒストンＨ１は高純度であることが好ましく、ヒストンＨ１に含まれるＤＮＡの含有量は１％以下であることが好ましい。
（ｃ）プレート
上記（ａ）で得られたｐＡＤＰＲ及び／又は上記（ｂ）で得られたヒストンＨ１は、例えば上記の溶液Ａ又はＰＢＳ等の適当なバッファーで希釈し、マイクロタイタープレート等に適量加えて４℃で一晩〜一昼夜静置して、固相（プレート）に固定して固相化する。マイクロタイタープレートは、市販のものを用いることができ、当業者であれば適宜選択することができる。例えば９６ｗｅｌｌ型のＩｍｍｕｌｏｎ ２Ｈｂを用いる場合、５０〜１００μｌのｐＡＤＰＲ及び／又はヒストンＨ１溶液を添加することができる。
また、上述のようにヒストンＨ１の希釈には、溶液Ａを用いることが好ましい。本発明は、ヒストンＨ１を、溶液Ａ（０．２５Ｍ ＮａＣｌ＋２５ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４））で希釈した後、固相に固定することを特徴とする、ヒストンＨ１の固相化方法を含む。例えば、上記（ｂ）に記載するように、全ヒストンを溶液Ａに対して透析して可溶化したものから精製したヒストンＨ１又は異なる方法で得たヒストンＨ１を、溶液Ａで希釈して、得られる希釈溶液をプレート等の固相に添加することでヒストンＨ１を固相化する方法を含む。
次に、ｐＡＤＰＲ及び／又はヒストンＨ１が固相化されたプレートをＴＢＳ（２５ｍＭ トリス，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０４％窒化ソーダ（ＮａＮ３），ｐＨ７．４）、ＰＢＳ等のバッファーで洗浄する。次に、プレート上の抗原未吸着部位を１〜５％スキムミルク又は０．５〜３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＴＢＳなどを９６ｗｅｌｌプレートの場合１００〜２００μｌ添加して、室温で１時間反応させることにより遮蔽（ブロッキング）する。その後ＴＢＳ等で１〜３回洗浄して、ＥＬＩＳＡ用抗原プレートを作製する。
本発明は、当該ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１が固相に固定された（固相化された）神経系疾患の診断又は検出用のプレート（以下、「本発明のプレート」とも言う）も含む。また、本発明のプレートの固相化、洗浄、ブロッキングの条件は、当業者であれば適宜変更することができ、上記記載した条件に限らない。また、本発明のプレートは、ｐＡＤＰＲ及び／又はヒストンＨ１が固相化されていれば良く、上記の洗浄及びブロッキング処理の有無によって限定されるものではない。
（ｄ）生体試料（検体）
本発明で用いる生体試料は、神経系疾患を検出する被験者から採取されるものである。生体試料としては、体液を用いることができ、具体的には血液、唾液、漿液、リンパ液等を用いることができ、血清であってもよい。
（ｅ）ＥＬＩＳＡ
本発明において、抗体量の測定には例えばＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法を用いることができる。
本発明において、ＥＬＩＳＡ法はまず、上記（ｃ）で得られた本発明のプレートに上記（ｄ）で得られた生体試料を添加する。添加する生体試料は、ＴＢＳやＰＢＳや生理食塩水等で希釈して添加することもできる。本発明のプレートに添加する生体試料の量は、９６ｗｅｌｌプレートの場合、５０〜１００μｌであることが好ましい。添加後、プレートを室温で１時間静置する。次にプレートをＴＢＳやＰＢＳ等のバッファーで１〜５回洗浄する。
続いて二次抗体を加え、室温で１時間反応させた後、前述のようにプレートを洗浄する。本発明において、抗体希釈は２００倍で、希釈反応液は１％ＢＳＡ、０．４％スキムミルク及び０．０２％ＮａＮ３を含有するＴＢＳにて行うことができるが、これに限定されない。二次抗体としては、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ又は抗ヒストンＨ１ ＩｇＧを検出するためには抗ヒトＩｇＧ抗体を、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ又は抗ヒストンＨ１ ＩｇＡを検出するためには抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることができる。特に、抗ヒトＩｇＧ抗体としては、ヒトＩｇＧサブクラスＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４に特異的な抗体を用いることもできる。二次抗体はビオチン、アビジン又はＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）などで標識化されたものであってもよい。
次に、二次抗体を三次抗体又は三次試薬を用いて発色等により検出する。二次抗体に、前記のビオチン又はアビジン標識抗ヒト抗体を用いる場合、三次試薬としてアルカリフォスファターゼ標識アビジン又はビオチンを用い、発色基質にはパラニトロフェニールホスフェイトを用いて発色させることができる。前記のＨＲＰ標識二次抗体を用いる場合、三次試薬としてＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を用いて発光させることができる。あるいは三次抗体としてＨＲＰなどで標識した抗体、例えば二次抗体がマウス由来ＩｇＧのときはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を、二次抗体がラット由来ＩｇＧのときはＨＲＰ抗ラットＩｇＧ抗体を用いて発光させることができる。検出は当業者であれば適宜方法を選択して実行することができる。
シグナルの検出は、プレートリーダーを用いて、発色、発光系に即した波長で吸光度を測定することで行うことができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識系の場合は４０５ｎｍにおける吸光度を、又はＨＲＰ標識系であって停止液に硫酸を用いる場合は４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、抗体価とすることができる。
（６）神経系疾患の検出
神経系疾患の検出には、二次抗体に抗ヒトＩｇＧ抗体又は抗ヒトＩｇＡ抗体を用いたときには、抗ｐＡＤＰＲ抗体（抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡを含む）及び／又は抗ヒストンＨ１抗体（抗ヒストンＨ１ ＩｇＧ、抗ヒストンＨ１ ＩｇＡを含む）の抗体価を指標とすることができる。この場合、抗ｐＡＤＰＲ抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体の抗体価が平均値よりも高いときには、神経系疾患である可能性が高い。
神経系疾患、例えばＡＤ及びＳＤＡＴの患者では、自己抗体（ここでは抗ｐＡＤＰＲ抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体）のサブクラスが主にＩｇＧ１及びＩｇＧ２である。これに対し、代表的な自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス患者の自己抗体のサブクラスはＩｇＧ２が主である。したがって、ＩｇＧ１とＩｇＧ２との比（Ｇ１／Ｇ２）を測定することにより、その値を指標として自己免疫疾患と区別して神経系疾患の検出を行うことができる。例えば、Ｇ１／Ｇ２値が高いときは、神経系疾患である可能性が高いと判断でき、Ｇ１／Ｇ２値が小さいときは、神経系疾患である可能性が小さいと判断することができる。
（７）キット
本発明のキットは、神経系疾患の検出方法の実施に用いる本発明のプレートを含むものである。本発明のキットは、本発明の方法の実施に必要な要素をさらに含んでいても良い。そのような要素としては、例えば、生体試料を遠心処理するためのチューブ、プレート洗浄用のバッファー（例えばＴＢＳ、ＰＢＳ、溶液Ａ）、ブロッキング用の溶液、二次抗体、二次抗体希釈用溶液、標準用抗ｐＡＤＰＲ抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体、発色又は発光反応液、発色停止液、チップ、チューブなどが挙げられる。
３．神経系疾患の診断方法
本発明は、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする神経系疾患の診断方法を提供する。本発明の診断方法は、上記２．の神経系疾患の検出結果を利用して診断することができる。
神経系疾患の診断は、二次抗体に抗ヒトＩｇＧ抗体又は抗ヒトＩｇＡ抗体を用いたときには、抗ｐＡＤＰＲ抗体（抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡを含む）及び／又は抗ヒストンＨ１抗体（抗ヒストンＨ１ ＩｇＧ、抗ヒストンＨ１ ＩｇＡを含む）の抗体価を指標とすることができる。この場合、抗ｐＡＤＰＲ抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体の抗体価が健常人の値よりも高いときには、生体試料を提供した患者は神経系疾患を罹患している可能性が高いと判断することができる。
あるいは、神経系疾患の診断は、二次抗体に抗ヒトＩｇＧサブクラス特異的な抗体を用いてＧ１／Ｇ２を測定したときに、その値を指標とすることができる。例えばＧ１／Ｇ２値がＳＬＥ患者よりも大きいときには、当該試料の由来の患者は、ＳＬＥではなく神経系疾患を罹患している可能性が高いと判断することができる。
また、神経系疾患の患者では、抗Ｈ１抗体の産生量と抗ｐＡＤＰＲ抗体の産生量とが相関関係を示す。この関係は、抗Ｈ１抗体陽性の患者では、抗ｐＡＤＰＲ抗体産生が認められ、逆もまた成り立つことを意味する。このことを利用して、抗ｐＡＤＰＲ抗体価が高いことで知られるＳＬＥ患者との差別化を図ることができる。例えば、抗ｐＡＤＰＲ抗体が陽性であって、抗Ｈ１抗体も陽性の場合は、神経系疾患をＳＬＥから区別することができる。したがって、抗ｐＡＤＰＲ抗体だけでなく抗Ｈ１抗体を検出することで、あるいは抗Ｈ１抗体のみを検出することで、ＳＬＥと区別して神経系疾患を検出し診断することができる。
最近ＡＤ患者の脳神経細胞、とりわけ星膠細胞（アストロサイト）の細胞核におけるＡＤＰ−リボシル化活性の上昇［Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ）ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｒａｉｎ １９９９；１２２：２４７−２５３］、及び星膠細胞膜におけるヒストンＨ１の高発現［Ｂｏｌｔｏｎ ＳＪ，Ｒｕｓｓｅｌａｋｉｓ−Ｃａｒｎｅｉｒｏ Ｍ，Ｂｅｔｍｏｕｎｉ Ｓ，Ｐｅｒｒｙ，ＶＨ．Ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅａｒ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｉｓ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｐｒｉｏｎ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９９９；２５：４２５−４３２．］に関して報告がされている。この二つの現象には密接な関係のあることが知られている。ＡＤＰ−リボシル化反応は、主にタンパク質に生じる現象であり［Ｈａｙａｉｓｈｉ Ｏ，Ｕｅｄａ Ｋ．Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ａｎｄ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７７；４６：９５−１１６］、タンパク質の修飾反応として知られている。修飾、つまりＡＤＰリボシル化される代表的なタンパク質がヒストンＨ１である。Ｈ１は、核クロマチン、及びその構成単位であるヌクレオソーム（ＮＳ）の凝縮のために重要な働きを演じている。そのＨ１がＡＤＰ−リボシル化されると、その度合いによってクロマチンがタイトになったり、ルーズになったりする［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｉｔｓｕ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８０；８８：９１７−９２０］。このことは、クロマチンのＡＤＰリボシル化反応が遺伝子発現の調節に深く関わり、また発ガン物質などでＤＮＡが切断された場合にそれを修復する作用を有することを意味する［Ｖｉｒａｇ Ｌ，Ｓｕｚａｂｏ Ｃ．Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｒｅｖ ２００２；５４：３７５−４２９］。さらに、近い将来において、ＡＤＰ−リボシル化反応は、加齢と細胞核クロマチンの機能的、形態的変化とも深く関わってくるものと考えられる。
本発明者は、ＡＤＰ−リボシル化の延長反応で合成されるポリＡＤＰ−リボース（「ｐＡＤＰＲ」という）が、塩基性タンパク質と荷電結合すると、マウスやウサギに抗ｐＡＤＰＲ抗体を産生させることを初めて報告した［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｍｉｗａ Ｍ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ｔ．Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｐｏｌｙ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｉｂｏｓｅ）ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９７４；５９：３００−３０６］。さらに、ＡＤＰ−リボシル化反応を受けたヒストンでウサギを免疫すると、抗ヒストン抗体と抗ｐＡＤＰＲ抗体が同時に産生され、未修飾ヒストンで免疫した場合と比べてはるかに強力な抗体が産生されることを見出した［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８１；４３：１０１−１１０．、Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｎ：ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｈａｙａｉｓｈｉ Ｏ，Ｕｅｄａ Ｋ ｅｄｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８２：ｐｐ．５３３−５４６］。
以上のような本発明者の研究実績から、本発明者はＡＤ患者アストロサイト膜表面に発現されているヒストンＨ１はＡＤＰ−リボシル化されている可能性が高いと想定し、ＡＤ患者血中の抗ヒストンＨ１抗体と抗ｐＡＤＰＲ抗体を測定するに至った。
一方、免疫学的な見地とは別に、脳の虚血などの血流障害後に生じる神経細胞の修復には、ポリＡＤＰ−リボシル化が深く関与することが知られている［Ｓｚａｂｏ Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ ＶＤ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １９９８；１９：２８７−２９８］。この場合は、ＤＮＡ障害の修復のためにＡＤＰ−リボシル化反応が過度に促進する結果、ＮＡＤが枯渇して細胞死を誘導し、脳の変性に加担することになる。このような脳の虚血・血流障害時にＰＡＲＰ（ｐＡＤＰＲ合成酵素）の阻害剤を投与すると神経細胞死や変性を抑制できることから、ＰＡＲＰの阻害剤の開発が積極的に行われている［Ｖｉｒａｇ Ｌ，Ｓｕｚａｂｏ Ｃ．Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ Ｒｅｖ ２００２；５４：３７５−４２９］。これを裏付けるように、ＰＡＲＰのノックアウトマウスでは脳の血流障害に伴う神経細胞死が抑制されることが報告されている［Ｅｌｌａｓｓｏｎ ＭＪＬ，Ｓａｍｐｅｉ Ｋ，Ｍａｎｄｉｒ ＡＳ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｒｅｎｄｅｒｓ ｍｉｃｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ １９９７；３：１０８９−１０９５］。
以上を総括すると、ＡＤでは脳でのＡＤＰ−リボシル化が促進し、ｐＡＤＰＲが脳に沈着することが予測される。なお、最近ではＡＤＰ−リボシル化のターゲット分子はＨ１よりもＰＡＲＰのほうが頻度が高いといわれている［Ｌｉｎｄｈａｌ Ｔ，Ｓａｔｏｈ Ｍ，Ｐｏｉｒｉｅｒ ＧＧ，Ｋｌｕｎｇｌａｎｄ Ａ．Ｐｏｓｔｔｒａｎｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １９９５；２０：４０４−４１１］。加齢にともなって予想される脳関門の緩和は、ｐＡＤＰＲの血中への漏洩をもたらし、ひいては免疫系に接触する機会を増加させることになり、ＡＤにおいてｐＡＤＰＲに対する免疫応答を調べる理論的根拠は極めて高い。
２．神経系疾患の検出方法
本発明は、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする神経系疾患の検出方法を提供する。つまり、本方法は、生体試料中の抗ポリＡＤＰ−リボース抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体の量を、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１を用いて検出することにより、神経系疾患を検出する方法である。
（１）神経系疾患
本発明において神経系疾患とは、ＡＤＰリボシル化が関与する神経系の疾患を広く含むものであり、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）及びアルツハイマー型老年痴呆症（ＳＤＡＴ）が含まれる。特に、本方法は疾患時に抗ポリＡＤＰ−リボース抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体の発現が確認される疾患において有用である。
（２）ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨＩと生体試料との反応と抗体の検出
本発明の方法は、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１が固相化されたプレートに、生体試料を添加して反応させ、試料中の抗ポリＡＤＰ−リボース抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体を検出するものである。
（ａ）ポリＡＤＰ−リボース（ｐＡＤＰＲ）
本発明において用いるポリＡＤＰ−リボースは、ＡＤＰ−リボース（図１）が複数（図１「ｎ」）結合したものである。図１中、「Ｒ」はリボース、「Ｐ」はリン酸基及び「Ａｄ」はアデニンを示す。ｐＡＤＰＲは、ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＮＡＤ）やＮＡＤ＋から合成することができる。例えば、ＮＡＤを基質として、仔牛胸腺核を酵素源として合成し、精製して得ることができる［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｉｔｓｕ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８０；８８：９１７−９２０］。本発明で用いられるポリＡＤＰ−リボースは抗ポリＡＤＰ−リボース抗体に認識される限りその長さは限定されないが、平均鎖長は１０〜５０、好ましくは２０〜４０、より好ましくは３０である。なお、本発明に用いるｐＡＤＰＲは高純度であることが好ましく、ｐＡＤＰＲに含まれるＤＮＡやヒストンの割合は１％以下であることが好ましい。
（ｂ）ヒストンＨ１
本発明において用いるヒストンＨ１は、ヒト由来の細胞などの試料から全ヒストンを精製した後、イオン濃度勾配により全ヒストンから分離精製することができる。例えば、ヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０細胞核より全ヒストンを単離し、０．２５Ｍ ＮａＣｌ＋２５ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（溶液Ａ）に対して透析し、可溶化する。さらに陽イオンカラムＨｉＴｒａｐ ＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、酸性（ｐＨ３．５）条件下で塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度勾配によって全ヒストンからＨ１のみを分離することができる［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８１；４３：１０１−１１０．］。
全ヒストンは、上記の溶液Ａに対して透析することで、可溶化に成功した。従来、ヒストンは通常希塩酸又は塩を含まない水溶液中でのみ溶解することが知られていたが、この状態では以下に述べるＥＬＩＳＡの系でヒストンを固相化する場合、付着率の低下をきたしていた。しかしながら、本発明において上記の溶液Ａを使用することにより、ヒストンＨ１の固相への付着効率を高めることに成功した。なお、本発明に用いるヒストンＨ１は高純度であることが好ましく、ヒストンＨ１に含まれるＤＮＡの含有量は１％以下であることが好ましい。
（ｃ）プレート
上記（ａ）で得られたｐＡＤＰＲ及び／又は上記（ｂ）で得られたヒストンＨ１は、例えば上記の溶液Ａ又はＰＢＳ等の適当なバッファーで希釈し、マイクロタイタープレート等に適量加えて４℃で一晩〜一昼夜静置して、固相（プレート）に固定して固相化する。マイクロタイタープレートは、市販のものを用いることができ、当業者であれば適宜選択することができる。例えば９６ｗｅｌｌ型のＩｍｍｕｌｏｎ ２Ｈｂを用いる場合、５０〜１００μｌのｐＡＤＰＲ及び／又はヒストンＨ１溶液を添加することができる。
また、上述のようにヒストンＨ１の希釈には、溶液Ａを用いることが好ましい。本発明は、ヒストンＨ１を、溶液Ａ（０．２５Ｍ ＮａＣｌ＋２５ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４））で希釈した後、固相に固定することを特徴とする、ヒストンＨ１の固相化方法を含む。例えば、上記（ｂ）に記載するように、全ヒストンを溶液Ａに対して透析して可溶化したものから精製したヒストンＨ１又は異なる方法で得たヒストンＨ１を、溶液Ａで希釈して、得られる希釈溶液をプレート等の固相に添加することでヒストンＨ１を固相化する方法を含む。
次に、ｐＡＤＰＲ及び／又はヒストンＨ１が固相化されたプレートをＴＢＳ（２５ｍＭ トリス，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０４％窒化ソーダ（ＮａＮ３），ｐＨ７．４）、ＰＢＳ等のバッファーで洗浄する。次に、プレート上の抗原未吸着部位を１〜５％スキムミルク又は０．５〜３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＴＢＳなどを９６ｗｅｌｌプレートの場合１００〜２００μｌ添加して、室温で１時間反応させることにより遮蔽（ブロッキング）する。その後ＴＢＳ等で１〜３回洗浄して、ＥＬＩＳＡ用抗原プレートを作製する。
本発明は、当該ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１が固相に固定された（固相化された）神経系疾患の診断又は検出用のプレート（以下、「本発明のプレート」とも言う）も含む。また、本発明のプレートの固相化、洗浄、ブロッキングの条件は、当業者であれば適宜変更することができ、上記記載した条件に限らない。また、本発明のプレートは、ｐＡＤＰＲ及び／又はヒストンＨ１が固相化されていれば良く、上記の洗浄及びブロッキング処理の有無によって限定されるものではない。
（ｄ）生体試料（検体）
本発明で用いる生体試料は、神経系疾患を検出する被験者から採取されるものである。生体試料としては、体液を用いることができ、具体的には血液、唾液、漿液、リンパ液等を用いることができ、血清であってもよい。
（ｅ）ＥＬＩＳＡ
本発明において、抗体量の測定には例えばＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法を用いることができる。
本発明において、ＥＬＩＳＡ法はまず、上記（ｃ）で得られた本発明のプレートに上記（ｄ）で得られた生体試料を添加する。添加する生体試料は、ＴＢＳやＰＢＳや生理食塩水等で希釈して添加することもできる。本発明のプレートに添加する生体試料の量は、９６ｗｅｌｌプレートの場合、５０〜１００μｌであることが好ましい。添加後、プレートを室温で１時間静置する。次にプレートをＴＢＳやＰＢＳ等のバッファーで１〜５回洗浄する。
続いて二次抗体を加え、室温で１時間反応させた後、前述のようにプレートを洗浄する。本発明において、抗体希釈は２００倍で、希釈反応液は１％ＢＳＡ、０．４％スキムミルク及び０．０２％ＮａＮ３を含有するＴＢＳにて行うことができるが、これに限定されない。二次抗体としては、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ又は抗ヒストンＨ１ ＩｇＧを検出するためには抗ヒトＩｇＧ抗体を、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ又は抗ヒストンＨ１ ＩｇＡを検出するためには抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることができる。特に、抗ヒトＩｇＧ抗体としては、ヒトＩｇＧサブクラスＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４に特異的な抗体を用いることもできる。二次抗体はビオチン、アビジン又はＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）などで標識化されたものであってもよい。
次に、二次抗体を三次抗体又は三次試薬を用いて発色等により検出する。二次抗体に、前記のビオチン又はアビジン標識抗ヒト抗体を用いる場合、三次試薬としてアルカリフォスファターゼ標識アビジン又はビオチンを用い、発色基質にはパラニトロフェニールホスフェイトを用いて発色させることができる。前記のＨＲＰ標識二次抗体を用いる場合、三次試薬としてＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を用いて発光させることができる。あるいは三次抗体としてＨＲＰなどで標識した抗体、例えば二次抗体がマウス由来ＩｇＧのときはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を、二次抗体がラット由来ＩｇＧのときはＨＲＰ抗ラットＩｇＧ抗体を用いて発光させることができる。検出は当業者であれば適宜方法を選択して実行することができる。
シグナルの検出は、プレートリーダーを用いて、発色、発光系に即した波長で吸光度を測定することで行うことができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識系の場合は４０５ｎｍにおける吸光度を、又はＨＲＰ標識系であって停止液に硫酸を用いる場合は４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、抗体価とすることができる。
（６）神経系疾患の検出
神経系疾患の検出には、二次抗体に抗ヒトＩｇＧ抗体又は抗ヒトＩｇＡ抗体を用いたときには、抗ｐＡＤＰＲ抗体（抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡを含む）及び／又は抗ヒストンＨ１抗体（抗ヒストンＨ１ ＩｇＧ、抗ヒストンＨ１ ＩｇＡを含む）の抗体価を指標とすることができる。この場合、抗ｐＡＤＰＲ抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体の抗体価が平均値よりも高いときには、神経系疾患である可能性が高い。
神経系疾患、例えばＡＤ及びＳＤＡＴの患者では、自己抗体（ここでは抗ｐＡＤＰＲ抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体）のサブクラスが主にＩｇＧ１及びＩｇＧ２である。これに対し、代表的な自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス患者の自己抗体のサブクラスはＩｇＧ２が主である。したがって、ＩｇＧ１とＩｇＧ２との比（Ｇ１／Ｇ２）を測定することにより、その値を指標として自己免疫疾患と区別して神経系疾患の検出を行うことができる。例えば、Ｇ１／Ｇ２値が高いときは、神経系疾患である可能性が高いと判断でき、Ｇ１／Ｇ２値が小さいときは、神経系疾患である可能性が小さいと判断することができる。
（７）キット
本発明のキットは、神経系疾患の検出方法の実施に用いる本発明のプレートを含むものである。本発明のキットは、本発明の方法の実施に必要な要素をさらに含んでいても良い。そのような要素としては、例えば、生体試料を遠心処理するためのチューブ、プレート洗浄用のバッファー（例えばＴＢＳ、ＰＢＳ、溶液Ａ）、ブロッキング用の溶液、二次抗体、二次抗体希釈用溶液、標準用抗ｐＡＤＰＲ抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体、発色又は発光反応液、発色停止液、チップ、チューブなどが挙げられる。
３．神経系疾患の診断方法
本発明は、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする神経系疾患の診断方法を提供する。本発明の診断方法は、上記２．の神経系疾患の検出結果を利用して診断することができる。
神経系疾患の診断は、二次抗体に抗ヒトＩｇＧ抗体又は抗ヒトＩｇＡ抗体を用いたときには、抗ｐＡＤＰＲ抗体（抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＧ、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡを含む）及び／又は抗ヒストンＨ１抗体（抗ヒストンＨ１ ＩｇＧ、抗ヒストンＨ１ ＩｇＡを含む）の抗体価を指標とすることができる。この場合、抗ｐＡＤＰＲ抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体の抗体価が健常人の値よりも高いときには、生体試料を提供した患者は神経系疾患を罹患している可能性が高いと判断することができる。
あるいは、神経系疾患の診断は、二次抗体に抗ヒトＩｇＧサブクラス特異的な抗体を用いてＧ１／Ｇ２を測定したときに、その値を指標とすることができる。例えばＧ１／Ｇ２値がＳＬＥ患者よりも大きいときには、当該試料の由来の患者は、ＳＬＥではなく神経系疾患を罹患している可能性が高いと判断することができる。
また、神経系疾患の患者では、抗Ｈ１抗体の産生量と抗ｐＡＤＰＲ抗体の産生量とが相関関係を示す。この関係は、抗Ｈ１抗体陽性の患者では、抗ｐＡＤＰＲ抗体産生が認められ、逆もまた成り立つことを意味する。このことを利用して、抗ｐＡＤＰＲ抗体価が高いことで知られるＳＬＥ患者との差別化を図ることができる。例えば、抗ｐＡＤＰＲ抗体が陽性であって、抗Ｈ１抗体も陽性の場合は、神経系疾患をＳＬＥから区別することができる。したがって、抗ｐＡＤＰＲ抗体だけでなく抗Ｈ１抗体を検出することで、あるいは抗Ｈ１抗体のみを検出することで、ＳＬＥと区別して神経系疾患を検出し診断することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
抗ｐＡＤＰＲ抗体及び抗Ｈ１抗体を用いたＡＤ又はＳＤＡＴの診断方法
１−１．方法
（１）ｐＡＤＰＲの合成と精製
本発明者が開発した方法［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｉｔｓｕ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８０；８８：９１７−９２０］により、仔牛胸腺核を酵素源とし、ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＮＡＤ）を基質としてｐＡＤＰＲを合成、精製した。ｐＡＤＰＲの平均鎖長は３０とした。この手法で精製されたポリマーに含まれるＤＮＡやヒストンの割合は１％以下である。
（２）ヒストンＨ１の精製
全ヒストンの精製は本発明者が開発した方法［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８１；４３：１０１−１１０．］を用いた。
すなわち、ヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０細胞核より全ヒストンを単離し、さらに陽イオンカラムＨｉＴｒａｐ ＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、酸性（ｐＨ３．５）条件下でＮａＣｌの濃度勾配によって全ヒストンからＨ１のみを分離した。
全ヒストンは、０．２５Ｍ ＮａＣｌ＋２５ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（溶液Ａ）に対して透析し、可溶化に成功した。なお、得られたＨ１標品に含まれるＤＮＡの含有量は１％以下であった。
（３）抗ｐＡＤＰＲ抗体測定法
抗ｐＡＤＰＲ抗体は、固相酵素抗体法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）にて測定した。
Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢマイクロタイタープレートを固相とし、ｐＡＤＰＲは溶液Ａで１μｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルに５０μｌ加え４℃で一昼夜静置した。その後、ＴＢＳ（２５ｍＭ トリス，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０４％窒化ソーダ（ＮａＮ３），ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで２％スキムミルク含有ＴＢＳにて室温で１時間反応させ、抗原未吸着部位を遮蔽した。最後にＴＢＳで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ用抗原プレートを作製した。
血清希釈は２００倍とし、希釈反応液は、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．４％スキムミルク、及び０．０２％ＮａＮ３を含有するＴＢＳにて行った。
二次抗体には、ビオチン標識抗ヒトサブクラス（Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４）特異的抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を使用した。また、第三次試薬としてアルカリフォスファターゼ標識アビジン（Ｚｙｍｅｄ社）を用い、発色用基質にはパラニトロフェニールホスフェイトを用いた。抗体価はＡ４０５で表した。
（４）抗Ｈ１抗体測定法
抗Ｈ１抗体の測定は、使用する抗原をＨ１としたこと以外は、抗ｐＡＤＰＲ抗体測定法に準じて行った。
（５）検体
６例のＡＤ及び２０例のＳＤＡＴを試験群とした。対照群として、ＡＤ及びＳＤＡＴのいずれでもない高齢者５９例（平均年齢７７±７歳）、４０例の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者、及び６０歳以下の健常人２７例を使用した。試験群及び対照群の血清を検体としてＥＬＩＳＡに使用した。ＡＤ及びＳＤＡＴの診断は、ＤＭＳ−ＩＶ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，４ｔｈ ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９４）に従い、またＳＬＥの診断はアメリカリウマチ学会診断基準（Ｕｐｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＬＥ（１９９７））に従って行った。
１−２．結果
ＡＤと抗ｐＡＤＰＲ抗体及び抗Ｈ１抗体との関係：
ＡＤ患者及びＳＤＡＴ患者をあわせた２６例の結果を図２に示す。ＳＬＥ患者４０例の結果を図３に示す。
抗ｐＡＤＰＲ抗体については、６例のＡＤ中６例（１００％）が陽性を示し、またＳＤＡＴでは２０例中１５例（７５％）が陽性を示した（図２「Ａｎｔｉ−ｐＡＤＰＲ」）。また抗Ｈ１抗体については、ＡＤで５０％（３／６）、ＳＤＡＴで６５％（１３／２０）が陽性であった（図２「Ａｎｔｉ−Ｈ１」）。図２及び図３中のカラムは健常人の平均値（縦軸）及び２ＳＤ（横軸）を示す。
なお、ＡＤ患者及びＳＤＡＴ患者において抗Ｈ１陽性者は抗ｐＡＤＰＲ抗体も全て陽性であり、相関係数（ｒ）は０．７６８となった（図４）。一方、抗ｐＡＤＰＲ抗体価が高いことで知られるＳＬＥ患者［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｉｔｓｕ Ｙ，Ｍｉｗａ Ｍ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ｔ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ １９７７；２６５：１７５−１７７］４０症例で同様の検査を行ったところ、その相関係数は０．１８４となり、有意の差（ｐ＜０．０１）をもって低値を示した（図３及び図５）。
以上の結果は、ＡＤあるいはＳＤＡＴ患者の生体内、特に脳でヒストンＨ１がｐＡＤＰＲで修飾されていることを示唆するとともに、抗Ｈ１及び抗ｐＡＤＰＲ抗体の産生機構が膠原病ＳＬＥ患者と異なることを示している。さらに特記すべきことは、２〜３の症例で調べた結果、自己抗体のサブクラスがＳＬＥではＩｇＧ２、一方ＡＤ／ＳＤＡＴではＩｇＧ１とＩｇＧ２の両者であった。このことは、ＡＤ／ＳＤＡＴ患者とＳＬＥ患者との間で自己抗体産生機構に差があることをさらに支持するものである。従って、Ｇ１／Ｇ２比はＡＤやＳＤＡＴといった神経系疾患の診断上、有力な指標になると言える。
［実施例２］
抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡの測定によるＡＤ診断方法
２−１．方法
（１）抗ｐＡＤＰＲ抗体測定法
抗ｐＡＤＰＲ抗体は、固相酵素抗体法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）にて測定した。
ＥＬＩＳＡ用抗原プレートは実施例１（３）で作製したものを使用した。
ＥＬＩＳＡ用抗原プレートを洗浄液（０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０；ｐＨ７．４）で３回洗浄した。プレートに反応用溶液（０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１０％ＮＣＳ；ｐＨ７．４）を５０μｌ／ｗｅｌｌ、検体を５μｌ／ｗｅｌｌ分注した。検体は、検体１０μｌを反応用溶液２００μｌで２１倍に希釈したものを使用した。プレートを振とう後、プレート表面をシールし、４℃で一晩湿潤環境下にて反応させた。反応後プレートを洗浄液で３回洗浄し、二次抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌ分注し、プレート表面をシールして室温で、６０分湿潤環境で反応させた。反応後、プレートを洗浄液で３回洗浄した後、基質のＴＭＢ（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ Ｔ０４４０）を５０μｌ／ｗｅｌｌ分注し、プレート表面をシールし、室温で１０〜１５分暗所にて反応させた。続いて、反応停止液［１Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ａｂｂｏｔｔ ７２１２）］を５０μｌ／ｗｅｌｌ分注し、反応を停め、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（２）二次抗体
二次抗体には、ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｍｏｎｏｓａｎ＃ＰＳ１０４Ｐ）、ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｍｏｎｏｓａｎ＃ＰＳ１０６Ｐ）を反応用溶液で各々１０００倍希釈したものを使用した。
（３）検体
健常人（Ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）血清（１０検体）として、市販血清から５０歳以上を選択して使用した。ＡＤ患者血清（４７検体）として、市販血清を使用した。
２−２．結果
結果を表１及び図６に示す。
（１）ＩｇＧ測定系
ＲＯＣ曲線（ｒｅｃｅｉｖｅ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ；受診者動作特性曲線）からｃｕｔ−ｏｆｆ値を０．７に設定すると、ＡＤ患者血清で３４／４６（７４％）の検出率となったが、１２／４６（２６％）が偽陰性（ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）（表１及び図６「ＡＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ（ＩｇＧ）」）、また、健常人血清の内、４／１０（４０％）が偽陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）となった（表１及び図６「Ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ（ＩｇＧ）」）。正診率（ａｃｃｕｒａｃｙ）は、７１％であった（表１、図６）。
（２）ＩｇＡ測定系
ＩｇＡ測定系は、ＲＯＣ曲線からｃｕｔ−ｏｆｆ値を０．１に設定すると、ＡＤ患者血清の内、２２／４７（４６．８％）が偽陰性となり（表１及び図６「ＡＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ（ＩｇＡ）」）、健常人血清の内、４／１０（４０％）が偽陽性となった（表１及び図６「Ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ（ＩｇＡ）」）。正診率は、５４．５％となる（表１、図６）。
一般的に、ＩｇＡは血清中でＩｇＧに次いで多量に存在し、血中以外に唾液、漿液中に存在することが知られている。血清中の抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ抗体が測定できたことで、この測定系が唾液にも応用できる可能性が示唆された。また、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ、抗Ｈ１ ＩｇＡを測定することにより、その値を指標として被験患者がＡＤ又はＳＤＡＴであるのかを判断することができる。
産業上の利用の可能性
本発明の方法は、抗ポリＡＤＰ−リボース抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体の産生を指標に用いており、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１を固相化したＥＬＩＳＡ系によって、簡便に当該抗体の産生を検出できる。このため、神経系疾患を検出し、診断することが容易になった。
また、ＩｇＧサブクラスであるＧ１／Ｇ２比を算出することで、又は抗ポリＡＤＰ−リボース抗体及び抗ヒストンＨ１抗体若しくは抗ヒストンＨ１抗体を検出することで、自己免疫疾患であるＳＬＥと区別して神経系疾患を検出し診断することが可能となった。
また、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ、抗Ｈ１ ＩｇＡを用いて神経系疾患を検出し診断することが可能となった。
明細書中の参考文献は、全体を通して本明細書に組み込まれるものとする。
［実施例１］
抗ｐＡＤＰＲ抗体及び抗Ｈ１抗体を用いたＡＤ又はＳＤＡＴの診断方法
１−１．方法
（１）ｐＡＤＰＲの合成と精製
本発明者が開発した方法［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｉｔｓｕ Ｈ，Ｔａｎａｋａ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８０；８８：９１７−９２０］により、仔牛胸腺核を酵素源とし、ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＮＡＤ）を基質としてｐＡＤＰＲを合成、精製した。ｐＡＤＰＲの平均鎖長は３０とした。この手法で精製されたポリマーに含まれるＤＮＡやヒストンの割合は１％以下である。
（２）ヒストンＨ１の精製
全ヒストンの精製は本発明者が開発した方法［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９８１；４３：１０１−１１０．］を用いた。
すなわち、ヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０細胞核より全ヒストンを単離し、さらに陽イオンカラムＨｉＴｒａｐ ＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、酸性（ｐＨ３．５）条件下でＮａＣｌの濃度勾配によって全ヒストンからＨ１のみを分離した。
全ヒストンは、０．２５Ｍ ＮａＣｌ＋２５ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（溶液Ａ）に対して透析し、可溶化に成功した。なお、得られたＨ１標品に含まれるＤＮＡの含有量は１％以下であった。
（３）抗ｐＡＤＰＲ抗体測定法
抗ｐＡＤＰＲ抗体は、固相酵素抗体法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）にて測定した。
Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢマイクロタイタープレートを固相とし、ｐＡＤＰＲは溶液Ａで１μｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルに５０μｌ加え４℃で一昼夜静置した。その後、ＴＢＳ（２５ｍＭ トリス，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０４％窒化ソーダ（ＮａＮ３），ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで２％スキムミルク含有ＴＢＳにて室温で１時間反応させ、抗原未吸着部位を遮蔽した。最後にＴＢＳで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ用抗原プレートを作製した。
血清希釈は２００倍とし、希釈反応液は、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．４％スキムミルク、及び０．０２％ＮａＮ３を含有するＴＢＳにて行った。
二次抗体には、ビオチン標識抗ヒトサブクラス（Ｇ１，Ｇ２，Ｇ３，Ｇ４）特異的抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を使用した。また、第三次試薬としてアルカリフォスファターゼ標識アビジン（Ｚｙｍｅｄ社）を用い、発色用基質にはパラニトロフェニールホスフェイトを用いた。抗体価はＡ４０５で表した。
（４）抗Ｈ１抗体測定法
抗Ｈ１抗体の測定は、使用する抗原をＨ１としたこと以外は、抗ｐＡＤＰＲ抗体測定法に準じて行った。
（５）検体
６例のＡＤ及び２０例のＳＤＡＴを試験群とした。対照群として、ＡＤ及びＳＤＡＴのいずれでもない高齢者５９例（平均年齢７７±７歳）、４０例の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者、及び６０歳以下の健常人２７例を使用した。試験群及び対照群の血清を検体としてＥＬＩＳＡに使用した。ＡＤ及びＳＤＡＴの診断は、ＤＭＳ−ＩＶ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，４ｔｈ ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９４）に従い、またＳＬＥの診断はアメリカリウマチ学会診断基準（Ｕｐｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＬＥ（１９９７））に従って行った。
１−２．結果
ＡＤと抗ｐＡＤＰＲ抗体及び抗Ｈ１抗体との関係：
ＡＤ患者及びＳＤＡＴ患者をあわせた２６例の結果を図２に示す。ＳＬＥ患者４０例の結果を図３に示す。
抗ｐＡＤＰＲ抗体については、６例のＡＤ中６例（１００％）が陽性を示し、またＳＤＡＴでは２０例中１５例（７５％）が陽性を示した（図２「Ａｎｔｉ−ｐＡＤＰＲ」）。また抗Ｈ１抗体については、ＡＤで５０％（３／６）、ＳＤＡＴで６５％（１３／２０）が陽性であった（図２「Ａｎｔｉ−Ｈ１」）。図２及び図３中のカラムは健常人の平均値（縦軸）及び２ＳＤ（横軸）を示す。
なお、ＡＤ患者及びＳＤＡＴ患者において抗Ｈ１陽性者は抗ｐＡＤＰＲ抗体も全て陽性であり、相関係数（ｒ）は０．７６８となった（図４）。一方、抗ｐＡＤＰＲ抗体価が高いことで知られるＳＬＥ患者［Ｋａｎａｉ Ｙ，Ｋａｗａｍｉｔｓｕ Ｙ，Ｍｉｗａ Ｍ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ｔ，Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ．Ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ １９７７；２６５：１７５−１７７］４０症例で同様の検査を行ったところ、その相関係数は０．１８４となり、有意の差（ｐ＜０．０１）をもって低値を示した（図３及び図５）。
以上の結果は、ＡＤあるいはＳＤＡＴ患者の生体内、特に脳でヒストンＨ１がｐＡＤＰＲで修飾されていることを示唆するとともに、抗Ｈ１及び抗ｐＡＤＰＲ抗体の産生機構が膠原病ＳＬＥ患者と異なることを示している。さらに特記すべきことは、２〜３の症例で調べた結果、自己抗体のサブクラスがＳＬＥではＩｇＧ２、一方ＡＤ／ＳＤＡＴではＩｇＧ１とＩｇＧ２の両者であった。このことは、ＡＤ／ＳＤＡＴ患者とＳＬＥ患者との間で自己抗体産生機構に差があることをさらに支持するものである。従って、Ｇ１／Ｇ２比はＡＤやＳＤＡＴといった神経系疾患の診断上、有力な指標になると言える。
［実施例２］
抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡの測定によるＡＤ診断方法
２−１．方法
（１）抗ｐＡＤＰＲ抗体測定法
抗ｐＡＤＰＲ抗体は、固相酵素抗体法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）にて測定した。
ＥＬＩＳＡ用抗原プレートは実施例１（３）で作製したものを使用した。
ＥＬＩＳＡ用抗原プレートを洗浄液（０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０；ｐＨ７．４）で３回洗浄した。プレートに反応用溶液（０．０２５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、１０％ＮＣＳ；ｐＨ７．４）を５０μｌ／ｗｅｌｌ、検体を５μｌ／ｗｅｌｌ分注した。検体は、検体１０μｌを反応用溶液２００μｌで２１倍に希釈したものを使用した。プレートを振とう後、プレート表面をシールし、４℃で一晩湿潤環境下にて反応させた。反応後プレートを洗浄液で３回洗浄し、二次抗体を５０μｌ／ｗｅｌｌ分注し、プレート表面をシールして室温で、６０分湿潤環境で反応させた。反応後、プレートを洗浄液で３回洗浄した後、基質のＴＭＢ（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ Ｔ０４４０）を５０μｌ／ｗｅｌｌ分注し、プレート表面をシールし、室温で１０〜１５分暗所にて反応させた。続いて、反応停止液［１Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ａｂｂｏｔｔ ７２１２）］を５０μｌ／ｗｅｌｌ分注し、反応を停め、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（２）二次抗体
二次抗体には、ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｍｏｎｏｓａｎ＃ＰＳ１０４Ｐ）、ＨＲＰ標識した抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｍｏｎｏｓａｎ＃ＰＳ１０６Ｐ）を反応用溶液で各々１０００倍希釈したものを使用した。
（３）検体
健常人（Ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）血清（１０検体）として、市販血清から５０歳以上を選択して使用した。ＡＤ患者血清（４７検体）として、市販血清を使用した。
２−２．結果
結果を表１及び図６に示す。
ＲＯＣ曲線（ｒｅｃｅｉｖｅ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ；受診者動作特性曲線）からｃｕｔ−ｏｆｆ値を０．７に設定すると、ＡＤ患者血清で３４／４６（７４％）の検出率となったが、１２／４６（２６％）が偽陰性（ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）（表１及び図６「ＡＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ（ＩｇＧ）」）、また、健常人血清の内、４／１０（４０％）が偽陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）となった（表１及び図６「Ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ（ＩｇＧ）」）。正診率（ａｃｃｕｒａｃｙ）は、７１％であった（表１、図６）。
（２）ＩｇＡ測定系
ＩｇＡ測定系は、ＲＯＣ曲線からｃｕｔ−ｏｆｆ値を０．１に設定すると、ＡＤ患者血清の内、２２／４７（４６．８％）が偽陰性となり（表１及び図６「ＡＤ ｐａｔｉｅｎｔｓ（ＩｇＡ）」）、健常人血清の内、４／１０（４０％）が偽陽性となった（表１及び図６「Ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ（ＩｇＡ）」）。正診率は、５４．５％となる（表１、図６）。
一般的に、ＩｇＡは血清中でＩｇＧに次いで多量に存在し、血中以外に唾液、漿液中に存在することが知られている。血清中の抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ抗体が測定できたことで、この測定系が唾液にも応用できる可能性が示唆された。また、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ、抗Ｈ１ ＩｇＡを測定することにより、その値を指標として被験患者がＡＤ又はＳＤＡＴであるのかを判断することができる。
産業上の利用の可能性
本発明の方法は、抗ポリＡＤＰ−リボース抗体及び／又は抗ヒストンＨ１抗体の産生を指標に用いており、ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１を固相化したＥＬＩＳＡ系によって、簡便に当該抗体の産生を検出できる。このため、神経系疾患を検出し、診断することが容易になった。
また、ＩｇＧサブクラスであるＧ１／Ｇ２比を算出することで、又は抗ポリＡＤＰ−リボース抗体及び抗ヒストンＨ１抗体若しくは抗ヒストンＨ１抗体を検出することで、自己免疫疾患であるＳＬＥと区別して神経系疾患を検出し診断することが可能となった。
また、抗ｐＡＤＰＲ ＩｇＡ、抗Ｈ１ ＩｇＡを用いて神経系疾患を検出し診断することが可能となった。
明細書中の参考文献は、全体を通して本明細書に組み込まれるものとする。
Claims (19)
- ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする、神経系疾患の検出方法。
- 生体試料が体液である請求項１記載の方法。
- 生体試料が血液、唾液、漿液及びリンパ液からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１記載の方法。
- 生体試料が血清である請求項１記載の方法。
- 神経系疾患がアルツハイマー病又はアルツハイマー型老年痴呆症である請求項１記載の方法。
- 抗体の検出が、ＩｇＧ１とＩｇＧ２との比を指標とするものである請求項１記載の方法。
- 抗体の検出が、ＩｇＧ又はＩｇＡの値を指標とするものである請求項１記載の方法。
- ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１と生体試料とを反応させて、ポリＡＤＰ−リボースに対する抗体及び／又はヒストンＨ１に対する抗体を検出することを特徴とする、神経系疾患の診断方法。
- 生体試料が体液である請求項８記載の方法。
- 生体試料が血液、唾液、漿液及びリンパ液からなる群から選択される少なくとも一つである請求項８記載の方法。
- 生体試料が血清である請求項８記載の方法。
- 神経系疾患がアルツハイマー病又はアルツハイマー型老年痴呆症である請求項８記載の方法。
- 抗体の検出が、ＩｇＧ１とＩｇＧ２との比を指標とするものである請求項８記載の方法。
- 抗体の検出が、ＩｇＧ又はＩｇＡの値を指標とするものである請求項８記載の方法。
- ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１を含む、神経系疾患の診断又は検出用キット。
- 神経系疾患がアルツハイマー病又はアルツハイマー型老年痴呆症である請求項１５記載のキット。
- ポリＡＤＰ−リボース及び／又はヒストンＨ１が固相に固定された、神経系疾患の診断又は検出用プレート。
- 神経系疾患がアルツハイマー病又はアルツハイマー型老年痴呆症である請求項１７記載のプレート。
- ヒストンＨ１を、０．２５Ｍ ＮａＣｌ及び２５ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４）からなる溶液で希釈した後、固相に固定することを特徴とする、ヒストンＨ１の固相への固相化方法。
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