JPS63121752A - 抗体測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は免疫学の分野で、特に動物の疾患等の発症の免
疫学的検定・診断に用いるための抗酸性抗原測定用試薬
に関する。

従来の技術および発明が解決しようとする問題点 生体成分のうち酸性物質たとえばポリヌクレオチド、核
酸類、およびカルシオリピンなどのホスファチジルグリ
セロールまたホスファチジルコリン等のリン脂質類に代
表されるりん酸化合物、またコンドロイチン硫酸、ヘパ
リン、デルマタン硫酸などの硫酸化合物、またシアル酸
含有のガングリオシド等のシアロ糖脂質およびシアロ糖
蛋白質などの酸性化合物に対する抗体の発見、検索によ
り、動物での種々の疾患と抗体形成との関連が。

病理学的にまた診断学的に明らかにされつつある。

抗ＤＮＡ抗体に代表される抗核抗体は３０年以上も以前
より研究され、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍ
ｉｃ　１ｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、５Ｌ
Ｅ）などの自己免疫疾患との関連性が明らかにされてき
た（金井芳之、抗ＤＮＡ抗体と疾患９代謝、毅（３）　
、　２５３〜，１９８３　）　。またヒトの自己免疫疾
患だけではなくＭＲＬ／１マウスなどのような自己免疫
疾患動物またそれ由来のハイブリドーマなどが産生ずる
抗ＤＮＡ抗体や抗ポリＡＤＰ−リボース抗体などの抗核
抗体の簡便な測定試薬も開発され、病態との関係が広範
に検討されてきている（本発明者らによる特開昭５８−
５６６９４．特開昭６０−２５３８６９．特開昭６１−
７６９５９．特開昭６１−２２１１２７参照）。

他方心筋などの動物組織のミトコンドリアの膜成分とし
であるいはトレボネーマ・バリーダム（Ｔｒｅｐｏｎｅ
ｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ＞に存在するカルシオリビンに
対する抗体が梅毒患者に発見され、長年梅毒の診断に応
用されてきた。抗カルシオリビン抗体（以下抗ＣＬ抗体
と略記する。）は他にらい病。

肝炎、またＳＬＥ　（ミッチェル　Ｄ、ロックシンら：
　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｄ、　Ｌｏｃｋｓｋｉｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メ
デイシンＴｈｅＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、」旦、１５２〜＋１９８
５）などの疾患でも検出され、固相酵素抗体法で測定さ
れている。

上記の２種類のリン酸化合物に対する抗体、即ち抗ＤＮ
Ａ抗体とカルシオリビンのようなリン脂質に対する抗体
とは交叉すると言われているが（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｄ、
　Ｌｏｃｋｓｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ、前記論文）５本発明
は抗ＣＬ抗体が抗ＤＮＡ抗体と独立した抗体であること
をＭＲＬ＃！マウス血清を用いて証明したく第１６回日
本免疫学会総会記事１９８６年、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）
。

その際本発明者は、抗体間の交叉性や特異性の証明には
、一般に言われているように、測定試料中に夾雑する各
種の抗体や抗原抗体複合物の影響・妨害をいかに排除し
て目的とする抗体の検出の感度を高め、また抗原特異性
をより明確にすることが必要であり、その手段を見出す
ために種々工夫。

検討を要した。

問題点を解決するための手段 前記の酸性抗原類に対する抗体の測定を行う場合、測定
感度と抗体間の特異性の増強およびｂｉｏ−１ｏｇｉｃ
ａｌ　ｆａｌｓｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅまたはｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　ｆａｌｓｅｐｏｓｉｔｉｖｅ　　な非特異
反応が極力避けられることなどが必須である。そのため
には測定検体である液体試料等の中に対象とする抗体と
ともに夾雑する各種の抗体やとりわけ抗原抗体複合物を
できる限り除去することが、目的にかなうことであり、
本発明者は鋭意研究を進めた結果、塩基性物質結合担体
で液体試料等を予め処理する行程を含めれば、酸性抗原
抗体複合物を特に除去できるであろうことに想到し、種
々検討したところその目的が達成されることを実証し本
発明を完成した。

本発明者は自己免疫疾患動物のＭＲＬ／７！マウ久にお
いても、ヒトＳＬＥ患者同様、抗核抗体の他、抗ＣＬ抗
体も産生されているものと考え、ＭＲＬ／１マウス血清
を採取し、本発明者らが先に開発した固相酵素抗体法（
以下Ｅｌｉｓａと略記する。）でそれぞれの抗体価を測
定した。また抗−重鎖ＤＮＡ　（以下５ｓＤＮＡと略記
する。）モノクローナル抗体ＩＡ２をＭＲＬ＃！マウス
由来ハイブリドーマより調製し、その培養口液中の抗体
も測定した。さらにまた妊娠ＳＬＥ患者の血清抗体価も
検査した。

抗核抗体の測定には抗原プレートとして特開昭５８−５
６６９４などに示された方法によりｓ　５ＤＮＡなどを
固定したＤｙｎａｔｅｃｋ　Ｉｍｍｕｌｏｎ　＃２プレ
ート上での抗体の結合活性で抗体活性を測定した。と同
時に種々の濃度の各核酸抗原を阻害剤として加え結合阻
害曲線を求めた。抗ＣＬ抗体の測定には抗原プレートと
して後記参考例１に示すような方法により作成したＣＬ
固定Ｆａｌｃｏｎプレートを用いた。

そしてこれら抗体を測定する場合において、塩基性物質
結合担体で抗体含有試料を吸収操作することによる効果
を非処理の場合と比較検討した。

塩基性物質結合担体としては代表例としてリジンセファ
ロースを使用した。市販のりジン−セファロース（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社製）は膨張、洗浄後、１０χの牛胎児
血清（以下ＦＢＳと略記する。）を含むトリス−食塩緩
衝液（以下ＴＢＳと略記する。）を加え４０分間室温で
放置し、非特異結合をブロックした。

沈澱が生じた後、上清を除去し、５χＦＢＳ　−ＴＢＳ
を加え７０ｍｇ　（乾燥重量）／ｒｔｌｌの濃度に調整
した。

次に抗体を含む試料であるハイブリドーマ培養液、マウ
ス、ヒトなどの血清に拮抗阻害剤として各濃度の核酸類
、ＣＬの希釈液を１：１の割合で混合し、２００μｌに
調整した。この混合液を９６穴マイクロプレート（Ｆａ
ｌｃｏｎ社製）上で、室温、４５分反応させた後、１５
０μｌをマイクロチューブにとり、等量の前記リジン−
セファロース担体を加えて振とうした後、４℃で９０分
放置した。次に室温で３分、　１７００ｒｐｍで遠沈し
、抗原抗体複合物を沈澱させ、その上清５０μｌをとり
Ｅｌｉｓａにより抗体量を測定した。阻害剤濃度を横軸
、プレート結合抗体量を縦軸にとり阻害曲線を描いた。

抗体を含む各々の検体につき、リジン−セファロース担
体による吸収操作の効果を非処理の場合と比較した。Ｍ
ＲＬ／　Ａマウス及びＳＬＥ患者の血清については、５
ｓＤＮＡを固定したプレートにおいても。

ＣＬを固定したプレートにおいても各々の阻害剤による
阻害率が、リジン−セファロース担体前処理の場合、非
処理の場合に比べ、各濃度で大きくかつ薬剤濃度依存的
な標準的な阻害曲線が得られた。

非処理の場合は、−旦下った曲線も阻害剤濃度が高くな
ると逆に結合抗体量が増加するｒｅｂｏｕｎｄ現象が見
られ複雑な様相を呈した（実験例１及び２）。

即わちリジン−セファロース担体により前処理すること
によって、抗原抗体複合物等が除去され、対象とする抗
体の測定がより純粋に、より妨害のない形で実施できる
ことが実証された。またＭＲＬ／βマウス由来のハイブ
リドーマより得られた抗５ｓＤＮへ抗体１八２の５ｓＤ
Ｎ八プレートへの結合の５ｓＤＮ八添加よる阻害を、リ
ジン−セファロース担体前処理と非処理とで比較したと
ころ、阻害剤濃度の全領域で前処理した場合の阻害の方
が大きいことがわかり（実験例３）８木組体による前処
理が妨害物質の除去に有用であることが示された。

本発明の酸性抗原に対する抗体の測定前処理用試薬に含
有される塩基性物質結合担体としては、リジン、ヒドロ
キシリジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチンなど
の塩基性アミノ酸、プトレッシン、スペルミジン、スペ
ルミン、カダベリンなどのジアミン、ポリアミン類、コ
リン、イツリンなどの動物アルカロイド、プロタミン、
サルミン、クルベインなどに代表される塩基性ポリペプ
チド、塩基性蛋白質、またピペラジン、ピペリジン、モ
ルホリンなどの塩基類から選ばれる塩基性物質とセファ
ロース、アガロース、セファデックス、バイオシェル、
ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレンビーズ、ヒドロ
キシアパタイト、セルロースなどの担体とを結合したも
のが用いられる。

酸性抗原の種類、量などにより上記塩基性物質結合担体
は適宜選択されるべきである。以下本発明の実施態様を
具体的に参考例、実施例、実験例をもって説明するが、
本発明はこれらには限定されない。

参考例１　抗ＣＬ抗体測定用ＣＬプレートの作成ＣＬ（
Ｓｉｇｍａ社製、牛心筋由来、Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｏ、
ｃ５６４６）のメタノール溶液からまずロータリーエバ
ポレーターでメタノールをとばし、次にリン酸緩衝液（
２０ｍＭ、　ＰＨ６，８）に懸濁した。４°Ｃで２．５
時間攪拌してミセルを作った。直ちに５０μＡ　（ＣＬ
として２０ｐ　ｇ／ｍ　Ｉｔ　）を９６穴Ｆａｌｃｏｎ
マイクロプレート３９１２゜Ｍｉｃｒｏ　Ｔｅｓｔｍ　
（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ
社製）に加え、４〜８℃で一昼夜コーティングした。次
にＴＢＳ（２５ｍＭ　）リス、１４０ｍＭ　ＮａＣ１，
ｐＨ７，４）で３回洗浄した。次に０．５％Ｔｗｅｅｎ
　２０を加えた５χＦＢＳ−ＴＢＳで１時間プレートを
ブロックした。即ちにＴＢＳで３回洗浄し、抗体測定に
使用した。

参考例２　抗５ｓＯＮ＾抗体測定用５ｓＤＮＡプレート
の作成 本発明者らの先に出願した前記特開昭５８−５６６９４
、特開昭６０−２５３８６９及び特開昭６１−２２１１
２７に記載された方法にもとすき、作成した。

実施例１　リジン−セフ１０一ス担体の処理リジン−セ
ファロース粉末１ｇを０．ＩＮ塩酸５０ｍ１に　少量ず
つ加え膨張させ、全量加えた後４０分間室温に放置した
。沈澱が生じた後、上清を除去し、沈澱　リジン−セフ
ァロースは再び０．ＩＮ塩酸５０ｍ７！と混合攪拌し、
４０分間室温放置により再度沈澱を得た。上清を除去し
、同様の操作を更に２回繰り返し洗浄を行った。上清を
除去し、１０χＦＢＳ−ＴＢＳを５０ｍ　ｌ加え、４０
分間室温で放置し非特異結合をブロックした。沈澱が生
じた後に、上清を除去し、５χＦＢＳ−ＴＢＳを加え７
０ｍｇ　　（乾燥重量）／ｍ　Ｉｌの濃度に調整した。

実施例２　リジン−セファロース担体による抗原抗体複
合物の除去 抗体を含む試料であるマウス、ヒトなどの血清およびハ
イブリドーマ培養液に核酸類、ＣＬなどの拮抗阻害剤（
原濃度５０μｇ／ｍ　１！　）の希釈液（１／１０〜１
／２０００）を１：１の割合で混合し、２００μｐに調
整した。この混合液を９６穴マイクロプレート（Ｆａｌ
ｃｏｎ社製）上で、室温４５分反応させた後、１５０μ
ｌをマイクロチューブにとり、等量の実施例１で得たり
ジン−セファロース担体を加えて振とうした後、４℃で
９０分間放置した。次に室温で３分、１７００ｒｐｍで
遠沈し、抗原抗体複合物を沈澱させた。

実施例３　抗原プレート結合抗体量の測定実施例２で抗
原抗体複合物を沈澱させたその上清５０μｌをとり、前
記特開昭５８−５６６９４．特開昭６０−２５３８６９
及び特開昭６１−２２１１２７に記載された方法でＲ１
１ｓａを行い、抗体量を測定した。

実験例Ｉ　　ＭＲＬ＃！マウスの５ｓＤＮＡプレートで
の抗体測定 ６ケ月令の雌性ＭＲＬ／βマウスの血清を採取し、各阻
害剤を添加し、その後リジン−セファロース担体による
処理、非処理で５ｓＤＮＡプレ一ト結合の抗５ｓＤＮＡ
抗体の変動を調べた（表−１）。

阻害剤が５ｓＤＮＡでもポリＡＤＰ−リポースでも、リ
ジン−セファロース担体前処理の場合、阻害剤濃度依存
的な標準的な阻害曲線が得られた。本担体非処理の場合
は、添加した５ｓＤＮＡの各濃度において、前処理の場
合に比較して阻害率がかなり小さかった。ポリーＡＤＰ
リボース添加の時は、１０−８ｍ。

１／ｍ　ＩＩまで一旦見られた阻害も高濃度になるにし
たがい、減少し、結合抗体量が増加するｒｅｂｏｕｎｄ
現象が見られ、複雑な阻害パターンであった。本担体に
より前処理する場合、抗原抗体複合物等が除去され、対
象とする抗体の測定が、より純粋に、より妨害のない形
で、実施できることが明らかになった。

実１例２　　ＭＲＬ＃ｉ’マウスのＣＬプレートでの抗
体測定 ６ケ月令の雌性ＭＲＬ＃！マウスの血清を採取し、各阻
害剤を添加し、その後リジン−セファロース担体による
処理、非処理でＣＬプレート結合の抗ＣＬ抗体の変動を
しらべた。阻害剤がポリＡＤＰ−リボースでも、　ＣＬ
の場合でも、リジン−セファロース担体前処理の方が非
処理の場合よりも、抗ＣＬ抗体の結合の阻害が、各濃度
で大きく、かつ阻害剤濃度依存的な標準的な阻害曲線が
得られた。本担体非処理の場合は、添加したポリＡＤＰ
−リボースの濃度が増加してもなかなか阻害がかからな
かった。またＣＬ添加の場合は、２　ＸＩＯ−９ｍｏｌ
／ｍ４で一旦見られた阻害も高濃度になるにしたがい、
なくなり逆に１４０χまでに結合抗体量が増加するｒｅ
ｂｏｕｎｄ現象が見られた。ともに複雑な阻害パターン
が見られたのに対して、本担体により前処理する場合は
、実験例１と同様抗原抗体複合物等が除去され、対象と
する抗体の測定が、より純粋に、より妨害のない形で、
実施できることが明らかになった。

実験例３　　ＭＲＬ＃！マウス由来ハイブリドーマの抗
５ｓＤＮＡプレートでの抗体測定 ＭＲＬ／　Ａマウス由来ハイブリドーマ培養上清より得
られた抗５ｓＤＮＡ抗体ＩＡ２に、各阻害剤を添加し、
その後り、ジン−セファロース担体による処理、非処理
で５ｓＤＮＡプレ一ト結合の抗５ｓＤＮＡ抗体の変動を
調べた（表−３）。添加した５ｓＤＮＡの全濃度領域で
、前処理した場合の阻害の方が大きいことがわかり、本
担体による前処理がなんらかの妨害物質の除去に有用で
あることが示された。なおＩＡ２抗体はＣＬとは交叉せ
ず、従ってＣＬプレートへの抗体結合の阻害実験は実施
しえなかった。

発明の効果 実験例で示されたように、酸性抗原に対する抗体の測定
において、塩基性物質結合担体で前処理する行程はきわ
めて有用であり、本担体を含有する抗体測定用前処理試
薬は産業上の利用価値が高い。実際本発明者は、妊娠Ｓ
ＬＥ患者の出産の可否、予後の判定等に抗ＣＬ抗体の測
定の価値が検討されている現状において、核酸抗原とＣ
Ｌとが交叉することに鑑み、血清中の抗原抗体複合物の
存在が更に、両抗原に対する抗体のより正確な測定を妨
害している可能性があることから、本発明の塩基性物質
結合担体で前処理すればより明確なアッセイが実現でき
るものと考え、妊娠ＭＲＬ／　Ａマウス血清について本
処理をとり入れ検討した。すると本前処理により、抗原
抗体複合物質等が相当除去され、抗５ｓＤＮＡ抗体及び
抗ＣＬ抗体がそれぞれ明確に測定できることがわかり、
本処理の実施が効果的であることが示された（第１６回
　日本免疫学会総会記事１９８６年、ｉｎ　ｐｒｅｓｓ
）。本前処理試薬は基礎研究、臨床研究の両面において
、酸性抗原に対する抗体の測定の際広範に用いられるポ
テンシャルを有することが明らかにされた。

特許出願人　三井東圧化学株式会社 特許出願人　三井製薬工業株式会社 特許出廓人　合弁　芳之

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 塩基性物質結合担体を含有することを特徴とする酸性抗
   原に対する抗体の測定前処理用試薬。