ES2473587T3

ES2473587T3 - Proteínas de fusión de RAGE y métodos de uso

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Publication number: ES2473587T3
Application number: ES05778764.0T
Authority: ES
Inventors: Adnan M.M. Mjalli; Ye E. Tian; Jeffrey C. Webster; Robert Rothlein
Original assignee: Trans Tech Pharma Inc
Current assignee: vTv Therapeutics LLC
Priority date: 2004-08-03
Filing date: 2005-08-03
Publication date: 2014-07-07
Anticipated expiration: 2025-08-03
Also published as: US7981423B2; GEP20105110B; CN1993378A; KR101323411B1; NZ552128A; ZA200906459B; US20110244516A1; NO20065949L; UA93356C2; IL180554A; AU2005271452A1; EP1781700B1; ZA200700643B; US8877192B2; US20120171202A1; US20080075733A1; AP2007003869A0; WO2006017647A1; EP1781700A1; MX2007001559A

Abstract

Proteína de fusión que comprende un polipéptido de RAGE unido directamente a un polipéptido distinto de RAGE, en la que el polipéptido distinto de RAGE comprende (i) un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina que puede plegarse, y (ii) un dominio CH3 de una inmunoglobulina; en la que el polipéptido de RAGE comprende un sitio de unión a ligando de RAGE; en la que el polipéptido de RAGE comprende un ligador interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de manera que el aminoácido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE está unido al aminoácido N-terminal del ligador interdominio de RAGE, y el aminoácido C-terminal del ligador interdominio de RAGE está unido directamente al aminoácido N-terminal del polipéptido distinto de RAGE; y en la que la proteína de fusión comprende un ligador interdominio derivado de RAGE en vez de un polipéptido 15 bisagra interdominio derivado de una inmunoglobulina.

Description

Prote�nas de fusión de RAGE y métodos de uso

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a la regulaci�n del receptor para productos finales de glicosilaci�n avanzada (Receptor for Advanced Glycated Endproducts) (RAGE). Más particularmente, la presente invención describe proteínas de fusión que comprenden un polip�ptido de RAGE, métodos de preparación de tales proteínas de fusión y el uso de tales proteínas para el tratamiento de trastornos basados en RAGE.

Antecedentes

La incubaci�n de proteínas o lípidos con azúcares aldosa da como resultado la oxidación y glicosilaci�n no

15 enzim�ticas de grupos amino en proteínas para formar aductos de Amadori. Con el tiempo, los aductos experimentan transposiciones, deshidrataciones y reticulaciones adicionales con otras proteínas para formar complejos conocidos como productos finales de glicosilaci�n avanzada (AGE). Los factores que promueven la formación de AGE incluyen recambio de proteínas retrasado (por ejemplo como en amiloidosis), acumulación de macromoléculas que tienen un alto contenido en lisina y altos niveles de glucosa en sangre (por ejemplo como en diabetes) (Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761, (1995)). Se ha implicado a los AGE en una variedad de trastornos incluyendo complicaciones asociadas con diabetes y envejecimiento normal.

Los AGE presentan unión específica y saturable a receptores de superficie celular en monocitos, macr�fagos, células endoteliales de la microvasculatura, células de músculo liso, células mesangiales y neuronas. El receptor

25 para productos finales de glicosilaci�n avanzada (RAGE) es un miembro de la familia de moléculas de supergenes de inmunoglobulinas. El dominio extracelular (N-terminal) de RAGE incluye tres regiones de tipo inmunoglobulina: un dominio de tipo V (variable) seguido por dos dominios de tipo C (constante) (Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al., Circ. (supl.) 96#194 (1997)). Un único dominio que se extiende a través de la membrana y una cola citos�lica corta, altamente cargada siguen al dominio extracelular. El dominio N-terminal, extracelular puede aislarse mediante prote�lisis de RAGE o mediante enfoques de biología molecular para generar RAGE soluble (RAGEs) compuesto por los dominios V y C.

RAGE se expresa en múltiples tipos de células incluyendo leucocitos, neuronas, células de la microgl�a y endotelio vascular (por ejemplo, Hori et al., J. Biol. Chem., 270:25752-761 (1995)). También se encuentran niveles

35 aumentados de RAGE en tejidos envejecidos (Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997)), y la retina, la vasculatura y el ri��n diabéticos (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995)). También se encuentran niveles aumentados de RAGE en tejidos envejecidos (Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997)), y la retina, la vasculatura y el ri��n diabéticos (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995)).

Adem�s de AGE, otros compuestos pueden unirse a y modular RAGE. RAGE se une a múltiples ligandos funcional y estructuralmente diversos incluyendo amiloide beta (Aβ), amiloide A s�rico (SAA), productos finales de glicosilaci�n avanzada (AGE), S100 (un miembro proinflamatorio de la familia de calgranulina), carboximetil-lisina (CML), anfoterina y CD11b/CD18 (Bucciarelli et al., Cell Mol. Life Sci., 59:1117-128 (2002); Chavakis et al., Microbes Infect., 6:1219-1225 (2004); Kokkola et al., Scand. J. Immunol., 61:1-9 (2005); Schmidt et al., J. Clin. Invest., 108:949-955

45 (2001); Rocken et al., Am. J. Pathol., 162:1213-1220 (2003)).

Se ha mostrado que la unión de ligandos tales como AGE, S100/calgranulina, β-amiloide, CML (Nε-carboximetillisina) y anfoterina a RAGE modifica la expresión de una variedad de genes. Estas interacciones pueden iniciar entonces mecanismos de transducci�n de señales incluyendo activación de p38, fosforilaci�n de Erk1-2, MAP cinasas, p21ras y la activación del mediador transcripcional de se�alizaci�n inflamatoria, NF-κB (Yeh et al., Diabetes, 50:1495-1504 (2001)). Por ejemplo, en muchos tipos de células, la interacción entre RAGE y sus ligandos puede generar estr�s oxidativo, que de ese modo da como resultado la activación del factor de transcripción sensible a radicales libres NF-κB, y la activación de genes regulados por NF-κB, tales como las citocinas IL-1β y TNF-α. Además, la expresión de RAGE se regula por incremento por medio de NF-κB y muestra expresión

55 aumentada en sitios de inflamación o estr�s oxidativo (Tanaka et al., J Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). Por tanto, puede alimentarse una espiral ascendente y a menudo perjudicial mediante un bucle de retroalimentación positiva iniciado por la unión del ligando.

La activación de RAGE en diferentes tejidos y órganos puede conducir a varias consecuencias fisiopatol�gicas. Se ha implicado a RAGE en una variedad de estados incluyendo: inflamación aguda y crónica (Hofmann et al., Cell 97: 889-901 (1999)), el desarrollo de complicaciones diab�ticas tardías tales como aumento de la permeabilidad vascular (Wautier et al., J. Clip. Invest., 97:238-243 (1995)), nefropat�a (Teillet et al., J. Am. Soc. Nephrol., 11:14881497 (2000)), arteriosclerosis (Vlassara et al., The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med., 28:419-426 (1996)) y retinopat�a (Hammes et al., Diabetologia, 42:603-607 (1999)). Se ha implicado a RAGE también en 65 enfermedad de Alzheimer (Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996)) y en invasión y metástasis tumorales (Taguchi et

al., Nature, 405:354-357 (2000)).

A pesar de la amplia expresión de RAGE y su aparente papel pleiotr�pico en múltiples modelos de enfermedad diversos, RAGE no parece ser esencial para el desarrollo normal. Por ejemplo, ratones deficientes en RAGE no

5 tienen un fenotipo anómalo manifiesto, lo que sugiere que aunque RAGE puede desempeñar un papel en la patología de la enfermedad cuando se estimula de manera crónica, la inhibición de RAGE no parece contribuir a ningún fenotipo agudo no deseado (Liliensiek et al., J. Clin. Invest., 113:1641-50 (2004)).

La unión antagonizante de ligandos fisiológicos a RAGE puede regular por disminución los cambios fisiopatol�gicos provocados por concentraciones excesivas de AGE y otros ligandos de RAGE. Reduciendo la unión de ligandos end�genos a RAGE, pueden reducirse los síntomas asociados con trastornos mediados por RAGE. RAGE soluble (RAGEs) puede antagonizar eficazmente la unión de ligandos de RAGE a RAGE. Sin embargo, RAGEs puede tener una semivida cuando se administra in vivo que puede ser demasiado corta como para ser terapéuticamente útil para uno o más trastornos. Por tanto, hay una necesidad de desarrollar compuestos que antagonicen la unión de AGE y

15 otros ligandos fisiológicos al receptor RAGE teniendo el compuesto un perfil farmacocin�tico deseable.

Sumario

Las realizaciones de la presente invención comprenden proteínas de fusión de RAGE y usos de tales proteínas tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la presente invención comprenden una proteína de fusión que comprende un polip�ptido de RAGE unido a un segundo polip�ptido distinto de RAGE. La proteína de fusión comprende un sitio de unión a ligando de RAGE. La proteína de fusión comprende además un polip�ptido de RAGE unido directamente a un polip�ptido que comprende el dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del dominio CH2.

25 La presente invención también comprende un método para preparar una proteína de fusión de RAGE. El método comprende unir un polip�ptido de RAGE a un segundo polip�ptido distinto de RAGE. El polip�ptido de RAGE comprende un sitio de unión a ligando de RAGE. El método puede comprender unir un polip�ptido de RAGE directamente a un polip�ptido que comprende el dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción del dominio CH2.

Tambi�n se dan a conocer en el presente documento métodos y composiciones para tratar un trastorno mediado por RAGE en un sujeto. El método puede comprender administrar una proteína de fusión de la presente invención al sujeto. La composición puede comprender una proteína de fusión de RAGE de la presente invención en un portador

35 farmac�uticamente aceptable.

Hay diversas ventajas que pueden estar asociadas con realizaciones particulares de la presente invención. En una realización, las proteínas de fusión de la presente invención pueden ser estables metab�licamente cuando se administran a un sujeto. Además, las proteínas de fusión de la presente invención pueden presentar unión de alta afinidad para ligandos de RAGE. En determinadas realizaciones, las proteínas de fusión de la presente invención se unen a ligandos de RAGE con afinidades en el intervalo nanomolar alto a micromolar bajo. Uniéndose con alta afinidad a ligandos de RAGE fisiológicos, las proteínas de fusión de la presente invención pueden usarse para inhibir la unión de ligandos end�genos a RAGE, proporcionando de ese modo medios para mejorar enfermedades mediadas por RAGE.

45 Además, las proteínas de fusión de la presente invención pueden proporcionarse en forma de proteína o ácido nucleico. En una realización de ejemplo, la proteína de fusión puede administrarse de manera sist�mica y permanecer en la vasculatura para tratar posiblemente enfermedades vasculares mediadas en parte por RAGE. En otra realización de ejemplo, la proteína de fusión puede administrarse localmente para tratar enfermedades en las que ligandos de RAGE contribuyen a la patología de la enfermedad. Alternativamente, puede administrarse un constructo de ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión a un sitio mediante el uso de un portador apropiado tal como un virus o ADN desnudo cuando la expresión local transitoria puede inhibir localmente la interacción entre ligandos de RAGE y receptores. Por tanto, la administración puede ser transitoria (por ejemplo, como cuando se administra la proteína de fusión) o de naturaleza más permanente (por ejemplo, como cuando se

55 administra la proteína de fusión como un ADN recombinante).

Breve descripción de las figuras

Diversas características, aspectos y ventajas de la presente invención resultarán más evidentes con referencia a las siguientes figuras.

La figura 1 muestra diversas secuencias de RAGE según realizaciones alternativas de la presente invención: Panel A, SEQ ID NO: 1, la secuencia de amino�cidos para RAGE humano; y SEQ ID NO: 2, la secuencia de amino�cidos para RAGE humano sin la secuencia señal de amino�cidos 1-22; panel B, SEQ ID NO: 3, la secuencia de

65 amino�cidos para RAGE humano sin la secuencia señal de amino�cidos 1-23; panel C, SEQ ID NO: 4, la secuencia de amino�cidos de RAGEs humano; SEQ ID NO: 5, la secuencia de amino�cidos de RAGEs humano sin la

secuencia señal de amino�cidos 1-22, y SEQ ID NO: 6, la secuencia de amino�cidos de RAGEs humano sin la secuencia señal de amino�cidos 1-23; panel D, SEQ ID NO: 7, una secuencia de amino�cidos que comprende el dominio V de RAGE humano; SEQ ID NO: 8, una secuencia de amino�cidos alternativa que comprende el dominio V de RAGE humano; SEQ ID NO: 9, un fragmento N-terminal del dominio V de RAGE humano; SEQ ID NO: 10, un 5 fragmento N-terminal alternativo del dominio V de RAGE humano; SEQ ID NO: 11, la secuencia de amino�cidos para los amino�cidos 124-221 de RAGE humano; SEQ ID NO: 12, la secuencia de amino�cidos para los amino�cidos 227-317 de RAGE humano; SEQ ID NO: 13, la secuencia de amino�cidos para los amino�cidos 23-123 de RAGE humano; panel E, SEQ ID NO: 14, la secuencia de amino�cidos para los amino�cidos 24-123 de RAGE humano; SEQ ID NO: 15, la secuencia de amino�cidos para los amino�cidos 23-136 de RAGE humano; SEQ ID NO: 16, la secuencia de amino�cidos para los amino�cidos 24-136 de RAGE humano; SEQ ID NO: 17, la secuencia de amino�cidos para los amino�cidos 23-226 de RAGE humano; SEQ ID NO: 18, la secuencia de amino�cidos para los amino�cidos 24-226 de RAGE humano; panel F, SEQ ID NO: 19, la secuencia de amino�cidos para los amino�cidos 23-251 de RAGE humano; SEQ ID NO: 20, la secuencia de amino�cidos para los amino�cidos 24-251 de RAGE humano; SEQ ID NO: 21, un ligador interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 22, un segundo ligador interdominio de 15 RAGE; SEQ ID NO: 23, un tercer ligador interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 24, un cuarto ligador interdominio de RAGE; panel G, SEQ ID NO: 25, ADN que codifica para los amino�cidos 1-118 de RAGE humano; SEQ ID NO: 26, ADN que codifica para los amino�cidos 1-123 de RAGE humano; y SEQ ID NO: 27, ADN que codifica para los amino�cidos 1-136 de RAGE humano; Panel H, SEQ ID NO: 28, ADN que codifica para los amino�cidos 1-230 de RAGE humano; y SEQ ID NO: 29, ADN que codifica para los amino�cidos 1-251 de RAGE humano; panel I, SEQ ID NO: 38, una secuencia de amino�cidos parcial para los dominios CH2 y CH3 de IgG humana; SEQ ID NO: 39, ADN que codifica para una porción de los dominios CH2 y CH3 humanos de IgG humana; SEQ ID NO: 40, una secuencia de amino�cidos para los dominios CH2 y CH3 de IgG humana; panel J, SEQ ID NO: 41, un ADN que codifica para los dominios CH2 y CH3 de IgG humana; SEQ ID NO: 42, una secuencia de amino�cidos para el dominio CH2 de IgG humana; SEQ ID NO: 43, una secuencia de amino�cidos para el dominio CH3 de IgG humana; y SEQ ID NO: 44, un

25 quinto ligador interdominio de RAGE.

La figura 2 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 30) de una región que codifica par una proteína de fusión de RAGE (TTP-4000) según una realización de la presente invención. La secuencia codificante 1-753 destacada en negrita codifica para una secuencia de proteína N-terminal de RAGE mientras que la secuencia 754-1386 codifica para una secuencia de proteína Fc de IgG humana (γ1).

La figura 3 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 31) de una región que codifica para una proteína de fusión de RAGE alternativa (TTP-3000) según una realización de la presente invención. La secuencia codificante 1-408 destacada en negrita codifica para una secuencia de proteína N-terminal de RAGE, mientras que la secuencia 409

35 1041 codifica para una secuencia de proteína Fc de IgG humana (γ1).

La figura 4 muestra las secuencias de amino�cidos, SEQ ID NO: 32 (TTP-4000), SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, que codifican cada una para una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios según realizaciones alternativas de la presente invención. La secuencia de RAGE est� destacada con letras en negrita.

La figura 5 muestra las secuencias de amino�cidos, SEQ ID NO: 35 (TTP-3000), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37, que codifican cada una para una proteína de fusión de RAGE de tres dominios según realizaciones alternativas de la presente invención. La secuencia de RAGE est� destacada con letras en negrita.

45 La figura 6, panel A, muestra una comparación de los dominios de proteína en RAGE humano y proteína Fc de Ig gamma-1 humana, y los puntos de escisión usados para preparar TTP-3000 (en la posición 136) y TTP-4000 (en la posición 251) según realizaciones alternativas de la presente invención; y el panel B muestra la estructura de dominios para TTP-3000 y TTP-4000 según realizaciones alternativas de la presente invención.

La figura 7 muestra los resultados de un ensayo de unión in vitro para RAGEs y las proteínas de fusión de RAGE TTP-4000 (TT4) y TTP-3000 (TT3), a los ligandos de RAGE amiloide beta (A-beta), S100b (S100) y anfoterina (Ampho), según una realización de la presente invención.

La figura 8 muestra los resultados de un ensayo de unión in vitro para la proteína de fusión de RAGE TTP-4000

55 (TT4) (“proteína”) a amiloide beta en comparación con un control negativo que sólo incluye los reactivos de inmunodetecci�n (“complejo solo”), y el antagonismo de tal unión por un antagonista de RAGE (“ligando de RAGE”) según una realización de la presente invención.

La figura 9 muestra los resultados de un ensayo de unión in vitro para la proteína de fusión de RAGE TTP-3000 (TT3) (“proteína”) a amiloide beta en comparación con un control negativo que sólo incluye los reactivos de inmunodetecci�n (“complejo solo”), y el antagonismo de tal unión por un antagonista de RAGE (“ligando de RAGE”) según una realización de la presente invención.

La figura 10 muestra los resultados de un ensayo basado en células que mide la inhibición de la producción de TNF

65 α inducida por S100b-RAGE mediante las proteínas de fusión de RAGE TTP-3000 (TT3) y TTP-4000 (TT4), y RAGEs según una realización de la presente invención.

La figura 11 muestra un perfil farmacocin�tico para la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 según una realización de la presente invención en el que cada curva representa un animal diferente en las mismas condiciones experimentales.

5 La figura 12 muestra los niveles relativos de liberación de TNF-α a partir de células THP-1 debida a la estimulaci�n mediante la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 y estimulaci�n mediante IgG humana como una medida de una respuesta inflamatoria según una realización de la presente invención.

La figura 13 muestra el uso de la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 para reducir la reestenosis en animales diabéticos según realizaciones alternativas de la presente invención, en la que el panel A muestra que la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 reducía la razón íntima/media en comparación con un control negativo (IgG), y el panel B muestra que la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 reducía la proliferaci�n de células de músculo liso vascular de una manera sensible a la dosis.

15 La figura 14 muestra el uso de la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 para reducir la formación de amiloide y la disfunción cognitiva en animales enfermedad de Alzheimer (EA) según realizaciones alternativas de la presente invención en la que el panel A muestra que la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 reducía la carga de amiloide en el cerebro, y el panel B muestra que la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 mejoraba la función cognitiva.

La figura 15 muestra curvas de unión de saturación con TTP-4000 a diversos ligandos de RAGE conocidos inmovilizados según una realización de la presente invención.

Descripci�n detallada

25 Para los fines de esta memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario, debe entenderse que todos los números que expresan cantidades de componentes, condiciones de reacción y etc. usados en la memoria descriptiva est�n modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la siguiente memoria descriptiva son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener por la presente invención. Por lo menos, y no como intento de limitar la aplicación de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos notificados y aplicando técnicas de redondeo habituales.

35 A pesar de que los intervalos numéricos y parámetros que exponen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se notifican de manera tan precisa como sea posible. Sin embargo cualquier valor numérico contiene inherentemente determinados errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba. Además, debe entenderse que todos los intervalos dados a conocer en el presente documento abarcan todos y cada uno de los subintervalos contenidos en los mismos. Por ejemplo, debe considerarse que un intervalo indicado de “1 a 10” incluye todos y cada uno de los subintervalos entre (e incluidos) el valor mínimo de 1 y el valor máximo de 10; es decir, todos los subintervalos que comienzan con un valor mínimo de 1 o más, por ejemplo de 1 a 6,1, y que terminan con un valor máximo de 10 o menos, por ejemplo, de 5,5 a 10. Adicionalmente, cualquier referencia a que “se incorpora en el presente documento” debe entenderse que se incorpora en su totalidad.

45 Se indica además que, tal como se usa en esta memoria descriptiva, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que se limite expresa e inequívocamente a un referente. El término “o” se usa de manera intercambiable con el término “y/o” a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Adem�s, los términos “porción” y “fragmento” se usan de manera intercambiable para referirse a partes de un polip�ptido, ácido nucleico u otro constructo molecular.

Tal como se usa en el presente documento, el término “en el sentido N-terminal/de 5’” se refiere a un residuo que est� en posición N-terminal con respecto a un segundo residuo cuando la molécula es una proteína, o en 5’ con

55 respecto a un segundo residuo cuando la molécula es un ácido nucleico. También tal como se usa en el presente documento, el término “en el sentido C-terminal/de 3’” se refiere a un residuo que est� en posición C-terminal con respecto a un segundo residuo cuando la molécula es una proteína, o en 3’ con respecto a un segundo residuo cuando la molécula es un ácido nucleico.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica. Se remite particularmente a los profesionales sanitarios a Current Protocols in Molecular Biology (Ansubel) para definiciones y términos de la técnica. Las abreviaturas para los residuos de amino�cido son los códigos de 3 letras y/o 1 letra convencionales usados en la técnica para referirse a uno de los 20 L-amino�cidos comunes.

65 Un “ácido nucleico” es un polinucle�tido tal como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). El término se usa para incluir ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios y ARN y ADN preparado a partir de análogos de nucleótido o nucle�sido.

El término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede usarse para transportar una segunda

5 molécula de ácido nucleico al interior de una célula. En una realización, el vector permite la replicaci�n de secuencias de ADN insertadas en el vector. El vector puede comprender un promotor para potenciar la expresión de la molécula de ácido nucleico en al menos algunas células huésped. Los vectores pueden replicarse de manera autónoma (extracromos�mica) o pueden integrarse en un cromosoma de la célula huésped. En una realización, el vector puede comprender un vector de expresión que puede producir una proteína derivada de al menos parte de una secuencia de ácido nucleico insertada en el vector.

Tal como se conoce en la técnica, puede describirse que condiciones para hibridar secuencias de ácido nucleico entre s� oscilan entre rigurosidad baja y alta. Generalmente, condiciones de hibridación altamente rigurosas se refieren a híbridos de lavado en tampón de sal bajo a altas temperaturas. La hibridación puede ser para filtrar el ADN 15 unido usando disoluciones de hibridación convencionales en la técnica tales como NaHPO4 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, a 65�C, y lavar en NaHPO4 0,25 M, SDS al 3,5% seguido por lavar en 0,1 x SSC/SDS al 0,1% a una temperatura que oscila entre temperatura ambiente y 68�C dependiendo de la longitud de la sonda (véase por ejemplo Ausubel, F.M. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4� ed., capítulo 2, John Wiley & Sons, N.Y.). Por ejemplo, un lavado de alta rigurosidad comprende lavar en 6x SSC/pirofosfato de sodio 0,05% a 37�C para una sonda de oligonucle�tido de 14 bases o a 48�C para una sonda de oligonucle�tido de 17 bases o a 55�C para una sonda de oligonucle�tido de 20 bases o a 60�C para una sonda de oligonucle�tido de 25 bases o a 65�C para una sonda de nucleótido de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud. Las sondas de ácido nucleico pueden marcarse con radionucle�tidos mediante marcaje de extremos un extremo con, por ejemplo, [α-32P]ATP, o incorporación de nucleótidos radiomarcados tales como [α-32P]dCTP mediante marcaje con cebadores aleatorios.

25 Alternativamente, las sondas pueden marcarse mediante la incorporación de nucleótidos biotinilados o marcados con fluoresce�na, y detectarse la sonda usando estreptavidina o anticuerpos anti-fluoresce�na.

Tal como se usa en el presente documento, “moléculas orgánicas pequeñas” son moléculas de peso molecular inferior a 2.000 Daltons que contienen al menos un átomo de carbono.

“Polip�ptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable en el presente documento para describir moléculas de proteína que pueden comprender proteínas o bien parciales o bien de longitud completa.

El término “proteína de fusión” se refiere a una proteína o un polip�ptido que tiene una secuencia de amino�cidos

35 derivada de dos o más proteínas. La proteína de fusión también puede incluir regiones de unión de amino�cidos entre porciones de amino�cidos derivadas de proteínas separadas.

Tal como se usa en el presente documento, un “polip�ptido distinto de RAGE” es cualquier polip�ptido que no se deriva de RAGE o un fragmento del mismo. Tales polip�ptidos distintos de RAGE incluyen p�ptidos de inmunoglobulina, polip�ptidos de dimerizaci�n, polip�ptidos de estabilizaci�n, p�ptidos anf�filos o polip�ptidos que comprenden secuencias de amino�cidos que proporcionan “etiquetas” para la selección como diana o purificación de la proteína.

Tal como se usa en el presente documento, los “p�ptidos de inmunoglobulina” pueden comprender una cadena

45 pesada de inmunoglobulina o una porción de la misma. En una realización, la porción de la cadena pesada puede ser el fragmento Fc o una porción del mismo. Tal como se usa en el presente documento, el fragmento Fc comprende el polip�ptido bisagra de cadena pesada, y los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de una inmunoglobulina, en forma o bien monom�rica o bien dim�rica. O, el fragmento Fc y CH1 pueden usarse como polip�ptido de inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (s) o IgA (α). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los subtipos de cadena pesada conocidos: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. Un ejemplo de actividad biológica que puede alterarse incluye reducción de la capacidad de un isotipo para unirse a algunos receptores de Fc tal como por ejemplo mediante modificación de la región bisagra.

55 Los términos “identidad” o “porcentaje de identidad” se refieren a la identidad de secuencia entre dos secuencias de amino�cidos o entre dos secuencias de ácido nucleico. El porcentaje de identidad puede determinarse alineando dos secuencias y se refiere al número de residuos idénticos (es decir, amino�cido o nucleótido) en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. La alineación y comparación de secuencias puede realizarse usando los algoritmos convencionales en la técnica (por ejemplo Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443; Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:2444) o mediante versiones informatizadas de estos algoritmos (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI) disponibles públicamente como BLAST y FASTA. Además, puede usarse ENTREZ, disponible a través de los National Institutes of Health, Bethesda MD, para la

65 comparación de secuencias. En una realización, el porcentaje de identidad de dos secuencias puede determinarse usando GCG con un peso de hueco de 1, de manera que cada hueco de amino�cido est� ponderado como si fuera un único apareamiento erróneo de amino�cido entre las dos secuencias.

Tal como se usa en el presente documento, el término “residuos conservados” se refiere a amino�cidos que son

5 iguales a lo largo de una pluralidad de proteínas que tienen la misma estructura y/o función. Una región de residuos conservados puede ser importante para la estructura o función de la proteína. Por tanto, los residuos conservados contiguas tal como se identifican en una proteína tridimensional pueden ser importantes para la estructura o función de la proteína. Para encontrar residuos conservados o regiones conservadas de estructura 3-D, puede realizarse una comparación de secuencias para proteínas iguales o similares de diferentes especies, o de individuos de la misma especie.

Tal como se usa en el presente documento, el término “homólogo” significa un polip�ptido que tiene un grado de homología con la secuencia de amino�cidos de tipo natural. Pueden realizarse comparaciones de homología a simple vista o, más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente

15 disponibles. Estos programas inform�ticos disponibles comercialmente pueden calcular el porcentaje de homología entre dos o más secuencias (por ejemplo Wilbur, W. J. y Lipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726730). Por ejemplo, pueden tomarse secuencias homólogas para que incluyan secuencias de amino�cidos que en realizaciones alternativas son al menos idénticas en un 75%, idénticas en un 85%, idénticas en un 90%, idénticas en un 95% o idénticas en un 98% entre s�.

Tal como se usa en el presente documento, un “dominio” de polip�ptido o proteína comprende una región a lo largo de un polip�ptido o una proteína que comprende una unidad independiente. Pueden definirse dominios en cuanto a estructura, secuencia y/o actividad biológica. En una realización, un dominio de polip�ptido puede comprender una región de una proteína que se pliega de una manera que es sustancialmente independiente del resto de la proteína.

25 Pueden identificarse dominios usando bases de datos de dominios tales como, pero sin limitarse a PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT y PROCLASS.

Tal como se usa en el presente documento, “dominio de inmunoglobulina” es una secuencia de amino�cidos que es estructuralmente homóloga, o idéntica a, un dominio de una inmunoglobulina. La longitud de la secuencia de amino�cidos de un dominio de inmunoglobulina puede ser de cualquier longitud. En una realización, un dominio de inmunoglobulina puede ser de menos de 250 amino�cidos. En una realización de ejemplo, un dominio de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 80-150 amino�cidos de longitud. Por ejemplo, la región variable y las regiones CH1, CH2 y CH3 de una IgG son cada una dominios de inmunoglobulina. En otro ejemplo, las regiones variables, las CH1, CH2, CH3 y CH4 de una IgM son cada una dominios de inmunoglobulina.

35 Tal como se usa en el presente documento, un “dominio de inmunoglobulina de RAGE” es una secuencia de amino�cidos de la proteína RAGE que es estructuralmente homóloga, o idéntica a, un dominio de una inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, el dominio 1 de tipo C2 similar a Ig de RAGE (“dominio C1”) o el dominio 2 de tipo C2 similar a Ig de RAGE (“dominio C2”).

Tal como se usa en el presente documento, un “ligador interdominio” comprende un polip�ptido que une dos dominios entre s�. Una región bisagra Fc es un ejemplo de un ligador interdominio en una IgG.

45 Tal como se usa en el presente documento, “unido directamente” identifica una unión covalente entre dos grupos diferentes (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico, polip�ptidos, dominios de polip�ptido) que no tiene ningún átomo intermedio entre los dos grupos que est�n uniéndose.

Tal como se usa en el presente documento, “dominio de unión a ligando” se refiere a un dominio de una proteína responsable de la unión a un ligando. El término dominio de unión a ligando incluye homólogos de un dominio de unión a ligando o porciones del mismo. A este respecto, pueden realizarse sustituciones de amino�cidos deliberadas en el sitio de unión a ligando basándose en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad o hidrofilia de los residuos, siempre que se conserve la especificidad de unión del dominio de unión a ligando.

55 Tal como se usa en el presente documento, un “sitio de unión a ligando” comprende residuos en una proteína que interaccionan directamente con un ligando, o residuos implicados en el posicionamiento del ligando en proximidad estrecha a los residuos que interaccionan directamente con el ligando. La interacción de residuos en el sitio de unión a ligando puede definirse por la proximidad espacial de los residuos a un ligando en el modelo o estructura. El término sitio de unión a ligando incluye homólogos de un sitio de unión a ligando, o porciones del mismo. A este respecto, pueden realizarse sustituciones de amino�cidos deliberadas en el sitio de unión a ligando basándose en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad o hidrofilia de los residuos, siempre que se conserve la especificidad de unión del sitio de unión a ligando. Un sitio de unión a ligando puede existir en uno o más dominios de unión a ligando de una proteína o un polip�ptido.

65 Tal como se usa en el presente documento, el término “interaccionar” se refiere a una condición de proximidad entre un ligando o compuesto, o porciones o fragmentos del mismo, y una porción de una segunda molécula de interés. La interacción puede ser no covalente, por ejemplo, como resultado de enlaces por puentes de hidrógeno, interacciones de van der Waals o interacciones electrostáticas o hidrófobas, o puede ser covalente.

Tal como se usa en el presente documento, un “ligando” se refiere a una molécula o un compuesto o una entidad

5 que interacciona con un sitio de unión a ligando, incluyendo sustratos o análogos o partes de los mismos. Tal como se describe en el presente documento, el término “ligando” puede referirse a compuestos que se unen a la proteína de interés. Un ligando puede ser un agonista, un antagonista o un modulador. O, un ligando puede no tener un efecto biológico. O, un ligando puede bloquear la unión de otros ligandos inhibiendo de esta manera un efecto biológico. Los ligandos pueden incluir, pero no se limitan a, inhibidores de molécula pequeña. Estas moléculas

10 pequeñas pueden incluir p�ptidos, peptidomim�ticos, compuestos orgánicos y similares. Los ligandos también pueden incluir polip�ptidos y/o proteínas.

Tal como se usa en el presente documento, un “compuesto modulador” se refiere a una molécula que cambia o altera la actividad biológica de una molécula de interés. Un compuesto modulador puede aumentar o disminuir la 15 actividad, o cambiar las características físicas o químicas o las propiedades funcionales o inmunol�gicas, de la molécula de interés. Para RAGE, un compuesto modulador puede aumentar o disminuir la actividad, o cambiar las características o las propiedades funcionales o inmunol�gicas del RAGE, o una porción del mismo. Un compuesto modulador puede incluir p�ptidos naturales y/o sintetizados químicamente o artificiales, p�ptidos modificados (por ejemplo, fosfop�ptidos), anticuerpos, hidratos de carbono, monosac�ridos, oligosac�ridos, polisac�ridos, glicol�pidos,

20 compuestos heteroc�clicos, nucle�sidos o nucleótidos o partes de los mismos y moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas. Un compuesto modulador puede ser un compuesto fisiológico end�geno o puede ser un compuesto natural o sintético. O, el compuesto modulador puede ser una molécula orgánica pequeña. El término “compuesto modulador” también incluye un compuesto o ligando modificado químicamente, e incluye isómeros y formas rac�micas.

25 Un “agonista” comprende un compuesto que se une a un receptor para formar un complejo que provoca una respuesta farmacol�gica específica para el receptor implicado.

Un “antagonista” comprende un compuesto que se une a un agonista o a un receptor para formar un complejo que 30 no da lugar a una respuesta farmacol�gica sustancial y que puede inhibir la respuesta biológica inducida por un agonista.

Por tanto, los agonistas de RAGE puede unirse a RAGE y estimular procesos celulares mediados por RAGE y los antagonistas de RAGE pueden inhibir que los procesos mediados por RAGE se estimulen por un agonista de RAGE. 35 Por ejemplo, en una realización, el proceso celular estimulado por agonistas de RAGE comprende la activación de la transcripción del gen de TNF-α.

El término “miméticos de p�ptido” se refiere a estructuras que sirven como sustitutos para p�ptidos en interacciones entre moléculas (Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24:243-252). Los miméticos de p�ptido pueden

40 incluir estructuras sintéticas que pueden contener o no uniones de p�ptido y/o amino�cidos pero que conservan las características estructurales y funcionales de un p�ptido, o agonista o antagonista. Los miméticos de p�ptido también incluyen peptoides, oligopeptoides (Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 89:9367); y bibliotecas de p�ptidos que contienen p�ptidos de una longitud diseñada que representan todas las posibles secuencias de amino�cidos que corresponden a un p�ptido, o agonista o antagonista de la invención.

45 El término “tratar” se refiere a mejorar un síntoma de una enfermedad o un trastorno y puede comprender curar el trastorno, previniendo sustancialmente la aparición del trastorno, o mejorando el estado del sujeto. El término “tratamiento” tal como se usa en el presente documento, se refiere al espectro completo de tratamientos para un trastorno dado que padece el paciente, incluyendo alivio de un síntoma o la mayoría de los síntomas que resultan de

50 ese trastorno, una cura para el trastorno particular o prevención de la aparición del trastorno.

Tal como se usa en el presente documento, el término “CE50” se define como la concentración de un agente que da como resultado el 50% de un efecto biológico medido. Por ejemplo, la CE50 de un agente terapéutico que tiene un efecto biológico medible puede comprender el valor al que el agente presenta el 50% del efecto biológico.

55 Tal como se usa en el presente documento, el término “CI50” se define como la concentración de un agente que da como resultado una inhibición del 50% de un efecto medido. Por ejemplo, la CI50 de un antagonista de la unión a RAGE puede comprender el valor al que el antagonista reduce la unión del ligando al sitio de unión a ligando de RAGE en un 50%.

60 Tal como se usa en el presente documento, una “cantidad eficaz” significa la cantidad de un agente que es eficaz para producir un efecto deseado en un sujeto. El término “cantidad terapéuticamente eficaz” indica la cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que provocar� la respuesta terapéutica de un animal o ser humano que est� buscándose. La dosis real que comprende la cantidad eficaz puede depender de la vía de administración, el tamaño

65 y la salud del sujeto, el trastorno que est� tratándose, y similares.

El término “portador farmac�uticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento puede referirse a compuestos y composiciones que son adecuados para su uso en sujetos humanos o animales, tales como por ejemplo, para composiciones terapéuticas administradas para el tratamiento de un trastorno o enfermedad mediado por RAGE.

5 El término “composición farmacéutica” se usa en el presente documento para indicar una composición que puede administrarse a un huésped mamífero, por ejemplo, por vía oral, por vía parenteral, por vía típica, mediante pulverización de inhalaci�n, por vía intranasal o por vía rectal, en formulaciones de dosificación unitaria que contienen portadores, diluyentes, adyuvantes, vehículos y similares no tóxicos convencionales.

10 El término “parenteral” tal como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal o técnicas de infusión.

Prote�nas de fusión de RAGE

15 Las realizaciones de la presente invención comprenden proteínas de fusión de RAGE, métodos de preparación de tales proteínas de fusión y el uso de tales proteínas de fusión. La presente invención puede realizarse de una variedad de modos.

20 Por ejemplo, realizaciones de la presente invención proporcionan proteínas de fusión que comprenden un polip�ptido de RAGE unido a un segundo polip�ptido distinto de RAGE. La proteína de fusión comprende un sitio de unión a ligando de RAGE. En una realización, el sitio de unión a ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión a ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una realización, el sitio de unión a ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica

25 en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma.

El polip�ptido de RAGE est� unido a un polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción (por ejemplo, un fragmento de la misma) de un dominio de inmunoglobulina. En una realización, el polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2

30 o CH3 de una IgG humana.

Una proteína o un polip�ptido de RAGE puede comprender proteína RAGE humana de longitud completa (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) o un fragmento de RAGE humano. Tal como se usa en el presente documento, un fragmento de un polip�ptido de RAGE tiene al menos 5 amino�cidos de longitud, puede ser mayor de 30

35 amino�cidos de longitud, pero es menor que la secuencia de amino�cidos completa. En realizaciones alternativas, el polip�ptido de RAGE puede comprender una secuencia que es idéntica en un 70% o en un 80% o en un 85% o en un 90% a RAGE humano, o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGE humano, o un fragmento del mismo, con glicina como primer residuo en vez de metionina (véase por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender RAGE de longitud completa con la

40 secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (figuras 1A y 1B) o una porción de esa secuencia de amino�cidos.

Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender RAGEs (por ejemplo, SEQ ID NO: 4), un polip�ptido idéntico en un 90% a RAGEs, o un fragmento de RAGEs. Tal como se usa en el presente documento,

45 RAGEs es la proteína RAGE que no incluye la región transmembrana o la cola citoplasmática (Park et al., Nature Med., 4:1025-1031 (1998)). Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGEs humano, o un fragmento del mismo, con glicina como el primer residuo en vez de una metionina (véase por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O, un polip�ptido de RAGE puede comprender RAGEs humano con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) (figura 1C) o una porción de esa secuencia de amino�cidos.

50 En otras realizaciones, la proteína RAGE puede comprender un dominio V de RAGE (por ejemplo, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; figura 1D) (Neeper et al., (1992); Schmidt et al. (1997)). O, puede usarse una secuencia idéntica en un 90% al dominio V de RAGE o un fragmento del mismo.

55 O, la proteína RAGE puede comprender un fragmento del dominio V de RAGE (por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, figura 1D). En una realización la proteína RAGE puede comprender un sitio de unión a ligando. En una realización, el sitio de unión a ligando puede comprender SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma. Aún en otra realización, el fragmento de RAGE es un p�ptido sintético.

60 Por tanto, el polip�ptido de RAGE usado en las proteínas de fusión de la presente invención puede comprender un fragmento de RAGE de longitud completa. Tal como se conoce en la técnica, RAGE comprende tres dominios de polip�ptido similares a inmunoglobulina, el dominio V y los dominios C1 y C2 cada uno unido al otro por un ligador interdominio. RAGE de longitud completa también incluye un polip�ptido transmembrana y una cola citoplasmática

65 en el sentido C-terminal del dominio C2 y unido al dominio C2.

En una realización, el polip�ptido de RAGE no incluye ningún residuo de secuencia señal. La secuencia señal de RAGE puede comprender o bien los residuos 1-22 o bien los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa.

Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 7)

5 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 8) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 124-221 de RAGE humano (SEQ ID NO: 11) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio C1 de RAGE. En otra realización, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 227-317 de RAGE humano (SEQ ID NO: 12) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio C2 de RAGE. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 13) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 14) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE y un ligador interdominio en el sentido C-terminal. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 17) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los

15 amino�cidos 24-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 18) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 y el ligador interdominio que une estos dos dominios. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 5) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o 24-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 6) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente a RAGEs (es decir, que codifica para los dominios V, C1 y C2 y ligadores interdominio). O, pueden usarse fragmentos de cada una de estas secuencias.

La proteína de fusión puede incluir varios tipos de p�ptidos que no se derivan de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polip�ptido de la proteína de fusión puede comprender un polip�ptido derivado de una inmunoglobulina. En una realización, el polip�ptido de inmunoglobulina puede comprender una cadena pesada de inmunoglobulina o

25 una porción (es decir, fragmento) de la misma. Por ejemplo, el fragmento de cadena pesada puede comprender un polip�ptido derivado del fragmento Fc de una inmunoglobulina, en el que el fragmento Fc comprende el polip�ptido bisagra de cadena pesada, y los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina como mon�mero. La cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los isotipos conocidos de cadena pesada: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε) o IgA (α). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los subtipos conocidos de cadena pesada: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polip�ptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o porciones de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como realizaciones de ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de los mismos pueden comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40.

35 La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Por tanto, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención comprende un ligador interdominio derivado de RAGE en vez de un polip�ptido bisagra interdominio derivado de una inmunoglobulina.

Por tanto en una realización, la proteína de fusión puede comprender además un polip�ptido de RAGE unido directamente a un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento o una porción del dominio CH2 de una inmunoglobulina. En una realización, el dominio CH2, o un fragmento del mismo comprende SEQ ID NO: 42. El polip�ptido de RAGE comprende un sitio de unión a ligando. El sitio de unión a ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una realización, el sitio de

45 unión a ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma.

El polip�ptido de RAGE usado en las proteínas de fusión de la presente invención comprende un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Adicionalmente, el fragmento de RAGE comprende un ligador interdominio. El polip�ptido de RAGE comprende un dominio de inmunoglobulina de RAGE unido a un ligador interdominio en el sentido C-terminal (es decir, más cercano al extremo C-terminal). Aún en otra realización, el polip�ptido de RAGE puede comprender dos (o más) dominios de inmunoglobulina de RAGE cada uno unido al otro mediante un ligador interdominio. El polip�ptido de RAGE puede comprender además múltiples dominios de inmunoglobulina de RAGE unidos entre s� por uno o más ligadores interdominio y que tienen un ligador interdominio terminal unido al dominio

55 de inmunoglobulina de RAGE N-terminal y/o el dominio de inmunoglobulina C-terminal. Combinaciones adicionales de dominios de inmunoglobulina de RAGE y ligadores interdominio est�n dentro del alcance de la presente invención.

El polip�ptido de RAGE comprende un ligador interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de manera que el amino�cido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido N-terminal del ligador interdominio, y el amino�cido C-terminal del ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal de un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como

65 realización de ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3, o una porción de los mismos, de una IgG1 humana puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40.

Tal como se describió anteriormente, la proteína de fusión de la presente invención puede comprender un único dominio o múltiples dominios de RAGE. Además, el polip�ptido de RAGE que comprende un ligador interdominio unido a un dominio de polip�ptido de RAGE puede comprender un fragmento de proteína RAGE de longitud

5 completa. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma o los amino�cidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un ligador interdominio en el sentido C-terminal. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1, el ligador interdominio que une estos dos dominios y un segundo ligador interdominio en el sentido Cterminal de C1.

Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina

15 derivados de la proteína RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer ligador interdominio de RAGE unido a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo ligador interdominio de RAGE, de manera que el amino�cido N-terminal del primer ligador interdominio est� unido al amino�cido Cterminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el amino�cido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido C-terminal del primer ligador interdominio, el amino�cido Nterminal del segundo ligador interdominio est� unido al amino�cido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y el amino�cido C-terminal del segundo ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal del dominio de inmunoglobulina CH2. En una realización, una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios puede comprender SEQ ID NO: 32. En realizaciones alternativas, una proteína

25 de fusión de RAGE de cuatro dominios comprende SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34.

Alternativamente, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un único dominio de inmunoglobulina de RAGE unido por medio de un ligador interdominio de RAGE al amino�cido N-terminal de un dominio de inmunoglobulina CH2 o una porción de un dominio de inmunoglobulina CH2. En una realización, una proteína de fusión de RAGE de tres dominios puede comprender SEQ ID NO: 35. En realizaciones alternativas, una proteína de fusión de RAGE de tres dominios puede comprender SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37.

35 Un fragmento de ligador interdominio de RAGE puede comprender una secuencia de p�ptido que se encuentra de manera natural en el sentido C-terminal de, y por tanto, unida a, un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el ligador interdominio puede comprender secuencias de amino�cidos que se encuentran de manera natural en el sentido C-terminal del dominio V. En una realización, el ligador puede comprender SEQ ID NO: 21, correspondiente a los amino�cidos 117-123 de RAGE de longitud completa. O, el ligador puede comprender un p�ptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un ligador interdominio que comprende varios amino�cidos (por ejemplo, 1-3, 1-5 � 1-10 � 115 amino�cidos) en el sentido N-terminal y en el sentido C-terminal de SEQ ID NO: 21. Por tanto, en una realización, el ligador interdominio comprende SEQ ID NO: 23 que comprende los amino�cidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O, pueden usarse fragmentos de SEQ ID NO: 21 delecionando, por ejemplo, 1, 2 � 3 amino�cidos de

45 cualquier extremo del ligador. En realizaciones alternativas, el ligador puede comprender una secuencia que es idéntica en un 70%, o idéntica en un 80%, o idéntica en un 90% a SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.

Para el dominio C1 de RAGE, el ligador puede comprender una secuencia de p�ptido que se encuentra de manera natural en el sentido C-terminal del dominio C1. En una realización, el ligador puede comprender SEQ ID NO: 22, correspondiente a los amino�cidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O, el ligador puede comprender un p�ptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un ligador que comprende varios (1-3, 1-5 � 1-10 � 1-15 amino�cidos) amino�cidos en el sentido N-terminal y en el sentido Cterminal de SEQ ID NO: 22. O, pueden usarse fragmentos de SEQ ID NO: 22, delecionando por ejemplo, 1-3, 1-5 � 1-10 � 1-15 amino�cidos de cualquier extremo del ligador. Por ejemplo, en una realización, un ligador interdominio

55 de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 24, correspondiente a los amino�cidos 222-226. O un ligador interdominio puede comprender SEQ ID NO: 44, correspondiente a los amino�cidos 318-342 de RAGE.

M�todos de producción de proteínas de fusión de RAGE

La presente invención también comprende un método para preparar una proteína de fusión de RAGE. Por tanto, en una realización, la presente invención comprende un método de preparación de una proteína de fusión de RAGE que comprende la etapa de unir covalentemente un polip�ptido de RAGE unido a un segundo polip�ptido distinto de RAGE en el que el polip�ptido de RAGE comprende un sitio de unión a ligando de RAGE. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE unido y el segundo polip�ptido distinto de RAGE pueden codificarse por un constructo de ADN 65 recombinante. El método puede comprender además la etapa de incorporar el constructo de ADN en un vector de expresión. Además, el método puede comprender la etapa de insertar el vector de expresión en una célula huésped.

Por ejemplo, realizaciones de la presente invención proporcionan proteínas de fusión que comprenden un polip�ptido de RAGE unido a un segundo polip�ptido distinto de RAGE. La proteína de fusión comprende un sitio de unión a ligando de RAGE. En una realización, el sitio de unión a ligando comprende el dominio más N-terminal de la

5 proteína de fusión. El sitio de unión a ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una realización, el sitio de unión a ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma.

o CH3 de una IgG humana.

La proteína de fusión pude modificarse mediante ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante. Por

15 ejemplo, en una realización, la presente invención puede comprender una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica para un polip�ptido de RAGE unido a un segundo polip�ptido distinto de RAGE. El polip�ptido de RAGE comprende un sitio de unión a ligando de RAGE.

La proteína o el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), o un fragmento de RAGE humano. En una realización, el polip�ptido de RAGE no incluye ningún residuo de secuencia señal. La secuencia señal de RAGE puede comprender o bien los residuos 1-22 o bien los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1). En realizaciones alternativas, el polip�ptido de RAGE puede comprender una secuencia idéntica en un 70% o en un 80% o en un 90% a RAGE humano, o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGE humano, o un fragmento 25 del mismo, con glicina como primer residuo en vez de metionina (véase por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender RAGE de longitud completa con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (figuras 1A y 1B) o una porción de esa secuencia de amino�cidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender RAGEs (por ejemplo, SEQ ID NO: 4), un polip�ptido idéntico en un 90% a RAGEs, o un fragmento de RAGEs. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGEs humano, o un fragmento del mismo, con glicina como primer residuo en vez de metionina (véase por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender RAGEs con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) (figura 1C) o una porción de esa secuencia de amino�cidos. En otras realizaciones, la proteína RAGE puede comprender un dominio V (por ejemplo, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; figura 1D). O, puede usarse una secuencia idéntica en un 90% al dominio V o un fragmento del mismo. O, la

35 proteína RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, figura 1D). En una realización, el sitio de unión a ligando puede comprender SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma. Aún en otra realización, el fragmento de RAGE es un p�ptido sintético.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico comprende SEQ ID NO: 25 para codificar para los amino�cidos 1118 de RAGE humano o un fragmento del mismo. Por ejemplo, puede usarse una secuencia que comprende los nucleótidos 1-348 de SEQ ID NO: 25 para codificar para los amino�cidos 1-116 de RAGE humano. O, el ácido nucleico puede comprender SEQ ID NO: 26 para codificar para los amino�cidos 1-123 de RAGE humano. O, el ácido nucleico puede comprender SEQ ID NO: 27 para codificar para los amino�cidos 1-136 de RAGE humano. O,

45 el ácido nucleico puede comprender SEQ ID NO: 28 para codificar para los amino�cidos 1-230 de RAGE humano. O, el ácido nucleico puede comprender SEQ ID NO: 29 para codificar para los amino�cidos 1-251 de RAGE humano. O pueden usarse fragmentos de estas secuencias de ácido nucleico para codificar para fragmentos de polip�ptido de RAGE.

La proteína de fusión puede incluir varios tipos de p�ptidos que no se derivan de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polip�ptido de la proteína de fusión comprende un polip�ptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los isotipos conocidos de cadena pesada: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε) o IgA (α). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los subtipos conocidos de cadena pesada: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4),

55 IgA1 (α1), IgA2 (α2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polip�ptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como realizaciones de ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de los mismos puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. El p�ptido de inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41.

La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Por tanto, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención comprende un ligador interdominio derivado de RAGE en vez de un polip�ptido bisagra interdominio derivado de una inmunoglobulina. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión puede codificarse por un constructo de ADN recombinante. Además, el método puede comprender la etapa de incorporar el

65 constructo de ADN en un vector de expresión. Además, el método puede comprender transfectar el vector de expresión en el interior de una célula huésped.

Por tanto, en una realización, la presente invención comprende un método de preparación de una proteína de fusión de RAGE que comprende la etapa de unir covalentemente un polip�ptido de RAGE a un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina. La proteína de

5 fusión comprende un sitio de unión a ligando de RAGE. El sitio de unión a ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una realización, el sitio de unión a ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma.

Por ejemplo, en una realización, la presente invención comprende un ácido nucleico que codifica para un polip�ptido de RAGE unido directamente a un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. En una realización, el dominio CH2, o un fragmento del mismo, comprende SEQ ID NO: 42. El segundo polip�ptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana. Como realización de ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana puede comprender SEQ ID NO: 38 o

15 SEQ ID NO: 40. El p�ptido de inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41.

El polip�ptido de RAGE comprende un ligador interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de manera que el amino�cido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido N-terminal del ligador interdominio, y el amino�cido C-terminal del ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal de un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender un polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de ambos, o uno cualquiera, de estos dominios. Como realización de ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3

25 de una IgG1 humana, o una porción de los mismos, puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40.

La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un único dominio o múltiples dominios de RAGE. Además, el polip�ptido de RAGE que comprende un ligador interdominio unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de una proteína RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de proteína RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer ligador interdominio unido a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo ligador interdominio de RAGE, de manera que el amino�cido Nterminal del primer ligador interdominio est� unido al amino�cido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina 35 de RAGE, el amino�cido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido Cterminal del primer ligador interdominio, el amino�cido N-terminal del segundo ligador interdominio est� unido al amino�cido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el amino�cido C-terminal del segundo ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal del polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o fragmento del mismo. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1, el ligador interdominio que une estos dos dominios y un segundo ligador interdominio en el sentido C-terminal de C1. En una realización, un constructo de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de

45 cuatro dominios.

Alternativamente, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un único dominio de inmunoglobulina de RAGE unido por medio de un ligador interdominio de RAGE al amino�cido N-terminal del polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2

o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma o los amino�cidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un ligador interdominio en el sentido C-terminal. En una realización, un constructo de ácido nucleico que

55 comprende SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma puede codificar para una proteína de fusión de tres dominios de RAGE.

Un fragmento de ligador interdominio de RAGE puede comprender una secuencia de p�ptido que se encuentra de manera natural en el sentido C-terminal de, y por tanto, unida a, un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el ligador interdominio puede comprender secuencias de amino�cidos que se encuentran de manera natural en el sentido C-terminal del dominio V. En una realización, el ligador puede comprender SEQ ID NO: 21, correspondiente a los amino�cidos 117-123 de RAGE de longitud completa. O, el ligador puede comprender un p�ptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un ligador interdominio que comprende varios amino�cidos (por ejemplo, 1-3, 1-5 � 1-10 � 165 15 amino�cidos) en el sentido N-terminal y en el sentido C-terminal de SEQ ID NO: 21. Por tanto, en una realización, el ligador interdominio comprende SEQ ID NO: 23 que comprende los amino�cidos 117-136 de RAGE de longitud

completa. O, pueden usarse fragmentos de SEQ ID NO: 21 delecionando, por ejemplo, 1, 2 � 3 amino�cidos de cualquier extremo del ligador. En realizaciones alternativas, el ligador puede comprender una secuencia que es idéntica en un 70%, o idéntica en un 80%, o idéntica en un 90% a SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.

5 Para el dominio C1 de RAGE, el ligador puede comprender una secuencia de p�ptido que se encuentra manera natural en el sentido C-terminal del dominio C1. En una realización, el ligador puede comprender SEQ ID NO: 22, correspondiente a los amino�cidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O, el ligador puede comprender un p�ptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un ligador que comprende varios (1-3, 1-5 � 1-10 � 1-15 amino�cidos) amino�cidos en el sentido N-terminal y en el sentido C

10 terminal de SEQ ID NO: 22. O, pueden usarse fragmentos de SEQ ID NO: 22, delecionando por ejemplo, 1-3, 1-5 � 1-10 � 1-15 amino�cidos de cualquier extremo del ligador. Por ejemplo, en una realización, un ligador interdominio de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 24, correspondiente a los amino�cidos 222-226. O un ligador interdominio puede comprender SEQ ID NO: 44, correspondiente a los amino�cidos 318-342 de RAGE.

15 El método puede comprender además la etapa de incorporar el constructo de ADN en un vector de expresión. Por tanto, en una realización, la presente invención comprende un vector de expresión que codifica para una proteína de fusión que comprende un polip�ptido de RAGE unido directamente a un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina. En una realización, el polip�ptido de RAGE comprende constructos, tales como los descritos en el presente documento, que tienen un ligador

20 interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de manera que el amino�cido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido N-terminal del ligador interdominio, y el amino�cido C-terminal del ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal de un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo. Por ejemplo, el vector de expresión usado para transfectar las células puede comprender la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 30, o

25 un fragmento de la misma, o SEQ ID NO: 31, o un fragmento de la misma.

El método puede comprender además la etapa de transfectar una célula con el vector de expresión de la presente invención. Por tanto, en una realización, la presente invención comprende una célula transfectada con el vector de expresión que expresaba la proteína de fusión de RAGE de la presente invención, de manera que la célula expresa 30 una proteína de fusión que comprende un polip�ptido de RAGE unido directamente a un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina. El polip�ptido de RAGE comprende un constructo, tal como los descritos en el presente documento, que tiene un ligador interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de manera que el amino�cido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido N-terminal del ligador interdominio, y el amino�cido C-terminal

35 del ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal de un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo. Por ejemplo, el vector de expresión puede comprender la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 30, o un fragmento de la misma, o SEQ ID NO: 31, o un fragmento de la misma.

40 Por ejemplo, pueden construirse pl�smidos para expresar proteínas de fusión de RAGE-Fc de IgG fusionando diferentes longitudes de una secuencia de ADNc en 5’ de RAGE humano con una secuencia de ADNc en 3’ de Fc de IgG1 humana (γ1). Las secuencias del casete expresión pueden insertarse en un vector de expresión tal como el vector de expresión pcDNA3.1 (Invitrogen, CA) usando técnicas recombinantes convencionales.

45 Además, el método puede comprender transfectar el vector de expresión en el interior de una célula huésped. En una realización, el recombinante puede transfectarse en el interior de células de ovario de h�mster chino y optimizarse la expresión. En realizaciones alternativas, las células pueden producir de 0,1 a 20 gramos/litro, o de 0,5 a 10 gramos/litro, o aproximadamente 1-2 gramos/litro.

50 Tal como se conoce en la técnica, tales constructos de ácido nucleico pueden modificarse mediante mutación, tal como por ejemplo, mediante amplificación por PCR de un molde de ácido nucleico con cebadores que comprenden la mutación de interés. De este modo, pueden diseñarse polip�ptidos que comprenden afinidad variable por ligandos de RAGE. En una realización, las secuencias mutadas pueden ser idénticas en un 90% o más al ADN de partida. Como tal, las variantes pueden incluir secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas (es decir,

55 equivalentes a aproximadamente 20-27�C por debajo de la temperatura de fusión (TF) del dúplex de ADN en sal 1 molar).

La secuencia codificante puede expresarse transfectando el vector de expresión en un huésped apropiado. Por ejemplo, los vectores recombinantes pueden transfectarse de manera estable en el interior de células de ovario de 60 h�mster chino (CHO), y seleccionarse y clonarse células que expresan la proteína de fusión. En una realización, las células que expresan el constructo recombinante se seleccionan por resistencia a neomicina codificada por el pl�smido aplicando el antibiótico G418. Pueden seleccionarse clones individuales y pueden expandirse clones que expresan altos niveles de proteína recombinante tal como se detecta mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western del sobrenadante celular, y purificarse el producto g�nico mediante cromatograf�a de afinidad usando

65 columnas de proteína A.

Se muestran realizaciones de muestra de ácidos nucleicos recombinantes que codifican para las proteínas de fusión de la presente invención en las figuras 2-5. Por ejemplo, tal como se describió anteriormente, la proteína de fusión producida por el constructo de ADN recombinante puede comprender un polip�ptido de RAGE unido a un segundo polip�ptido distinto de RAGE. La proteína de fusión puede comprender dos dominios derivados de proteína RAGE y

5 dos dominios derivados de una inmunoglobulina. Un ejemplo de constructo de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, TTP-4000 (TT4), que tiene este tipo de estructura se muestra en la figura 2 (SEQ ID NO: 30). Tal como se muestra en la figura 2, la secuencia codificante 1-753 (destacada en negrita) codifica para la secuencia de proteína N-terminal de RAGE mientras que la secuencia desde 754-1386 codifica para la secuencia de proteína Fc de IgG.

Cuando se deriva de SEQ ID NO: 30 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, la proteína de fusión puede comprender la secuencia de amino�cidos de cuatro dominios de SEQ ID NO: 32, o el polip�ptido con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34) (figura 4). En la figura 4, la secuencia de amino�cidos de RAGE est� destacada con letras en negrita. La secuencia de inmunoglobulina son los dominios CH2

15 y CH3 de inmunoglobulina de IgG. Tal como se muestra en la figura 6B, los primeros 251 amino�cidos de la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 de longitud completa contiene como secuencia de polip�ptido de RAGE una secuencia señal que comprende los amino�cidos 1-22/23, el dominio V de inmunoglobulina (incluyendo el sitio de unión a ligando) que comprende los amino�cidos 23/24-116, un ligador interdominio que comprende los amino�cidos de 117 a 123, un segundo dominio de inmunoglobulina (C1) que comprende los amino�cidos 124-221 y un ligador interdominio en el sentido C-terminal que comprende los amino�cidos 222-251.

En una realización, la proteína de fusión puede no comprender necesariamente el segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. Un constructo de

25 ácido nucleico de ejemplo que codifica para este tipo de proteína de fusión se muestra en la figura 3 (SEQ ID NO: 31). Tal como se muestra en la figura 3, la secuencia codificante de los nucleótidos 1 a 408 (destacada en negrita) codifica para la secuencia de proteína N-terminal de RAGE, mientras que la secuencia de 409-1041 codifica para la secuencia de proteína Fc de IgG1 (γ1).

Cuando se deriva de SEQ ID NO: 31 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, la proteína de fusión puede comprender la secuencia de amino�cidos de tres dominios de SEQ ID NO: 35, o el polip�ptido con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37) (figura 5). En la figura 5, la secuencia de amino�cidos de RAGE est� destacada con letras en negrita. Tal como se muestra en la figura 6B, los primeros 136 amino�cidos de la proteína de fusión de RAGE TTP-3000 de longitud completa contiene como polip�ptido de RAGE

35 una secuencia señal que comprende los amino�cidos 1-22/23, el dominio V de inmunoglobulina (incluyendo el sitio de unión a ligando) que comprende los amino�cidos 23/24-116 y un ligador interdominio que comprende los amino�cidos de 117 a 136. La secuencia desde 137 hasta 346 incluye los dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulina de IgG.

Las proteínas de fusión de la presente invención pueden comprender estabilidad in vivo mejorada con respecto a polip�ptidos de RAGE que no comprenden un segundo polip�ptido. La proteína de fusión puede modificarse adicionalmente para aumentar la estabilidad, eficacia, potencia y biodisponibilidad. Por tanto, las proteínas de fusión de la presente invención pueden modificarse mediante procesamiento postraduccional o mediante modificación química. Por ejemplo, la proteína de fusión puede prepararse de manera sintética para incluir amino�cidos L-, D-o

45 no naturales, amino�cidos alfa-disustituidos o N-alquilamino�cidos. Adicionalmente, pueden modificarse proteínas mediante acetilaci�n, acilaci�n, ADP-ribosilaci�n, amidaci�n, unión de lípidos tales como fosfatidilinositol, formación de enlaces disulfuro, y similares. Además, puede añadirse polietilenglicol para aumentar la estabilidad biológica de la proteína de fusión.

Uni�n de antagonistas de RAGE a proteínas de fusión de RAGE

Las proteínas de fusión de la presente invención pueden comprender varias aplicaciones. Por ejemplo, la proteína de fusión de la presente invención puede usarse en un ensayo de unión para identificar ligandos de RAGE, tales como agonistas, antagonistas o moduladores de RAGE.

55 Por ejemplo, se da a conocer en el presente documento un método para la detección de moduladores de RAGE que comprende: (a) proporcionar una proteína de fusión que comprende un polip�ptido de RAGE unido a un segundo polip�ptido distinto de RAGE, en el que el polip�ptido de RAGE comprende un sitio de unión a ligando; (b) mezclar un compuesto de interés y un ligando que tiene una afinidad de unión conocida para RAGE con la proteína de fusión; y (c) medir la unión del ligando de RAGE conocido a la proteína de fusión de RAGE en presencia del compuesto de interés. En una realización, el sitio de unión a ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión.

Las proteínas de fusión de RAGE también pueden proporcionar kits para la detección de moduladores de RAGE.

65 Por ejemplo, en una realización, un kit puede comprender (a) un compuesto que tiene afinidad de unión conocida a RAGE como control positivo; (b) una proteína de fusión de RAGE que comprende un polip�ptido de RAGE unido a un segundo polip�ptido distinto de RAGE, en el que el polip�ptido de RAGE comprende un sitio de unión a ligando de RAGE; y (c) instrucciones para su uso. En una realización, el sitio de unión a ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión.

5 La proteína o el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), o un fragmento de RAGE humano. En una realización, el polip�ptido de RAGE no incluye ningún residuo de secuencia señal. La secuencia señal de RAGE puede comprender o bien los residuos 1-22 o bien los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1). En realizaciones alternativas, el polip�ptido de RAGE puede comprender una secuencia idéntica en un 70%, en un 80% o en un 90% a RAGE humano, o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGE humano, o un fragmento del mismo, con glicina como primer residuo en vez de metionina (véase por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender RAGE de longitud completa con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (figuras 1A y 1B) o una porción de esa secuencia de amino�cidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender RAGEs (por ejemplo, SEQ ID NO: 4), un polip�ptido

15 idéntico en un 90% a RAGEs o un fragmento de RAGEs. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGEs humano, o un fragmento del mismo, con glicina como primer residuo en vez de metionina (véase por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender RAGEs con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) (figura 1C) o una porción de esa secuencia de amino�cidos. En otras realizaciones, la proteína RAGE puede comprender un dominio V (por ejemplo, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; figura 1D). O, puede usarse una secuencia idéntica en un 90% al dominio V o un fragmento del mismo. O, la proteína RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, figura 1D). En una realización, el sitio de unión a ligando puede comprender SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma. Aún en otra realización, el fragmento de RAGE es un p�ptido sintético.

25 La proteína de fusión puede incluir varios tipos de p�ptidos que no se derivan de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polip�ptido de la proteína de fusión comprende un polip�ptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los isotipos conocidos de cadena pesada: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε) o IgA (α). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los subtipos conocidos de cadena pesada: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polip�ptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como realizaciones de ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de los mismos puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. El p�ptido de

35 inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41.

La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Por tanto, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender una secuencia de Fc derivada de RAGE en vez de una cadena de inmunoglobulina. La proteína de fusión comprende un dominio de inmunoglobulina de RAGE unido a un polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o un fragmento del mismo. El polip�ptido de RAGE comprende un ligador interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de manera que el amino�cido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido N-terminal del ligador interdominio, y el amino�cido C-terminal del ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido Nterminal de un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El

45 polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender un polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de ambos, o cualquiera, de estos dominios. Como realización de ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana, o una porción de los mismos, puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40.

La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un único dominio o múltiples dominios de RAGE. Además, el polip�ptido de RAGE que comprende un ligador interdominio unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de una proteína RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de proteína RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. La proteína de fusión puede 55 comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer ligador interdominio unido a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo ligador interdominio de RAGE, de manera que el amino�cido Nterminal del primer ligador interdominio est� unido al amino�cido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el amino�cido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido Cterminal del primer ligador interdominio, el amino�cido N-terminal del segundo ligador interdominio est� unido al amino�cido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y el amino�cido C-terminal del segundo ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal del polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o fragmento del mismo. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, 65 correspondiente al dominio V, el dominio C1, el ligador interdominio que une estos dos dominios y un segundo ligador interdominio en el sentido C-terminal de C1. En una realización, un constructo de ácido nucleico que

comprende SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios.

Alternativamente, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina

5 derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un único dominio de inmunoglobulina de RAGE unido por medio de un ligador interdominio de RAGE al amino�cido N-terminal del polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2

o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma o los amino�cidos 24-136 de

10 RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un ligador interdominio en el sentido C-terminal. En una realización, un constructo de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de tres dominios.

15 Tal como se describe en el presente documento, un fragmento de ligador interdominio de RAGE puede comprender una secuencia de p�ptido que se encuentra manera natural en el sentido C-terminal de, y por tanto, unida a, un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el ligador interdominio puede comprender secuencias de amino�cidos que se encuentran de manera natural en el sentido C-terminal del dominio

V. En una realización, el ligador puede comprender SEQ ID NO: 21, correspondiente a los amino�cidos 117-123 de

20 RAGE de longitud completa. O, el ligador puede comprender un p�ptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un ligador interdominio que comprende varios amino�cidos (por ejemplo, 1-3, 1-5 � 1-10 � 1-15 amino�cidos) en el sentido N-terminal y en el sentido C-terminal de SEQ ID NO:

21. Por tanto, en una realización, el ligador interdominio comprende SEQ ID NO: 23 que comprende los amino�cidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O, pueden usarse fragmentos de SEQ ID NO: 21 delecionando, por

25 ejemplo, 1, 2 � 3 amino�cidos de cualquier extremo del ligador. En realizaciones alternativas, el ligador puede comprender una secuencia que es idéntica en un 70% o idéntica en un 80% o idéntica en un 90% a SEQ ID NO: 21

o SEQ ID NO: 23.

Para el dominio C1 de RAGE, el ligador puede comprender una secuencia de p�ptido que se encuentra de manera

30 natural en el sentido C-terminal del dominio C1, En una realización, el ligador puede comprender SEQ ID NO: 22, correspondiente a los amino�cidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O, el ligador puede comprender un p�ptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un ligador que comprende varios (1-3, 1-5 � 1-10 � 1-15 amino�cidos) amino�cidos en el sentido N-terminal y en el sentido Cterminal de SEQ ID NO: 22. O, pueden usarse fragmentos de SEQ ID NO: 22, delecionando por ejemplo, 1-3, 1-5 �

35 1-10 � 1-15 amino�cidos de cualquier extremo del ligador. Por ejemplo, en una realización, un ligador interdominio de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 24, correspondiente a los amino�cidos 222-226. O un ligador interdominio puede comprender SEQ ID NO: 44, correspondiente a los amino�cidos 318-342 de RAGE.

Por ejemplo, la proteína de fusión de RAGE puede usarse en un ensayo de unión para identificar posibles ligandos

40 de RAGE. En una realización de ejemplo de un ensayo de unión de este tipo, puede recubrirse un ligando de RAGE conocido sobre un sustrato sólido (por ejemplo, placas Maxisorb) a una concentración de aproximadamente 5 microgramos por pocillo, en el que cada pocillo contiene un volumen total de aproximadamente 100 microlitros (μl). Pueden incubarse las placas a 4�C durante la noche para permitir que se absorba el ligando. Alternativamente, pueden usarse periodos de incubaci�n más cortos a temperatura superior (por ejemplo, temperatura ambiente). Tras

45 un periodo de tiempo para permitir que el ligando se una al sustrato, pueden aspirarse los pocillos de ensayo y puede añadirse un tampón de bloqueo (por ejemplo, BSA al 1% en tampón de imidizol 50 mM, pH 7,2) para bloquear la unión no específica. Por ejemplo, puede añadirse tampón de bloqueo a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces pueden aspirarse las placas y/o lavarse con un tampón de lavado. En una realización, puede usarse un tampón que comprende imidizol 20 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05%, CaCl2 5 mM y MgCl2 5 mM,

50 pH 7,2 como tampón de lavado. Entonces puede añadirse la proteína de fusión a diluciones crecientes a los pocillos de ensayo. Entonces puede permitirse que se incube la proteína de fusión de RAGE con el ligando inmovilizado en el pocillo de ensayo de manera que la unión pueda alcanzar el equilibrio. En una realización, se permite que se incube la proteína de fusión de RAGE con el ligando inmovilizado durante aproximadamente una hora a 37�C. En realizaciones alternativas, pueden usarse periodos de incubaci�n más largos a temperaturas inferiores. Tras

55 haberse incubado la proteína de fusión y el ligando inmovilizado, puede lavarse la palca para eliminar cualquier proteína de fusión no unida. Puede detectarse la proteína de fusión unida al ligando inmovilizado de varios modos. En una realización, la detección emplea un ELISA. Por tanto, en una realización, puede añadirse un complejo de inmunodetecci�n que contiene un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG1 humana, anticuerpo de cabra biotinilado anti-IgG de ratón y una fosfatasa alcalina unida a avidina a la proteína de fusión inmovilizada en el pocillo de ensayo.

60 Puede permitirse que el complejo de inmunodetecci�n se una a la proteína de fusión inmovilizada de manera que la unión entre la proteína de fusión y el complejo de inmunodetecci�n alcance el equilibrio. Por ejemplo, puede permitirse que el complejo se una a la proteína de fusión durante una hora a temperatura ambiente. En ese momento, puede eliminarse cualquier complejo no unido lavando el pocillo de ensayo con tampón de lavado. Puede detectarse el complejo unido añadiendo el sustrato de fosfatasa alcalina, fosfato de para-nitrofenilo (PNPP) y

65 midiendo la conversión de PNPP en para-nitrofenol (PNP) como un aumento de la absorbancia a 405 nm.

En una realización, el ligando de RAGE se une a la proteína de fusión de RAGE con afinidad nanomolar (nM) o micromolar (μM). Un experimento que ilustra la unión de ligandos de RAGE a proteínas de fusión de RAGE de la presente invención se muestra en la figura 7. Se prepararon disoluciones de TTP-3000 (TT3) y TTP-4000 (TT4) que tenían concentraciones iniciales de 1,082 mg/ml y 370 μg/ml, respectivamente. Tal como se muestra en la figura 7, a

5 diversas diluciones, la proteínas de fusión TTP-3000 y TTP-4000 pueden unirse a los ligandos de RAGE inmovilizados amiloide-beta (Abeta) (amiloide beta (1-40) de Biosource), S100b (S100) y anfoterina (Ampho), dando como resultado un aumento de la absorbancia. En ausencia de ligando (es decir, recubrimiento con BSA sólo) no hubo aumento de la absorbancia.

10 El ensayo de unión de la presente invención puede usarse para cuantificar la unión del ligando a RAGE. En realizaciones alternativas, los ligandos de RAGE pueden unirse a la proteína de fusión de la presente invención con afinidades de unión que oscilan entre 0,1 y 1000 nanomolar (nM) o entre 1 y 500 nM o entre 10 y 80 nM.

La proteína de fusión de la presente invención también puede usarse para identificar compuestos que tienen la

15 capacidad de unirse a RAGE. Tal como se muestra en las figuras 8 y 9, respectivamente, puede someterse a ensayo un ligando de RAGE para determinar su capacidad para competir con amiloide beta inmovilizado por la unión a las proteínas de fusión TTP-4000 (TT4) o TTP-3000 (TT3). Por tanto, puede observarse que un ligando de RAGE a una concentración de ensayo final (FAC) de 10 μM puede desplazar la unión de la proteína de fusión de RAGE a amiloide beta a concentraciones de 1:3, 1:10, 1:30 y 1:100 de la disolución inicial de TTP-4000 (figura 8) o TTP-3000

20 (figura 9).

Modulaci�n de efectores celulares

Pueden usarse realizaciones de las proteínas de fusión de la presente invención para modular una respuesta

25 biológica mediada por RAGE. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden diseñarse para modular aumentos de la expresión g�nica inducidos por RAGE. Por tanto, en una realización, pueden usarse proteínas de fusión de la presente invención para modular la función de enzimas biológicas. Por ejemplo, la interacción entre RAGE y sus ligandos puede generar estr�s oxidativo y activación de NF-κB y genes regulados por NF-κB, tales como las citocinas IL-1β, TNF-α y similares. Además, se ha mostrado que varias otras rutas reguladoras, tales como las que

30 implican p21ras, MAP cinasas, ERK1 y ERK2, se activan mediante la unión de AGE y otros ligandos a RAGE.

En la figura 10 se muestra el uso de las proteínas de fusión de la presente invención para modular la expresión del efector celular TNF-α. Pueden cultivarse células mieloides THP-1 en medios RPMI-1640 complementados con FBS al 10% e inducirse para que secreten TNF-α mediante estimulaci�n de RAGE con S100b. Cuando se produce tal 35 estimulaci�n en presencia de una proteína de fusión de RAGE, puede inhibirse la inducción de TNF-α mediante la unión de S100b a RAGE. Por tanto, tal como se muestra en la figura 10, la adición de 10 μg de proteína de fusión de RAGE TTP-3000 (TT3) o TTP-4000 (TT4) reduce la inducción mediante S100b de TNF-α en de aproximadamente el 50% al 75%. La proteína de fusión TTP-4000 puede ser al menos tan eficaz en el bloqueo de la inducción mediante S100b de TNF-α como RAGE (figura 10). La especificidad de la inhibición para las secuencias de RAGE de TTP

40 4000 y TTP-3000 se muestra mediante el experimento en el que se a�adi� IgG sola a células estimuladas con S100b. La adición de IgG y S100b al ensayo muestra los mismos niveles de TNF-α que S100b solo.

Caracter�sticas fisiológicas de proteínas de fusión de RAGE

45 Aunque RAGEs puede tener un beneficio terapéutico en la modulación de enfermedades mediadas por RAGE, RAGEs humano puede tener limitaciones como agente terapéutico independiente basándose en la semivida relativamente corta de RAGEs en plasma. Por ejemplo, mientras que RAGEs de roedor tiene una semivida en ratas normales y diab�ticas de aproximadamente 20 horas, RAGEs humano tiene una semivida inferior a 2 horas cuando se somete a ensayo mediante retención de inmunorreactividad de RAGEs (Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.,

50 290:1458-1466 (1999)).

Para generar un agente terapéutico de RAGE que tenga características de unión similares a las de RAGEs, pero un perfil farmacocin�tico más estable, puede usarse una proteína de fusión de RAGE que comprende un sitio de unión a ligando de RAGE unido a uno o más dominios de inmunoglobulina humana. Tal como se conoce en la técnica, los

55 dominios de inmunoglobulina pueden incluir la porción Fc de la cadena pesada de inmunoglobulina.

La porción Fc de inmunoglobulina puede conferir varios atributos a una proteína de fusión. Por ejemplo, la proteína de fusión de Fc puede aumentar la semivida en suero de tales proteínas de fusión, con frecuencia desde horas hasta varios días. El aumento de la estabilidad farmacocin�tica es generalmente un resultado de la interacción del

60 ligador entre las regiones CH2 y CH3 del fragmento Fc con el receptor FcRn (Wines et al., J. Immunol., 164:53135318 (2000)).

Aunque proteínas de fusión que comprenden un polip�ptido de Fc de inmunoglobulina pueden proporcionar la ventaja de estabilidad aumentada, las proteínas de fusión de inmunoglobulina pueden provocar una respuesta 65 inflamatoria cuando se introducen en un huésped. La respuesta inflamatoria puede deberse, en gran parte, a la

porci�n Fc de la inmunoglobulina de la proteína de fusión. La respuesta proinflamatoria puede ser una característica deseable si la diana se expresa en un tipo de célula enferma que se necesita eliminar (por ejemplo, una célula cancerosa, un linfocito o una población de linfocitos que provocan una enfermedad autoinmunitaria). La respuesta proinflamatoria puede ser una característica neutra si la diana es una proteína soluble, ya que la mayoría de las

5 proteínas solubles no activan inmunoglobulinas. Sin embargo, la respuesta proinflamatoria puede ser una característica negativa si la diana se expresa en tipos de células cuya destrucción conducir� a efectos secundarios desfavorables. Además, la respuesta proinflamatoria puede ser una característica negativa si se establece una cascada inflamatoria en el sitio de una unión de la proteína de fusión a una diana tisular, puesto que muchos mediadores de la inflamación pueden ser perjudiciales para el tejido circundante y/o pueden provocar efectos sist�micos.

El sitio proinflamatorio principal en fragmentos Fc de inmunoglobulina reside en la región bisagra entre CH1 y CH2. Esta región bisagra interacciona con FcR1-3 en diversos leucocitos y provoca que estas células ataquen la diana. (Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000)).

15 Como agentes terapéuticos para enfermedades mediadas por RAGE, las proteínas de fusión de RAGE pueden no requerir la generación de una respuesta inflamatoria. Por tanto, realizaciones de las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención pueden comprender una proteína de fusión que comprende un polip�ptido de RAGE unido a un(os) dominio(s) de inmunoglobulina(s) en donde se elimina la región bisagra Fc de la inmunoglobulina y se sustituye por un polip�ptido de RAGE. De este modo, puede minimizarse la interacción entre la proteína de fusión de RAGE y receptores de Fc en células inflamatorias. Sin embargo, puede ser importante mantener un apilamiento apropiado y otras interacciones de estructura tridimensional entre los diversos dominios de inmunoglobulina de la proteína de fusión. Por tanto, realizaciones de las proteínas de fusión de la presente invención pueden sustituir el ligador interdominio de RAGE biol�gicamente inerte, pero estructuralmente similar que separa los dominios V y C1

25 de RAGE, o el ligador que separa los dominios C1 y C2 de RAGE, en lugar de la región bisagra normal de la cadena pesada de inmunoglobulina. Por tanto, el polip�ptido de RAGE de la proteína de fusión puede comprender una secuencia de ligador interdominio que se encuentra de manera natural en el sentido C-terminal de un dominio de inmunoglobulina de RAGE para formar un fragmento de ligador/dominio de inmunoglobulina de RAGE. De este modo, pueden mantenerse las interacciones tridimensionales entre los dominios de inmunoglobulina a las que contribuyen o bien RAGE o bien la inmunoglobulina.

En una realización, una proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede comprender un aumento sustancial de la estabilidad farmacocin�tica en comparación con RAGEs. Por ejemplo, la figura 11 muestra que una vez que la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 ha saturado sus ligandos, puede conservar una semivida de más

35 de 300 horas. Esto puede contrastarse con la semivida para RAGEs de tan sólo unas pocas horas en plasma humano.

Por tanto, en una realización, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención pueden usarse para antagonizar la unión de ligandos fisiológicos a RAGE como medio para tratar enfermedades mediadas por RAGE sin generar una cantidad inaceptable de inflamación. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden presentar una disminución sustancial en la generación de una respuesta proinflamatoria en comparación con IgG. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 12, la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 no estimula la liberación de TNF-α a partir de células en condiciones en las que se detecta estimulaci�n por IgG humana de la liberación de TNF-α.

45 Tratamiento de enfermedad con proteínas de fusión de RAGE

En el presente documento se dan a conocer métodos para el tratamiento de un trastorno mediado por RAGE en un sujeto humano. En una realización, el método puede comprender administrar a un sujeto una proteína de fusión que comprende un polip�ptido de RAGE que comprende un sitio de unión a ligando de RAGE unido a un segundo polip�ptido distinto de RAGE. La proteína de fusión comprende un sitio de unión a ligando de RAGE. En una realización, el sitio de unión a ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión a ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE o una porción del mismo. En una realización, el sitio de unión a ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma.

55 El polip�ptido de RAGE puede estar unido a un polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción (por ejemplo, un fragmento del mismo) de un dominio de inmunoglobulina. En una realización, el polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2 o CH3 de una IgG humana.

La proteína o el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) o un fragmento de RAGE humano. En una realización, el polip�ptido de RAGE no incluye ningún residuo de secuencia señal. La secuencia señal de RAGE puede comprender o bien los residuos 1-22 o bien los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1). En realizaciones alternativas, el polip�ptido de RAGE puede

65 comprender una secuencia que es idéntica en un 70%, en un 80% o en un 90% a RAGE humano o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGE humano o un fragmento del mismo, con glicina como primer residuo en vez de metionina (véase por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender RAGE de longitud completa con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (figuras 1A y 1B) o una porción de esa secuencia de amino�cidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender RAGEs (por ejemplo, SEQ ID NO: 4), un polip�ptido

5 idéntico en un 90% a RAGEs o un fragmento de RAGEs. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGEs humano o un fragmento del mismo, con glicina como primer residuo en vez de metionina (véase por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender RAGEs con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) (figura 1C) o una porción de esa secuencia de amino�cidos. En otras realizaciones, la proteína RAGE puede comprender un dominio V (por ejemplo, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; figura 1D). O, puede usarse una secuencia idéntica en un 90% al dominio V o un fragmento del mismo. O, la proteína RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, figura 1D). En una realización, el sitio de unión a ligando puede comprender SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma. Aún en otra realización, el fragmento de RAGE es un p�ptido sintético.

15 La proteína de fusión puede incluir varios tipos de p�ptidos que no se derivan de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polip�ptido de la proteína de fusión comprende un polip�ptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los isotipos conocidos de cadena pesada: IgG (γ), IgM (μ), IgD (ε), IgE (ε) o IgA (α). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los subtipos conocidos de cadena pesada: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polip�ptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como realizaciones de ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de los mismos puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. El p�ptido de

25 inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41.

o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 8) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 124-221 de RAGE humano (SEQ ID NO: 11) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio C1 de RAGE. En otra realización, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 227-317 de RAGE humano (SEQ ID NO: 12) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio C2 de RAGE. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 13) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-123 de

35 RAGE humano (SEQ ID NO: 14) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE y un ligador interdominio en el sentido C-terminal. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 17) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 18) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 y el ligador interdominio que une estos dos dominios. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 5) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o 24-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 6) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente a RAGEs (es decir, que codifica para los dominios V, C1 y C2 y ligadores interdominio). O, pueden usarse fragmentos de cada una de estas secuencias.

45 La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Por tanto, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención comprende un ligador interdominio derivado de RAGE en vez de un polip�ptido bisagra interdominio derivado de una inmunoglobulina.

Por tanto en una realización, la proteína de fusión puede comprender además un polip�ptido de RAGE unido directamente a un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento del mismo. En una realización, el dominio CH2 o un fragmento del mismo comprende SEQ ID NO: 42.

El polip�ptido de RAGE comprende un ligador interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el amino�cido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al

55 amino�cido N-terminal del ligador interdominio, y el amino�cido C-terminal del ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal de un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento del mismo. El polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana. Como realización de ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40.

La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un único dominio o múltiples dominios de RAGE. Además, el polip�ptido de RAGE que comprende un ligador interdominio unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de una proteína RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de proteína RAGE 65 y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer ligador interdominio unido a un segundo

dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo ligador interdominio de RAGE, de tal manera que el amino�cido N-terminal del primer ligador interdominio est� unido al amino�cido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el amino�cido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido C-terminal del primer ligador interdominio, el amino�cido N-terminal del segundo ligador interdominio

5 est� unido al amino�cido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y el amino�cido C-terminal del segundo ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal del polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o fragmento del mismo. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1, el ligador interdominio que une estos dos dominios y un segundo ligador interdominio en el sentido C-terminal de C1. En una realización, un constructo de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios.

15 Alternativamente, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un único dominio de inmunoglobulina de RAGE unido mediante un ligador interdominio de RAGE al amino�cido N-terminal del polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2

o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma o los amino�cidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un ligador interdominio en el sentido C-terminal. En una realización, un constructo de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de tres dominios.

25 Un fragmento de ligador interdominio de RAGE puede comprender una secuencia de p�ptido que se encuentra de manera natural en el sentido C-terminal de, y por tanto, unida a, un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el ligador interdominio puede comprender secuencias de amino�cidos que se encuentran de manera natural en el sentido C-terminal del dominio V. En una realización, el ligador puede comprender SEQ ID NO: 21, correspondiente a los amino�cidos 117-123 de RAGE de longitud completa. O, el ligador puede comprender un p�ptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un ligador interdominio que comprende varios amino�cidos (por ejemplo, 1-3, 1-5 � 1-10 � 115 amino�cidos) en el sentido N-terminal y en el sentido C-terminal de SEQ ID NO: 21. Por tanto, en una realización, el ligador interdominio comprende SEQ ID NO: 23 que comprende los amino�cidos 117-136 de RAGE de longitud

35 completa. O, pueden usarse fragmentos de SEQ ID NO: 21 delecionando, por ejemplo, 1, 2 � 3 amino�cidos de cualquier extremo del ligador. En realizaciones alternativas, el ligador puede comprender una secuencia que es idéntica en un 70% o idéntica en un 80% o idéntica en un 90% a SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.

Para el dominio C1 de RAGE, el ligador puede comprender una secuencia de p�ptido que se encuentra de manera natural en el sentido C-terminal del dominio C1. En una realización, el ligador puede comprender SEQ ID NO: 22, correspondiente a los amino�cidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O, el ligador puede comprender un p�ptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un ligador que comprende varios amino�cidos (1-3, 1-5 � 1-10 � 1-15 amino�cidos) en el sentido N-terminal y en el sentido Cterminal de SEQ ID NO: 22. O, pueden usarse fragmentos de SEQ ID NO: 22, delecionando por ejemplo, 1-3, 1-5 �

45 1-10 � 1-15 amino�cidos de cualquier extremo del ligador. Por ejemplo, en una realización, un ligador interdominio de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 24, correspondiente a los amino�cidos 222-226. O un ligador interdominio puede comprender SEQ ID NO: 44, correspondiente a los amino�cidos 318-342 de RAGE.

En una realización, puede administrarse una proteína de fusión de la presente invención por diversas vías. La administración de la proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede emplear inyección intraperitoneal (i.p.). Alternativamente, la proteína de fusión de RAGE puede administrarse por vía oral, por vía intranasal o como aerosol. En otra realización, administración es intravenosa (i.v.). La proteína de fusión de RAGE también puede inyectarse por vía subcutánea. En otra realización, la administración de la proteína de fusión es intraarterial. En otra realización, la administración es sublingual. Además, la administración puede emplear una cápsula de liberación con

55 el tiempo. Aún en otra realización, la administración puede ser transrectal, tal como mediante un supositorio o similar. Por ejemplo, la administración subcutánea puede ser útil para tratar trastornos crónicos cuando es deseable la administración por el propio paciente.

Se ha usado una variedad de modelos animales para validar el uso de compuestos que modulan RAGE como agentes terapéuticos. Ejemplos de estos modelos son los siguientes:

a) RAGEs inhibió la formación de neo�ntima en un modelo de rata de reestenosis tras lesión arterial en ratas tanto diab�ticas como normales inhibiendo la activación endotelial, de músculo liso y de macr�fagos por medio de RAGE (Zhou et al., Circulation 107:2238-2243 (2003));

65 b) la inhibición de interacciones RAGE/ligando, usando o bien RAGEs o bien un anticuerpo anti-RAGE, redujo la formación de placas amiloides en un modelo de ratón de amiloidosis sist�mica (Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Junto a la reducción de placas amiloides hubo una reducción de las citocinas inflamatorias, interleucina-6 (IL-6) y factor estimulante de colonias de macr�fagos (M-CSF) as� como una activación reducida de NF-kB en los animales tratados;

5 c) ratones transg�nicos para RAGE (ratones que sobreexpresan RAGE y ratones que expresan de manera dominante negativa RAGE) muestran formación de placas y d�ficits cognitivos en un modelo de ratón de EA (Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004));

10 d) El tratamiento de ratas diab�ticas con RAGEs redujo la permeabilidad vascular (Bonnardel-Phu et al., Diabetes,

48: 2052-2058 (1999));

e) El tratamiento con RAGEs redujo las lesiones ateroscler�ticas en ratones nulos para apolipoprote�na E diabéticos y previno los indicios funcionales y morfológicos de nefropat�a diab�tica en ratones db/db (Hudson et al., Arch.

15 Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)); y

f) RAGEs atenu� la intensidad de la inflamación en un modelo de ratón de artritis inducida por col�geno (Hofmann et al., Genes Immunol., 3:123-135 (2002)), un modelo de ratón de encefalomielitis alérgica experimental (Yan et al., Nat. Med. 9:28-293 (2003)) y un modelo de ratón de enfermedad inflamatoria del intestino (Hofmann et al., Cell,

20 97:889-901 (1999)).

Por tanto, en una realización, las proteínas de fusión de la presente invención pueden usarse para tratar un síntoma de diabetes y/o complicaciones resultantes de la diabetes mediados por RAGE. En realizaciones alternativas, el síntoma de diabetes o complicaciones diab�ticas tardías pueden comprender nefropat�a diab�tica, retinopat�a

25 diab�tica, una úlcera de pie diabético, una complicación cardiovascular de diabetes o neuropatía diab�tica.

Originalmente identificado como receptor para moléculas cuya expresión est� asociada con la patología de la diabetes, el propio RAGE es esencial para la fisiopatolog�a de las complicaciones diab�ticas. In vivo, se ha mostrado que la inhibición de la interacción de RAGE con su(s) ligando(s) es terapéutica en múltiples modelos de 30 complicaciones diab�ticas e inflamación (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)). Por ejemplo, un tratamiento de dos meses con anticuerpos anti-RAGE normalizó la función renal y redujo la histopatolog�a renal anómala en ratones diabéticos (Flyvbjerg et al., Diabetes 53: 166-172 (2004)). Además, el tratamiento con una forma soluble de RAGE (RAGEs) que se une a ligandos de RAGE e inhibe interacciones RAGE/ligando, redujo las lesiones ateroscler�ticas en ratones nulos para apolipoprote�na E diabéticos y atenu� la patología funcional y morfológica de

35 nefropat�a diab�tica en ratones db/db (Bucciarelli et al., Circulation 106: 2827-2835 (2002)).

Adem�s, se ha mostrado que la glicoxidaci�n no enzim�tica de macromoléculas que da como resultado en última instancia la formación de productos finales de glicosilaci�n avanzada (AGE) se potencia en sitios de inflamación, en insuficiencia renal, en presencia de hiperglucemia y otros estados asociados con estr�s oxidativo sist�mico o local 40 (Dyer et al., J. Clin. Invest., 91: 2463-2469 (1993); Reddy et al., Biochem., 34:10872-10878 (1995); Dyer et al., J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991); Degenhardt et al., Cell Mol. Biol., 44:1139-1145 (1998)). La acumulación de AGE en la vasculatura puede producirse de manera centrada, como en el amiloide articular compuesto por AGE-β2microglobulina encontrado en pacientes con amiloidosis relacionada con di�lisis (Miyata et al., J. Clin. Invest., 92:1243-1252 (1993); Miyata et al., J. Clin. Invest., 98:1088-1094 (1996)), o de manera general, tal como se muestra 45 a modo de ejemplo mediante la vasculatura y los tejidos de pacientes con diabetes (Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004 (1995)). La acumulación progresiva de AGE a lo largo del tiempo en pacientes con diabetes sugiere que los mecanismos de aclaramiento end�genos no pueden funcionar eficazmente en sitios de deposición de AGE. Tales AGE acumulados tienen la capacidad de alterar las propiedades celulares mediante varios mecanismos. Aunque RAGE se expresa a niveles bajos en tejidos y vasculatura normales, en un entorno en el que se acumulan

50 los ligandos del receptor, se ha mostrado que RAGE se regula por incremento (Li et al., J. Biol. Chem., 272:1649816506 (1997); Li et al., J. Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). La expresión RAGE aumenta en el endotelio, células de músculo liso y fagocitos mononucleares infiltrantes en la vasculatura diab�tica. Además, estudios en cultivo celular han demostrado que la interacción AGE-RAGE provoca cambios en propiedades celulares importantes en la homeostasis vascular.

55 En la figura 13 se ilustra el uso de las proteínas de fusión de RAGE en el tratamiento de la patología relacionada con la diabetes. Se evalu� la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 en un modelo de rata diab�tica de reestenosis que implicó medir la proliferaci�n de músculo liso y la expansión de la íntima tras lesión vascular. Tal como se ilustra en la figura 13, el tratamiento con TTP-4000 puede reducir significativamente la razón íntima/media (I/M) (figura 13A;

60 tabla 1) en la reestenosis asociada con diabetes de una manera sensible a la dosis. Además, el tratamiento con TTP-4000 puede reducir significativamente la proliferaci�n de células del músculo liso vascular asociada con reestenosis de una manera sensible a la dosis.

65 Tabla 1

Efecto de TTP-4000 en modelo de rata de reestenosis

IgG (n=9): TTP-4000 (n=9), dosis baja** (0,3 mg/animal qod x 4) TTP-4000 (n=9), dosis alta** (1,0 mg/animal qod x 4)

�rea de la luz (mm2): 0,2 � 0,03 0,18 � 0,04 0,16 � 0,02

�rea de la media (mm2): 0,12 � 0,01 0,11 � 0,02 0,11 � 0,01

Raz�n I/M: 1,71 � 0,27 1,61 � 0,26 1,44* � 0,15

*P<0,05

** Tanto para la dosis alta como para la baja, se us� una dosis de carga de 3 mg/animal.

En otras realizaciones, las proteínas de fusión de la presente invención también pueden usarse para tratar o revertir

5 amiloidosis y enfermedad de Alzheimer. RAGE es un receptor para amiloide beta (Aβ) as� como otras proteínas amiloidog�nicas incluyendo SAA y amilina (Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997); Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000); Sousa et al., Lab Invest., 80:1101-1110 (2000)). Además, los ligandos de RAGE, incluyendo los AGE, S100b y proteínas Aβ, se encuentran en tejido circundante a la placa senil en el ser humano (Luth et al., Cereb. Cortex 15:211-220 (2005); Petzold et al, Neurosci. Lett., 336:167

10 170 (2003); Sasaki et al., Brain Res., 12:256-262 (2001; Yan et al., Restor. Neurol Neruosci., 12:167-173 (1998)). Se ha mostrado que RAGE se une a material fibrilar de lámina β independientemente de la composición de las subunidades (p�ptido amiloide-β, amilina, amiloide A s�rico, p�ptido derivado de priones) (Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Además, se ha mostrado que la deposición de amiloide da como resultado una expresión potenciada de RAGE. Por ejemplo, en los cerebros de pacientes con

15 enfermedad de Alzheimer (EA), la expresión de RAGE aumenta en neuronas y en la gl�a (Yan, et al., Nature 382:685-691 (1996)). De manera concurrente con la expresión de ligandos de RAGE, RAGE se regula por incremento en astrocitos y células de la microgl�a en el hipocampo de individuos con EA pero no se regula por incremento en individuos que no tienen EA (Lue et al., Exp. Neurol., 171:29-45 (2001)). Estos hallazgos sugieren que las células que expresan RAGE se activan mediante interacciones RAGE/ligando de RAGE en la proximidad de

20 la placa senil. Además, in vitro, la activación mediada por Aβ de células de la microgl�a puede bloquearse con anticuerpos dirigidos contra el dominio de unión a ligando de RAGE (Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997)). También se ha demostrado que RAGE puede servir como punto central para el ensamblaje de fibrillas (Deane et al., Nat. Med. 9:907-913 (2003)).

25 Además, la inhibición in vivo de interacciones RAGE/ligando usando o bien RAGEs o bien un anticuerpo anti-RAGE puede reducir la formación de placas amiloides en un modelo de ratón de amiloidosis sist�mica (Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Ratones dobles transg�nicos que sobreexpresan RAGE humano y proteína precursora de amiloide (APP) humana con las mutaciones Swedish y London (mutante hAPP) en neuronas desarrollan defectos del aprendizaje y anomalías neuropatol�gicas antes que sus equivalentes transg�nicos para hAPP mutantes

30 individuales. En cambio, los ratones dobles transg�nicos con disminución de la capacidad de se�alizaci�n de Aβ debido a neuronas que expresan una forma negativa dominante de RAGE en el mismo trasfondo de hAPP mutante muestran una aparición retardada de anomalías neuropatol�gicas y del aprendizaje en comparación con su equivalente transg�nico para APP individual (Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004)).

35 Además, se ha mostrado que la inhibición de la interacción RAGE-amiloide disminuye la expresión de RAGE celular y marcadores de estr�s celular (as� como la activación de NF-κB) y disminuye la deposición de amiloide (Yan et al., Nat. Med, 6:643-651 (2000)) lo que sugiere un papel para la interacción RAGE-amiloide tanto en la perturbación de las propiedades celulares en un entorno enriquecido para amiloide (incluso en fases tempranas) como en la acumulación de amiloide.

40 Por tanto, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención también pueden usarse para tratar, reducir la amiloidosis y para reducir las placas amiloides y la disfunción cognitiva asociada con enfermedad de Alzheimer (EA). Tal como se describió anteriormente, se ha mostrado que RAGEs reduce tanto la formación de placas amiloides en el cerebro como el posterior aumento de marcadores inflamatorios en un modelo animal de EA. Las figuras 14A y

45 14B muestran que ratones que tienen EA, y se tratan durante 3 meses o bien con TTP-4000 o bien con RAGEs de ratón, tenían menos placas de amiloide beta (Aβ) y menos disfunción cognitiva que animales que recibieron un vehículo o un control negativo de IgG humana (IgG1). Al igual que RAGEs, TTP-4000 también puede reducir las citocinas inflamatorias IL-1 y TNF-α (datos no mostrados) asociadas con EA.

50 Además, pueden usarse proteínas de fusión de la presente invención para tratar la aterosclerosis y otros trastornos cardiovasculares. Por tanto, se ha mostrado que la cardiopat�a isqu�mica es particularmente alta en pacientes con diabetes (Robertson, et al., Lab Invest., 18:538-551 (1968); Kannel et al, J. Am. Med. Assoc., 241:2035-2038 (1979); Kannel et al., Diab. Care, 2:120-126 (1979)). Además, estudios han mostrado que la aterosclerosis en pacientes con diabetes est� más acelerada y es más extensa que en pacientes que no padecen diabetes (véase por ejemplo Waller et al., Am. J. Med., 69:498-506 (1980); Crall et al, Am. J. Med. 64:221-230 (1978); Hamby et al., Chest, 2:251257 (1976); y Pyorala et al., Diab. Metab. Rev., 3: 463-524 (1978)). Aunque los motivos para la aterosclerosis acelerada en el entorno de diabetes son muchos, se ha mostrado que la reducción de AGE puede reducir la

5 formación de placas.

Por ejemplo, las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención también pueden usarse para tratar el accidente cerebrovascular. Cuando se compar� TTP-4000 con RAGEs en un modelo de animal relevante para la enfermedad de accidente cerebrovascular, se encontr� que TTP-4000 proporcionaba una reducción 10 significativamente mayor del volumen de infarto. En este modelo, se liga la arteria carótida media de un ratón y después se somete a reperfusi�n para formar un infarto. Para evaluar la eficacia de proteínas de fusión de RAGE para tratar o prevenir el accidente cerebrovascular, se trataron ratones con RAGEs o TTP-4000 o inmunoglobulina de control justo antes de la reperfusi�n. Tal como puede observarse en la tabla 2, TTP-4000 fue más eficaz que RAGEs en limitar el área de infarto en estos animales lo que sugiere que TTP-4000, debido a su mejor semivida en

15 plasma, podía mantener una protección mayor que RAGEs.

Tabla 2

Reducci�n de infarto en accidente cerebrovascular

% de reducción de infarto**

RAGEs: 15%*

TTP-4000 (300 μg): 38%*

TTP-4000 (300 μg): 21%*

TTP-4000 (300 μg): 10%*

Control de isotipo de IgG (300 μg): 4%

*Significativo para p<0,001; **En comparación con solución salina

20 En otra realización, las proteínas de fusión de la presente invención pueden usarse para tratar el cáncer. En una realización, el cáncer tratado usando las proteínas de fusión de la presente invención comprende células cancerosas que expresan RAGE. Por ejemplo, los c�nceres que pueden tratarse con la proteína de fusión de RAGE de la presente invención incluyen algunos c�nceres de pulmón, algunos gliomas, algunos papilomas y similares. La

25 anfoterina es una proteína de unión a ADN cromos�mico distinta de histona del grupo I de alta movilidad (Rauvala et al., J. Biol. Chem., 262: 16625-16635 (1987); Parkikinen et al., J. Biol. Chem. 268: 19726-19738 (1993)) que se ha mostrado que interacciona con RAGE. Se ha mostrado que la anfoterina promueve el crecimiento de neuritas, as� como sirve como superficie para el ensamblaje de complejos de proteasa en el sistema fibrinol�tico (que también se sabe que contribuye a la movilidad celular). Además, se ha observado un efecto inhibidor del crecimiento tumoral

30 local de bloquear RAGE en un modelo de tumor primario (glioma C6), el modelo de metástasis pulmonar de Lewis (Taguchi et al., Nature 405:354-360 (2000)) y papilomas que surgen de manera espontánea en ratones que expresan el transg�n v-Ha-ras (Leder et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9178-9182 (1990)).

En aún otra realización, pueden usarse proteínas de fusión de la presente invención para tratar la inflamación. Por

35 ejemplo, en realizaciones alternativas, la proteína de fusión de la presente invención se usa para tratar la inflamación asociada con autoinmunidad, inflamación asociada con enfermedad inflamatoria del intestino, inflamación asociada con artritis reumatoide, inflamación asociada con psoriasis, inflamación asociada con esclerosis múltiple, inflamación asociada con hipoxia, inflamación asociada con accidente cerebrovascular, inflamación asociada con infarto de miocardio, inflamación asociada con choque hemorrágico, inflamación asociada con septicemia, inflamación

40 asociada con trasplante de órgano o inflamación asociada con cicatrización de heridas alterada.

Por ejemplo, tras un tratamiento trombol�tico, células inflamatorias tales como granulocitos infiltran el tejido isqu�mico y producen radicales oxígeno que pueden destruir más células de las que se destruyeron por la hipoxia. Se ha mostrado que inhibir el receptor en los neutr�filos responsable de que los neutr�filos puedan infiltrar el tejido 45 con anticuerpos u otros antagonistas proteicos mejora la respuesta. Dado que RAGE es un ligando para este receptor de neutr�filos, una proteína de fusión que contiene un fragmento de RAGE puede actuar como señuelo y prevenir que los neutr�filos circulen al sitio sometido a reperfusi�n y por tanto prevenir una destrucción tisular adicional. El papel de RAGE en la prevención de la inflamación puede indicarse mediante estudios que muestran que RAGEs inhibió la expansión de la neo�ntima en un modelo de rata de reestenosis tras lesión arterial en ratas

50 tanto diab�ticas como normales, supuestamente inhibiendo la proliferaci�n endotelial, de células del músculo liso y la activación de macr�fagos mediante RAGE (Zhou et al., Circulation, 107:2238-2243 (2003)). Además, RAGEs inhibió modelos de inflamación incluyendo hipersensibilidad de tipo retardado, encefalitis autoinmunitaria experimental y enfermedad inflamatoria del intestino (Hofinan et al., Cell, 97:889-901 (1999)).

Adem�s, en una realización, las proteínas de fusión de la presente invención pueden usarse para tratar trastornos con base autoinmunitaria. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la presente invención pueden usarse para tratar la insuficiencia renal. Por tanto, las proteínas de fusión de la presente invención pueden usarse para tratar la nefritis de lupus sist�mico o nefritis de lupus inflamatorio. Por ejemplo, se ha mostrado que S100/calgranulinas comprenden 5 una familia de polip�ptidos de unión a calcio estrechamente relacionados caracterizados por dos regiones de mano EF unidas mediante un p�ptido de conexión (Schafer et al., TIBS, 21:134-140 (1996); Zimmer et al., Brain Res. Bull., 37:417-429 (1995); Rammes et al., J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997); Lugering et al., Eur. J. Clin. Invest., 25:659-664 (1995)). Aunque carecen de p�ptidos señal, se ha sabido desde hace mucho tiempo que S100/calgranulinas acceden al espacio extracelular, especialmente en sitios de respuestas inmunitarias/inflamatorias crónicas, como en fibrosis qu�stica y artritis reumatoide. RAGE es un receptor para muchos miembros de la familia de S100/calgranulina, que media en sus efectos proinflamatorios sobre células tales como linfocitos y fagocitos mononucleares. Además, estudios sobre la respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado, colitis en ratones nulos para IL-10, artritis inducida por col�geno y modelos de encefalitis autoinmunitaria experimental sugieren que la interacción RAGE-ligando (supuestamente con S-100/calgranulinas) tiene un papel proximal en la cascada

15 inflamatoria.

Por tanto, en el presente documento se da a conocer un método para inhibir la interacción de un AGE con RAGE en un sujeto administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de la presente invención. El sujeto tratado usando las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención puede ser un animal. En una realización, el sujeto es un ser humano. El sujeto puede padecer una enfermedad relacionada con AGE tal como diabetes, complicaciones diab�ticas tales como nefropat�a, neuropatía, retinopat�a, úlcera de pie, amiloidosis o insuficiencia renal, e inflamación. O, el sujeto puede ser un individuo con enfermedad de Alzheimer. En una realización alternativa, el sujeto puede ser un individuo con cáncer. En aún otras realizaciones, el sujeto puede padecer lupus eritematoso sist�mico o nefritis de lupus inflamatorio. Otras enfermedades pueden estar mediadas por

25 RAGE y, por tanto, pueden tratarse usando las proteínas de fusión de la presente invención. Por tanto, en realizaciones alternativas adicionales de la presente invención, las proteínas de fusión pueden usarse para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, artritis, vasculitis, nefropat�as, retinopat�as y neuropatías en sujetos humanos o animales.

Una cantidad terapéuticamente eficaz puede comprender una cantidad que puede prevenir la interacción de RAGE con un AGE u otros tipos de ligandos de RAGE end�genos en un sujeto. Por consiguiente, la cantidad variar� con el sujeto que est� tratándose. La administración del compuesto puede ser horaria, diaria, semanal, mensual, anual o como un único acontecimiento. En diversas realizaciones alternativas, la cantidad eficaz de la proteína de fusión puede oscilar entre aproximadamente 1 ng/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o

35 entre aproximadamente 10 μg/kg de peso corporal y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal o entre aproximadamente 100 μg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. La cantidad eficaz real puede establecerse mediante ensayos de dosis/respuesta usando métodos convencionales en la técnica (Johnson et al., Diabetes. 42: 1179, (1993)). Por tanto, tal como conocen aquellos en la técnica, la cantidad eficaz puede depender de la biodisponibilidad, bioactividad y biodegradabilidad del compuesto.

Composiciones

La presente invención puede comprender una composición que comprende una proteína de fusión de la presente invención mezclada con un portador farmac�uticamente aceptable. La proteína de fusión comprende un polip�ptido

45 de RAGE unido a un segundo polip�ptido distinto de RAGE. La proteína de fusión comprende un sitio de unión a ligando de RAGE. En una realización, el sitio de unión a ligando comprende el dominio más N-terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión a ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE o una porción del mismo. En una realización, el sitio de unión a ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma.

El polip�ptido de RAGE est� unido a un polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción (por ejemplo, un fragmento del mismo) de un dominio de inmunoglobulina. En una realización, el polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2

o CH3 de una IgG humana.

55 La proteína o el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) o un fragmento de RAGE humano. En una realización, el polip�ptido de RAGE no incluye ningún residuo de secuencia señal. La secuencia señal de RAGE puede comprender o bien los residuos 1-22 o bien los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1). En realizaciones alternativas, el polip�ptido de RAGE puede comprender una secuencia que es idéntica en un 70%, en un 80% o en un 90% a RAGE humano o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGE humano o un fragmento del mismo, con glicina como primer residuo en vez de metionina (véase por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender RAGE de longitud completa con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (figuras 1A y 1B) o una porción de esa secuencia de amino�cidos. Las proteínas de

65 fusión de la presente invención también pueden comprender RAGEs (por ejemplo, SEQ ID NO: 4), un polip�ptido idéntico en un 90% a RAGEs o un fragmento de RAGEs. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender RAGEs humano o un fragmento del mismo, con glicina como primer residuo en vez de metionina (véase por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O, el RAGE humano puede comprender RAGEs con la secuencia señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) (figura 1C) o una porción de esa secuencia de amino�cidos. En otras realizaciones, la proteína RAGE puede comprender un dominio V (por ejemplo, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8;

5 figura 1D). O, puede usarse una secuencia idéntica en un 90% al dominio V o un fragmento del mismo. O, la proteína RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, figura 1D). En una realización, el sitio de unión a ligando puede comprender SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica en un 90% a la misma. En aún otra realización, el fragmento de RAGE es un p�ptido sintético.

o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 8) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 124-221 de RAGE humano (SEQ ID NO: 11) o una secuencia idéntica en un 90% a la 15 misma, correspondiente al dominio C1 de RAGE. En otra realización, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 227-317 de RAGE humano (SEQ ID NO: 12) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio C2 de RAGE. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 13) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 14) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V de RAGE y al ligador interdominio en el sentido C-terminal. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 17) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, o los amino�cidos 24-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 18) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1 y el ligador interdominio que une esos dos dominios. O, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 5) o una secuencia idéntica

25 en un 90% a la misma, o 24-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 6) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente a RAGEs (es decir, que codifican para los dominios V, C1 y C2 y ligadores interdominios). O, pueden usarse fragmentos de cada una de estas secuencias.

La proteína de fusión puede incluir varios tipos de p�ptidos que no se derivan de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polip�ptido de la proteína de fusión comprende un polip�ptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los isotipos conocidos de cadena pesada: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε) o IgA (α). Además, la cadena pesada (o porción de la misma) puede derivarse de uno cualquiera de los subtipos conocidos de cadena pesada: IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgA1 (α1), IgA2 (α2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo

35 polip�ptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de cualquiera, o ambos, de estos dominios. Como realizaciones a modo de ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana o una porción de los mismos puede comprender SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 40. El p�ptido de inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 o SEQ ID NO: 41.

La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Por tanto, la proteína de fusión de RAGE de la presente invención comprende un ligador interdominio derivado de RAGE en vez de un polip�ptido bisagra interdominio derivado de una inmunoglobulina.

Por tanto en una realización, la proteína de fusión puede comprender además un polip�ptido de RAGE directamente

45 unido a un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento del mismo. En una realización, el dominio CH2, o un fragmento del mismo, comprende SEQ ID NO: 42.

El polip�ptido de RAGE comprende un ligador interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de tal manera que el amino�cido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido N-terminal del ligador interdominio, y el amino�cido C-terminal del ligador interdominio de RAGE est� directamente unido al amino�cido N-terminal de un polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento del mismo. El polip�ptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina,

o una porción del mismo, puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana. Como realización de

ejemplo, el polip�ptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una IgG1 humana puede comprender SEQ ID NO: 55 38 o SEQ ID NO: 40.

La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un único dominio o múltiples dominios de RAGE. Además, el polip�ptido de RAGE que comprende un ligador interdominio unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de una proteína RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de proteína RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer ligador interdominio unido a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo ligador interdominio de RAGE, de tal manera que el amino�cido N-terminal del primer ligador interdominio est� unido al amino�cido C-terminal del primer dominio de 65 inmunoglobulina de RAGE, el amino�cido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido C-terminal del primer ligador interdominio, el amino�cido N-terminal del segundo ligador interdominio

est� unido al amino�cido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y el amino�cido C-terminal del segundo ligador interdominio de RAGE est� directamente unido al amino�cido N-terminal del polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o fragmento del mismo. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19) o una secuencia idéntica en un 90% a la

5 misma o los amino�cidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma, correspondiente al dominio V, el dominio C1, el ligador interdominio que une estos dos dominios y un segundo ligador interdominio en el sentido C-terminal de C1. En una realización, un constructo de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 30 o un fragmento del mismo puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de cuatro dominios.

10 Alternativamente, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polip�ptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un único dominio de inmunoglobulina de RAGE por medio de un ligador interdominio de RAGE al amino�cido N-terminal del polip�ptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2

15 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polip�ptido de RAGE puede comprender los amino�cidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma o los amino�cidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16) o una secuencia idéntica en un 90% a la misma correspondiente al dominio V de RAGE y un ligador interdominio en el sentido C-terminal. En una realización, un constructo de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 31 o un fragmento del mismo puede codificar para una proteína de fusión de RAGE de tres

20 dominios.

Un fragmento de ligador interdominio de RAGE puede comprender una secuencia pept�dica que est� de manera natural en el sentido C-terminal de, y por tanto, unida a, un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el ligador interdominio puede comprender secuencias de amino�cidos que est�n de manera 25 natural en el sentido C-terminal del dominio V. En una realización, el ligador puede comprender SEQ ID NO: 21, correspondiente a los amino�cidos 117-123 de RAGE de longitud completa. O, el ligador puede comprender un p�ptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un ligador interdominio que comprende varios amino�cidos (por ejemplo, 1-3, 1-5 � 1-10 � 1-15 amino�cidos) en el sentido Nterminal y en el sentido C-terminal de SEQ ID NO: 21. Por tanto, en una realización, el ligador interdominio

30 comprende SEQ ID NO: 23 que comprende los amino�cidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O, pueden usarse fragmentos de SEQ ID NO: 21 delecionando, por ejemplo, 1, 2 � 3 amino�cidos de cualquier extremo del ligador. En realizaciones alternativas, el ligador puede comprender una secuencia que es idéntica en un 70% o idéntica en un 80% o idéntica en un 90% a SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 23.

35 Para el dominio C1 de RAGE, el ligador puede comprender una secuencia pept�dica que est� de manera natural en el sentido C-terminal del dominio C1. En una realización, el ligador puede comprender SEQ ID NO: 22, correspondiente a los amino�cidos 222-251 de RAGE de longitud completa. O, el ligador puede comprender un p�ptido que tiene porciones adicionales de la secuencia de RAGE natural. Por ejemplo, puede usarse un ligador que comprende varios amino�cidos (1-3, 1-5 � 1-10 � 1-15 amino�cidos) en el sentido N-terminal y en el sentido C

40 terminal de SEQ ID NO: 22. O, pueden usarse fragmentos de SEQ ID NO: 22, delecionando por ejemplo, 1-3, 1-5 � 1-10 � 1-15 amino�cidos de cualquier extremo del ligador. Por ejemplo, en una realización, un ligador interdominio de RAGE puede comprender SEQ ID NO: 24, correspondiente a los amino�cidos 222-226. O un ligador interdominio puede comprender SEQ ID NO: 44, correspondiente a los amino�cidos 318-342 de RAGE.

45 Los portadores farmac�uticamente aceptables pueden comprender cualquiera de los portadores farmac�uticamente aceptados convencionales conocidos en la técnica. El portador puede comprender un diluyente. En una realización, el portador farmacéutico puede ser un líquido y la proteína de fusión o el constructo de ácido nucleico puede estar en forma de una disolución. En otra realización, el portador farmac�uticamente aceptable puede ser un sólido en forma de un polvo, un polvo liofilizado o un comprimido. O, el portador farmacéutico puede ser un gel, supositorio o

50 crema. En realizaciones alternativas, el portador puede comprender un liposoma, una microc�psula, una célula o un virus encapsulado en pol�mero. Por tanto, el término portador farmac�uticamente aceptable abarca, pero no se limita a, cualquiera de los portadores farmac�uticamente aceptados convencionales, tales como agua, alcoholes, solución salina tamponada con fosfato, azúcares (por ejemplo, sacarosa o manitol), aceites o emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua o una emulsión de triglic�ridos, diversos tipos de agentes humectantes, comprimidos,

55 comprimidos recubiertos y cápsulas.

La administración de las proteínas de fusión de RAGE de la presente invención puede emplear diversas vías. Por tanto, la administración de la proteína de fusión de RAGE de la presente invención puede emplear inyección intraperitoneal (i.p.). Alternativamente, la proteína de fusión de RAGE puede administrarse por vía oral, intranasal o 60 como aerosol. En otra realización, la administración es intravenosa (i.v.). La proteína de fusión de RAGE también puede inyectarse por vía subcutánea. En otra realización, la administración de la proteína de fusión es intraarterial. En otra realización, administración es sublingual. Además, la administración puede emplear una cápsula de liberación en el tiempo. En aún otra realización, la administración puede ser transrectal, como mediante un supositorio o similar. Por ejemplo, la administración subcutánea puede ser útil para tratar trastornos crónicos cuando

65 es deseable la administración por el propio paciente.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una disolución inyectable estéril en un vehículo o disolvente parenteralmente aceptable, no tóxico. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse est�n agua, solución de Ringer, 3-butanodiol, disolución isot�nica de cloruro de sodio o tampones acuosos, tales como por ejemplo, tampones citrato, acetato, glicina, histidina, fosfato, tris o succinato fisiológicamente aceptables.

5 La disolución inyectable puede contener estabilizadores para proteger frente a la degradación química y la formación de agregados. Los estabilizadores pueden incluir antioxidantes tales como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT), tampones (citratos, glicina, histidina) o tensioactivos (polisorbato 80, polox�meros). La disolución también puede contener conservantes antimicrobianos, tales como alcohol benc�lico y parabenos. La disolución también puede contener tensioactivos para reducir la agregación, tales como polisorbato 80, polox�mero u otros tensioactivos conocidos en la técnica. La disolución también puede contener otros aditivos, tales como un azúcar/azúcares o solución salina, para ajustar la presión osm�tica de la composición para que sea similar a la sangre humana.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de un polvo liofilizado estéril para inyección tras la

15 reconstitución con un diluyente. El diluyente puede ser agua para inyección, agua bacteriost�tica para inyección o solución salina estéril. El polvo liofilizado puede producirse mediante secado por congelación de una disolución de la proteína de fusión para producir la proteína en forma seca. Tal como se conoce en la técnica, la proteína liofilizada tiene generalmente una estabilidad aumentada y una mayor vida útil de almacenamiento que una disolución líquida de la proteína. El polvo liofilizado (torta) puede contener un tampón para ajustar el pH, tal como por ejemplo tampón citrato, acetato, glicina, histidina, fosfato, tris o succinato fisiológicamente aceptable. El polvo liofilizado también puede contener lioprotectores para mantener su estabilidad física y química. Los lioprotectores comúnmente usados son azúcares no reductores y disac�ridos tales como sacarosa, manitol o trehalosa. El polvo liofilizado puede contener estabilizadores para proteger frente a la degradación química y la formación de agregados. Los estabilizadores pueden incluir, pero no se limitan a antioxidantes (BHA, BHT), tampones (citratos, glicina, histidina) o

25 tensioactivos (polisorbato 80, polox�meros). El polvo liofilizado también puede contener conservantes antimicrobianos, tales como alcohol benc�lico y parabenos. El polvo liofilizado también puede contener tensioactivos para reducir la agregación, tales como, pero sin limitarse a, polisorbato 80 y polox�mero. El polvo liofilizado también puede contener aditivos (por ejemplo, azúcares o solución salina) para ajustar la presión osm�tica para que sea similar a la sangre humana tras la reconstitución del polvo. El polvo liofilizado también puede contener agentes de carga, tales como azúcares y disac�ridos.

Las composiciones farmacéuticas para inyección también pueden estar en forma de una suspensión oleaginosa. Esta suspensión puede formularse según los métodos conocidos usando agentes de dispersi�n o humectantes y agentes de suspensión adecuados tal como se describió anteriormente. Además, se emplean convenientemente

35 aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Con este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido usando mono o diglic�ridos sintéticos. Además, pueden formularse suspensiones aceitosas suspendiendo el principio activo en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco o en un aceite mineral tal como una parafina líquida. Por ejemplo, ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran uso en la preparación de productos inyectables. Las suspensiones aceitosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina sólida o alcohol cet�lico. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante tal como ácido asc�rbico.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua o suspensiones acuosas. La fase aceitosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite

45 de cacahuete o un aceite mineral, por ejemplo una parafina líquida o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas que se producen de manera natural, por ejemplo goma arábiga o goma tragacanto, fosf�tidos que se producen de manera natural, por ejemplo semilla de soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anh�dridos de hexitol, por ejemplo monooleato de sorbitano, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo polioxietilensorbitano.

Las suspensiones acuosas también pueden contener los compuestos activos en mezcla con excipientes. Tales excipientes pueden incluir agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa sádica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; agentes de dispersi�n o humectantes, tales como un fosf�tido que se produce de manera natural tal como lecitina o productos

55 de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alif�ticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxicetanol o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tales como monooleato de polioxietilensorbitol o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anh�dridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitano.

Los polvos dispersables y gránulos adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua pueden proporcionar el compuesto activo en mezcla con un agente de dispersi�n, agente de suspensión y uno o más conservantes. Anteriormente se describieron conservantes, agentes de dispersi�n y agentes de suspensión adecuados.

65 Las composiciones también pueden estar en forma de supositorios para administración rectal de los compuestos de la invención. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente adecuado no irritante que es sólido a temperaturas habituales pero líquido a la temperatura rectal y por tanto se fundir� en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao y polietilenglicoles, por ejemplo.

5 Para uso t�pico, pueden usarse cremas, pomadas, jaleas, disoluciones o suspensiones que contienen los compuestos de la invención. Las aplicaciones típicas también pueden incluir enjuagues bucales y gárgaras. Pueden usarse conservantes, antioxidantes tales como BHA y BHT, dispersantes, tensioactivos o tampones adecuados.

Los compuestos de la presente invención también pueden administrarse en forma de sistemas de administración de

10 liposoma, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes y vesículas multilaminares. Pueden formarse liposomas a partir de una variedad de fosfol�pidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.

En determinadas realizaciones, los compuestos de la presente invención pueden modificarse para retrasar

15 adicionalmente el aclaramiento de la circulación mediante enzimas metabólicas. En una realización, los compuestos pueden modificarse mediante la unión covalente de pol�meros solubles en agua tales como polietilenglicol (PEG), copol�meros de PEG y polipropilenglicol, polivinilpirrolidona o poliprolina, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vin�lico) y similares. Tales modificaciones también pueden aumentar la solubilidad del compuesto en disolución acuosa. Pueden unirse de manera covalente pol�meros tales como PEG a uno o más residuos amino reactivo,

20 residuos sulfhidrilo o residuos carboxilo. Se han descrito numerosas formas activadas de PEG, incluyendo ésteres activos de ácido carbox�lico o derivados de carbonato, particularmente aquellas en las que los grupos salientes son N-hidroxsuccinimida, p-nitrofenol, imidazol o 1-hidroxi-2-nitrobenceno-3-sulfona para su reacción con grupos amino, derivados de haloacetilo o multimodales para su reacción con grupos sulfhidrilo, y derivados de aminohidrazina o hidrazida para su reacción con grupos carbohidrato.

25 En las patentes estadounidenses n.os 6.267.958 y 5.567.677 se describen métodos adicionales para la preparación de formulaciones de proteínas que pueden usarse con las proteínas de fusión de la presente invención.

En un aspecto adicional, los moduladores de RAGE de la invención se utilizan en tratamientos de terapia adyuvante

30 o terapia de combinación con otros agentes terapéuticos conocidos. Lo siguiente es una lista no exhaustiva de adyuvantes y agentes terapéuticos adicionales que pueden usarse en combinación con los moduladores de proteína de fusión de RAGE de la presente invención:

Clasificaciones farmacol�gicas de agentes anticancer�genos: 35

1.: Agentes alquilantes: ciclofosfamida, nitrosoureas, carboplatino, cisplatino, procarbazina

2.: Antibióticos: bleomicina, daunorubicina, doxorubicina

40 3. Antimetabolitos: metotrexato, citarabina, fluorouracilo

4. Alcaloides vegetales: vinblastina, vincristina, etop�sido, paclitaxel

5. Hormonas: tamoxifeno, acetato de octreotida, finasterida, flutamida 45

6. Modificadores de la respuesta biológica: interferones, interleucinas

Clasificaciones farmacol�gicas del tratamiento para artritis reumatoide

50 1. Analgésicos: aspirina

2. AINE (antiinflamatorios no esteroideos): ibuprofeno, naproxeno, diclofenaco

3. FARME (fármacos antirreum�ticos modificadores de la enfermedad): metotrexato, preparaciones de oro, 55 hidroxicloroquina, sulfasalazina

4. Modificadores de la respuesta biológica, FARME: etanercept, infliximab, glucocorticoides

Clasificaciones farmacol�gicas del tratamiento para la diabetes mellitus 60

1.: Sulfonilureas: tolbutamida, tolazamida, gliburida, glipizida

2.: Biguanidas: metformina

65 3. Diversos agentes orales: acarbosa, troglitazona 4. Insulina

Clasificaciones farmacol�gicas del tratamiento para la enfermedad de Alzheimer

5 1. Inhibidor de la colinesterasa: tacrina, donepezilo

2. Antipsic�ticos: haloperidol, tioridazina

3. Antidepresivos: desipramina, fluoxetina, trazodona, paroxetina 10

4. Anticonvulsivos: carbamazepina, ácido valproico

En el presente documento se da a conocer un método de tratamiento de enfermedades mediadas por RAGE, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una 15 proteína de fusión de RAGE en combinación con agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste en agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides vegetales, antibióticos, hormonas, modificadores de la respuesta biológica, analgésicos, AINE, FARME, glucocorticoides, sulfonilureas, biguanidas, insulina, inhibidores de la colinesterasa, antipsic�ticos, antidepresivos y anticonvulsivos. En una realización adicional, la presente invención proporciona la composición farmacéutica de la invención tal como se describió anteriormente, que comprende

20 además uno o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste en agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides vegetales, antibióticos, hormonas, modificadores de la respuesta biológica, analgésicos, AINE, FARME, glucocorticoides, sulfonilureas, biguanidas, insulina, inhibidores de la colinesterasa, antipsic�ticos, antidepresivos y anticonvulsivos.

25 Ejemplos

Las características y ventajas del concepto inventivo cubierto por la presente invención se ilustran adicionalmente en los ejemplos que siguen.

30 Ejemplo 1: Producción de proteínas de fusión de RAGE-Fc de IgG

Se construyeron dos pl�smidos para expresar proteínas de fusión de RAGE-Fc de IgG. Se construyeron ambos pl�smidos ligando diferentes longitudes de una secuencia de ADNc en 5’ de RAGE humano con la misma secuencia de ADNc en 3’ de Fc de IgG humana (γ1). Se insertaron entonces estas secuencias de expresión (es decir, 35 productos de ligamiento) en el vector de expresión pcDNA3.1 (Invitrogen, CA). Las secuencias de ácido nucleico que codifican para la región que codifica para la proteína de fusión se muestran en las figuras 2 y 3. Para la proteína de fusión TTP-4000, la secuencia de ácido nucleico desde 1 hasta 753 (destacada en negrita) codifica para la secuencia de proteína N-terminal de RAGE, mientras que la secuencia de ácido nucleico desde 754 hasta 1386 codifica para la secuencia de proteína Fc de IgG (figura 2). Para TTP-3000, la secuencia de ácido nucleico desde 1

40 hasta 408 (destacada en negrita) codifica para la secuencia de proteína N-terminal de RAGE, mientras que la secuencia de ácido nucleico desde 409 hasta 1041 codifica para la secuencia de proteína Fc de IgG (figura 3).

Para producir las proteínas de fusión de RAGE, se transfectaron de manera estable los vectores de expresión que comprenden las secuencias de ácido nucleico de o bien SEQ ID NO: 30 o bien SEQ ID NO: 31 en células CHO. Se

45 seleccionaron transformantes positivos para resistencia a neomicina conferida mediante el pl�smido y se clonaron. Se expandieron clones de alta producción tal como se detectaron mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western y se purificó el producto g�nico mediante cromatograf�a de afinidad usando columnas de proteína A. Se optimizó la expresión de modo que las células estuviesen produciendo TTP-4000 recombinante a niveles de aproximadamente 1,3 gramos por litro.

50 Los polip�ptidos expresados que codifican para las dos proteínas de fusión se ilustran en las figuras 4-6. Para la estructura de cuatro dominios de TTP-4000, los primeros 251 amino�cidos (mostrados en negrita en la figura 4) contienen una secuencia señal (1-22/23), el dominio de inmunoglobulina V (y de unión a ligando) (23/24-116), un segundo ligador interdominio (117-123), un segundo dominio de inmunoglobulina (CH1) (124-221) y un segundo

55 ligador (222-251) de la proteína RAGE humana (figuras 4, 6B). La secuencia desde 252 hasta 461 incluye los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 de IgG.

Para la estructura de tres dominios de TTP-3000, los primeros 136 amino�cidos (mostrados en negrita) contienen una secuencia señal (1-22/23), el dominio de inmunoglobulina V (y de unión a ligando) (23/24-116) y una secuencia 60 de ligador interdominio (117-136) de la proteína RAGE humana (figuras 5, 6B). Además, para TT3, la secuencia desde 137 hasta 346 incluye los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 de IgG.

Ejemplo 2: Método para someter a prueba la actividad de una proteína de fusión de RAGE-IgG1

65 A. Unión a ligando in vitro:

Se recubrieron ligandos de RAGE conocidos sobre la superficie de placas Maxisorb a una concentración de 5 microgramos por pocillo. Se incubaron las placas a 4�C durante la noche. Tras la incubaci�n con ligando, se aspiraron las placas y se a�adi� un tampón de bloqueo de BSA al 1% en tampón imidizol 50 mM (pH 7,2) a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces se aspiraron las placas y/o se lavaron con tampón de 5 lavado (imidizol 20 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05%, CaCl2 5 mM y MgCl2 5 mM, pH 7,2). Se prepararon una disolución de TTP-3000 (TT3) a una concentración inicial de 1,082 mg/ml y una disolución de TTP-4000 (TT4) a una concentración inicial de 370 μg/ml. Se a�adi� la proteína de fusión a diluciones crecientes de la muestra inicial. Se permitió que la proteína de fusión de RAGE se incubase con el ligando inmovilizado a 37�C durante una hora tras lo cual se lav� la placa y se sometió a ensayo para detectar la unión de la proteína de fusión. Se detect� la unión mediante la adición de un complejo de inmunodetecci�n que contenía un anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG1 humana diluido 1:11.000 hasta una concentración de ensayo final (FAC) de 21 ng/100 μl, un anticuerpo de cabra biotinilado anti-IgG de ratón diluido 1:500, a una FAC de 500 ng/μl y una fosfatasa alcalina unida a avidina. Se incub� el complejo con la proteína de fusión inmovilizada durante una hora a temperatura ambiente tras lo cual se lav� la placa y se a�adi� el sustrato de fosfatasa alcalina fosfato de para-nitrofenilo (PNPP). Se cuantific� la unión

15 del complejo a la proteína de fusión inmovilizada midiendo la conversión de PNPP en para-nitrofenol (PNP) que se midió espectrofotom�tricamente a 405 nm.

Tal como se ilustra en la figura 7, las proteínas de fusión TTP-4000 (TT4) y TTP-3000 (TT3) interaccionan específicamente con los ligandos de RAGE conocidos amiloide beta (Abeta), S100b (S100) y anfoterina (Ampho). En ausencia de ligando, es decir, recubrimiento con BSA sola (BSA o BSA + lavado), no hubo aumento en la absorbancia por encima de niveles atribuibles a unión no específica del complejo de inmunodetecci�n. Cuando se usa amiloide beta como ligando marcado, puede ser necesario preincubar el amiloide beta antes del ensayo. La preincubaci�n puede permitir que el amiloide beta se autoagregue en forma de lámina plegada, ya que el amiloide beta puede unirse preferentemente a RAGE en forma de una lámina plegada.

25 Se muestran a modo de ejemplo pruebas adicionales de una interacción específica entre las proteínas de fusión de RAGE TTP-4000 y TTP-3000 con ligandos de RAGE en estudios que muestran que un ligando de RAGE puede competir eficazmente con un ligando de RAGE conocido por la unión a las proteínas de fusión. En estos estudios, se inmoviliz� amiloide beta (A-beta) sobre una placa Maxisorb y se a�adi� la proteína de fusión tal como se describió anteriormente. Además, se a�adi� un ligando de RAGE a algunos de los pocillos al mismo tiempo que la proteína de fusión.

Se encontr� que el ligando de RAGE podía bloquear la unión de TTP-4000 (TT4) en de aproximadamente el 25% al 30% cuando estaba presente TTP-4000 a 123 μg/ml (dilución 1:3, figura 8). Cuando la disolución inicial de TTP-4000

35 se diluyó en un factor de 10 � 30 (1:10 � 1:30), la unión de la proteína de fusión al ligando inmovilizado se inhibía completamente por el ligando de RAGE. De manera similar, el ligando de RAGE bloqueaba la unión de TTP-3000 (TT3) en aproximadamente el 50% cuando estaba presente TTP-3000 a 360 μg/ml (dilución 1:3, figura 9). Cuando la disolución inicial de TTP-3000 se diluyó en un factor de 10 (1:10), la unión de la proteína de fusión al ligando inmovilizado se inhibió completamente por el ligando de RAGE. Por tanto, la especificidad de unión de la proteína de fusión de RAGE al ligando de RAGE era dependiente de la dosis. Además, tal como se muestra en las figuras 8 y 9, no había esencialmente unión detectada en ausencia de proteína de fusión, es decir, usando sólo el complejo de inmunodetecci�n (“complejo solo”).

B. Efecto de proteínas de fusión de RAGE en un ensayo basado en células

45 El trabajo previo ha mostrado que las células THP-1 mieloides pueden secretar TNF-α, en respuesta a ligandos de RAGE. En este ensayo, se cultivaron células THP-1 en medios RPMI-1640 complementados con FBS al 10% usando un protocolo proporcionado por la ATCC. Se indujeron las células para que secretaran TNF-α por medio de estimulaci�n de RAGE con S100b 0,1 mg/ml tanto en ausencia como en presencia de las proteínas de fusión TTP3000 (TT3) o TTP-4000 (TT4) (10 μg), RAGEs (10 μg) y una IgG humana (10 μg) (es decir, como control negativo). Se midió la cantidad de TNF-α secretada por las células THP-1 24 horas tras la adición de las proteínas al cultivo celular usando un kit de ELISA disponible comercialmente para TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los resultados en la figura 10 demuestran que las proteínas de fusión inhiben la producción de TNF-α inducida por S100b/RAGE en estas células. Tal como se muestra en la figura 10, tras la adición de 10 μg de proteína de fusión de

55 RAGE TTP-3000 o TTP-4000, la inducción de TNF-α por S100b (FAC 0,1 mg/ml) se redujo en de aproximadamente el 45% al 70%, respectivamente. La proteína de fusión TTP-4000 puede ser al menos tan eficaz en el bloqueo de la inducción de TNF-α por S100b como lo es RAGEs (figura 10). La especificidad de la inhibición para las secuencias de RAGE de TTP-4000 y TTP-3000 se muestra mediante el experimento en el que se a�adi� IgG sola a células estimuladas con S100b. La adición de IgG y S100b al ensayo muestra los mismos niveles de TNF-α que S100b solo. La especificidad de la inhibición de la inducción de TNF-α por TTP-4000 y TTP-3000 para secuencias de RAGE de la proteína de fusión se muestra mediante un experimento en el que se a�adi� IgG sola a células estimuladas con S100b. Puede observarse que la adición de IgG, es decir, IgG humana sin la secuencia de RAGE (IgG humana de Sigma añadida a 10 μg/pocillo), y S100b al ensayo muestra los mismos niveles de TNF-α que S100b solo.

65 Ejemplo 3: Perfil farmacocin�tico de TTP-4000 Para determinar si TTP-4000 tendría un perfil farmacocin�tico superior en comparación con RAGEs humano, se les administr� a ratas y primates no humanos una inyección intravenosa (i.v.) de TTP-4000 (5 mg/kg) y entonces se sometió a ensayo el plasma para detectar la presencia de TTP-4000. En estos experimentos, dos monos macho sin

5 tratamiento previo recibieron una única dosis de bolo i.v. de TTP-4000 (5 mg/ml/kg) en una vena periférica seguido por un lavado con solución salina de aproximadamente 1,0 mililitros (ml). Se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 1,0 ml) antes de la dosis (es decir, antes de la inyección de la TTP-4000), o a 0,083, 0,25, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288 y 336 horas tras la dosis en tubos que contenían (heparina de litio). Tras la recogida, se colocaron los tubos sobre hielo húmedo (máximo 30 minutos) hasta la centrifugaci�n bajo refrigeración (a de 2 a 8�C) a 1500 x g durante 15 minutos. Entonces se almacen� cada muestra de plasma recogida en congelación (-70�C � 10�C) hasta que se sometió a ensayo para detectar polip�ptido de RAGE usando un ELISA a diversos puntos de tiempo tras la inyección, tal como se describe en el ejemplo 6.

El perfil cinético mostrado en la figura 11 revela que una vez que TTP-4000 ha saturado sus ligandos tal como se

15 demuestra por la pendiente bastante pronunciada de la fase alfa en 2 animales, conserva una semivida terminal de más de 300 horas. Esta semivida es significativamente mayor que la semivida de RAGEs humano en plasma (generalmente de aproximadamente 2 horas) y proporciona una oportunidad para inyecciones únicas para indicaciones agudas y semicr�nicas. En la figura 11 cada curva representa un animal diferente en las mismas condiciones experimentales.

Ejemplo 4: Activación de Fc por TTP-4000

Se realizaron experimentos para medir la activación del receptor de Fc por la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 en comparación con IgG humana. Se midió la activación del receptor de Fc midiendo la secreción de TNF-α a partir

25 de células THP-1 que expresan el receptor de Fc. En estos experimentos, se recubri� una placa de 96 pocillos con 10 μg/pocillo de TTP-4000 o IgG humana. La estimulaci�n de Fc da como resultado secreción de TNF-α. Se midió la cantidad de TNF-α mediante un ensayo de inmunoabsorci�n ligado a enzimas (ELISA).

Por tanto, en este ensayo, se mantuvo la línea celular mieloide, THP-1 (n.� de la ATTC TIB-202) en medios RPMI1640 complementados con suero bovino fetal al 10% según las instrucciones de la ATCC. Normalmente, se indujeron 40.000-80.000 células por pocillo para que secretaran TNF-alfa por medio de estimulaci�n del receptor de Fc recubriendo previamente el pocillo con 10 ug/pocillo de o bien TTP-4000 agregada con calor (63�C durante 30 min) o bien IgG1 humana. Se midió la cantidad de TNF-alfa secretada por las células THP-1 en sobrenadantes recogidos de cultivos de 24 horas de células en los pocillos tratados usando un kit de ELISA de TNF disponible

35 comercialmente (R&D Systems, Minneapolis, MN n.� DTA00C) según las instrucciones.

Se muestran los resultados en la figura 12 en la que puede observarse que TTP-4000 genera menos de 2 ng/pocillo de TNF e IgG generaba más de 40 ng/pocillo.

Ejemplo 5: Actividad in vivo de TTP-4000

Se compar� la actividad de TTP-4000 con RAGEs en varios modelos in vivo de enfermedad humana.

A. TTP-4000 en un modelo animal de reestenosis

45 Se evalu� la proteína de fusión de RAGE TTP-4000 en un modelo de rata diab�tica de reestenosis que implicaba medir la proliferaci�n de músculo liso y la expansión de la íntima 21 días tras una lesión vascular. En estos experimentos, se realizó una lesión con bal�n de la arteria carótida común en ratas diab�ticas y no diab�ticas Zucker usando un procedimiento convencional. Se administr� por vía intraperitoneal (i.p.) una dosis de carga (3 mg/rata) de IgG, TTP-4000 o solución salina tamponada con fosfato (PBS) un día antes de la lesión. Se administr� una dosis de mantenimiento cada dos días hasta el día 7 tras la lesión (es decir, el día 1, 3, 5 y 7 tras la lesión). La dosis de mantenimiento era alta = 1 mg/animal para un grupo, o baja = 0,3 mg/animal para el segundo grupo. Para medir la proliferaci�n de células de músculo liso vascular (CMLV), se sacrificaron los animales a los 4 días y 21 días tras la lesión.

55 Para la medición de la proliferaci�n celular, los animales de 4 días recibieron una inyección intraperitoneal de bromodesoxiuridina (BrDdU) 50 mg/kg a 18, 12 y 2 horas antes de la eutanasia. Tras el sacrificio, se recogieron las arterias car�tidas izquierda y derecha completas. Se almacenaron muestras en Histochoice durante al menos 24 horas antes de incrustar. Se realizó la evaluación de la proliferaci�n CMLV usando anticuerpo monoclonal de ratón anti-BrdU. Se aplicó un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón marcado con fluorescencia. Se cont� el número de núcleos positivos para BrdU por sección por dos observadores ciegos para los regímenes de tratamiento.

Se sacrificaron las ratas restantes a los 21 días para el análisis morfom�trico. Se realizaron análisis morfom�tricos por un observador ciego para los grupos de estudio, usando el software de planimetría microscópica digital

65 informatizada Image-Pro Plus sobre secciones en serie (separadas 5 mm) de arterias car�tidas teñidas mediante tinción de Van Gieson. Se expresaron todos los datos como la media � DE. Se realizó el análisis estadístico con el uso del software SPSS. Se compararon variables continuas usando pruebas de la t para datos independientes. Se consider� que un valor de P ≤ 0,05 era estadísticamente significativo.

5 Tal como se observa en las figuras 13A y 13B, el tratamiento con TTP-4000 redujo significativamente la razón de íntima/media y la proliferaci�n de células de músculo liso vascular de un modo sensible a la dosis. En la figura 13 B, el eje y representa el número de células en proliferaci�n con BrdU.

B. TTP4000 en un modelo animal de EA

10 Se realizaron experimentos para evaluar si TTP-4000 podía afectar a la formación de amiloide y la disfunción cognitiva en un modelo de ratón de EA. Los experimentos utilizaron ratones transg�nicos que expresaban la proteína precursora amiloide (APP) con la mutación Swedish humana bajo el control del promotor de cadena de PDGF-B. Con el tiempo, estos ratones generan altos niveles del ligando de RAGE, amiloide beta (Aβ). Previamente,

15 se ha mostrado que el tratamiento con RAGEs durante 3 meses reduce tanto la formación de placa amiloide en el cerebro como el aumento asociado en marcadores inflamatorios en este modelo.

Los ratones con APP (macho) usados en este experimento se diseñaron mediante microinyecci�n del gen de APP humano (con las mutaciones Swedish y London) en ovocitos de ratón bajo el control del promotor del gen de cadena

20 B de factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-B). Se generaron los ratones en un antecedente C57BL/6 y se desarrollaron por Molecular Therapeutics Inc. Se alimentaron los animales a voluntad y se mantuvieron mediante apareamiento hermano-hermana. Los ratones generados a partir de este constructo desarrollan depósitos de amiloide comenzando a los 6 meses de edad. Se criaron los animales durante 6 meses y entonces se mantuvieron durante 90 días y se sacrificaron para la cuantificación del amiloide.

25 Se les administr� a ratones transg�nicos para APP vehículo o TTP4000 cada dos días [qod (i.p.)] durante 90 días comenzando a los 6 meses de edad. Al final del experimento, se sacrificaron los animales y se examinaron para determinar la carga de placas de Aβ en el cerebro (es decir, el número de placas). Se us� un grupo de APP control de 6 meses para determinar el nivel inicial de depósitos de amiloide. Además, al final del estudio, se sometieron los

30 animales a análisis de comportamiento (laberinto de agua de Morris). Los investigadores eran ciegos para los compuestos de estudio. Se administraron las muestras a los ratones a 0,25 ml/ratón/cada dos días. Además, se le administraron a un grupo de ratones 200 ug/día de RAGEs humano.

1. Deposición de amiloide beta

35 Para el examen histológico, se anestesiaron los animales con una inyección intraperitoneal (i.p.) de pentobarbital sádico (50 mg/kg). Se perfundieron los animales de manera transcardial con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4�C seguido por paraformaldeh�do al 4%. Se extirparon los cerebros y se colocaron en paraformaldeh�do al 4% durante la noche. Se procesaron los cerebros con parafina y se incrustaron. Se obtuvieron diez secciones en

40 serie de 30 μm de grosor a través del cerebro. Se sometieron las secciones a anticuerpo primario durante la noche a 4�C (anticuerpo frente a p�ptido Aβ) con el fin de detectar los depósitos de amiloide en el cerebro de los animales transg�nicos (Guo et al., J. Neurosci., 22:5900-5909 (2002)). Se lavaron las secciones en solución salina tamponada con Tris (TBS) y se a�adi� anticuerpo secundario y se incub� durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar, se incubaron las secciones tal como se instruye en el kit Vector ABC Elite (Vector Laboratories) y se tiñeron con ácido

45 diaminobenzoico (DAB). Se detuvieron las reacciones en agua y se cubrieron con el cubreobjetos tras el tratamiento con xileno. Se determin� el área de amiloide en cada sección con un sistema de análisis de imágenes asistido por ordenador, que consiste en un ordenador Power Macintosh equipado con una tarjeta de captura de fotogramas Quick Capture, una cámara Hitachi CCD montada en un microscopio Olympus y un trípode de cámara. Se us� el software de análisis de imágenes de los NIH, v. 1.55. Se capturaron las imágenes y se determin� el área total de

50 amiloide a lo largo de las diez secciones. Un operario ciego para el estado del tratamiento realizó todas las mediciones. Se realizó la suma de los volúmenes de amiloide de las secciones y la división entre el número total de secciones para calcular el volumen de amiloide.

Para el análisis cuantitativo, se us� un ensayo de inmunoabsorci�n ligado a enzimas (ELISA) para medir los niveles

55 Aβ total humano, Aβtotal y Aβ1-42 en los cerebros de ratones transg�nicos para APP (Biosource International, Camarillo, CA). Se extrajeron Aβtotal y Aβ1-42 de los cerebros de los ratones mediante clorhidrato de guanidina y se cuantificaron tal como describe el fabricante. Este ensayo extrae el p�ptido Aβ total del cerebro (tanto soluble como agregado).

60 2. Función cognitiva

Se realizaron pruebas en el laberinto de agua de Morris tal como sigue: Se sometieron a prueba todos los ratones una vez en la prueba de laberinto de agua de Morris al final del experimento. Se entrenaron los ratones en un laberinto de agua de campo abierto de 1,2 m. Se llen� la piscina hasta una profundidad de hasta una profundidad de

65 30 cm con agua y se mantuvo a 25�C. Se colocó la plataforma de escape (10 cm cuadrados) 1 cm por debajo de la

superficie del agua. Durante los ensayos, se retir� la plataforma de la piscina. Se llev� a cabo la prueba con indicios en la piscina rodeada de cortinas blancas para esconder cualquier indicio exterior al laberinto. Se sometieron todos los animales a entrenamiento previo no espacial (NSP) durante tres días consecutivos. Estos ensayos son para preparar a los animales para la prueba de comportamiento final para determinar la retención de memoria para 5 encontrar la plataforma. Estos ensayos no se registraron, sino que eran para fines de entrenamiento sólo. Para los estudios de entrenamiento y aprendizaje, se retiraron las cortinas para visualizar indicios exteriores al laberinto (esto permitió la identificación de animales con alteraciones en la natación). En el día 1, se colocaron los ratones en la plataforma escondida durante 20 segundos (ensayo 1), para los ensayos 2-3 se liberaron los animales en el agua a una distancia de 10 cm de la plataforma con indicios o la plataforma escondida (ensayo 4) y se dej� que nadaran hasta la plataforma. En el segundo día de ensayos, se movió aleatoriamente la plataforma escondida entre el centro de la piscina o el centro de cada cuadrante. Se liberaron los animales en la piscina, orientados aleatoriamente hacia la pared y se les dej� 60 segundos para que alcanzaran la plataforma (3 ensayos). En el tercer ensayo, se les proporcion� a los animales tres ensayos, dos con una plataforma escondida y uno con una plataforma con indicios. Dos días tras el NSP, se sometieron los animales a ensayos de comportamiento finales (prueba de laberinto de agua

15 de Morris). Para estos ensayos (3 por animal), se colocó la plataforma en el centro de un cuadrante de la piscina y se liberaron los animales orientados hacia la pared en un modo aleatorio. Se dej� que el animal encontrara la plataforma o nadara durante 60 segundos (periodo de latencia, el tiempo que tarda en encontrar la plataforma). Se sometieron a prueba todos los animales en el plazo de 4-6 horas de la dosificación y se seleccionaron aleatoriamente para las pruebas por un operario ciego para el grupo de prueba.

Los resultados se expresan como la media � desviaciones estándar (DE). Se analizó la significación de las diferencias en los estudios de amiloide y de comportamiento usando una prueba de la t. Se realizaron las comparaciones entre el grupo control de APP de 6 meses de edad y los animales tratados con TTP-4000, as� como el grupo tratado con vehículo de APP de 9 meses de edad y los animales tratados con TTP-4000. Diferencias por

25 debajo de 0,05 se consideraron significativas. Se determinaron los cambios en porcentaje en amiloide y comportamiento tomando la suma de los datos en cada grupo y dividiendo entre la comparación (es decir, 1, i.p./control de 6 meses = % de cambio).

Las figuras 14A y 14B muestran que ratones tratados durante 3 meses con o bien TTP-4000 o bien RAGEs de ratón tenían menos placas de Aβ y menos disfunción cognitiva que animales tratados con vehículo e IgG1 humana (IgG1) control negativo. Estos datos indican que TTP-4000 es eficaz en la reducción de la patología de EA en un modelo de ratón transg�nico. También se encontr� que, como RAGEs, TTP-4000 puede reducir las citocinas inflamatorias IL-1 y TNF-α (datos no mostrados).

35 C. Eficacia de TTP-4000 en un modelo animal de accidente cerebrovascular

Tambi�n se compar� TTP-4000 con RAGEs en un modelo animal relevante para la enfermedad de accidente cerebrovascular. En este modelo, se ligó la arteria carótida media de un ratón durante 1 hora seguido por 23 horas de reperfusi�n, momento en el que se sacrificaron los ratones y se evalu� el área del infarto en el cerebro. Se trataron los ratones con RAGEs o TTP-4000 o inmunoglobulina control justo antes de la reperfusi�n.

En estos experimentos, se les inyect� a C57BL/6 macho vehículo a 250 μl/ratón o artículos de prueba de TTP (TTP3000, TTP-4000 a 250 μl/ratón). Se les inyect� a los ratones por vía intraperitoneal, 1 hora tras el inicio de la isquemia. Se sometieron los ratones a una hora de isquemia cerebral seguido por 24 horas de reperfusi�n. Para

45 inducir la isquemia, se anestesi� cada ratón y se mantuvo la temperatura corporal a 36-37�C mediante calentamiento externo. Se expuso la arteria carótida común izquierda (ACC) a través de una incisión en la línea media en el cuello. Se colocó una pinza microquir�rgica alrededor del origen de la arteria carótida interna (ACI). Se ligó el extremo distal de la ACE con seda y se transfect�. Se at� de manera floja una seda 6-0 alrededor del mu��n de la ACE. Se insert� suavemente la punta pulida al fuego de una sutura de nailon en el mu��n de la ACE. Se apret� el bucle de la seda 6-0 alrededor del mu��n y se hizo avanzar la sutura de nailon al interior y a través de la arteria carótida interna (ACI), hasta que se apoyaba en la arteria cerebral anterior, ocluyendo de ese modo las arterias cerebrales media y de comunicación anterior. Tras haber estado la sutura de nailon en su lugar durante 1 hora, volvió a anestesiarse el animal, se registr� la temperatura rectal y se retir� la sutura y se cerr� la incisión.

55 Se determin� el volumen de infarto anestesiando los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sádico (50 mg/kg) y extirpando entonces los cerebros. Entonces se cortaron los cerebros en cuatro secciones de 2 mm a través de la región infartada y se colocaron en cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al 2% durante 30 minutos. Después, se colocaron las secciones en paraformaldeh�do al 4% durante la noche. Se determin� el área de infarto en cada sección con un sistema de análisis de imágenes asistido por ordenador, que consiste en un ordenador Power Macintosh equipado con una tarjeta de captura de fotogramas Quick Capture, una cámara Hitachi CCD montada sobre un trípode de cámara. Se us� el software de análisis de imágenes de los NIH, v. 1.55. Se capturaron las imágenes y se determin� el área de infarto total a lo largo de las secciones. Un único operario ciego para el estado del tratamiento realizó todas las mediciones. Sumando los volúmenes de infarto de las secciones se calcul� el volumen de infarto total. Los resultados se expresan como la media � desviación estándar (DE). Se analizó la

65 significación de la diferencia en los datos de volumen de infarto usando una prueba de la t.

Tal como se ilustra mediante los datos en la tabla 2, TTP-4000 era más eficaz que RAGEs en la limitación del área de infarto en estos animales, lo que sugiere que TTP-4000, debido a su mejor semivida en plasma, podía mantener una mayor protección en estos ratones.

5 Ejemplo 6: Detección de proteína de fusión de RAGE mediante ELISA

Inicialmente, se recubren 50 ul del anticuerpo monoclonal específico frente a RAGE 1HB1011 a una concentración de 10 ug/ml en 1X PBS pH 7,3 sobre placas por medio de incubaci�n durante la noche. Cuando est�n listas para su

10 uso, se lavan las placas tres veces con 300 ul de tampón de lavado 1X imidazol-Tween y se bloquean con BSA al 1%. Se añaden las muestras (diluidas) y diluciones patrón de diluciones de TTP-4000 conocidas a un volumen final de 100 ul. Se permite que las muestras se incuben a temperatura ambiente durante una hora. Tras la incubaci�n, se lavan las placas tres veces. Se añade un conjugado de anticuerpo de cabra anti-IgG1 1 humana (Sigma A3312)-AP en 1XPBS con BSA al 1% y se permite que se incube a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavan las placas

15 tres veces. Se determina el color con fosfato de paranitrofenilo.

Ejemplo 7: Cuantificación de la unión de ligando de RAGE a proteína de fusión de RAGE

La figura 15 muestra las curvas de unión de saturación con TTP-4000 a diversos ligandos de RAGE conocidos

20 inmovilizados. Los ligandos se inmovilizan sobre una placa de microtitulaci�n y se incuban en presencia de concentraciones crecientes de proteína de fusión de desde 0 hasta 360 nM. Se detecta la interacción proteína de fusión-ligando usando un anticuerpo policlonal conjugado con fosfatasa alcalina que es específico para la porción de IgG de la quimera de fusión. Se calcularon las Kd relativas usando el software Graphpad Prism y coinciden con valores establecidos en la bibliografía de valores de RAGE-ligando de RAGE. HMG1B = anfoterina, CML=

25 carboximetil-lisina, A beta = amiloide beta 1-40.

Lista de secuencias

<110> TransTech Pharma, Inc. 30 <120> Proteínas de fusión de RAGE y métodos de uso

<130> 41305-318492

<150> Documento US 60/598.555

<151>

<160> 44 35 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 404

<212> PRT

<213> Homo sapiens 40 <400> 1

<210> 2

<211> 382

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 381

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 339

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 317

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 316

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 94

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 93

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 30 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10 15 <211> 29

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

10 <210> 12

<211> 91

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 101

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 100 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 204

<212> PRT

<213>: Homo sapiens 10 <400> 17

<210> 18

<211> 203

<212> PRT

<210> 19

<211> 229

<212> PRT

<213>: Homo sapiens 10 <400> 19

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 20

<211> 228

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 30 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23 15 <211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<211> 354 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25

15 <210> 26

<211> 369

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 27

<211> 408

<212> ADN

<213> Homo sapiens 25 <400> 27

<210> 28

<211> 690

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 753 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 1386

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 1041

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 461

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 439

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 438

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

<400> 34

<210> 35

<211> 346

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 324

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 323

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 210

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 633

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 220

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 663

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43 10 <211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

Claims

REIVINDICACIONES

1. Proteína de fusión que comprende un polip�ptido de RAGE unido directamente a un polip�ptido distinto de RAGE,

en la que el polip�ptido distinto de RAGE comprende (i) un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina que puede plegarse, y (ii) un dominio CH3 de una inmunoglobulina;

en la que el polip�ptido de RAGE comprende un sitio de unión a ligando de RAGE;

en la que el polip�ptido de RAGE comprende un ligador interdominio de RAGE unido a un dominio de inmunoglobulina de RAGE de manera que el amino�cido C-terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido N-terminal del ligador interdominio de RAGE, y el amino�cido C-terminal del ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal del polip�ptido distinto de RAGE; y

en la que la proteína de fusión comprende un ligador interdominio derivado de RAGE en vez de un polip�ptido bisagra interdominio derivado de una inmunoglobulina.
2.

Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión comprende (a) el ligador interdominio de RAGE que separa los dominios V y C1 de RAGE o (b) el ligador interdominio de RAGE que separa los dominios C1 y C2 de RAGE, en lugar de la región bisagra de la cadena pesada de inmunoglobulina.
3.

Proteína de fusión según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el polip�ptido de RAGE comprende un fragmento de RAGEs humano, en la que la secuencia de RAGEs humano se expone en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
4.

Proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la proteína de fusión comprende un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer ligador interdominio de RAGE unido a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo ligador interdominio de RAGE, de manera que el amino�cido Nterminal del primer ligador interdominio de RAGE est� unido al amino�cido C-terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el amino�cido N-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE est� unido al amino�cido C-terminal del primer ligador interdominio de RAGE, el amino�cido N-terminal del segundo ligador interdominio de RAGE est� unido al amino�cido C-terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y el amino�cido C-terminal del segundo ligador interdominio de RAGE est� unido directamente al amino�cido N-terminal del dominio CH2 de la inmunoglobulina o la porción del dominio CH2 de la inmunoglobulina del polip�ptido distinto de RAGE.
5.

Proteína de fusión según la reivindicación 4, en la que el segundo ligador interdominio de RAGE comprende la secuencia de amino�cidos expuesta en SEQ ID NO: 22 o una secuencia idéntica al menos en un 90% a la misma, o la secuencia de amino�cidos expuesta en SEQ ID NO: 24 o una secuencia idéntica al menos en un 90% a la misma.
6.

Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que el polip�ptido de RAGE es un único dominio de inmunoglobulina de RAGE unido por medio de un ligador interdominio de RAGE al amino�cido N-terminal del polip�ptido distinto de RAGE.
7.

Proteína de fusión según la reivindicación 6, en la que el ligador interdominio de RAGE comprende la secuencia de amino�cidos expuesta en SEQ ID NO: 21 o una secuencia idéntica al menos en un 90% a la misma, o la secuencia de amino�cidos expuesta en SEQ ID NO: 23 o una secuencia idéntica al menos en un 90% a la misma.
8.

Proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el sitio de unión a ligando de RAGE comprende SEQ ID NO: 9 o una secuencia idéntica al menos en un 90% a la misma, o SEQ ID NO: 10 o una secuencia idéntica al menos en un 90% a la misma.
9.

Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que el polip�ptido de RAGE comprende la secuencia de amino�cidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20 o una secuencia idéntica al menos en un 90% a las mismas.
10.

Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la secuencia de amino�cidos del polip�ptido de RAGE se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 20.
11.

Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la secuencia de amino�cidos del polip�ptido distinto de RAGE es o comprende la secuencia de amino�cidos expuesta en SEQ ID NO: 38.
12.

Proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana seleccionada del grupo que consiste en: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.
13.

Proteína de fusión según la reivindicación 12, en la que la inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
14.

Proteína de fusión según la reivindicación 13, en la que la inmunoglobulina es IgG1.
15.

Proteína de fusión según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de amino�cidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 37.
16.

Proteína de fusión según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de amino�cidos expuesta en SEQ ID NO: 37.
17.

Proteína de fusión según la reivindicación 1, que tiene la secuencia de amino�cidos expuesta en SEQ ID NO: 34.
18.

Proteína de fusión según la reivindicación 1, que puede codificarse por la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 30.
19.

Proteína de fusión según la reivindicación 1, que puede codificarse por la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 31.
20.

ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
21.

ácido nucleico según la reivindicación 20, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polip�ptido de RAGE es o comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.
22.

ácido nucleico según la reivindicación 20, que comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31.
23.

Vector de expresión que codifica para una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y/o que comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 20-22.
24.

Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en un portador farmacéutico.
25.

Composición farmacéutica según la reivindicación 24, formulada como o bien una disolución inyectable o bien un polvo liofilizado estéril.
26.

Método in vitro de preparación de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 que comprende la etapa de unir covalentemente el polip�ptido de RAGE al polip�ptido distinto de RAGE.
27.

Método según la reivindicación 26, en el que la proteína de fusión puede obtenerse eliminando la región bisagra FC de la inmunoglobulina y reemplaz�ndola por el polip�ptido de RAGE.
28.

Método según la reivindicación 26, en el que la proteína de fusión est� codificada por un constructo de ADN recombinante.
29.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, que comprende además la etapa de incorporar el constructo de ADN en un vector de expresión.
30.

Método según la reivindicación 29, que comprende además transfectar el vector de expresión en una célula huésped.
31.

Uso de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno mediado por RAGE en un sujeto.
32.

Uso según la reivindicación 31, en el que el medicamento est� destinado para administración intravenosa, intraperitoneal o subcutánea de la proteína de fusión de RAGE al sujeto.
33.

Uso según la reivindicación 31 o 32, en el que el medicamento est� destinado a tratar un síntoma de diabetes o un síntoma de complicaciones diab�ticas tardías.
34.

Uso según la reivindicación 33, en el que el síntoma de diabetes o complicaciones diab�ticas tardías comprende nefropat�a diab�tica, retinopat�a diab�tica, una úlcera de pie diabético, una complicación cardiovascular o neuropatía diab�tica.
35.

Uso según la reivindicación 31 � 32, en el que el medicamento est� destinado a tratar amiloidosis; enfermedad de Alzheimer; cáncer; insuficiencia renal; o inflamación asociada con cualquiera de autoinmunidad, enfermedad

inflamatoria del intestino, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, hipoxia, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, choque hemorrágico, septicemia, trasplante de órgano o cicatrización de heridas alterada.
36.

Célula huésped aislada que comprende un vector de expresión según la reivindicación 23.
37.

Célula huésped según la reivindicación 36, en la que la célula huésped es una célula de ovario de h�mster chino.
38.

Método de producción de una proteína de fusión que comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 36 � 37.