NL2001555C2 - Rage-fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen voor het gebruik ervan. - Google Patents

Description

RAGE-FUSIE-EIWITTEN, PREPARATEN EN WERKWIJZEN VOOR HET

GEBRUIK ERVAN

5

KRUISVERWIJZING NAAR VERWANTE AANVRAGEN

De onderhavige aanvraag maakt aanspraak op prioriteit onder 35 U.S.C. § 119(e) van Amerikaanse voorlopige octrooi-aanvraag serienummer 60/798.455, ingediend op 5 mei 2006. De beschrijving van Amerikaanse voorlopige octrooi-aanvraag 60/798.455 10 is hierin in het geheel door verwijzing opgenomen.

GEBIED VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op regulering van de Receptor voor Advanced Glycated Endproducts (RAGE). De onderhavige uitvinding beschrijft meer 15 in het bijzonder fusie-eiwitten die een RAGE-polypeptide omvatten, werkwijzen voor het maken van dergelijke fusie-eiwitten en preparaten van dergelijke RAGE-fusie-eiwitten en het gebruik van dergelijke RAGE-fusie-eiwitten voor behandeling van RAGE-gebaseerde stoornissen.

20 ACHTERGROND

Incubatie van eiwitten of lipiden met aldose-suikers resulteert in niet-enzymatische glycering en oxidatie van aminogroepen op eiwitten voor het vormen van Amadori adducten. Gedurende de tijd ondergaan de adducten aanvullende herrangschikkingen, dehydrataties en verknoping met andere eiwitten voor het vormen 25 van complexen die bekend zijn als Advanced Glycation End Products (AGE’s). Factoren die de vorming van AGE’s bevorderen omvatten vertraagde omzetting van eiwit (bijvoorbeeld als bij amyloidosis), accumulatie van macromoleculen die een hoog lysine-gehalte hebben en hoge glucose-niveaus van het bloed (zoals bijvoorbeeld bij diabetes) (Hori et al, J. Biol. Chem. 270: 25752-761, (1995)). AGE’s zijn betrokken bij 30 een verscheidenheid van stoornissen waaronder complicaties die met diabetes zijn geassocieerd en normale veroudering.

AGE’s vertonen specifieke en verzadigbare binding aan receptoren van het celoppervlak op monocyten, macro fagen, endotheelcellen van de microvasculatuur, 2 gladde spiercellen, mesengiale cellen en neuronen. De Receptor voor Advanced Glycated Endproducts (RAGE) is een lid van de immunoglobuline-supergen familie van moleculen. Het extracellulaire (N-eindstandige) domein van RAGE omvat drie immunoglobuline-type gebieden: één V (variabel) type domein gevolgd door twee C-5 type (constante) domeinen (Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al, Circ. (Supply 96#194 (1997)). Een enkel transmembraan omspannend domein en een korte, sterk geladen, cytosolische staart volgen het extracellulaire domein. Het N-eindstandige extracellulaire domein kan worden geïsoleerd door proteolyse van RAGE of door moleculaire biologische benaderingswijzen voor het 10 genereren van oplosbaar RAGE (sRAGE) dat is samengesteld uit de V- en C-domeinen.

RAGE wordt op meerdere celsoorten tot expressie gebracht waaronder leukocyten, neuronen, microgliale cellen en vasculair endotheel (bijvoorbeeld Hori et al, J. Biol. Chem., 270:25752-761 (1995)). Verhoogde niveaus van RAGE worden ook 15 in weefsels gevonden die een verouderingsproces ondergaan (Schleicher et al, J. Clin. Invest., 99 (3): 457-468 (1997)) en de diabetische retina, vasculatuur en nier (Schmidt et al, Nature Med., 1:1002-1004 (1995)).

In aanvulling op AGE’s kunnen andere verbindingen aan RAGE binden en deze moduleren. RAGE bindt aan meerdere functioneel en structureel diverse liganden, 20 waaronder amyloïde-bèta (Αβ), serum amyloïde A (SAA), Advanced Glycation End products (AGE’s), S100 (een ontstekingsbevorderend lid van de Calgranuline familie), carboxymethyllysine (CML), amfoterine en CDllb/CD18 (Bucciarelli et al, Cell Mol Life Sci., 59:1117-128 (2002); Chavakis et al, Microbes Infect., 6:1219-1225 (2004); Kokkola et al, Scand. J. Immunol., 61:1-9 (2005); Schmidt et al, J. Clin. Invest., 25 108:949-955 (2001); Rocken et al, Am. J. Pathol, 162:1213-1220 (2003)).

Het is getoond dat binding van liganden zoals AGE’s, S100/calgranuline, β-amyloïde, CML (NE-Carboxymethyllysine) en amfoterine aan RAGE expressie van een verscheidenheid van genen modificeert. Deze interacties kunnen vervolgens mechanismen van signaaltransductie initiëren waaronder p38 activering, p21ras, MAP-30 kinasen, Erkl-2 fosforylatie en de activering van de transcriptionele bemiddelaar van signalering van ontsteking, NF-κΒ (Yeh et al, Diabetes, 50:1495-1504 (2001)). Bij vele celsoorten kan interactie tussen RAGE en de liganden ervan bijvoorbeeld oxidatieve stress genereren dat daardoor resulteert in activering van de voor vrije radicalen 3 gevoelige transcriptiefactor NF-κΒ en de activering van NF-icB-gereguleerde genen, zoals de cytokinen IL-Ιβ en TNF-α. Expressie van RAGE wordt bovendien opwaarts gereguleerd door middel van NF-κΒ en toont verhoogde expressie op plaatsen van ontsteking of oxidatieve stress (Tanaka et al, J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)).

5 Een neerwaartse en vaak schadelijke spiraal kan aldus worden gevoed door een positieve feedback lus die wordt geïnitieerd door binding van ligand.

Activering van RAGE in verschillende weefsels en organen kan tot een aantal pathofysio logische gevolgen leiden. RAGE is betrokken bij een verscheidenheid van aandoeningen waaronder: acute en chronische ontsteking (Hofmann et al, Cell 97:889-10 901 (1999)), de ontwikkeling van late complicaties bij diabetes zoals verhoogde vasculaire permeabiliteit (Wautier et al., J. Clin. Invest., 97:238-243 (1995)), nefropathie (Teillet et al., J. Am. Soc. Nephrol, 11:1488-1497 (2000)), arteriosclerose (Vlassara et al., The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med, 28:419-426 (1996)) en retinopathie (Hammes et al, Diabetologia, 42:603-607 (1999)). RAGE is 15 ook betrokken bij de ziekte van Alzheimer (Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996)) en bij tumor invasie en metastase (Taguchi et al, Nature, 405:354-357 (2000)).

Ondanks de wijd verbreidde expressie van RAGE en de ogenschijnlijke pleiotrope rol ervan bij meerdere modellen van diverse ziekten lijkt RAGE niet essentieel te zijn voor normale ontwikkeling. Knock-out muizen voor RAGE hebben 20 bijvoorbeeld geen duidelijk abnormaal fenotype dat suggereert dat terwijl RAGE een rol kan spelen bij pathologie van ziekte wanneer het chronisch wordt gestimuleerd, de remming van RAGE niet lijkt bij te dragen aan elk ongewenst acuut fenotype (Liliensiek et al, J. Clin. Invest., 113:1641-50(2004)).

Het tegenwerken van de binding van fysiologische liganden aan RAGE kan de 25 pathofysio logische veranderingen die teweeg worden gebracht door overmatige concentraties van AGE’s en andere liganden van RAGE, neerwaarts reguleren. Door het verlagen van de binding van endogene liganden aan RAGE kunnen symptomen die zijn geassocieerd met RAGE-bemiddelde stoornissen worden verlaagd. Oplosbaar RAGE (sRAGE) is in staat om op effectieve wijze de binding van liganden van RAGE 30 aan RAGE tegen te werken. sRAGE kan echter, wanneer het in vivo wordt toegediend, een halfwaardetijd hebben die te kort kan zijn om op therapeutische wijze bruikbaar te zijn voor één of meer stoornissen. Er is aldus een noodzaak verbindingen te ontwikkelen die de binding van AGE’s en andere fysiologische liganden aan de RAGE- 4 receptor tegen werken, waarbij de verbinding een gewenst farmacokinetisch profiel heeft.

SAMENVATTING

5 Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding omvatten fusie-eiwitten van RAGE en werkwijzen voor het gebruik van dergelijke eiwitten. De onderhavige uitvinding kan op een verscheidenheid van wijzen worden uitgevoerd. Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding kunnen een RAGE-fusie-eiwit omvatten dat een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-RAGE polypeptide omvat. In één 10 uitvoeringsvorm omvat het RAGE-fusie-eiwit een bindingsplaats voor een ligand van RAGE. Het RAGE-fusie-eiwit kan verder een RAGE-polypeptide omvatten dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat het CH2-domein van een immunoglobuline of een deel van het Cu2-domein omvat. In bepaalde uitvoeringsvormen omvat het RAGE-fusie-eiwit een aminozuursequentie zoals 15 uiteengezet is in SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek daar aan is. In sommige uitvoeringsvormen omvat een sequentie die tenminste 90% identiek is aan SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 bijvoorbeeld de sequentie van SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 zonder de C-eindstandige lysine.

20 De onderhavige uitvinding omvat ook een werkwijze voor het maken van een RAGE-fusie-eiwit. In één uitvoeringsvorm omvat de werkwijze het koppelen van een RAGE-polypeptide aan een tweede niet-RAGE-polypeptide. In één uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide een bindingsplaats voor een ligand van RAGE. De werkwijze kan omvatten het koppelen van een RAGE-polypeptide op directe wijze aan 25 een polypeptide dat het CH2-domein van een immunoglobuline of een deel van het CH2-domein omvat. In bepaalde uitvoeringsvormen omvat het RAGE-fusie-eiwit een aminozuursequentie zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek daar aan is. In sommige uitvoeringsvormen omvat een sequentie die tenminste 30 90% identiek is aan SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 bijvoorbeeld de sequentie van SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 zonder de C-eindstandige lysine.

In andere uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding werkwijzen en preparaten voor het behandelen van een RAGE-bemiddelde stoornis bij een patiënt 5 omvatten. De werkwijze kan het toedienen van een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding aan de patiënt omvatten. Het preparaat kan een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding in een farmaceutisch aanvaardbare drager omvatten.

5 In andere uitvoeringsvormen verschaft de onderhavige uitvinding ook preparaten die een gevriesdroogd mengsel van een beschermend middel voor vriesdrogen, een RAGE-fusie-eiwit en een buffer omvatten. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld een stabiel gereconstitueerd preparaat omvatten dat een RAGE-fusie-eiwit bij een hoeveelheid van tenminste 50 mg/ml en een 10 verdunningsmiddel omvat, waarbij het gereconstitueerde preparaat is bereid van een gevriesdroogd mengsel van het RAGE-fusie-eiwit en een beschermend middel voor vriesdrogen.

Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding kunnen ook industrieel geproduceerde voorwerpen omvatten. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kunnen de 15 industrieel geproduceerde voorwerpen een houder omvatten die een preparaat bevat dat een gevriesdroogd RAGE-fusie-eiwit omvat. Het voorwerp voor vervaardiging kan ook instructies voor het reconstitueren van het gevriesdroogde preparaat met een verdunningsmiddel omvatten.

In andere uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding ook werkwijzen voor 20 het bereiden van een stabiel gereconstitueerd preparaat van een RAGE-fusie-eiwit omvatten. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de werkwijze het reconstitueren van een gevriesdroogd mengsel van een RAGE-fusie-eiwit en een beschermend middel voor vriesdrogen in een verdunningsmiddel omvatten, zodanig dat de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat tenminste 50 mg/ml is. In één 25 uitvoeringsvorm kan de werkwijze bijvoorbeeld de stappen van het vriesdrogen van een mengsel dat een RAGE-fusie-eiwit en een voor het vriesdrogen beschermende hoeveelheid van een beschermend middel voor vriesdrogen omvat en het reconstitueren van het gevriesdroogde mengsel in een verdunningsmiddel omvatten.

Er zijn verscheidene voordelen die met specifieke uitvoeringsvormen van de 30 onderhavige uitvinding kunnen zijn geassocieerd. In één uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding metabool stabiel zijn wanneer ze aan een patiënt worden toegediend. De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook binding aan liganden van RAGE met hoge affiniteit vertonen.

6

Bij bepaalde uitvoeringsvormen binden de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding aan liganden van RAGE met affiniteiten in het traject van hoog nanomolair tot laag micromolair. Door binding met hoge affiniteit aan fysiologische liganden van RAGE, kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden 5 gebruikt voor het remmen van binding van endogene liganden aan RAGE, waardoor middelen worden verschaft voor het verzwakken van RAGE-bemiddelde ziekten.

De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook in de vorm van eiwit of nucleïnezuur worden verschaft. In één voorbeeld van een uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit systemisch worden toegediend en in het vaatstelsel blijven 10 om mogelijk vasculaire ziekten die gedeeltelijk worden bemiddeld door RAGE te behandelen. In een ander voorbeeld van een uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit lokaal worden toegediend voor het behandelen van ziekten waarbij liganden van RAGE bijdragen aan de pathologie van de ziekte. Als alternatief kan een nucleïnezuur-construct dat voor het RAGE-fusie-eiwit codeert op een plaats worden afgeleverd door 15 het gebruik van een geschikte drager zoals een virus of als een kaal DNA, waarbij transiënte lokale expressie lokaal de interactie tussen liganden van RAGE en receptoren kan remmen. Toediening kan aldus transient (bijvoorbeeld zoals wanneer het RAGE-fusie-eiwit wordt toegediend) of meer permanent van aard (bijvoorbeeld zoals wanneer het RAGE-fusie-eiwit als een recombinant DNA wordt toegediend) zijn.

20 Er zijn aanvullende kenmerken van de uitvinding die hierna zullen worden beschreven. Het moet duidelijk zijn dat de uitvinding wat betreft de toepassing ervan niet is beperkt tot de details die in de volgende conclusies, beschrijving en figuren zijn uiteengezet. De uitvinding kan in andere uitvoeringsvormen worden gebruikt en kan op verscheidene wijzen worden gebruikt en worden uitgevoerd.

25

KORTE BESCHRIJVING VAN DE FIGUREN

Verscheidene kenmerken, aspecten en voordelen van de onderhavige uitvinding zullen duidelijker worden met verwijzing naar de volgende figuren.

Figuur 1 toont verscheidene sequenties van RAGE en immunoglobuline-30 sequenties die in overeenstemming zijn met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding: Paneel A, SEQ ID NO: 1, de aminozuursequentie voor humaan RAGE; en SEQ ID NO: 2 de aminozuursequentie voor humaan RAGE zonder de signaalsequentie van aminozuren 1-22; Paneel B, SEQ ID NO: 3, de aminozuur- 7 sequentie voor humaan RAGE zonder de signaal sequentie van aminozuren 1-23; Paneel C, SEQ ID NO: 4, de aminozuursequentie van humaan sRAGE; SEQ ID NO: 5, de aminozuursequentie van humaan sRAGE zonder de signaalsequentie van aminozuren 1-22, en SEQ ID NO: 6, de aminozuursequentie van humaan sRAGE 5 zonder de signaalsequentie van aminozuren 1-23; Paneel D, SEQ ID NO: 7, een aminozuursequentie die het V-domein van humaan RAGE omvat; SEQ ID NO: 8, een andere aminozuursequentie die het V-domein van humaan RAGE omvat; SEQ ID NO: 9, een N-eindstandig fragment van het V-domein van humaan RAGE; SEQ ID NO: 10, een ander N-eindstandig fragment van het V-domein van humaan RAGE; SEQ ID NO: 10 11, de aminozuursequentie voor aminozuren 124-221 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 12, de aminozuursequentie voor aminozuren 227-317 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 13, de aminozuursequentie voor aminozuren 23-123 van humaan RAGE; Paneel E, SEQ ID NO: 14, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-123 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 15, de aminozuursequentie voor aminozuren 23-136 van humaan RAGE; 15 SEQ ID NO: 16, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-136 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 17, de aminozuursequentie voor aminozuren 23-226 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 18, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-226 van humaan RAGE; Paneel F, SEQ ID NO: 19, de aminozuursequentie voor aminozuren 23-251 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 20, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-251 van 20 humaan RAGE; SEQ ID NO: 21, een interdomein linker van RAGE; SEQ ID NO: 22, een tweede interdomein linker van RAGE; SEQ ID NO: 23, een derde interdomein linker van RAGE; SEQ ID NO: 24, een vierde interdomein linker van RAGE; Paneel G, SEQ ID NO: 25, DNA dat codeert voor aminozuren 1-118 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 26, DNA dat codeert voor aminozuren 1-123 van humaan RAGE; en SEQ ID 25 NO: 27, DNA dat codeert voor aminozuren 1-136 van humaan RAGE; Paneel H, SEQ ID NO: 28, DNA dat codeert voor aminozuren 1-230 van humaan RAGE; SEQ ID NO: 29, DNA dat codeert voor aminozuren 1-251 van humaan RAGE; Paneel I, SEQ ID NO: 38, een gedeeltelijke aminozuursequentie voor de Ch2- en CH3-domeinen van humaan IgG; SEQ ID NO:39, DNA dat codeert voor een deel van de humane Ch2- en 30 CH3-domeinen van humaan IgG; SEQ ID NO: 40, een aminozuursequentie voor de Ch2- en C^-domeinen van humaan IgG; Paneel J, SEQ ID NO: 41, een DNA dat codeert voor de humane Ch2- en C^-domeinen van humaan IgG; SEQ ID NO: 42, een aminozuursequentie voor het C^-domain van humaan IgG; SEQ ID NO: 43, een 8 aminozuursequentie voor het CH3-domein van humaan IgG; en SEQ ID NO: 44, een vijfde interdomein linker van RAGE; Paneel K, SEQ ID NO: 45, de aminozuursequentie van humaan sRAGE zonder de signaalsequentie van aminozuren 1-23, waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen 5 van pyroglutaminezuur, SEQ ID NO: 46, een andere aminozuursequentie die het V-domein van humaan sRAGE omvat waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur, SEQ ID NO: 47, een ander N-eindstandig fragment van het V-domein van humaan RAGE waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur, SEQ 10 ID NO: 48, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-123 van humaan RAGE, waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur; Paneel L, SEQ ID NO: 49, de aminozuursequentie van aminozuren 24-136 van humaan RAGE, waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur, SEQ ID NO: 50, de 15 aminozuursequentie voor aminozuren 24-226 van humaan RAGE, waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur, SEQ ID NO: 51, de aminozuursequentie voor aminozuren 24-251 van humaan RAGE, waarbij het glutamine-residu aan het N-uiteinde is gecycliseerd voor het vormen van pyroglutaminezuur; Paneel M, SEQ ID NO: 52, een andere DNA-20 sequentie die voor een deel van de humane Ch2- en Ch3-domeinen van humaan IgG in SEQ ID NO: 38 codeert en SEQ ID NO: 53, een andere DNA-sequentie die voor de humane Ch2- en CH3-domeinen van humaan IgG in SEQ ID NO: 40 codeert.

Figuur 2 toont andere DNA-sequenties SEQ ID NO: 30 (Paneel A) en SEQ ID NO: 54 (Paneel B) dat codeert voor een eerste coderend gebied voor een RAGE-fusie-25 eiwit (TTP-4000) dat in overeenstemming is met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding. Coderende sequentie 1-753 dat in vetgedrukte letters is gemarkeerd codeert voor de N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE terwijl sequentie 754-1386 voor de eiwitsequentie van humaan IgG (yl) zonder het schamiergebied codeert.

30 Figuur 3 toont andere DNA-sequenties SEQ ID NO: 31 (Paneel A) en SEQ ID

NO: 55 (Paneel B) die coderen voor het coderende gebied van een tweede RAGE-fusie-eiwit (TTP-3000) dat in overeenstemming is met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding. Coderende sequentie 1-408 dat in vetgedrukte letters is 9 gemarkeerd codeert voor N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE terwijl sequentie 409-1041 voor eiwitsequentie van humaan IgG (γΐ) zonder het schamiergebied codeert.

Figuur 4 toont de aminozuursequenties, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 en SEQ ID NO: 56 die elk coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met vier 5 domeinen dat in overeenstemming is met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding. RAGE-sequentie is in vetgedrukte letters gemarkeerd.

Figuur 5 toont de aminozuursequenties, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 en SEQ ID NO: 57 die elk coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen dat in overeenstemming is met andere uitvoeringsvormen van de 10 onderhavige uitvinding. RAGE-sequentie is in vetgedrukte letters gemarkeerd.

Figuur 6, Paneel A, toont een vergelijking van de eiwitdomeinen van humaan RAGE en humaan Ig gamma-1 Fc-eiwit en splitsingspunten die worden gebruikt voor het maken van TTP-3000 (op positie 136) en TTP-4000 (op positie 251) in overeenstemming met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding; en 15 Paneel B toont de domeinstructuur voor TTP-3000 en TTP-4000 die in overeenstemming is met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding.

Figuur 7 toont resultaten van een in vitro bindingstest voor sRAGE en een eerste RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 (TT4) en een tweede RAGE-fusie-eiwit TTP-3000 (TT3), aan de RAGE-liganden amyloïde-bèta (A-bèta), SI00b (SI00) en amfoterine (Ampho), 20 in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

Figuur 8 toont resultaten van een in vitro bindingstest voor een eerste RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 (TT4) (“Proteïne”) aan amyloïde-bèta in vergelijking met een negatieve controle die alleen het reagens voor immuundetectie omvat (“alleen complex”) en antagonisme van een dergelijke binding door een antagonist van RAGE 25 (“RAGE-ligand”) in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

Figuur 9 toont resultaten van een in vitro bindingstest voor een tweede RAGE-fusie-eiwit TTP-3000 (TT3) (“Proteïne”) aan amyloïde-bèta in vergelijking met een negatieve controle die alleen het reagens voor immuundetectie omvat (“alleen 30 complex”) en antagonisme van een dergelijke binding door een antagonist van RAGE (“RAGE-ligand”) in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

10

Figuur 10 toont de resultaten van een cel-gebaseerde test die de remming meet van S1 OOb-RAGE-geïnduceerde productie van TNF-α door RAGE-fiisie-eiwitten TTP-3000 (TT3) en TTP-4000 (TT4) en sRAGE in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

5 Figuur 11 toont de resultaten van een cel-gebaseerde test die de remming meet van HMGBl-RAGE-geïnduceerde productie van TNF-α door RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 en anti-RAGE antilichaam in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

Figuur 12 toont een farmacokinetisch profiel voor RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 10 in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding waarbij elke kromme een ander dier onder dezelfde experimentele omstandigheden vertegenwoordigt.

Figuur 13 toont relatieve niveaus van afgifte van TNF-α van THP-1-cellen door stimulatie door RAGE-fiisie-eiwit TTP-4000 en humane IgG stimulatie als een maat 15 van een ontstekingsreactie in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

Figuur 14 toont het gebruik van RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 voor het verlagen van restenose bij diabetische dieren in overeenstemming met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding, waarbij Paneel A toont dat RAGE-fusie-eiwit TTP-20 4000 de intima/media verhouding verlaagde in vergelijking met een negatieve controle (IgG) en Paneel B toont dat RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 proliferatie van vasculaire gladde spiercellen op een dosis-reagerende wijze verlaagde.

Figuur 15 toont het gebruikt van RAGE-fiisie-eiwit TTP-4000 voor het verlagen van amyloïde vorming en cognitieve dysfunctie bij dieren met de ziekte van Alzheimer 25 (AD) in overeenstemming met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding, waarbij Paneel A toont dat RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 de hoeveelheid amyloïde in de hersenen verlaagde en Paneel B toont dat RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 cognitieve functie verbeterde.

Figuur 16 toont de krommes van verzadiging van binding met TTP-4000 aan 30 verscheidene geïmmobiliseerde bekende RAGE-liganden in overeenstemming met een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding.

Figuur 17 toont het gebruik van RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 voor het verlagen van de afstoting van allogene transplantaten van cellen van de eilandjes van de 11 alvleesklier die in overeenstemming is met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding, waarbij open (niet-gevulde) cirkels niet-behandelde controle dieren aangeven; cirkels met diagonale arcering dieren aangeven die zijn behandeld met TTP-4000 bij een eerste dosering; cirkels met golvende arcering dieren aangeven 5 die zijn behandeld met TTP-4000 bij een tweede dosering; met ruiten gevulde cirkels dieren aangeven die zijn behandeld met controle PBS; en dichte cirkels dieren aangeven die met controle IgG zijn behandeld.

Figuur 18 toont het gebruik van RAGE-fusie-eiwitten TTP-4000 voor het verlagen van de afstoting van syngene transplantaten van cellen van eilandjes van de 10 alvleesklier die in overeenstemming is met andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding, waarbij open (niet-gevulde) cirkels niet-behandelde controle dieren aangeven; en dichte cirkels dieren aangeven die zijn behandeld met TTP-4000.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING

15 Tenzij het tegengestelde wordt aangegeven zijn de numerieke parameters die in de volgende specificatie uiteengezet zijn, benaderingen die kunnen variëren afhankelijk van de gewenste eigenschappen die worden gezocht om te worden verkregen door de onderhavige uitvinding. Op het minst en niet als een poging om de toepassingen van de doctrine van equivalenten van de beschermingsomvang van de conclusies te beperken 20 zou elke numerieke parameter tenminste moeten worden beschouwd met betrekking tot het aantal vermelde significante getallen en door het toepassen van de gewoonlijke technieken van afronding.

Ondanks dat de numerieke trajecten en parameters die de brede beschermingsomvang van de uitvinding uiteenzetten benaderingen zijn, zijn de 25 numerieke waarden die uiteengezet zijn in de specifieke voorbeelden zo precies mogelijk vermeld. Elke numerieke waarde bevat echter inherent bepaalde fouten die noodzakelijkerwijs resulteren van de standaardafwijking die in de onderscheidenlijke metingen van testen worden gevonden. Het moet bovendien duidelijk zijn dat alle trajecten die hierin zijn beschreven elke en alle subtrajecten die daarin zijn opgenomen 30 omvatten. Een gesteld traject van “1 tot 10” zou bijvoorbeeld moeten worden beschouwd elke en alle subtrajecten tussen (en waaronder) de minimale waarde van 1 en de maximale waarde van 10 te omvatten; dat wil zeggen, alle subtrajecten die met een minimale waarde van 1 of meer beginnen, bijvoorbeeld 1 tot 6,1 en eindigen met 12 een maximale waarde van 10 of lager, bijvoorbeeld 5,5 tot 10. In aanvulling moet elke verwijzing waarnaar hierin wordt verwezen als “hierin opgenomen” worden begrepen als in het geheel opgenomen.

Het moet verder worden opgemerkt dat, zoals in deze specificatie wordt gebruikt, 5 de enkelvoudige vormen “een”, “de” en “het” verwijzingen in het meervoud omvatten tenzij uitdrukkelijk en ondubbelzinnig tot één verwijzing wordt beperkt. De term “of’ wordt onderling uitwisselbaar gebruikt met de term “en/of’ tenzij de samenhang duidelijk anders aangeeft.

De termen “deel” en “fragment” worden ook onderling uitwisselbaar gebruikt om 10 te verwijzen naar delen van een polypeptide, nucleïnezuur of ander moleculair construct.

“Polypeptide” en “eiwit” worden hierin onderling uitwisselbaar gebruikt voor het beschrijven van eiwitmoleculen die ofwel gedeeltelijke eiwitten of eiwitten met de volledige lengte kunnen omvatten.

15 Zoals in het vakgebied bekend is zijn “eiwitten”, “peptiden”, “polypeptiden” en “oligopeptiden” ketens van aminozuren (kenmerkend L-aminozuren) waarvan de alfa-koolstoffen zijn gekoppeld door middel van peptidebindingen die worden gevormd door een condensatiereactie tussen de carboxylgroep van de alfa-koolstof van één aminozuur en de aminogroep van de alfa-koolstof van een ander aminozuur. De 20 aminozuren die een eiwit vormen zijn kenmerkend in volgorde genummerd, beginnend bij het amino-eindstandige residu en toenemend in de richting van het carboxy-eindstandige residu van het eiwit.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst de term “stroomopwaarts” naar een residu dat N-eindstandig is aan een tweede residu wanneer het molecuul een eiwit is of 5’ aan 25 een tweede residu wanneer het molecuul een nucleïnezuur is. Zoals hierin ook wordt gebruikt verwijst de term “stroomafwaarts” naar een residu dat C-eindstandig is aan een tweede residu wanneer het molecuul een eiwit is, of 3’ aan een tweede residu wanneer het molecuul een nucleïnezuur is.

Tenzij anders wordt gedefinieerd hebben alle technische en wetenschappelijke 30 termen die hierin worden gebruikt dezelfde betekenis zoals die algemeen duidelijk is bij de deskundigen in het vakgebied. Deskundigen worden in het bijzonder verwezen naar Current Protocols in Molecular Biology (zie bijvoorbeeld Ausubel, F.M. et al, Short Protocols in Molecular Biology, 4de editie, Hoofdstuk 2, John Wiley & Sons, 13 N.Y.) voor definities en termen van het vakgebied. Afkortingen voor aminozuur-residuen zijn de standaard 3-letter en/of 1-letter codes die in het vakgebied worden gebruikt om te verwijzen naar één van de 20 algemene L-aminozuren.

Een “nucleïnezuur” is een polynucleotide zoals deoxyribonucleïnezuur (DNA) of 5 ribonucleïnezuur (RNA). De term wordt gebruikt om enkelstrengs nucleïnezuren, dubbelstrengs nucleïnezuren en RNA en DNA dat van nucleotide- of nucleoside-analoga is gemaakt te omvatten.

De term “vector” verwijst naar een nucleïnezuurmolecuul dat kan worden gebruikt voor het transporteren van een tweede nucleïnezuurmolecuul in een cel. In één 10 uitvoeringsvorm maakt de vector replicatie van DNA-sequenties die in de vector zijn geïnsereerd mogelijk. De vector kan een promoter omvatten voor het verhogen van de expressie van het nucleïnezuurmolecuul in tenminste sommige gastheercellen. Vectoren kunnen op autonome wijze (extrachromosomaal) repliceren of kunnen in een chromosoom van de gastheercel zijn geïntegreerd. In één uitvoeringsvorm kan de 15 vector een expressievector omvatten die in staat is een eiwit te produceren dat afkomstig is van tenminste een deel van een nucleïnezuursequentie die in de vector is geïnsereerd.

Zoals in het vakgebied bekend is kunnen omstandigheden voor het aan elkaar hybridiseren van nucleïnezuursequenties worden beschreven als variërend van lage 20 naar hoge stringentie. Hoge stringente hybridisatie-omstandigheden verwijzen in het algemeen naar het wassen van hybriden in buffer met laag zoutgehalte bij hoge temperaturen. Hybridisatie kan aan filter-gebonden DNA zijn door het gebruik van hybridisatie-oplossingen die in het vakgebied standaard zijn, zoals 0,5 M NaHPC>4, 7% natriumdodecylsulfaat (SDS), bij 65°C en wassen in 0,25 M NaHPC>4, 3,5% SDS 25 gevolgd door wassen in 0,1 x SSC/0,1% SDS bij een temperatuur die varieert van kamertemperatuur tot 68°C afhankelijk van de lengte van de probe. Een was bij hoge stringentie omvat bijvoorbeeld wassen in 6x SSC/0,05% natriumpyrofosfaat bij 37°C voor een oligonucleotide-probe van 14 basen of bij 48°C voor een oligonucleotide-probe van 17 basen of bij 55°C voor een oligonucleotideprobe van 20 basen, of bij 30 60°C voor een oligonucleotide-probe van 25 basen, of bij 65°C voor een nucleotide- probe met een lengte van ongeveer 250 nucleotiden. Nucleïnezuurprobes kunnen met radionucleotiden worden gemerkt door eindstandig merken met bijvoorbeeld [γ-P]ATP of incorporatie van radioactief gemerkte nucleotiden zoals [a- PJdCTP door 14 willekeurige labelling met primers. Als alternatief kunnen probes worden gemerkt door incorporatie van gebiotinyleerde of fluoresceïne-gemerkte nucleotiden en de probe wordt gedetecteerd door het gebruik van Streptavidine of anti-fluoresceïne antilichamen.

5 Zoals hierin wordt gebruikt zijn “kleine organische moleculen” moleculen met een molecuulgewicht van lager dan 2.000 Dalton die tenminste één koolstofatoom bevatten.

De term “fusie-eiwit” verwijst naar een eiwit of polypeptide dat een aminozuursequentie heeft die afkomstig is van twee of meer eiwitten. Het fusie-eiwit 10 kan ook koppelende gebieden van aminozuren tussen delen van aminozuren die afkomstig zijn van afzonderlijke eiwitten omvatten.

Zoals hierin wordt gebruikt is een “niet-RAGE-polypeptide” elk polypeptide dat niet afkomstig is van RAGE of een fragment daarvan. Dergelijke niet-RAGE-polypeptiden omvatten immunoglobuline-peptiden, dimeriserende polypeptiden, 15 stabiliserende polypeptiden, amfifiele peptiden of polypeptiden die aminozuur-sequenties omvatten die “merkers” voor het doelgericht sturen of zuiveren van het eiwit verschaffen.

Zoals hierin wordt gebruikt kunnen “immunoglobuline-peptiden” een zware keten van een immunoglobuline of een deel daarvan omvatten. In één uitvoeringsvorm 20 kan het deel van de zware keten het Fc-fragment of een deel daarvan zijn. Zoals hierin wordt gebruikt omvat het Fc-fragment het schamierpolypeptide van de zware keten en de Ch2- en Ch3-domeinen van de zware keten van een immunoglobuline in ofwel monomere of dimere vorm. Het ChI- en Fc-fragment kunnen ook als het immunoglobuline-polypeptide worden gebruikt. De zware keten (of deel daarvan) kan 25 afkomstig zijn van elk van de bekende isotypen van zware ketens: IgG (γ), IgM (μ), IgD (6), IgE (ε) of IgA (a). In aanvulling kan de zware keten (of deel daarvan) afkomstig zijn van elk van de bekende subtypen van zware ketens: IgGl (γΐ), IgG2 (γ2), IgG3 (y3), IgG4 (γ4), IgAl (al), IgA2 (a2), of mutaties van deze isotypen of subtypen die de biologische activiteit veranderen. Een voorbeeld van biologische 30 activiteit die kan worden veranderd omvat verlaging van het vermogen van een isotype om te binden aan sommige Fc-receptoren zoals bijvoorbeeld door modificatie van het schamiergebied.

15

De termen “overeenkomst” of “percentage overeenkomst” verwijst naar sequentie-overeenkomst tussen twee aminozuursequenties of tussen twee nucleïnezuur-sequenties. Percentage overeenkomst kan worden bepaald door het positioneren van twee sequenties en verwijst naar het aantal identieke residuen (d.w.z. aminozuur of 5 nucleotiden) op posities die worden gedeeld door de sequenties de worden vergeleken. Sequentie-positionering en vergelijking kan worden uitgevoerd door het gebruik van de algoritmen die in het vakgebied standaard zijn (bijvoorbeeld Smith en Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman en Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443; Pearson en Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 85:2444) of door gecomputeriseerde versies 10 van deze algoritmen (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI) die publiekelijk verkrijgbaar zijn als BLAST en FASTA. Ook, ENTREZ, verkrijgbaar door middel van de National Institutes of Health, Bethesda MD, kan voor de sequentievergelijking worden gebruikt. In één uitvoeringsvorm kan het percentage overeenkomst van twee sequenties worden 15 bepaald door het gebruik van GCG met een gap weight van 1, zodanig dat elke tussenruimte van een aminozuur wordt gewogen alsof het een enkele verkeerde paring van aminozuren tussen de twee sequenties is.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst de term “geconserveerde residuen” naar aminozuren die hetzelfde zijn onder een verscheidenheid van eiwitten die dezelfde 20 structuur en/of functie hebben. Een gebied van geconserveerde residuen kan belangrijk zijn voor eiwitstructuur en functie. Opeenvolgende geconserveerde residuen zoals ze in een driedimensionaal eiwit worden geïdentificeerd kunnen aldus belangrijk zijn voor de structuur en functie van een eiwit. Voor het vinden van geconserveerde residuen of geconserveerde gebieden van een 3-D-structuur kan een vergelijking van sequenties 25 voor dezelfde of overeenkomstige eiwitten van verschillende soorten of van individuen van dezelfde soort worden uitgevoerd.

Zoals hierin wordt gebruikt betekent de term “homoloog” een polypeptide dat een mate van homologie heeft met de wildtype aminozuursequentie. Vergelijkingen op homologie kan door middel van het oog worden uitgevoerd of meer gebruikelijk met 30 behulp van eenvoudig verkrijgbare programma’s voor sequentievergelijking. Deze in de handel verkrijgbare computerprogramma’s kunnen het percentage homologie tussen twee of meer sequenties berekenen (bijvoorbeeld Wilbur, W. J. en Lipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730). Homologe sequenties kunnen bijvoorbeeld 16 worden beschouwd aminozuursequenties te omvatten die in andere uitvoeringsvormen tenminste 70% identiek, 75% identiek, 85% identiek, 90% identiek, 95% identiek, 97% identiek, of 98% identiek, of 99% identiek aan elkaar zijn.

Zoals hierin wordt gebruikt omvat de term tenminste 90% identiek daarmee 5 sequenties die variëren van 90 tot 99,99% overeenkomst met de aangegeven sequenties en omvat alle trajecten daartussen. De term tenminste 90% identiek daarmee omvat aldus sequenties die 91, 91,5, 92, 92,5, 93, 93,5, 94, 94,5, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99, 99,5 procent identiek zijn aan de aangegeven sequentie. Op overeenkomstige wijze omvat de term “tenminste 70% identiek” sequenties die variëren van 70 10 tot 99,99% identiek, met alle trajecten daartussen. De bepaling van percentage overeenkomst wordt bepaald door het gebruik van algoritmen die hier zijn beschreven.

Zoals hierin wordt gebruikt omvat een polypeptide of eiwit “domein” een gebied langs een polypeptide of eiwit dat een onafhankelijke eenheid omvat. Domeinen kunnen worden gedefinieerd in termen van structuur, sequentie en/of biologische 15 activiteit. In één uitvoeringsvorm kan een polypeptidedomein een gebied van een eiwit omvatten dat op een wijze vouwt die nagenoeg onafhankelijk is van de rest van het eiwit. Domeinen kunnen worden geïdentificeerd door het gebruik van gegevensbanken van domeinen zoals maar niet beperkt tot PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT en PROCLASS.

20 Zoals hierin wordt gebruikt is een “immunoglobuline-domein” een sequentie van aminozuren die structureel homoloog is of identiek is aan een domein van een immunoglobuline. De lengte van de sequentie van aminozuren van een immunoglobuline-domein kan van elke lengte zijn. In één uitvoeringsvorm kan een immunoglobuline-domein kleiner zijn dan 250 aminozuren. In een voorbeeld van een 25 uitvoeringsvorm kan een immunoglobuline-domein ongeveer 80-150 aminozuren in lengte zijn. Het variabele gebied en de ChI-, Ch2- en Cr3-gebieden van een IgG zijn elk bijvoorbeeld immunoglobuline-domeinen. In een ander voorbeeld zij de variabele, de ChI-, Ch2-, Ch3- en Cn4-gebieden van een IgM elk immunoglobuline-domeinen.

Zoals hierin wordt gebruikt is een “RAGE-immunoglobuline-domein” een 30 sequentie van aminozuren van RAGE-eiwit die structureel homoloog is of identiek is aan een domein van een immunoglobuline. Een RAGE-immunoglobuline-domein kan bijvoorbeeld het V-domein van RAGE, het Ig-achtige Cl-type 1 domein van RAGE

17 (“Cl-domein) of het Ig-achtige C2-type 2-domein (“C2-domein”) van RAGE omvatten.

Zoals hierin wordt gebruikt omvat een “interdomein linker” een polypeptide dat twee domeinen tezamen verbindt. Een Fc-schamiergebied is een voorbeeld van een 5 interdomein linker in een TgG.

Zoals hierin wordt gebruikt identificeert “direct gekoppeld” een covalente koppeling tussen twee verschillende groepen (bijvoorbeeld nucleïnezuursequenties, polypeptiden, polypeptide-domeinen) die geen tussenliggende atomen tussen de twee groepen die worden gekoppeld heeft.

10 Zoals hierin wordt gebruikt verwijst “ligand-bindend domein” naar een domein van een eiwit dat verantwoordelijk is voor het binden van een ligand. De term ligand-bindend domein omvat homologen van een ligand-bindend domein of delen daarvan. In dit opzicht kunnen opzettelijke aminozuursubstituties in de ligand-bindende plaats worden gemaakt op basis van overeenkomst in polariteit, lading, oplosbaarheid, 15 hydrofobiciteit of hydrofiliteit van de residuen zolang de bindingsspecifïciteit van het ligand-bindende domein wordt behouden.

Zoals hierin wordt gebruikt omvat een “ligand bindende plaats” residuen in een eiwit die op directe wijze in interactie vertonen met een ligand of residuen die zijn betrokken bij het positioneren van het ligand in dichte nabijheid aan die residuen die op 20 directe wijze met het ligand interactie vertonen. De interactie van residuen in de ligand-bindende plaats kan worden bepaald door de ruimtelijke nabijheid van de residuen met een ligand in het model of de structuur. De term ligand-bindende plaats omvat homologen van een ligand-bindende plaats of delen daarvan. In dit opzicht kunnen opzettelijke aminozuursubstituties in de ligand-bindende plaats worden gemaakt op 25 basis van overeenkomst in polariteit, lading, oplosbaarheid, hydrofobiciteit of hydro filiteit van de residuen zolang de bindingsspecifïciteit van de ligand-bindende plaats wordt behouden. Een ligand-bindende plaats kan in één of meer ligand-bindende domeinen van een eiwit of polypeptide voorkomen.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst de term “interactie” naar een omstandigheid 30 van nabijheid tussen een ligand of verbinding of delen of fragmenten daarvan en een deel van een tweede molecuul van belang. De interactie kan niet-covalent zijn, bijvoorbeeld als een resultaat van waterstofbinding, van der Waals interacties of elektrostatische of hydrofobe interacties of het kan covalent zijn.

18

Zoals hierin wordt gebruik verwijst “ligand” naar een molecuul of verbinding of eenheid die interactie vertoont met een ligand bindingsplaats, waaronder substraten of analoga of delen daarvan. Zoals hierin is beschreven kan de term “ligand” verwijzen naar verbindingen die aan het eiwit van belang binden. Een ligand kan een agonist, een 5 antagonist of een modulator zijn. Of een ligand kan geen biologisch effect hebben. Of een ligand kan de binding van andere liganden blokkeren waardoor een biologisch effect wordt geremd. Liganden kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, remmers in de vorm van kleine moleculen. Deze kleine moleculen kunnen peptiden, peptidomimetica, organische verbindingen en dergelijke omvatten. Liganden kunnen 10 ook polypeptiden en/of eiwitten omvatten.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst een “modulerende verbinding” naar een molecuul dat de biologische activiteit van een molecuul van belang verandert of verwisselt. Een modulerende verbinding kan activiteit verhogen of verlagen of de fysische of chemische kenmerken of functionele of immunologische eigenschappen van 15 het molecuul van belang veranderen. Voor RAGE kan een modulerende verbinding activiteit verhogen of verlagen of de kenmerken of functionele of immunologische eigenschappen van het RAGE of een deel daarvan veranderen. Een modulerende verbinding kan natuurlijke en/of chemisch gesynthetiseerde of kunstmatige peptiden, gemodificeerde peptiden (bijvoorbeeld fosfopeptiden), antilichamen, koolhydraten, 20 monosacchariden, oligosacchariden, polysacchariden, glycolipiden, heterocyclische verbindingen, nucleosiden of nucleotiden of delen daarvan en kleine organische of anorganische moleculen omvatten. Een modulerende verbinding kan een endogene fysiologische verbinding zijn of het kan een natuurlijke of synthetische verbinding zijn. Of de modulerende verbinding kan een klein organisch molecuul zijn. De term 25 “modulerende verbinding” omvat ook een chemisch gemodificeerde ligand of verbinding en omvat isomeren en racemische vormen.

Een “agonist” omvat een verbinding die aan een receptor bindt voor het vormen van een complex dat een farmacologische respons opwekt die specifiek is voor de betrokken receptor.

30 Een “antagonist” omvat een verbinding die aan een agonist of aan een receptor bindt voor het vormen van een complex dat niet een aanzienlijke farmacologische respons opwekt en de biologische respons die door een agonist wordt geïnduceerd kan remmen.

19 RAGE-agonisten kunnen daardoor aan RAGE binden en RAGE-bemiddelde cellulaire processen stimuleren en RAGE-antagonisten kunnen RAGE-bemiddelde processen remmen om te worden gestimuleerd door een RAGE-agonist. In één uitvoeringsvorm omvat het cellulaire proces dat door RAGE-agonisten wordt 5 gestimuleerd bijvoorbeeld activering van transcriptie van het TNF-a-gen.

De term “peptidomimetica” verwijst naar structuren die dienen als substituenten voor peptiden bij interacties tussen moleculen (Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chetn., 24:243-252). Peptidomimetica kunnen synthetische structuren omvatten die wel of niet aminozuren en/of peptidebindingen kunnen bevatten maar die de structurele en 10 functionele kenmerken van een peptide of agonist of antagonist behouden. Peptidomimetica omvatten ook peptoïden, oligopeptoïden (Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 89:9367); en peptide-bibliotheken die peptiden van een ontworpen lengte bevatten die alle mogelijke sequenties van aminozuren die met een peptide of agonist of antagonist van de uitvinding overeenkomen vertegenwoordigen.

15 De term “behandeling” of “behandelt” verwijst naar het verbeteren van een symptoom van een ziekte of stoornis en kan het genezen van de stoornis, het nagenoeg voorkomen van het begin van de stoornis of het verbeteren van de omstandigheid van de patiënt omvatten. De term “behandeling” zoals hierin wordt gebruikt verwijst naar het volledige spectrum van behandelingen voor een bepaalde stoornis waaraan de 20 patiënt lijdt, waaronder het verlichten van één symptoom of de meeste symptomen die resulteren van die stoornis, een genezing voor de specifieke stoornis of het voorkomen van het begin van de stoornis.

Zoals hierin wordt gebruikt wordt de term “EC50” gedefinieerd als de concentratie van een middel die in 50% van een gemeten biologisch effect resulteert. 25 De EC50 van een therapeutisch middel dat een meetbaar biologisch effect heeft kan bijvoorbeeld de waarde waarbij het middel 50% van het biologische effect vertoond omvatten.

Zoals hierin wordt gebruikt wordt de term “IC50” gedefinieerd als de concentratie van een middel die resulteert in 50% remming van een gemeten effect. De 30 IC50 van een antagonist van binding van RAGE kan bijvoorbeeld de waarde omvatten waarbij de antagonist binding van het ligand aan de ligand-bindende plaats van RAGE met 50% verlaagt.

20

Zoals hierin wordt gebruikt betekent een “effectieve hoeveelheid” de hoeveelheid van een middel die effectief is voor het produceren van een gewenst effect bij een patiënt. De term “therapeutisch effectieve hoeveelheid” geeft die hoeveelheid van een geneesmiddel of farmaceutisch middel aan die de therapeutische respons bij een dier of 5 mens die men wenst zal opwekken. De werkelijke dosis die de effectieve hoeveelheid omvat kan afhangen van de route van toediening, de grootte en gezondheid van de patiënt, de stoornis die wordt behandeld en dergelijke.

De term “farmaceutisch aanvaardbare drager” zoals hierin wordt gebruikt kan verwijzen naar verbindingen en preparaten die geschikt zijn voor gebruik bij humane of 10 dierlijke patiënten, zoals bijvoorbeeld voor therapeutische preparaten die worden toegediend voor de behandeling van een RAGE-bemiddelde stoornis of ziekte.

De term “farmaceutisch preparaat” wordt hierin gebruikt om een preparaat aan te geven dat aan een zoogdierlijke gastheer kan worden toegediend, bijvoorbeeld op orale, parenterale, topicale wijze, door inhalatie spray, intranasale wijze of rectale wijze, in 15 preparaten voor eenheidsdosering die gebruikelijke niet-toxische dragers, verdunnings-middelen, adjuvans, hulpstoffen en dergelijke bevatten.

De term “parenteraal” zoals hierin wordt gebruikt omvat subcutane injecties, intraveneuze, intramusculaire, intracistemale injectie of technieken van infusie.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst “afstoting” naar de immuun- of 20 ontstekingsreactie op weefsel die leidt tot vernietiging van cellen, weefsels of organen of die leidt tot schade aan cellen, weefsels of organen. De afgestoten cellen, weefsel of orgaan kan afkomstig zijn van dezelfde patiënt die de afweerreactie opwekt of kan van een andere patiënt in de patiënt die afstoting vertoont zijn getransplanteerd.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst de term “cel” naar de structurele en 25 functionele eenheden van een zoogdierlijk levend systeem die elk een onafhankelijk levend systeem omvatten. Zoals in het vakgebied bekend is omvatten cellen een kern, cytoplasma, intracellulaire organellen en een celwand die de cel omgeeft en die het mogelijk maakt dat de cel onafhankelijk is van andere cellen.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst de term “weefsel” naar een aggregaat van 30 cellen die een overeenkomstige structuur en functie hebben of die tezamen werken voor het uitvoeren van een specifieke functie. Een weefsel kan een verzameling van overeenkomstige cellen en de intercellulaire bestanddelen die de cellen omgeven 21 omvatten. Weefsels omvatten, maar zijn niet beperkt tot, spierweefsel, zenuwweefsel en bot.

Zoals hierin wordt gebruikt verwijst een “orgaan” naar een volledig gedifferentieerde structurele of functionele eenheid in een dier dat voor een bepaalde 5 specifieke functie is gespecialiseerd. Een orgaan kan een groep van weefsel omvatten die een specifieke functie of groep van functies uitoefenen. Organen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het hart, longen, hersenen, oog, maag, milt, alvleesklier, nieren, lever, dunne darmen, huid, baarmoeder, blaas en bot.

Een “stabiel” preparaat is één waarin het RAGE-fusie-eiwit daarin gedurende 10 opslag in wezen de fysische en chemische stabiliteit en biologische activiteit ervan behoudt. Verscheidene analytische technieken voor het meten van eiwitstabiliteit zijn in het vakgebied verkrijgbaar en zijn samengevat in Peptide en Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee redacteur, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) en Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Stabiliteit kan bij een 15 geselecteerde temperatuur gedurende een geselecteerde tijdsperiode worden gemeten. Voor snelle screening kan het preparaat gedurende 1 week tot 1 maand bij 40°C worden gehouden waarna de stabiliteit wordt gemeten. De mate van aggregatie volgend op vriesdrogen en opslag kan bijvoorbeeld als een indicator van stabiliteit van het RAGE-fusie-eiwit worden gebruikt (zie de Voorbeelden hierin). Een “stabiel” 20 preparaat kan bijvoorbeeld één zijn waarin minder dan ongeveer 10% en bij voorkeur minder dan ongeveer 5% van het RAGE-fusie-eiwit aanwezig is als een aggregaat in het preparaat. In andere uitvoeringsvormen kan een toename van vorming van aggregaten volgend op vriesdrogen en opslag van het gevriesdroogde preparaat worden bepaald. Een “stabiel” gevriesdroogd preparaat kan bijvoorbeeld één zijn waarbij de 25 toename van aggregaten in het gevriesdroogde preparaat lager is dan ongeveer 5% of lager is dan ongeveer 3%, wanneer het gevriesdroogde preparaat gedurende tenminste één week bij 40°C wordt geïncubeerd. In andere uitvoeringsvormen kan stabiliteit van het preparaat van RAGE-fusie-eiwit worden gemeten door het gebruik van een test op biologische activiteit zoals een bindingstest zoals die hierin is beschreven.

30 Een “gereconstitueerd” preparaat is één dat is bereid door het oplossen van een preparaat van een gevriesdroogd RAGE-fusie-eiwit in een verdunningsmiddel, zodanig dat het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat wordt gedispergeerd en/of opgelost. Het gereconstitueerde preparaat kan geschikt zijn voor toediening 22 (bijvoorbeeld parenterale toediening) aan een patiënt die met het fusie-eiwit behandeld dient te worden en kan in bepaalde uitvoeringsvormen van de uitvinding één zijn die geschikt is voor subcutane toediening.

Met “isotonisch” wordt bedoeld dat het preparaat van belang een osmotische druk 5 heeft van ongeveer 240 tot ongeveer 340 mOsm/kg. In een uitvoerinsgvorm is een isotonisch preparaat één dat een osmotische druk heeft die in wezen hetzelfde is als humaan bloed (285-310 mOsm/kg). Isotoniciteit kan worden gemeten door het gebruik van een dampdruk of een vriespuntverlaging type osmometer.

Een “beschermend middel voor vriesdrogen (“lyoprotectant”)” is een molecuul 10 dat, wanneer het wordt gecombineerd met een RAGE-fusie-eiwit, chemische en/of fysische instabiliteit van het eiwit tijdens vriesdrogen en daaropvolgende opslag aanzienlijk voorkomt of verlaagt. Illustratieve beschermende middelen voor vriesdrogen omvatten suikers zoals sucrose of trehalose; een polyol zoals suikeralcoholen, bijvoorbeeld erythritol, arabitol, xylitol, sorbitol en mannitol; of 15 combinaties daarvan. In een uitvoeringsvorm kan het beschermende middel voor vriesdrogen een suiker omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan het beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan het beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker zoals sucrose omvatten. Het beschermende middel voor vriesdrogen kan aan het 20 preparaat voorafgaand aan het vriesdrogen worden toegevoegd bij een “voor vriesdrogen beschermende hoeveelheid” dat betekent dat, volgend op vriesdrogen van het eiwit in de aanwezigheid van een voor vriesdrogen beschermende hoeveelheid van het beschermende middel voor vriesdrogen het RAGE-fusie-eiwit in wezen de fysische en chemische stabiliteit en de biologische activiteit ervan behoudt tijdens vriesdrogen 25 en opslag.

Het “verdunningsmiddel” voor een gevriesdroogd preparaat is hierin één dat farmaceutisch aanvaardbaar is (veilig en niet-toxisch voor toediening aan een mens) en bruikbaar is voor de bereiding van een gereconstitueerd preparaat. Illustratieve verdunningsmiddelen omvatten steriel water, bacteriostatisch water voor injectie 30 (BWFI), een pH-gebufferde oplossing (bijvoorbeeld fosfaat-gebufferde zoutoplossing), steriele zoutoplossing, Ringer’s oplossing of dextrose-oplossing. In een uitvoeringsvorm verschaft het verdunningsmiddel een gereconstitueerd preparaat dat geschikt is voor injectie. In een andere uitvoeringsvorm, waar het verdunningsmiddel 23 een gereconstitueerd preparaat verschaft dat geschikt is voor injectie, kan het verdunningsmiddel water voor injectie (WF1) omvatten.

Een “conserveringsmiddel” voor een gereconstitueerd preparaat is een verbinding die kan worden toegevoegd aan het verdunningsmiddel of aan het gereconstitueerde 5 preparaat om in wezen de bacteriële werking in het gereconstitueerde preparaat te verlagen. In een uitvoeringsvorm kan de hoeveelheid van het conserveringsmiddel worden toegevoegd bij een hoeveelheid die bruikbaar is voor het bewerkstelligen van de productie van een gereconstitueerd preparaat voor meerder gebruik. Voorbeelden van mogelijke conserveringsmiddelen omvatten octadecyldimethylbenzylammonium-10 chloride, hexamethoniumchloride, benzalkoniumchloride (een mengsel van alkyl-benzyldimethylammoniumchloriden waarbij de alkylgroepen verbindingen met lange ketens zijn) en benzethoniumchloride. Andere soorten van conserveringsmiddelen omvatten aromatische alcoholen zoals fenol, butyl en benzylalcohol, allylparabenen zoals methyl- of propylparabeen, catechol, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol en m-15 cresol.

Een “volume-vormend middel (“bulking agent”)” voor een gevriesdroogd preparaat is een verbinding die massa toevoegt aan het gevriesdroogde mengsel en bij draagt aan de fysische structuur van de gevriesdroogde koek (bewerkstelligd bijvoorbeeld de productie van een in wezen uniforme gevriesdroogde koek die een 20 structuur van open poriën behoudt). Illustratieve volume-vormende middelen omvatten, maar zijn niet beperkt tot mannitol, glycine en xorbitol.

RAGE-fusie-eiwitten

Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding omvatten RAGE-fusie-25 eiwitten, werkwijzen voor het maken van dergelijke fusie-eiwitten en werkwijzen voor het gebruik van dergelijke fusie-eiwitten. De onderhavige uitvinding kan op een verscheidenheid van wijzen worden uitgevoerd.

Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding verschaffen bijvoorbeeld RAGE-fusie-eiwitten die een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-30 RAGE-polypeptide omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fiisie-eiwit een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de ligand-bindingsplaats het meest N-eindstandige domein van het RAGE-fusie-eiwit. De bindingsplaats voor het ligand van RAGE kan het V-domein van RAGE of een deel 24 daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de bindingsplaats voor een ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is (Figuur 1).

5 In een uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide zijn gekoppeld aan een polypeptide dat een immunoglobuline-domein of een deel (bijvoorbeeld een fragment daarvan) van een immunoglobulinedomein omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het polypeptide dat een immunoglobuline-domein omvat tenminste een deel van tenminste één van de Ch2- of de CH3-domeinen van een humaan IgG.

10 In bepaalde uitvoeringsvormen omvat het RAGE-fusie-eiwit een aminozuur- sequentie zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, of 99% identiek daar aan is. In sommige uitvoeringsvormen omvat een sequentie die tenminste 90% identiek is aan SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 bijvoorbeeld de sequentie van SEQ ID NO: 15 56 of SEQ ID NO: 57 zonder de C-eindstandige lysine.

Een RAGE-eiwit of polypeptide kan humaan RAGE-eiwit met de volledige lengte omvatten (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 1) of een fragment van humaan RAGE. Zoals hierin wordt gebruikt heeft een fragment van een RAGE-polypeptide een lengte van tenminste 5 aminozuren, kan het langer zijn dan een lengte van 30 aminozuren, 20 maar is korter dan de volledige aminozuursequentie. In andere uitvoeringsvormen van de fusie-eiwitten, preparaten en werkwijzen van de onderhavige uitvinding kan het RAGE-polypeptide een sequentie omvatten die tenminste ongeveer 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, of 99% identiek is aan humaan RAGE of een fragment daarvan. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide bijvoorbeeld 25 humaan RAGE of een fragment daarvan met Glycine als het eerste residu in plaats van een Methionine omvatten (zie bijvoorbeeld Neeper et al, (1992)). Of het humane RAGE kan RAGE met de volledige lengte omvatten waarbij de signaalsequentie is verwijderd (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 2 of SEQ ID NO: 3) (Figuren IA en 1B) of een deel van die aminozuursequentie.

30 De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook sRAGE

(bijvoorbeeld SEQ ID NO: 4), een polypeptide dat tenminste 90% identiek is aan sRAGE, of een fragment van sRAGE omvatten. Zoals hierin wordt gebruikt is sRAGE het RAGE-eiwit dat niet het transmembraangebied of de cytoplasmatische staart omvat 25 (Park et al, Nature Med., 4:1025-1031 (1998)). Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld humaan sRAGE of een fragment daarvan, met Glycine als het eerste residu in plaats van een Methionine omvatten (zie bijvoorbeeld Neeper et al., (1992)). Of een RAGE-polypeptide kan humaan sRAGE waarbij de signaalsequentie is 5 verwijderd omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ TD NO: 5 of SEQ ID NO: 6 of SEQ 1D NO: 45 in Figuur 1) of een deel van die aminozuursequentie.

In andere uitvoeringsvormen kan het RAGE-eiwit een V-domein van RAGE omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 7 of SEQ ID NO: 8 of SEQ ID NO: 46 in Figuur 1) (Neeper et al, (1992); Schmidt et al. (1997)). Of een sequentie die tenminste 10 90% identiek is aan het V-domein van RAGE of een fragment daarvan kan worden gebruikt.

Of het RAGE-eiwit kan een fragment van het V-domein van RAGE omvatten (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 9 of SEQ ID NO: 10 of SEQ ID NO: 47 in Figuur 1). In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-eiwit een ligand-bindingsplaats omvatten. In een 15 uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats SEQ ID NO: 9, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, omvatten. In nog een andere uitvoeringsvorm, is het RAGE-fragment een synthetisch peptide.

20 In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 23-53 van SEQ ID NO: 1 (Figuur 1) omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 24-52 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 31-52 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoerinsgvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 31-25 116 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand- bindingsplaats aminozuren 19-52 van SEQ ID NO: 1 omvatten. De ligand-bindingsplaats kan bijvoorbeeld een V-domein van RAGE of een deel daarvan omvatten, zoals het ligand-bindingsdomein van RAGE (bijvoorbeeld aminozuren 1-118, 23-118, 24-118, 31-118, 1-116, 23-116, 24-116, 31-116, 1-54, 23-54, 24-54, 31-54, 1-53, 23-53, 30 24-53 of 31-53 van SEQ ID NO: 1 of fragmenten daarvan). Of fragmenten van de polypeptiden die functioneel een RAGE-ligand binden kunnen worden gebruikt. Of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, of 99% identiek is aan het V-domein van RAGE of een fragment daarvan (bijvoorbeeld zoals hierboven 26 is beschreven) kan worden gebruikt. Bij uitvoeringsvormen waarbij het N-uiteinde van het fusie-eiwit glutamine is, zoals bijvoorbeeld door verwijdering van de signaalsequentie die residuen 1-23 van SEQ ID NO: 1 omvat (bijvoorbeeld Q24 voor een polypeptide dat aminozuren 24-118 of SEQ ID NO: 1 omvat) kan verder, zoals in 5 het vakgebied bekend is, de glutamine cycliseren teneinde pyroglutaminezuur (pE) te vormen.

Het RAGE-polypeptide dat in de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding wordt gebruikt kan aldus een fragment van RAGE met de volledige lengte omvatten. Zoals in het vakgebied bekend is omvat RAGE drie immunoglobuline-10 achtige polypeptide-domeinen, het V-domein en de Cl- en C2-domeinen die elk aan elkaar zijn gekoppeld door een interdomein linker. RAGE met de volledige lengte omvat ook een transmembraan polypeptide en een cytoplasmatische staart stroomafwaarts (C-eindstandig) van het C2-domein en gekoppeld aan het C2-domein.

In een uitvoeringsvorm, omvat het RAGE-polypeptide geen residuen van een 15 signaalsequentie. De signaalsequentie van RAGE kan ofwel residuen 1-22 of residuen 1-23 van RAGE met de volledige lengte omvatten. Zoals in het vakgebied bekend is kan in uitvoeringsvormen waarbij het N-uiteinde van het fusie-eiwit glutamine is (bijvoorbeeld omvat de signaalsequentie residuen 1-23) het N-eindstandige glutamine (Q24) cycliseren voor het vormen van pyroglutaminezuur (pE). Constructen als 20 voorbeeld van dergelijke moleculen zijn polypeptiden die de aminozuursequenties hebben zoals ze uiteengezet zijn in SEQ ID NO’s: 45, 46, 47, 48, 49, 50 en 51 (Figuur 1), alsook RAGE-fusie-eiwitten die de aminozuursequenties hebben zoals ze uiteengezet zijn in SEQ ID NOs: 56 en 57 (Figuur 4).

Zoals in het vakgebied bekend is kan aan het Ch3-gebied van het RAGE-fusie-25 eiwit van de onderhavige uitvinding het C-eindstandige aminozuur zijn afgesplitst door een post-translationele modificatie wanneer het in bepaalde recombinante systemen tot expressie wordt gebracht (zie bijvoorbeeld Li, et al., BioProcessing J., 2005; 4, 23-30). In een uitvoeringsvorm, is het C-eindstandige aminozuur dat wordt afgesplitst lysine (K). In andere uitvoeringsvormen kan het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige 30 uitvinding aldus een polypeptide omvatten dat de aminozuursequentie heeft zoals uiteengezet is in SEQ ID NOs: 32-37, 56 en 57 zonder de C-eindstandige lysine (K).

In verscheidene uitvoeringsvormen kan het RAGE-polypeptide aldus aminozuren 23-116 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 7) of een sequentie die tenminste 90% 27 identiek daar aan is, of aminozuren 24-116 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 8) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-116 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 46) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, overeenkomend met het V-domein 5 van RAGE, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 124-221 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 11) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het Cl-domein van RAGE, omvatten. In een andere uitvoeringsvorm, kan het RAGE-polypeptide aminozuren 227-317 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 12) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het C2-10 domein van RAGE, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-123 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 13) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-123 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 14) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein van RAGE en een stroomafwaartse interdomein linker, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan 15 aminozuren 24-123 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 48) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-226 van humaan RAGE (SEQ 1D NO: 17) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-226 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 18) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan 20 is, die overeenkomt met het V-domein, het Cl-domein en de interdomein linker die deze twee domeinen koppelt, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 24-226 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 50), of een sequentie die 90% identiek daar aan is, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-339 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 5) of een sequentie die 25 tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-339 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 6) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met sRAGE (d.w.z. codeert voor de V-, Cl- en C2-domeinen en interdomein linkers) omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 24-339 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 45) of een sequentie die 30 tenminste 90% identiek daar aan is, omvatten. Of fragmenten van elk van deze sequenties kunnen worden gebruikt. Zie Figuur 1 voor de aminozuursequenties van deze polypeptiden.

28

Het RAGE-fiisie-eiwit kan verscheidene soorten van peptiden omvatten die niet afkomstig zijn van RAGE of een fragment daarvan. Het tweede polypeptide van het RAGE-fiisie-eiwit kan een polypeptide omvatten dat afkomstig is van een immunoglobuline. In één uitvoeringsvorm kan het immunoglobuline-polypeptide een 5 zware keten van een immunoglobuline of een deel (d.w.z. een fragment) daarvan omvatten. Het fragment van de zware keten kan bijvoorbeeld een polypeptide omvatten dat afkomstig is van het Fc-fragment van een immunoglobuline, waarbij het Fc-fragment het schamierpolypeptide van de zware keten en de Ch2- en Ch3-domeinen van de zware keten van het immunoglobuline als een monomeer omvat. De zware 10 keten (of deel daarvan) kan afkomstig zijn van één van de bekende isotopen van de zware keten: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), of IgA (α). In aanvulling kan de zware keten (of deel daarvan) worden verkregen van één van de bekende subtypen van de zware keten: IgGl (yl), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgAl (al), IgA2 (a2), of mutaties van deze isotypen of subtypen die de biologische activiteit veranderen. Het 15 tweede polypeptide kan de Ch2- en Ch3-domeinen van een humaan IgGl of delen van elk of beide van deze domeinen omvatten. Als een voorbeeld van een uitvoeringsvorm kan het polypeptide dat de Ch2- en Ch3-domeinen van een humane IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 40 (Figuur 1) of een deel daarvan omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan 20 IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO:38 of een fragment daarvan omvatten. Het immunoglobuline-peptide kan worden gecodeerd door de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO: 39 of SEQ ID NO: 41 (Figuur 1). De immunoglobulinesequentie in SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 kan ook worden gecodeerd door SEQ ID NO: 52 of SEQ ID NO: 53 (Figuur 1), waarbij stille basenveranderingen voor de codons die 25 coderen voor proline (CCG naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige codon verwijderen (d.w.z. nucleotiden 622-627 van SEQ ID NO: 39 worden gemodificeerd voor het genereren van SEQ ID NO: 52 of nucleotiden 652-657 van SEQ ID NO: 41 worden gemodificeerd teneinde SEQ ID NO: 53 te genereren).

30 Het schamiergebied van het Fc-deel van de immunoglobulineketen kan in vivo ontstekingsbevorderend zijn. In één uitvoeringsvorm omvat het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding aldus een interdomein linker die afkomstig is van RAGE in 29 plaats van een interdomein schamierpolypeptide dat van een immunoglobuline afkomstig is.

In bepaalde uitvoeringsvormen kan het RAGE-fusie-eiwit aldus een RAGE-polypeptide omvatten dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat een 5 Cn2-domein van een immunoglobuline of een fragment of een deel van het Ch2-domein van een immunoglobuline omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het Ch2-domein of een fragment daarvan SEQ ID NO: 42 (Figuur 1). In een uitvoeringsvorm omvat het fragment van SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 42 waarbij de eerste tien aminozuren, die tenminste een deel van het Fc schamiergebied omvatten, zijn 10 verwijderd. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide een ligand-bindingsplaats omvatten. De bindingsplaats voor het ligand van RAGE kan het V-domein van RAGE of een deel daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de bindingsplaats voor een ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 15 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is.

Het RAGE-polypeptide dat in de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding wordt gebruikt kan een immunoglobuline-domein van RAGE omvatten. In aanvulling of als alternatief kan het fragment van RAGE een interdomein linker 20 omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan een immunoglobuline-domein van RAGE gekoppeld aan een stroomopwaartse (d.w.z. dichter bij het N-uiteinde) of stroomafwaartse (d.w.z. dichter bij het C-uiteinde) interdomein linker omvatten. In nog een andere uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide twee (of meer) immunoglobuline-domeinen van RAGE omvatten die elk aan elkaar zijn gekoppeld 25 door een interdomein linker. Het RAGE-polypeptide kan verder meerdere immunoglobuline-domeinen van RAGE omvatten die aan elkaar zijn gekoppeld door één of meer interdomein linkers en die een eindstandige interdomein linker verbonden aan het N-eindstandige immunoglobuline-domein van RAGE en/of het C-eindstandige immunoglobuline-domein van RAGE hebben. Aanvullende combinaties van 30 immunoglobuline-domeinen en interdomein linkers van RAGE vallen binnen de beschermingsomvang van de onderhavige uitvinding.

In één uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE die zodanig aan het immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld dat het 30 C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker is gekoppeld en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Cn2-domein van een 5 immunoglobuline of een fragment daarvan omvat. Het polypeptide dat een Cn2-domein van een immunoglobuline omvat, kan de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel van elk, of beide, van deze domeinen omvatten. Als voorbeeld van uitvoeringsvormen kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen of een deel daarvan van een humaan IgGl omvat, SEQ ID NO: 40 of een deel daarvan omvatten. 10 In één uitvoeringsvorm kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 38 of een fragment daarvan omvatten. Of het humane IgGl kan SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten waarbij de eindstandige lysine (K) is verwijderd.

Zoals hierboven is beschreven kan het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige 15 uitvinding een enkele of meerdere domeinen van RAGE omvatten. Het RAGE-polypeptide dat een interdomein linker omvat die is gekoppeld aan een domein van een RAGE-polypeptide kan ook een fragment van het RAGE-eiwit met volledige lengte omvatten. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 15) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is of 20 aminozuren 24-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 16) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-136 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 49), of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein van RAGE en een stroomafwaartse interdomein-linker, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan 25 aminozuren 23-251 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 19) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 20) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 51), of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het 30 V-domein, het Cl-domein, de interdomein linker die deze twee domeinen koppelt en een tweede interdomein linker stroomafwaarts van Cl, omvatten.

In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit bijvoorbeeld twee immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van RAGE-eiwit en twee 31 immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan een eerste immunoglobuline-domein van RAGE en een eerste interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een tweede immunoglobuline-domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE 5 omvatten, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline domein van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is 10 gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE en het C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het Ch2-immunoglobuline domein. In andere uitvoeringsvormen wordt het RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen gecodeerd door SEQ ID NO: 30 of SEQ ID NO: 54 (Figuur 2). In 15 één uitvoeringsvorm kan een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen SEQ ID NO: 32 omvatten (Figuur 4). In andere uitvoeringsvormen omvat een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, of SEQ ID NO: 56 (Figuur 4).

Als alternatief kan een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen één immunoglobuline-domein dat afkomstig is van RAGE en twee immunoglobuline-20 domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld een enkel immunoglobuline-domein van RAGE gekoppeld door middel van een interdomein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van een C^-immunoglobuline domein of een deel van een CH2-immunoglobuline-domein omvatten. In andere uitvoeringsvormen wordt het RAGE-fusie-eiwit met drie 25 domeinen gecodeerd door SEQ ID NO: 31 of SEQ ID NO: 55 (Figuur 3). In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen SEQ ID NO: 35 (Figuur 5) omvatten. In andere uitvoeringsvormen kan een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, of SEQ ID NO: 57 omvatten (Figuur 5).

Een fragment van een interdomein linker van RAGE kan een peptidesequentie 30 omvatten die van nature stroomafwaarts is van, en aldus gekoppeld is aan, een immunoglobuline-domein van RAGE. Voor het V-domein van RAGE kan de interdomein linker bijvoorbeeld aminozuursequenties omvatten die van nature stroomafwaarts zijn van het V-domein. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID

32 NO: 21 omvatten, die overeenkomt met aminozuren 117-123 van RAGE met de volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een interdomein linker die verscheidene aminozuren (bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren) stroomopwaarts of 5 stroomafwaarts van SEQ TD NO: 21 omvat, kan bijvoorbeeld worden gebruikt. In één uitvoeringsvorm omvat de interdomein linker aldus SEQ ID NO: 23 die aminozuren 117-136 van RAGE met de volledige lengte omvat. Of fragmenten van SEQ ID NO: 21 waarbij bijvoorbeeld 1, 2 of 3 aminozuren van elk uiteinde van de linker zijn verwijderd kunnen worden gebruikt. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een 10 peptide omvatten dat tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan SEQ ID NO: 21 of SEQ ID NO: 23.

Voor het Cl-domein van RAGE kan de linker een peptidesequentie omvatten die van nature stroomafwaarts van het Cl-domein is. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID NO: 22 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-251 van RAGE met 15 de volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een linker die verscheidene aminozuren (1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren) stroomopwaarts en stroomafwaarts van SEQ ID NO: 22 omvat kan bijvoorbeeld worden gebruikt. Of fragmenten van SEQ ID NO: 22 kunnen worden gebruikt, waarbij bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren 20 van elk uiteinde van de linker zijn verwijderd. In één uitvoeringsvorm kan een interdomein linker van RAGE bijvoorbeeld SEQ ID NO: 24 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-226. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een peptide omvatten dat tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan SEQ ID NO: 22 of SEQ ID NO: 24.

25 Of een interdomein linker kan SEQ ID NO: 44 omvatten die overeenkomt met aminozuren 318-342 van RAGE. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een peptide omvatten dat tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan SEQ ID NO: 44.

Het zal voor een deskundige in het vakgebied bovendien duidelijk zijn dat 30 afzonderlijke substituties, deleties of addities die een enkel aminozuur of een klein percentage van aminozuren (kenmerkend minder dan ongeveer 5%, meer kenmerkend minder dan ongeveer 1%) in een gecodeerde sequentie veranderen, toevoegen of verwijderen op conservatieve wijze gemodificeerde variaties zijn waarbij de 33 veranderingen resulteren in de substitutie van een aminozuur met een chemisch overeenkomstig aminozuur. Tabellen van conservatieve substituties die functioneel overeenkomstige aminozuren verschaffen zijn in het vakgebied goed bekend. De volgende voorbeelden van groepen bevatten elk aminozuren die conservatieve 5 substituties voor elkaar zijn: 1) Alanine (A), Serine (S), Threonine (T); 2) Asparaginezuur (D), Glutaminezuur (E); 3) Asparagine (N), Glutamine (Q); 4) Arginine (R), Lysine (K); 10 5) Isoleucine (I), Leucine (L), Methionine (M), Valine (V); en 6) Fenylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptofaan (W).

Een conservatieve substitutie is een substitutie waarbij het substituerende aminozuur (natuurlijk voorkomend of gemodificeerd) structureel verwant is aan het aminozuur dat wordt gesubstitueerd, d.w.z. heeft ongeveer dezelfde grootte en 15 elektronische eigenschappen als het aminozuur dat wordt gesubstitueerd. Het substituerende aminozuur zou aldus dezelfde of een overeenkomstige functionele groep in de zijketen hebben als het oorspronkelijke aminozuur. Een “conservatieve substitutie” verwijst ook naar het gebruik van een substituerend aminozuur dat identiek is aan het aminozuur dat wordt vervangen behalve dat een functionele groep in de 20 zijketen wordt beschermd met een geschikte beschermende groep.

Zoals in het vakgebied bekend is kunnen aminozuren chemisch worden gemodificeerd van de natuurlijke structuur ervan door ofwel enzymatische of niet-enzymatische reactiemechanismen. In één uitvoeringsvorm kan een N-eindstandige glutaminezuur of glutamine bijvoorbeeld cycliseren onder verlies van water, voor het 25 vormen van pyroglutaminezuur (pyroE of pE) (Chelius et al, Anal.Chem, 78: 2370-2376 (2006) en Burstein et al., Proc. National Acad. Sci., 73:2604-2608 (1976)). Als alternatief zou een fusie-eiwit dat een N-eindstandige pyroglutaminezuur heeft mogelijk kunnen worden verkregen door middel van een nucleïnezuursequentie die codeert voor glutaminezuur op de positie in het eiwit die door middel van post-30 translationele bewerking het N-uiteinde wordt (bijvoorbeeld wanneer residu 24 van SEQ ID NO: 1 glutamaat is in plaats van een glutamine).

Werkwijzen voor het produceren van RAGE-fusie-eiwitten 34

De onderhavige uitvinding omvat ook een werkwijze voor het maken van een RAGE-fusie-eiwit. In één uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding aldus een werkwijze voor het maken van een RAGE-fusie-eiwit die de stap omvat van het op covalente wijze koppelen van een RAGE-polypeptide dat is gekoppeld aan een tweede 5 niet-RAGE-polypeptide, waarbij het RAGE-polypeptide een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvat. Het gekoppelde RAGE-polypeptide en het tweede niet-RAGE-polypeptide kunnen bijvoorbeeld worden gecodeerd door een recombinant DNA-construct. De werkwijze kan verder de stap van het incorporeren van het DNA-construct in een expressievector omvatten. De werkwijze kan ook de stap van het 10 insereren van de expressievector in een gastheercel omvatten.

Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding verschaffen bijvoorbeeld RAGE-fusie-eiwitten die een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-RAGE polypeptide omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de 15 bindingsplaats voor het ligand het meest N-eindstandige domein van het RAGE-fusie-eiwit. De bindingsplaats voor het ligand van RAGE kan het V-domein van RAGE of een deel daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de bindingsplaats voor het ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ 20 ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is.

In een uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide zijn gekoppeld aan een polypeptide dat een immunoglobuline-domein of een deel (bijvoorbeeld een fragment daarvan) van een immunoglobuline-domein omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het polypeptide dat een immunoglobuline-domein omvat tenminste een deel van tenminste 25 één van de Ch2- of de CH3-domeinen van een humaan IgG.

Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding kunnen aldus geïsoleerde DNA-moleculen omvatten die voor de RAGE-fiisie-eiwitten van de onderhavige uitvinding coderen. Bij bepaalde uitvoeringsvormen coderen de DNA-moleculen voor een RAGE-fusie-eiwit dat een aminozuursequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ 30 ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek daar aan is. Bij sommige uitvoeringsvormen omvat een sequentie die tenminste 90% identiek is aan SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 bijvoorbeeld de sequentie van SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 35 57 zonder de C-eindstandige lysine. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding aldus een DNA-molecuul omvatten dat de sequentie heeft zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 54 of SEQ ID NO: 55 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is.

5 Het RAGE-fusie-eiwit kan door recombinante DNA-technieken worden gemanipuleerd. In één uitvoeringsvorm kan de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld een geïsoleerde nucleïnezuursequentie omvatten die, complementariteit met of aanzienlijke overeenkomst met een polynucleotidesequentie die codeert voor een RAGE-polypeptide dat is gekoppeld aan een tweede niet-RAGE-polypeptide omvat. In een 10 uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvatten.

Het RAGE-eiwit of polypeptide kan humaan RAGE met de volledige lengte (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 1) of een fragment van humaan RAGE omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide geen residuen van een signaalsequentie. 15 De signaalsequentie van RAGE kan ofwel residuen 1-22 of residuen 1-23 van RAGE met de volledige lengte (SEQ ID NO: 1) omvatten. In andere uitvoeringsvormen kan het RAGE-polypeptide een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan humaan RAGE, of een fragment daarvan. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide bijvoorbeeld humaan 20 RAGE of een fragment daarvan, met Glycine als het eerste residu in plaats van een Methionine (zie bijvoorbeeld Neeper et al, (1992)) omvatten. Of het humane RAGE kan RAGE met de volledige lengte waarbij de signaalsequentie is verwijderd (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 2 of SEQ ID NO: 3) (Figuren IA en 1B) of een deel van die aminozuursequentie omvatten. De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding 25 kunnen ook sRAGE (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 4), een polypeptide die tenminste 90% identiek is aan sRAGE, of een fragment van sRAGE omvatten. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld humaan sRAGE of een fragment daarvan, met Glycine als het eerste residu in plaats van een Methionine (zie bijvoorbeeld Neeper et al., (1992)) omvatten. Of het humane RAGE kan sRAGE waarbij de signaalsequentie is verwijderd (Zie 30 bijvoorbeeld SEQ ID NO: 5 of SEQ ID NO: 6 of SEQ ID NO: 45 in Figuur 1) of een deel van die aminozuursequentie omvatten. In andere uitvoeringsvormen kan het RAGE-eiwit een V-domein omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 of SEQ ID NO: 46 in Figuur 1). Of een sequentie die tenminste 90% identiek is aan het 36 V-domein of een fragment daarvan kan worden gebruikt. Of het RAGE-eiwit kan een fragment van RAGE omvatten dat een deel van het V-domein omvat (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 of SEQ ID NO: 47 in Figuur 1). In een uitvoeringsvorm kan de bindingsplaats voor het ligand SEQ ID NO: 9 of een sequentie 5 die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ TD NO: 10, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is omvatten. In nog een andere uitvoeringsvorm is het RAGE-fragment een synthetisch peptide.

In een uitvoeringsvorm omvat de nucleïnezuursequentie SEQ ID NO: 25 om te 10 coderen voor aminozuren 1-118 van humaan RAGE of een fragment daarvan. Een sequentie die nucleotiden 1- 348 van SEQ ID NO: 25 omvat, kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te coderen voor aminozuren 1-116 van humaan RAGE. Of het nucleïnezuur kan SEQ ID NO: 26 omvatten om te coderen voor aminozuren 1-123 van humaan RAGE. Of het nucleïnezuur kan SEQ ID NO: 27 omvatten om te coderen voor 15 aminozuren 1-136 van humaan RAGE. Of het nucleïnezuur kan SEQ ID NO: 28 omvatten om te coderen voor aminozuren 1-230 van humaan RAGE. Of het nucleïnezuur kan SEQ ID NO: 29 omvatten om te coderen voor aminozuren 1-251 van humaan RAGE. Of fragmenten van deze nucleïnezuursequenties kunnen worden gebruikt om te coderen voor fragmenten van het RAGE-polypeptide.

20 Het RAGE-fusie-eiwit kan verscheidene soorten van peptiden omvatten die niet afkomstig zijn van RAGE of een fragment daarvan. Het tweede polypeptide van het RAGE-iusie-eiwit kan een polypeptide omvatten dat van een immunoglobuline afkomstig is. De zware keten (of deel daarvan) kan afkomstig zijn van één van de bekende isotypen van de zware keten: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε) of IgA (a). In 25 aanvulling kan de zware keten (of deel daarvan) afkomstig zijn van één van de bekende subtypen van de zware keten: IgGl (yl), IgG2 (y2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgAl (al), IgA2 (a2), of mutaties van deze isotypen of subtypen die de biologische activiteit veranderen. Het tweede polypeptide kan de Ch2- en Cn3-domeinen van een humaan IgGl of een deel van elk of beide van deze domeinen omvatten. Als een voorbeeld van 30 uitvoeringsvormen kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het polypeptide dat de Ch2- en Cn3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 38 of een fragment daarvan omvatten.

37

Het immunoglobuline-peptide kan worden gecodeerd door de nucleïnezuursequentie van SEQ 1D NO: 39 of SEQ ID NO: 41. In andere uitvoeringsvormen kan de immunoglobulinesequentie in SEQ ID NO: 38 of SEQ 1D NO: 40 ook worden gecodeerd door respectievelijk SEQ ID NO: 52 of SEQ ID NO: 53.

5 Het schamiergebied van het Fc-deel van de immunoglobulineketen kan in vivo ontstekingsbevorderend zijn. Het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan aldus een interdomein linker omvatten die afkomstig is van RAGE in plaats van een interdomein schamierpolypeptide dat van een immunoglobuline afkomstig is.

In één uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding aldus een werkwijze 10 voor het maken van een RAGE-fusie-eiwit die de stap omvat van het op covalente wijze koppelen van een RAGE-polypeptide aan een polypeptide dat een CH2-domein van een immunoglobuline of een deel van een Cn2-domein van een immunoglobuline omvat. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvatten. De bindingsplaats voor het ligand van RAGE kan het V-15 domein van RAGE of een deel daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de bindingsplaats voor het ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is.

20 In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit bijvoorbeeld worden gecodeerd door een recombinant DNA-construct. De werkwijze kan ook de stap omvatten van het incorporeren van het DNA-construct in een expressievector. De werkwijze kan ook het transfecteren van de expressievector in een gastheercel omvatten. Uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding omvatten aldus ook 25 expressievectoren die coderen voor DNA-moleculen die voor de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding coderen. Bij bepaalde uitvoeringsvormen coderen de DNA-moleculen voor een RAGE-fusie-eiwit dat een aminozuursequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek daar aan is. Bij 30 sommige uitvoeringsvormen omvat een sequentie die tenminste 90% identiek is aan SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 bijvoorbeeld de sequentie van SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 zonder de C-eindstandige lysine.

38

Nog andere uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding omvatten ook cellen die zijn getransfecteerd met een expressievector die codeert voor DNA-moleculen die coderen voor de RAGE-fiisie-eiwitten van de onderhavige uitvinding. Bij bepaalde uitvoeringsvormen coderen de DNA-moleculen voor een RAGE-fusie-5 eiwit dat een aminozuursequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ TD NO: 56 of SEQ ID NO: 57 of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek daar aan is. Bij sommige uitvoeringsvormen omvat een sequentie die tenminste 90% identiek is aan SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 bijvoorbeeld de sequentie van SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 zonder de C-10 eindstandige lysine.

In één uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld een nucleïnezuur dat codeert voor een RAGE-polypeptide dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat een CH2-domein van een immunoglobuline of een fragment daarvan omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het C^-domein of een fragment daarvan 15 SEQ ID NO: 42. In een uitvoeringsvorm omvat het fragment van SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 42 waarvan de eerste 10 aminozuren zijn verwijderd. Het tweede polypeptide kan de CH2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl omvatten. Als een voorbeeld van uitvoeringsvormen kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl omvat SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten. In één uitvoeringsvorm kan 20 het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 38 of een fragment daarvan omvatten. Het immunoglobuline-peptide kan worden gecodeerd door de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO: 39 of SEQ ID NO: 41. De immunoglobulinesequentie in SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 kan ook worden gecodeerd door SEQ ID NO: 52 of SEQ ID NO: 25 53, waarbij stille basenveranderingen voor de codons die coderen voor proline (CCG

naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige codon verwijderen (d.w.z. nucleotiden 622-627 van SEQ ID NO: 39 worden gemodificeerd voor het genereren van SEQ ID NO: 52 of nucleotiden 652-657 van SEQ ID NO: 41 worden 30 gemodificeerd voor het genereren van SEQ ID NO: 53).

In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE gekoppeld aan het immunoglobuline-domein van RAGE omvatten zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE aan het N- 39 eindstandige aminozuur van de interdomein linker is gekoppeld en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een CH2-domein van een immunoglobuline-domein, of een fragment daarvan omvat. Het polypeptide dat een 5 Cu2-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat kan een polypeptide omvatten dat de Ch2- en Cn3-domeinen van een humaan IgGl of een deel van beide of van elk van deze domeinen omvat. Als een voorbeeld van uitvoeringsvormen kan het polypeptide dat de Ch2- en Cu3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het 10 polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 38 of een fragment daarvan omvatten. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 waarbij de C-eindstandige lysine (K) is verwijderd omvatten.

15 Het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan een enkele of meerdere

domeinen van RAGE omvatten. Het RAGE-polypeptide dat een interdomein linker gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE omvat, kan ook een fragment van een RAGE-eiwit met een volledige lengte omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit bijvoorbeeld twee immunoglobuline domeinen die afkomstig 20 zijn van een RAGE-eiwit en twee immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan een eerste immunoglobuline-domein van RAGE en een eerste interdomein linker gekoppeld aan een tweede immunoglobuline-domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvatten, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein 25 linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline-domein van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein 30 van RAGE en het C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het polypeptide dat een Cu2-immunoglobuline domein of fragment daarvan omvat. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-251 van humaan RAGE (SEQ ID

40 NO: 19) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 20) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 51) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan 5 is, die overeenkomt met het V-domein, het Cl-domein, de interdomein linker die deze twee domeinen koppelt en een tweede interdomein linker stroomafwaarts van Cl omvatten. In één uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 30 of een fragment daarvan omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen (Figuur 2A). In een andere uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID 10 NO: 54 (Figuur 2B) omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen, waarbij stille basenveranderingen voor de codons die coderen voor een pro line (CCG naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie worden gemaakt voor het verwijderen van een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige codon (d.w.z. nucleotiden 1375-1380 van SEQ ID NO: 30 worden 15 gemodificeerd voor het genereren van SEQ ID NO: 54).

Als alternatief kan een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen één immunoglobuline-domein die afkomstig is van RAGE en twee immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld een enkel immunoglobuline-domein van RAGE omvatten 20 dat is gekoppeld door middel van een interdomein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van het polypeptide dat een CH2-immunoglobuline-domein of een fragment daarvan omvat. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 15) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is of aminozuren 24-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 16) of een 25 sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-136 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 49) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein van RAGE en een stroomafwaartse interdomein linker omvatten (Figuur 1). In één uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 31 of een fragment 30 daarvan omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen (Figuur 3A). In een andere uitvoeringsvorm kan het nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 55 omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen, waarbij stille basenveranderingen voor de codons die coderen voor proline (CCG naar CCC) en glycine 41 (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige codon verwijderen (d.w.z. nucleotiden 1030-1035 van SEQ ID NO: 31 worden gemodificeerd voor het genereren van SEQ ID NO: 55) (Figuur 3B).

5 Een fragment van de interdomein linker van RAGE kan een peptidesequentie omvatten die van nature stroomafwaarts is van en aldus gekoppeld is aan een immunoglobuline-domein van RAGE. Voor het V-domein van RAGE kan de interdomein linker bijvoorbeeld aminozuursequenties omvatten die van nature stroomafwaarts van het V-domein zijn. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID 10 NO: 21 omvatten die overeenkomt met aminozuren 117-123 van RAGE met de volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een interdomein linker die verscheidene aminozuren (bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren) stroomopwaarts en stroomafwaarts van SEQ ID NO: 21 omvat kan bijvoorbeeld worden gebruikt. In één 15 uitvoeringsvorm omvat de interdomein linker aldus SEQ ID NO: 23 die aminozuren 117-136 van RAGE met de volledige lengte omvat. Of fragmenten van SEQ ID NO: 21 waarbij bijvoorbeeld 1, 2, of 3 aminozuren van elk uiteinde van de linker zijn verwijderd, kunnen worden gebruikt. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 20 99% identiek is aan SEQ ID NO: 21 of SEQ ID NO: 23.

Voor het Cl-domein van RAGE kan de linker een peptidesequentie omvatten die van nature stroomafwaarts van het Cl-domein is. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID NO: 22 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-251 van RAGE met de volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van 25 de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een linker die verscheidene (1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren) aminozuren stroomopwaarts en stroomafwaarts van SEQ ID NO: 22 heeft kan bijvoorbeeld worden gebruikt. Of fragmenten van SEQ ID NO: 22 kunnen worden gebruikt waarbij bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren van één van de uiteinden van de linker zijn verwijderd. In één uitvoeringsvorm kan een 30 interdomein linker van RAGE bijvoorbeeld SEQ ID NO: 24 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-226. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan SEQ ID NO 22 of SEQ ID NO: 24.

42

Of een interdomein linker kan SEQ ID NO: 44 omvatten die overeenkomt met aminozuren 318-342 van RAGE. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan SEQ ID NO 44.

5 De werkwijze kan verder de stap van het incorporeren van het DNA-construct in een expressievector omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding aldus een expressievector die codeert voor een RAGE-fusie-eiwit dat een RAGE-polypeptide omvat dat direct gekoppeld is aan een polypeptide dat een CH2-domein van een immunoglobuline of een deel van een Ch2-domein van een immunoglobuline 10 omvat. In een uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide constructen zoals die welke hierin zijn beschreven, die een interdomein linker van RAGE gekoppeld hebben aan een immunoglobuline-domein van RAGE zodanig dat de C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker is gekoppeld en het C-eindstandige aminozuur 15 van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een C^-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat. De expressievector die wordt gebruikt voor het transfecteren van de cellen kan bijvoorbeeld de nucleïnezuursequentie SEQ ID NO: 30 of een fragment daarvan, SEQ ID NO: 54, of een fragment daarvan, SEQ ID 20 NO: 31, of een fragment daarvan, of SEQ ID NO: 55, of een fragment daarvan omvatten.

De werkwijze kan verder de stap omvatten van het transfecteren van een cel met de expressievector van de onderhavige uitvinding. In een uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding aldus een cel die is getransfecteerd met de expressievector die 25 het RAGE-fusie-eiwit van de uitvinding tot expressie brengt, zodanig dat de cel een RAGE-fusie-eiwit tot expressie brengt dat een RAGE-polypeptide omvat dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat een Ch2-domein van een immunoglobuline of een deel van een CH2-domein van een immunoglobuline omvat. In een uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide constructen, zoals die welke hierin zijn 30 beschreven, die een interdomein linker van RAGE gekoppeld hebben aan een immunoglobuline-domein van RAGE, zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de 43 interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een CH2-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat. De expressievector kan bijvoorbeeld de nucleïnezuursequentie SEQ ID NO: 30 of een fragment daarvan, SEQ ID NO: 54, of een fragment daarvan, 5 SEQ ID NO: 31, of een fragment daarvan, of SEQ ID NO: 55, of een fragment daarvan omvatten.

Plasmiden kunnen bijvoorbeeld worden geconstrueerd voor het tot expressie brengen van RAGE-IgG fusie-eiwitten door het fuseren van verschillende lengten van een 5’-cDNA-sequentie van humaan RAGE met een 3’ cDNA-sequentie van humaan 10 IgGl (γΐ). De sequenties van de expressiecassette kunnen in een expressievector zoals expressievector pcDNA3.1 (Invitrogen, CA) worden geïnsereerd door het gebruik van standaard recombinante technieken.

De werkwijze kan ook het transfecteren van de expressievector in een gastheercel omvatten. RAGE-fusie-eiwitten kunnen tot expressie worden gebracht in zoogdierlijke 15 expressiesystemen waaronder systemen waarbij de expressieconstructen in de zoogdierlijke cellen worden geïntroduceerd door het gebruik van een virus zoals retrovirus of adenovirus. Zoogdierlijke cellijnen die beschikbaar zijn als gastheren voor expressie zijn in het vakgebied goed bekend en omvatten vele onsterfelijk gemaakte cellijnen die verkrijgbaar zijn van de American Type Culture Collection (ATCC). Deze 20 omvatten onder andere eierstokcellen van de Chinese hamster (CHO), NSO, SP2-cellen, Hela-cellen, niercellen van baby hamster (BHK), apenniercellen (COS), humane hepatocellulaire carcinoomcellen (bijvoorbeeld Hep G2), A549-cellen en een aantal andere cellijnen. Cellijnen kunnen worden geselecteerd door het bepalen welke cellijnen hoge expressieniveaus van een RAGE-fusie-eiwit hebben. Andere cellijnen 25 die kunnen worden gebruikt zijn insectencellijnen zoals Sf9-cellen. Gastheercellen van planten omvatten bijvoorbeeld Nicotiana, Arabidopsis, kroos, maïs, tarwe, aardappel, enzovoort. Bacteriële gastheercellen omvatten soorten van E. coli en Streptomyces. Gastheercellen van gist omvatten Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae en Pichia pastoris. Wanneer recombinante expressievectoren die voor genen 30 voor RAGE-fusie-eiwitten coderen in zoogdierlijke gastheercellen worden geïntroduceerd, worden de RAGE-fusie-eiwitten geproduceerd door het kweken van de gastheercellen gedurende een tijdsperiode die voldoende is om expressie van het RAGE-fusie-eiwit in de gastheercellen of uitscheiding van het RAGE-fusie-eiwit in het 44 kweekmedium waarin de gastheercellen worden gekweekt mogelijk te maken. RAGE-fusie-eiwitten kunnen van het kweekmedium worden teruggewonnen door het gebruik van standaard werkwijzen van eiwitzuivering.

Nucleïnezuurmoleculen die voor RAGE-fusie-eiwitten coderen en expressie-5 vectoren die deze nucleïnezuurmoleculen omvatten kunnen worden gebruikt voor transfectie van een geschikte gastheercel die van zoogdieren, planten, bacteriën of gisten afkomstig is. Transformatie kan door elke bekende werkwijze voor het introduceren van polynucleotiden in een gastheercel zijn. Werkwijzen voor introductie van heterologe polynucleotiden in zoogdierlijke cellen zijn in het vakgebied goed 10 bekend en omvatten dextran-bemiddelde transfectie, calciumfosfaat-precipitatie, polybreen-bemiddelde transfectie, protoplastfusie, elektroporatie, inkapseling van het/de polynucleotide(n) in liposomen en directe micro-injectie van het DNA in kernen. In aanvulling kunnen nucleïnezuurmoleculen in zoogdierlijke cellen worden geïntroduceerd door virale vectoren. Werkwijzen voor het transformeren van planten-15 cellen zijn in het vakgebied goed bekend waaronder bijvoorbeeld Agrobacterium-bemiddelde transformatie, biolistische transformatie, directe injectie, elektroporatie en virale transformatie. Werkwijzen voor het transformeren van bacteriële cellen en gistcellen zijn in het vakgebied ook goed bekend.

Een expressievector kan ook aan een expressiesysteem worden afgeleverd door 20 het gebruik van biolostische technieken met DNA, waarbij het plasmide op microscopische deeltjes, bij voorkeur van goud, wordt geprecipiteerd en de deeltjes in een doelwitcel of expressiesysteem worden geschoten. Biolistische technieken met DNA zijn in het vakgebied goed bekend en inrichtingen, bijvoorbeeld een “gengeweer” zijn in de handel verkrijgbaar voor het afleveren van de microdeeltjes in een cel 25 (bijvoorbeeld Helios Gene Gun, Bio-Rad Labs., Hercules, CA) en in de huid (PMED Device, PowderMed Ltd., Oxford, UK).

Expressie van RAGE-fusie-eiwitten van productiecellijnen kan worden verhoogd door het gebruik van een aantal bekende technieken. Het expressiesysteem met het glutaminesynthetasegen (het GS-systeem) en het plasma-gecodeerde neomycine-30 resistentie systeem zijn bijvoorbeeld algemene benaderingswijzen voor het verhogen van expressie onder bepaalde omstandigheden.

RAGE-fusie-eiwitten die door verschillende cellijnen tot expressie zijn gebracht kunnen glycosylatiepatronen hebben die van elkaar verschillen. Alle RAGE-fusie- 45 eiwitten die worden gecodeerd door de nucleïnezuurmoleculen die hierin worden verschaft of die de aminozuursequenties omvatten die hierin worden verschaft, zijn deel van de onderhavige uitvinding, ongeacht de glycosylatie van het RAGE-fusie-eiwit.

5 Tn één uitvoeringsvorm kan een recombinante ex pressi evector in eierstokcellen van de Chinese hamster (CHO) worden getransfecteerd en expressie kan worden geoptimaliseerd. In andere uitvoeringsvormen kunnen de cellen 0,1 tot 20 gram/liter of 0,5 tot 10 gram/liter of ongeveer 1-2 gram/liter produceren.

Zoals in het vakgebied bekend is kunnen dergelijke nucleïnezuurconstructen 10 worden gemodificeerd door mutatie, zoals bijvoorbeeld door PCR-amplificatie van een nucleïnezuurmatrijs met primers die de mutatie van belang omvatten. Op deze wijze kunnen polypeptiden die variërende affiniteit voor liganden van RAGE omvatten worden ontworpen. In één uitvoeringsvorm kunnen de gemuteerde sequenties 90% of meer identiek zijn aan het DNA waarvan wordt uitgegaan. Als zodanig kunnen 15 varianten nucleotidesequenties omvatten die onder stringente omstandigheden (d.w.z. gelijkwaardig aan ongeveer 20-27°C onder de smelttemperatuur (TM) van de DNA-duplex in 1 molair zout) hybridiseren.

De coderende sequentie kan tot expressie worden gebracht door het transfecteren van de expressievector in een geschikte gastheer. De recombinante vectoren kunnen 20 bijvoorbeeld op stabiele wijze in eierstokcellen van de Chinese hamster (CHO) worden getransfecteerd en cellen die het RAGE-fusie-eiwit tot expressie brengen worden geselecteerd en gekloneerd. In een uitvoeringsvorm worden de cellen die het recombinante construct tot expressie brengen geselecteerd op plasmide-gecodeerde neomycine-resistentie door het toevoegen van het antibioticum G418. Afzonderlijke 25 klonen kunnen worden geselecteerd en klonen die hoge niveaus van recombinant eiwit tot expressie brengen, zoals wordt gedetecteerd door Westem-blot-analyse van het supernatant van de cellen, kunnen worden uitgebreid en het genproduct kan worden gezuiverd door affiniteitschromatografie door het gebruik van Proteïne A kolommen.

Voorbeelden van uitvoeringsvormen van recombinante nucleïnezuren die coderen 30 voor de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding zijn getoond in Figuren 2 en 3. Zoals bijvoorbeeld hierboven is beschreven kan het RAGE-fusie-eiwit dat wordt geproduceerd door het recombinante DNA-construct een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-RAGE-polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan twee 46 domeinen omvatten die afkomstig zijn van RAGE-eiwit en twee domeinen die afkomstig zijn van een immunoglobuline. Als voorbeeld van nucleïnezuurconstructen die coderen voor een RAGE-fusie-eiwit is TTP-4000 (TT4) dat dit soort van structuur heeft in Figuur 2 (SEQ ID NO: 30 en SEQ ID NO: 54) getoond. Zoals voor SEQ ID 5 NO: 30 en SEQ TD NO: 54 is getoond codeert de coderende sequentie 1-753 (in vetgedrukte letters gemarkeerd) voor de N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE terwijl de sequentie van 754-1386 voor de Fc-eiwitsequentie van IgG zonder de scharnier codeert.

Wanneer het wordt verkregen van SEQ ID NO: 30 of SEQ ID NO: 54 of een 10 sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, kan het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie volgens SEQ ID NO: 32 met vier domeinen of het polypeptide waarbij de signaalsequentie is verwijderd omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 of SEQ ID NO: 56 in Figuur 4). In SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 of SEQ ID NO: 56 is de aminozuursequentie voor RAGE met 15 vetgedrukte letters gemarkeerd. De immunoglobulinesequentie zijn de Ch2- en Ch3-immunoglobulinedomeinen van IgG zonder het schamiergebied.

Figuur 6 toont een vergelijking van de polypeptidedomeinen die worden gevonden in RAGE en IgG (Figuur 6A) en de domeinstructuur van de RAGE-fusie-eiwitten TTP-3000 en TTP-4000. Zoals in Figuur 6B is getoond bevatten de eerste 251 20 aminozuren van het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 met de volledige lengte als de RAGE-polypeptidesequentie een signaalsequentie die aminozuren 1-22/23, het V-immunoglobuline-domein (waaronder de bindingsplaats voor het ligand) die aminozuren 23/24-116 omvat, een interdomein linker die aminozuren 117 tot 123 omvat, een tweede immunoglobuline-domein (Cl), die aminozuren 124-221 omvat en 25 een stroomafwaartse interdomein linker die aminozuren 222-251 omvat.

In een uitvoeringsvorm hoeft het RAGE-fusie-eiwit niet noodzakelijkerwijs het tweede RAGE-immunoglobuline-domein te omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld één immunoglobuline-domein dat afkomstig is van RAGE en twee immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide 30 omvatten. Een voorbeeld van nucleïnezuurconstructen die voor dit soort van RAGE-fusie-eiwit coderen is getoond in Figuur 3 (SEQ ID NO: 31 en SEQ ID NO: 55). Zoals in SEQ ID NO: 31 en SEQ ID NO: 55 is getoond codeert de coderende sequentie van nucleotiden 1 tot 408 (in vetgedrukte letters gemarkeerd) voor de N-eindstandige 47 eiwitsequentie van RAGE, terwijl de sequentie van 409-1041 voor de eiwitsequentie van IgG 1 (γΐ) codeert.

Wanneer het wordt verkregen van SEQ ID NO: 31 of SEQ 1D NO: 55, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, kan het RAGE-fusie-eiwit de 5 aminozuursequentie van SEQ TD NO: 35 met drie domeinen of het polypeptide waarvan de signaalsequentie is verwijderd omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 of SEQ ID NO: 57 in Figuur 5). In SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 of SEQ ID NO: 57 in Figuur 5 is de aminozuursequentie van RAGE met een vetgedrukt lettertype gemarkeerd. Zoals in Figuur 6B is getoond bevatten de 10 eerste 136 aminozuren van het RAGE-fusie-eiwit TTP-3000 met de volledige lengte als het RAGE-polypeptide een signaalsequentie die aminozuren 1-22/23 omvat, het V-immunoglobuline-domein (waaronder de ligand-bindingsplaats) die aminozuren 23/24-116 omvat en een interdomein linker die aminozuren 117 tot 136 omvat. De sequentie van 137-346 omvat de Ch2- en CH3-immunoglobuline-domeinen van IgG zonder het 15 schamiergebied.

De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen verbeterde in vivo stabiliteit omvatten ten opzichte van RAGE-polypeptiden die niet een tweede polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan verder worden gemodificeerd voor het verhogen van de stabiliteit, de werkzaamheid, kracht en de biologische 20 beschikbaarheid. De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen aldus door post-translationele bewerking of door chemische modificatie worden gemodificeerd. Het RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld synthetisch worden bereid om L-, D- of niet-natuurlijke aminozuren, alfa-digesubstitueerde aminozuren of N-alkyl-aminozuren te omvatten. In aanvulling kunnen eiwitten worden gemodificeerd door 25 acetylatie, acylatie, ADP-ribosylatie, amidatie, verbinding van lipiden zoals fosfatidyl-inositol, vorming van disulfide-bindingen en dergelijke. Polyethyleenglycol kan bovendien worden toegevoegd voor het verhogen van de biologische stabiliteit van het RAGE-fusie-eiwit.

30 Binding van antagonisten van RAGE aan RAGE-fusie-eiwitten

De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen een aantal toepassingen omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan 48 bijvoorbeeld worden gebruikt in een bindingstest voor het identificeren van liganden voor RAGE, zoals agonisten, antagonisten of modulators van RAGE.

In één uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld een werkwijze voor detectie van modulators van RAGE, die omvat (a) het verschaffen van 5 een RAGE-fusie-eiwit dat een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-RAGE polypeptide omvat, waarbij het RAGE-polypeptide een ligand-bindingsplaats omvat; (b) het mengen van een verbinding van belang en een ligand die een bekende bindingsaffiniteit voor RAGE met het RAGE-fusie-eiwit heeft; en (c) het meten van binding van het bekende RAGE-ligand aan het RAGE-fusie-eiwit in de aanwezigheid 10 van de verbinding van belang. In een uitvoeringsvorm omvat de ligand-bindingsplaats het meest N-eindstandig domein van het RAGE-fusie-eiwit.

De RAGE-fusie-eiwitten kunnen ook kits verschaffen voor de detectie van modulators van RAGE. In één uitvoeringsvorm kan een kit van de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld omvatten (a) een verbinding die een bekende bindingsaffiniteit 15 voor RAGE heeft als een positieve controle; (b) een RAGE-fusie-eiwit dat een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede, niet-RAGE-polypeptide omvat, waarbij het RAGE-polypeptide een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvat; en (c) instructies voor gebruik. In een uitvoeringsvorm omvat de ligand-bindingsplaats het meest N-eindstandige domein van het RAGE-fusie-eiwit.

20 Het RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld in een bindingstest worden gebruikt voor het identificeren van mogelijke liganden van RAGE. In één voorbeeld van een uitvoeringsvorm van een dergelijke bindingstest kan een bekende ligand van RAGE op een vast substraat (bijvoorbeeld Maxisorb platen) worden bekleed bij een concentratie van ongeveer 5 microgram per putje, waarbij elk putje een totaal volume van ongeveer 25 100 microliter (μΐ) bevat. De platen kunnen gedurende de nacht bij 4°C worden geïncubeerd om het mogelijk te maken dat het ligand op het substraat absorbeert of het bindt. Als alternatief kunnen kortere incubatieperioden bij hogere temperaturen (bijvoorbeeld kamertemperatuur) worden gebruikt. Na een tijdsperiode om het mogelijk te maken dat het ligand aan het substraat bindt, kunnen de testputjes worden 30 afgezogen en een blokkerende buffer (bijvoorbeeld, 1% BSA in 50 mM imidizoolbuffer, pH 7,2) kan worden toegevoegd om niet-specifieke binding te blokkeren. De blokkerende buffer kan bijvoorbeeld gedurende 1 uur bij kamertemperatuur aan de platen worden toegevoegd. De platen kunnen vervolgens 49 worden afgezogen en/of worden gewassen met een wasbuffer. In één uitvoeringsvorm kan een buffer die 20 mM imidazool, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20, 5 mM CaCh en 5 mM MgCb, pH 7,2 bevat als een wasbuffer worden gebruikt. Het RAGE-fusie-eiwit kan vervolgens bij toenemende verdunningen aan de testputjes worden toegevoegd. Het 5 RAGE-fusie-eiwit kan vervolgens worden toegestaan met het geïmmobiliseerde ligand in het testputje te incuberen, zodanig dat binding een evenwicht kan bereiken. In één uitvoeringsvorm wordt het RAGE-fusie-eiwit toegestaan gedurende ongeveer één uur bij 37°C met het geïmmobiliseerde ligand te incuberen. In andere uitvoeringsvormen kunnen langere incubatieperioden bij lagere temperaturen worden gebruikt. Nadat het 10 RAGE-fusie-eiwit en het geïmmobiliseerde ligand zijn geïncubeerd kan de plaat worden gewassen voor het verwijderen van elk niet-gebonden RAGE-fusie-eiwit. Het RAGE-fusie-eiwit dat is gebonden aan het geïmmobiliseerde ligand kan op een verscheidenheid van wijzen worden gedetecteerd. In één uitvoeringsvorm maakt de detectie gebruik van ELISA. In één uitvoeringsvorm kan een immuundetectiecomplex 15 dat een monoklonaal anti-humaan IgGl van muis, gebiotinyleerd anti-muis IgG van geit en een met avidine gekoppelde alkalische fosfatase bevat, worden toegevoegd aan het RAGE-fusie-eiwit dat in het testputje is geïmmobiliseerd. Het immuundetectiecomplex kan worden toegestaan aan het geïmmobiliseerde RAGE-fusie-eiwit te binden, zodanig dat de binding tussen het RAGE-fusie-eiwit en het immuundetectiecomplex 20 een evenwicht bereikt. Het complex kan bijvoorbeeld worden toegestaan gedurende één uur bij kamertemperatuur aan het RAGE-fusie-eiwit te binden. Op dat punt kan elk niet-gebonden complex worden verwijderd door het wassen van het testputje met wasbuffer. Het gebonden complex kan worden gedetecteerd door het toevoegen van het substraat voor alkalische fosfatase, />ara-nitrofenylfosfaat (PNPP) en het meten van de 25 omzetting van PNPP naar para-nitrofenol (PNP) als een toename van absorptie bij 405 nm.

In een uitvoeringsvorm bindt het RAGE-ligand aan het RAGE-fusie-eiwit met een affiniteit in het nanomolaire (nM) of micromolaire (μΜ) traject. Een experiment dat binding van RAGE-liganden aan RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige 30 uitvinding illustreert is in Figuur 7 getoond. Oplossingen van TTP-3000 (TT3) en TTP-4000 (TT4) die initiële concentraties hebben van respectievelijk 1,082 mg/ml en 370 pg/ml, werden bereid. Zoals in Figuur 7 is getoond zijn de RAGE-fusie-eiwitten TTP-3000 en TTP-4000 bij verscheidene verdunningen in staat om aan geïmmobiliseerde 50 RAGE-liganden Amyloïde-bèta (Abèta) (Amyloid Bèta (1-40) van Biosource), SI00b (SI00) en amfoterine (Ampho) te binden, dat in een toename van absorptie resulteert. In de afwezigheid van ligand (d.w.z. het bekleden met alleen BSA) was er geen toename in absorptie.

5 De bindingstest van de onderhavige uitvinding kan worden gebruikt voor het kwantificeren van binding van ligand aan RAGE. In andere uitvoeringsvormen kunnen RAGE-liganden aan het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding binden met bindingsaffmiteiten die variëren van 0,1 tot 1000 nanomolair (nM) of van 1 tot 500 nM of van 10 tot 80 nM.

10 Het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan ook worden gebruikt voor het identificeren van verbindingen die het vermogen hebben om aan RAGE te binden. Zoals in respectievelijk Figuren 8 en 9 is getoond kan een RAGE-ligand worden getest op het vermogen ervan om te concurreren met geïmmobiliseerd amyloïde bèta om te binden aan RAGE-fusie-eiwitten TTP-4000 (TT4) of TTP-3000 15 (TT3). Het kan aldus worden gezien dat een RAGE-ligand bij een uiteindelijke testconcentratie (FAC) van 10 μΜ binding van RAGE-fusie-eiwit aan amyloïde-bèta bij concentraties van 1:3, 1:10, 1:30 en 1:100 van de initiële TTP-4000 oplossing (Figuur 8) of TTP-3000 (Figuur 9) kan verdringen.

20 Modulatie van cellulaire effectoren

Uitvoeringsvormen van de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt voor het moduleren van een biologische respons die wordt bemiddeld door RAGE. De RAGE-fusie-eiwitten kunnen bijvoorbeeld worden ontworpen voor het moduleren van RAGE-geïndüceerde toename van genexpressie. In 25 een uitvoeringsvorm kunnen RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding aldus worden gebruikt voor het moduleren van de functie van biologische enzymen. De interactie tussen RAGE en de liganden ervan kan bijvoorbeeld oxidatieve stress en activering van NF-κΒ en NF-icB-gereguleerde genen, zoals de cytokinen IL-Ιβ, TNF-a en dergelijke genereren. In aanvulling is het getoond dat verscheidene andere 30 regulerende routes, zoals die welke p21ras, MAP-kinasen, ERK1 en ERK2 behelzen, worden geactiveerd door binding van AGE’s en andere liganden aan RAGE.

Het gebruik van de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding voor het moduleren van de expressie van de cellulaire effector TNF-α is in Figuur 10 getoond.

51 THP-1 myeloïde cellen kunnen worden gekweekt in RPMI-1640 medium dat is aangevuld met 10% FBS en worden geïnduceerd om TNF-α uit te scheiden door middel van stimulatie van RAGE met SlOOb. Wanneer een dergelijke stimulatie plaatsvindt in de aanwezigheid van een RAGE-fusie-eiwit kan inductie van TNF-a 5 door binding van SlOOb aan RAGE worden geremd. Zoals aldus in Figuur 10 is getoond verlaagt de toevoeging van 10 pg RAGE-fusie-eiwit TTP-3000 (TT3) of TTP-4000 (TT4) inductie van TNF-α door SlOOb met ongeveer 50% tot 75%. RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 kan tenminste net zo effectief zijn in het blokkeren van inductie van TNF-α door SlOOb als sRAGE (Figuur 10). Specificiteit van de remming voor de 10 RAGE-sequenties van TTP-4000 en TTP-3000 is getoond door het experiment waarbij alleen IgG werd toegevoegd aan met SlOOb-gestimuleerde cellen. Toevoeging van IgG en SlOOb aan de test toont dezelfde niveaus van TNF-α als SlOOb alleen.

In een andere cel-gebaseerde test werd het vermogen beoordeeld van TTP-4000 om te voorkomen dat het RAGE-ligand HMGB1 interactie vertoont met RAGE en 15 andere receptoren voor HMGB1. Anders dan anti-RAGE antilichamen die aan RAGE binden en de interactie van een ligand voor RAGE met RAGE voorkomen kan TTP-4000 de interactie van een ligand voor RAGE met RAGE blokkeren door aan het ligand voor RAGE te binden. Het is vermeld dat HMGB1 een ligand is voor RAGE en de Toll-achtige receptoren 2 en 4 (Park et al., J. Biol. Chem., 2004; 279(9):7370-7). 20 Deze drie receptoren (RAGE, Toll-achtige receptor 2 en Toll-achtige receptor 4) worden alle tot expressie gebracht op THP-l-cellen (Parker et al., J. Immunol., 2004, 172(8): 4977-86).

Bij dit experiment werden THP-1 cellen gestimuleerd TNF-α te produceren door HMGB1 (50 mg/ml) in de aanwezigheid of afwezigheid van ofwel TTP4000 of anti-25 RAGE antilichamen. Bij de omstandigheden die in de test werden gebruikt zou HMGB1 de enige induceerder van TNF-α moeten zijn. De resultaten in Figuur 11 tonen dat het anti-RAGE antilichaam en RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 HMGB1 blokkeert van interactie met RAGE dat tot expressie wordt gebracht op de THP-1 cellen en dat TTP-4000 HMGB1-geïnduceerde productie van TNF-α in een sterkere mate remt dan het 30 anti-RAGE antilichaam. De gegevens geven aldus aan dat TTP-4000 de activiteit van HMGB1 in een sterkere mate kan remmen dan het anti-RAGE antilichaam door HMGB1 te remmen van interactie met Toll-achtige receptoren 2 en 4 alsook RAGE dat op THP-l-cellen aanwezig is.

52

Fysiologische kenmerken van RAGE-fusie-eiwitten

Terwijl sRAGE een therapeutisch voordeel kan hebben bij de modulatie van RAGE-bemiddelde ziekten, kan humaan sRAGE beperkingen hebben als een 5 zelfstandig therapeutisch middel op basis van de relatieve korte halfwaardetijd van sRAGE in plasma. Terwijl bijvoorbeeld sRAGE van knaagdieren bij normale en diabetische ratten een halfwaardetijd heeft van bij benadering 20 uur, heeft humaan sRAGE een halfwaardetijd van minder dan 2 uur wanneer het wordt bepaald door retentie van de immunoreactiviteit van sRAGE (Renard et al., J. Pharmacol. Exp. 10 Then, 290:1458-1466 (1999)).

Voor het genereren van een therapeutisch middel van RAGE dat overeenkomstige kenmerken van binding heeft als sRAGE maar een meer stabiel farmacokinetisch profiel heeft, kan een RAGE-fusie-eiwit dat een bindingsplaats voor een ligand van RAGE gekoppeld aan één of meer humane immunoglobuline-domeinen 15 omvat, worden gebruikt. Zoals in het vakgebied bekend is, kunnen de immunoglobuline-domeinen het Fc-deel van de zware keten van het immunoglobuline omvatten.

Het Fc-deel van het immunoglobuline kan verscheidene eigenschappen aan een RAGE-fusie-eiwit verlenen. Het Fc-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld de halfwaardetijd in 20 het serum van dergelijke fusie-eiwitten verlengen, vaak van uren tot verscheidene dagen. De toename in farmacokinetische stabiliteit is in het algemeen een resultaat van de interactie van de linker tussen de Ch2- en Cn3-gebieden van het Fc-fragment met de FcRn-receptor (Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000)).

Alhoewel fusie-eiwitten die een Fc-polypeptide van een immunoglobuline 25 omvatten het voordeel van verhoogde stabiliteit kunnen verschaffen, kunnen fusie-eiwitten met immunoglobuline een ontstekingsreactie opwekken wanneer ze in een gastheer worden geïntroduceerd. De ontstekingsreactie kan voor een groot deel te wijten zijn aan het Fc-deel van het immunoglobuline van het fusie-eiwit. De ontstekingsbevorderende respons kan een gewenst kenmerk zijn indien het doelwit tot 30 expressie wordt gebracht op een celsoort die ziek is die vernietigd dient te worden (bijvoorbeeld een kankercel of een populatie van lymfocyten die een auto-immuun-ziekte veroorzaken). De ontstekingsbevorderende respons kan een neutraal kenmerk zijn indien het doelwit een oplosbaar eiwit is, omdat de meeste oplosbare eiwitten niet 53 immunoglobulinen activeren. De ontstekingsbevorderende respons kan echter een negatief kenmerk zijn indien het doelwit tot expressie wordt gebracht op celsoorten waarvan de vernietiging tot ongewenste bijwerkingen zou leiden. De ontstekingsbevorderende reactie kan ook een negatief kenmerk zijn indien een ontstekingscascade 5 ontstaat op de plaats van een binding van een fusie-eiwit aan een doelwitweefsel omdat vele bemiddelaars van een ontsteking schadelijk voor het omringende weefsel zouden kunnen zijn en/of systemische effecten kunnen veroorzaken.

De primaire ontstekings-bevorderende plaats op Fc-fragmenten van immuno-globuline is aanwezig in het schamiergebied tussen de ChI en Ch2. Dit schamiergebied 10 vertoont interactie met het FcRl-3 op verscheidene leukocyten en veroorzaakt dat deze cellen het doelwit aanvallen. (Wines et al, J. Immunol, 164:5313-5318 (2000)).

Als therapeutische middelen voor RAGE-bemiddelde ziekten kunnen RAGE-fusie-eiwitten niet de generering van een ontstekingsreactie vereisen. Uitvoeringsvormen van RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen aldus een 15 RAGE-fusie-eiwit omvatten dat een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een immunoglobuline domein(en) omvat, waarbij het Fc-schamiergebied van het immuno-globuline is verwijderd en is vervangen door een RAGE-polypeptide. Op deze wijze kan de interactie tussen het RAGE-fusie-eiwit en Fc-receptoren op ontstekingscellen worden geminimaliseerd. Het kan echter belangrijk zijn om de juiste stapeling en 20 andere driedimensionale structurele interacties tussen de verscheidene immuno-globuline-domeinen van het RAGE-fusie-eiwit aan te houden. Uitvoeringsvormen van de RAGE-fiisie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen aldus de biologisch inerte, maar structureel overeenkomstige interdomein linker van RAGE die de V- en Cl-domeinen van RAGE scheidt of de linker die de Cl- en C2-domeinen van RAGE 25 scheidt substitueren ter vervanging van het normale schamiergebied van de zware keten van het immunoglobuline. Het RAGE-polypeptide van het RAGE-fusie-eiwit kan aldus een sequentie van een interdomein linker omvatten die van nature stroomafwaarts van een immunoglobuline-domein van RAGE wordt gevonden voor het vormen van een immunoglobuline-domein/linker fragment van RAGE. Op deze wijze kunnen de drie-30 dimensionale interacties tussen de immunoglobuline-domeinen die worden bijgedragen door ofwel RAGE of het immunoglobuline worden aangehouden.

In een uitvoeringsvorm kan een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding een aanzienlijke toename van farmacokinetische stabiliteit in vergelijking met sRAGE

54 omvatten. Figuur 12 toont bijvoorbeeld dat indien het RAGE-fitsie-eiwit TTP-4000 met liganden ervan verzadigd is, het een halfwaardetijd kan bereiken van meer dan 300 uur. Dit kan worden vergeleken met de halfwaardetijd van sRAGE van maar een paar uur in humaan plasma.

5 Tn een uitvoeringsvorm kunnen aldus de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het tegenwerken van de binding van fysiologische liganden aan RAGE als een wijze voor het behandelen van RAGE-bemiddelde ziekten zonder het genereren van een onaanvaardbare omvang van ontsteking. De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen een 10 aanzienlijke afname van het genereren van een ontstekings-bevorderende reactie vertonen in vergelijking met IgG. Zoals bijvoorbeeld in Figuur 13 is getoond stimuleert het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 niet afgifte van TNF-α van cellen onder omstandigheden waarbij stimulatie van afgifte van TNF-α door humaan IgG wordt gedetecteerd.

15

Behandeling van ziekte met RAGE-fusie-eiwitten

De onderhavige uitvinding kan ook werkwijzen voor de behandeling van RAGE-bemiddelde stoornis bij een humane patiënt omvatten. In een uitvoeringsvorm kan de werkwijze omvatten het aan een patiënt toedienen van een RAGE-fusie-eiwit dat een 20 RAGE-polypeptide omvat dat een bindingsplaats voor een ligand van RAGE gekoppeld aan een tweede niet-RAGE-polypeptide omvat.

Bij bepaalde uitvoeringsvormen omvat het RAGE-preparaat een gevriesdroogd RAGE-fusie-eiwit. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding werkwijzen voor het behandelen van een RAGE-bemiddelde stoornis bij een patiënt 25 omvatten, die omvat het aan een persoon toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een gereconstitueerd preparaat dat een RAGE-fusie-eiwit, een beschermend middel voor vriesdrogen en een buffer omvat.

Elk van de uitvoeringsvormen van de RAGE-fusie-eiwitten die hierin zijn beschreven kunnen worden gebruikt voor behandeling van ziekte in de therapeutische 30 samenstellingen en preparaten van de onderhavige uitvinding. Het RAGE-fusie-eiwit kan aldus een sequentie omvatten die afkomstig is van een bindingsplaats voor een ligand van RAGE die aan een immunoglobuline-polypeptide is gekoppeld. Uitvoeringsvormen van het RAGE-fusie-eiwit kunnen een RAGE-polypeptide 55 omvatten dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat een Cii2-domein van een immunoglobuline of een deel van een Cn2-domein van een immunoglobuline omvat. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een immunoglobulinedomein van RAGE omvatten, 5 zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobulinedomein van RAGE is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Cn2-domein van een immunoglobuline, of een deel daarvan, omvat. Bepaalde uitvoeringsvormen 10 van het fiisie-eiwit kunnen bijvoorbeeld een eerste immunoglobulinedomein van RAGE en een eerste interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een tweede immunoglobulinedomein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvatten, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobulinedomein 15 van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobulinedomein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobulinedomein van RAGE en het C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op 20 directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het Ch2-immunoglobulinedomein of een deel van een Cn2-domein van een immunoglobuline.

In andere uitvoeringsvormen van dit multi-domein fusie-eiwit kan het RAGE-polypeptide de aminozuursequentie omvatten zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is of de aminozuursequentie zoals 25 uiteengezet is in SEQ ID NO: 47 of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek daar aan is. In andere alternatieve uitvoeringsvormen kan het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie omvatten zoals uiteengezet is in tenminste één van SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 of 57 of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% 30 identiek daar aan is. In bepaalde uitvoeringsvormen omvat een sequentie die tenminste 90% identiek is aan SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57 bijvoorbeeld het polypeptide met SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57 zonder de C-eindstandige lysine. Of andere uitvoeringsvormen zoals ze hierin zijn beschreven 56 kunnen het RAGE-fusie-eiwit dat in de preparaten van de onderhavige uitvinding wordt gebruikt omvatten.

Een verscheidenheid van beschermende middelen voor vriesdrogen kunnen in het preparaat van het gevriesdroogde RAGE-fiisie-eiwit worden gebruikt. Bij sommige 5 uitvoeringsvormen kan het beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker omvatten. De niet-reducerende suiker kan bijvoorbeeld sucrose, mannitol of trehalose omvatten. Ook kan een verscheidenheid van buffers in het preparaat van het gevriesdroogde RAGE-fiisie-eiwit worden gebruikt. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de buffer histidine omvatten.

10 Het gevriesdroogde RAGE-fusie-eiwit kan aanvullende bestanddelen omvatten.

Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan het preparaat van het RAGE-fiisie-eiwit verder tenminste één van een oppervlakte-actieve stof, een chelerend middel of een volume-vormend middel omvatten. Bij één uitvoeringsvorm omvat het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fiisie-eiwit ongeveer 40-100 mg/ml RAGE-fiisie-eiwit dat de 15 sequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37, of 57; ongeveer 2 mM tot ongeveer 50 mM histidine; ongeveer 60 mM tot ongeveer 65 mM sucrose; ongeveer 0,001% tot ongeveer 0,05% Tween 80; en een pH van ongeveer 6,0 tot 6,5. Het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fiisie-eiwit kan bij bepaalde uitvoeringsvormen bijvoorbeeld ongeveer 40-50 mg/ml RAGE-fiisie-eiwit dat de 20 sequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ 1D NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57; ongeveer 10 mM histidine, ongeveer 65 mM sucrose, ongeveer 0,01% Tween 80 en bij een pH van ongeveer 6,0 omvatten. Of andere concentraties van het RAGE-fusie-eiwit kunnen worden gebruikt in de preparaten voor behandeling van RAGE-bemiddelde stoornissen zoals nodig is.

25 Het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit kan een stabiel therapeutisch middel omvatten dat is bereid voor gebruik in een ziekenhuis of als een voorgeschreven geneesmiddel. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit bijvoorbeeld minder dan 10% of minder dan 5% of minder dan 3% afbraak na één week bij 40 graden Celsius vertonen.

30 Het preparaat van het RAGE-fiisie-eiwit kan ook stabiel zijn bij reconstitutie in een verdunningsmiddel. Bij bepaalde uitvoeringsvormen is minder dan ongeveer 10%, 5%, 4%, 3%, 2% of 1% van het RAGE-fusie-eiwit aanwezig als een aggregaat in het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit.

57

Het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit kan geschikt zijn voor toediening door verscheidene routes en is nodig voor de behandeling van de RAGE-bemiddelde stoornis van belang. Toediening van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan gebruik maken van intraperitoneale (IP) injectie. Als 5 alternatief kan het RAGE-fusie-eiwit op orale wijze, op intranasale wijze of als een aërosol worden toegediend. In een andere uitvoeringsvorm is toediening intraveneus (IV). Het RAGE-fusie-eiwit kan ook op subcutane wijze worden geïnjecteerd. In een andere uitvoeringsvorm is toediening van het RAGE-fusie-eiwit intra-arterieel. In een andere uitvoeringsvorm is toediening sublinguaal. Toediening kan ook gebruik maken 10 van een capsule met afgifte in de tijd. In nog een andere uitvoeringsvorm kan toediening transrectaal zijn, zoals door een zetpil of dergelijke. Subcutane toediening kan bijvoorbeeld bruikbaar zijn voor het behandelen van chronische stoornissen wanneer het zelfstandig toedienen wordt gewenst.

Zoals hierin in meer detail is beschreven, is RAGE betrokken bij de pathogenese 15 van een verscheidenheid van ziektetoestanden en het is gevonden dat de RAGE-fusie- eiwitten van de onderhavige uitvinding effectief te zijn bij het verbeteren van dergelijke ziektetoestanden. Preparaten van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kunnen aldus worden gebruikt voor het behandelen van een verscheidenheid van RAGE-bemiddelde stoornissen.

20 Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan een preparaat van een gereconstitueerd RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het behandelen van een symptoom van diabetes of een symptoom van late complicaties van diabetes. Het symptoom van diabetes of late complicaties van diabetes omvatten bijvoorbeeld tenminste één van diabetische nefropathie, diabetische retinopathie, een diabetische 25 voetzweer, een cardiovasculaire complicatie of diabetische neuropathie.

Bij andere uitvoeringsvormen kan een preparaat van een gereconstitueerd RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het behandelen van tenminste één van amyloïdose, ziekte van Alzheimer, kanker, nierfalen of ontsteking die is geassocieerd met auto-immuniteit, inflammatoire darmziekte, reumatoïde artritis, 30 psoriasis, multipele sclerose, hypoxie, beroerte, hartaanval, hemorrhagische shock, sepsis, orgaantransplantatie of verzwakte genezing van wonden.

Of het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit kan worden gebruikt voor het behandelen van osteoporose. Bij bepaalde uitvoeringsvormen 58 verhoogt de toediening van een preparaat van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld de botdichtheid van de persoon of verlaagt het de snelheid van een afname van de botdichtheid van een persoon.

Bij sommige uitvoeringsvormen kan de auto-immuniteit die wordt behandeld 5 door het gebruik van de preparaten van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding afstoting van tenminste één van huidcellen, alvleeskliercellen, zenuwcellen, spiercellen, endotheelcellen, hartcellen, levercellen, niercellen, een hart, beenmergcellen, bot, bloedcellen, slagaderlijke cellen, aderlijke cellen, kraakbeencellen, schildkliercellen of stamcellen omvatten. Of het preparaat van het gereconstitueerde 10 RAGE-fusie-eiwit kan worden gebruikt voor het behandelen van nierfalen.

Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit worden gebruikt voor het behandelen van ontsteking en/of afstoting die is geassocieerd met transplantatie van tenminste één van een orgaan, een weefsel of een verscheidenheid van cellen van een eerste plaats naar een tweede plaats. De eerste 15 en tweede plaatsen kunnen ofwel bij verschillende personen of bij dezelfde persoon zijn. Transplantatie van een verscheidenheid van verschillende celsoorten kan worden verbeterd door het gebruik van preparaten van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding. De getransplanteerde cellen, weefsel, of orgaan kunnen bijvoorbeeld een cel, weefsel of orgaan van een alvleesklier, huid, lever, nier, hart, 20 beenmerg, bloed, bot, spier, slagader, ader, kraakbeen, schildklier, zenuwstelsel of stamcellen omvatten.

Voorbeelden van het gebruik van RAGE-füsie-eiwitten van de onderhavige uitvinding bij de behandeling van dergelijke ziekten en stoornissen zijn hierin beschreven.

25 Een verscheidenheid van dierlijke modellen zijn bijvoorbeeld gebruikt voor het valideren van het gebruik van de verbindingen die RAGE moduleren als therapeutische middelen. Voorbeelden van deze modellen zijn als volgt: a) sRAGE remde neointima vorming bij een model van rat van restenose volgend op arteriële schade bij zowel diabetische en normale ratten door het remmen van de 30 activering van endotheel, gladde spieren en macrofaag door middel van RAGE (Zhou et al, Circulation 107:2238-2243 (2003)); b) Remming van interacties van RAGE/ligand door het gebruik van ofwel sRAGE of een anti-RAGE antilichaam, verlaagde de vorming van amyloïde-plaques bij een model 59 van muis van systemische amyloidosis (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Samengaand met de vermindering van amyloi'de plaques was er een verlaging van de inflammatoire cytokinen, interleukine-6 (IL-6) en macrofaag-kolonie-stimulerende factor (M-CSF) alsook verlaagde activering van NF-κΒ bij de behandelde dieren; 5 c) RAGE transgene muizen (muizen die RAGE tot overexpressie brengen en muizen die RAGE dominant negatief tot expressie brengen) vertonen plaque-vorming en cognitieve gebreken bij een model van muis van AD (Arancio et al, EMBOJ., 23:4096-4105 (2004)); d) Behandeling van diabetische ratten met sRAGE verlaagde de vasculaire 10 permeabiliteit (Bonnardel-Phu et al, Diabetes, 48:2052-2058 (1999)); e) Behandeling met sRAGE verlaagde atherosclerotische beschadigingen bij diabetische apolipoproteïne E-null muizen en voorkwam de functionele en morfologische indices van diabetische nefropathie bij db/db muizen (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)); en 15 f) sRAGE verzwakte de ernst van ontsteking bij een model van muis van collageen-geïnduceerde artritis (Hofmann et al, Genes Immunol, 3:123-135 (2002)), een model van muis van experimentele allergische encefalomyelitis (Yan et al, Nat. Med. 9:28-293 (2003)) en een model van muis van inflammatoire darmziekte (Hofmann et al, Cell, 97:889-901 (1999)).

20 In een uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding aldus worden gebruikt voor het behandelen van een symptoom van diabetes en/of complicaties resulterend van diabetes die door RAGE worden bemiddeld. In andere uitvoeringsvormen kan het symptoom van diabetes of late complicaties van diabetes diabetische nefropathie, diabetische retinopathie, een diabetische voetzweer, 25 een cardiovasculaire complicatie van diabetes of diabetische neuropathie omvatten.

Oorspronkelijk geïdentificeerd als een receptor voor moleculen waarvan de expressie is geassocieerd met de pathologie van diabetes, is RAGE zelf essentieel voor de pathofysiologie van diabetische complicaties. In vivo is het getoond dat remming van interactie van RAGE met het (de) ligand(en) ervan therapeutisch is in meerdere 30 modellen van diabetische complicaties en ontsteking (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)). Een behandeling van twee maanden met anti-RAGE antilichamen normaliseerde bijvoorbeeld de nierfünctie en verlaagde abnormale histopathologie van nieren bij diabetische muizen (Flyvbjerg et al, Diabetes 53:166- 60 172 (2004)). Behandeling met een oplosbare vorm van RAGE (sRAGE) dat aan liganden van RAGE bindt en interacties van RAGE/ligand remt, verlaagde bovendien atherosclerotische beschadigingen bij diabetische apolipoproteïne E-null muizen en verzwakte de functionele en morfologische pathologie van diabetische nefropathie bij 5 db/db muizen (Bucciarelli et al, Circulation 106:2827-2835 (2002)).

Het is ook getoond dat niet-enzymatische glycoxidatie van macromoleculen, die uiteindelijk resulteert in de vorming van advanced glycation endproducts (AGE’s) is verhoogd op plaatsen van ontsteking, bij renaal falen, in de aanwezigheid van hyperglycemie en andere aandoeningen die zijn geassocieerd met systemische of lokale 10 oxidant stress (Dyer et al, J. Clin. Invest., 91:2463-2469 (1993): Reddy et al, Biochem., 34:10872-10878 (1995); Dyer et al, J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991); Degenhardt et al, Cell Mol Biol, 44:1139-1145(1998)). Accumulatie van AGE’s in de vasculatuur kan focaal voorkomen, zoals in het amyloïde van gewrichten dat is samengesteld uit AGE-p2-microglobuline dat wordt gevonden bij patiënten met dialyse-15 verwante amyloidosis (Miyata et al, J. Clin. Invest., 92:1243-1252 (1993); Miyata et al., J. Clin. Invest, 98:1088-1094 (1996)), of algemeen zoals wordt geïllustreerd door de vasculatuur en weefsels van patiënten met diabetes (Schmidt et al, Nature Med., 1:1002-1004 (1995)). De progressieve accumulatie van AGE’s gedurende de tijd bij patiënten met diabetes suggereert dat endogene mechanismen van klaring niet in staat 20 zijn om op effectieve wijze te functioneren op plaatsen van afzetting van AGE. Dergelijke geaccumuleerde AGE’s hebben het vermogen om cellulaire eigenschappen te veranderen door een aantal mechanismen. Alhoewel RAGE bij lage niveaus tot expressie wordt gebracht in normale weefsels en vasculatuur is het getoond dat het in een omgeving waarbij de liganden van de receptor accumuleren RAGE opwaarts wordt 25 gereguleerd (Li et al, J. Biol. Chem., 272:16498-16506 (1997); Li et al, J. Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). Expressie van RAGE is verhoogd in endotheel, gladde spiercellen en infiltrerende mononucleaire fagocyten bij diabetische vasculatuur. Studies in celkweek hebben ook getoond dat interactie van AGE-RAGE veranderingen van cellulaire eigenschappen 30 veroorzaakt die belangrijk zijn bij vasculaire homeostase.

Het gebruik van de RAGE-fusie-eiwitten bij de behandeling van diabetes verwante pathologie is in Figuur 14 geïllustreerd. Het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 werd beoordeeld in een diabetische model van rat van restenose die het meten van 61 proliferatie van gladde spiercellen en intima uitbreiding volgend op vasculaire schade behelsde. Zoals in Figuur 14 is geïllustreerd kan behandeling met TTP-4000 de verhouding van intima/media (I/M) aanzienlijk verlagen (Figuur 14A; Tabel 1) bij diabetes-geassocieerde restenose op een dosis-reagerende wijze. Behandeling met TTP-5 4000 kan ook restenose-geassocieerde proliferatie van vasculaire gladde spiercellen aanzienlijk verlagen op een dosis-afhankelijke wijze (Figuur 14B).

Tabel 1

Effect van TTP-4000 bij een model van rat van restenose

IgG (n=9) TTP-4000 (n=9) TTP-4000 (n=9)

Lage dosis** Hoge dosis** (0,3 mg/dier qod x 4) (1,0 mg/dier qod x 4)

Gebied van intima (mm2) 0,2 ±0,03 0,18 ±0,04 0,16 ±0,02

Gebied van media (mm2) 0,12 ±0,01 0,11 ±0,02 0,11 ±0,01 I/M verhouding 1,71 ±0,27 1,61 ±0,26 1,44* ±0,15 10 *P<0,05; ** Voor zowel hoge en lage dosis werd een loading-dosis van 3 mg/dier gebruikt.

In andere uitvoeringsvormen kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding ook worden gebruikt voor het behandelen of omkeren van amyloidosis en de 15 ziekte van Alzheimer. RAGE is een receptor voor amyloïde-bèta (Αβ) alsook andere amyloïdogene eiwitten waaronder SAA en amyline (Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 94:5296-5301 (1997); Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000); Sousa et al, Lab Invest., 80:1101-1110 (2000)). De RAGE-liganden, waaronder AGE’s, SI00b en Αβ-eiwitten, worden ook gevonden in weefsel 20 dat de seniele plaque bij mensen omgeeft (Luth et al, Cereb. Cortex 15:211-220 (2005); Petzold et al, Neurosci. Lett., 336:167-170 (2003); Sasaki et al, Brain Res., 12:256-262 (2001); Yan et al, Restor. Neurol Neurosci., 12:167-173 (1998)). Het is getoond dat RAGE β-sheet fïbrillair materiaal bindt ongeacht de samenstelling van de subeenheden (amyloïde-β peptide, amyline, serum amyloïde A, prion-afkomstig peptide) (Yan et al., 25 Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al, Nat. Med, 6:643-651 (2000)). In aanvulling is het getoond dat afzetting van amyloïde in verhoogde expressie van RAGE resulteert. In de hersenen van patiënten met de ziekte van Alzheimer (AD) neemt expressie van RAGE bijvoorbeeld toe in neuronen en glia (Yan, et al, Nature 382:685-691 (1996)).

62

Gelijktijdig met expressie van liganden van RAGE wordt RAGE opwaarts gereguleerd in astrocyten en microgliale cellen in de hippocampus van individuen met AD maar wordt niet opwaarts gereguleerd bij individuen die niet AD hebben (Lue et al, Exp. Neurol, 171:29-45 (2001)). Deze vindingen suggereren dat cellen die RAGE tot 5 expressie brengen worden geactiveerd door middel van interacties van RAGE/RAGE-ligand in de nabijheid van de seniele plaques. Αβ-bemiddelde activering van microgliale cellen kan in vitro ook worden geblokkeerd met antilichamen die zijn gericht tegen het ligand-bindende domein van RAGE (Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997)). Het is ook getoond dat RAGE als een focaal punt kan 10 dienen voor verzameling van fibrillen (Deane et al, Nat. Med. 9:907-913 (2003)).

Remming van interacties van RAGE/ligand door het gebruik van ofwel sRAGE of een anti-RAGE-antilichaam kan in vivo ook vorming van amyloïde plaques verlagen in een model van muis van systemische amyloïdose (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Dubbele transgene muizen die humaan RAGE en humaan amyloïde 15 voorlopereiwit (APP) met de Swedish en London mutaties (mutant hAPP) tot overexpressie brengen in neuronen ontwikkelen eerder leerstoornissen en neuropathologische abnormaliteiten dan de transgene tegenhangers ervan met een enkele mutante hAPP. In tegenstelling tonen dubbele transgene muizen met afgenomen capaciteit van Αβ-signalering doordat de neuronen een dominante negatieve vorm van 20 RAGE in dezelfde mutante hAPP achtergrond tot expressie brengen, een vertraagd begin van neuropathologische abnormaliteiten en abnormaliteit van leren in vergelijking met de transgene tegenhangers ervan van een enkele APP (Arancio et al., EMBOJ., 23:4096-4105 (2004)).

In aanvulling is het getoond dat remming van interactie van RAGE-amyloïde 25 expressie van cellulair RAGE en merkers van stress van cellen (alsook activering van NF-κΒ) verlaagd en afzetting van amyloïde te niet doet (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)) dat een rol suggereert voor interactie van RAGE-amyloïde bij zowel perturbatie van cellulaire eigenschappen in een omgeving die is verrijkt met amyloid (zelfs in vroege fasen) alsook bij accumulatie van amyloid.

30 De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen aldus ook worden gebruikt bij behandeling voor het verlagen van amyloïdose en voor het verlagen van amyloïde plaques en cognitieve dysfunctie die met de ziekte van Alzheimer (AD) zijn geassocieerd. Zoals hierboven is beschreven is getoond dat 63 sRAGE zowel de vorming van amyloïde plaques in de hersenen verlaagt en daaropvolgend de merkers voor ontsteking doet toenemen bij een dierlijk model van AD. Figuren 15A en 15B tonen dat muizen die AD hebben en gedurende 3 maanden worden behandeld met ofwel TTP-4000 of sRAGE van muis minder amyloïde bèta 5 (Αβ) plaques en minder cognitieve dysfiinctie hadden dan dieren die een hulpstof of een humane IgG als negatieve controle (IgGl) kregen. Zoals sRAGE kan TTP-4000 ook de inflammatoire cytokinen IL-1 en TNF-α, die met AD zijn geassocieerd, verlagen (gegevens niet getoond).

RAGE-fiisie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook worden gebruikt 10 voor het behandelen van atherosclerose en andere cardiovasculaire stoornissen. Het is aldus getoond dat ischemische hartziekte in het bijzonder veel voorkomt bij patiënten met diabetes (Robertson, et al, Lab Invest., 18:538-551 (1968); Kannel et al, J. Am. Med. Assoc, 241:2035-2038 (1979); Kannel et al, Diab. Care, 2:120-126 (1979)). In aanvulling hebben studies getoond dat atherosclerose bij patiënten met diabetes meer 15 wordt versneld en uitgebreid is dan bij patiënten die niet aan diabetes lijden (zie bijvoorbeeld Waller et al, Am. J. Med., 69:498-506 (1980); Crall et al, Am. J. Med. 64:221-230 (1978); Hamby et al, Chest, 2:251-257 (1976); en Pyorala et al, Diab. Metab. Rev., 3:463-524 (1978)). Alhoewel er veel redenen zijn voor de versnelde atherosclerose met betrekking tot diabetes, is het getoond dat verlaging van AGE’s de 20 vorming van plaques kan verminderen.

De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen bijvoorbeeld ook worden gebruikt voor het behandelen van een beroerte. Wanneer TTP-4000 werd vergeleken met sRAGE bij een dierlijk model van beroerte dat relevant is voor de ziekte, werd gevonden dat TTP-4000 een aanzienlijk sterkere verlaging van het volume 25 van het infarct verschaft. Bij dit model wordt de middelste halsslagader van een muis geligeerd en vervolgens door reperfusie behandeld voor het vormen van een infarct. Voor het bepalen van de werkzaamheid van RAGE-fusie-eiwitten voor het behandelen of voorkomen van beroerte werden muizen met sRAGE of TTP-4000 of controle immunoglobuline behandeld vlak voorafgaand aan reperfusie. Zoals in Tabel 2 kan 30 worden gezien was TTP-4000 meer werkzaam dan sRAGE bij het beperken van het gebied van een infarct bij deze dieren dat suggereert dat TTP-4000, door de betere halfwaardetijd in plasma, in staat was een betere bescherming te onderhouden dan sRAGE.

64

Tabel 2

Verlaging van infarct bij beroerte % verlaging van infarct** sRAGE 15%* ~TTP^4ÖÖÖ(3ÖÖ7ïg) 38%* ΤΓΡ^4000(300μ1) 2Ï%* *TTP^4ÖÖÖ(3ÖÖ7ïg) iö%*

IgG Isotype controle (300 pg) 4% * Significant tot p<0,001; ** In vergelijking met zoutoplossing 5 In een andere uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het behandelen van kanker. In één uitvoeringsvorm omvat de kanker die wordt behandeld door het gebruik van de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kankercellen die RAGE tot expressie brengen. Soorten kanker die bijvoorbeeld met het RAGE-fusie-eiwit van de 10 onderhavige uitvinding kunnen worden behandeld omvatten sommige soorten longkanker, sommige gliomen, sommige papillomen en dergelijke. Amfoterine is een groep I niet-histon chromosomaal DNA-bindend eiwit met hoge mobiliteit (Rauvala et al, J. Biol. Chem., 262:16625-16635 (1987); Parkikinen et al, J. Biol. Chem. 268:19726-19738 (1993)) waarvan is getoond dat het met RAGE interactie vertoont. 15 Het is getoond dat amfoterine uitgroei van neurieten bevordert alsook als een oppervlak dient voor het verzamelen van protease-complexen in het fibrinolytische systeem (waarvan ook bekend is dat het bijdraagt aan mobiliteit van cellen). In aanvulling is een lokaal remmend effect van de groei van tumoren van het blokkeren van RAGE waargenomen in een model van een primaire tumor (C6-glioom) het model van Lewis 20 longmetastase (Taguchi et al, Nature 405:354-360 (2000)) en op spontane wijze opkomende papillomen bij muizen die het v-Ha-ras transgen tot expressie brengen (Leder et al, Proc. Natl. Acad. Sci, 87:9178-9182 (1990)).

In nog een andere uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het behandelen van ontsteking. In andere 25 uitvoeringsvormen kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het behandelen van ontsteking die is geassocieerd met inflammatoire darmziekte, ontsteking die is geassocieerd met reumatoïde artritis, 65 ontsteking die is geassocieerd met psoriasis, ontsteking die is geassocieerd met multipele sclerose, ontsteking die is geassocieerd met hypoxie, ontsteking die is geassocieerd met beroerte, ontsteking die is geassocieerd met hartaanval, ontsteking die is geassocieerd met hemorrhagische shock, ontsteking die is geassocieerd met sepsis, 5 ontsteking die is geassocieerd met orgaantransplantatie, ontsteking die is geassocieerd met verzwakte genezing van wonden of ontsteking die is geassocieerd met afstoting van eigen (bijvoorbeeld auto-immuun) of niet-eigen (bijvoorbeeld getransplanteerde) cellen, weefsel of organen.

Bijvoorbeeld volgend op trombolytische behandeling infiltreren ontstekingscellen 10 zoals granulocyten het ischemische weefsel en produceren zuurstoffadicalen die meer cellen kunnen vernietigen dan door de hypoxie werden gedood. Het is getoond dat remming van de receptor op de neutrofiel, die er verantwoordelijk voor is dat de neutrofielen in staat zijn de weefsels binnen te dringen, met antilichamen of andere eiwit-antagonisten, deze reactie verzwakt. Omdat RAGE een ligand is voor deze 15 neutrofiel-receptor kan een RAGE-fusie-eiwit dat een fragment van RAGE bevat werken als een lokmiddel en kan voorkomen dat de neutrofiel naar de plaats van reperfusie beweegt en kan aldus verdere vernietiging van weefsel worden voorkomen. De rol van RAGE bij het voorkomen van ontsteking kan worden aangegeven door studies die tonen dat sRAGE neointimale uitbreiding in een model van rat van 20 restenose volgend op arteriële beschadiging bij zowel diabetische en normale ratten remt, vermoedelijk door het remmen van proliferatie van endotheliale gladde spiercellen en activering van macrofagen door middel van RAGE (Zhou et al, Circulation, 107:2238-2243 (2003)). In aanvulling remde sRAGE modellen van ontsteking waaronder vertraagd type van hypergevoeligheid, experimentele auto-25 immuun encefalitis en inflammatoire darmziekte (Hofman et al, Cell, 97:889-901 (1999)).

In een uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden gebruikt voor het behandelen van auto-immuun-gebaseerde stoornissen. In een uitvoeringsvorm kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de 30 onderhavige uitvinding bijvoorbeeld worden gebruikt voor het behandelen van nierfalen. De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen aldus worden gebruikt voor het behandelen van systemische lupus nefritis of inflammatoire lupus nefritis. Het is bijvoorbeeld getoond dat de SlOO/calgranulinen een familie van 66 nauw verwante calcium-bindende polypeptiden omvatten die wordt gekenmerkt door twee EF-hand gebieden die door een verbindend peptide worden verbonden (Schafer et al, TIBS, 21:134-140 (1996); Zimmer et al, Brain Res. Bull, 37:417-429 (1995); Rammes et al, J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997); Lugering et al, Eur. J. Clin.

5 Invest, 25:659-664 (1995)). Alhoewel ze signaalpeptiden missen is het al lang bekend dat S100/calgranulinen toegang tot de extracellulaire ruimte krijgen, in het bijzonder op plaatsen van chronische immuun/ontstekingsreacties, zoals bij cystische fibrose en reumatoïde artritis. RAGE is een receptor voor vele leden van de familie van S100/calgranuline, die de ontstekingsbevorderende effecten ervan op cellen zoals 10 lymfocyten en mononucleaire fagocyten bemiddelt. Ook suggereren studies op modellen van vertraagd soort van hypergevoeligheidsreactie, colitis bij IL-10 null muizen, collageengeïnduceerde artritis en experimentele auto-immuun encefalitis dat interactie van RAGE-ligand (vermoedelijk met SlOO/calgranulinen) een voorname rol heeft bij de ontstekingscascade.

15 Type I diabetes is een auto-immuunstoomis die kan worden voorkomen of kan worden afgezwakt door behandeling met de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding. Het is bijvoorbeeld getoond dat sRAGE de overdracht van splenocyten van niet-zwaarlijvige diabetische (NOD) muizen naar NOD-muizen met ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD-scid muizen) mogelijk kan maken. NOD-scid 20 muizen vertonen niet op spontane wijze diabetes maar vereisen de aanwezigheid van immunocyten die in staat zijn de cellen van de eilandjes te vernietigen, zodanig dat diabetes vervolgens wordt geïnduceerd. Het werd gevonden dat ontvangende NOD-scid muizen die met sRAGE zijn behandeld een vertraagd begin van diabetes, die werd geïnduceerd door splenocyten die zijn overgebracht van een diabetische (NOD) muis, 25 vertoonden in vergelijking met ontvangende NOD-scid muizen die niet met sRAGE zijn behandeld (Amerikaanse octrooi-publicatie 2002/0122799). Zoals in US 2002/0122799 is gesteld zijn de experimentele resultaten met het gebruik van sRAGE in dit model relevant voor humane ziekte zoals klinische achtergronden waarin toekomstige immuuntherapieën en transplantatie van eilandjes kunnen voorkomen.

30 In een uitvoeringsvorm kan een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding aldus worden gebruikt voor het behandelen van ontsteking die is geassocieerd met transplantatie van tenminste één van een orgaan, een weefsel of een verscheidenheid van cellen van een eerste plaats naar een tweede plaats. De eerste en tweede plaatsen 67 kunnen in verschillende personen of in dezelfde persoon zijn. In andere uitvoeringsvormen omvatten de getransplanteerde cellen, weefsel of orgaan cellen van een alvleesklier, huid, lever, nier, hart, long, beenmerg, bloed, bot, spier, endotheelcellen, slagader, ader, kraakbeen, schildklier, zenuwstelsel of stamcellen. Toediening van de 5 RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kan bijvoorbeeld worden gebruikt voor het bewerkstelligen van transplantatie van cellen van de eilandjes van een eerste niet-diabetische persoon naar een tweede diabetische persoon.

In een andere uitvoeringsvorm kan de onderhavige uitvinding een werkwijze verschaffen voor het behandelen van osteoporose door het toedienen van een 10 therapeutisch effectieve hoeveelheid van een RAGE-fiisie-eiwit van de onderhavige uitvinding aan een persoon (Zhou et al, J. Exp. Med., 203:1067 -1080 (2006)). In een uitvoeringsvorm, kan de werkwijze voor het behandelen van osteoporose verder de stap van het verhogen van de botdichtheid van de persoon of het verlagen van de snelheid van afname van botdichtheid van een persoon omvatten.

15 In verscheidene geselecteerde uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding aldus een werkwijze verschaffen voor het remmen van de interactie van een AGE met RAGE bij een persoon door het toedienen aan de persoon van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding. De persoon die is behandeld door het gebruik van de RAGE-fusie-eiwitten van de 20 onderhavige uitvinding kan een dier zijn. In een uitvoeringsvorm is de persoon een mens. De persoon kan lijden aan een AGE-verwante ziekte zoals diabetes, diabetische complicaties zoals nefropathie, neuropathie, retinopathie, voetzweren, amyloïdoses, of renaal falen en ontsteking. Of de persoon kan een individu met de ziekte van Alzheimer zijn. In een alternatieve uitvoeringsvorm kan de persoon een individu met kanker zijn. 25 In nog andere uitvoeringsvormen kan de persoon lijden aan systemische lupus erythematose of inflammatoire lupus nefritis. Andere ziekten kunnen worden bemiddeld door RAGE en kunnen aldus worden behandeld door het gebruik van de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding. In aanvullende alternatieve uitvoeringsvormen van de onderhavige uitvinding kunnen de RAGE-fusie-eiwitten 30 worden gebruikt voor de behandeling van de ziekte van Crohn, artritis, vasculitis, neffopathieën, retinopathieën en neuropathieën bij humane of dierlijke patiënten. In andere uitvoeringsvormen kan ontsteking, die zowel auto-immuunresponsen (bijvoorbeeld afstoting van eigen) en niet-auto-immuunresponsen (bijvoorbeeld 68 afstoting van niet-eigen) behelzen, worden bemiddeld door RAGE en kan aldus worden behandeld door het gebruik van RAGE-fusie-ei witten van de onderhavige uitvinding.

Een therapeutisch effectieve hoeveelheid kan een hoeveelheid omvatten die in staat is de interactie van RAGE met een AGE of andere soorten van endogene liganden 5 van RAGE bij een persoon te voorkomen. Dienovereenkomstig zal de hoeveelheid variëren met de persoon die wordt behandeld. Toediening van de verbinding kan elk uur, dagelijks, wekelijks, maandelijks, jaarlijks of als een enkele gebeurtenis zijn. Bij verscheidene alternatieve uitvoeringsvormen kan de effectieve hoeveelheid van het RAGE-fusie-eiwit variëren van ongeveer 1 ng/kg lichaamsgewicht tot ongeveer 100 10 mg/kg lichaamsgewicht of van ongeveer 10 pg/kg lichaamsgewicht tot ongeveer 50 mg/kg lichaamsgewicht of van ongeveer 100 pg/kg lichaamsgewicht tot ongeveer 20 mg/kg lichaamsgewicht. De werkelijke effectieve hoeveelheid kan worden vastgesteld door dosis/respons testen door het gebruik van werkwijzen die in het vakgebied standaard zijn (Johnson et al, Diabetes. 42: 1179, (1993)). Zoals bij de deskundigen in 15 het vakgebied bekend is kan de effectieve hoeveelheid aldus afhangen van de biologische beschikbaarheid, biologische activiteit en biologische afbreekbaarheid van de verbinding.

Preparaten 20 De onderhavige uitvinding kan een preparaat omvatten dat een RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding gemengd met een farmaceutisch aanvaardbare drager omvat. Het RAGE-fusie-eiwit kan een RAGE-polypeptide gekoppeld aan een tweede niet-RAGE-polypeptide omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-fusie-eiwit een bindingsplaats voor een ligand van RAGE omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat 25 de ligand-bindingsplaats het meest N-eindstandige domein van het RAGE-fusie-eiwit. De bindingsplaats voor een ligand van RAGE kan het V-domein van RAGE of een deel daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat de bindingsplaats voor een ligand van RAGE SEQ ID NO: 9 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47 30 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is.

In een uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide zijn gekoppeld aan een polypeptide dat een immunoglobuline-domein of een deel (bijvoorbeeld een fragment daarvan) van een immunoglobuline-domein omvat. In één uitvoeringsvorm omvat het 69 polypeptide dat een immunoglobuline-domein omvat tenminste een deel van tenminste één van de Ch2- of de CH3-domeinen van een humaan IgG.

In bepaalde uitvoeringsvormen omvat het RAGE-fusie-eiwit een aminozuursequentie zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 of een 5 sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% 97%, 98% of 99% identiek daar aan is. In sommige uitvoeringsvormen omvat een sequentie die tenminste 90% identiek is aan SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 bijvoorbeeld de sequentie van SEQ ID NO: 56 of SEQ ID NO: 57 zonder de C-eindstandige lysine.

Het RAGE eiwit of polypeptide kan humaan RAGE met de volledige lengte 10 (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 1) of een fragment van humaan RAGE omvatten. In een uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide geen residuen van de signaalsequentie. De signaalsequentie van RAGE kan ofwel residuen 1-22 of residuen 1-23 van RAGE met de volledige lengte omvatten (SEQ ID NO: 1). In andere uitvoeringsvormen kan het RAGE-polypeptide een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 15 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan humaan RAGE of een fragment daarvan. In één uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide bijvoorbeeld humaan RAGE of een fragment daarvan omvatten, waarbij Glycine als het eerste residu is in plaats van een Methionine (zie bijvoorbeeld Neeper et al., (1992)). Of het humane RAGE kan RAGE met de volledige lengte omvatten waarbij de signaalsequentie is 20 verwijderd (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 2 of SEQ ID NO: 3) (Figuren IA en 1B) of een deel van die aminozuursequentie.

De RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding kunnen ook sRAGE (bijvoorbeeld SEQ ID NO: 4), een polypeptide dat tenminste 90% identiek is aan sRAGE, of een fragment van sRAGE omvatten. Het RAGE-polypeptide kan 25 bijvoorbeeld humaan sRAGE, of een fragment daarvan omvatten, waarbij Glycine als het eerste residu is in plaats van een Methionine (zie bijvoorbeeld Neeper et al., (1992)). Of het humane RAGE kan sRAGE omvatten waarbij de signaalsequentie is verwijderd (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 of SEQ ID NO: 45 in Figuur 1) of een deel van die aminozuursequentie. In andere uitvoeringsvormen kan het 30 RAGE-eiwit een V-domein omvatten (zie bijvoorbeeld SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 of SEQ ID NO: 46 in Figuur 1). Of, een sequentie die tenminste 90% identiek is aan het V-domein of een fragment daarvan kan worden gebruikt. Of het RAGE-eiwit kan een fragment van RAGE omvatten dat een deel van het V-domein omvat (zie bijvoorbeeld 70 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 of SEQ ID NO: 47 in Figuur 1). In een uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats SEQ ID NO: 9, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 10, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of SEQ ID NO: 47, of een sequentie die tenminste 90% 5 identiek daar aan is omvatten. Τη nog een andere uitvoeringsvorm is het RAGE-ffagment een synthetisch peptide.

Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-116 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 7) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-116 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 8) of een sequentie die tenminste 10 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-116 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 46), of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein van RAGE, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 124-221 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 11) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het Cl-15 domein van RAGE omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan het RAGE-polypeptide aminozuren 227-317 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 12) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het C2-domein van RAGE, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-123 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 13) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of 20 aminozuren 24-123 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 14) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein van RAGE en een stroomafwaartse interdomein linker, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 24-123 van humaan RAGE omvatten, waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 48), of een sequentie die tenminste 90% identiek daar 25 aan is. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-226 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 17) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-226 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 18) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met het V-domein, het Cl-domein en de interdomein linker die deze twee domeinen koppelt, omvat. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 24-30 226 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliceert voor het vormen van pE (SEQ ID NO:

50), of een sequentie die 90% identiek daar aan is, omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 23-339 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 5) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-339 van humaan RAGE (SEQ

71 ID NO: 6) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, die overeenkomt met sRAGE (d.w.z. coderend voor de V-, Cl- en C2-domeinen en interdomein linkers) omvatten. Of het RAGE-polypeptide kan aminozuren 24-339 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliseert voor het vormen van pE (SEQ ID NO: 45), of een sequentie die 5 tenminste 90% identiek daar aan is, omvatten. Of fragmenten van elk van deze sequenties kunnen worden gebruikt.

In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 22-51 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 23-51 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere 10 uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 31-51 van SEQ ID NO: 1 omvatten. In een andere uitvoeringsvorm kan de ligand-bindingsplaats aminozuren 31-116 van SEQ ID NO: 1 omvatten. De ligand-bindingsplaats kan bijvoorbeeld een V-domein van RAGE of een deel daarvan omvatten zoals het ligand-bindende domein van RAGE (bijvoorbeeld aminozuren 1-118, 23-118, 24-118, 31-118, 1-116, 23-116, 24-15 116, 31-116,1-54,23-54, 24-54, 31-54,1-53,23-53,24-53 of 31-53 van SEQ ID NO: 1 of fragmenten daarvan) (Figuur 1). Of fragmenten van de polypeptiden die op functionele wijze een RAGE-ligand binden kunnen worden gebruikt. Of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, of 99% identiek is aan het V-domein van RAGE of een fragment daarvan (bijvoorbeeld zoals hierboven is 20 beschreven) kan worden gebruikt. Zoals in het vakgebied bekend is kan bij uitvoeringsvormen waarbij het N-uiteinde van het fusie-eiwit glutamine is, zoals bijvoorbeeld door het verwijderen van de signaalsequentie die residuen 1-23 van SEQ ID NO: 1 omvat (bijvoorbeeld Q24 voor een polypeptide dat aminozuren 24-118 of SEQ ID NO:l omvat), de glutamine verder cycliseren teneinde pyroglutaminezuur (pE) 25 te vormen.

Het RAGE-fusie-eiwit kan verscheidene soorten van peptiden die niet afkomstig zijn van RAGE of en fragment daarvan omvatten. Het tweede polypeptide van het RAGE-fusie-eiwit kan een polypeptide omvatten dat afkomstig is van een immunoglobuline. De zware keten (of deel daarvan) kan afkomstig zijn van één van de 30 bekende isotypen van de zware keten: IgG (γ), IgM (μ), IgD (δ), IgE (ε), of IgA (a). In aanvulling kan de zware keten (of deel daarvan) afkomstig zijn van één van de bekende subtypen van de zware keten: IgGl (γΐ), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4), IgAl (al), IgA2 (a2), of mutaties van deze isotypen of subtypen die de biologische activiteit 72 veranderen. Het tweede polypeptide kan de Ch2- en CH3-domeinen van een humane IgGl of een deel van één ervan of beide van deze domeinen omvatten. Als een voorbeeld van uitvoeringsvormen kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 40 of een deel daarvan 5 omvatten. In een uitvoeringsvorm kan het polypeptide dat de Ch2- en Cn3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 38 of een deel daarvan omvatten. Het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humaan IgGl of een deel daarvan omvat kan bijvoorbeeld SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 omvatten, waarbij de eindstandige lysine (K) is verwijderd. Het immunoglobulinepeptide kan 10 worden gecodeerd door de nucleïnezuursequentie van SEQ ID NO: 39 of SEQ ID NO: 41. De immunoglobulinesequentie in SEQ ID NO: 38 of SEQ ID NO: 40 kan ook worden gecodeerd door respectievelijk SEQ ID NO: 52 of SEQ ID NO: 53.

Het Fc-deel van de immunoglobulineketen kan in vivo ontstekingsbevorderend zijn. In één uitvoeringsvorm omvat het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige 15 uitvinding aldus een interdomein linker die afkomstig is van RAGE in plaats van een interdomein schamierpolypeptide dat van een immunoglobuline aikomstig is.

In één uitvoeringsvorm kan het RAGE- fusie-eiwit aldus verder een RAGE-polypeptide omvatten dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat een CH2-domein van een immunogobuline of een fragment daarvan omvat. In één 20 uitvoeringsvorm omvat het CH2-domein of een fragment daarvan SEQ ID NO: 42. In een uitvoeringsvorm omvat het fragment van SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 42 waarvan de eerste tien aminozuren zijn verwijderd.

In één uitvoeringsvorm omvat het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE die aan een immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld zodanig dat het 25 C-eindstandige aminozuur van het immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Ci[2-domein van een immunoglobuline of een fragment daarvan omvat. Het polypeptide dat een CH2-domein 30 van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat kan de Ch2- en C^-domeinen van een humane IgGl of een deel van beide of één van deze domeinen omvatten. Als een voorbeeld van een uitvoeringsvorm kan het polypeptide dat de Ch2- en Ch3-domeinen van een humane IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 40 of een 73 deel daarvan omvatten. In een uitvoeringsvorm kan het polypeptide dat de Ch2- en CH3-domeinen van een humane IgGl of een deel daarvan omvat, SEQ ID NO: 38 of een deel daarvan omvatten. Het polypeptide dat de Ch2- en C][3-domeinen van een humane IgGl of een deel daarvan omvat, kan bijvoorbeeld SEQ ID NO: 38 of SEQ ID 5 NO: 40 omvatten waarbij de eindstandige lysine (K) is verwijderd.

Het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan een enkele of meerdere domeinen van RAGE omvatten. Het RAGE-polypeptide dat een interdomein linker gekoppeld aan een immunoglobuline-domein van RAGE omvat kan een fragment van een RAGE-eiwit met volledige lengte omvatten. In één uitvoeringsvorm kan het 10 RAGE-fusie-eiwit bijvoorbeeld twee immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van RAGE-eiwit en twee immunolgobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide omvatten. Het RAGE-fusie-eiwit kan een eerste immunoglobuline-domein van RAGE en een eerste interdomein linker gekoppeld aan een tweede immunoglobuline-domein van RAGE en een tweede interdomein linker van 15 RAGE omvatten, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobuline-domein van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is 20 gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobuline-domein van RAGE en het C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het polypeptide dat een CH2-immunoglobuline-domein of een fragment daarvan omvat. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-251 van humaan RAGE (SEQ ID 25 NO: 19) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 20) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-251 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliceert voor het vormen van pE, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is (SEQ ID NO: 51), die overeenkomt met het V-domein, het Cl-domein, de interdomein linker die deze 30 twee domeinen koppelt en een tweede interdomein linker stroomafwaarts van Cl omvatten. In één uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 30 of een fragment daarvan omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen. In een andere uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 54 74 omvat coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met vier domeinen, waarbij stille basenveranderingen voor de codons die coderen voor proline (CCG naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de sequentie worden gemaakt voor het verwijderen van een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige 5 codon (d.w.z. nucleotiden 1375-1380 van SEQ TD NO: 30 worden gemodificeerd voor het genereren van SEQ ID NO: 54).

Als alternatief kan een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen één immunoglobuline-domein dat afkomstig is van RAGE en twee immunoglobuline-domeinen die afkomstig zijn van een humaan Fc-polypeptide, omvatten. Het RAGE-10 fusie-eiwit kan bijvoorbeeld een enkel immunoglobuline-domein van RAGE gekoppeld door middel van een interdomein linker van RAGE aan het N-eindstandige aminozuur van het polypeptide dat omvat het CH2-immunoglobuline-domein of een fragment daarvan omvatten. Het RAGE-polypeptide kan bijvoorbeeld aminozuren 23-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 15) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan 15 is of aminozuren 24-136 van humaan RAGE (SEQ ID NO: 16) of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is, of aminozuren 24-136 van humaan RAGE waarbij Q24 cycliceert voor het vormen van pE, of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is (SEQ ID NO: 49), die overeenkomt met het V-domein van RAGE en een stroomafwaartse interdomein linker omvatten. In één uitvoeringsvorm kan een 20 nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 31 of een fragment daarvan omvat, coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen. In een andere uitvoeringsvorm kan een nucleïnezuurconstruct dat SEQ ID NO: 55 omvat, coderen voor een RAGE-fusie-eiwit met drie domeinen, waarbij stille basenveranderingen voor de codons die coderen voor proline (CCG naar CCC) en glycine (GGT naar GGG) aan het C-uiteinde van de 25 sequentie zijn gemaakt voor het verwijderen van een cryptische RNA-splitsingsplaats vlakbij het eindstandige codon (d.w.z. nucleotiden 1030-1035 van SEQ ID NO: 31 worden gemodificeerd voor het genereren van SEQ ID NO: 55).

Een fragment van de interdomein linker van RAGE kan een peptidesequentie omvatten die van nature stroomafwaarts is van, en aldus gekoppeld is aan, een 30 immunoglobuline-domein van RAGE. Voor het V-domein van RAGE kan de interdomein linker bijvoorbeeld aminozuursequenties omvatten die van nature stroomafwaarts zijn van het V-domein. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID NO: 21 omvatten, die overeenkomt met aminozuren 117-123 van RAGE met de 75 volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een interdomein linker die verscheidene aminozuren (bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren) stroomopwaarts en stroomafwaarts van SEQ ID NO: 21 omvat, kan bijvoorbeeld worden gebruikt. In één 5 uitvoeringsvorm omvat de interdomein linker aldus SEQ ID NO: 23 die aminozuren 117-136 van RAGE met de volledige lengte omvat. Of fragmenten van SEQ ID NO: 21 waarbij bijvoorbeeld 1, 2, of 3 aminozuren van één van de uiteinden van de linker zijn verwijderd kunnen worden gebruikt. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 10 99% identiek is aan SEQ ID NO: 21 of SEQ ID NO: 23.

Voor het Cl-domein van RAGE kan de linker een peptidesequentie omvatten die van nature stroomafwaarts van het Cl-domein is. In een uitvoeringsvorm kan de linker SEQ ID NO: 22 omvatten die overeenkomt met aminozuren 222-251 van RAGE met de volledige lengte. Of de linker kan een peptide omvatten dat aanvullende delen van 15 de natuurlijke sequentie van RAGE heeft. Een linker die verscheidene (1-3, 1-5, of Ι-ΙΟ, of 1-15 aminozuren) aminozuren stroomopwaarts en stroomafwaarts van SEQ ID NO: 22 omvat kan bijvoorbeeld worden gebruikt. Of fragmenten van SEQ ID NO: 22 kunnen worden gebruikt, waarbij bijvoorbeeld 1-3, 1-5, of 1-10, of 1-15 aminozuren van één van de uiteinden van de linker zijn verwijderd. In één uitvoeringsvorm kan een 20 interdomein linker van RAGE bijvoorbeeld SEQ ID NO: 24 omvatten, die overeenkomt met aminozuren 222-226. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan SEQ ID NO: 22 of SEQ ID NO: 24.

Of een interdomein linker kan SEQ ID NO: 44 omvatten, die overeenkomt met 25 aminozuren 318-342 van RAGE. In andere uitvoeringsvormen kan de linker een sequentie omvatten die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek is aan SEQ ID NO: 44.

Farmaceutisch aanvaardbare dragers kunnen elk van de standaard farmaceutisch geaccepteerde dragers die in het vakgebied bekend zijn omvatten. In één 30 uitvoeringsvorm kan de farmaceutische drager een vloeistof zijn en het RAGE-fusie-eiwit of nucleïnezuurconstruct kan in de vorm van een oplossing zijn. In een andere uitvoeringsvorm kan de farmaceutisch aanvaardbare drager een vaste stof zijn in de vorm van een poeder, een gevriesdroogd poeder of een tablet. Of de farmaceutische 76 drager kan een gel, zetpil of crème zijn. In andere uitvoeringsvormen kan de drager een liposoom, een microcapsule, een in polymeer ingekapselde cel of een virus zijn. De term farmaceutisch aanvaardbare drager omvat aldus, maar is niet beperkt tot, elk van de standaard farmaceutisch geaccepteerde dragers, zoals water, alcoholen, fosfaat-5 gebufferde zoutoplossingen, suikers (bijvoorbeeld sucrose of mannitol), oliën of emulsies zoals olie/water emulsies of een triglyceride emulsie, verscheidene soorten van bevochtigende middelen, tabletten, beklede tabletten en capsules.

Bij bepaalde uitvoeringsvormen kunnen de RAGE-fusie-eiwitten in een neutrale vorm (waaronder zwitterion vormen) of als positief- of negatief-geladen soorten 10 aanwezig zijn. Bij sommige uitvoeringsvormen kunnen de RAGE-fusie-eiwitten worden gecomplexeerd met een counterion voor het vormen van een farmaceutisch aanvaardbaar zout.

De termen “farmaceutisch aanvaardbaar zout” verwijst naar een complex dat één of meer RAGE-fusie-eiwitten en één of meer counterionen omvat, waarbij de 15 counterionen afkomstig zijn van farmaceutisch aanvaardbare anorganische en organische zuren en basen.

Farmaceutisch aanvaardbare anorganische basen omvatten metaalionen. Metaalionen die meer van voorkeur zijn omvatten, maar zijn niet beperkt tot, geschikte alkalimetaalzouten, aardalkalimetaalzouten en andere fysiologisch aanvaardbare 20 metaalionen. Zouten die afkomstig zijn van anorganische basen omvatten aluminium, ammonium, calcium, kobalt, nikkel, molybdenum, vanadium, mangaan, chroom, selenium, tin, koper, ijzer, ijzerhoudend, lithium, magnesium, mangaanzouten, mangeen, kalium, rubidium, natrium en zink en bij de gewoonlijke valenties ervan.

Farmaceutisch aanvaardbare zuuradditiezouten van de RAGE-fusie-eiwitten van 25 de onderhavige uitvinding kunnen worden bereid van de volgende zuren, waaronder, zonder beperking, mierenzuur, azijnzuur, acetamidobenzoëzuur, adipinezuur, ascorbinezuur, boorzuur, propionzuur, benzoëzuur, kampferzuur, carbonzuur, cyclaamzuur, dehydrocholinezuur, malonzuur, edetinezuur, ethylzwavelzuur, fendizoïnezuur, metafosforzuur, bamsteenzuur, glycolzuur, gluconzuur, melkzuur, 30 appelzuur, wijnsteenzuur, looizuur, citroenzuur, salpeterzuur, ascorbinezuur, glucuronzuur, maleïnezuur, foliumzuur, fumaarzuur, propionzuur, pyrodruivenzuur, asparaginezuur, glutaminezuur, benzoëzuur, zoutzuur, broomwaterstofzuur, joodwaterstofeuur, lysine, isocitroenzuur, trifluorazijnzuur, pamoïnezuur, propionzuur, 77 anthranilinzuur, mesylinezuur, orotinezuur, oxaalzuur, oxaal azijnzuur, oliezuur, stearinezuur, salicylzuur, aminosalicylzuur, silicaat, p-hydroxybenzoëzuur, nicotinezuur, fenylazijnzuur, amandelzuur, pamoïnezuur, sulfonzuur, methaansulfon-zuur, fosforzuur, fosfonzuur, ethaansulfonzuur, ethaandisulfonzuur, ammonium, 5 benzeensulfonzuur, pantotheenzuur, naftaleensulfonzuur, tolueensulfonzuur, 2- hydroxy-ethaansulfonzuur, sulfanilzuur, zwavelzuur, salpeterzuur, salpeterigzuur, zwavelzuurmonomethylester, cyclohexylaminosulfonzuur, β-hydroxyboterzuur, glycine, glycylglycine, glutaminezuur, cacodylaat, diaminohexaanzuur, kampfer-sulfonzuur, gluconzuur, thiocyaanzuur, oxoglutaarzuur, pyridoxal-5-fosfaat, 10 chloorfenoxy-azijnzuur, undecaanzuur, N-acetyl-L-asparaginezuur, galactaarzuur en galacturonzuur.

Farmaceutisch aanvaardbare organische basen omvatten trimethylamine, diethylamine, Ν,Ν’-dibenzylethyleendiamine, chloorprocaïne, choline, dibenzylamine, di-ethanolamine, ethyleendiamine, meglumine (N-methylglucamine), procaine, 15 cyclische aminen, quatemaire ammonium kationen, arginine, betaine, cafeïne, clemizool, 2-ethylamino-ethanol, 2-diethylamino-ethanol, 2-dimethylamino-ethanol, ethaandiamine, butylamine, ethanolamine, ethyleendiamine, N-ethylmorfoline, N-ethylpiperidine, ethylglucamine, glucamine, glucosamine, histidine, hydrabamine, imidazool, isopropylamine, methylglucamine, morfoline, piperazine, pyridine, 20 pyridoxine, neodymium, piperidine, polyamine-harsen, procaine, purinen, theobromine, triethylamine, tripropylamine, triethanolamine, tromethamine, methylamine, taurine, cholaat, 6-amino-2-methyl-2-heptanol, 2-amino-2-methyl-l,3-propaandiol, 2-amino-2-methyl-1 -propanol, alifatische mono- en dicarbonzuren, fenyl-gesubstitueerde alkaanzuren, hydroxy-alkaanzuren, aromatische zuren, alifatische en aromatische 25 sulfonzuren, strontium, tricine, hydrazine, fenylcyclohexylamine, 2-(N-mor- fo linojethaansul fonzuur, bis(2-hydroxy-ethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methaan, N-(2-acetamido)-2-amino-ethaansulfonzuur, 1,4-piperazinediethaansulfonzuur, 3-morfo-lino-2-hydroxypropaansulfonzuur, l,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]-propaan, 4-morfolinepropaansulfonzuur, 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1 -ethaansulfonzuur, 2-30 [(2-hydroxy-1 ,l-bis(hydroxymethyl)ethyl)amino]ethaansulfon-zuur, N,N-bis(2-hy- droxy-ethyl)-2-amino-ethaansulfonzuur, 4-(N-morfolino)butaansuIfonzuur, 3-(N,N-bis[2-hydroxyethyl]amino)-2-hydroxypropaansulfonzuur, 2-hydroxy-3-[tris(hydroxy-methyl)methylamino]-l-propaansulfonzuur, 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-l-(2-hy- 78 droxypropaansulfonzuur), piperazine-1,4-bis(2-hydroxypropaansulfonzuur)dihydraat, 4-(2-hydroxyethyl)-1 -piperazinepropaansulfonzuur, N, V-bis(2-hydroxyethyl)glycine, N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(4-butaansulfonzuur), N-(tris(hydroxymethyl)-methyl]-3-aminopropaansulfonzuur, N-tris(hydroxymethyl)methyl-4-aminobutaan-5 sulfonzuur, N-(1,1 -dimethyl-2-hydroxyethyl)-3-amino-2-hydroxypropaansulfonzuur, 2-(cyclohexylamino)ethaansulfonzuur, 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1 -propaan- sulfonzuur, 3-(cyclohexylamino)-1 -propaansulfonzuur, Ar-(2-acetamido)iminodi-azijnzuur, 4-(cyclohexylamino)-1 -butaansulfonzuur, A-[tris(hydroxymethyl)methyl]-glycine, 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propaandiol en trometamol.

10 Toediening van de RAGE-fusie-ei witten van de onderhavige uitvinding kan van verscheidene routes gebruik maken. Toediening van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kan aldus gebruik maken van intraperitoneale (IP) injectie. Als alternatief kan het RAGE-fusie-eiwit op orale wijze, intranasale wijze of als een aërosol worden toegediend. In een andere uitvoeringsvorm is toediening intraveneus (IV). Het 15 RAGE-fusie-eiwit kan ook subcutaan worden toegediend. In een andere uitvoeringsvorm is toediening van RAGE-fusie-eiwit intra-arterieel. In een andere uitvoeringsvorm is toediening sublinguaal. Toediening kan ook gebruik maken van een capsule met afgifte gedurende de tijd. Subcutane toediening kan bijvoorbeeld bruikbaar zijn voor het behandelen van chronische stoornissen wanneer het gewenst is dat iemand 20 zelf de toediening uitvoert.

In een ander aspect van de onderhavige uitvinding kunnen de RAGE-fusie-eiwitten van de uitvinding worden gebruikt in adjuvans in therapeutische of therapeutische combinatiebehandelingen met andere bekende therapeutische middelen. Het volgende is een niet-uitputtende opsomming van adjuvans en aanvullende 25 therapeutische middelen die in combinatie met de modulators van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt:

Farmacologische classificatie van antikanker middelen: 30 1. Alkylerende middelen: Cyclofosfamide, nitroso-ureum, carboplatine, cisplatine, procarbazine 2. Antibiotica: Bleomycine, Daunorubicine, Doxorubicine 79 3. Antimetabolieten: Methotrexaat, Cytarabine, Fluoruracil, Azathioprine, 6-

Mercaptopurine en cytotoxische chemotherapeutische middelen tegen kanker 4. Alkaloïden van planten: Vinblastine, Vincristine, Etoposide, Paclitaxel, 5. Hormonen: Tamoxifen, Octreotide-acetaat, Finasteride, Flutamide 5 6. Modificeerders van de biologische respons: Interferons, Tnterleukinen

Farmacologische classificaties van behandeling van reumatoïde artritis 1. Analgesica: Aspirine 2. NSAIDs (niet-steroïdale ontstekingsremmende geneesmiddelen): Ibuprofen, 10 Naproxen, Diclofenac 3. DMARDs (ziekte-modificerende antireumatische geneesmiddelen): Methotrexaat, goudpreparaten, hydroxychloroquine, sulfasalazine 4. Modificeerders van de biologische respons, DMARDs: Etanercept, Infliximab Glucocorticoïden, zoals beclomethason, methylprednisolon, bètamethason, prednison, 15 dexamethason en hydrocortison

Farmacologische classificaties van behandeling van diabetes mellitus 1. Sulfonylureums: Tolbutamide, Tolazamide, Glyburide, Glipizide 2. Biguaniden: Metformin 20 3. Veelzijdige orale middelen: Acarbose, Troglitazon 4. Insuline

Farmacologische classificaties van behandeling van ziekte van Alzheimer 1. Cholinesterase remmer: Tacrine, Donepezil 25 2. Antipsychotica: Haloperidol, Thioridazine 3. Antidepressiva: Desipramine, Fluoxetine, Trazodon, Paroxetine 4. Anticonvulsants: Carbamazepine, Valproïnezuur

In een uitvoeringsvorm kunnen de preparaten van de onderhavige uitvinding een 30 therapeutisch effectieve hoeveelheid van een RAGE-fusie-eiwit in combinatie met een enkele of meerdere aanvullende therapeutische middelen omvatten. In aanvulling op de middelen die hiervoor zijn beschreven kunnen de volgende therapeutische middelen in combinatie met de RAGE-fusie-eiwitten van de onderhavige uitvinding worden 80 gebruikt: immuunonderdrukkende middelen zoals cyclosporine, tacrolimus, rapamycine en andere FK-506 type immuunonderdrukkende middelen.

In één uitvoeringsvorm kan de onderhavige uitvinding daarom een werkwijze van het behandelen van RAGE-bemiddelde ziekten verschaffen, waarbij de werkwijze 5 omvat het aan een patiënt, die daar behoefte aan heeft, toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een RAGE-fusie-eiwit in combinatie met therapeutische middelen die zijn gekozen uit de groep die bestaat uit alkylerende middelen, antimetabolieten, alkaloïden van planten, antibiotica, hormonen, modificeerders van de biologische respons, analgesica, NSAID’s, DMARD’s, modificeerders van de 10 biologische reactie (bijvoorbeeld glucocorticoïden), sulfonylureums, biguaniden, insuline, cholinesterase-remmers, antipsychotica, antidepressiva, anticonvulsants en immuun-onderdrukkende middelen zoals cyclosporine, tacrolimus, rapamycine en andere FK-506 type immuun-onderdrukkende middelen. In een andere uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding het farmaceutische preparaat van de uitvinding 15 zoals hierboven is beschreven, die verder één of meer therapeutische middelen omvat die zijn gekozen uit de groep die bestaat uit alkylerende middelen, antimetabo lieten, alkaloïden van planten, antibiotica, hormonen, modificeerders van de biologische respons, analgesica, NSAID’s, DMARD’s, modificeerders van de biologische reactie (bijvoorbeeld glucocorticoïden), sulfonylureums, biguaniden, insuline, cholinesterase-20 remmers, antipsychotica, antidepressiva, anticonvulsants en immuunonderdrukkende middelen zoals cyclosporine, tacrolimus, rapamycine en andere FK-506 type immuunonderdrukkende middelen.

25

Gevriesdroogde preparaten

In andere uitvoeringsvormen verschaft de onderhavige uitvinding ook preparaten die een RAGE-fiisie-eiwit omvatten. Uitvoeringsvormen van de preparaten kunnen een gevriesdroogd mengsel van een beschermend middel voor vriesdrogen, een RAGE-30 fusie-eiwit en buffer omvatten.

Een verscheidenheid van beschermende middelen voor vriesdrogen kunnen in preparaten van het gevriesdroogde RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding worden gebruikt. Bij sommige uitvoeringsvormen kan het beschermend middel voor 81 vriesdrogen een niet-reducerende suiker omvatten. De niet-reducerende suiker kan bijvoorbeeld sucrose, mannitol of trehalose omvatten. Een verscheidenheid van buffers kan ook in het preparaat van het gevriesdroogde RAGE-fusie-eiwit worden gebruikt. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de buffer histidine omvatten.

5 Elet gevriesdroogde RAGE-fusie-eiwit kan aanvullende bestanddelen omvatten.

Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit verder tenminste één van een oppervlakte-actieve stof, een chelerend middel of een volume-vormend middel omvatten. In één uitvoeringsvorm omvat het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit ongeveer 40-100 mg/ml RAGE-fusie-eiwit dat de 10 sequentie omvat zoals die uiteengezet is in SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57; ongeveer 2 mM tot ongeveer 50 mM histidine; ongeveer 60 mM tot ongeveer 65 mM sucrose; ongeveer 0,001% tot ongeveer 0,05% Tween 80; en een pH van ongeveer 6,0 tot 6,5. Het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit kan in bepaalde uitvoeringsvormen bijvoorbeeld ongeveer 40-50 mg/ml RAGE-fusie-eiwit omvatten 15 dat de sequentie omvat zoals die uiteengezet is in SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57; ongeveer 10 mM histidine; ongeveer 65 mM sucrose; ongeveer 0,01% Tween 80; en een pH van ongeveer 6,0. Of andere concentraties van het RAGE-fusie-eiwit kunnen worden gebruikt, zoals hierin verder is beschreven.

In één uitvoeringsvorm omvat de onderhavige uitvinding een gereconstitueerd 20 preparaat dat een gevriesdroogd RAGE-fusie-eiwit omvat dat in een verdunningsmiddel is gereconstitueerd, waarbij de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat binnen het traject van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml is. Of andere concentraties van het RAGE-fusie-eiwit kunnen worden gebruikt, zoals hierin is beschreven.

25 In andere uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding ook werkwijzen voor het bereiden van een stabiel gereconstitueerd preparaat van een RAGE-fusie-eiwit omvatten. Het gereconstitueerde preparaat kan een concentratie omvatten die geschikt is voor direct gebruik (bijvoorbeeld directe toediening aan een persoon) of die verder kan worden verdund en/of kan worden gemengd met een afleverend middel.

30 Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de werkwijze het reconstitueren van een gevriesdroogd mengsel van het RAGE-fusie-eiwit en een beschermend middel voor vriesdrogen in een verdunningsmiddel omvatten, zodanig dat de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat in een traject is van ongeveer 1 82 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml. Of andere concentraties zoals hierin wordt beschreven kunnen worden gebruikt zoals hierin wordt beschreven.

Een verscheidenheid van beschermende middelen voor vriesdrogen kunnen in de preparaten van het gereconstitueerde RAGE-fiisie-eiwit van de onderhavige uitvinding 5 worden gebmikt. Bij sommige uitvoeringsvormen kan het beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker omvatten. De niet-reducerende suiker kan bijvoorbeeld sucrose, mannitol of trehalose omvatten. Een verscheidenheid van buffers kunnen ook in het preparaat van het gevriesdroogde RAGE-fusie-eiwit worden gebruikt. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de buffer histidine omvatten.

10 Het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit kan aanvullende bestanddelen omvatten. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit verder tenminste één van een oppervlakte actieve stof, een chelerend middel of een volume-vormend middel omvatten. In één uitvoeringsvorm omvat het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit ongeveer 40-100 mg/ml RAGE-15 fusie-eiwit dat de sequentie omvat zoals die uiteengezet is in SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57; ongeveer 2 mM tot ongeveer 50 mM histidine; ongeveer 60 mM tot ongeveer 65 mM sucrose; ongeveer 0,001% tot ongeveer 0,05% Tween 80; en een pH van ongeveer 6,0 tot 6,5. Het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit kan in bepaalde uitvoeringsvormen bijvoorbeeld ongeveer 40-50 mg/ml RAGE-fusie-20 eiwit omvatten dat de sequentie omvat zoals die uiteengezet is in SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57; ongeveer 10 mM histidine, ongeveer 65 mM sucrose, ongeveer 0,01% Tween 80 en bij een pH van ongeveer 6,0.

Een verscheidenheid van verdunningsmiddelen die geschikt zijn voor farmaceutische middelen kunnen worden gebruikt voor het reconstitueren van het 25 gevriesdroogde RAGE-fusie-eiwit. In een uitvoeringsvorm is het gevriesdroogde RAGE-fusie-eiwit steriel. Ook in een uitvoeringsvorm is het verdunningsmiddel steriel. In één uitvoeringsvorm kan het verdunningsmiddel water voor injectie (WFI) omvatten. In bepaalde uitvoeringsvormen is de hoeveelheid van het verdunningsmiddel die wordt toegevoegd gebaseerd op de therapeutische dosering en het farmacokinetische profiel 30 van het RAGE-fusie-eiwit alsook de biologische verenigbaarheid van het preparaat en de drager die wordt toegediend. In een uitvoeringsvorm is het gereconstitueerde preparaat isotonisch.

83

Het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit kan een stabiel therapeutisch middel omvatten dat is bereid voor gebruik in een ziekenhuis of als een voorgeschreven geneesmiddel. In bepaalde uitvoeringsvormen kan het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit minder dan 10%, of minder dan 5% of minder dan 5 3% afbraak binnen één week bij 40 graden Celsius vertonen.

Het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit kan ook stabiel zijn bij reconstitutie in een verdunningsmiddel. Bij bepaalde uitvoeringsvormen is minder dan ongeveer 10% of ongeveer 5% of ongeveer 4% of ongeveer 3% of ongeveer 2% of ongeveer 1% van het RAGE-fusie-eiwit aanwezig als een aggregaat in het preparaat van het RAGE-fusie-10 eiwit.

Het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit kan geschikt zijn voor toediening door verscheidene routes en zoals nodig is voor behandeling van de RAGE-bemiddelde stoornis van belang. Bij bepaalde uitvoeringsvormen is het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit geschikt voor tenminste één van intraveneuze, 15 intraperitoneale of subcutane toediening van het preparaat aan een persoon.

Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding bijvoorbeeld een stabiel gereconstitueerde preparaat omvatten dat een RAGE-fusie-eiwit omvat bij een concentratie van tenminste 10 mg/ml of tenminste 20 mg/ml of tenminste 50 mg/ml en een verdunningsmiddel, waarbij het gereconstitueerde preparaat van een gevriesdroogd 20 mengsel van het RAGE-fusie-eiwit en een beschermend middel voor vriesdrogen is bereid. In andere uitvoeringsvormen kan de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat tenminste 100 mg/ml, of tenminste 200 mg/ml of tenminste 400 mg/ml zijn. In nog andere uitvoeringsvormen is de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat bij een hoeveelheid binnen het 25 traject van ongeveer 0,5 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml, of ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 200 mg/ml, of ongeveer 40 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml, ongeveer 40 tot 100 mg/ml of ongeveer 40-50 mg/ml. Het preparaat kan ook een buffer omvatten.

In nog andere uitvoeringsvormen kan de onderhavige uitvinding industrieel geproduceerde voorwerpen omvatten die RAGE-fusie-eiwitten omvatten. Bij bepaalde 30 uitvoeringsvormen kan het industrieel geproduceerd voorwerp een houder omvatten die een gevriesdroogd RAGE-fusie-eiwit en instructies voor het reconstitueren van het gevriesdroogde preparaat met een verdunningsmiddel omvat. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kunnen de industrieel geproduceerde voorwerpen een houder 84 omvatten die een preparaat bevat dat een gevriesdroogd mengsel van een beschermend middel voor vriesdrogen, een RAGE-fusie-eiwit en een buffer omvat. Het industriëel geproduceerd voorwerp kan ook instructies voor het reconstitueren van het gevriesdroogde preparaat met een verdunningsmiddel omvatten.

5 Een verscheidenheid van beschermendende middelen voor vriesdrogen kunnen in de industriëel geproduceerde voorwerpen van de onderhavige uitvinding worden gebruikt. Bij sommige uitvoeringsvormen kan het beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker omvatten. De niet-reducerende suiker kan bijvoorbeeld sucrose, mannitol of trehalose omvatten. Een verscheidenheid van buffers 10 kunnen ook in het preparaat van het gevriesdroogde RAGE-fusie-eiwit worden gebruikt. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de buffer histidine omvatten.

Het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit van de industriëel geproduceerde voorwerpen van de onderhavige uitvinding kunnen aanvullende bestanddelen omvatten. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan het preparaat van het gevriesdroogde RAGE-fusie-15 eiwit verder tenminste één van een oppervlakte-actieve stof, een chelerend middel of een volume-vormend middel omvatten. In één uitvoeringsvorm van de voorwerpen van de vervaardiging van de onderhavige uitvinding omvat het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit door reconstitutie volgens de instructies die worden verschaft ongeveer 40-100 mg/ml RAGE-fusie-eiwit dat de sequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ ID 20 NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57; ongeveer 2 mM tot ongeveer 50 mM histidine; ongeveer 60 mM tot ongeveer 65 mM sucrose; ongeveer 0,001% tot ongeveer 0,05% Tween 80; en een pH van ongeveer 6,0 tot 6,5. Het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit kan in bepaalde uitvoerings-vormen bijvoorbeeld ongeveer 40-50 mg/ml RAGE-fusie-eiwit omvatten dat de sequentie omvat zoals die uiteengezet is in 25 SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57; ongeveer 10 mM histidine; ongeveer 65 mM sucrose; ongeveer 0,01% Tween 80; en een pH van ongeveer 6,0. Of andere concentraties van het RAGE-fusie-eiwit kunnen worden gebruikt, zoals hierin is beschreven.

Een verscheidenheid van verdunningsmiddelen die geschikt zijn voor 30 farmaceutische middelen kunnen worden verschaft voor het reconstitueren van het gevriesdroogde RAGE-fusie-eiwit. In een uitvoeringsvorm kan het gevriesdroogde preparaat steriel zijn. Als alternatief of in aanvulling kan het verdunningsmiddel steriel zijn. In één uitvoeringsvorm kan het verdunningsmiddel water voor injectie (WFI) 85 omvatten. Het industriëel geproduceerd voorwerp kan aldus verder een tweede houder omvatten die een verdunningsmiddel bevat voor het reconstitueren van het gevriesdroogde preparaat, waarbij het verdunningsmiddel water voor injectie (WFI) is. In een uitvoeringsvorm is het gereconstitueerde preparaat isotonisch.

5 Tn bepaalde uitvoeringsvormen is de hoeveelheid van het verdunningsmiddel die wordt toegevoegd ook gebaseerd op de therapeutische dosering en het farmaco-kinetische profiel van het RAGE-fusie-eiwit alsook de biologische verenigbaarheid van het preparaat en de drager die wordt toegediend. In een alternatieve uitvoeringsvorm zijn de instructies voor het reconstitueren van het gevriesdroogde preparaat zodat de 10 concentraties zoals ze hierin zijn beschreven worden verkregen. Bij bepaalde uitvoeringsvormen zijn de instructies voor het reconstitueren van het gevriesdroogde preparaat bijvoorbeeld zodanig dat de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat in het traject is van ongeveer 40 mg/ml tot ongeveer 100 mg/ml.

15 Het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit dat wordt verschaft als het industriëel geproduceerd voorwerp kan een stabiel therapeutisch middel omvatten dat is bereid voor gebruik in een ziekenhuis of als een voorgeschreven geneesmiddel. Bij bepaalde. uitvoeringsvormen kan het RAGE-fusie-eiwit, wanneer het wordt gereconstitueerd volgens de instructies die worden verschaft, minder dan 10%, of minder dan 5%, of 20 minder dan 3% afbraak na één week bij 40 graden Celsius vertonen. Het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit kan ook stabiel zijn bij reconstitutie in een verdunningsmiddel. Bij bepaalde uitvoeringsvormen is minder dan ongeveer 10%, of ongeveer 5%, of ongeveer 4%, of ongeveer 3% of ongeveer 2% of ongeveer 1% van het RAGE-fusie-eiwit aanwezig als een aggregaat in het preparaat van het RAGE-fusie-eiwit.

25 Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit, wanneer het wordt gereconstitueerd volgens de instructies die worden verschaft, ook geschikt zijn voor toediening door verscheidene routes en zoals nodig is voor behandeling van de RAGE-bemiddelde stoornis van belang. Bij bepaalde uitvoeringsvormen is het preparaat van het gereconstitueerde RAGE-fusie-eiwit 30 geschikt voor tenminste één van intraveneuze, intraperitoneale of subcutane toediening van het preparaat aan de persoon.

Bij bepaalde uitvoeringsvormen van de preparaten, industriëel geproduceerde voorwerpen en werkwijzen voor het maken van de preparaten die een RAGE-fusie- 86 eiwit omvatten, kan de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat tenminste 10 mg/ml, of tenminste 20 mg/ml, of tenminste 50 mg/ml zijn. In andere uitvoeringsvormen kan de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat tenminste 100 mg/ml, of 200 mg/ml of 400 mg/ml zijn. In 5 andere uitvoeringsvormen is de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat bijvoorbeeld tenminste ongeveer 0,5 tot 400 mg/ml of ongeveer 1 tot 200 mg/ml, 40 tot 400 mg/ml, 50 tot 400 mg/ml, 40 tot 100 mg/ml, 50 tot 100 mg/ml of ongeveer 40-50 mg/ml. Bij één uitvoeringsvorm wordt het RAGE-fusie-eiwit bijvoorbeeld toegediend in een preparaat als een steriele waterige oplossing 10 die een pH heeft die varieert van ongeveer 5,0 tot ongeveer 6,5 en van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 200 mg/ml RAGE-fusie-eiwit, van ongeveer 1 millimolair tot ongeveer 100 millimolair histidine-buffer, van ongeveer 0,01 mg/ml tot ongeveer 10 mg/ml polysorbaat 80, van ongeveer 100 millimolair tot ongeveer 400 millimolair trehalose en van ongeveer 0,01 millimolair tot ongeveer 1,0 millimolair dinatrium 15 EDTA dihydraat omvat.

Elk van de uitvoeringsvormen die hierin zijn beschreven kunnen worden gebruikt als het RAGE-fusie-eiwit in de preparaten van de onderhavige uitvinding. Voor elk van de gevriesdroogde preparaten, de gereconstitueerde gevriesdroogde preparaten of de werkwijzen voor het maken van de gevriesdroogde preparaten of gereconstitueerde 20 gevriesdroogde preparaten of de industrieel geproduceerde voorwerpen die ofwel de gevriesdroogde preparaten of de gereconstitueerde gevriesdroogde preparaten van de onderhavige uitvinding omvatten, kan het RAGE-fusie-eiwit aldus een sequentie omvatten die afkomstig is van een bindingsplaats voor een ligand van RAGE gekoppeld aan een immunoglobuline-polypeptide.

25 Uitvoeringsvormen van het RAGE-fusie-eiwit kunnen aldus een RAGE- polypeptide omvatten dat op directe wijze is gekoppeld aan een polypeptide dat een CH2-domein van een immunoglobuline of een deel van een CH2-domein van een immunoglobuline zoals hierin is beschreven omvat. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan het RAGE-polypeptide een interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een 30 immunoglobulinedomein van RAGE omvatten, zodanig dat het C-eindstandige aminozuur van het immunoglobulinedomein van RAGE is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van de interdomein linker en het C-eindstandige aminozuur van de interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N- 87 eindstandige aminozuur van een polypeptide dat een Cn2-domein van een immunoglobuline of een deel daarvan omvat. Bepaalde uitvoeringsvormen van het fusie-eiwit kunnen bijvoorbeeld een eerste immunoglobulinedomein van RAGE en een eerste interdomein linker van RAGE gekoppeld aan een tweede immunoglobuline-5 domein van RAGE en een tweede interdomein linker van RAGE omvatten, zodanig dat het N-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het eerste immunoglobulinedomein van RAGE, het N-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobulinedomein van RAGE is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van de eerste interdomein linker, het N-10 eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker is gekoppeld aan het C-eindstandige aminozuur van het tweede immunoglobulinedomein van RAGE en het C-eindstandige aminozuur van de tweede interdomein linker van RAGE op directe wijze is gekoppeld aan het N-eindstandige aminozuur van het CH2-immunoglobulinedomein of een deel van een Ciü-domein van een immunoglobuline.

15 In andere uitvoeringsvormen kan het RAGE-polypeptide van het RAGE-fusie- eiwit bijvoorbeeld de aminozuursequentie omvatten zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 10 of een sequentie die tenminste 90% identiek daar aan is of de aminozuursequentie zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 47 of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek daar aan is. In andere 20 alternatieve uitvoeringsvormen kan het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie omvatten zoals uiteengezet is in tenminste één van SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 56 of 57, of een sequentie die tenminste 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of 99% identiek daar aan is. Bij bepaalde uitvoeringsvormen omvat een sequentie die tenminste 90% identiek is aan SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57 het 25 polypeptide van SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 56, 35, 36, 37 of 57 zonder de C-eindstandige lysine.

Bereiding van gevriesdroogde preparaten

In een andere uitvoeringsvorm verschaft de onderhavige uitvinding een preparaat 30 voorafgaand aan vriesdrogen, een gevriesdroogd preparaat, een gereconstitueerd preparaat en werkwijzen voor bereiding daarvan.

Na bereiding van een RAGE-fusie-eiwit van belang zoals hierboven is beschreven kan een “preparaat voorafgaand aan vriesdrogen” worden geproduceerd. De 88 hoeveelheid van het RAGE-fusie-eiwit dat aanwezig is in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen kan worden bepaald door rekening te houden met de gewenste volumes van dosering, wijze(n) van toediening, enzovoort. In een uitvoeringsvorm kan de hoeveelheid van het fusie-eiwit in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen hoger 5 zijn dan 1 mg/ml. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de hoeveelheid fusie-eiwit in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen ook lager zijn dan ongeveer 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml of 200 mg/ml.

In een andere uitvoeringsvorm kan het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen een pH-gebufferde oplossing zijn bij een pH van ongeveer 4-8. In een andere 10 uitvoeringsvorm kan het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen een pH-gebufferde oplossing zijn bij een pH van ongeveer 5-7. In een andere uitvoeringsvorm kan het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen een pH-gebufferde oplossing zijn bij een pH van lager dan 6,7. In een andere uitvoeringsvorm kan het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen een pH-gebufferde oplossing bij een pH van ongeveer 6,0 zijn. Illustratieve 15 buffers omvatten histidine, fosfaat, Tris, citraat, succinaat en andere organische zuren zoals hierin zijn beschreven. De concentratie van de buffer kan van ongeveer 1 mM tot ongeveer 100 mM of lager dan ongeveer 50 mM of van ongeveer 2 mM tot ongeveer 50 mM of lager dan ongeveer 15 mM of van ongeveer 3 mM tot ongeveer 15 mM zijn, afhankelijk van bijvoorbeeld de buffer en de gewenste isotoniciteit van het preparaat 20 (bijvoorbeeld het gereconstitueerde preparaat). In een uitvoeringsvorm is de buffer histidine.

Het beschermende middel voor vriesdrogen kan aan het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen worden toegevoegd. In een uitvoeringsvorm omvat het beschermende middel voor vriesdrogen een suiker. In een andere uitvoeringsvorm omvat het 25 beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker. In een andere uitvoeringsvorm omvat het beschermende middel voor vriesdrogen de niet-reducerende suiker sucrose. Of de niet-reducerende suiker kan mannitol omvatten. Of de niet-reducerende suiker kan trehalose omvatten. De hoeveelheid van het beschermende middel voor vriesdrogen in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen is in het 30 algemeen zodanig dat bij reconstitutie het resulterende preparaat isotonisch zal zijn. Een hypertonisch gereconstitueerd preparaat kan echter ook bruikbaar zijn, bijvoorbeeld in preparaten voor perifere parenterale toediening. In aanvulling zou de hoeveelheid van het beschermend middel voor vriesdrogen niet zo laag moeten zijn dat 89 een onaanvaardbare hoeveelheid van afbraak en/of aggregatie van het eiwit door vriesdrogen optreed. In andere uitvoeringsvormen kan een onaanvaardbare hoeveelheid van aggregatie zijn wanneer 20%, of 10% of 5% of meer van het RAGE-fusie-eiwit als een aggregaat in een preparaat aanwezig is. Een illustratief traject van concentraties van 5 beschermend middel voor vriesdrogen in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen kan lager zijn dan ongeveer 400 mM. In een andere uitvoeringsvorm is het traject van concentraties van beschermend middel voor vriesdrogen in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen lager dan ongeveer 100 mM. In andere uitvoeringsvormen kan het traject van concentratie van beschermend middel voor vriesdrogen in het preparaat 10 voorafgaand aan vriesdrogen daarom variëren van ongeveer 0,5 mM tot 400 mM of van ongeveer 2 mM tot 200 mM of van ongeveer 30 mM tot ongeveer 150 mM of van ongeveer 60-65 mM. Bij sommige uitvoeringsvormen wordt het beschermende middel voor vriesdrogen ook toegevoegd bij een hoeveelheid om het gereconstitueerde preparaat isotonisch te maken.

15 De verhouding van RAGE-fusie-eiwit tot beschermend middel voor vriesdrogen in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen wordt voor elke combinatie van RAGE-fusie-eiwit en beschermend middel voor vriesdrogen gekozen. In een uitvoeringsvorm van een isotonisch gereconstitueerd preparaat met een hoge concentratie van RAGE-fusie-eiwit (bijvoorbeeld hoger of gelijk aan ongeveer 50 mg/ml) kan de molaire 20 verhouding van beschermend middel voor vriesdrogen tot RAGE-fusie-eiwit van ongeveer 50 tot ongeveer 1500 mol beschermend middel voor vriesdrogen tot 1 mol RAGE-fusie-eiwit zijn. In een andere uitvoeringsvorm kan de molaire verhouding van beschermend middel voor vriesdrogen tot RAGE-fusie-eiwit van ongeveer 150 tot ongeveer 1000 mol beschermend middel voor vriesdrogen tot 1 mol fusie-eiwit zijn. In 25 een andere uitvoeringsvorm kan de molaire verhouding van beschermend middel voor vriesdrogen tot RAGE-fusie-eiwit van ongeveer 150 tot 300 mol beschermend middel voor vriesdrogen tot 1 mol RAGE-fusie-eiwit zijn. Deze trajecten kunnen bijvoorbeeld geschikt zijn wanneer het beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker is, zoals sucrose, trehalose of mannitol.

30 In een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding kan een oppervlakte-actieve stof aan het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen worden toegevoegd. Als alternatief of in aanvulling kan de oppervlakte-actieve stof worden toegevoegd aan het gevriesdroogde preparaat en/of het gereconstitueerde preparaat. Illustratieve oppervlakte-actieve 90 stoffen omvatten niet-ionische oppervlakte-actieve stoffen zoals polysorbaten (bijvoorbeeld polysorbaten 20 of 80) (Tween 20™ of Tween 80™); poloxameren (bijvoorbeeld poloxameer 188). De hoeveelheid van oppervlakte-actieve stof die wordt toegevoegd is zodanig dat het aggregatie van het gereconstitueerde eiwit verlaagt en de 5 vorming van uit deeltjes bestaand materiaal na reconstitutie minimaliseert. De oppervlakte-actieve stof kan in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen aanwezig zijn bij bijvoorbeeld een hoeveelheid van ongeveer 0,001% tot 0,5%. In een uitvoerinsgvorm waarbij de oppervlakte-actieve stof polysorbaat 80 omvat kan de oppervlakte-actieve stof bijvoorbeeld in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen 10 aanwezig zijn bij een hoeveelheid van ongeveer 0,005% tot 0,05% of ongeveer 0,008% tot 0,012% of bij ongeveer 0,01%. Als alternatief kan de oppervlakte-actieve stof zodanig in het preparaat aanwezig zijn dat het een uiteindelijke concentratie omvat die varieert van 0,001 mg/ml tot ongeveer 100 mg/ml, of ongeveer 0,01 mg/ml tot ongeveer 10 mg/ml.

15 Bij bepaalde uitvoeringsvormen van de uitvinding kan een mengsel van het beschermend middel voor vriesdrogen (zoals sucrose of histidine) en een volume-vormend middel (bijvoorbeeld mannitol of glycine) worden gebruikt bij de bereiding van het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen. Het volume-vormende middel kan de productie mogelijk maken van een uniforme gevriesdroogde koek zonder uitgebreide 20 holtes daarin, enzovoort.

Andere farmaceutisch aanvaardbare dragers, excipiënten of stabiliserende middelen zoals die welke zijn beschreven in Remington’s Pharmaceutical Sciences 16de editie, Osol, A. redacteur (1980) kunnen in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen worden opgenomen (en/of het gevriesdroogde preparaat en/of het gereconstitueerde 25 preparaat) met dien verstande dat ze niet op nadelige wijze de gewenste kenmerken van het preparaat beïnvloeden. Aanvaardbare dragers, excipiënten of stabiliserende middelen zijn niet toxisch voor ontvangers bij de doseringen en de concentraties die worden gebruikt en omvatten aanvullende bufferende middelen; conserveringsmiddelen; cosolvents; anti-oxidanten waaronder ascorbinezuur en methionine; 30 chelerende middelen zoals EDTA; metaalcomplexen (bijvoorbeeld Zn-eiwit complexen); biologisch afbreekbare polymeren zoals polyesters; en/of zoutvormende counterionen zoals natrium.

91

De preparaten van het RAGE-fusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kunnen ook aanvullende eiwitten bevatten zoals nodig is voor de specifieke indicatie die wordt behandeld. De aanvullende eiwitten kunnen zodanig worden geselecteerd dat de eiwitten elk complementaire activiteiten hebben die elkaar of het RAGE-fusie-eiwit 5 niet negatief beïnvloeden. Dergelijke eiwitten zijn op geschikte wijze in combinatie aanwezig bij hoeveelheden die effectief zijn voor het doel dat wordt beoogd.

De preparaten van het RAGE-iusie-eiwit van de onderhavige uitvinding kunnen steriel zijn voor in vivo toedieningen. Dit kan worden volbracht door filtratie door steriele filtratiemembranen, voorafgaand aan, of volgend op vriesdrogen en 10 reconstitutie.

Nadat het RAGE-fusie-eiwit, beschermend middel voor vriesdrogen en andere eventuele bestanddelen tezamen zijn gemengd kan het preparaat worden gevriesdroogd. Vele verschillende vriesdrogers zijn voor dit doel beschikbaar zoals Hull50™ (Huil, USA) of GT20™ (Leybold-Heraeus, Duitsland) vriesdrogers. Vriesdrogen wordt 15 volbracht door het bevriezen van het preparaat en daaropvolgend het ijs van de bevroren inhoud te sublimeren bij een temperatuur die geschikt is voor primair drogen. Onder deze omstandigheid is de temperatuur van het product lager dan het eutectische punt of de collapse temperatuur van het preparaat. De temperatuur van opslag voor het primaire drogen zal kenmerkend variëren van ongeveer -50°C tot 25°C (met dien 20 verstande dat het product bevroren blijft gedurende het primaire drogen) bij een geschikte druk, die kenmerkend varieert van ongeveer 50 tot 250 mTorr. In een uitvoeringsvorm is de druk ongeveer 100 mTorr en kan het monster tussen ongeveer -30°C en 25°C worden gevriesdroogd. Het preparaat, de grootte en soort van de houder die het monster bevat (bijvoorbeeld een glazen buisje) en het volume van de vloeistof 25 kan de tijd bepalen die voor het drogen nodig kan zijn, die kan variëren van een paar uur tot verscheidene dagen (bijvoorbeeld 40-60 uur). Omstandigheden voor vriesdrogen kunnen worden gevarieerd afhankelijk van het preparaat en de grootte van het buisje.

In sommige gevallen kan het gewenst zijn om het vriesdrogen van het eiwit -30 preparaat uit te voeren in de houder waarin reconstitutie van het eiwit moet worden uitgevoerd, teneinde stappen van overdracht te voorkomen. De houder kan in dit geval bijvoorbeeld een buisje van 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100 of 250 cc zijn. In een uitvoerings- 92 vorm is de houder elke houder die geschikt is voor het bereiden van een gereconstitueerd preparaat dat een volume heeft van kleiner of gelijk aan 100 ml.

Als een algemene kwestie zal vriesdrogen resulteren in een gevriesdroogd preparaat waarbij het vochtgehalte daarvan lager is dan ongeveer 5%. In een 5 uitvoeringsvorm is het vochtgehalte van het gevriesdroogde preparaat lager dan ongeveer 3%. In een andere uitvoeringsvorm is het vochtgehalte van het gevriesdroogde preparaat lager dan ongeveer 1%.

Reconstitutie van het gevriesdroogde preparaat 10 Op het gewenste moment, kenmerkend wanneer het tijd is om het RAGE-fusie- eiwit toe te dienen aan een patiënt of persoon, kan het gevriesdroogde preparaat worden gereconstitueerd met een verdunningsmiddel zodanig dat de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat ongeveer hoger is dan 10 mg/ml of hoger is dan 20 mg/ml of hoger is dan 50 mg/ml of ongeveer 30-50 mg/ml is of 15 ongeveer 50 mg/ml is. In andere uitvoeringsvormen kan de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat tenminste 100 mg/ml, of 200 mg/ml of 400 mg/ml zijn. In andere uitvoeringsvormen kan de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat bijvoorbeeld in het traject zijn van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 600 mg/ml of van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 500 20 mg/ml of van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml of van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 200 mg/ml of van ongeveer 10 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml of van ongeveer 10 mg/ml tot ongeveer 200 mg/ml, of van ongeveer 40 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml, of van ongeveer 40 mg/ml tot ongeveer 200 mg/ml of van ongeveer 50 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml, of van ongeveer 50 mg/ml tot ongeveer 200 mg/ml. In 25 andere uitvoeringsvormen is de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat van ongeveer 40 mg/ml tot ongeveer 100 mg/ml of ongeveer 50 mg/ml tot ongeveer 100 mg/ml, of ongeveer 40 mg/ml tot ongeveer 50 mg/ml. Dergelijke concentraties van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat worden beschouwd in het bijzonder bruikbaar te zijn wanneer subcutane 30 aflevering van het gereconstitueerde preparaat wordt beschouwd. Voor andere routes van toediening, zoals intraveneuze toediening, kunnen echter lagere concentraties van het eiwit in het gereconstitueerde preparaat worden gewenst (bijvoorbeeld van ongeveer 5-50 mg/ml, of van ongeveer 10-40 mg/ml RAGE-fusie-eiwit in het 93 gereconstitueerde preparaat). In sommige uitvoeringsvormen kan de concentratie van het fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat aldus hetzelfde of lager dan 2 keer de concentratie van het fusie-eiwit in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen zijn.

Bij bepaalde uitvoeringsvormen is de concentratie van het fusie-eiwit in het 5 gereconstitueerde preparaat aanzienlijk hoger dan die in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen. De concentratie van het fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat kan in bepaalde uitvoeringsvormen bijvoorbeeld ongeveer 2-40 of 2-10 of 3-8 keer die zijn van het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen. In een uitvoeringsvorm kan de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat ongeveer 3-6 10 keer die zijn van die van het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen. In een andere uitvoeringsvorm waarbij de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen ongeveer 15 mg/ml is, is de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat hoger dan of gelijk aan ongeveer 50 mg/ml (bijvoorbeeld tenminste drievoudig of tenminste viervoudig hoger).

15 De aflevering van een hoge concentratie van eiwit is vaak voordelig of nodig voor subcutane toediening door de beperkingen met betrekking tot het volume (minder dan of gelijk aan 1,5 ml) of vereisten van dosering (meer dan of gelijk aan 100 mg). Eiwitconcentraties (meer dan of gelijk aan 50 mg/ml) kunnen echter moeilijk te verkrijgen te zijn bij de bereidingswerkwijze omdat bij hoge concentraties een eiwit de 20 neiging kan hebben om te aggregeren gedurende het bewerken en moeilijk wordt om te behandelen (bijvoorbeeld pomp) en steriel te filtreren. Als alternatief kan de werkwijze van vriesdrogen een werkwijze verschaffen om concentratie van een eiwit mogelijk te maken. Een RAGE-fusie-eiwit kan bijvoorbeeld in buisjes worden gevuld bij een volume (Vf) en vervolgens worden gevriesdroogd. Het gevriesdroogde RAGE-fusie-25 eiwit wordt vervolgens gereconstitueerd met een kleiner volume (Vr) water of conserveringsmiddel (bijvoorbeeld BWFI) dan het oorspronkelijke volume (bijvoorbeeld Vr = 0,25 Vf) dat in een hogere concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in de gereconstitueerde oplossing resulteert. Deze werkwijze resulteert ook in de concentratie van de buffers en excipiënten. Voor subcutane toediening is de oplossing 30 bij voorkeur isotonisch.

Reconstitutie vindt in het algemeen plaats bij een temperatuur van ongeveer 25°C om volledige hydratatie zeker te stellen, alhoewel andere temperaturen als gewenst kunnen worden gebruikt. De tijd die nodig is voor reconstitutie kan bijvoorbeeld 94 afhangen van het soort van verdunningsmiddel, de hoeveelheid van excipiënt(en) en eiwit. Illustratieve verdunningsmiddelen omvatten steriel water, bacteriostatisch water voor injectie (BWFI), een pH-gebufferde oplossing (bijvoorbeeld fosfaat-gebufferde zoutoplossing), steriele zoutoplossing, Ringer’s oplossing of dextrose oplossing. In een 5 uitvoeringsvorm verschaft het verdunningsmiddel een gereconstitueerd preparaat dat geschikt is voor injectie. In een andere uitvoeringsvorm, waarbij het verdunningsmiddel een gereconstitueerd preparaat verschaft dat geschikt is voor injectie, omvat het verdunningsmiddel water voor injectie (WFI). Het verdunningsmiddel bevat eventueel een conserveringsmiddel. De hoeveelheid van het conserveringsmiddel dat wordt 10 gebruikt kan worden bepaald door het vaststellen van verschillende concentraties van conserveringsmiddel voor het testen op verenigbaarheid met het eiwit en werkzaamheid als conserveringsmiddel.

In andere uitvoeringsvormen kan het gereconstitueerde preparaat minder dan 8.000 of minder dan 6.000 of minder dan 4.000 of minder dan 2.000 of minder dan 15 1.000 of minder dan 600 of minder dan 400 of minder dan 200 of minder dan 100 of minder dan 50 deeltjes hebben die in grootte gelijk zijn aan of groter zijn dan 10 pm per houder van 50 ml. In andere uitvoeringsvormen kan het gereconstitueerde preparaat minder dan 8.000 of minder dan 6.000 of minder dan 4.000 of minder dan 2.000 of minder dan 1.000 of minder dan 600 of minder dan 400 of minder dan 200 of minder 20 dan 100 of minder dan 50 deeltjes hebben die in grootte gelijk zijn aan of groter zijn dan 25 pm per houder van 50 ml.

Toediening van het gereconstitueerde preparaat

Het gereconstitueerde preparaat kan in overeenstemming met bekende 25 werkwijzen worden toegediend aan een zoogdier die behoefte heeft aan behandeling met het RAGE-fusie-eiwit, zoals een mens, zoals intraveneuze toediening als een bolus of door continue infusie gedurende een tijdsperiode, door intramusculaire, intraperitoneale, intracerobrospinale, subcutane, intra-articulaire, intrasynoviale, intrathecale, orale, topicale of inhalatie-routes.

30 In uitvoeringsvormen kan het gereconstitueerde preparaat aan het zoogdier worden toegediend door subcutane (d.w.z. onder de huid) toediening. Voor dergelijke doeleinden kan het gereconstitueerde preparaat worden geïnjecteerd door het gebruik van een spuit. Andere inrichtingen voor toediening van het gereconstitueerde preparaat 95 zijn echter beschikbaar zoals inrichtingen voor injectie (bijvoorbeeld de Inject-ease™ en Genject™ inrichtingen); injectiepennen (zoals de GenPen™); naaldloze inrichtingen (bijvoorbeeld MediJector™ en Biojector™); en subcutane afleverende systemen in de vorm van pleisters.

5 De geschikte dosering of therapeutisch effectieve hoeveelheid van het RAGE- fusie-eiwit zal bijvoorbeeld afhangen van de aandoening die behandelt dient te worden, de ernst en het verloop van de aandoening, of het RAGE-fusie-eiwit wordt toegediend voor preventieve of therapeutische doeleinden, voorgaande therapie, de geneeskundige geschiedenis van de patiënt en de reactie op het RAGE-fusie-eiwit en de oordeel-10 kundigheid van de begeleidende geneesheer. Het RAGE-fusie-eiwit kan aan de persoon (bijvoorbeeld patiënt) op één moment of gedurende een serie van behandelingen worden toegediend of kan op elk moment vanaf de diagnose worden toegediend. Het RAGE-fusie-eiwit kan als de enige behandeling worden toegediend of in samenhang met andere geneesmiddelen of therapieën die bruikbaar zijn voor het behandelen van de 15 aandoening van belang. Bij een uitvoeringsvorm is een dosering van ongeveer 0,1-20 mg/kg een initiële gegadigde dosering voor toediening aan de persoon ofwel door bijvoorbeeld één of meer afzonderlijke toedieningen. Zoals hierboven is beschreven kunnen andere strategieën van dosering bruikbaar zijn.

20 Industrieel geproduceerde voorwerpen

In een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt een industriëel geproduceerd voorwerp verschaft die het gevriesdroogde preparaat van de onderhavige uitvinding bevat en instructies voor de reconstitutie en/of het gebruik ervan verschaft. Het industriëel geproduceerd voorwerp kan een houder omvatten. Geschikte houders 25 omvatten bijvoorbeeld flesjes, buisjes (bijvoorbeeld buisjes met tweeledige kamers), spuiten (zoals spuiten met tweeledige kamers) en testbuisjes. De houder kan van een verscheidenheid van materialen worden gevormd zoals glas of plastic. De houder kan het gevriesdroogde preparaat omvatten. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan er een merker zijn gehecht of zijn geassocieerd met de houder. De label kan instructies voor 30 reconstitutie en/of gebruik aangeven. Bij bepaalde uitvoeringsvormen kan de label bijvoorbeeld aangeven dat het gevriesdroogde preparaat wordt gereconstitueerd naar eiwitconcentraties zoals ze hierboven zijn beschreven. De label kan verder aangeven dat het preparaat bruikbaar is of is bedoeld voor subcutane toediening.

96

De houder die het preparaat bevat kan een buisje voor meerder gebruik zijn dat herhaalde toedieningen mogelijk maakt (bijvoorbeeld van 2-6, of 2-10, of 2-50 toedieningen) van het gereconstitueerde preparaat. Het industrieel geproduceerd voorwerp kan verder een tweede houder omvatten die een geschikt verdunningsmiddel 5 omvat (bijvoorbeeld WFT). Door het mengen van het verdunningsmiddel en het gevriesdroogde preparaat zal de uiteindelijke concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat in het algemeen tenminste 10 mg/ml zijn. In één uitvoeringsvorm is de uiteindelijke concentratie van het RAGE-fiisie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat tenminste ongeveer 20 mg/ml. In een andere 10 uitvoeringsvorm is de uiteindelijke concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat tenminste ongeveer 50 mg/ml. In andere uitvoeringsvormen kan de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat tenminste 100 mg/ml, of 200 mg/ml, of 400 mg/ml zijn. In andere uitvoeringsvormen is de uiteindelijke concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het 15 gereconstitueerde preparaat tussen ongeveer 1-400 mg/ml, of 1-200 mg/ml, of 1-100 mg/ml, of 10-400 mg/ml, of 10-200 mg/ml, of 10-100 mg/ml, of van 40-400 mg/ml, of van 40-200 mg/ml, of van 40-100 mg/ml, of van 50-400 mg/ml, of van 50-200 mg/ml, of van 50-100 mg/ml, of van 40 mg/ml tot 50 mg/ml. Het industriëel geproduceerd voorwerp kan verder andere materialen die gewenst zijn vanuit een commercieel 20 standpunt en van een standpunt van de gebruiker omvatten, waaronder andere buffers, verdunningsmiddelen, filters, naalden, spuiten en bijlagen bij de verpakking met instructies voor gebruik.

VOORBEELDEN

25 Kenmerken en voordelen van het inventieve concept die in de onderhavige uitvinding zijn opgenomen zijn verder in de voorbeelden die volgen geïllustreerd. Voorbeeld IA: Productie van RAGE-fusie-eiwitten

Twee plasmiden werden geconstrueerd voor het tot expressie brengen van RAGE-IgG fusie-eiwitten. Beide plasmiden werden geconstrueerd door het ligeren van 30 verschillende lengten van een 5’ cDNA-sequentie van humaan RAGE met dezelfde 3’ cDNA-sequentie van humaan IgG Fc (γΐ). Deze expressiesequenties (d.w.z. ligatie-producten) werden vervolgens geïnsereerd in expressievector pcDNA3.1 (Invitrogen, CA). De nucleïnezuursequenties die coderen voor het coderende gebied van het RAGE- 97 fusie-eiwit zijn in Figuren 2 en 3 getoond. Voor het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 codeert de nucleïnezuursequentie van 1 tot 753 (gemarkeerd in vetgedrukte letters) voor de N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE, terwijl de nucleïnezuursequentie van 754 tot 1386 voor de Fc-eiwitsequentie van IgG zonder de scharnier codeert 5 (Figuur 2). Voor TTP-3000, codeert de nucleïnezuursequentie van 1 tot 408 (gemarkeerd in vetgedrukte letters) voor de N-eindstandige eiwitsequentie van RAGE, terwijl de nucleïnezuursequentie van 409 tot 1041 voor de Fc-eiwitsequentie van IgG zonder de scharnier codeert (Figuur 3).

Voor het produceren van de RAGE-fusie-ei witten werden de expressievectoren 10 die de nucleïnezuursequenties van ofwel SEQ ID NO: 30 of SEQ ID NO: 31 omvatten op stabiele wijze in CHO-cellen getransfecteerd. Positieve trans formanten werden geselecteerd op neomycine-resistentie die door het plasmide werd verleend en gekloneerd. Klonen met een hoge productie, zoals werd gedetecteerd door Westem-blot analyse van supernatant, werden uitgebreid en het genproduct werd gezuiverd door 15 affiniteitschromatografie door het gebruik van Proteïne A-kolommen. Expressie werd zodanig geoptimaliseerd dat cellen recombinant TTP-4000 produceerden bij niveaus van ongeveer 1,3 gram per liter.

Voorbeeld 1B: Andere productie van RAG£-fusie-eiwitten met vier domeinen

20 Een plasmide werd geconstrueerd voor het tot expressie brengen van RAGE-IgG

fusie-ei witten. Het plasmide werd geconstrueerd door het ligeren van een 5’ cDNA-sequentie van humaan RAGE met een 3’ cDNA-sequentie van humaan IgG (γΐ) zonder het schamiergebied. PCR werd gebruikt voor het amplifïceren van het cDNA. Aan het 5’-uiteinde voegde de PCR-primer verder een plaats voor het Eco RI-restrictie-enzym 25 toe voor klonering en een Kozak-consensus translatie-initiatiesequentie. Aan het 3’-uiteinde voegde de PCR-primer een Xho I-restrictiep laats toe vlak na het terminatiecodon. Aan het 3’-uiteinde omvatte de PCR-primer ook twee stille basenveranderingen die een cryptische RNA-splitsingsplaats in het immunoglobuline-deel vlakbij het eindstandige codon verwijderen. Het codon dat codeert voor proline 30 (residu 459 op basis van de nummering van de eiwitsequentie van SEQ ID NO: 32) werd veranderd van CCG naar CCC en het codon dat codeert voor glycine (residu 460 op basis van de nummering van de eiwitsequentie van SEQ ID NO: 32) werd van GGT naar GGG veranderd. Het PCR-fragment werd gedigereerd met Eco R1 en Xho I en 98 vervolgens geïnsereerd in een retrovector plasmide (pCNS-newMCS-WPRE (new ori), verkrijgbaar van Gala, Inc.) die was gedigereerd met Mfe I (voor het vormen van een verenigbaar uiteinde met Eco RI) en gedigereerd met Xho I. Van het geïnsereerde deel van het gekloneerde plasmide en de overgangen van klonering werd de sequentie 5 geanalyseerd om zeker te zijn dat geen mutaties gedurende de klonering zijn opgetreden.

Voor het produceren van het RAGE-IgG-fusie-eiwit werd de expressievector die de nucleïnezuursequentie SEQ ID NO: 54 omvat op stabiele wijze in CHO-cellen getransfecteerd.

10 De sequentie van het geïsoleerde RAGE-fusie-eiwit TTP-4000, dat door de getransfecteerde cellen tot expressie werd gebracht, werd bevestigd door verscheidene studies voor karakterisering als ofwel SEQ ID NO: 34 of SEQ ID NO: 56, of zowel SEQ ID NO: 34 en SEQ ID NO: 56. De signaalsequentie die wordt gecodeerd door de eerste 23 aminozuren van SEQ ID NO: 32 werd aldus gesplitst en het N-eindstandige 15 residu was glutamine (Q) of pyroglutaminezuur (pE) of een mengsel daarvan. Karakteriserende studies toonden ook glycosylatieplaatsen op N2 en N288 (op basis van de nummering van SEQ ID NO: 34 of SEQ ID NO: 56) en toonden dat het Ch3-gebied van het RAGE-fusie-eiwit het C-eindstandige residu verwijderd kan hebben door een posttranslationele modificatie wanneer het in dit recombinante systeem tot 20 expressie wordt gebracht.

Voorbeeld 1C: Andere productie van RAGE-fusie-eiwitten met drie domeinen

Een plasmide kan worden geconstrueerd voor het tot expressie brengen van RAGE-IgG fusie-eiwitten met drie domeinen (bijvoorbeeld één RAGE-domein en twee 25 IgG-domeinen) zoals TTP-3000 op de wijze die hierboven is beschreven voor TTP-4000. Het plasmide werd geconstrueerd door het ligeren van een 5’ cDNA-sequentie van humaan RAGE dat codeert voor aminozuren 1-136 van humaan RAGE met een 3’ cDNA-sequentie van humaan IgG Fc(yl) zonder het schamiergebied. PCR kan worden gebruikt voor het amplificeren van het cDNA. Aan het 5’-uiteinde kan een PCR-primer 30 een restrictieplaats toevoegen (bijvoorbeeld een plaats voor een Eco RI-restrictie-enzym zoals voor TTP-4000 is gebruikt) voor klonering en een Kozak-consensus translatie-initiatiesequentie. Aan het 3’-uiteinde kan de PCR-primer ook een restrictieplaats toevoegen (bijvoorbeeld een Xho I-restrictieplaats) vlak na het 99 terminatiecodon. De PCR-primer ook stille basenveranderingen omvatten zoals nodig kan zijn voor het verwijderen van elke cryptische RNA-splitsingsplaats, zoals de cryptische RNA-splitsingsplaatsen die aan het 3’-uiteinde van het Cn2-domein van het immunoglobuline zijn gelokaliseerd, zoals in Voorbeeld 1B is beschreven. Voor het 5 verwijderen van deze cryptische splitsingsplaatsen kan het codon dat codeert voor proline 344 van SEQ ID NO: 35 (d.w.z. residuen 1030-1032 op basis van de nummering van de DNA-sequentie van SEQ ID NO: 31) worden veranderd van CCG naar CCC en het codon dat codeert voor glycine 345 van SEQ ID NO: 35 (residuen 1033-1035 op basis van de nummering van de DNA-sequentie van SEQ ID NO: 31) 10 kan van GGT naar GGG worden veranderd. Het PCR-fragment kan vervolgens met de geschikte restrictie-enzymen worden gedigereerd (bijvoorbeeld Eco RI en Xho I) en in de retrovector plasmide pCNS-newMCS-WPRE (new ori; verkrijgbaar van Gala, Ine.) worden geïnsereerd. De vector kan worden gedigereerd met Mfel voor het vormen van een verenigbaar uiteinde met Eco RI en ook worden gedigereerd met Xho I. Van het 15 geïnsereerde deel van het gekloneerde plasmide en de overgangen van klonering kan de sequentie worden geanalyseerd om zeker te zijn dat geen mutaties gedurende de klonering zijn opgetreden.

Voor het produceren van het RAGE-IgG-fusie-eiwit kan de expressievector die de nucleïnezuursequentie SEQ ID NO: 55 (d.w.z. die de verandering van de DNA-20 sequentie voor het verwijderen van cryptische splitsingsplaatsen omvat) omvat, op stabiele wijze in CHO-cellen worden getransfecteerd, zoals in Voorbeeld IA en 1B is beschreven.

De sequentie van het geïsoleerde RAGE-fusie-eiwit TTP-3000, dat door de getransfecteerde cellen tot expressie wordt gebracht, kan ofwel SEQ ID NO: 36, SEQ 25 ID NO: 37 of SEQ ID NO: 57 of een combinatie van SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 en/of SEQ ID NO: 57 zijn. De signaalsequentie die wordt gecodeerd door de eerste 22 en/of 23 aminozuren van SEQ ID NO: 35 kunnen aldus worden gesplitst en het N-eindstandige residu kan glutamine (Q) of pyroglutaminezuur (pE) of een mengsel daarvan zijn. Glycosylatie kan optreden op plaatsen N2 en NI74 (op basis van de 30 nummering van SEQ ID NO: 37 of SEQ ID NO: 57) en/of andere glycosylatieplaatsen die aanwezig kunnen zijn. Het Cn3-gebied van het RAGE-fusie-eiwit kan het C-eindstandige residu ervan verwijderd hebben door een posttranslationele modificatie wanneer het in dit recombinante systeem tot expressie wordt gebracht.

100

Voorbeeld 2: Werkwijze voor het testen van activiteit van een RAGE-IgGl fusie-eiwit A. Binding van ligand in vitro 5 Bekende RAGE-liganden werden bekleed op het oppervlak van Maxisorb-platen bij een concentratie van 5 microgram per putje. Platen werden gedurende de nacht bij 4°C geïncubeerd. Volgend op de incubatie met het ligand werden de platen afgezogen en een blokkerende buffer van 1% BS A in 50 mM imidizoolbuffer (pH 7,2) werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur aan de platen toegevoegd. De platen werden 10 vervolgens afgezogen en/of gewassen met wasbuffer (20 mM imidizool, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20, 5 mM CaCh en 5 mM MgCl?, pH 7,2). Een oplossing van TTP-3000 (TT3) bij een initiële concentratie van 1,082 mg/ml en een oplossing van TTP-4000 (TT4) bij een initiële concentratie van 370 pg/ml werden bereid. Het RAGE-fusie-eiwit werd bij toenemende verdunningen van het initiële monster toegevoegd. Het 15 RAGE-fusie-eiwit werd toegestaan gedurende één uur bij 37°C met het geïmmobiliseerde ligand te incuberen waarna de plaat werd gewassen en werd getest op binding van het RAGE-fusie-eiwit. Binding werd gedetecteerd door de toevoeging van een immunodetectiecomplex dat een monoklonaal anti-humaan IgGl van muis, dat 1:11.000 is verdund tot een uiteindelijke testconcentratie (FAC) van 21 ng/100 μΐ, een 20 gebiotinyleerd anti-muis IgG van geit dat 1:500 is verdund naar een FAC van 500 ng/μΐ en een avidine-gekoppelde alkalische fosfatase bevat. Het complex werd gedurende één uur bij kamertemperatuur met het geïmmobiliseerde RAGE-fusie-eiwit geïncubeerd waarna de plaat werd gewassen en het substraat voor alkalische fosfatase, para-nitrofenylfosfaat (PNPP), werd toegevoegd. Binding van het complex aan het 25 geïmmobiliseerde RAGE-fusie-eiwit werd gekwantificeerd door het meten van de omzetting van PNPP naar para-nitrofenol (PNP) dat op spectrofotometrische wijze bij 405 nm werd gemeten.

Zoals in Figuur 7 is geïllustreerd vertonen de RAGE-fusie-eiwitten TTP-4000 (TT4) en TTP-3000 (TT3) specifieke interactie met bekende liganden van RAGE 30 amyloïde-bèta (Abèta), SI00b (SI00) en amfoterine (Ampho). In de afwezigheid van ligand, d.w.z. alleen bekleding met BSA (BSA of BSA + was) was er geen toename van absorptie boven niveaus die toe te schrijven zijn aan niet-specifieke binding van het immunodetectiecomplex. Wanneer amyloïde bèta wordt gebruikt als het merkende 101 ligand kan het nodig zijn om het amyloïde-bèta voorafgaand aan de test te incuberen. Voorafgaande incubatie kan het mogelijk maken dat het amyloïde-bèta zelf aggregeert in de vorm van een pleated-sheet, daar amyloïde-bèta RAGE bij voorkeur bindt in de vorm van een pleated sheet.

5 Aanvullend bewijs voor een specifieke interactie tussen RAGE-fusie-eiwitten TTP-4000 en TTP-3000 met liganden van RAGE wordt geïllustreerd in studies die tonen dat een ligand van RAGE in staat is om op effectieve wijze te concurreren met een bekende ligand van RAGE voor het binden aan de RAGE-fusie-eiwitten. Bij deze studies werd amyloïde-bèta (A-bèta) op een Maxisorb-plaat geïmmobiliseerd en 10 RAGE-fusie-eiwit werd toegevoegd zoals hierboven is beschreven. In aanvulling werd aan sommige van de putjes een ligand van RAGE toegevoegd op hetzelfde moment als het RAGE-fusie-eiwit.

Het werd gevonden dat het ligand van RAGE de binding van TTP-4000 (TT4) met ongeveer 25% tot 30% kon blokkeren wanneer TTP-4000 bij 123 pg/ml (1:3 15 verdunning, Figuur 8) aanwezig was. Wanneer de initiële oplossing van TTP-4000 met een factor 10 of 30 werd verdund (1:10 of 1:30) werd de binding van het RAGE-fusie-eiwit aan het geïmmobiliseerde ligand volledig geremd door het ligand van RAGE. Op overeenkomstige wijze blokkeerde het ligand van RAGE binding van TTP-3000 (TT3) met ongeveer 50% wanneer TTP-3000 bij 360 pg/ml (1:3 verdunning, Figuur 9) 20 aanwezig was. Wanneer de initiële oplossing van TTP-3000 met een factor 10 werd verdund (1:10) werd de binding van het RAGE-fusie-eiwit aan het geïmmobiliseerde ligand volledig geremd door het ligand van RAGE. Specificiteit van binding van het RAGE-fiisie-eiwit aan het ligand van RAGE was aldus dosis-afhankelijk. In Figuren 8 en 9 is ook getoond dat er in wezen geen binding werd gedetecteerd in de afwezigheid 25 van RAGE-fusie-eiwit, d.w.z. met het gebruik van alleen het immunodetectie-complex (“Complex alleen”).

B. Effect van RAGE-fusie-eiwit in cel-gebaseerde testen

Voorgaand werk heeft getoond dat de myeloïde THP-1-cellen TNF-α kunnen 30 uitscheiden als reactie op RAGE-liganden. In deze test werden THP-1-cellen gekweekt in RPMI-1640 media dat is aangevuld met 10% FBS door het gebruik van een protocol dat wordt verschaft door ATCC. De cellen werden geïnduceerd TNF-α uit te scheiden door middel van stimulatie van RAGE met 0,1 mg/ml SI00b zowel in de afwezigheid 102 en aanwezigheid van RAGE-fusie-eiwitten TTP-3000 (TT3) of TTP-4000 (TT4) (10 μg), sRAGE (10 pg) en een humaan IgG (10 pg) (d.w.z. als een negatieve controle). De hoeveelheid TNF-α die door de THP-1 -cellen werd uitgescheiden werd 24 uur na de toevoeging van de eiwitten aan de celkweek gemeten door het gebruik van een in de 5 handel verkrijgbare ELTSA-kit voor TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN). De resultaten in Figuur 10 tonen dat de RAGE-fusie-eiwitten de S100b/RAGE-geïnduceerde productie van TNF-α in deze cellen remde. Zoals in Figuur 10 is getoond werd door toevoeging van 10 pg van de RAGE-fusie-eiwitten TTP-3000 of TTP-4000 inductie van TNF-α door SI00b (0,1 mg/ml FAC) met respectievelijk ongeveer 45% tot 10 70% verlaagd. Fusie-eiwit TTP-4000 kan net zo effectief zijn in het blokkeren van inductie van TNF-α door SI00b als sRAGE (Figuur 10). Specificiteit van de remming voor RAGE-sequenties van TTP-4000 en TTP-3000 is getoond door het experiment waarbij IgG alleen werd toegevoegd aan SI00b gestimuleerde cellen. Toevoeging van IgG en SI00b aan de test toont dezelfde niveaus van TNF-α als SI00b alleen. 15 Specificiteit van de remming van inductie van TNF-α door TTP-4000 en TTP-3000 voor sequenties van het RAGE-fusie-eiwit is getoond door een experiment waarbij IgG alleen werd toegevoegd aan SlOOb-gestimuleerde cellen. Het kan worden gezien dat de toevoeging van IgG, d.w.z. humaan IgG zonder de sequentie van RAGE (Humaan IgG van Sigma toegevoegd bij 10 pg/putje) en SI00b aan de test dezelfde niveaus van TNF-20 α als S100b alleen toont.

In een andere cel-gebaseerde test werd het vermogen van TTP-4000 om te voorkomen dat het ligand van RAGE, HMGB1, met RAGE en andere receptoren van HMGB1 interactie vertoont, beoordeeld. Anders dan anti-RAGE antilichamen die aan RAGE binden en de interactie van een ligand van RAGE met RAGE voorkomen, kan 25 TTP-4000 de interactie van een ligand van RAGE met RAGE blokkeren door aan het RAGE-ligand te binden. Het is vermeld dat HMGB1 een ligand voor RAGE en de Toll-achtige receptoren 2 en 4 is (Park et al., J. Biol. Chem., 2004; 279(9):7370-7). Al deze drie receptoren (RAGE, Toll-achtige receptor 2 en Toll-achtige receptor 4) worden tot expressie gebracht op THP-l-cellen (Parker, et al.,«7. Immunol., 2004, 172(8):4977-86). 30 Bij dit experiment werden THP-l-cellen gestimuleerd TNF-α te produceren door HMGB1 (50 mg/ml) in de aanwezigheid of afwezigheid van ofwel TTP4000 of anti-RAGE antilichamen. Onder de omstandigheden die bij de test worden gebruikt zou HMGB1 de enige inducer van TNFa moeten zijn. De hoeveelheid TNFa die door de 103 THP-1-cellen wordt uitgescheiden werd 24 uur na de toevoeging van de eiwitten aan de celkweek gemeten door het gebruik van een in de handel verkrijgbare ELISA kit voor TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN). De resultaten in Figuur 11 tonen dal hel anti-RAGE antilichaam en RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 HMGB1 blokkeren om te 5 reageren met RAGE dat tot expressie wordt gebracht op de THP-1-cellen, maar dat TTP-4000 HMGB1-geïnduceerde productie van TNF-α in een sterkere mate remt dan dat het anti-RAGE antilichaam dat doet. De gegevens geven aldus aan dat TTP-4000 activiteit van HMGB1 in een sterkere mate kan remmen dan het anti-RAGE antilichaam door HMGB1 te remmen om interactie te vertonen met Toll-achtige 10 receptoren 2 en 4 alsook het RAGE dat op THP-1-cellen aanwezig is.

Voorbeeld 3: Farmacokinetisch profiel van TTP-4000

Om te bepalen of TTP-4000 een superieur farmacokinetisch profiel zou hebben in vergelijking met humaan sRAGE, kregen ratten en niet-humane primaten een 15 intraveneuze (IV) injectie van TTP-4000 (5 mg/kg) en vervolgens werd plasma getest op de aanwezigheid van TTP-4000. Bij deze experimenten kregen twee naïeve mannelijke apen een enkele IV bolus dosis van TTP-4000 (5 mg/ml/kg) in een perifere ader gevolgd door een spoeling van zoutoplossing van bij benadering 1,0 milliliter (ml). Bloedmonsters (bij benadering 1,0 ml) werden voorafgaand aan de dosis (d.w.z. 20 voorafgaand aan injectie van het TTP-4000) of na 0,083, 0,25, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288 en 336 uur na de dosis in buisjes die lithiumheparine bevatten verzameld. Volgend op verzameling werden de buisjes op nat ijs geplaatst (maximaal 30 minuten) tot centrifugatie onder koeling (bij 2 tot 8°C) bij 1500 x g gedurende 15 minuten. Elk geoogst plasmamonster werd vervolgens bevroren (-70°C ± 25 10°C) opgeslagen totdat het op RAGE-polypeptide werd getest door het gebruik van een ELISA op verscheidene tijdstippen volgend op de injectie zoals in Voorbeeld 6 is beschreven.

Het kinetische profiel dat in Figuur 12 is getoond onthuld dat indien TTP-4000 eenmaal is verzadigd met de liganden ervan, zoals wordt getoond door de redelijke 30 steile hellingen van de alfa-fase bij 2 dieren, het een terminale halfwaardetijd behoudt van meer dan 300 uur. Deze halfwaardetijd is aanzienlijk hoger dan de halfwaardetijd van humaan sRAGE in plasma (in het algemeen ongeveer 2 uur) en verschaft een mogelijkheid voor enkele injecties voor acute en semi-chronische indicaties. In Figuur 104 12 vertegenwoordigt elke kromme een ander dier onder dezelfde experimentele omstandigheden.

Voorbeeld 4: TTP-4000 Fc-activering 5 Experimenten werden uitgevoerd voor het meten van de activering van de Fc- receptor door RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 in vergelijking met humaan IgG. Activering van de Fc-receptor werd gemeten door het meten van uitscheiding van TNF-α van THP-1-cellen die de Fc-receptor tot expressie brengen. Bij deze experimenten werd een plaat met 96 putjes bekleed met 10 pg/putje TTP-4000 of humaan IgG. Fc stimulatie 10 resulteert in uitscheiding van TNF-α. De hoeveelheid van TNF-α werd gemeten door een enzym-gekoppelde immuun-absorberende test (ELISA).

Bij deze test werd de myeloïde cellijn THP-1 (ATTC # TIB-202) aangehouden in RPMI-1640 media dat is aangevuld met 10% foetaal runderserum volgens instructies van het ATCC. Kenmerkend werden 40.000-80.000 cellen per putje geïnduceerd om 15 TNF-alfa uit te scheiden door middel van stimulatie van de Fc-receptor door de putjes vooraf te bekleden met 10 pg/putje van ofwel door warmte geaggregeerde (63°C gedurende 30 minuten) TTP-4000 of humaan IgGl. De hoeveelheid van TNF-alfa die werd uitgescheiden door de THP-1-cellen werd gemeten in supematanten die van kweken van cellen van 24 uur in de behandelde putjes werden verzameld door het 20 gebruik van een in de handel verkrijgbare TNF ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN # DTA00C) volgens instructies. Resultaten zijn getoond in Figuur 13 waar kan worden gezien dat TTP-4000 minder dan 2 ng/putje TNF en IgG meer dan 40 ng/putje genereerde.

25 Voorbeeld 5: In vivo activiteit van TTP-4000

De activiteit van TTP-4000 werd vergeleken met sRAGE in verscheidene in vivo modellen van humane ziekte.

A. TTP-4000 in een dierlijk model van restenose 30 Het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000 werd beoordeeld in een model van restenose van een diabetische rat dat het meten van proliferatie van gladde spieren en intima uitbreiding 21 dagen volgend op vasculaire schade behelsde. Bij deze experimenten werd een schade van de linker algemene halsslagader door een ballon uitgevoerd bij 105

Zucker diabetische en niet-diabetische ratten door het gebruik van een standaard werkwijze. Een loading-dosis (3 mg/rat) van IgG, TTP-4000 of fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) werd één dag voorafgaand aan de schade intraperitoneaal (IP) toegediend. Een onderhoudsdosis werd om de dag afgeleverd tot dag 7 na schade 5 (d.w.z. op dagen 1, 3, 5 en 7 na schade). De onderhoudsdosis was hoog = 1 mg/dier voor één groep of laag = 0,3 mg/dier voor de tweede groep. Voor het meten van de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen (VSMC) werden dieren 4 dagen en 21 dagen na de schade opgeofferd.

Voor de meting van celproliferatie kregen dieren na 4 dagen een intraperitoneale 10 injectie van broomdeoxyuridine (BrDdU) 50 mg/kg op 18, 12 en 2 uur voorafgaand aan euthanasie. Na het opofferen werden de gehele linker en rechter halsslagaders geoogst. Monsters werden gedurende tenminste 24 uur in Histochoice opgeslagen voordat de monsters werden ingebed. Bepaling van proliferatie van VSMC werd uitgevoerd door het gebruik van anti-BrdU monoklonaal antilichaam van muis. Een fluorescent 15 gemerkte anti-muis secundair antilichaam van geit werd toegediend. Het aantal BrdU-positieve kernen per coupe werd geteld door twee waarnemers die niet op de hoogte waren van de behandelingsstrategieën.

De resterende ratten werden na 21 dagen opgeofferd voor morfometrische analyse. Morfometrische analysen werden uitgevoerd door een waarnemer die niet op 20 de hoogte was van de groepen die werden bestudeerd, door het gebruik van gecomputeriseerde digitale microscopische planimetrie software Image-Pro Plus op opeenvolgende coupes, (5 mm afstand) halsslagaders gekleurd met Van Gieson kleuring. Alle gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Statistische analyse werd uitgevoerd met het gebruik van SPSS software. Continue variabelen werden 25 vergeleken door het gebruik van niet-gepaarde t-testen. Een waarde van P < 0,05 werd beschouwd statistisch significant te zijn.

Zoals in Figuren 14A en 14B kan worden gezien verlaagde behandeling met TTP-4000 aanzienlijk de verhoudingen van intima/media en proliferatie van vasculaire gladde spiercellen op een dosis-reagerende wijze. In Figuur 14B vertegenwoordigt de 30 y-as het aantal BrdU prolifererende cellen.

B. TTP4000 in een dierlijk model van AD

106

Experimenten werden uitgevoerd om te beoordelen of TTP-4000 vorming van amyloïde en cognitieve dysfimctie in een model van AD bij muis kon beïnvloeden. De experimenten maakten gebruik van transgene muizen die het humane Swedish mutante amyloïde voorloper-eiwit (APP) tot expressie brachten onder de regulering van de 5 PDGF-B-keten promoter. Gedurende de tijd genereren deze muizen hoge niveaus van het ligand van RAGE, amyloïde bèta (Αβ). Hiervoor is getoond dat behandeling met sRAGE gedurende 3 maanden zowel de vorming van amyloïde plaques in de hersenen en de geassocieerde toename van merkers van ontsteking bij dit model verlaagde.

De APP muizen (mannelijk) die in dit experiment werden gebruikt werden 10 gemaakt door micro-injectie van het humane APP-gen (met de Swedish en London mutaties) in eieren van muis onder de regulering van de promoter van het gen voor van bloedplaatjes afkomstige groeifactor B (PDGF-B) keten. De muizen werden gegenereerd op een C57BL/6 achtergrond en werden ontwikkeld door Molecular Therapeutics Inc. Dieren werden ad libitum gevoerd en aangehouden door kruisingen 15 tussen broers en zusters. De muizen die van dit construct werden gegenereerd ontwikkelden amyloïde afzettingen beginnend op een leeftijd van 6 maanden. Dieren werden tot een leeftijd van 6 maanden gefokt en vervolgens gedurende 90 dagen aangehouden en opgeofferd voor kwantificering van amyloïde.

APP transgene muizen kregen elke andere dag hulpstof of TTP4000 toegediend 20 [qod (i.p.)] gedurende 90 dagen beginnend op een leeftijd van 6 maanden. Aan het einde van het experiment werden dieren opgeofferd en onderzocht op aanwezigheid van Αβ-plaques in de hersenen (d.w.z. aantal plaques). Een controle APP-groep van 6 maanden werd gebruikt voor het bepalen van de basislijn van afzetting van amyloïde. In aanvulling werden de dieren aan het einde van de studie onderworpen aan analyse 25 van het gedrag (Morris water maze (doolhof)). De onderzoekers werden niet op de hoogte gebracht van de verbindingen die werden onderzocht. Monsters werden bij 0,25 ml/muis/elke andere dag aan de muizen gegeven. In aanvulling kreeg één groep van muizen 200 gg/dag humaan sRAGE.

30 1. Afzetting van amyloïde-bèta

Voor histologisch onderzoek werden de dieren verdoofd met een intraperitoneale injectie (IP) van natriumpentobarbital (50 mg/kg). De dieren werd transcardiaal door perfusie behandeld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) van 4°C, gevolgd door 107 4% paraformaldehyde. De hersenen werden verwijderd en gedurende de nacht in 4% paraformaldehyde geplaatst. De hersenen werden opgewerkt naar paraffine en ingebed. Tien opeenvolgende coupes met een dikte van 30 μητ door de hersenen werden verkregen. Coupes werden gedurende de nacht bij 4°C aan primair antilichaam (Αβ 5 peptide antilichaam) onderworpen teneinde de amyloïde afzettingen in de hersenen van de transgene dieren te detecteren (Guo et al, J. Neurosci., 22:5900-5909 (2002)). Coupes werden in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) gewassen en secundair antilichaam werd toegevoegd en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na het wassen werden coupes geïncubeerd zoals wordt geïnstrueerd in de Vector ABC 10 Elite kit (Vector Laboratories) en gekleurd met diaminobenzoëzuur (DAB). De reacties werden gestopt in water en met een dekglaasje bedekt na behandeling met xyleen. Het amyloïde gebied in elke coupe werd bepaald met een computer-geassisteerd beeldanalysesysteem, dat bestaat uit een Power Macintosh computer die is uitgerust met een Quick Capture frame grabber card, Hitachi CCD camera die is bevestigd op 15 een Olympus microscoop en een camera standaard. NIH Image Analysis Software, v.

1.55 werd gebruikt. De beelden werden vastgelegd en het totale gebied van amyloïde werd over de tien coupes bepaald. Een enkele onderzoeker die niet op de hoogte was van elke status van behandeling, voerde alle metingen uit. Het optellen van de amyloïde volumes van de coupes en het delen door het totaal aantal van coupes werd uitgevoerd 20 voor het berekenen van het amyloïde volume.

Voor kwantitatieve analyse werd een enzym-gekoppelde immuun-absorberende test (ELISA) gebruikt voor het meten van de niveaus van humaan totaal Αβ, Αβίοι33ι en Αβι-42 in de hersenen van APP transgene muizen (Biosource International, Camarillo, CA). Αβ(ο&3ΐ en Αβι.42 werden van de hersenen van muis geëxtraheerd door guanidine-25 hydrochloride en gekwantificeerd zoals door de fabrikant is beschreven. Deze test extraheert het totale Αβ peptide van de hersenen (zowel oplosbaar en geaggregeerd).

2. Cognitieve functie

Het testen met de Morris water-maze (doolhof) werd als volgt uitgevoerd: Alle 30 muizen werden eenmaal getest in de Morris water maze (doolhof) test aan het einde van het experiment. Muizen werden in een waterdoolhof met een open veld van 1,2 m getraind. Het bad werd tot een diepte van 30 cm met water gevuld en het water werd op een temperatuur van 25°C gehouden. Het ontsnappingsplatform (10 vierkante cm) werd 108 1 cm onder het wateroppervlak geplaatst. Gedurende de proefnemingen werd het platform van het bad verwijderd. De cued (met aanwijzingen) testen werd uitgevoerd in het bad dat was omgeven met witte gordijnen voor het verbergen van alle extra cues (aanwijzingen) voor het doolhof. Alle dieren ondergingen niet-ruimtelijke 5 voorafgaande training (“non-spatial pretraining”; NSP) gedurende drie opeenvolgende dagen. Deze proefnemingen zijn ervoor om de dieren voor te bereiden op de uiteindelijke gedragstest voor het bepalen van de retentie van geheugen voor het vinden van het platform. Deze proefnemingen werden niet geregistreerd, maar waren alleen voor doeleinden van training. Voor de studies van training en leren werden de 10 gordijnen naar extra cues (aanwijzingen) van het doolhof verwijderd (dit maakte de identificatie mogelijk van dieren met beschadiging van het vermogen van zwemmen). Op dag 1 werden de muizen gedurende 20 seconden op het verborgen platform geplaatst (proefneming 1), gedurende proefnemingen 2-3 werden de dieren op een afstand van 10 cm van het cued (met aanwijzingen) platform of verborgen platform 15 (proefneming 4) los gelaten en werden toegestaan naar het platform te zwemmen. Op de tweede dag van de proefnemingen werd het verborgen platform willekeurig verplaatst tussen het midden van het bad of het midden van elke kwadrant. De dieren werden in het bad los gelaten, willekeurig met de kop naar de wand en werden toegestaan gedurende 60 seconden het platform te bereiken (3 proefnemingen). Bij de 20 derde proefneming, de dieren kregen drie proefnemingen, twee met een verborgen platform en één met een cued (met aanwijzingen) platform. Twee dagen volgend op de NSP werden dieren onderworpen aan de uiteindelijke gedragstesten (Morris water maze (doolhof) test). Voor deze proefnemingen (3 per dier), werd het platform in het midden van één kwadrant van het bad geplaatst en de dieren werden met de kop in de 25 richting van de wand op een willekeurige wijze los gelaten. Het dier werd toegestaan gedurende 60 seconden het platform te vinden of te zwemmen (latentie periode, de tijd die het duurt om het platform te vinden). Alle dieren werden binnen 4-6 uur van dosering getest en door een onderzoeker, die niet op de hoogte was van de testgroepen, willekeurig geselecteerd voor het testen.

30 De resultaten zijn uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardafwijkingen (SD). De significantie van verschillen in de studies van amyloïde en de gedragsstudies werden geanalyseerd door het gebruik van een t-test. Vergelijkingen werden gemaakt tussen de APP controle groep van 6 maanden oude muizen en de met TTP-4000 behandelde 109 dieren alsook een APP met hulpstof behandelde groep en de met TTP-4000 behandelde dieren van 9 maanden oud. Verschillen van lager dan 0,05 werden als significant beschouwd. Percentage veranderingen in amyloïde en gedrag werden bepaald door het optellen van de gegevens van elke groep en het delen door de vergelijking (d.w.z. 1, 5 i.p./6 maanden controle = % verandering).

Figuren 15A en 15B tonen dat muizen die gedurende 3 maanden zijn behandeld met ofwel TTP-4000 of sRAGE van muis minder Αβ-plaques en minder cognitieve dysfunctie hebben dan dieren die zijn behandeld met hulpstof en humaan IgGl (IgGl) dat als negatieve controle dient. Deze gegevens geven aan dat TTP-4000 effectief is in 10 het verlagen van pathologie van AD bij een model van een transgene muis. Het werd ook gevonden dat net zoals sRAGE TTP-4000 de inflammatoire cytokinen IL-1 en TNF-α kan verlagen (gegevens niet getoond).

C. Werkzaamheid van TTP-4000 in een dierlijk model van beroerte 15 TTP-4000 werd ook vergeleken met sRAGE in een ziekte-relevant dierlijk model voor beroerte. Bij dit model werd de middelste halsslagader van een muis gedurende 1 uur geligeerd gevolgd door reperfusie gedurende 23 uur, waarbij op dat punt de muizen werden opgeofferd en het gebied van het infarct in de hersenen werd bepaald. Muizen werden vlak voorafgaand aan reperfusie behandeld met sRAGE of TTP-4000 of 20 controle immunoglobuline.

Bij deze experimenten werden mannelijke C57BL/6 geïnjecteerd met hulpstof bij 250 μΐ/muis of TTP testartikelen (TTP-3000, TTP-4000 bij 250 μΐ/muis). Muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd, 1 uur na de initiatie van ischemie. Muizen werden aan één uur van cerebrale ischemie onderworpen gevolgd door reperfusie gedurende 24 25 uur. Voor het induceren van ischemie werd elke muis verdoofd en de lichaamstemperatuur werd op 36-37°C gehouden door externe verwarming. De linker algemene halsslagader (CCA) werd blootgelegd door een insnijding in de middellijn in de nek. Een microchirurgische klem werd rond de oorsprong van de arterie carotis interne (ICA) geplaatst. Het distale uiteinde van de ECA werd met zijde geligeerd en 30 dwars doorgesneden. Een 6-0 zijde werd losjes rond het stompje van ECA geknoopt. Het door vuur gepolijste uiteinde van een nylonhechtdraad werd voorzichtig in het ECA stompje geïnsereerd. De lus van de 6-0 zijde werd strak getrokken rond het stompje en de hechtdraad van nylon werd verder in en door de interne halsslagader 110 (ICA) gebracht totdat het in de anterieure cerebrale arterie was geplaatst waardoor de voorste communicerende en middelste hersenslagader werden afgesloten. Nadat de hechtdraad van nylon gedurende 1 uur was ingebracht werd het dier opnieuw verdoofd, werd de rectale temperatuur geregistreerd en werd de hechtdraad verwijderd en de 5 insnijding gesloten.

Het volume van het infarct werd bepaald door het verdoven van de dieren met een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (50 mg/kg) en vervolgens het verwijderen van de hersenen. De hersenen werden vervolgens in vier coupes van 2 mm gesneden door het gebied van het infarct en gedurende 30 minuten in 2% 10 trifenyltetrazoliumchloride (TTC) geplaatst. Daarna werden de coupes gedurende de nacht in 4% paraformaldehyde geplaatst. Het gebied van het infarct in elke coupe werd bepaald met een computer-geassisteerd beeldanalysesysteem dat bestaat uit een Power Macintosh computer die is uitgerust met een Quick Capture frame grabber card, Hitachi CCD camera die is bevestigd op een camerastandaard. NIH Image Analysis Software, 15 v. 1.55 werd gebruikt. De beelden werden vastgelegd en het totale gebied van het infarct werd over de coupes bepaald. Een enkele onderzoeker die niet op de hoogte was van de status van behandeling, voerde alle experimenten uit. Door het optellen van de volumes van het infarct van de coupes werd het totale volume van het infarct berekend. De resultaten zijn uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardafwijking (SD). De 20 significantie van het verschil van de gegevens van het volume van het infarct werden geanalyseerd door het gebruik van een t-test.

Zoals door de gegevens in Tabel 2 is geïllustreerd was TTP-4000 meer werkzaam dan sRAGE bij het beperken van het gebied van het infarct bij deze dieren, dat suggereert dat TTP-4000, vanwege de betere halfwaardetijd ervan in plasma, in staat 25 was een betere bescherming aan te houden bij deze muizen.

Voorbeeld 6: Detectie van RAGE-fusie-eiwit door ELISA

Eerst werd 50 μΐ van het RAGE-specifieke monoklonale antilichaam 1HB1011 bij een concentratie van 10 pg/ml in IX PBS pH 7,3 bekleed op platen door middel van 30 incubatie gedurende de nacht. Wanneer ze klaar zijn voor gebruik werden de platen drie keer gewassen met 300 μΐ van IX imidazool-Tween wasbuffer en geblokkeerd met 1% BSA. De monsters (verdund) en standaardverdunningen van bekende verdunningen van TTP-4000 worden bij een uiteindelijk volume van 100 μΐ toegevoegd. De monsters

Ill worden toegestaan gedurende één uur bij kamertemperatuur te incuberen. Na incubatie worden de platen drie keer gewassen. Een anti-humaan IgGl 1 (Sigma A3312) AP conjugaal van geit in 1XPBS met 1% BSA wordt toegevoegd en toegestaan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te incuberen. De platen worden drie keer gewassen. Kleur 5 wordt ontwikkeld met paranitrofenylfosfaat.

Voorbeeld 7: Kwantificering van binding van ligand van RAGE aan RAGE-fusie-eiwit

Figuur 16 toont de krommes van verzadigende binding van TTP-4000 aan 10 verscheidene geïmmobiliseerde bekende liganden van RAGE. De liganden zijn geïmmobiliseerd aan een microtiterplaat en in de aanwezigheid van toenemende concentraties van RAGE-fusie-eiwit van 0 tot 360 nM geïncubeerd. De interactie van RAGE-fusie-eiwit - ligand wordt gedetecteerd door het gebruik van een polyklonaal antilichaam dat is geconjugeerd met alkalische fosfatase, dat specifiek is voor het IgG 15 deel van de fusiechimeer. Relatieve Kds werden berekend door het gebruik van Graphpad Prizm software en komen overeen met de in de literatuur vastgestelde waarden voor waarden van RAGE-ligand van RAGE. HMG1B = Amfoterine, CML = Carboxymethyllysine, A bèta = Amyloïde bèta 1 -40.

20 Voorbeeld 8: Gebruik van RAGE-fusie-eiwit voor het voorkomen van allogene transplantaatafstoting

Het kan worden verwacht dat blokkade van RAGE de allogene transplantaatafstoting blokkeert. Deze experimenten onderzochten of blokkade van interacties van ligand-RAGE door het gebruik van een RAGE-fusie-eiwit van de uitvinding afstoting 25 van cellen van eilandjes, die zijn getransplanteerd van een gezonde donor naar een diabetisch dier, zou verzwakken zoals wordt gemeten door de tijdsduur waarbij de getransplanteerde dieren een glucoseniveau van het bloed onder een doelwit-concentratie kunnen aanhouden. Zoals hierin is besproken werd het gevonden dat toediening van een RAGE-fusie-eiwit (bijvoorbeeld TTP-4000) aan diabetische dieren 30 die transplantaties van cellen van eilandjes hadden gekregen aanzienlijk de terugkeer van hyperglycemie vertraagde en aldus afstoting van getransplanteerde cellen van eilandjes bij twee (allogene en syngene) modellen van dieren van transplantatie.

112 A. Allogene transplantatie van eilandjes bij muizen

Bij de eerste set van experimenten werd getest of toediening van een RAGE-fusie-eiwit (TTP-4000) de allogene afstoting van getransplanteerde cellen van eilandjes en de terugkeer van diabetes bij een model van diabetes van een C57BL/6J (B6) muis 5 zou kunnen moduleren.

Dierlijk model van diabetes C57BL/6J (6-8 weken oud) (B6) muizen werden diabetisch gemaakt door een enkele intraveneuze injectie van streptozotocine (STZ) (Sigma Chemical Co., St. Louis, 10 MO) bij 200 mg/kg. BALB/cJ (6-8 weken oud) (BALB) muizen dienden als donoren voor de transplantatie van eilandjes waardoor aldus een allogene mismatch voor transplantatie van eilandjes wordt verschaft.

Isolatie van eilandjes 15 Muizen (BALB/c) werden verdoofd met ketamine HCl/xylazine HC1 oplossing (Sigma, St. Louis MO). Na intraductale injectie van 3 ml van koude Hank’s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS, Gibco, Grand Island, NY) die 1,5 mg/ml collagenase P (Roche Diagnostics, Branchburg, NJ) bevat, werden alvleesklieren chirurgisch verkregen en gedurende 20 minuten bij 37°C gedigereerd. De eilandjes 20 werden gewassen met HBSS en gezuiverd door discontinue gradiëntcentrifugatie door het gebruik van Polysucrose 400 (Cellgro, Hemdon VA) die vier verschillende dichtheden heeft (26%, 23%, 20% en 11 %). De weefselfragmenten op het raakvlak van de 20% en 23% lagen werden verzameld, gewassen en geresuspendeerd in HBSS. Afzonderlijke eilandjes die vrij zijn van verbonden acinaire, vasculaire en ductale 25 weefsels werden zorgvuldig gekozen onder een omgekeerde microscoop, waarbij sterk gezuiverde eilandjes voor transplantatie worden geleverd.

Transplantatie van eilandjes

Streptozotocine-geïnduceerde diabetische C57BL/6 (B6) muizen kregen binnen 2 30 dagen van de diagnose van diabetes transplantaten van eilandjes. BALB/cJ (6-8 weken oud) (BALB) muizen dienden als donors voor allogene transplantatie van eilandjes. Voor transplantatie werden 500-600 vers geïsoleerde eilandjes (d.w.z. bij benadering 113 550 eilandjes equivalenten) van donormuizen genomen met een infusieset en getransplanteerd in de subcapsulaire ruimte van de rechter nier van een ontvanger.

Behandeling met testverbindingen 5 Testverbindingen werden toegediend op het moment dat de eilandjes werden getransplanteerd; toediening werd gedurende ongeveer 60 dagen voortgezet, afhankelijk van hoe het controle dier zich gedraagt. Muizen werden met 0,25 ml van ofwel fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), TTP-4000 in PBS of IgG in PBS geïnjecteerd volgens de strategie hieronder (Tabel 3).

10 Tabel 3

Toediening van testverbindingen en/of hulpstof

Testgroep Aantal muizen Loading-dosis Onderhoudsdosis Strategie

Onbehandelde 8 controle

Controle met 8 0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag

hulpstof op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 60 dagen; IP

(PBS)

TgG 8 (300 pg) (100 pg) (100 pg)

0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 60 dagen; IP

TTP-4000 8 (300 pg) (100 pg) (100 pg)

0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 60 dagen; IP

TTP-4000 8 (300 pg) (30 pg) (30 pg)

0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 60 dagen; IP

Het volgen van de functie van het transplantaat van eilandjes

Het functioneren van het transplantaat van de eilandjes werd gevolgd door het 15 dagelijks opeenvolgend meten van glucose van het bloed gedurende de eerste 2 weken na transplantatie van de eilandjes, gevolgd daarna door om de dag te meten. Omkeer van diabetes werd gedefinieerd als het bloed een glucoseniveau heeft van lager dan 200 mg/dl bij twee opeenvolgende metingen. Verlies van het transplantaat werd bepaald wanneer glucose van het bloed 250 mg/dl overschrijdt bij twee opeenvolgende 20 metingen. De resultaten zijn in Tabel 4 getoond.

114

Tabel 4

Effecten van TTP-4000 op transplantatie van allogene transplantatie van eilandjes*

TTP-4000 TTP-4000 ïgG

300 μg LD + 300 μg + 30 300 μg LD + Niet- 100 μg qod ip PBS μg qod ip 100 pg qod ip behandelde (Groep 1) (Groep 2) (Groep 3) (Groep 4) controle Ï4 9 13 8 9 16 8 14 9 8 13 ÏÖ Ï2 TÖ 9 13 8 12 8 ÏÖ Ï2 Π Π 8 9 16 8 Π 8 8 15 8 8 9 ÏÏ 14 8 8 Π 9 7 9 - 9

Gemiddelde Ï4ÏÏ25 8/75 11,125 8,875 8,833333 ~SD 1,457738 1,164965 2,167124 1,125992 1,029857 "ö 8 8 8 8 Ï2 * Waarden in Tabel 4 weerspiegelen de dag van verlies van transplantaat voor elk dier 5 zoals wordt gedefinieerd door terugkeer van verhoogde niveaus van glucose in het bloed

De effecten van het toedienen van TTP-4000 op afstoting van allogene transplantaten van eilandjes van BALB/c in B6-muizen zijn getoond als een Kaplan-10 Meier Cumulative overlevingsgrafiek in Figuur 17. Het kan worden gezien dat er een toename is in de tijd voordat falen van het transplantaat wordt gedetecteerd voor dieren die zijn behandeld met TTP-4000 (Groepen 1 en 3) in tegenstelling tot dieren die in het geheel niet zijn behandeld (Controle) of dieren die zijn behandeld met de hulpstof (PBS) of humaan IgGl. Door het gebruik van een verscheidenheid van statistische 15 analysen (Mantel-Cox Logrank, Breslow-Gehan-Wilcoxon; Tarone-Ware, Peto-Peto-Wilcoxin; en Harrington-Fleming) waren de verschillen tussen de Controle en TTP-4000 (Groepen 1 en 3) significant (Tabel 5).

115

Tabel 5

Statistische werkwijze Controle versus Groep 1 Controle versus Groep 3 (TTP-4000) (TTP-4000)

Chi-square DF* P-waarde Chi-square DF P-waarde Logrank (Mantel-Cox) 18,777 ï <0,0001 7,662 ï 0,0056

Breslow-Gehan-Wilcoxon 15,092 1 0,0001 4,904 1 0,0268

Tarone-Ware 16,830 ï <0,0001 6,212 ï 0,0127

Peto-Peto-Wilcoxon 14,359 ï 0,0002 4,315 ï 0,0378

Harrington-Fleming (rho = 0,5) 16,830 1 <0,0001 6,212 1 0,0127 * Vrijheidsgraden 5 B. Transplantatie van eilandjes bij NOD-muizen als een model van auto-immuunziekte

Bij de tweede set van experimenten werd getest of toediening van RAGE-fusie-eiwit (d.w.z. TTP-4000 of TTP-3000) het verloop van terugkerende diabetes bij NOD-muizen zou moduleren door het gebruik van een syngeen NOD model van 10 transplantatie.

Dierlijke modellen van diabetes

Spontane auto-immuun niet-zwaarlijvige diabetische muizen (NOD/LtJ) (12-25 weken oud) dienden als ontvangers van cellen van eilandjes, terwijl jonge pre-15 diabetische NOD/LtJ muizen (6-7 weken oud) als donoren dienden bij syngene transplantatie van eilandjes. Eilandjes voor transplantatie werden geïsoleerd zoals hierboven is beschreven in Deel A (Allogene transplantatie van eilandjes).

Transplantatie van eilandjes: 20 Diabetische NOD/LtJ muizen kregen transplantaten van eilandjes binnen 2 dagen van de diagnose van diabetes. 500-600 vers geïsoleerde eilandjes (bij benadering 550 eilandjes equivalenten) van donormuizen werden met een infusieset genomen en getransplanteerd in de subcapsulaire ruimte van de rechter nier.

25 Behandeling met testverbindingen 116

Testverbindingen werden op het moment dat de eilandjes werden getransplanteerd toegediend en toediening werd gedurende bij benadering 8 weken voortgezet. Muizen werden met 0,25 ml van ofwel PBS, TTP-4000 in PBS of TTP-3000 in PBS geïnjecteerd volgens de strategie die hieronder uiteengezet is (Tabel 6).

5

Tabel 6

Groep Aantal muizen Volume Volume Strategie loading-dosis onderhoudsdosis TTP-4000 8 (300 pg) (100 pg) (100 pg)

0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 8 weken; IP

TTP-3000 8 (300 pg) (100 pg) (100 pg)

0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 8 weken; IP

PBS 8 0,25 ml/dosis/muis 0,25 ml/dosis/muis Eenmaal om de dag

op dag 1 beginnend op dag 2 (QOD) x 8 weken; IP

Het volgen van de functie van het transplantaat van eilandjes

Het functioneren van het transplantaat van de eilandjes werd gevolgd door het 10 dagelijks opeenvolgend meten van glucose van het bloed gedurende de eerste 2 weken na transplantatie van de eilandjes, gevolgd daarna door om de dag te meten. Omkeer van diabetes werd gedefinieerd als het bloed een glucoseniveau heeft van lager dan 200 mg/dl bij twee opeenvolgende metingen. Verlies van het transplantaat werd bepaald wanneer glucose van het bloed 250 mg/dl overschrijdt bij twee opeenvolgende 15 metingen. De resultaten zijn in Tabel 7 getoond.

Tabel 7

Effecten van TTP-4000 en TTP-3000 op terugkeer van diabetes bij syngene transplantatie van eilandjes bij NOD-muizen* TTP-4000 TTP-3000 Controle 300 pg LD + 100 pg 300 pg + qod ip (Groep 1) 100 pg qod ip (Groep 2) 35 44 23 38 46 25 4Ö 42 26 43 41 22 36 34 22 117 45 32 24 44 30 Tl 38 20 22 _ 24

Gemiddelde 39,875 38,42857 22,727273 ~SD 3,758324 6,32079 1,8488326 ~ü 8 7 Π * Waarden weerspiegelen de dag van ver ies van transplantaat voor elk dier zoals wordt gedefinieerd door terugkeer van verhoogde niveaus van glucose in het bloed

De effecten van het toedienen van TTP-4000 op afstoting van syngeen 5 getransplanteerde eilandjes bij diabetische NOD-muizen zijn getoond als een Kaplan-Meier Cumulative overlevingsgrafiek in Figuur 18. Zoals in de gegevens in Tabel 7 is getoond was er een toename van de tijd voordat falen van het transplantaat wordt gedetecteerd voor dieren die zijn behandeld met TTP-4000 (Groep 1) en TTP-3000 (Groep 2) in tegenstelling tot dieren die in het geheel niet zijn behandeld (Controle). 10 Figuur 18 toont de toename in de tijd voorafgaand aan detectie van falen van het transplantaat voor dieren die zijn behandeld met TTP-4000 (Groep 1) en dieren die in het geheel niet zijn behandeld. Door het gebruik van een verscheidenheid van statistische analysen (Mantel-Cox Logrank, Breslow-Gehan-Wilcoxon; Tarone-Ware, Peto-Peto-Wilcoxin; Harrington-Fleming) werd getoond dat de verschillen tussen de 15 Controle en TTP-4000 (Groep 1) en de Controle en TTP-3000 (Groep 2) significant zijn (Tabel 8).

Tabel 8

Statistische werkwijze Controle versus Groep 1 Controle versus Groep 2 (TTP-4000) (TTP-3000)

Chi-square DF* P-waarde Chi-square DF P-waarde Logrank (Mantel-Cox) 18,410 1 <0,0001 16,480 1 <0,0001

Breslow-Gehan-Wilcoxon 14,690 1 0,0001 12,927 1 0,0001

Tarone-Ware 16,529 ï <0,0001 14,686 ï 0,0001

Peto-Peto-Wilcoxon 14,812 1 0,0001 13,027 1 0,0003

Harrington-Fleming (rho = 0,5) 16,529 1 <0,0001 14,686 1 0,0001 * Vrijheidsgraden 118

Voorbeeld 9 - Gevriesdroogd preparaat van RAGE-fusie-eiwit

Bij de ontwikkeling van een gevriesdroogd preparaat door het gebruik van het RAGE-fusie-eiwit TTP-4000, werden beschermende middelen voor vriesdrogen en buffers eerst gescreend door het meten van de stabiliteit van het eiwit na vriesdrogen en 5 reconstitutie. Het gevriesdroogde eiwit in elk preparaat werd ook onderworpen aan versnelde stabiliteitsstudies voor het bepalen van de mogelijke stabiliteit van het eiwit gedurende de houdbaarheid ervan.

Bij initiële studies van screening werden experimenten ontworpen voor het beoordelen van de omstandigheden van bereiding die geschikte oplosbaarheid en 10 stabiliteit zouden kunnen verschaffen voor TTP-4000 dat wordt bereid als een bevroren hoeveelheid en die gereconstitueerde preparaten verschaffen die concentraties van het RAGE-fusie-eiwit hebben bij ongeveer 50 mg/ml of hoger. Preparaten die natrium-acetaat, natriumcitraat, natriumfosfaat, natriumsuccinaat, histidine en natriumchloride bevatten werden tezamen met sucrose en mannitol getest. Verscheidene pH’s tussen 5,5 15 en 7,0 werden ook beoordeeld.

De biofysische en chemische stabiliteit van TTP-4000 werd beoordeeld door het gebruik van chromatografie met uitsluiting op grootte (SEC), SDS-PAGE, Fourier-Transform Infrarood Spectroscopie (FTIR), circulair dichroïsme (CD), peptide-mapping en ultraviolette - zichtbare absorptie (UV-Vis).

20 Op basis van de oplosbaarheid van het RAGE-fusie-eiwit in preparaten die één of meer van natriumcitraat, histidine, sucrose, mannitol en Tween 80 bevatten bij een pH van 7,0 of lager, werden preparaten die één of meer van deze buffers, beschermende middelen voor vriesdrogen of oppervlakte-actieve stoffen bevatten, gekozen voor verdere studie.

25

Voorbeeld 10 - Gevriesdroogd preparaat van RAGE-fusie-eiwit.

Op basis van de informatie die in Voorbeeld 9 is verzameld werden aanvullende preparaten voor TTP-4000 onderzocht. De studies waren gericht op het identificeren van de buffers en/of beschermende middelen voor vriesdrogen die bruikbaar zijn voor 30 het aanhouden van een stabiel product door middel van de werkwijze van het vriesdrogen en het mogelijk verkrijgen van een hoge concentratie van TTP-4000 tijdens reconstitutie (d.w.z. van ongeveer of hoger dan 50 mg/ml). Zes preparaten werden onderzocht gedurende een versnelde stabiliteitstudie van 2 weken. De preparaten zijn 119 samengevat in Tabel 9. Studies waren ook gericht op het ontwikkelen van een cyclus van vriesdrogen voor hogere doses van TTP-4000 (250 mg) zoals hieronder is beschreven.

Volgend op vriesdrogen werden de monsterbuisjes voor ontwikkeling van het 5 preparaat door smelten afgesloten en gedurende 2 weken in een kamer van 40°C geplaatst. De monsters voor het ontwikkelen van opschaling werden bij 2-8°C opgeslagen tot het testen werd uitgevoerd.

Werkwijzen voor analyse van het monster 10 De concentratie van TTP-4000 in monsters werd gemeten door UV-Vis spectrofotometrie. Een Aglient UV-Vis werd gebruikt voor het verkrijgen van eiwit-spectra alsook spectra van buffer als blanco. Eenmaal verkregen werden de waarden van absorptie gecorrigeerd voor elke verstrooiing van licht die kan optreden als een resultaat van elke eiwitaggregatie.

15 Resterend vocht werd geanalyseerd door het gebruik van een Karl Fisher titratiewerkwijze. Gevriesdroogde monsters voor het ontwikkelen van een preparaat werden met de juiste hoeveelheid WFI gereconstitueerd. De tijd van reconstitutie werd beschouwd de tijd te zijn vanaf het moment dat het water werd toegevoegd tot het tijdstip dar er geen zichtbare vaste stoffen aanwezig waren. De pH van elk monster 20 werd na reconstitutie gemeten door het gebruik van een juist gecalibreerde semi-micro probe.

Chromatografie met uitsluiting op grootte (SEC) werd uitgevoerd door het gebruik van een TSKgel Super SW2000 kolom voor het analyseren of volgen van de fysische stabiliteit (afbraak en vorming van oplosbare aggregaten) van TTP-4000 25 gedurende het vriesdrogen en opslag onder versnellende omstandigheden. Monsters werden in een Aglient 1100 serie LC die is uitgerust met twee TSKgel Super SW2000, 4,6 x 300 mm, 4 pm kolommen (Tosoh Bioscience, 18674) geïnjecteerd.

Voor het meten van de deeltjestelling werd een monster van 1 ml 20-voudig verdund in 20 ml. Het monster werd ontgast door sonicatie gedurende ongeveer 30 30 seconden en door voorzichtig handmatig te zwenken zonder belletjes te introduceren. Drie hoeveelheden, elk met een volume van 5 ml, werden afgenomen in de licht-verduisterde tellersensor. Bij de instelling van de inrichting op een cumulatieve wijze 120 werden deeltjes verzameld bij instellingen van groter of gelijk aan 10 μιη en groter of gelijk aan 25 μηι.

Resultaten: 5 Op basis van de studies van voorafgaande bereiding van Voorbeeld 9 werden initieel twee buffers onderzocht: natriumcitraat en L-histidine. De geconcentreerde preparaten 1-6 (Tabel 9) werden bereid door concentrators voor in de centrifuge. De uiteindelijke eiwitconcentratie in de preparaten 1-6 in Tabel 9 was in een traject van tussen ongeveer 4-15 mg/ml.

10

Tabel 9. Preparaten van TTP-4000

Natriumcitraat Histidine Sucrose Mannitol Tween 80 pH

(mM) (mM) (mM) (mM) (%) ~ ÏÖ 6Ö 6^0 ~2 ÏÖ 30 5Ö 1 ÏÖ 6Ö êTÖI 6fi ~4 ÏÖ 6Ö 1 ÏÖ 3Ö 5Ö

“6 ÏÖ 60 (VH M

Door het gebruik van preparaten 1-6 in Tabel 9, werden buisjes (2 ml) gebruikt met volumes voor het vullen van 0,7 ml. De ruimte boven de vloeistof (“headspace”) in 15 het buisje werd gevuld met lucht. Voorafgaand aan drogen werden monsters bevroren bij een temperatuur van opslag van tussen -50°C tot -20°C gedurende bij benadering 12 uur. De monsters werden gedroogd bij een verlaagde druk van 100 mTorr en een temperatuur van opslag van -20°C en -10°C gedurende bij benadering 36 uur, gevolgd door een temperatuur van opslag van 20°C gedurende bij benadering 12 uur. Volgend 20 op vriesdrogen werden deksels op de buisjes geplaatst en werd de bovenkant gesmolten. Stevige koeken werden van elk van de preparaten 1-6 geproduceerd.

De gevriesdroogde producten werden aan versnelde stabiliteitstudies onderworpen teneinde de chemische stabiliteit van de preparaten vast te stellen. De gevriesdroogde producten werden gedurende 2 weken bij opslag bij 40°C en 75% 25 relatieve vochtigheid geplaatst.

121

De gevriesdroogde producten werden gereconstitueerd met 0,206 ml WFI. Alle gevriesdroogde producten werden binnen 20 seconden of korter gereconstitueerd. De pH bleef constant bij alle gereconstitueerde preparaten gedurende de periode van opslag van 2 weken. Waarden van resterend vocht die voor de gevriesdroogde 5 producten werden bepaald op tijdstip 0 en 2 weken waren tussen 3,0% en 0,8% en toonden dat cyclus van vriesdrogen in staat was om op voldoende wijze de preparaten van voorafgaand aan vriesdrogen te drogen. De osmolariteit van alle gereconstitueerde preparaten was binnen een gewenst isotonisch traject tussen 250 mOsm/kg en 400 mOsm/kg (zie Tabel 10). De viscositeit van elk gereconstitueerd preparaat was lager 10 dan 3,7 cP (centiPoise).

Tabel 10. Gereconstitueerde preparaten van TTP-4000 en osmolariteit

Natriumcitraat Histidine Sucrose Mannitol Tween 80 Osmolariteit (mM) (mM) (mM) (mM) (%) (mOsm/kg) 1 ÏÖ 6Ö 322 ~2 ÏÖ 30 50 385 1 ÏÖ 6Ö ÖTÏÏÏ 324 ~4 IÖ 60 264 ~5 ÏÖ 3Ö 50 336 “6 ÏÖ 6Ö Ö7Ö1 262 SEC-analyse werd uitgevoerd op monsters van preparaat 5 in Tabel 10 die op 15 verscheidene stappen gedurende de werkwijze van vriesdrogen zijn genomen en geven aan dat bij deze preparaten TTP-4000 niet in het bijzonder gevoelig was voor elk van de stappen van de werkwijze van vriesdrogen op basis van de constante lage niveaus van geaggregeerd materiaal en materiaal dat is afgebroken.

SEC-analyse werd ook uitgevoerd op de preparaten voorafgaand aan vriesdrogen 20 voor het uitvoeren van vriesdrogen alsook op de gereconstitueerde preparaten op het tijdstip nul en na een versnelde stabiliteitstudie van 2 weken. De hoeveelheid van onzuiverheden (aggregaat of afgebroken product) was constant laag (d.w.z. lager dan 4%) Tabel 11).

25 Tabel 11. Gereconstitueerde preparaten van TTP-4000 en % intact eiwit

Natrium- Histidine Sucrose Mannitol Tween 80 % intact % intact eiwit 122 citraat (mM) (mM) (mM) (mM) (%) eiwit (T=0) (T=2 wk) 1 ÏÖ 60 963 973 ~2 ÏÖ 3Ö 5Ö 963 973 1 ÏÖ 6Ö Ö3Ï 963 973 ~4 ÏÖ 6Ö 973 973 ~5 ÏÖ 3Ö 5Ö 97Ï9 963 "6 ÏÖ 6Ö Ö3Ï 973 963

Peptide mapping onthulde geen oxidatie of deaminatie van TTP-4000 door vriesdrogen of opslag onder versnellende omstandigheden.

SDS-PAGE werd uitgevoerd op preparaten 1, 3, 4 en 6 en toonde dat TTP-4000 5 fysische stabiliteit behield gedurende de werkwijze van vriesdrogen en opslag in deze preparaten.

Voor het opschalen van de werkwijze van het vriesdrogen voor gebruik met buisjes voor vriesdrogen van 50 ml en een dosering van 250 mg TTP-4000 werden monsters bereid door de oplossing te concentreren naar 15 mg/ml TTP-4000 door het 10 gebruik van ultrafiltratie en vervolgens de oplossing te diafïltreren tegen 10 mM histidine en 65 mM sucrose bij pH 6,0- Tween 80 werd tot een uiteindelijke hoeveelheid van 0,01% (vol/vol) toegevoegd.

Het preparaat voorafgaand aan vriesdrogen (16,67 ml) werd aan elk buisje van 50 ml toegevoegd. De monsters werden blootgesteld aan een cyclus van vriesdrogen 15 waarbij de monsters gedurende 30 minuten bij een temperatuur van opslag van tussen 5°C en -5°C werden afgekoeld, gevolgd door koeling bij een temperatuur van opslag van -50°C gedurende bij benadering 3 uur. De monsters werden gedroogd bij een verlaagde druk van 100 mTorr en een temperatuur van opslag van tussen -20°C en -10°C gedurende bij benadering 34 uur, gevolgd door een temperatuur van opslag van tussen 20 5°C en 20°C gedurende bij benadering 11 uur. Volgend op vriesdrogen werd een deksel op de buisjes geplaatst en werd de bovenkant dicht gesmolten. Een farmaceutische uitstekende witte koek werd geproduceerd. De koek leek stevig en verloor de structuur ervan niet gedurende de behandeling en opslag.

De concentratie van het gereconstitueerde monster, zoals werd bepaald door 25 absorptie bij 280 nm, was 40,5 mg/ml TTP-4000. Bij aanvullende studies was onder overeenkomstige omstandigheden, de concentratie TTP-4000 in het gereconstitueerde monster constant ongeveer 50 mg/ml.

123

Het gereconstitueerde monster werd gemeten op gehalte van deeltjes na 0, 2 en 6 uur opslag bij kamertemperatuur. De resultaten in Tabel 12 tonen dat het gereconstitueerde monster een lage hoeveelheid van gehalte van uit deeltjes bestaand materiaal had.

5

Tabel 12. Aantal deeltjes gedetecteerd in het gereconstitueerde monster gedurende de opslag

Grootte van deeltjes Tijdstip = 0 Tijdstip = 2 uur Tijdstip = 6 uur Deeltjes per ml > 10 pm 562 368 948 >25 pm 8 Ï6 2Ö

Deeltjes per houder >10pm 2753 1803 4645 >25 pm 39 78 98

Samengevat werd TTP-4000 bereid in citraat- en histidine-buffers die één of 10 meer van sucrose, mannitol en Tween 80 bevatten. Testen toonden dat preparaten die natriumcitraat of histidine bevatten overeenkomstige kenmerken van uitvoering hadden en dat TTP-4000 beter oplosbaar kan zijn in preparaten die histidine bevatten.

Studies voor het verder opschalen waren gericht op preparaten die histidine bevatten. Volgend op een cyclus van vriesdrogen werd de chemische en fysische 15 stabiliteit van TTP-4000 beoordeeld en geen aanzienlijke verschillen tussen de preparaten met histidine werden gedetecteerd. Ook werd mannitol van het preparaat uitgesloten. Het uiteindelijke preparaat dat werd gekozen uit de studie van het ontwikkelen van een preparaat bevatte 10 mM histidine, 60 mM sucrose en 0,01% Tween 80 bij ongeveer pH 6,0. Dit preparaat toonde een superieur vermogen om het 20 TTP-4000 stabiel te houden gedurende het vriesdrogen en de opslag en verschafte ook de hoogste concentratie van TTP-4000 gedurende de studie. Bij de studie van het opschalen werd het niveau van sucrose verhoogd naar 65 mM om de osmolariteit van het preparaat dichter bij de isotoniciteit aan te passen. Gedurende de studie van het opschalen werd het ook gevonden dat het aanhouden van de pH van het preparaat van 25 TTP-4000 voorafgaand aan vriesdrogen en gereconstitueerde preparaat op of vlakbij pH 6,0 en lager dan 6,7 een bruikbare pH was voor het verlagen van precipitatie of aggregatie van het eiwit.

Het voorgaande wordt alleen als illustratief voor het principe van de uitvinding beschouwd. Omdat voor de deskundigen in het vakgebied talrijke modificaties en 124 veranderingen eenvoudig duidelijk kunnen zijn, is het niet de bedoeling om de uitvinding te beperken tot de exacte uitvoeringsvormen zoals ze zijn getoond en zijn beschreven en alle geschikte modificaties en equivalenten die binnen de beschermings-omvang van de bijgevoegde conclusies vallen worden beschouwd binnen het concept 5 van de onderhavige uitvinding te vallen.

Claims (55)

1. Preparaat dat een gevriesdroogd mengsel van een beschermend middel voor vriesdrogen, een RAGE-fusie-eiwit en een buffer omvat, waarbij het RAGE-fusie-eiwit 5 de aminozuursequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ TD NO: 36, zonder de C-eindstandige lysine.

2. Preparaat dat een gevriesdroogd mengsel van een beschermend middel voor vriesdrogen, een RAGE-fusie-eiwit en een buffer omvat, waarbij het RAGE-fusie-eiwit 10 de aminozuursequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 36.

3. Preparaat volgens conclusie 1 of 2, waarbij het beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker omvat.

4. Preparaat volgens conclusie 3, waarbij de niet-reducerende suiker tenminste één van sucrose, mannitol of trehalose omvat.

5. Preparaat volgens conclusie 1 of 2, waarbij de buffer histidine omvat.

6. Preparaat volgens conclusie 1 of 2, dat verder tenminste één van een oppervlakte-actieve stof, een chelerend middel of een volume-vormend middel omvat.

7. Gereconstitueerd preparaat dat een gevriesdroogd RAGE-fusie-eiwit gereconstitueerd in een verdunningsmiddel omvat, waarbij de concentratie van het

8. Gereconstitueerd preparaat dat een gevriesdroogd RAGE-fusie-eiwit gereconstitueerd in een verdunningsmiddel omvat, waarbij de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat binnen het traject is van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml, en waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 36.

9. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 7 of 8, waarbij het 5 verdunningsmiddel water voor injectie (WFT) omvat.

10. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 7 of 8, waarbij het gereconstitueerde preparaat geschikt is voor subcutane of intramusculaire toediening.

11. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 7 of 8, waarbij het gereconstitueerde preparaat isotonisch is.

12. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 7 of 8, waarbij het preparaat ongeveer 1-400 mg/ml van het RAGE-fusie-eiwit; ongeveer 1 mM tot ongeveer 100 15 mM histidine-buffer; ongeveer 60 mM tot ongeveer 65 mM sucrose; en ongeveer 0,001% tot ongeveer 0,05% Tween 80; omvat en een pH van ongeveer 6,0 tot 6,5 heeft.

13. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 7 of 8, waarbij het preparaat ongeveer 40-50 mg/ml van het RAGE-fusie-eiwit; ongeveer 10 mM histidine; en 20 ongeveer 65 mM sucrose; ongeveer 0,01% Tween 80 omvat; en een pH van ongeveer 6,0 heeft.

14. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 7 of 8, waarbij het preparaat minder dan 5% afbraak na 1 week bij 40 graden Celsius vertoont. 25

15. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 7 of 8, waarbij minder dan ongeveer 10% van het RAGE-fusie-eiwit aanwezig is als een aggregaat in het preparaat na reconstitutie.

16. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 7 of 8, waarbij het gevriesdroogde preparaat van het RAGE-fusie-eiwit een beschermend middel voor vriesdrogen omvat.

17. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 16, waarbij het beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker omvat.

18. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 17, waarbij de niet-5 reducerende suiker tenminste één van sucrose, mannitol of trehalose omvat.

19. Gereconstitueerde preparaat volgens conclusie 7 of 8, waarbij het gevriesdroogde preparaat van het RAGE-fusie-eiwit tenminste één van een buffer, een oppervlakte-actieve stof, een chelerend middel of een volume-vormend middel omvat. 10

20. Voorwerp dat een houder omvat die een gevriesdroogd RAGE-fusie-eiwit en instructies voor het reconstitueren van het gevriesdroogde preparaat met een verdunningsmiddel bevat en waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 36, zonder de C-eindstandige lysine. 15

21. Voorwerp dat een houder omvat die een gevriesdroogd RAGE-fusie-eiwit en instructies voor het reconstitueren van het gevriesdroogde preparaat met een verdunningsmiddel bevat en waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 36. 20

22. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij het verdunningsmiddel water voor injectie (WFI) omvat.

23. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij het gereconstitueerde 25 preparaat geschikt is voor subcutane of intramusculaire toediening.

24. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij het gereconstitueerde preparaat isotonisch is.

25. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij door reconstitutie volgens de instructies, het preparaat ongeveer 1-400 mg/ml van het RAGE-fusie-eiwit; ongeveer 1 mM tot ongeveer 100 mM histidine buffer; ongeveer 60 mM tot ongeveer 65 mM sucrose; en ongeveer 0,001% tot ongeveer 0,05% Tween 80 omvat; en een pH van ongeveer 6,0 tot 6,5 heeft.

25 RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat binnen het traject is van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml, en waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 36, zonder de C-eindstandige lysine.

26. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij door reconstitutie het 5 preparaat ongeveer 40-50 mg/ml van het RAGE-fusie-eiwit; ongeveer 10 mM histidine; ongeveer 65 mM sucrose; en ongeveer 0,01% Tween 80 omvat; en een pH van ongeveer 6,0 heeft.

27. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij de instructies voor het 10 reconstitueren van het gevriesdroogde preparaat zijn, zodanig dat de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat in het traject is van ongeveer 40 mg/ml tot ongeveer 100 mg/ml.

28. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij het gevriesdroogde preparaat 15 steriel is.

29. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, dat verder een tweede houder omvat die een verdunningsmiddel voor het reconstitueren van het gevriesdroogde preparaat bevat, waarbij het verdunningsmiddel water voor injectie (WFI) is. 20

30. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij door reconstitutie volgens de instructies het preparaat minder dan 5% afbraak na 1 week bij 40 graden Celsius vertoont.

31. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij na reconstitutie minder dan ongeveer 10% van het RAGE-fusie-eiwit als een aggregaat in het preparaat aanwezig is.

32. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij het gevriesdroogde materiaal 30 van het RAGE-fusie-eiwit een beschermend middel voor vriesdrogen omvat.

33. Voorwerp volgens conclusie 32, waarbij het beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker omvat.

34. Voorwerp volgens conclusie 32, waarbij de niet-reducerende suiker tenminste één van sucrose, mannitol of trehalose omvat.

35. Voorwerp volgens conclusie 20 of 21, waarbij het gevriesdroogde RAGE- fusie-eiwit tenminste één van een buffer, een oppervlakte-actieve stof, een chelerend middel of een volume-vormend middel omvat.

36. Werkwijze voor het bereiden van een stabiel gereconstitueerd preparaat van 10 een RAGE-fusie-eiwit, die het reconstitueren van een gevriesdroogd mengsel van het RAGE-fusie-eiwit en een beschermend middel voor vriesdrogen in een verdunnings-middel omvat, zodanig dat de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat in een traject is van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml en waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie omvat zoals 15 uiteengezet is in SEQ ID NO: 36, zonder de C-eindstandige lysine.

37. Werkwijze voor het bereiden van een stabiel gereconstitueerd preparaat van een RAGE-fusie-eiwit, die het reconstitueren van een gevriesdroogd mengsel van het RAGE-fusie-eiwit en een beschermend middel voor vriesdrogen in een verdunnings- 20 middel omvat, zodanig dat de concentratie van het RAGE-fusie-eiwit in het gereconstitueerde preparaat in een traject is van ongeveer 1 mg/ml tot ongeveer 400 mg/ml en waarbij het RAGE-fusie-eiwit de aminozuursequentie omvat zoals uiteengezet is in SEQ ID NO: 36.

38. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, waarbij het beschermende middel voor vriesdrogen een niet-reducerende suiker omvat.

39. Werkwijze volgens conclusie 38, waarbij het beschermende middel voor vriesdrogen tenminste één van sucrose, mannitol of trehalose omvat. 30

40. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, waarbij het gevriesdroogde mengsel verder tenminste één van een buffer, een oppervlakte-actieve stof, een chelerend middel of een volume-vormend middel omvat.

41. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, waarbij het gereconstitueerde preparaat ongeveer 40-100 mg/ml van het RAGE-fusie-eiwit; ongeveer 2 mM tot ongeveer 60 mM histidine; ongeveer 60 mM tot ongeveer 65 mM sucrose; en ongeveer 5 0,001 % tot ongeveer 0,05% Tween 80 omvat; en een pH van ongeveer 6,0 tot 6,5 heeft.

42. Werkwijze volgens conclusie 36 of 37, die verder omvat het bereiden van het gevriesdroogde RAGE-fusie-eiwit door het vriesdrogen van een mengsel dat het RAGE-fusie-eiwit en een tegen vriesdrogen beschermende hoeveelheid van een 10 beschermend middel voor vriesdrogen omvat.

43. Preparaat volgens een van de conclusies 1-19, voor de behandeling van een RAGE-bemiddelde stoornis bij een persoon.

44. Preparaat volgens conclusie 43, waarbij het preparaat bedoeld is voor tenminste één van intraveneuze, intraperitoneale of subcutane toediening aan de persoon.

45. Preparaat volgens conclusie 43, voor toepassing bij het behandelen van een 20 symptoom van diabetes of een symptoom van late complicaties van diabetes.

46. Preparaat volgens conclusie 45, waarbij het symptoom van diabetes of late complicaties van diabetes tenminste één van diabetische nefropathie, diabetische retinopathie, een diabetische voetzweer, een cardiovasculaire complicatie of 25 diabetische neuropathie omvat.

47. Preparaat volgens conclusie 43, voor toepassing bij het behandelen van tenminste één van amyloïdoses, ziekte van Alzheimer, kanker, nierfalen of ontsteking geassocieerd met auto-immuniteit, inflammatoire darmziekte, reumatoïde artritis, 30 psoriasis, multipele sclerose, hypoxie, beroerte, hartaanval, hemorrhagische shock, sepsis, orgaantransplantatie of verzwakte genezing van wonden.

48. Preparaat volgens conclusie 43, voor toepassing bij het behandelen van osteoporose.

49. Preparaat volgens conclusie 48, waarbij de behandeling van osteoporose het 5 verhogen van de botdichtheid van de persoon of het verlagen van de snelheid van afname van de botdichtheid van een persoon omvat.

50. Preparaat volgens conclusie 47, waarbij de auto-immuniteit afstoting van tenminste één van huidcellen, alvleeskliercellen, zenuwcellen, spiercellen, endotheel- 10 cellen, hartcellen, levercellen, niercellen, een hart, beenmergcellen, bot, bloedcellen, slagaderlijke cellen, aderlijke cellen, kraakbeencellen, schildkliercellen of stamcellen omvat.

51. Preparaat volgens conclusie 43, voor toepassing bij het behandelen van 15 nierfalen.

52. Preparaat volgens conclusie 43, voor toepassing bij het behandelen van ontsteking en/of afstoting die is geassocieerd met transplantatie van tenminste één van een orgaan, een weefsel of een verscheidenheid van cellen van een eerste plaats naar 20 een tweede plaats.

53. Preparaat volgens conclusie 52, waarbij de eerste en tweede plaatsen bij verschillende personen zijn.

54. Preparaat volgens conclusie 52, waarbij de eerste en tweede plaatsen bij dezelfde persoon zijn.

55. Preparaat volgens conclusie 52, waarbij de getransplanteerde cellen, weefsel of orgaan een cel, weefsel of orgaan van een alvleesklier, huid, lever, nier, hart, 30 beenmerg, bloed, bot, spier, slagader, ader, kraakbeen, schildklier, zenuwstelsel of stamcellen omvat.