CN104072587A - 鱼精蛋白模拟肽及其药用盐与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鱼精蛋白模拟肽及其药用盐与应用。鱼精蛋白模拟肽是由9～20个碱性氨基酸组成的直链多肽，所述碱性氨基酸为精氨酸（Arg，R）、赖氨酸（Lys，K）和组氨酸（His，H）中的一种或多种。经验证，系列鱼精蛋白模拟肽及其药用盐具有鱼精蛋白的功能，在血液中对肝素具有中和与拮抗作用，可替代鱼精蛋白在临床上用于中和与拮抗血液中由肝素引起的出血倾向。

Description

鱼精蛋白模拟肽及其药用盐与应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别是涉及人为设计、人工合成的由碱性氨基酸组成的直链多肽分子（鱼精蛋白模拟肽），该多肽分子具有鱼精蛋白的功能，在血液中对肝素具有中和与拮抗作用，可替代鱼精蛋白在临床上用于消除及中和血液中由肝素引起的出血倾向。 

背景技术

心血管疾病患者在实施心外循环或支架介入的手术之前需向血管中注射抗凝药肝素，以避免在手术过程中产生血栓，但在手术完成后需要及时消除血管中的肝素避免发生流血不止的恶性事件。目前，临床上用于拮抗肝素的唯一药物是鱼精蛋白，但是使用鱼精蛋白具有以下缺点或弊端: 

1、鱼精蛋白是从鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼的成熟精子的细胞核中提取的蛋白，它包含的是一类蛋白分子群，其分子量在8000道尔顿以下，主要分子区间在4000-6000道尔顿范围，因此严格地说鱼精蛋白不是单一分子的纯蛋白制品； 

2、由于鱼精蛋白成品是非均一态的分子群，因此其拮抗肝素的作用量随制备鱼精蛋白的批次不同而不同，其质量难以达到均一性及一致性； 

3、鱼精蛋白是从鱼的成熟精子中提取，从生产原料的资源角度限制并制约了鱼精蛋白的出产。 

4、鱼精蛋白是外源大分子蛋白，人体会对其产生过敏反应，尤其对再次使用鱼精蛋白的病人可能会造成重大医疗事故，存在临床使用的隐患和风险。 

使用鱼精蛋白虽存在缺点或弊端，但到目前为止还未有其它可拮抗肝素的鱼精蛋白替代药物出现。 

发明内容

本发明的目的是提供一系列人为设计、人工合成的由碱性氨基酸组成的直链多肽分子即鱼精蛋白模拟肽，该多肽分子具有鱼精蛋白的功能，在血液中对肝素具有中和与拮抗作用，可替代鱼精蛋白在临床上用于消除及中和血液中由肝素引起的出血倾向。 

本发明提供的鱼精蛋白模拟肽，是由9-20个碱性氨基酸组成的直链多肽，所述碱性氨基酸为选自精氨酸（Arg，R）、赖氨酸（Lys，K）和组氨酸（His，H）中的一种或多种。 

氨基酸为多种时，直链多肽中三种碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸和组氨酸可以在任意位置、以任意比例组合。 

具体的，所述系列鱼精蛋白模拟肽由9～20个单纯精氨酸组成（R9～R20），或由9～20个单纯赖氨酸组成（K9～K20），或由9～20个单纯组氨酸组成（H9～H20）。少于7个氨基酸的肽链没有拮抗肝素的效果，由9个氨基酸组成的肽链开始显示拮抗肝素的活性，且随着氨基酸肽链的延长，拮抗肝素的活性增加。另一方面，肽链拮抗肝素的效果与组成肽链的氨基酸碱性强弱呈正相关的关系，即相同数量的氨基酸肽链，单纯由精氨酸组成的肽链拮抗肝素的效果优于单纯由赖氨酸组成的肽链，单纯由赖氨酸组成的肽链拮抗肝素的效果优于单纯由组氨酸组成的肽链。 

在以上由精氨酸组成的鱼精蛋白模拟肽中以一个组氨酸替换，组氨酸可处于任意位置。组氨酸在肽链所处的位置未对模拟肽拮抗肝素效应有明显的干扰。 

优选的鱼精蛋白模拟肽是由9～20（尤其优选为15）个精氨酸组成的肽链。 

另一优选鱼精蛋白模拟肽是由9～20（尤其优选为15）个精氨酸组成的肽链，但其中任意一个位置可替换成一个组氨酸（基于15个精氨酸的直链长肽，由14个精氨酸和1个组氨酸组成，标记为R15-H）。该模拟肽有利于对该药物分子做同位素（如碘）标记。 

另外，以上所述系列鱼精蛋白模拟肽任何成盐形式的化合物(药用盐)也属于本发明。成盐形式包括无机盐形式，如硫酸盐、醋酸盐、磷酸盐、盐酸盐、碳酸盐等；有机盐形式，如马来酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、磺酸盐、水杨酸盐、苹果酸盐等。系列鱼精蛋白模拟肽的无机、有机酸成盐形式不影响其拮抗肝素的效果。 

本发明另一目的在于提供所述系列鱼精蛋白模拟肽及其成盐形式的化合物在制备拮抗肝素药物中的应用。该药物在临床上用于消除与中和血液中由肝素引起的出血倾向。 

本发明设计、人工合成的由氨基酸组成的直链多肽分子（鱼精蛋白模拟肽）相对鱼精蛋白具有以下优势： 

1、疗效确切：本发明的鱼精蛋白模拟肽及其成盐形式的化合物在血液中对肝素具有中和与拮抗作用； 

2、本发明的鱼精蛋白模拟肽是人为设计的多肽分子，由碱性氨基酸组成，具有明确的氨基酸组成及分子序列，便于人工合成。 

3、本发明的鱼精蛋白模拟肽可通过人工合成的方式在短时间内、大批量、高纯度地制备完成，不仅摆脱了使用天然鱼类资源的问题又满足了临床上大批量需求的需要。 

4、本发明的鱼精蛋白模拟肽的分子量比鱼精蛋白小，其分子量约为1500-3000范围，经高效液相色谱法纯化后肽纯度>99.0％，达到肽类药物制备的国际纯度标准，降低了临床使用的致敏率，因此比使用天然鱼精蛋白具有更高的安全性。 

5、由于本发明的鱼精蛋白模拟肽是由单一分子构成，因此使用剂量将更加严谨和精确，作用更确切。 

试验证明，上述系列鱼精蛋白模拟肽及其任何成盐形式的化合物在血液中对肝素具有中和与拮抗作用，因此，可替代鱼精蛋白，以系列鱼精蛋白模拟肽或其任何成盐形式的化合物为活性成分制备拮抗肝素药物，在临床上用于消除及中和血液中由肝素引起的出血倾向。 

基于上述优势，本发明的鱼精蛋白模拟肽可替代鱼精蛋白在临床上用于消除与中和血液中由肝素引起的出血倾向，在临床上具有独特的作用。 

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 

具体实施方式

生物体的遗传基因被存储在多聚核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们基本上都是由20个自然界存在的天然氨基酸组成。由于氨基酸的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。一般来说，含有50个以上氨基酸的分子被称为蛋白质，一般超过10个氨基酸的肽链被称为多肽，少于10个氨基酸的肽链被称作寡肽。目前发现最小的功能肽链只有2个氨基酸。 

由于人类基因组计划的完成和人类蛋白组计划的开展，已有越来越多的蛋白质功能片段被发现并被作为药物应用到生物医药领域中来。现已在临床上得到应用的多肽药物有“催产素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽链的基础上进行人工改构制备成为用于治疗消化道出血和肢端肥大症的多肽药物“奥曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白质中的功能片段常常能筛选到含有几十个或小到只由二个氨基酸组成的多肽片段，它们为人工合成多肽功能片段并将它们投入应用奠定了基础。 

1963年，美国洛克菲勒大学的Robert Bruce Merrifield教授建立了固相多肽合成法，开创了一种革命性的有机固相合成法，它可快捷，简便高效的合成多肽，在此基础上为多肽机械自动化合成奠定了基础并在60年代末世界上首次出现多肽自动合成仪的雏形，随着技术进步及对多肽研究的需求，多肽合成仪的种类从合成量上分，可分为微克级、毫克级、克级和公斤级；从功能上分，可分为研究型、小试型、中试型、普通生产型和GMP生产型；从自动化程度上分，可分为全自动、半自动和手动型；从通道上分，可分为单通道的和多通道合成仪。R.Merrifield教授因此获得1984年诺 贝尔化学奖。 

如今多肽合成已成为一种商业化技术服务项目，可按照客户的需求进行多肽合成及多肽修饰等服务。 

本发明即借鉴现代技术手段，提供一系列人为设计、人工合成的鱼精蛋白模拟肽，使其具有与鱼精蛋白相同或近似的拮抗肝素的活性。 

鱼精蛋白(Protamine)是从鱼类精巢中提取分离出的一种碱性蛋白质，临床用途广泛，是最常用的肝素中毒解毒药。 

文献介绍其氨基酸序列PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR（P代表脯氨酸，R代表精氨酸，S代表丝氨酸，V代表缬氨酸，G代表甘氨酸），分子量约3800。虽然已有人测出鱼精蛋白的一种氨基酸序列，但由于鱼精蛋白为天然鱼类精巢中的提取物，实际包括了非均一态的分子群，并非单一构成，结构有不确定性，事实上难以人工复制。本发明中，所谓“模拟”的概念，是指借鉴鱼精蛋白已知的序列信息，通过人为设计的方式，获取功能与鱼精蛋白相同或类似、同样具有拮抗肝素活性的人工产品，作为鱼精蛋白的替代品。 

为清楚展示本发明，以下分段落详述。实施例或实验中所用方法如无特别说明均为常规方法，可参考《多肽药物研究与开发》（主编：厉保秋，人民卫生出版社，2011-07），《硫酸鱼精蛋白生物测定法》（2010版《中国药品检验标准操作规范》，中国医药出版社）。 

实施例或实验中提到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验可获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。 

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，可结合实施例对本发明多肽的设计、特征、功效及具体应用进行深入了解，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

实施例1：鱼精蛋白模拟肽的设计 

设计思路及手段：肝素（Heparin）是一种从牛肺或猪小肠粘膜中提取的天然抗凝血物质，其平均分子量为15KD的粘多糖硫酸脂，呈强酸性带大量负电荷。根据肝素的化学性质特点，本发明首先采用荷正电的碱性氨基酸组成的多肽用以中和或拮抗带大量负电荷的肝素。 

按照碱性强弱排列，三种碱性氨基酸依次为精氨酸（Arg，R）>赖氨酸（Lys，K）>组氨酸（His，H）。通过理论设计和有效的实验验证，本发明最终确定了一系列人 为设计、人工合成的鱼精蛋白模拟肽。它们是由三种碱性氨基酸组成的氨基酸数量在9～20个的直链多肽，所述碱性氨基酸为精氨酸（Arg，R）、赖氨酸（Lys，K）和组氨酸（His，H）。这里：三种碱性氨基酸可以在任意位置、以任意比例组合。具体来讲，可进行以下罗列： 

A组：系列鱼精蛋白模拟肽是由单纯精氨酸（Arg，R）组成的氨基酸数量为9～20个的直链多肽（可表示为R9～R20）。少于7个精氨酸的肽链没有拮抗肝素的效果，由9个精氨酸组成的肽链开始显示拮抗肝素的活性，且随着精氨酸肽链的延长，拮抗肝素的活性增加。 

B组：系列鱼精蛋白模拟肽是由单纯赖氨酸（Lys，K）组成的氨基酸数量为9～20个的直链多肽（可表示为K9～K20）。少于7个赖氨酸的肽链没有拮抗肝素的效果，由9个赖氨酸组成的肽链开始显示拮抗肝素的活性，且K9～K20范围内，随着赖氨酸肽链的延长，拮抗肝素的活性增加。 

C组：系列鱼精蛋白模拟肽是由单纯组氨酸（His，H）组成的氨基酸数量为9～20个的直链多肽（可表示为H9～H20）。少于7个组氨酸的肽链没有拮抗肝素的效果，由9个组氨酸组成的肽链开始显示拮抗肝素的活性，且H9～H20范围内，随着组氨酸肽链的延长，拮抗肝素的活性增加。 

实验证明，由单一种类碱性氨基酸（精氨酸或赖氨酸或组氨酸）组成的肽链（A组-C组）对肝素均显示有拮抗作用，肽链拮抗肝素的效果与组成肽链的氨基酸碱性强弱呈正相关的关系（参见试验2），即相同数量的氨基酸肽链，单纯由精氨酸组成的肽链（A组）拮抗肝素的效果优于单纯由赖氨酸组成的肽链（B组），单纯由赖氨酸组成的肽链（B组）拮抗肝素的效果优于单纯由组氨酸组成的肽链（C组）。 

D组：混合氨基酸组，基于A-C组肽链均具有活性，可以以其中一组为基本肽链，在任意一个或多个位置替换成另外一种或两种氨基酸以此形成的直链多肽。按照排列组合计算，D组所形成的多肽数量是庞大的。表1以9个精氨酸为基本肽链，改变其中2个氨基酸为例，直观地给出混合氨基酸组的构成，以帮助理解。显然，表1中仍未穷尽该方式组合的多肽。 

表1：9个精氨酸改变其中2个氨基酸的混合氨基酸 

另一方面，混合氨基酸肽链组中，对肝素同样有拮抗作用（参见试验4）；且不同氨基酸数量的多肽，拮抗肝素的活性随数量的增多而增加（参见试验1）。且可以预知，相同氨基酸数量的多肽，组成中氨基酸碱性强弱（碱性R＞K＞H）与拮抗肝素活性呈正相关，例如表1中，活性R9-2K＞R9-1H1K＞R9-2H。 

E组：由精氨酸组成的肽链R9～R20，其中任意一个位置替换成一个组氨酸。该组的设计目的是便于对该药物分子做同位素碘）标记追踪。 

为便于药物分子代谢的追踪研究，以精氨酸为主的肽链中（以R15为例）在其任意位置采用一个可被同位素碘标记的组氨酸替代（H^I-125或，H^I-131）形成如表2所列多肽序列： 

表2：15个精氨酸中变化1个组氨酸的混合氨基酸 

解释：表2中H不放在末端是为防止羧肽酶对多肽的降解导致失去同位素标记的H，影响分子追踪。 

实验证明（参见针对R15的试验3），在包含一个组氨酸的由精氨酸组成的鱼精蛋白模拟肽中，组氨酸在肽链所处的位置未对模拟肽拮抗肝素效应有明显的干扰，因此在以精氨酸为主的碱性氨基酸肽链中，组氨酸可处于任意位置，且不会对模拟肽拮抗肝素活性产生明显影响。 

F组：优选的鱼精蛋白模拟肽组 

根据实验检测结果，在众多的被检测肽链中按照如下思路考虑优选鱼精蛋白模拟 肽： 

1.在有效的多肽链中尽量选取链短的多肽，利于降低外源肽分子的抗原性及中和肝素之外多余的肽分子可在体内被快速降解； 

2.三种碱性氨基酸肽链中选取碱性最强的氨基酸肽链，选取精氨酸组成的肽链用于中和或拮抗强酸性肝素。 

由于多肽药物的分子量越大越容易激发机体产生抗体及不良反应、拮抗肝素的效果、生产投入产出性价比等因素的综合考虑，尽可能采用短肽链为临床用药，依据该思路，推荐优选的鱼精蛋白模拟肽包括R16，R15，R14，R13，R12，R11，R10等以及它们适宜的药用盐。 

本发明特别提出一种优选的鱼精蛋白模拟肽，其是由精氨酸组成的R15多肽链。其结构如下： 

试验验证（参见试验6）鱼精蛋白模拟肽R15拮抗肝素活性与鱼精蛋白相当，可作为鱼精蛋白（提取产品）的替代品，用于临床上消除和中和血液中由肝素引起的出血倾向。 

G组：鱼精蛋白模拟肽药用盐 

在以上系列鱼精蛋白模拟肽的设计中，其可药用的成盐形式的化合物也被考虑到。所述成盐形式包括无机盐形式，如硫酸盐、醋酸盐、磷酸盐、盐酸盐、碳酸盐等，也包括有机盐形式，如马来酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、磺酸盐、水杨酸盐、苹果酸盐等。可以确证，系列鱼精蛋白模拟肽的无机盐和有机酸盐均不影响其拮抗肝素的活性（参见试验5）。 

实施例2：鱼精蛋白模拟肽的合成 

1963年，美国科学家R.B.Merrifield发明创立了将目的肽氨基酸的羧基端（C端）固定在不溶性树脂上，树脂上结合的氨基酸的氨基端（N端）与有待连接的氨基酸的 羧基端进行缩合反应达到延长肽链的固相合成法。多肽合成的顺序是从多肽的羧基端（C端）开始逐个氨基酸缩合连接向肽段的氨基端（N端）方向逐个延伸。当进行氨基酸的羧基接合反应时要将其氨基和侧链基团保护起来避免发生反应，目前常用的有叔丁氧羰基（Boc）保护法和芴甲氧羰基（Fmoc）保护法，因此，每连接上一个氨基酸就要经历一次以结合在固相载体上的氨基酸作为氨基的脱保护基并同过量的下一个有待连接的氨基酸的活化羧基发生缩合反应延长肽链。通过这样的步骤反复多次地进行下去，即达到缩合—>洗涤—>去保护—>中和和洗涤—>下一轮缩合（再接上一个氨基酸），直至达到所需要合成的肽链长度。多肽合成完成后再将合成的多肽产物从固相树脂上裂解下来，经过高效液相色谱的纯化最终得到合成产物。基于以上的原理，多肽合成可以是手工操作合成，也可以采用多肽合成仪经过输入合成序列和程序自动化合成。 

本发明系列鱼精蛋白模拟肽的合成采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成法。合成的直链多肽采用WANG树脂（购自吉尔生化（上海）有限公司）在多肽自动合成仪（ABI433A型）上自多肽的羧基端（C）向氨基端(N)逐个氨基酸缩合延伸，合成完成后采用TFA（三氟乙酸，Trifluoroacetic acid）法（具体方法参见文献：Chillemi F.Merrifield R B.Use of N-im-dinitrophenylhistidine in the solid-phase synthesis of the tricosapeptides124-146of human hemoglobin.Biochemistry，1969，(8)：4344）将目的多肽从树脂上裂解下来，用高效液相色谱法(HPLC)进行纯化，具体参数为：采用日本Daiso公司C18色谱柱(10μm，50×250mm)，流动相A为(含0.05％三氟乙酸和2％乙腈的水溶液)，流动相B为90％乙腈/水，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长为220纳米，收集流出峰溶液，冷冻干燥，得到白色絮状固体多肽产物。 

采用固相合成法得到目标多肽，多肽分子经高效液相色谱法纯化可得到纯度>99.0％的多肽产物。 

实施例1设计的系列鱼精蛋白模拟肽均可按以上介绍合成得到。本发明着重阐述多肽分子的氨基酸序列设计和应用，关于多肽合成的具体操作依据设计由常规手段完成，在此不再一一赘述。 

试验1、检测不同氨基酸数量的系列鱼精蛋白模拟肽在体外对血浆中肝素抗凝的拮抗作用 

试验目的：检测合成的系列鱼精蛋白模拟肽在体外对血浆中肝素抗凝的拮抗作用。 

试验原理： 

本试验主要是针对6种氨基酸数量不同的鱼精蛋白模拟肽拮抗肝素的活性进行检 测，肝素拮抗剂的原理是鱼精蛋白所带正电荷中和与抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）结合的肝素的负电荷，从而把抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）释放出来，活化Ⅱa、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa、Ⅻa凝血因子，促使凝血激活酶的形成，使凝血酶原变成凝血酶，加速纤维蛋白原变成纤维蛋白。 

试验材料： 

采用固相合成法合成6种鱼精蛋白模拟肽R3、R5、R7、R9、R15和R20，R表示精氨酸（Arg），纯度均>99.0％，批号20130321，水溶性良好，水溶分装后经冷冻干燥呈白色絮状物； 

肝素钠：购自国药集团化学试剂有限公司，批号F20110919，比活150U/mg； 

硫酸鱼精蛋白注射液：购自北京悦康凯悦制药有限公司，国药准字H11020246、09121002，有效期至2015.09；平均分子量约为3800。 

实验用全血：新鲜动物全血取自新西兰兔（购自军事医学科学院实验动物中心）。 

试验方法： 

肝素标准品溶液的配制 

精密称取肝素标准品适量，按标示效价加0.9％氯化钠溶液溶解使成几种不同浓度的溶液，相邻两种浓度每1mL中所含肝素单位数相差应相等，且不超过5个单位，一般可配成每1mL中含85、90、95、100、105、110、115、120、125等单位的溶液。供试品溶液的配制 

供试品为鱼精蛋白模拟肽。供试品如为粉末，精密称取适量，按干燥品计算，加0.9％氯化钠溶液溶解使成每1mL中含1mg的溶液。 

检定法 

取管径均匀(0.8×3.8cm)清洁干燥的小试管8支，第1管和第8管为空白对照管，加入0.9％氯化钠溶液0.2mL，第2～7管为供试品管，每管均加入供试品溶液0.1ml，再每管分别加入上述一种浓度的肝素标准品稀释液0.1ml，立即混匀。取刚抽出的兔全血适量，分别加入上述8支试管内，每管0.8ml，立即混匀，避免产生气泡，并开始计算时间，将小试管置37±0.5℃恒温水浴中，从采血时起至小试管放入恒温水浴的时间不得超过2分钟；如用血浆，则分别于上述各管中加入0.7mL的血浆，置37±0.5℃恒温水浴中预热5～10分钟，每管分别加入1％氯化钙溶液0.1mL，立即混匀，避 免产生气泡，并开始计算时间。观察并记录各管凝结时间。 

结果判断 

两支对照管的凝结时间相差不得超过1.35倍。在供试品管的凝结时间不超过两支对照管平均凝结时间150％的各管中，以肝素浓度最高的一管作为终点管。 

同样重复5次，5次试验测得终点管的肝素浓度，相差不得大于10个单位。5次结果的平均值，即为供试品(干燥品)1mg中和肝素的单位数（中和肝素数）。 

兔全血数据处理： 

记录肝素抗凝血时间，即加入系列鱼精蛋白模拟肽后的凝集时间，并与非肝素抗凝的血浆凝集时间设为对照凝集时间，计算各凝集试验的平均值，以加入模拟肽的nmol浓度比上中和1IU肝素作为模拟肽的抗肝素能力指数（I）。 

抗肝素能力指数=多肽浓度/每单位肝素，nmol/U)。 

6种鱼精蛋白模拟肽R3、R5、R7、R9、R15和R20检定结果列于表3。 

表3鱼精蛋白模拟肽家兔肝素化全血中和肝素的单位数结果和抗肝素指数 

I=抗肝素能力指数；R=精氨酸；-=不适用或无法计算 

结论：试验结果表明R9、R15、R20显示出拮抗肝素的效应，并且单纯由精氨酸（R）组成的肽链随着精氨酸数目的增多即由9个精氨酸（R9）延伸至20个精氨酸（R20），伴随着分子量增加抗肝素能力指数数值下降，表明拮抗肝素的效果越加显著。 

发明人进一步对R20以上的多肽进行试验，结果至R25及以上均具有显著的拮抗肝素的效果，因此，对于拮抗肝素能力而言，氨基酸的数量理论上是不存在上限的。但考虑实际合成与工业应用，氨基酸数量不宜太大。 

另一方面，鉴于表3所列R7和R9为是否具有拮抗肝素能力的分水岭，发明人针对R8对动物全血进行了同样的实验，结果（见表4）表明R8全血凝集时间比空白全血有较大的延长，有较微弱的拮抗肝素的活性，但是小于70U/mg。 

综合考虑，本发明确定R9-R20较为适宜。 

表4鱼精蛋白模拟肽R8家兔肝素化全血中和肝素的单位数结果和抗肝素指数 

用同样方法对赖氨酸K3-K20和组氨酸H3-H20也进行了相同的试验，得出了相同的结论。为使内容简练，实验过程和数据不再罗列。 

本试验证明： 

1、少于7个氨基酸的肽链没有明显拮抗肝素的效果； 

2、由8个氨基酸组成的肽链开始显示拮抗肝素的活性，但氨基酸数量达到9个后的肽链拮抗肝素效果更明显，且随着氨基酸肽链的延长，拮抗肝素的活性增加。确定R9～R20或K9～K20或H9～H20范围内的鱼精蛋白模拟肽适合。 

3、鱼精蛋白模拟肽的生物活性随肽链长短的不同，活性与商品化鱼精蛋白的作用接近或稍弱。 

试验2、检测三种单纯碱性氨基酸长肽在体外对血浆中肝素抗凝的拮抗作用 

试验目的：为确定三种碱性氨基酸即精氨酸（Arg，R）、赖氨酸（Lys，K）、组氨酸（His，H）对肝素的拮抗作用，特别针对合成的R15(含15个精氨酸的肽链)、K15(含15个赖氨酸的肽链)、H15(含15个组氨酸的肽链)，比较三个肽链对肝素的拮抗作用。 

试验材料： 

采用固相合成法合成的3种鱼精蛋白模拟肽（R15、K15和H15），纯度均>99.0％，水溶性良好，水溶分装后经冷冻干燥呈白色絮状物； 

肝素钠：购自国药集团化学试剂有限公司，批号F20110919，比活150U/mg； 

硫酸鱼精蛋白注射液：购自北京悦康凯悦制药有限公司，国药准字H11020246、09121002，有效期至2015.09； 

试验动物：家兔，购自军事医学科学院实验动物中心； 

试验方法和数据处理与试验例1相同。试验结果见表5。 

表5鱼精蛋白模拟肽R15、K15和H15家兔肝素化全血中和肝素的单位数和抗肝素指数比较 

I=抗肝素能力指数；R=精氨酸；H=组氨酸；K=赖氨酸；-=不适用或无法计算 

按照氨基酸的pKa值区分，三种碱性氨基酸的碱性强弱依次为精氨酸Arg，R（pKa=12.5）>赖氨酸Lys，K（pKa=10.5）>组氨酸His，H（pKa=6.0）。 

根据氨基酸的等电点pI值，精氨酸Arg，R（pI=10.76）>赖氨酸Lys，K（pI=9.74）>组氨酸His，H（pI=7.59）。 

本试验证明了：由单一种类碱性氨基酸（精氨酸或赖氨酸或组氨酸）组成的15个氨基酸的肽链对肝素均显示有中和或拮抗作用；肽链拮抗肝素的效果与组成肽链的氨基酸碱性强弱呈正相关的关系，由精氨酸组成的肽链拮抗肝素的效果优于由赖氨酸组成的肽链，由赖氨酸组成的肽链拮抗肝素的效果优于由组氨酸组成的肽链。 

试验3、检测组氨酸在鱼精蛋白模拟肽分子中不同位置对拮抗肝素的影响 

试验目的： 

为开发成为临床体内用药，为方便研究药物代谢在肝素拮抗分子内设置可同位素标记的组氨酸His，检测组氨酸在鱼精蛋白模拟肽分子中不同位置对拮抗肝素的影响。 

试验材料： 

采用固相合成法合成的3种鱼精蛋白模拟肽（从表2中随机取R15-2、R15-5和R15-8），纯度均>99.0％，水溶性良好，水溶分装后经冷冻干燥呈白色絮状物； 

其它材料、试验方法及数据处理与试验例1相同。 

试验结果见表6。 

表6鱼精蛋白模拟肽R15-H家兔肝素化全血中和肝素的单位数和抗肝素指数比较 

I=抗肝素能力指数；R=精氨酸；H=组氨酸；-=不适用或无法计算 

由碱性氨基酸组成的多肽链中，精氨酸（Arg，R）的荷正电性强于赖氨酸（Lys或K）及组氨酸（His或H）。本试验在由精氨酸组成的强碱性氨基酸肽链，将其中一个精氨酸变更为组氨酸（Lys，H）利于同位素标记多肽分子，以追踪药物代谢反应及组织分布。试验证明：在包含一个组氨酸的由精氨酸组成的鱼精蛋白模拟肽中，组氨酸在肽链所处的位置（无论是处在第2位、第5位还是第8位）均未对模拟肽拮抗肝素效应有明显的干扰，组氨酸可处于任意位置，且不会对模拟肽拮抗肝素活性产生明显影响。 

由此可知，在混合不同种类碱性氨基酸的肽链中，不同种类氨基酸可处于任意位置，通常不会对模拟肽拮抗肝素活性产生明显影响。 

试验4、检测三种混合碱性氨基酸长肽在体外对血浆中肝素抗凝的拮抗作用 

试验方法参见试验1。试验材料为表6所列的固相法合成的三种不同氨基酸混合的直链长肽，几种混合氨基酸组成的鱼精蛋白模拟肽家兔肝素化全血中和肝素的单位数和肝素指标结果见表7。 

表7混合氨基酸鱼精蛋白模拟肽家兔肝素化全血中和肝素的单位数和抗肝素指数比较 

I=抗肝素能力指数；R=精氨酸；H=组氨酸；K=赖氨酸；-=不适用或无法计算 

可见，在混合碱性氨基酸的肽链中，在10-20个不同数量精氨酸长肽中还可以附加组合其它两种氨基酸，得到的模拟肽同样有拮抗肝素活性。 

试验5、检测系列鱼精蛋白模拟肽成盐形式的化合物在体外对血浆中肝素抗凝的拮抗作用 

试验目的：本发明的鱼精蛋白模拟肽是由碱性氨基酸组成的多肽链，具有成盐性，可使多肽分子以盐化合物的形式存在，使其在存放过程中更趋于稳定。 

成盐反应是指有机碱加酸或有机酸加碱而成盐的反应，在此特指本发明的系列碱性多肽（鱼精蛋白模拟肽）与有机酸或无机酸的成盐反应，包括与马来酸、枸橼酸、酒石酸、磺酸、水杨酸、苹果酸等有机酸或与硫酸、醋酸、磷酸、盐酸、碳酸等无机酸反应而生成的盐化合物。将系列碱性多肽（鱼精蛋白模拟肽）进行成盐反应制成盐，其目的主要是增加药物的稳定性和溶解度。 

试验方法： 

1.成盐反应，以硫酸鱼精蛋白模拟肽为例，具体实验方法： 

配制R15浓度10mg/ml的乙醇溶液，加入0.05%硫酸乙醇溶液，振荡离心，加乙醇洗涤2次离心，后加水溶解，冻干，得无机盐形式鱼精蛋白模拟肽（R15硫酸盐）。用HPLC-UV方法进行质量和纯度鉴定，结果表明，此方法制备的R15盐酸盐的的平均收率>70%，纯度>98%。 

2、以硫酸盐为例说明无机盐形式的鱼精蛋白模拟肽的拮抗肝素效果，按照前述的活性测定方法，对等摩尔浓度的R15成盐前后的拮抗肝素的活性进行了比较，证明成盐之后对活性没有影响，其中R15硫酸盐的含量分析，用未成盐形成进行标化，未计算硫酸根的重量。实验结果见表8。 

表8鱼精蛋白模拟肽R15和R15硫酸盐家兔肝素化全血中和肝素的单位数和抗肝素指数比较 

I=抗肝素能力指数；R=精氨酸；-=不适用或无法计算。 

试验结果证明R15的硫酸盐形式不影响其拮抗肝素的效果。同样验证了其它无机酸和有机酸盐形式的多肽，结论是碱性氨基酸肽（鱼精蛋白模拟肽）的无机酸、有机酸成盐形式均不影响同样数量氨基酸的鱼精蛋白模拟肽拮抗肝素的效果。 

试验6：鱼精蛋白模拟肽R15动物体内试验对肝素过量的拮抗效应 

试验材料： 

采用固相合成法合成R15硫酸盐，纯度均>99.0％，批号20130321，水溶性良好，水溶分装后经冷冻干燥呈白色絮状物； 

肝素钠注射液：购自天津生物化学制药有限公司批准文号：国药准字H12020505，规格，2毫升:1.25万单位； 

硫酸鱼精蛋白注射液：购自北京悦康凯悦制药有限公司，国药准字H11020246、09121002，有效期至2015.09； 

APTT试剂盒(批号Y118081)，PT试剂盒(批号Y103125),上海太阳生物技术有限公司；梓檬酸钠，Sigma。 

实验用动物：新西兰兔，雄性，12只（购自军事医学科学院实验动物中心）实验前在本实验室饲养一周，实验前禁食过夜，不禁水。 

R15硫酸盐供试品溶液的配制：供试品为粉末，精密称取适量，按干燥品计算，加生理盐水溶解使成每1mL中含1mg的溶液。 

实验方法：实验分组，分为3组，每组4只动物，分为正常对照组、商品化鱼精蛋白组、R15硫酸盐组。实验流程见表9，大耳白兔称重后，用肝素注射液左侧耳缘静脉给药100u/kg，5min后右侧耳缘静脉取1.35ml血，与0.15ml柠檬酸钠以9:1体积抗凝。3000r/min，15min，离心，取血浆用于APTT和PT测定。10分钟内左侧耳缘静脉分别注射硫酸鱼精蛋白1mg/kg、R15硫酸盐1mg/kg，正常对照组注射等量生理盐水，5min后，右侧耳缘静脉取1.35ml血，与0.15ml柠檬酸钠以9:1体积抗凝。3000r/min，15min，离心，取血浆用于APTT和PT测定。 

表9实验设计和分组给药 

实验结果和数据处理：结果见表10，结果可以看出，肝素化家兔血浆凝血时间与正常对照组比较有显著性差异，凝血明显延长，用鱼精蛋白模拟肽中和后基本恢复正常，商品化鱼精蛋白和实验药物鱼精蛋白模拟肽R15硫酸盐比较没有显著性差异(p>0.05)；正常对照组比较有较显著的差异（p<0.05）。 

表10肝素化后家兔血浆血凝指标的变化及鱼精蛋白中和后家兔血浆血凝指标 

*与生理盐水组比显著性差异（p<0.05），**，与商品化鱼精蛋白组比较没有显著性差异(p>0.05)。 

以上试验证明本发明的鱼精蛋白模拟肽可作为鱼精蛋白的替代品，在临床上用于消除或中和血液中由肝素引起的出血倾向，具有临床应用的开发潜力。 

试验7：鱼精蛋白模拟肽的安全性评价，急性毒性试验 

1材料与方法 

1.1药物 

鱼精蛋白模拟肽R15（含量：96.54%）。 

1.2溶剂 

生理盐水，石家庄四药有限公司生产。 

1.3动物 

昆明小鼠86只（16只预实验用，70只正式实验用）,雌雄各半,体重(20-25)g,购于军事医学科学院动物实验中心,适应环境1周后进入正式实验。自由饮水,定时通风,湿度保持60%,光照和黑暗时间各12h。 

1.4方法 

1.4.1预实验 

取健康无孕小白鼠16只，体重18-22g，试验前禁食不禁水，以理论计算鱼精蛋白模拟肽使用剂量（25mg/kg）的3倍（75mg/kg）开始给药，测试出100%死亡剂量和0%死亡剂量为50mg/kg（3只测试小鼠均死亡）和25mg/kg（3只测试小鼠均未死亡），给药后连续观察1周，记录精神状态等一般情况以及小鼠毒性反应和死亡情况。 

1.4.2正式试验 

1.4.2.1剂量的确定 

以0%和100%死亡剂量确定以0.85左右的剂量比值分成6组，分别为25、30、35、40、45、50mg/kg。 

1.4.2.2试验方法 

取健康无孕小白鼠70只体重试验前禁食不禁水按性别体重将小鼠随机分为6组（鱼精蛋白模拟肽各浓度组及生理盐水对照组），每组10只雌雄各半。试验当天供试品各剂量组尾静脉注射给予小鼠药液1次，对照组小鼠给予等体积生理盐水，应急检验给药后连续观察2周，记录精神状态等一般情况以及小鼠毒性反应和死亡情况。 

2结果 

2.1急性中毒症状 

死亡小鼠均在注射后2h内死亡，绝大部分在30min内死亡，高剂量组40mg/kg、45mg/kg在10min左右死亡。死亡小鼠在注射后2-5ming出现非正常生理反应，静卧，不喜动；行动迟缓，前肢无力，只用后腿活动；不时有猛蹬后腿、蹦跳、尾巴翘起的反情况，不久后死亡，身体僵硬。尸检发现膈处发黑，另外心脏大部分发黑，雌雄均出现以上现象。未死亡的小鼠在注射后2-5ming出现非正常生理反应静卧，不喜动，蜷缩一处，很少出现蹦跳，尾部翘起的挣扎现象，基本12小时后恢复常态，与正常小鼠无异。 

2.2半数致死量 

采用半数致死量测定法Bliss法，测得鱼精蛋白模拟肽小白鼠尾静脉注射给药LD50=35.394mg/kg，LD50(Feiller校正)95%的可信限=32.177-38.473mg/kg。结果见表11。 

表11用Bliss法计算半数致死量 

回归方程y(Probit)=-12.479+11.285Log(D) 

半数致死量LD50=35.394mg/kg 

LD50(Feiller校正)95%的可信限=32.177～38.473mg/kg 

LD5=25.302mg/kg 

LD95=49.51mg/kg 

讨论：合成的鱼精蛋白模拟肽LD50=35.394mg/kg，与文献报道的天然鱼精蛋白的半数致死量38mg/kg数值非常接近，表明鱼精蛋白模拟肽与天然鱼精蛋白的安全性相近。 

以上通过实施例和试验详细介绍了本发明提供的鱼精蛋白模拟肽。综合可知： 

1.鱼精蛋白模拟肽由于具有明确的氨基酸序列和分子式，选取的是具有中和或拮抗肝素最佳活性的短链肽，降低外源肽分子的抗原性，提高在体内的降解清除速率； 

2.由于是单一分子，因此中和或拮抗肝素的量效关系稳定、明确，不随生产批次的不同而变化； 

3.由于是单一分子，生产纯度高，质量标准明确； 

4.取代鱼精蛋白有效避免外源性大分子群作为药物对人造成的临床副作用及隐患。 

Claims (10)

1.鱼精蛋白模拟肽，是由9～20个碱性氨基酸组成的直链多肽，所述碱性氨基酸为选自精氨酸（Arg，R）、赖氨酸（Lys，K）和组氨酸（His，H）中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的鱼精蛋白模拟肽，其特征在于：所述系列鱼精蛋白模拟肽由9～20个单纯精氨酸组成（R9～R20），或由9～20个单纯赖氨酸组成（K9～K20），或由9～20个单纯组氨酸组成（H9～H20）。

3.根据权利要求1所述的鱼精蛋白模拟肽，其特征在于：直链多肽中三种碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸和组氨酸可以在任意位置、以任意比例组合。

4.根据权利要求1或2或3所述的鱼精蛋白模拟肽，其特征在于：所述系列鱼精蛋白模拟肽基于9～20个单纯精氨酸，且其中任意一个精氨酸被组氨酸替换（R9-H～R20-H）。

5.根据权利要求1或2或3所述的鱼精蛋白模拟肽，其特征在于：所述系列鱼精蛋白模拟肽基于9～20个单纯赖氨酸，且其中任意一个赖氨酸被组氨酸替换（K9-H～K20-H）。

6.根据权利要求1或2所述的鱼精蛋白模拟肽，其特征在于：所述鱼精蛋白模拟肽由15个单纯精氨酸组成（R15）。

7.根据权利要求4所述的鱼精蛋白模拟肽，其特征在于：所述鱼精蛋白模拟肽为基于15个精氨酸的直链长肽，由14个精氨酸和1个组氨酸组成（R15-H）。

8.权利要求1-7任一所述鱼精蛋白模拟肽的药用盐。

9.根据权利要求8所述鱼精蛋白模拟肽的药用盐，其特征在于，包括无机盐形式，如硫酸盐、醋酸盐、磷酸盐、盐酸盐、碳酸盐等；有机盐形式，如马来酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、磺酸盐、水杨酸盐、苹果酸盐等。

10.权利要求1-7任一所述鱼精蛋白模拟肽或权利要求8-9所述鱼精蛋白模拟肽的药用盐在制备拮抗肝素药物中的应用，该药物在临床上用于消除与中和血液中由肝素引起的出血倾向。