JP5373077B2 - ポリペプチド系物質、その製造方法、組織器官の虚血の予防用薬及び治療用薬 - Google Patents
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Description
ポリペプチドで、上記のポリペプチドのアミノ酸の配列順序がTrp−Ser−Asn−Val−Leu−Arg−Gly−Met−Gly−Gly−Ala−Pheである。
心筋ペプチド溶液から心筋ペプチドCを抽出する方法で、上記の方法が下記のステップを含む。
心筋ペプチドCを製造する化学合成方法で、上記の方法は下記のことを含む。
(2)t−ブトキシカルボニル基(t−ButyloXycarbonyl)
(3)トシル(Tosyl)基
(4)9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc:9−FluorenylmethoXycarbonyl)。
エリート高圧液体クロマトグラフィーP230システム、PF−2の二次元液体クロマトグラフィー分離システム(米国ダイオネクス社)解析型クロマトグラフィーカラム、waters、C18、4.6X250mm、SPE固相抽出カラム(waters社)、C18半調製逆相クロマトグラフィーカラム(米国熱電会社)、真空冷凍乾燥機(米国熱電会社)、遠心分離機など。
1.心筋ペプチド溶液に70%の硫酸アンモニウム溶液を入れ、温度が4℃の条件で一晩放置し、遠心して、上清液と沈殿物を分離する。
2.上清溶液を取って、SPE固相抽出カラムを通し、60%のアセトニトリールと0.1%の三フッ素酢酸の混合溶液で溶出して、画分Aを収集する。
勾配溶出:0−5min0%B、5−35min0%−100%B、35−40min100%B、40−45min100%−0%B。
移動相:A相が100%H2O+0.1%TFAで、B相が95%ACN+0.1%TFAである
紫外線メーター:波長λ=280nm、R=3.0
勾配溶出:0−5min0%B、5−50min0%−100%B、50−60min100%B、60−65min100%−0%B。
MALDI−TOF−TOF質量スペクトルメーター(米国AB会社−4800)で得た物に対して質量スペクトルの測定を行うが、その中にMALDI−TOF一級質量スペクトルは陽イオン反射測定モードを採用して、二次タンデム質量スペクトルは陽イオン反射モードを採用して、測定の結果は図2の通りである。
活性の測定は大連珍奥薬業公司の提供した「心筋細胞育成活性測定試験」の方法で行われる。この方法は体外培養心筋細胞のアドリアマイシンによる中毒試験に基づき、2、4−ジフェニル臭素化テトラゾール(MTT)を反応指示薬として、心筋ペプチドが障害を受けた心筋細胞線粒体の脱酸酵素の活力を強化する作用を観察して、心筋の保護作用を判定する。
1.試験用動物
SD幼いマウス、2−4の日齢、瀋陽薬科大学動物センターから提供されたもの。
心筋ペプチドC(CMPC)、大連珍奥薬業有限公司から提供されたもので、ロット番号:C1586102。
1.体外試験
1.1心筋細胞の初代培養
幼いマウスの心室を取って、D−Hank’sで洗った後に細かく切って、II型コラゲナーゼで消化して、心筋細胞と繊維細胞を得て、15%のFCSを含む高糖DMEM(DMEM−H−15)で培養する。差異的細胞接着と化学方法で繊維細胞を取り除いて、心筋細胞を96孔の板に接種する。
細胞の培養方法が1.1と同じである。
1.3. CMPCの初代培養心筋細胞酸素不足―酸素再供給による障害作用の抵抗
細胞の培養方法が1.1と同じである。
**P<0.01,*P<0.05 模型グループとの対比 ##P<0.01、#P<0.05 空白対照群との対比
2.体内実験
2.1.CMPC予防性投薬のマウスの心筋虚血−再潅流傷害に対する保護作用
250−300g のSDマウスを70匹取って、その中の60匹を体重のバランスによって無作為に6群に分けて、群ごとに10匹で、残った10匹が各群の死亡動物の補充とする。正常対照群:仮手術を行って、即ち冠動脈左前下行枝(LAD)で糸を通して、結紮しない。模型群:結紮の前に30分間静脈を経由して生理食塩水を5ml/kg投薬して、虚血−再潅流操作は模型の製造を参照する。陽性薬群:結紮の前に30minに静脈を経由してベラパミルを1.0mg/kg投薬して、虚血−再潅流操作が模型群と同じである。CMPCの高、中、低の薬分量群:結紮の前に30minに静脈を経由して相応濃度のCMPC(1.8、0.6、0.2mg/kg)を投薬して、虚血−再潅流操作が模型群と同じである。
*P<0.05,**P<0.01 模型群との対比。##P<0.01仮手術群との対比
模型群ではマウスの血清のSOD活性が著しく下がって(P<0.01)、MDA値が著しくあがった(P<0.01)。陽性薬Verが血清SOD活性(P<0.01)を著しく高めて、MDA活性を下げる(P<0.05)。CMPC−H、M、L薬分量群では模型群と比較して、冠動脈を結紮したマウスの血清のSOD活力を高めて(P<0.01、P<0.05)、MDAの含有量(P<0.01、P<0.05〉を下げることができる。結果は表4を参照する。
*P<0.05,**P<0.01 模型群との対比。##P<0.01仮手術群との対比
模型群ではマウスの心筋梗塞の面積が著しくて上がった(P<0.01)ことに対して、陽性薬群、CMPCの各予防性投薬群では模型群と比較して、マウスの心筋梗塞の面積を著しく下げることができる(P<0.01)。結果は表5を参照する。
*P<0.05、**P<0.01 模型群との対比。##P<0.01仮手術群との対比
2.2.CMPC治療性投薬のマウスの心筋虚血−再潅流傷害に対する保護作用
LADを結紮した後に5minに尾静脈に注射投薬して、LADを結紮した 30minの後に30minに再潅流して、腹大動脈で血を採取した後に心臓を取って、上記の方法で生物化学指標と心筋梗塞の面積を測定する。
*P<0.05、**P<0.01 模型群との対比。##P<0.01仮手術群との対比
模型群ではマウスの血清SOD活性が著しく下がって(P<0.05)、MDA値が著しく上がった(P<0.01)。陽性薬Verでは血清SOD活性を著しく上げて(P<0.05)、MDA含有量を下げることができる(P<0.05)。CMPC−H、Mでは模型群と比較して、マウスの血清SOD活力を著しく上げることができる(P<0.05、P<0.01)。CMPC−LではSOD活性を上げる成り行きがあるが、模型群と比較して、著しい相違がない(P>0.05)。CMPC−H、M、Lの各薬分量群ではMDA含有量を著しく下げることができる(P<0.05)。結果は表7を参照する。
*P<0.05、**P<0.01 模型群との対比。##P<0.01仮手術群との対比
模型群ではマウスの心筋梗塞の面積が著しく上がった(P<0.01)ことに対して、陽性薬Ver、CMPCの各治療性投薬群では模型群と比較して、マウスの心筋梗塞の面積を著しく下げることができる(P<0.01)。結果は表8、図8を参照する。
三、結論
体外初代培養乳マウスの心筋細胞のアドリアマイシンによる障害と酸欠―酸素再供給による障害の模型で、心筋ペプチドCは障害を受けた心筋細胞線粒体の脱酸酵素の活性を高めて、障害を受けた心筋細胞に対して一定の保護の作用を持っている。体内の心筋ペプチドCの予防性と治療性投薬は虚血と再潅流したマウスの血清CK、LDH、MDAの含有量を著しく下げ、SOD含有量を上げ、しかも一定の薬分量の依存性があるとともに、マウスの心筋梗塞の面積を下げることができるので、心筋ペプチドCの治療性と予防性投薬の虚血と再潅流による障害を受けたマウスの心筋に保護の作用を持っていることが分かる。
Claims (8)
- アミノ酸の配列順序がLys−Gly−Ala−Trp−Ser−Asn−Val−Leu−Arg−Gly−Met−Gly−Gly−Ala−Pheであることを特徴とするポリペプチド。
- 下記のステップを含む方法:
(1)心筋ペプチドの溶液に質量パーセンテージ濃度が60−80%の硫酸アンモニウムの溶液を入れ、放置し、遠心して、上清液と沈殿物を分離する;
(2)上清液を取ってから、固相抽出カラムを通し、60%のアセトニトリールと0.1%の三フッ素酢酸の混合溶液で溶出し、画分Aを収集する;
(3)収集した画分Aを元の体積の1/8−3/4に濃縮してから、逆相クロマトグラフィで分離し、活性がある画分Bを収集し、逆相クロマトグラフィで分離する条件が、移動相:A相が100%H2O+0.1%TFAで、B相が60%ACN+0.1%TFAで、紫外線測定機器の波長λ=280nm、R=3.0で、勾配溶出:0−5min0%B、5−35min0%−100%B、35−40min100%B、40−45min100%−0%Bである;
(4)活性がある画分Bを元の体積の1/8−1/2に濃縮し、それから解析型逆相クロマトグラフィで更に分離し、活性がある画分Cを収集し、解析型逆相クロマトグラフィで分離する条件が、移動相:A相が100%H2O+0.1%TFAで、B相が95%ACN+0.1%TFAで、紫外線測定機器の波長λ=280nm、R=3.0で、勾配溶出:0−5min0%B、5−50min0%−100%B、50−60min100%B、60−65min100%−0%Bである;
(5)活性がある画分Cに質量スペクトルの測定を行い、質量スペクトルのデータで分析した結果、画分Cの中に活性があるペプチドのアミノ酸の配列があること同定すると、上記の画分Cが上記のポリペプチドであることが分かる;
を特徴とする、心筋ペプチドの溶液から請求項1に記載のポリペプチドを抽出する方法。 - 上記の硫酸アンモニウムの溶液の質量パーセンテージ濃度が70%であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 下記のステップ:
(1)それぞれトリプトファン、セリン、アスパラギン、バリン、ロイシン、アルギニン、グリシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、リジンのアミノ基を保護基で保護する;
(2)先に固相担体を溶解し、更にポリペプチドのアミノ酸の配列順序の中の最初に保護されたアミノ酸を当該固相担体に固定してから、得た物を洗浄し、最初に保護されたアミノ酸とつながった固相担体を得る;
(3)第二の保護アミノ酸を最初のアミノ酸を結合した固相担体に入れて、縮合剤の存在で反応を行いペプチド結合を形成してから、アミノ酸のアミノ基の保護基を除いて、得た固相担体を洗浄する;
(4)ポリペプチドのアミノ酸の順序によって、順次に相応の保護アミノ酸を入れ、上記のアミノ基保護基を取り除き、洗浄ステップを繰り返して、最後のアミノ酸がペプチドチェーンと結び付けるまでペプチドチェーンを絶えず延長する;
(5)分離液を取って、上記のステップ(4)で得たポリペプチドを結合した固相担体を浸漬してから、濾過後に得た濾液を取って沈殿を行い、ポリペプチドの中間体を得る;
(6)得たポリペプチドの中間体を分離純化して、目標のものを得る;
を含む方法を特徴とする請求項1に記載のポリペプチドを製造する化学合成方法。 - ステップ(1)に記載のアミノ酸が下記のグループ:
(1)カルボベンゾキシ基(Carbobenzoxyl);
(2)t−ブトキシカルボニル(t−Butyloxycarbonyl)基;
(3)トシル(Tosyl)基;
(4)9−フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc:9−Fluorenylmethoxycarbonyl);
で保護されることを特徴とする請求項4に記載の化学合成方法。 - 請求項1に記載のポリペプチドを含む組織器官の虚血の予防用および/あるいは治療用薬。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含む心筋虚血、脳虚血、肝虚血、胃虚血、腸虚血、肺虚血あるいは腎臓虚血の予防用および/あるいは治療用薬。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含む心筋虚血の予防用および/あるいは治療用薬。
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